CN110343720A - 一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用，该方法将埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，产生的重组病毒经过测定，可以明显提高杆状病毒的滴度，增强感染性，可以在病毒繁殖扩增过程中，加入少量病毒可达到高的感染性，节省生产成本。本发明的使用不但可以降低杆状病毒扩增成本，同时获得的高感染性重组杆状病毒也可改善杆状病毒作为生物杀虫剂杀虫速度慢等缺点；本发明还可促进昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用、杆状病毒受体以及杆状病毒入侵宿主的机制等研究的发展，本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及生物防治领域，具体涉及一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用。
背景技术
杆状病毒基因组为单一闭合双链环状DNA，大小为80～180kb，因其病毒粒子为杆状，因此被称为杆状病毒，专一性感染节肢动物的病原微生物。近年来杆状病毒已被广泛应用于外源蛋白表达、基因治疗及生物杀虫剂等方面。
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus AcMNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV)是研究的最为广泛的两种昆虫杆状病毒。AcMNPV表达系统生产的人乳头瘤病毒疫苗(CervarixTM，葛兰素史克)已经上市，并取得非常好的免疫效果；还有一些商品化的杀虫剂，也已经广泛应用于农业害虫防治。自1993年由中国科学院武汉病毒研究所和湖北蒋湖农场登记的中国第一个昆虫病毒杀虫剂产品-棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂以来，在中国登记的NPV杀虫剂有效成分达10多种，产品有38个(中国农药信息网)。目前，中国推广应用的杀虫剂主要有茶尺蠖NPV、茶毛虫NPV和茶刺蛾NPV。国外报道巴西已经有约100万公顷大豆种植用黎豆夜蛾NPV作为杀虫剂。就如何提高杆状病毒外源蛋白的表达量和杀虫力，科学家也进行了大量的研究方面，比如敲除一些杆状病毒基因组上与病毒复制非必需的一些基因来改良系统提高表达量，也有插入一些外源毒素基因比如钳蝎毒素基因来提高杀虫能力。
不管是改良表达效率还是提高杀虫能力，重组病毒均需要大量的扩增繁殖，才能应用于外源蛋白的生产或者杀虫剂的制备，在重组病毒制备及扩增过程中，需要消耗大量的人力财力，如果能在病毒感染的过程中，应用一定手段提高感染效率，即用少量的病毒可以繁殖扩增更多的病毒，达到提高表达量或杀虫能力、节省人力物力及降低成本的目的。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种增强杆状病毒感染性的方法，该方法是将埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，产生的重组病毒经过测定，可以明显提高杆状病毒的滴度，增强感染性，可以在病毒繁殖扩增过程中，加入少量病毒可达到高的感染性，节省生产成本。目前，没有埃博拉GP蛋白应用于提高杆状病毒滴度的任何文献报道和专利申请。本发明公开的方法易于掌握，一次性构建的重组病毒，可以永久应用。本发明是一种提高杆状病毒滴度的新方法，用于提高杆状病毒的滴度，即将埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，即可显著提高杆状病毒的滴度，进而提高其感染性，该方法简单明了，便于操作，成本低廉，易于推广，提高效率显著。
本发明还提供一种高感染性重组杆状病毒及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，由埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，提高杆状病毒感染性。
其中，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，即可显著提高杆状病毒的滴度，进而提高其感染性。
作为优选，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上具体为：扩增埃博拉GP蛋白基因，插入到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的pFastBacDUAL系列质粒中(Bac-to-Baculovirus Expression Systems,InvitrogenTM)，用构建的携带埃博拉GP蛋白基因的pFastBacDUAL质粒转化含有杆状病毒Bac-to-Bac系统及辅助质粒表达转座酶的DH10B感受态细胞，使得埃博拉GP蛋白基因转座到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的Tn7转座插入位点。
