CN103267747A

CN103267747A - 一种用于真核表达中快速鉴定重组病毒粒子产生的方法

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Publication number: CN103267747A
Application number: CN2013101328042A
Authority: CN
Inventors: 李国辉; 王鹏; 胡朝阳
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2013-08-28

Abstract

本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及一种用于真核表达中快速鉴定重组病毒粒子产生的方法，该方法是利用真核表达载体Ac-Bacmid为分子载体，该分子载体ac68基因3'端120-bp被egfp基因表达盒和串联的Cm表达盒替换，构建整合表达egfp的整合型重组杆粒，通过脂质体的介导将整合型重组杆粒转染昆虫细胞后，通过绿色荧光可视化信号来直接监测芽生型病毒粒子产生的情况。本发明通过观察绿色荧光蛋白信号来快速判定转染的sf-9昆虫细胞中是否产生重组芽生型病毒粒子BV，进而为转座到Ac-Bacmid上外源靶基因的表达以及其后续功能研究提供基础。

Description

一种用于真核表达中快速鉴定重组病毒粒子产生的方法

技术领域

本发明将绿色荧光蛋白介导到真核表达系统中，属于生物化学与分子生物学领域。具体而言，特指体外构建重组杆状病毒穿梭载体(Ac-Bacmid)时在ac68基因位点引入绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达盒，通过观察绿色荧光蛋白信号来快速判定转染的sf-9昆虫细胞中是否产生重组芽生型病毒粒子BV，进而为转座到Ac-Bacmid上外源靶基因的表达以及其后续功能研究提供基础。

背景技术

杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)是一种真核表达系统，现已广泛用于外源靶基因的表达和高效价疫苗的生产中，实践表明该表达系统在外源蛋白的生产过程中具有以下优势(i)表达产物具有正确的折叠构象和翻译后修饰；(ii)可以同时表达多个外源基因或外源DNA大片段；(iii)只特异性地感染无脊椎动物，对于人类是一种安全的表达系统(iv)外源基因在多角体或P10强启动子的驱动下，其表达产量较高。自1983年利用该系统成功地表达出人干扰素-β(IFN-β)（Smith et al.,Mol Cell Biol,1983,3:2156-2165)以来，包括白介素1-3(IL-1,IL-2,IL-3)(Wang et al.,Gene,1994,145:273-277;Gujar and Michalak,2006,Vet ImmunolImmunopathol,15,112:183-198;DiFalco et al.,1997,J Biotechnol,56:49-56)等众多外源蛋白都已成功地在该系统中获得表达，另外；通过该系统能够同时表达病毒的多个结构蛋白，可用来研究病毒样颗粒(VLP)的自我组装动态过程。到目前为止，爱滋病毒(HIV)；单纯疱疹病毒(HSV)；人乳头状瘤病毒(HPV)；多瘤病毒(PY)；细小病毒；传染性粘液囊病毒(IBD)；丙型肝炎病毒(HCV)；肠道病毒71(EV71)；SARS冠状病毒(SARS-CoV)，这些病毒的结构蛋白在BEVS中都成功地获得表达并组装成病毒样颗粒状(VLP)的结构(Hu,2005,Acta Pharmacol Sin,26:405-416)，进而为研发这些病毒的高效价基因工程疫苗提供实验基础。为此，BEVS以其独有的特点和优势，越来越广泛地被应用到功能蛋白和高效价疫苗的表达和生产研究中。

