CN113913468B

CN113913468B - 一种蜘蛛的基因编辑方法

Info

Publication number: CN113913468B
Application number: CN202010662596.7A
Authority: CN
Inventors: 张蔚; 李枢强; 李逢源; 杨晗
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2020-07-10
Filing date: 2020-07-10
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2040-07-10
Also published as: CN113913468A

Abstract

本申请提供了一种蜘蛛的基因编辑方法，通过优化显微注射技术和选择合适时期的受精卵，极大的提高了蜘蛛显微注射的成活率和基因编辑的效率，从而实现了利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在蜘蛛受精卵上进行内源基因的精准编辑。

Description

一种蜘蛛的基因编辑方法

技术领域

本发明涉及动物遗传操作育种和基因功能研究的技术领域，具体涉及一种蜘蛛基因编辑的方法。

背景技术

蜘蛛隶属的螯肢亚门是节肢动物的基部类群，它代表了其他现存节肢动物多足，甲壳和昆虫的姐妹类群。蜘蛛是研究演化发育的理想类群。随着蜘蛛基因组信息的不断丰富和完善，功能基因组学在蜘蛛研究中的地位越发重要，但是在蜘蛛中开展的基因功能研究与遗传操作还很缺乏。

基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术为功能基因组的研究提供了有效的手段。Cas9基因编辑诱导的DSBs可以通过两种方式修复，一种是非同源末端直接修复(Non-homologous end-joining,NHEJ)，另一种是同源直接修复(Homologous-direct repair,HDR)，NHEJ引起插入或缺失突变，可以破坏目标基因的开放性阅读框(ORF)，从而我们可以实现目标基因的敲除，而我们可以通过HDR的修复方式敲除一段特定的序列或者插入一段我们感兴趣的基因片段，继而实现同源重组。迄今已在双翅目，鳞翅目，膜翅目，直翅目，鞘翅目昆虫以及枝角目，蜱螨目，十足目和端足目中建立了高效的基因编辑技术(张忠杰，刘晓静，李木旺，谭安江，黄勇平，基因组编辑技术在昆虫功能基因组研究中的应用，生命科学，2015)。但是，迄今没有在蜘蛛中建立有效的基因组编辑技术。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，发明人经过长期的研究，通过多次尝试和反复优化，首次实现了利用蜘蛛受精卵的显微注射进行蜘蛛的CRISPR/Cas9基因编辑的方法。具体的，本发明包括如下方案：

在第一个方面中，本发明公开了一种蜘蛛的基因编辑方法，其包括下列步骤：

1)制备靶向目标基因的sgRNA(single guide RNA)；

2)将步骤1)制备的sgRNA以及Cas9核酸内切酶通过显微注射导入蜘蛛受精卵中；其中，所述蜘蛛受精卵为处于合胞期的胚胎。

在一个实施方案中，其中所述蜘蛛为温室拟肥腹蛛Parasteatoda tepidariorum、隆头蛛Stegodyphus mimosarum、棕色遁蛛Loxosceles reclusa、黑寡妇蜘蛛Latrodectushesperus、络新妇蛛Trichonephila clavipes、草间钻头蛛Hylyphantes graminicola、家幽灵蛛Pholcus phalangioides、颚蚁蛛Toxeus maxillosus、拟环纹豹蛛Pardosapseudoannulataar、白额巨蟹蛛Heteropoda venatoria、龙栖蚁微蛛Solenysalongqiensis、克氏阿瑟蛛Althepus christae、穴塔姆蛛Tamgrinia alveolifera、水蛛Argyroneta aquatica、唇须孔蛛Portia labiata、三突花蛛Misumenoides formosipes和玉翠蛛Siler semiglaucus。

在又一个实施方案中，所述显微注射时，将受精卵放置在0.1-1毫米孔径的圆孔网筛板上，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0毫米或上述两点之间任意值，优选地，孔径为0.4毫米；

进一步优选地，所述受精卵表面用油覆盖，所述油例如卤化烃油Halocarbon 700(sigma，H8898)、Halocarbon 27(sigma，H8773)、Voltalef 10S(vwr，P24627)、矿物油(sigma，M8410、M3516)、石蜡油NidOil(Nidacon，NO-100)或者凡士林(sigma，16415)，更优选为卤化烃油700。

