CN104017826A - 一种改造的家蚕杆状病毒载体及利用其提高ns1表达量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改造的家蚕杆状病毒载体，该载体是在家蚕杆状病毒载体Bm-Bacmid中，几丁质酶和半胱氨酸蛋白酶基因被串联的Cm表达盒和egfp表达盒替换。该载体中整合表达egfp基因，可用来实时监测细胞转染或感染及昆虫被感染后的情况。利用该载体，在其转座位点插入家蚕二分浓核病毒ns1基因表达盒，通过制备的重组病毒感染BmN细胞或者家蚕，可获得靶基因的表达。结果表明：该载体中缺失Chitinase和CysteinProtease基因，可延迟细胞裂解及昆虫的液化，有利于外源基因的表达，在一定程度上抑制靶蛋白的酶切，从而提高ns1基因的表达产量，为深入研究NS1蛋白结构与功能奠定坚实的基础。

Description

一种改造的家蚕杆状病毒载体及利用其提高NS1表达量的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术，公开了一种新颖的家蚕杆状病毒表达载体的构建流程及其在蛋白表达中的应用。 

背景技术

杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)通过制备携带有外源基因的重组杆状病毒，感染昆虫或昆虫细胞进行外源蛋白的表达，表达产物具有正确的空间折叠和糖基化等修饰，其生物活性接近其对应的天然产物。在BEVS中，常用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)或者家蚕核型多角体病毒(BmNPV)用作重组病毒构建的载体，而在表达外源蛋白时，我们倾向选择家蚕杆状病毒-昆虫细胞表达系统，这与我国的家蚕资源丰富及大规模养殖密切相关(Maeda et al.,Nature,1985,315:592–594)，容易获得大量的目标蛋白。家蚕杆状病毒具有容纳外源大片段DNA或同时表达多个外源基因的能力；另外，家蚕杆状病毒不感染人、畜等脊椎动物，表达外源蛋白所需时间周期也远短于动物或植物系统，可通过昆虫或细胞培养对外源蛋白进行大规模生产，这些特性使BEVS成为目前最有效、应用最广泛的一种真核表达系统(Kato et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2010,85:459-470)。 

家蚕是我国一种具有重要经济价值的昆虫，主要以桑叶为食，只需要简单的设备就可对家蚕进行大规模饲养，其生产的蚕丝是我国农业经济的重要组成部分，在改善民生和可持续发展中起着重要作用；同时，由于家蚕饲养成本低廉，在家蚕体内表达外源蛋白，所需时间较短，容易对靶蛋白进行大规模生产，是一种非常优良的生物反应器，也是实现基因工程产业化的理想载体；2009年已完成对家蚕全基因组序列的测定和分析(Xia et al.,Science,2009,326:433–436)，遗传背景清楚，有利于我们对家蚕进行遗传改造，培育出更适合外源蛋白表达的家蚕新品种。另外，Luckow等(Luckow et al.,J Virol,1993,67:4566-4579；Possee et al.,Biotechnol Bioeng,2008,101:1115–1122)建立了一种高效、快速的用来构建重组病毒的筛选体系，剔除了多轮空斑筛选的繁琐程序，提高重组病毒的阳性得率，由此，极大地简化了家蚕重组杆状病毒的构建、分离、鉴定以及定量，家蚕杆状病毒表达系统的应用由此得到了推广。自1985年利用该系统首次成功表达人干扰素-α(IFN-α)(Maeda et al.,Nature,1985,315:592–594)以来，截止到目前为止，已通过BEVS在家蚕体内成功地表达了乙型肝炎表面抗原、人酸性/碱性成细胞生长因子、荧光素酶以及纤维素酶等上千种具有重要功能的重组蛋白(Lihoradova et al.,Mol Biol,2004,38:603–607；Wu et al.,Protein Expr Purif,2001,21:192-200；Palhan et al.,Biotechniques,1995,19:97–104；Lee et al.,Biotechnol Lett,2006,28:645–650)，现 已广泛应用于重组蛋白药物的研发、疫苗生产以及重组病毒杀虫剂等系列研究领域中，在生产实践中具有广阔的应用空间和发展前景。 