作为广泛使用的一种表达系统，BEVS在生产实践中的应用已有近三十年的历程，而表重组病毒粒子的制备是该系统表达外源蛋白流程中最关键的。传统重组杆状病毒的构建流程：首先构建携带有靶基因的重组转移质粒，将其与苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组DNA共转染昆虫sf-9细胞，通过同源重组在转染的细胞内产生重组病毒，但重组交换率仅为0.1%，并且需要多轮空斑筛选才能获得目的重组病毒，其技术操作繁琐、耗时长：仅鉴定与纯化重组病毒就要耗费一个多月，并且还极易出现假阳性。1993年Luckow等(Luckowet al.,J Virol,1993,67:4566-4579)构建了一种高效、快速的杆状病毒-昆虫表达系统。该系统由供体质粒(donor plasmid)和大肠杆菌DH10Bac组成，DH10Bac中含有Ac-Bacmid杆粒和位点特异性转座发生所需要的辅助质粒。Ac-Bacmid基因组大小为134kbp以上，因此外源基因不能通过酶切、连接的方式与Ac-Bacmid进行重组，而必须先将靶基因连接到供体载体/转移载体上，将构建的重组质粒转化大肠杆菌DH10B，在辅助质粒提供的转座酶作用下，供体质粒上Tn7R-Tn7L间的DNA片段就可以通过转座插入到Ac-Bacmid特定位点上，以上这些实验操作都在大肠杆菌中完成的。从大肠杆菌DH10B中抽提重组Ac-Bacmid，并将其转染昆虫细胞，随后进入细胞内的Ac-Bacmid就可以复制、表达并装配成子代病毒，该系统重组率高，操作简单、不需进行空斑纯化，只需7～10天即可构建重组病毒。富集细胞培养上清中高滴度的病毒液感染昆虫细胞，以及优化靶基因的表达条件，使多角体启动子控制下的靶基因得到高表达，通过对靶蛋白进行Western blot鉴定，就完成了靶基因在BEVS中表达的整个流程。由此可以看出，通过对这些技术上的改进，以及细胞培养和转染所需试剂的商品化，都极大地简化了重组病毒构建的整个技术流程，缩短了靶基因在BEVS中表达所需要的时间，从而使得BEVS越来越完善并大众化。据统计，通过BEVS已成功表达了数千种外源蛋白，该表达系统的日益成熟为蛋白结构和功能的研究奠定了坚实的基础。

尽管这样，重组蛋白的快速表达仍然是目前制约蛋白功能与其结构研究的一个瓶颈。Ac-Bacmid在大肠杆菌中是以低拷贝复制的，只有10%甚至更低的sf-9细胞会被脂质体介导的Ac-Bacmidc成功转染，其转染效率较低，因此对Ac-Bacmid是否成功转染昆虫sf-9细胞产生了重组病毒粒子，是靶蛋白成功表达、纯化以及其功能分析的一个重要前提条件。绿色荧光蛋白(EGFP)是一种可视化信号分子，其已广泛应用于靶蛋白的胞内定位以及与其它蛋白相互作用的研究中，而本申请专利将绿色荧光蛋白的应用拓展到真核表达系统中，通过观察胞内产生以及扩散的荧光信号有利于迅速判定脂质体介导Ac-Bacmid转染发生以及具有感染性芽生型病毒粒子BV产生的情况。另外，研究表明Ac-Bacmid上的一些基因缺失并不影响病毒BV的形成和其感染力，已报道的有杆状病毒几丁质酶基因(chitinase)和组织蛋白酶基因(v-cathepsin)，它们相应的表达产物与被感染的宿主组织液化有关，这两个基因缺失并不影响芽生型病毒BV粒子的形成，并能延迟被感染的宿主细胞裂解时间(Hawtin et al.,Virology,1997,238:243–253)。另外，也有研究报道表明ac68基因也是病毒增殖的非必须基因，该基因缺失不会影响芽生型病毒粒子BV的产生以及芽生型病毒粒子BV的感染能力(Nie et al.,J Virol,2012,86:3985-3994)。以往在BEVS表达外源基因的实验过程中，通过Western blot没有鉴定到靶蛋白的表达，我们就会怀疑实验设计和实验过程中的每个步骤，尤其是重组Ac-Bacmid转染是否成功，反复通过RT-PCR和Western blot等技术来检查实验中的每个步骤，耗时、耗力、而且还浪费试剂。由此可以看出，产生感染性的重组病毒粒子不仅关系到靶基因在BEVS中能否成功表达，同时也是一些外源基因在BEVS中难表达或不能表达的一个重要判定依据。为此，本发明通过同源重组将构建的两个串联表达盒（EGFP表达盒和Cm表达盒）替换ac68基因，从而借助绿色荧光可视化信号来鉴定带有EGFP表达盒的Ac-Bacmid的转染情况，进而快速判断转染的昆虫细胞内病毒基因组表达以及病毒增殖的情况，为利用该表达系统高效地表达外源基因奠定坚实的科学基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：建立重组Ac-Bacmid转染sf-9细胞是否成功产生重组病毒粒子的分析手段。构建用于与Ac-Bacmid发生同源重组的四连体片段