在又一个实施方案中，所述显微注射时，使用注射针将所述sgRNA和Cas9核酸内切酶导入蜘蛛受精卵中；

优选地，所述注射针采用P-97程控水平微电极拉制仪拉制玻璃毛细管SutterBF100-50-10制得。还优选地，所述拉制的参数为热度620units，拉力100units，速率50units和时间模式200units。

其中，所述热度设置控制供给加热片的电流大小，需要参考RAMP温度进行设置；拉力设置控制硬拉力的强度；速率是在玻璃软化并开始在恒定的负载下拉开时测定的；时间是两种可用的冷却方式之一，它控制着冷却空气被激活的时间长度。

在又一个实施方案中，其中所述sgRNA和Cas9核酸内切酶混合后一同注射到受精卵中；优选地，所述sgRNA的注射浓度为100ng/μL-400ng/μL，例如100ng/μL、150ng/μL、200ng/μL、250ng/μL、300ng/μL、350ng/μL、400ng/μL或上述任意两点之间的任意值；或者所述Cas9核酸内切酶的注射浓度为300ng/μL-400ng/μL，例如300ng/μL、310ng/μL、320ng/μL、330ng/μL、340ng/μL、350ng/μL、360ng/μL、370ng/μL、380ng/μL、390ng/μL、400ng/μL或上述任意两点之间的任意值。

在又一个实施方案中，每枚受精卵注射的注射液体积约为0.1nL-1nL(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0nL或上述两点之间任意值)。

本发明的第二个方面提供了一种蜘蛛受精卵的显微注射方法，其包括下列步骤：

S1、收取处于合胞期的蜘蛛受精卵；

S2、将所述蜘蛛受精卵置于0.1-1毫米孔径的圆孔网筛板上(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0毫米或上述两点之间任意值)，优选0.4毫米孔径；

在一个优选地的方案中，用油覆盖受精卵表面，所述油例如卤化烃油Halocarbon700(sigma，H8898)、Halocarbon 27(sigma，H8773)、Voltalef 10S(vwr，P24627)、矿物油(sigma，M8410、M3516)、石蜡油NidOil(Nidacon，NO-100)或者凡士林(sigma，16415)，优选地用卤化烃油700覆盖卵表面；

S3、利用注射针将注射液注入受精卵中，优选地，每枚受精卵注射的注射液体积约为0.1nL-1nL(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0nL或上述两点之间任意值)；

S4、将注射后的受精卵继续培养。

在一个实施方案中，所述网筛板为聚氨酯筛板、不锈钢筛板、碳钢板或镀锌板。

在又一个实施方案中，所述蜘蛛为温室拟肥腹蛛、隆头蛛、棕色遁蛛、黑寡妇蜘蛛、络新妇蛛、草间钻头蛛、家幽灵蛛、颚蚁蛛、拟环纹豹蛛、白额巨蟹蛛、龙栖蚁微蛛、克氏阿瑟蛛、穴塔姆蛛、水蛛、唇须孔蛛、三突花蛛和玉翠蛛。

本发明的第三个方面提供了一种特异性识别蜘蛛Antp基因的sgRNA，包括：sgRNA-1和/或sgRNA-2；其中，

所述sgRNA-1的序列如下：

GAAATTAATACGACTCACTATAGAGGCTGCATGTACTGACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；

所述sgRNA-2的序列如下：

GAAATTAATACGACTCACTATAGAATCAGCAGGTGATGATGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

目前蜘蛛中尚未实现利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在受精卵上进行内源基因的精准编辑。发明人通过多年的研究发现，通过选择合胞期的受精卵，能够最大限度的提高蜘蛛显微注射的成活率和基因编辑的成功率。进一步的，发明人还优化了显微注射的步骤，将受精卵固定在一定孔径的网筛板上，选择了锥度较大且孔口相对较小的注射针，以减少注射过程中卵的损坏。将卤化碳油700(Sigma)覆盖在注射后的卵表面，提高了孵化率。从而成功实现了蜘蛛的CRISPR/Cas9基因编辑，为开展蜘蛛基因的功能研究和蜘蛛品种的遗传改良提供了强有力的技术手段。