作为优选，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上具体为：扩增埃博拉GP蛋白基因，构建重组打靶载体，载体中在埃博拉GP蛋白基因两侧克隆打靶的同源臂(同源臂和复制缺陷杆状病毒缺失的基因同源)，将构建好的载体和复制缺陷型的杆状病毒DNA共同转染昆虫细胞，通过空斑筛选重组病毒，即通过同源重组使得复制缺陷的病毒重新获得复制能力，使得埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上。
本发明所述的高感染性重组杆状病毒，通过转座方式、同源重组方式或其它方式将埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，获得重组杆状病毒。本发明将埃博拉的GP蛋白基因插入到杆状病毒基因组上与病毒复制不相关或不影响病毒的复制即可，本发明中优选将埃博拉GP蛋白基因转座到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的Tn7转座插入位点。
其中，所述重组杆状病毒的一步生长曲线显著升高，外源基因的表达量显著增加。
本发明所述的高感染性重组杆状病毒在制备快速生物杀虫剂中的应用。
在本发明总体过程包括1、构建重组病毒，主要通过两种方法构建重组病毒；2、比较两种病毒感染后产生的子代病毒；3、比较两种病毒外源蛋白的表达量。
1、构建重组病毒
a、转座方式构建重组病毒：设计一对引物，扩增埃博拉GP蛋白基因，插入到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的pFASTBACDUAL系列质粒中，用构建的携带埃博拉GP蛋白基因的pFASTBACDUAL质粒转化含有杆状病毒Bac-to-Bac系统及辅助质粒(表达转座酶)的DH10B感受态细胞，使得埃博拉GP蛋白基因转座到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的Tn7转座插入位点，通过抗生素、蓝白斑筛选阳性菌落，提取DNA，进一步通过PCR鉴定，获取正确的重组Bacmid，提取DNA，转染昆虫细胞，观察细胞的病变情况，72小时后收获病毒，继续按照常规手段感染昆虫细胞进行病毒扩增，72小时后收获病毒，利用终点稀释法测定病毒滴度，4℃避光保存，用于本专利所有方法中。
b、同源重组方法构建重组病毒：设计一对引物，扩增埃博拉GP蛋白基因，构建重组打靶载体，载体中在埃博拉GP蛋白基因两侧克隆打靶的同源臂(同源臂和复制缺陷杆状病毒缺失的基因同源)，将构建好的载体和复制缺陷型的杆状病毒DNA共同转染昆虫细胞，通过空斑筛选重组病毒，即通过同源重组使得复制缺陷的病毒重新获得复制能力，这样埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上。将空斑筛选的病毒继续感染昆虫细胞，扩增病毒，收获病毒，测定病毒滴度，4℃避光保存备用。
2、比较两种病毒感染后产生的子代病毒
分别用相同感染复数的重组病毒和对照病毒感染昆虫细胞，感染后不同时间点取样，用终点稀释法测定各个时间点样品病毒滴度，比较两种病毒的一步生长曲线。实验重复三次，用Excel 2016统计显著性。
3、比较两种病毒外源蛋白的表达量
将报告基因egfp，通过转座方式插入杆状病毒基因组，转染细胞，收获重组病毒，终点稀释法测定滴度后，相同感染复数病毒感染细胞，感染后72h收集细胞，悬浮于1mlPBS，超声破碎4min，12000转离心5min，上清用于光谱分析，比较EGFP蛋白表达量。
本发明将埃博拉病毒糖蛋白基因插入到杆状病毒基因组上，形成的新病毒不仅携带自身的表面糖蛋白，而且含有埃博拉病毒的糖蛋白，这样提高了病毒的感染性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明首次公开了一种能显著提高杆状病毒感染性的方法，用于提高杆状病毒的滴度，将埃博拉的GP蛋白基因插入杆状病毒基因组后，能显著的提高杆状病毒感染效率。本发明的使用不但可以降低杆状病毒扩增成本，同时获得的高感染性重组杆状病毒也可改善杆状病毒作为生物杀虫剂杀虫速度慢等缺点；由于埃博拉病毒以巨胞饮的内吞方式入侵宿主，GP蛋白在入侵中发挥重要作用，其糖蛋白插入杆状病毒后可以增强杆状病毒感染性，本发明还可促进昆虫杆状病毒与宿主细胞相互作用、杆状病毒受体以及杆状病毒入侵宿主的机制等研究的发展。本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。
附图说明
图1为利用本发明中所述方法构建的重组病毒和对照病毒一步生长曲线比较示意图；取105的对数生长期的BmN细胞传代入6孔板(每个待测病毒3个重复)；贴壁后，取两种病毒，BmBac-egfp和BmBac-egfp-GP，以感染复数5的剂量分别感染BmN细胞(加入病毒后，用新鲜培养基补足，确保总体积一致，减少误差)；感染1h后，去除感染液，用培养基清洗两次，加入2mL的新鲜培养基，培养箱中正常培养；以加入2mL的新鲜培养基的时间点定为0时，不同时间点定点取样(0h，12h，24h，48h，72h)，依次取出病毒样品60μl，4℃保存；对所有的时间点取样的病毒样品，利用终点稀释法测定滴度，绘制病毒的生长曲线；