氯霉素和egfp两个表达盒通过同源重组替换ac68基因中待敲除的一段DNA片段，通过氯霉素抗性平板筛选重组克隆，并对这些重组克隆进行PCR验证；从大肠杆菌中提取验证后的重组Ac-Bacmid，通过脂质体的介导将其转染sf-9细胞，然后对转染后的细胞进行96h连续荧光显微观察，由此可方便、快速、准确地判定出重组Ac-Bacmid转染sf-9细胞后产生可感染性的病毒粒子情况；解除制约“重组Ac-Bacmid在sf-9细胞中的转染效率低，转染是否成功”判定依据难的瓶颈，建立使外源基因在改造后的新颖BEVS系统中实现快速表达。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种用于真核表达中快速鉴定重组病毒粒子产生的方法，是利用真核表达载体Ac-Bacmid为分子载体，该分子载体ac68基因3'端120-bp用串联的Cm基因表达盒和egfp基因表达盒替换，构建整合表达egfp的整合型重组杆粒，通过脂质体的介导将整合型重组杆粒转染昆虫细胞后，通过绿色荧光可视化信号来直接监测芽生型病毒粒子产生的情况。

所述egfp基因表达盒是和Cm表达盒串联排列的。

本发明还公开了用于上述方法的整合表达egfp的整合型重组杆粒，它通过下述方法构建：利用真核表达载体Ac-Bacmid为分子载体，通过同源重组用egfp基因表达盒替换该分子载体ac68基因3'端120-bp，构建整合表达egfp的整合型重组杆粒。

附图说明

图1.重组质粒

的构建流程示意图。

图2.对构建的重组质粒

进行PCR和酶切鉴定。1:对

进行KpnI/PstI双酶切（产物为和酶切后的载体片段）；2:特异性PCR扩增产物

片段；3:对

进行Pst I/Hind III双酶切(产物为和酶切后的载体片段)；4:特异性PCR扩增产物

片段；5:对

进行Kpn I/Hind III双酶切(产物为

和酶切后的载体片段);6:特异性PCR扩增产物

片段；对鉴定正确的重组质粒进行序列测定，其结果表明：

序列与理论序列完全一致，可用于下一步Ac-Bacmid中ac68基因的敲除实验中。

图3.表达盒替换ac68基因3'端120-bp的流程示意图和PCR鉴定。A：通过ET-重组对Ac-Bacmid中的ac68基因进行敲除并插入

表达盒；B:不同的引物分别在野生型和缺失型的Ac-Bacmid上所对应的位置；C:分别在以野生型和缺失型的Ac-Bacmid为模板，对不同的引物对所扩增的PCR产物进行琼脂糖电泳分析。

图4.构建的重组pAc-Bacmid转染sf-9细胞以及转染后的病毒上清感染sf-9细胞后的荧光显微观察。

具体实施方式

实验材料SnaBI、BamH I、Kpn I、Hind III、T₄DNA ligase、Taq酶，pMD18-T载体均购至宝生物工程（大连）有限公司，PCR引物合成和序列测定由上海生工生物工程公司完成，pUC18-Cm(Tang et al.,J Invertebr Pathol,2013,113:70-77)杆粒Ac-Bacmid、质粒pFastHTB购自Invitrogen公司，质粒抽提试剂盒和切胶回收试剂盒购自Omega公司，egfp基因和大肠杆菌菌株DH5α为本实验室保存，L-arabinose、卡那霉素、氨卞青霉素和氯霉素购自Sigma公司，其它试剂均为国产分析纯。

本发明中的文字外框线是表示基因盒，仅为了便于理解，其命名与无外框线的含义相同。

实施例1.重组质粒

的构建

通过Primer Premier5.0软件设计两条特异性引物IE1-F-:5'-TACGTAGTAGGTTATTGATAAAATGA-3'(SnaBI)(SEQ ID NO.1)和IE1-R:5'-GGATCCAGTCACTTGGTTGTT-3'(BamH I)(SEQ ID NO.2)，从杆状病毒AcMNPV基因组中扩增ie1早期启动子：长度为579bp的DNA片段，将扩增的DNA片段连接到pMD18-T载体上并对其测序，将序列测定正确的DNA片段亚克隆到pFastHTB载体上产生重组质粒：pFastHTB-ie1；通过特异性引物EGFP-F:5'-GGATCCATGGTGAGCAAGGGC-3'(BamHI)(SEQ ID NO.3)和EGFP-R:5'-GGTAC CTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'(KpnI)(SEQ ID NO.4)扩增egfp基因序列全长，将扩增的目的片段与pMD18-T载体进行连接，对测序正确的目的片段亚克隆到pFastHTB-ie1载体上，对产生的重组质粒命名为：