附图说明

图1为温室拟肥腹蛛Antp基因序列及sgRNA靶点。深灰色框代表外显子区域，浅灰色框代表Hox domain区域，向下的尖三角表示sgRNA靶点的位置。

图2为CRISPR基因编辑Antp成功的突变蜘蛛。基因编辑Antp蜘蛛腹节长出额外的一对附肢(eL)；L1-4代表第一至第四对附肢。其中A为右侧面；B为左侧面。

图3为蜘蛛Antp基因突变PCR检测凝胶电泳结果示意图。

具体实施方式

在本发明优选的但非限制性的实施方案中，所述蜘蛛类动物选自以下组:蛛形纲：蜘蛛目Araneae,包括漏斗蛛科Agelenidae、暗蛛科Amaurobidae、安蛛科Anapidae、近管蛛科Anyphaenidae、园蛛科Araneidae、地蛛科Atypidae、琴蛛科Cithaeronidae、管巢蛛科Clubionidae、圆颚蛛科Corinnidae、栉足蛛科Ctenidae、螲蟷蛛科Ctenizidae、并齿蛛科Cybaeidae、弓蛛科Cyrtaucheniidae、妖面蛛科Deinopidae、潮蛛科Desidae、卷叶蛛科Dictynidae、长尾蛛科Dipluridae、石蛛科Dysderidae、隆头蛛科Eresidae、优列蛛科Eutichuridae、管网蛛科Filistatidae、平腹蛛科Gnaphosidae、栅蛛科Hahniidae、长纺蛛科Hersiliidae、异纺蛛科Hexathelidae、古筛蛛科Hypochilidae、弱蛛科Leptonetidae、皿蛛科Linyphiidae、光盔蛛科Liocranidae、节板蛛科Liphistiidae、狼蛛科Lycosidae、拟态蛛科Mimetidae、米图蛛科Miturgidae、密蛛科Mysmenidae、线蛛科Nemesiidae、络新妇科Nephilidae、类球蛛科Nesticidae、花洞蛛科Ochyroceratidae、拟壁钱科Oecobiidae、卵形蛛科Oonopidae、猫蛛科Oxyopidae、二纺蛛科Palpimanidae、逍遥蛛科Philodromidae、幽灵蛛科Pholcidae、刺足蛛科Phrurolithidae、派模蛛科Pimoidae、盗蛛科Pisauridae、粗螯蛛科Prodidomidae、褛网蛛科Psechridae、跳蛛科Salticidae、花皮蛛科Scytodidae、类石蛛科Segestriidae、拟扁蛛科Selenopidae、刺客蛛科Sicariidae、华模蛛科Sinopimoidae、巨蟹蛛科Sparassidae、斯坦蛛科Stenochilidae、合螯蛛科Symphytognathidae、特园蛛科Synaphridae、泰莱蛛科Telemidae、四盾蛛科Tetrablemmidae、肖蛸科Tetragnathidae、捕鸟蛛科Theraphosidae、球蛛科Theridiidae、球体蛛科Theridiosomatidae、蟹蛛科Thomisidae、隐石蛛科Titanoecidae、管蛛科Trachelidae、转蛛科Trochanteriidae、妩蛛科Uloboridae、拟平腹蛛科Zodariidae、逸蛛科Zoropsidae。

在本发明的多个方面，术语”gRNA”、“嵌合RNA”、“嵌合指导RNA”、“指导RNA”、“单个指导RNA”、single guide RNA(sgRNA)以及“合成指导RNA”是可互换地使用的并且是指包括指导序列、tracr序列以及tracr配对序列的多核苷酸序列。术语“指导序列”是指在指定靶位点的指导RNA内约20bp的序列，并且可与术语“指导”或“间隔子”互换地使用。术语“tracr配对序列”也可与术语“(一个或多个)同向重复”互换地使用。

本发明的若干方面涉及包括一种或多种载体的载体系统，或载体本身。载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达CRISPR转录物(例如核酸转录物、蛋白质、或酶)。例如，CRISPR转录物可表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、或哺乳动物细胞中。适合的宿主细胞进一步讨论于Goeddel(戈德尔)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)中。可替代地，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶来转录和翻译。

一般而言，“CRISPR系统”统称为转录物和涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同向重复”和在内源CRISPR系统背景下的tracrRNA加工的部分同向重复)、指导序列(在内源CRISPR系统背景下也称为“间隔子(spacer)”)、或来自CRISPR座位的其他序列和转录物。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于I型、II型、或III型CRISPR系统。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR系统的特殊生物，如化脓链球菌。

在一些实施例中，一个载体包含可操作地连接到编码CRISPR酶(如Cas蛋白)的酶编码序列上的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，化脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可见于SwissProt数据库登录号Q99ZW2下。在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶如Cas9具有DNA切割活性。在一些实施例中，该CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自化脓链球菌或肺炎链球菌的Cas9。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1蜘蛛受精卵显微注射方法的建立

