CN108148839A - 家蚕30k蛋白19g1基因启动子lp19及其表达载体和应用 - Google Patents

家蚕30k蛋白19g1基因启动子lp19及其表达载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19，启动子核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；并提供了其表达载体pFBDM‑LP19‑Fluc‑IG和应用；表达载体通过转座的方式，利用asd缺失型rSW106‑inv菌感染Sf9细胞和BmN细胞获得重组杆状病毒，将重组病毒分别重新感染Sf9细胞和家蚕幼虫后，通过荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶的活性。本发明的有益效果为：本发明提供的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用，证实了启动子LP19可在Sf9昆虫细胞和家蚕幼虫中驱动外源基因进行表达，丰富了昆虫—杆状病毒表达系统中基因启动子的选择，为LP19启动子在杆状病毒表达外源蛋白中的应用提供依据；表明LP19启动子在杆状病毒表达系统生产重组药物、疫苗等方面，具有良好的应用潜力。

Description

家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用。
背景技术
昆虫基因启动子是位于结构基因5'端上游的能与RNA聚合酶结合并启动转录的一段特定DNA序列。该序列在昆虫基因的表达调控中起着关键作用：决定着下游基因转录的特异性、方向和效率。此外，昆虫基因启动子在构建外源基因的表达载体的过程中具有重要作用，它决定了外源基因表达的时空顺序、表达强度、转录效率和基因的表达水平。所以，研究昆虫启动子的功能对于基因的表达调控机制和昆虫基因工程技术的发展具有十分重要的科学意义。
研究表明昆虫基因启动子存在多种特征元件，通过与RNA聚合酶识别、结合，从而启动目的基因的转录过程。昆虫基因启动子具备真核生物启动子的典型特征，一般具有以下结构：(1)转录起始位点：通常位于翻译起始密码子(AUG)上游-40～-70bp处。大多数情况下(＞90％)转录起始位点周围为嘌呤残基；(2)TATA box：一般位于-25～-35bp处，其一致性序列为TATAWAW(W代表A或T)。TATA box并不是一成不变的，其中在真核生物中有43％的结构基因启动子中有TATA box；(3)CAGT box：通常位于TATA box上游-10～-40bp处，对它的缺失或突变会影响启动子活性。除此之外，有的昆虫基因启动子还具有GC box、CAAT box等基本转录调控元件和其它的一些组织特异型调控元件。
当前，随着分子生物学技术的迅速发展和昆虫基因组研究的日益成熟，利用昆虫--杆状病毒表达系统进行药物研发、疫苗生产、基因治疗、重组杆状病毒杀虫剂等方面的研究得到了广泛的关注。杆状病毒表达系统使用较多的启动子是多角体(polh)启动子和p10启动子，目前已经成功表达了上千种外源蛋白，但是如何提高外源蛋白表达量和组织表达特异性仍然制约着昆虫--杆状病毒表达系统的大规模推广应用。为了更好的利用昆虫--杆状病毒表达系统生产外源蛋白，国内外许多学者采取优化启动子的方法对杆状病毒进行改造。因此，发掘昆虫中新的启动子，并对其启动子活性进行研究，对昆虫--杆状病毒表达系统的发展具有重要的经济价值和应用价值。
家蚕是鳞翅目的模式昆虫，其血液中有有一些含量丰富的蛋白质。其中，30K蛋白因其分子质量而得名，是家蚕末龄后期至蛹期血液中含量最高的一类蛋白质。其中，载脂蛋白19G1被认为是属于的与结构相关“30K蛋白”，是五龄幼虫及蛹中主要的蛋白组分，大量分布在血淋巴和卵细胞中。因此，位于家蚕30K蛋白19G1基因上游的启动子作为重要的表达调控元件，克隆其启动子核苷酸序列，研究其在外源蛋白表达载体中的活性，可以为昆虫--杆状病毒表达系统提供重要的启动子序列资源。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用，以丰富昆虫--杆状病毒表达系统中基因启动子的选择。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19，所述的启动子核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二个目的是提供了含有上述的启动子LP19的重组杆状病毒表达载体pFBDM-LP19-Fluc-IG。
本发明的第三个目的是提供了上述重组杆状病毒表达载体pFBDM-LP19-Fluc-IG的构建方法，是将pGL3.Basic载体和pFBDM-IG载体分别用BamHI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到载体pFBDM-Fluc-IG；然后将家蚕LP19启动子的PCR产物和pFBDM-Fluc-IG载体用NruI和BamHI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，即得到载体pFBDM-LP19-Fluc-IG。
其中，pFBDM-IG转移载体是在pFBDM原始载体的BstBI和PstI中插入IRES和GFP基因，IRES基因，即内部核糖体进入位点，介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译；GFP基因表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起到报告基因的作用，IRES有助于GFP蛋白的表达。
本发明的第四个目的是提供了用于扩增上述的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19的PCR特异性引物，所述正向引物LP19F的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，为5'-atcgcgaaccagcaggatggttctg-3'；反向引物LP19R的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，为5'-aggatcctttggagcgtcgagtcctgc-3'。
本发明的第五个目的是提供了上述家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19在调控目的基因表达中的应用。
进一步的，上述的应用，所述目的基因为萤火虫荧光素酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