如图1所示，以Ac-Bacmid为模板，通过特异性引物ac68D-F:5'-GGGCATGCATGTTGCAGCAAAAATTAAAT-3'(SphI)(SEQ ID NO.5)和ac68D-R:5'-TAAAGCTTGGCAAATTAAAATTAGCTG CGT-3'(Hind III)(SEQ ID NO.6)扩增ac68基因待敲除的下游DNA片段：长度为528bp的ac68-D，将(SphI/HindIII)双酶切后纯化回收的ac68-D片段，与经过同样双酶切后的载体pFastBacHTB进行连接，产生重组质粒pFastBacHTB-D；通过特异性引物IE1-F:5'-AACTGC AGTAGGTTATTGATAAAATGAACGGA-3'(PstI)(SEQ ID NO.7)和EGFP-R:5'-AAGCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3'(SphI)(SEQ ID NO.8)从构建好的

中扩增长度为1299bp的egfp表达盒，将(pstI/SphI)双酶切后纯化回收的egfp表达盒DNA片段，与经过同样双酶切后的载体pFastBacHTB-D进行连接，产生重组质粒

通过特异性引物ac68U-F:5'-CGGGTACCTTCTTCCATGTCTTTGAAAGATTGC-3'(KpnI)(SEQ ID NO.9)和ac68U-R:5'-CGGGATCCATTAACATTGACCGTTTGATCGT-3'(BamHI)(SEQID NO.10)从Ac-Bacmid扩增553bp的ac68-U，对扩增产物进行BamH I和Kpn I双酶切，将酶切回收后的DNA片段与同样双酶切后的pUC18-Cm进行连接，产生重组质粒pUC18-U-Cm；通过对重组质粒

进行Pst I和Hind III双酶切，将纯化回收后的DNA片段

与经同样双酶切后的pUC18-U-Cm载体进行连接，产生的重组质粒命名为

上述PCR反应中：所需的模板杆状病毒AcMNPV基因组和egfp基因均保存于本实验室；pMD18-T载体购自TaKaRa公司，pFastHTB载体购自Invitrogen公司。

实施例2.重组质粒

的鉴定

通过对构建的

进行KpnI/PstI双酶切，产物为和酶切后的载体片段，通过PCR特异性扩增

片段；对

进行Pst I/Hind III双酶切，产物为

和酶切后的载体片段，通过PCR特异性扩增

片段；通过对

进行Kpn I/Hind III双酶切，产物为

和酶切后的载体片段，通过PCR特异性扩增

片段；对这些酶切后的产物和相应的PCR产物进行电泳分析，如图2，结果表明PCR产物与酶切后的产物位于同一水平线上，对鉴定正确的重组质粒进行序列测定，其结果表明：测定的

通过KpnI/Hind III对重组质粒

进行双酶切，对酶切回收后的

四连体片段进行定量。

实施例3.

串联表达盒替换Ac-Bacmid上ac68基因3'端120-bp的DNA片段

将低温保存的大肠杆菌DH10B（含有Ac-Bacmid和pBAD-gbaA质粒）划线至新鲜配置的含Amp和Kan抗性的LB平板上，37℃倒置培养48h。从平板上挑取单克隆菌落于3ml含Amp和Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、245rpm摇床中培养过夜，次日转接1ml菌液至100ml含Amp和Kan抗性的LB液体无盐培养基中，37℃剧烈振荡培养。当培养的菌液OD₆₀₀达到0.2～0.3值时，直接往100ml LB液体无盐培养基添加0.1g L-arabinose粉末，摇匀使其充分溶解在培养基中，继续培养45-60min使菌液OD₆₀₀达到0.4-0.5。将培养物冰浴15-30分钟，然后于4℃、7,000rpm离心10min，收集菌体，沉淀用预冷的10%甘油洗三遍。获得的菌体悬浮于200μl10%甘油中，分装成50μl/管，放置在冰上备用。