尽管BEVS系统有诸多优势以及技术上的不断改进，但在实践中还是面临着一些挑战，比如在培养的昆虫细胞中表达外源蛋白，其生产成本较为昂贵(Tiwari et al.,Mol Biotechnol,2010,46:80–89)；在家蚕等昆虫体内表达外源蛋白，其成本虽然较低，但又增加了从昆虫体内分离及靶蛋白纯化的难度；BEVS系统中缺乏有效的荧光信号，难以对转染的细胞中是否产生感染性的重组病毒粒子进行快速判定，影响外源蛋白表达的进程；另外，与原核表达系统相比，BEVS表达的外源蛋白，其产量相对较低，尤其是感染后的细胞最终会裂解，致使靶蛋白的表达水平及其修饰还未达到最佳状态(Ikonomou et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2003,62:1–20)，而通过ie1早期启动子替代多角体晚期启动子可以连续表达靶源蛋白，使其糖基化修饰得到高效加工，但降低了靶蛋白的表达量(Jarvis et al.,Biotechnology,1990,8:950–955)，这些不足之处在一定程度上都限制了BEVS系统的使用。因此，为优化家蚕杆状病毒-昆虫细胞表达系统，有必要对家蚕杆状病毒穿梭载体上的一些序列进行改造，简化重组病毒粒子鉴定的方法，缩短外源蛋白表达所需时间，提高BEVS中外源蛋白的表达产量及其稳定性。 

家蚕杆状病毒基因组大小为128kb，理论预计有143个开放阅读框(Gomi et al.,J Gen Virol,1999,80:1323-1337)，其中包含有几丁质酶和半胱氨酸蛋白酶基因，这两个基因紧挨排列在一起，相互之间有48bp的间隔序列。几丁质酶基因全长1659bp，编码一个由552个氨基酸组成的蛋白质；半胱氨酸蛋白酶基因全长972bp，编码一个由323个氨基酸组成的蛋白质，研究表明几丁质酶能水解家蚕内外表皮、中肠及围食膜组织中的几丁质，促进虫体液化，而半胱氨酸蛋白酶与细胞裂解直接相关(Hawtin et al.,Virology,1997,238:243–253；Hodgson et al.,J Virol,2011,8:3918–3929)，而在家蚕体内表达的外源蛋白也经常发生降解，研究表明这与BEVS系统中的Cystein Protease(半胱氨酸蛋白酶)有关(Kadono-Okuda et al.,Biochem Biophys Res Commun,1995,213:389–396)，因此延迟细胞裂解及虫体液化的时间可提高外源蛋白的表达产量。Chitinase和Cystein Protease是家蚕杆状病毒复制的非必需基因，通过构建缺失Chitinase和Cystein Protease的病毒表达载体，获得这两种基因缺失型的病毒，可延长该病毒感染的昆虫细胞存活时间，并抑制靶蛋白的降解，从而提高外源蛋白的表达量和其稳定性。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：建立一种新颖、高效表达外源基因的家蚕杆状病毒载体(Bm-Bacmid)，并利用该载体来表达家蚕二分浓核病毒NS1蛋白，提高NS1蛋白的表达量。主要技术路线：通过酶切、连接的方式，构建氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp) 表达盒串联的重组质粒；通过同源重组，将串联的Cm表达盒和egfp表达盒替换家蚕杆状病毒载体中的Chitinase和Cystein Protease两个基因，从而获得带荧光标记的家蚕杆状病毒穿梭载体；通过转座，将多角体启动子控制的ns1基因定点插入到改造后的Bm-Bacmid中，在脂质体Cellfectin的介导下，将鉴定后的重组Bm-Bacmid转染BmN细胞，通过观察细胞中产生的绿色荧光信号，可快速判定感染性的重组病毒粒子的产生，将收集后的重组病毒上清液皮下注射4龄家蚕，从而建立了表达NS1蛋白的家蚕生物反应器体系。 