选取正常发育成熟的温室拟肥腹蛛的受精卵进行显微注射，具体包括以下步骤：

(1)在蜘蛛产卵3-6小时后，取处于合胞期的受精卵，将受精卵排列在网筛板上，用卤化烃油700(Sigma)覆盖卵的表面，准备注射；

(2)使用P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller(P-97程控水平微电极拉制仪)拉玻璃毛细管(Sutter BF100-50-10)形成注射用针；优选地，参数为热度620units(RAMP温度为590)，拉力强度100units，速率50units和时间模式200units；用解剖剪将注射用针的尖端剪断；

(3)用微量移液器将注射液转移至注射玻璃针内，将玻璃注射针的末端与成茂注射仪相连，然后注射；

(4)注射后受精卵的保存环境中，保持温度为20-28℃，保持相对湿度为40-70％；

(5)显微注射96小时后，以12-24小时为间隔时间，观察受精卵的发育情况；受精卵孵化后，用笔刷把它们轻轻地从卤化烃油700中取出放在培养皿上。

最终共注射752个蜘蛛卵，存活的数量达到445个，存活率提高到近60％，可以进行基因编辑。

实施例2利用实施例1的显微注射手段进行基因编辑

基因编辑过程整体包括下列步骤：特异性gRNA的设计与体外转录、显微注射、突变表型和基因型的鉴定。具体步骤如下；

(1)通过软件搜索GGN₁₈NGG或者GN₁₉NGG序列并设计single guide RNA(sgRNA)的靶点；在同一个外显子上设计两个sgRNA，且两个靶点之间的距离在100-1000nt(核苷酸)之间；图1显示了温室拟肥腹蛛Antp基因序列及设计得到的两个sgRNA靶点(sgRNA-1和sgRNA-2)，其中所述sgRNA-1的序列为：

所述sgRNA-2的序列为：

其中上述sgRNA序列包含三个部分：T7聚合酶结合位点(上述序列中5’端下划线区域)、靶点(上述序列中粗体部分，注意不含靶点末尾的NGG)以及CRISPR F(项目引物)(上述序列中3’端序列)；CRISPR F(项目引物)与CRISPR通用反向引物sgR组成引物对进行PCR用于合成scaffold序列，其中PCR的模板为scf-gRNA(该序列存在于质粒中)。

所述反向引物sgR的序列为：

AAAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT(SEQ ID NO:3)

scf-gRNA的序列为：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT(SEQ ID NO:4)。

靶点和scaffold序列组成sgRNA，并经由T7启动子转录。

(2)转录模板PCR，在PCR管中加入M5 taq聚合酶混合液，质粒scf-gRNA，通用反向引物，项目引物和双蒸水，PCR体系见表1；

表1转录模板PCR体系(100微升)

(3)超净台内准备新的进口EP管，各加入100微升乙酸铵，将第二步转录模板PCR产物加入进口EP管中，吹打混匀；再加入400微升无水乙醇，上下倒置混匀，置于-20℃冰箱20分钟；

(4)-4℃，14000rpm离心10分钟，小心去掉上清；由于模板DNA沉淀较少，且与管壁相贴不牢固，需要先用蓝枪头小心吸取大部分上清，最后用黄枪头小心吸取剩余上清；

(5)烘干沉淀10-15分钟，由于加有乙酸铵，烘干后打开烘箱会有一股酸味；使用不含RNA酶的10微升双蒸水(含DEPC)溶解沉淀；

(6)吸取0.5微升模板DNA进行电泳；

(7)依次加入酶混合液、转录缓冲液(T7 RiboMAX^TM快速大量RNA制备试剂盒)以及模板DNA，然后混匀；转录体系见表2；

表2转录体系(10微升)

(8)加入DNA酶0.5微升，混匀，PCR仪内37℃孵育15分钟，以除去DNA模板；

(9)将上步体外转录的sgRNA加入进口离心管中，加水至60微升；再加入60微升水饱和酚/氯仿，常温，12000转离心5分钟；

(10)吸取上清45微升到已加入5微升乙酸钠(T7 RiboMAX^TM快速大量RNA制备试剂盒)的进口离心管中，充分混匀；加入125微升无水乙醇(RNA专用)，-20℃放置20-30分钟；