取2μg回收的

线性片段与50μl感受态DH10B混合，冰上放置5min，转入预冷的0.2cm的电激杯(BIO-RAD)，用BIO-RAD电穿孔仪电激，参数为2.3kV、25μF、200Ω，电激时间在5ms左右。电激后立即向电激杯中加入800μl SOC液体培养基，于37℃振荡培养1h，涂布于K⁺A⁺Cm⁺(50μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨卞青霉素、25μg/ml氯霉素)抗性平板上，于37℃温箱中培养36～48h，观察菌落生长情况。挑取单菌落进行培养并抽提Ac-Bacmid进行PCR鉴定，如图3所示，从而获得

表达盒替换ac68基因3'端120-bp的重组Ac-Bacmid。

上述反应中：L-arabinose购自Sigma公司，用来诱导pBAD-gbaA质粒表达同源重组酶；卡那霉素、氨卞青霉素和氯霉素购自Sigma公司。

实施例4.重组Ac-Bacmid转染sf-9细胞后的荧光显微观察

将鉴定后的重组克隆接种在含K⁺A⁺Cm⁺(50μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨卞青霉素、25μg/ml氯霉素)的LB培养基中，37℃、250～300rpm振荡培养48小时；取1.5ml菌液，12,000rpm离心1min；弃上清，沉淀用0.3ml溶液I重悬后，加0.3ml新鲜配置的溶液II，轻轻颠倒混匀，室温放置5min，溶液从浑浊变得澄清；缓慢加入0.3ml溶液III，轻轻颠倒混匀。此时有白色沉淀物产生，为蛋白质与E.coli基因组DNA的混合物；冰浴5～10min；12,000rpm离心10min，将上清移至另一含等量异丙醇的EP管内，轻轻颠倒混匀，冰浴5～10min，或者-20℃放置过夜；12000rpm离心15min；弃上清，加0.5ml70%乙醇洗涤两次，12,000rpm离心1min；弃上清，将残余的乙醇吸弃，超净台内室温干燥10min，加40μl无菌去离子水溶解DNA沉淀。

通过II(Cat.no.10362-100)脂质体的介导将重组Ac-Bacmid转染昆虫sf-9细胞，对转染24h后的细胞进行荧光显微观察，如图4所示：结果发现有单个的荧光信号散落在细胞之间，随着时间的延长，荧光信号越来越多，转染后96h，发现30%的细胞内都出现荧光信号，这些荧光信号可以有效地判定重组Ac-Bacmid转染成功，在sf-9细胞内产生了可感染性的病毒粒子；将转染后的上清再次感染sf-9细胞，荧光显微观察结果表明：感染36h后，几乎每一个细胞中都出现荧光信号，说明转染上清中的芽生型病毒粒子能再次感染细胞并产生可感染性的病毒粒子。这些结果同时也表明ac68基因位点插入egfp表达盒不会影响病毒的复制和增殖，可用作Ac-Bacmid成功转染细胞的一个有效标志，为改造后的Ac-Bacmid快速表达外源基因奠定基础。

提取Bacmid DNA所用缓冲液：

溶液I：15mM Tris-HCl(pH8.0);10mM EDTA,100μg/ml RNase A；

溶液II：0.2M NaOH；1%SDS；

溶液III：3M KAc(pH5.5)。

综上所述，利用本发明的表达系统，为重组蛋白快速表达流程中的重组病毒粒子制备提供了一种有效的鉴定方法，克服了对重组病毒粒子鉴定上的繁琐程序，为重组蛋白的快速表达提供技术上的改进，也为功能蛋白的结构和功能研究提供保证。

Claims

1.一种用于真核表达中快速鉴定重组病毒粒子产生的方法，其特征在于：利用真核表达载体Ac-Bacmid为分子载体，该分子载体ac68基因3' 端120-bp被egfp基因表达盒和串联的Cm表达盒替换，构建整合表达egfp的整合型重组杆粒，通过脂质体的介导将整合型重组杆粒转染昆虫细胞后，通过绿色荧光可视化信号来直接监测芽生型病毒粒子产生的情况。

2.按照权利要求1所述的用于真核表达中快速鉴定重组病毒粒子产生的方法，其特征在于：所述egfp基因表达盒是在来源于杆状病毒AcMNV的 ie1早期基因启动子控制下。

3.一种整合表达egfp的整合型重组杆粒，其特征在于通过下述方法构建：利用真核表达载体Ac-Bacmid为分子载体，通过同源重组用串联的Cm表达盒和egfp基因表达盒替换该分子载体ac68基因3' 端120-bp，构建整合表达egfp的整合型重组杆粒。