本发明所要解决的问题是通过以下技术方案来实现的： 

一种改造的家蚕杆状病毒载体，包括家蚕杆状病毒载体Bm-Bacmid，所述家蚕杆状病毒载体Bm-Bacmid中，几丁质酶和半胱氨酸蛋白酶基因被串联的Cm表达盒和egfp表达盒替换。所述的egfp表达盒是ie1早期启动子控制的egfp表达盒。 

本发明还公开了一种提高家蚕二分浓核病毒NS1蛋白真核表达产量的方法，在所述改造的家蚕杆状病毒载体转座位点，插入一个多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒ns1基因表达盒，将其转染BmN昆虫细胞，通过观察细胞中产生的绿色荧光信号，判定感染性的重组病毒粒子的产生，将收集后的重组病毒上清液皮下注射4龄家蚕，建立了表达NS1蛋白的家蚕生物反应器体系。 

本发明的方法具体是：通过构建串联有Cm表达盒和egfp基因表达盒的pUC119-US-Cm-egfp-DS重组质粒，其中US片段长度为538bp，其来源于待敲除的Chitinase基因上游序列；DS片段长度为514bp，来源于待敲除的Cystein Protease基因下游序列。以构建的pUC119-US-Cm-egfp-DS重组质粒为模板，通过PCR扩增可获得长度为3675bp的US-Cm-egfp-DS片段，将纯化的该DNA片段转化含有Bm-Bacmid的大肠杆菌DH10B感受态细胞，涂布在氯霉素和卡那霉素抗性平板上，通过多轮PCR对平板上的重组克隆进行验证；利用酶切、连接的方法构建供体质粒pFastHTB-ns1，在转座酶的作用下，该供体质粒与改造后的Bm-Bacmid载体间发生转座，从而获得可表达ns1基因的重组Bm-Bacmid穿梭载体，将其转染家蚕BmN细胞，对转染后的细胞进行荧光显微连续观察，可确定转染上清溶液中是否已产生重组病毒粒子，收集转染后的病毒上清溶液，对4龄家蚕进行皮下注射，通过观察绿色荧光来监测病毒在家蚕体内增殖的情况，建立高效表达NS1蛋白的家蚕生物反应器体系，为深入研究NS1蛋白的结构与功能提供基础。 

所述Cm基因表达盒与egfp基因表达盒是串联排列的。 

本发明公开了缺失Chitinase和Cystein Protease基因的家蚕穿梭载体，利用该分子载体，构建整合表达ns1基因的整合型重组杆粒，通过对转染后的BmN细胞、及皮下注射重组病毒 的家蚕体内荧光进行观察，可作为重组病毒粒子BV增殖及NS1蛋白在家蚕体内表达的情况的一个判定依据。 

本发明：家蚕杆状病毒穿梭载体中缺失几丁质酶(Chitinase)和半胱氨酸蛋白酶(Cystein Protease)基因，缺失位点插入了串联的Cm基因表达盒和egfp表达盒：Cm基因表达盒用于对目的片段缺失的筛选和鉴定，egfp表达盒可用于转染与感染的情况判定。 

利用该改造的家蚕杆状病毒载体表达NS1蛋白，其重组病毒感染昆虫细胞后，由于几丁质酶(Chitinase)和半胱氨酸蛋白酶(Cystein Protease)基因的缺失，延迟细胞裂解及昆虫液化的时间，提高了昆虫或昆虫细胞中NS1蛋白的表达产量。 

本发明将串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒取代家蚕杆状病毒穿梭载体中的几丁质酶(Chitinase)和半胱氨酸蛋白酶基因(Cystein Protease)，通过转座将家蚕二分浓核病毒ns1基因定点插入到改造后的家蚕穿梭载体中，制备缺失Chitinase和Cystein Protease基因、多角体启动子控制下的ns1基因重组病毒；同时制备未缺失Chitinase和Cystein Protease基因、多角体启动子控制下的ns1基因的重组病毒，对它们感染细胞后的NS1蛋白量进行比较分析，发现缺失型病毒感染的细胞中靶蛋白表达量是对照组的3倍，从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法，为该蛋白的结构与功能研究奠定基础，同时为有效表达其它功能基因提供技术策略上的参考。 