(11)4℃，14000转离心15分钟，小心吸走上清，样品间换枪头，防止污染；用70％乙醇(RNA专用)200微升洗一次，4℃，14000转离心5分钟；吸走上清，沉淀于37℃烘箱中干燥，用相应的双蒸水(DEPC+)溶解沉淀(每10微升转录体系加7.5微升的双蒸水)；

(12)吸取0.5微升跑电泳，其余放回-80℃冰箱保存(溶解时间大于30分钟)；

(13)纯化sgRNA后，通过体外裂解实验验证sgRNA和Cas9核酸内切酶混合液的有效性。混合液处理后的目标基因存在多个裂解条带，确保sgRNA正常工作。

(14)使用P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller(P-97程控水平微电极拉制仪)拉玻璃毛细管(Sutter BF100-50-10)形成注射用针；参数为620热度(RAMP温度为590)，100拉力，50速率和200时间模式；用解剖剪将注射用针的尖端剪断。

(15)在蜘蛛产卵3-6小时取处于合胞期的受精卵，并将受精卵排列在网筛板上，用卤化烃油700(Sigma)覆盖卵的表面，准备注射；

(16)各取1微升的750纳克/微升sgRNA，0.3微升的3300纳克/微升Cas9核酸内切酶以及0.7微升的双蒸水混合；混合液在冰上孵育15分钟；

(17)用微量移液器将混合液转移至注射玻璃针内，将玻璃注射针的末端与成茂注射仪相连，然后注射；

(18)注射后，受精卵保存在25℃和40-70％相对湿度的环境中；

(19)受精卵孵化后，用笔刷把它们轻轻地从卤化烃油700中取出放在培养皿上；

(20)显微注射96小时后以24小时为间隔时间观察受精卵的发育情况并且挑选出突变表型的受精卵进行照相，将发育停滞的受精卵保存在95％的乙醇中；图2为突变表型受精卵的侧面图，可见腹部第一节发育出第五对附肢；

(21)提取发育停滞受精卵以及具有突变表型受精卵的基因组DNA，并PCR扩增靶点序列，结果如图3所示；凝胶电泳图显示基因编辑Antp基因成功。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一种蜘蛛的基因编辑方法

<130> CP2020102

<141> 2020-07-10

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gaaattaata cgactcacta tagaggctgc atgtactgac gtgttttaga gctagaaata 60

gc 62

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gaaattaata cgactcacta tagaatcagc aggtgatgat gcgttttaga gctagaaata 60

gc 62

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aaaaaaaaag caccgactcg gtgccactt 29

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt 80

Claims

1.一种蜘蛛的基因编辑方法，其包括：

1）制备靶向目标基因的sgRNA；

2）将步骤1）制备的sgRNA以及Cas9核酸内切酶通过显微注射导入蜘蛛受精卵中；其中，所述受精卵处于合胞期；

其中在显微注射时，将受精卵放置在0.1-1毫米孔径的圆孔网筛板上；所述受精卵表面用卤代烃油700覆盖。

2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述蜘蛛为温室拟肥腹蛛Parasteatoda tepidariorum、隆头蛛Stegodyphus mimosarum、棕色遁蛛Loxosceles reclusa、黑寡妇蜘蛛Latrodectus hesperus、络新妇蛛Trichonephila clavipes、草间钻头蛛Hylyphantes graminicola、家幽灵蛛Pholcus phalangioides、颚蚁蛛Toxeus maxillosus、拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulataar、白额巨蟹蛛Heteropoda venatoria、龙栖蚁微蛛Solenysa longqiensis、克氏阿瑟蛛Althepus christae、穴塔姆蛛Tamgrinia alveolifera、水蛛Argyroneta aquatica、唇须孔蛛Portia labiata、三突花蛛 Misumenoides formosipes或者玉翠蛛Siler semiglaucus。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述显微注射使用注射针将所述sgRNA和Cas9核酸内切酶导入蜘蛛受精卵中。

4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述注射针通过拉针仪拉制玻璃毛细管获得，所述拉针仪为P-97程控水平微电极拉制仪；所述玻璃毛细管的型号为Sutter BF100-50-10。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述sgRNA和Cas9核酸内切酶混合后一同注射到受精卵中；所述sgRNA的注射浓度为100ng/μL-400ng/μL；

所述Cas9核酸内切酶的注射浓度为300ng/μL-400ng/μL。