本发明的第六个目的是提供了上述家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19在杆状病毒表达系统构建中的应用。证实了家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19在Sf9昆虫细胞和家蚕幼虫中能够驱动外源基因的高效表达，为其在杆状病毒表达外源蛋白中的应用提供依据；所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV)；杆状病毒构建方法为Bac-to-Bac法。
进一步的，上述的应用，是将家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19与目的基因连接构建表达载体，转座后将重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒，使LP19启动子驱动该目的基因在Sf9细胞中表达；Sf9细胞株为草地夜蛾细胞系Sf9。
进一步的，上述的应用，是将家蚕30K蛋白19G1基因启动子与目的基因连接构建表达载体，转座后将重组菌液感染BmN细胞获得重组杆状病毒，使LP19启动子驱动该目的基因在家蚕幼虫中表达；BmN细胞株为家蚕细胞系BmN。
进一步的，上述的应用，所述目的基因为萤火虫荧光素酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
本发明的有益效果为：本发明提供的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用，证实了启动子LP19可在Sf9昆虫细胞和家蚕幼虫中驱动外源基因进行表达，丰富了昆虫—杆状病毒表达系统中基因启动子的选择，为LP19启动子在杆状病毒表达外源蛋白中的应用提供依据；表明LP19启动子在杆状病毒表达系统生产重组药物、疫苗等方面，具有良好的应用潜力。
附图说明
图1为家蚕LP19启动子的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，1、2为LP19启动子基因，M1为DL5000DNA Marker。
图2为pFBDM-LP19-Fluc-IG载体结构示意图。
图3为pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒NruI/BamHI双酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，M为DL10000DNA Marker，1为pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒，2为pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒NruI/BamHI双酶切产物。
图4为重组杆状病毒AcMNPV-LP19-Fluc感染Sf9细胞后Fluc的表达量。重组病毒按照MOI＝5的比例感染Sf9细胞，12、24、48、72、96小时后分别收集病毒感染的细胞，利用荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶活性。每个病毒做3个重复，a、b、c不同字母代表不同感染时间的蛋白表达量差异显著性P＜0.05。
图5为重组杆状病毒BmNPV-LP19-Fluc注射感染家蚕幼虫后Fluc的表达量。10μL重组病毒(106PFU)注射接种家蚕5龄第1天幼虫，12、24、48、72、96小时后分别收集病毒感染家蚕的血淋巴，利用荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶活性。每个病毒做3个重复，a、b、c不同字母代表不同感染时间的蛋白表达量差异显著性P＜0.05。
具体实施方式
实施例1：
以家蚕30K蛋白19G1基因上游的1333bp核苷酸序列作为启动子序列，以此为模板，设计上游引物LP19F和下游引物LP19R，通过PCR扩增获得全长为1345bp的全长启动子片段，命名为LP19启动子，然后将LP19启动子与萤火虫荧光素酶Fluc基因连接，构建表达载体，转座后将重组菌液感染Sf9细胞和BmN细胞获得重组杆状病毒，并检测荧光素酶的活性，确定LP19启动子能够驱动外源基因在Sf9昆虫细胞和家蚕幼虫中表达。
具体采用如下技术方案：
1)LP19启动子的克隆：
从家蚕血淋巴中提取家蚕基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，PCR扩增引物为正向引物LP19F和反向引物LP19R(正向引物LP19F中含有NruI酶切位点，反向引物LP19R中含有BamHI酶切位点)，获得家蚕LP19启动子序列，如SEQ ID NO：1所示。对LP19启动子的核苷酸序列利用明尼苏达大学在线启动子分析软件(http://www-bimas.cit.nih.g ov/molbio/proscan/)进行结构分析发现，LP19启动子序列含有TATA box、AGGA box、GC box等元件。
2)转移载体pFBDM-LP19-Fluc-IG的构建：
将pGL3.Basic载体和pFBDM-IG载体分别用BamHI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到载体pFBDM-Fluc-IG；然后将家蚕LP19启动子的PCR产物和pFBDM-Fluc-IG载体用NruI和BamHI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到载体pFBDM-LP19-Fluc-IG。
3)LP19启动子在sf9昆虫细胞中表达外源基因的应用：
制备AcMultiBac/rSW106-inv+asd-感受态细胞，加入5μL pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒进行转座并利用LP19特异性引物进行菌液PCR验证，筛选正确的菌液保存备用；然后将构建的pFBDM-LP19-Fluc-IG/AcMultiBac/rSW106-inv+asd-重组菌液，按照以下方法感染Sf9细胞：用含8％FBS的Grace's培养基培养Sf9细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜；第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基；将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL菌液到1.5mL EP管里，5000rpm离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5 000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5ml EP管里稀释100倍、1 000倍；将稀释成100倍、1 000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基；3d后观察荧光检测是否感染成功；将有荧光的细胞上清收集起来即为P1代重组病毒AcMNPV-LP19-Fluc，将P1代重组病毒重新感染Sf9细胞后收集病毒感染的Sf9细胞，将Sf9细胞悬液反复冻融3次，4℃、10000g离心2min，将上清液转移到另一离心管中备用；再利用荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶的表达量即可。