附图说明

图1.重组质粒pUC119-US-Cm-egfp-DS的构建流程示意图。 

图2.重组质粒pUC119-US-Cm-egfp-DS的鉴定。 

1：通过US-F/US-R引物对扩增长度为551bp的US片段，扩增结果与理论预计一致；2:通过Cm-F/Cm-R引物对扩增长度为1079bp的Cm表达盒，扩增结果与理论预计一致；3:通过egfp-F/egfp-R引物对扩增长度为1544bp的egfp表达盒，扩增结果与理论预计一致；4:通过DS-F/DS-R引物对扩增长度为514bp的DS片段，扩增结果与理论预计一致；5:通过US-F/Cm-R引物对扩增长度为1630bp的US+Cm片段，扩增结果与理论预计一致；6:通过US-F/egfp-R引物对扩增长度为3174bp的US+Cm+egfp片段，扩增结果与理论预计一致；7:通过US-F/DS-R引物对扩增长度为3688bp的US+Cm+egfp+DS片段，扩增结果与理论预计一致；8:通过Cm-F/egfp-R引物对扩增长度为2623bp的Cm+egfp片段，扩增结果与理论预计一致；9:通过Cm-F/DS-R引物对扩增长度为3137bp的Cm+egfp+DS片段，扩增结果与理论预计一致；10:通过egfp-F/DS-R引物对扩增长度为2058bp的egfp+DS片段，扩增结果与理论预计一致。 

上述PCR扩增体系中，均用重组质粒pUC119-US-Cm-egfp-DS作为DNA模板。 

图3.缺失型重组Bm-Bacmid的构建流程示意图和PCR鉴定。 

A：通过同源重组对Bm-Bacmid进行改造，使串联的Cm和egfp基因表达盒替换Chitinase和Cystein Protease基因中的部分DNA片段；B:在野生型和缺失型的Bm-Bacmid上标识引物所对应的具体位置；C:以不同的引物对，从野生型和缺失型Bm-Bacmid中进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1,3,5,7,9：以缺失型Bm-Bacmid为模板，分别通过Cm-F/Cm-R扩增Cm基因表达盒、egfp-F/egfp-R扩增egfp基因表达盒、Cm-F/egfp-R扩增Cm与egfp基因表达盒、US-F/Cm-R扩增US与Cm表达盒，以及US-F/DS-R扩增包括US、Cm表达盒、egfp基因表达盒与DS四个DNA片段，所有的扩增产物与理论序列长度都一致；泳道2,4,6,8,10：以野生型Bm-Bacmid为模板，以Cm-F/Cm-R、egfp-F/egfp-R、Cm-F/egfp-R、US-F/Cm-R及US-F/DS-R为引物对进行扩增，扩增产物(用作阴性对照)与理论预计相一致。 

图4.缺失型重组Bm-Bacmid转染及感染BmN细胞后的荧光显微观察。 

A：将缺失Chitinase和Cystein Protease基因的重组杆粒pBm-Bacmid转染BmN细胞，对其在不同时间点进行荧光显微观察；B：将缺失Chitinase和Cystein Protease基因的重组病毒vBm-Bacmid感染BmN细胞，对其在不同时间点进行荧光显微观察。 

图5.利用改造后的重组Bm-Bacmid构建表达ns1基因的重组穿梭杆粒 

泳道1：以未发生转座的Bm-Bacmid为模板，以M13-F/M13-R引物对进行扩增，PCR产物大小理论长度为283bp；泳道2：以转座后的Bm-Bacmid为模板，以M13-F/M13-R引物对进行扩增，PCR产物大小理论长度为3381bp。 

图6.重组病毒粒子感染后的家蚕表型观察及家蚕体内表达的NS1蛋白鉴定。 

A：将重组病毒粒子皮下注入家蚕体内，观察其个体的生长情况；1，感染了野生型BmNPV的家蚕个体；2，感染了野生型病毒(不缺失Chitinase和Cystein Protease基因，表达NS1蛋白)的家蚕个体；3，感染了缺失型重组病毒(缺失Chitinase和Cystein Protease基因，表达NS1蛋白)的家蚕个体。B：通过Western blot对三种病毒感染后的家蚕血液NS1蛋白产量进行半定量分析。泳道1，空白对照；泳道2，重组表达NS1的野生型病毒感染家蚕后，其血液中NS1的鉴定；泳道3，重组表达NS1的缺失型病毒感染家蚕后，其血液中NS1的鉴定。 

具体实施方式

实验材料HindⅢ、PstI、Xba I、SacI、T₄DNA ligase、Taq酶和pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，引物合成和序列测定由上海生工生物工程公司完成，pUC18-Cm (Tang et al.,J Invertebr Pathol,2013,113:70-77)、家蚕穿梭载体Bm-Bacmid、pFastHTB质粒及DH10B菌株(Invitrogene公司)、pUC119质粒和大肠杆菌菌株DH5α(TaKaRa公司)、pFastHTB-P_ie1-egfp-sv40(Li et al.,生物工程学报，2014,30(4):625-635)本实验室保存， II(Cat.no.10362-100)购自Invitrogen公司，抽提质粒的试剂盒和切胶回收的试剂盒(Omega公司)，卡那霉素、氨卞青霉素、氯霉素庆大霉素和四环素购自Sigma公司，其它试剂均为国产分析纯。 

实施例1.重组质粒pUC119-US-Cm-egfp-DS的构建 

利用Primer Premier5.0软件设计四对特异性引物。首先，通过US-F:5'-GCAAGCTTCGTA TGCGTTTTGCTCGT-3'(HindⅢ)(SEQ ID NO.1)和US-R:5'-AACTGCAGCGCGCCAAGTTGG AACT-3'(PstI)(SEQ ID NO.2)两条特异性引物，从家蚕杆状病毒基因组中特异性扩增538bp特异性的US片段，将纯化后的DNA片段与经过同样双酶切的pUC119质粒进行连接，获得重组质粒pUC119-US；通过Cm-F:5'-AACTGCAGCTTCGAATAAATACCTGTGA-3'(PstI)(SEQ ID NO.3)和Cm-R:5'-AATCTAGAAACCAGCAATAGACATAAGC-3'(XbaI)(SEQ ID NO.4)引物对，从pUC18-Cm质粒中扩增长度为1039bp的Cm基因表达盒，将PstI和XbaI双酶切后的Cm基因表达盒与经过同样双酶切的pUC119-US进行连接，获得重组质粒pUC119-US-Cm；通过egfp-F:5'-GCTCTAGAGTAGGTTATTGATAAAATGAAC-3'(XbaI)(SEQ ID NO.5)和egfp-R:5'-CGAGCTCGATCCAGACATGATAAGATACATTG-3'(SacI)(SEQ ID NO.6)引物对，从pFastHTB-P_ie1-egfp-sv40质粒中扩增长度为1544bp的egfp基因表达盒，将XbaI与SacI双酶切后的egfp基因表达盒与经过同样双酶切的pUC119-US-Cm进行连接，获得重组质粒pUC119-US-Cm-egfp；通过DS-F:5'-GCGAGCTCGGAATTGATTAATCTGTCG-3'(SacI)(SEQ ID NO.7)和DS-R:5'-AGAGCTCAGCAGTAGACGCAAGTTCG-3'(SacI)(SEQ ID NO.8)引物对，从家蚕杆状病毒基因组中扩增514bp特异性的DS片段，将SacI酶切的DS片段与SacI酶切的pUC119-US-Cm-egfp载体进行连接，由于DS片段两端都是SacI酶切位点，该片段可以正向或者反向的形式同时与pUC119-US-Cm-egfp连接，因此挑取平板上的克隆进行测序，对正向连接的重组质粒命名为pUC119-US-Cm-egfp-DS(如图1所示)。 