4)LP19启动子在家蚕幼虫中表达外源基因的应用：
制备BmMultiBac/rSW106-inv+asd-感受态细胞，加入5μL pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒进行转座并利用LP19特异性引物进行菌液PCR验证，筛选正确的菌液保存备用；然后将构建的pFBDM-LP19-Fluc-IG/BmMultiBac/rSW106-inv+asd-重组菌液，按照以下方法感染BmN细胞：用TC-100培养基培养BmN细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜；第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基；将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL菌液到1.5mLEP管里，5000rpm离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5 000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL培养基，在另外的装有500μL培养基的1.5ml EP管里稀释100倍、1 000倍；将稀释成100倍、1 000倍的500μL菌液与培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，将菌液与培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基；3d后观察荧光检测是否感染成功；将有荧光的细胞上清收集起来即为P1代重组病毒BmNPV-LP19-Fluc，将10μL的P1代重组病毒(106PFU)注射接种家蚕5龄第1天幼虫，感染12、24、48、72、96小时后分别收集病毒感染家蚕的血淋巴，利用荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶的表达量。
实施例2：
1、LP19启动子的克隆：
用动物组织基因组DNA提取试剂盒从家蚕血淋巴中提取家蚕基因组DNA，设计一对特异性引物扩增家蚕LP19启动子基因片段(LP19F和LP19R)。并且在上下游引物5′末端分别引入NruⅠ和BamHⅠ酶切位点。PCR扩增条件为95℃10min；95℃30s，56℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳检测显示1345bp有明显的特异性条带(见图1)。将PCR产物胶回收后测序鉴定，证实已经成功得到家蚕LP19启动子序列。对其核苷酸序列利用明尼苏达大学在线启动子分析软件(http://www-bimas.cit.nih.g ov/molbio/proscan/)进行结构分析发现，LP19启动子序列含有TATA box、AGGA box、GC box等元件。
2、转移载体pFBDM-LP19-Fluc-IG的构建：
将pGL3.Basic载体和pFBDM-IG载体分别用BamHI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到载体pFBDM-Fluc-IG；然后将家蚕LP19启动子的PCR产物和pFBDM-Fluc-IG载体用NruI和BamHI进行酶切、胶回收、连接、转化得到载体pFBDM-LP19-Fluc-IG(载体示意图见图2)。将pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒用NruI和BamHI双酶切鉴定，可以得到1345bp和8406bp的特异性条带(见图3)。
3、LP19启动子在sf9昆虫细胞中表达外源基因的应用：
1)AcMulitBacmid/SW106/asd-/inv+感受态细胞的制备方法采用CaCl2法，制备过程大致如下：将保存于-80℃冰箱的菌种划线培养于Kan/Tet/Spe/DAP/IPTG/X-Gal的LB固体培养基上32℃培养48h左右，然后挑取蓝色单菌落放于相应抗性的LB培养液中32℃摇菌过夜。第二天，取菌液按照1:100的比例加入到新鲜的LB培养液中振荡培养至OD600达到0.2时加入终浓度为0.1％的L-阿拉伯糖继续培养，待OD600达到0.4～0.6时，转移菌液于干净的EP管中，冰置30min，然后4℃3000g离心10min；将细胞沉淀用25mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬起来，冰置30min，4℃3000g离心10min；再依次用10mL和1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬离心，最后加入终浓度为15％的甘油混匀，分装并立即冻存于-80℃超低温冰箱中备用。
2)pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒的转座：从-80℃超低温冰箱中取1支感受态细胞放于冰上解冻，待感受态细胞溶化后加入1ng质粒轻轻混匀，然后冰浴30min后在42℃水浴锅中热激90s，加入800μL新鲜的含DAP营养素的LB培养液，32℃摇床上活化复苏6h左右，然后涂于含有合适抗生素的LB固体培养基上，然后放于32℃恒温培养箱中培养。24～48h后挑取白色单克隆摇菌并进行菌液PCR鉴定，PCR扩增得到1345bp的特异性条带。
3)构建重组杆状病毒AcMNPV-LP19-Fluc：用含8％FBS的Grace's培养基培养Sf9细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜。第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基。将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL菌液到1.5mL EP管里，5 000rpm离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5 000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5ml EP管里稀释100倍、1 000倍。将稀释成100倍、1 000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基，3d后观察荧光。出现荧光后收集细胞培养上清即为P1代重组杆状病毒AcMNPV-LP19-Fluc。
4)萤火虫荧光素酶表达量的检测：
将P1代重组杆状病毒AcMNPV-LP19-Fluc按照MOI＝5的比例重新感染Sf9细胞，12、24、48、72和96小时后收集病毒感染的Sf9细胞，反复冻融3次，4℃、10 000g离心2min，将上清转移到一新的无菌离心管中备用。将100μL平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent加入试管中，再小心吸取20μL细胞裂解物至试管中，轻弹混匀，然后于化学发光仪(luminometer)中检测萤火虫荧光素酶的活性(如图4所示)。
4、LP19启动子在家蚕幼虫中表达外源基因的应用：
1)BmMulitBacmid/SW106/asd-/inv+感受态细胞的制备方法采用CaCl2法，制备过程参照AcMulitBacmid/SW106/asd-/inv+感受态细胞。
2)pFBDM-LP19-Fluc-IG质粒的转座：从-80℃超低温冰箱中取1支感受态细胞放于冰上解冻，待感受态细胞溶化后加入1ng质粒轻轻混匀，然后冰浴30min后在42℃水浴锅中热激90s，加入800μL新鲜的含DAP营养素的LB培养液，32℃摇床上活化复苏6h左右，然后涂于含有合适抗生素的LB固体培养基上，然后放于32℃恒温培养箱中培养。24～48h后挑取白色单克隆摇菌并进行菌液PCR鉴定，PCR扩增得到1345bp的特异性条带。
3)构建重组杆状病毒BmNPV-LP19-Fluc：用含8％FBS的TC-100培养基培养BmN细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜。第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基。将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1mL菌液到1.5mL EP管里，5 000rpm离心3min，倒掉上清，用PBS重悬菌体，5 000rpm离心3min，重复洗2次，倒掉上清，加入1mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5ml EP管里稀释100倍、1 000倍。将稀释成100倍、1 000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基，3d后观察荧光。出现荧光后收集细胞培养上清即为P1代重组杆状病毒BmNPV-LP19-Fluc。
4)萤火虫荧光素酶表达量的检测：
将P1代重组杆状病毒BmNPV-LP19-Fluc按照106PFU的量注射接种家蚕5龄第1天幼虫，感染12、24、48、72、96小时后分别收集病毒感染家蚕的血淋巴，4℃、12 000g离心10min，将上清转移到一新的无菌离心管中备用。将100μL平衡至室温的Luciferase ReactionReagent加入试管中，再小心吸取20μL细胞裂解物至试管中，轻弹混匀，然后于化学发光仪(luminometer)中检测萤火虫荧光素酶的活性(如图5所示)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19及其表达载体和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1333
<212> DNA
<213> BmLP19启动子核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
aaccagcagg atggttctgc ttcagcgggg tattccggga caccagcgga accatctggg 60
cggcctgatg ggctaccgta cgagacggcc gacgtttcag atccttcgat tcgcctcgaa 120
ggctccgtcg gccgggcgtc cttgagtgag ccgcgccgtc tggtagttgt gttgcccgcg 180
gtagcgccct tacctcatcc gggttttagt atagttacaa cagctgcccc acccttcaaa 240
ccgaaacgca ttactgcttc acggcaaaat aggcagggtg gtggtaccta accgtgcgaa 300
tccatacgaa aatattaata ttagcaaaac aaatatacct ttcacatggc atgttttaga 360
ctaccacgaa caatgtgaaa tttttaaatg tgtccattaa aattacacat ttaaattata 420
atgttgacgg cttgataatt tcactcaatc aataataaac tatatcttta tttcaatgca 480
ctttcaattg acatttgaac tatgatgttg atattgcatc tgacgttttt taattcaaaa 540
caatttcgag tataaaaggc agagtttcaa aggaaacagg cagttcgttc ttgggtaaca 600
cacaggtgag atacatttgg gttttaacgc tggagaatcc gtttcggata cccagtcgtg 660
gggggtaaca gaccgggtta tgtcagactt cggttcctcc aaggaagagg gagaccgagg 720
tcctcctctt cttctaattc ctgtcgagag tctacgtctt gagatatcta cctaccacac 780
aaaaactttt cttctattta gcgtttgtta aattgtaaga gtttgagaaa ccaattggcc 840
gatatttcga cctctggcat ttttttcatc actccgctga ctttttttat tctttttatt 900
gcttagatgg gtgaacgagc tcacagccca cctggtgtta agtggttacc ggagcccata 960
gacatttaca acgtaaatgc cccacccacc ttgaaattta aggtctaaga tctcaagtat 1020
aggtacttct tgtactggtc tccaaacacc gatcgtatga attttgtatc agtggatata 1080
aaattataca ctaagttgtt tatgtgtcta agctttcaaa gaagtcaaat atataatata 1140
cttttttatt taacaattaa tttgtcaagt tcgtttttgc tatatactca caaaatctgc 1200
caccgttttg cctcatatat acatcaaata tacatattat gttcaattct caatgtgtat 1260