实施例2.重组质粒pUC119-US-Cm-egfp-DS的鉴定 

由于该重组质粒中具有复杂的酶切位点，通过多轮PCR对该重组质粒进行鉴定(如图2所示)。泳道1:US-F/US-R引物对扩增US，产物长度为551bp；泳道2:Cm-F/Cm-R引物对扩增Cm基因表达盒，产物长度为1079bp；lane3:egfp-F/egfp-R引物对扩增egfp表达盒，产物长度为1544bp；泳道4:DS-F/DS-R引物对扩增DS片段，产物长度为514bp；泳道5: US-F/Cm-R引物对扩增US-Cm，产物长度为1630bp；泳道6:US-F/egfp-R引物对扩增US-Cm-egfp，产物长度为3174bp；lane7:US-F/DS-R引物对扩增US-Cm-egfp-DS，产物长度为3688bp；泳道8:Cm-F/egfp-R引物对扩增Cm-egfp，产物长度为2623bp；lane9:Cm-F/DS-R引物对扩增Cm-egfp-DS，产物长度为3137bp；泳道10:egfp-F/DS-R引物对扩增egfp-DS，产物长度为2058bp。 

上述PCR反应中，所用DNA模板均为重组质粒pUC119-US-Cm-egfp-DS。 

实施例3.将串联的Cm与egfp基因表达盒整合到家蚕Bm-Bacmid中 

通过US-F/DS-R对鉴定的重组质粒pUC119-US-Cm-egfp-DS进行PCR扩增，获得四联体目的片段US-Cm-egfp-DS，取5ng纯化的扩增产物，转化捕获有家蚕穿梭载体Bm-Bacmid的大肠杆菌DH10B感受态细胞中，理论上在同源重组酶的作用下，US-Cm-egfp-DS与家蚕穿梭载体Bm-Bacmid中的Chitinase和Cystein Protease基因发生双交换，获得Chitinase和Cystein Protease基因缺失型的Bm-Bacmid，同时，在缺失的Chitinase和Cystein Protease基因位点插入了串联的Cm-egfp基因表达盒。通过添加有K⁺A⁺Cm⁺(50μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨卞青霉素、25μg/ml氯霉素)三种抗生素的平板对重组Bm-Bacmid进行初筛，对平板上的克隆进行培养并抽提其重组Bacmid，利用不同的引物对对其进行多轮PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩曾产物进行分析(如图3C所示)，该结果证实了Cm-egfp基因表达盒取代了Chitinase和Cystein Protease基因中的部分DNA片段，获得了这两个基因的缺失重组杆粒。 

实施例4.Chitinase和Cystein Protease基因缺失对病毒增殖的影响 

为鉴定缺失Chitinase和Cystein Protease基因的家蚕重组杆粒，是否会影响病毒粒子的产生。抽提Chitinase和Cystein Protease基因缺失的家蚕重组杆粒，通过脂质体II(Cat.no.10362-100)的介导，使其进入BmN细胞。对转染后的细胞进行荧光显微观察，结果表明：转染24h后，有散落的绿色荧光分布在细胞之中，随着时间的延长，在细胞中分布的绿色荧光信号越来越多，在转染96h后，80％的视野中都布满了荧光信号(如图4A所示)。 

为鉴定在细胞上清中产生的病毒粒子是否具有感染能力，收集转染96h后的细胞上清，将其与BmN细胞孵育1h，吸掉培养细胞的上清，添加完全培养基，通过荧光显微对其进行连续观察，结果表明：感染24h后，能观察到绿色荧光，且均匀分布在细胞之中，随着时间的延长，绿色荧光信号越来越多，至感染96h后，整个视野中都布满了绿色荧光(如图4B所示)，说明细胞上清中的病毒粒子具有感染性，能启动第二轮感染。由此说明，缺失Chitinase和Cystein Protease两个基因的家蚕杆粒，能够在转染的BmN细胞中产生具有感染性的病毒粒子。因此，以该缺失型杆粒作分子载体，可构建高效表达外源基因的重组病毒。 