aattcaactt acgtttttaa aattctaatc cttaacaaat aattttacat attgcaggac 1320
tcgacgctcc aaa 1333
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> LP19F引物序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
atcgcgaacc agcaggatgg ttctg 25
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> LP19R引物序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
aggatccttt ggagcgtcga gtcctgc 27
<210> 4
<211> 1653
<212> DNA
<213> 萤火虫荧光素酶基因核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatccgct ggaagatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggaacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtggac atcacttacg ctgagtactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gaaacgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgggcatt 360
tcgcagccta ccgtggtgtt cgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaagctcc caatcatcca aaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtgccag agtccttcga tagggacaag acaattgcac tgatcatgaa ctcctctgga 600
tctactggtc tgcctaaagg tgtcgctctg cctcatagaa ctgcctgcgt gagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttc tgaggagcct tcaggattac 840
aagattcaaa gtgcgctgct ggtgccaacc ctattctcct tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctggtggcgc tcccctctct 960
aaggaagtcg gggaagcggt tgccaagagg ttccatctgc caggtatcag gcaaggatat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcaaag aggcgaactg tgtgtgagag gtcctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tcgttgaccg cctgaagtct 1320
ctgattaagt acaaaggcta tcaggtggct cccgctgaat tggaatccat cttgctccaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc aggtgtcgca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcata 1620
aaggccaaga agggcggaaa gatcgccgtg taa 1653

Claims (10)

1.家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19，其特征在于，所述的启动子核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
2.含有如权利要求1所述的启动子LP19的重组杆状病毒表达载体pFBDM-LP19-Fluc-IG。
3.根据权利要求2所述的重组杆状病毒表达载体pFBDM-LP19-Fluc-IG的构建方法，其特征在于，是将pGL3.Basic载体和pFBDM-IG载体分别用BamHI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到载体pFBDM-Fluc-IG；然后将家蚕LP19启动子的PCR产物和pFBDM-Fluc-IG载体用NruI和BamHI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，即得到载体pFBDM-LP19-Fluc-IG。
4.用于扩增如权利要求1所述的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19的PCR特异性引物，其特征在于，所述正向引物LP19F的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，反向引物LP19R的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求1所述的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19在调控目的基因表达中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述目的基因为萤火虫荧光素酶基因。
7.根据权利要求1所述的家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19在杆状病毒表达系统构建中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，是将家蚕30K蛋白19G1基因启动子LP19与目的基因连接构建表达载体，转座后将重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒，使LP19启动子驱动该目的基因在Sf9细胞中表达。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，是将家蚕30K蛋白19G1基因启动子与目的基因连接构建表达载体，转座后将重组菌液感染BmN细胞获得重组杆状病毒，使LP19启动子驱动该目的基因在家蚕幼虫中表达。
10.根据权利要求7-9所述的应用，其特征在于，所述目的基因为萤火虫荧光素酶基因。
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