实施例5.利用改造后的重组Bm-Bacmid制备表达ns1基因的重组病毒 

利用Primer Premier5.0软件设计ns1-F:5'-ATGAATTCATGGAATCGAAGT CAAATTT-3'(EcoR I)(SEQ ID NO.9)和ns1-R:5'-TACTCGAGCTACCCATAATATTTATTATATACG-3'(Xho I)(SEQ ID NO.10)，通过ns1-F和ns1-R从家蚕二分浓核病毒基因组中扩增ns1基因片段，对PCR扩增的目的片段进行EcoR I与Xho I双酶切，将纯化后的酶切片段与经过同样双酶切的pFastHTB进行连接，获得重组供体质粒pFastHTB-ns1,通过转座，将多角体启动子控制的ns1基因表达盒定点插入到改造后的家蚕Bm-Bacmid转座位点中。将100μl的悬液涂布于含三抗K⁺T⁺G⁺(50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素、7μg/ml庆大霉素)以及添加有40μg/ml IPTG和20mg/ml X-gal的LB培养基平板上，在37℃的烘箱中对其培养36～48h，对平板上较大的白色单菌落进行PCR鉴定(如图5所示)，从而获得能整合性表达ns1基因的重组Bm-Bacmid。 

实施例6.制备整合型表达ns1的重组病毒粒子及感染的家蚕体内NS1蛋白的表达 

从DH10B大肠杆菌中抽提上述鉴定后的重组Bm-Bacmid，通过脂质体的介导，将其转染贴壁培养的BmN细胞，对转染后的细胞进行荧光显微观察，对能观察到绿色荧光的转染孔做好标记，转染96h后，收集这些转染孔中的细胞培养上清；将收集的转染上清感染贴壁培养的BmN细胞，对感染后的细胞进行荧光显微观察，可进一步证实收集的上清中有感染性的重组病毒粒子，收集感染96h后的细胞培养上清，从而提高上清溶液中的病毒滴度。 

对4龄家蚕(306品系，易感品种)从皮下注射5μl的病毒上清溶液，共注射50头易感品系家蚕；以不表达ns1基因的野生型病毒(不缺失Chitinase和Cystein Protease基因)和整合表达ns1基因的野生型病毒分别注射家蚕作为对照，每组对照共注射50头，每天以新采摘的桑叶对它们进行喂饲，在27℃的室温条件下进行生长，6天后，发现不表达ns1基因的野生型病毒及整合表达ns1基因的野生型病毒，感染后的家蚕有明显的感染症状，食欲较差、体型相对偏小；而整合表达ns1基因的缺失型病毒感染的家蚕食欲较好，体型偏大。通过体式荧光显微镜对整合表达ns1基因的病毒感染的家蚕进行荧光观察，发现感染的家蚕整个体表都呈绿色，表明家蚕体内已感染整合有目的基因的重组病毒，并通过再次感染遍及家蚕的所有组织，对感染后的家蚕血液总蛋白进行Western blot分析，结果表明：缺失了Chitinase和Cystein Protease基因的重组病毒感染的家蚕血液中，其NS1的表达量是野生型病毒感染的家蚕靶蛋白表达产量的3倍(如图6B所示)。 

综上所述，通过同源重组技术，使串联的Cm基因表达盒和ie1早期启动子控制的egfp表达盒替换Chitinase和Cystein Protease，从而创建一种新颖、高效的外源基因表达载体，利用该载体可制备外源基因表达的重组病毒，与不缺失Chitinase和Cystein Protease的野生型病毒比较，该缺失型重组病毒可通过延迟细胞裂解时间及昆虫液化时间，确实有效地提高了ns1基因在感染的细胞及昆虫体内的表达量，为NS1蛋白的功能与结构研究奠定基础，同时也为大 规模表达其它功能蛋白提供参考。 

Claims (3)

1. 一种改造的家蚕杆状病毒载体，包括家蚕杆状病毒载体Bm-Bacmid，其特征在于，所述家蚕杆状病毒载体Bm-Bacmid中，几丁质酶和半胱氨酸蛋白酶基因被串联的Cm表达盒和egfp表达盒替换。

2.根据权利要求1所述改造的家蚕杆状病毒载体，其特征在于，所述的egfp表达盒是ie1早期启动子控制的egfp表达盒。

3.利用权利要求1所述家蚕杆状病毒载体提高NS1表达量的方法，其特征在于，在所述改造的家蚕杆状病毒载体转座位点，插入一个多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒ns1基因表达盒，将其转染BmN昆虫细胞，制备重组的芽生型BV病毒粒子，将该重组病毒感染BmN细胞或者家蚕，可提高靶蛋白NS1的表达产量。