图2为利用本发明中所述方法构建的重组病毒和对照病毒感染细胞EGFP蛋白表达比较示意图；取105的对数生长期的BmN细胞传代入6孔板(每个待测病毒3个重复)；贴壁后，取两种病毒，BmBac-egfp和BmBac-egfp-GP，以感染复数5的剂量分别感染BmN细胞(加入病毒后，用新鲜培养基补足，确保总体积一致，减少误差)；感染2h后，去除感染液，加入2mL的新鲜培养基，培养箱中正常培养；以加入2mL的新鲜培养基的时间点为0h，培养72h后，收集细胞，悬浮于1ml PBS，超声破碎4min，12000转离心5min，上清用于光谱分析(荧光光谱仪日立F-4600)；扫描模式为激发模式，激发光为488nm，发射光检测范围498-650nm，激发光栅：5nm，发射光栅5nm，PMT电压：750V；BmBac-egfp-GP荧光强度为1109，而BmBac-egfp为799，二者之间有显著差别(P＝0.0013)。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
以杆状病毒BmNPV、昆虫细胞BmN为例，以转座方式构建重组病毒。
实施步骤：
BmBacJS13是一株与BmNPV具有相同感染特性的穿梭载体Bacmid[Huang JS etal.Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx moriNucleopolyhedroviru.Virologica Sinica.2007，22(3)：218-225]，储存于大肠杆菌DH10B中，用于以下本实施例方法中。
对照病毒
从pEGFP-N1质粒(clotech公司)上用XhoI和XbaI(补平)酶切egfp基因，克隆入经XhoI和KpnI(补平)酶切的pFastBacDUAL，常规分子生物学方法构建质粒，命名为pFast-egfp。
取0.2ug的pFast-egfp质粒DNA，转化含有家蚕杆状病毒Bacmid(BmBacJS13)及辅助质粒(表达转座酶)的DH10B感受态细胞，在含有卡那霉素、四环素、庆大霉素及IPTG和x-gal的平板上筛选白色菌落，进一步PCR鉴定，正确重组Bacmid，命名为BmBac-egfp。
在35mm细胞培养皿中接种约5×105个/皿的BmN细胞，贴壁后，用2μl lipofectin转染试剂、30μl无血清培养基和2μg对照BmBac-egfp DNA混合液转染细胞，4小时后，除去转染混合液，添加新鲜的常规培养基培养，72小时后，收集上清，终点稀释法测定病毒滴度，4℃储存，作为本实施例中的对照病毒。
实施例2
重组Bacmid-BmBac-egfp-GP的构建
设计一对引物：
SEQ ID NO.1：GP F 5’-CGCTCTAGAATGGGCGTTACAGGAATATTG-’3(Xba I)
SEQ ID NO.2：GP R 5’-CCCAAGCTTCTAAAAGACAAATTTGCATAT-’3(Hind III)
以含有埃博拉病毒糖蛋白GP基因的质粒为模板，扩增该基因，用Xba I和Hind III酶切，回收；
设计第二对引物：
SEQ ID NO.3：PROMOTER GP64-F：
GGCAGGCCTGACAGATATTTAAATAAGCCAAAC(Stu I)
SEQ ID NO.4：PROMOTER GP64-R：
CGCTCTAGATGAGGCATCTTATATACCCGA(Xba I)
以BmBacJS13DNA为模板扩增gp64启动子，StuI与XbaI酶切，回收；同样用StuI与Hind III酶切质粒pFast-egfp，回收；将上述三个酶切回收片段按照常规分子生物学方法连接，转化DH10B感受态细胞，筛选重组子，PCR鉴定后，命名pFBD-egfp-GP，提取其DNA，溶解于20ul超纯水备用。
取0.2μg上述构建载体pFBD-egfp-GP转化携带BmBacJS13和辅助质粒(表达转座酶)的DH10B感受态细胞中，SOC培养基中37℃培养4h。然后在含有Kanamycin，Gentamicin和IPTG、X-gal的平板上筛选重组Bacmid，挑取白斑菌落，过夜培养后，提取DNA，用M13引物PCR进一步鉴定分析，筛选正确的重组Bacmid，命名为BmBac-egfp-GP，提取DNA备用。
细胞的转染
在35mm细胞培养皿中各接种约5×105个/皿的BmN细胞，贴壁后，用2ullipofectin转染试剂、30ul无血清培养基和2ug BmBac-egfp-GP DNA混合液转染细胞，转染4h后，除去转染混合液，添加新鲜培养基常规培养，72小时后，收集上清，终点稀释法测定病毒滴度，4℃储存，作为本实施例的感染性增强的病毒。
实施例3
同源重组方法构建重组病毒：
设计一对引物，扩增埃博拉GP蛋白基因，构建重组打靶载体，载体中在埃博拉GP蛋白基因两侧克隆打靶的同源臂(同源臂和复制缺陷杆状病毒缺失的基因同源)，将构建好的载体和复制缺陷型的杆状病毒DNA共同转染昆虫细胞，通过空斑筛选重组病毒，即通过同源重组使得复制缺陷的病毒重新获得复制能力，这样埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上。将空斑筛选的病毒继续感染昆虫细胞，扩增病毒，收获病毒，测定病毒滴度，4℃避光保存备用。
实施例4
病毒生长曲线比较：
取105的对数生长期的BmN细胞传代入6孔板(每个待测病毒3个重复)。贴壁后，取上述两种病毒，BmBac-egfp(实施例1)和BmBac-egfp-GP(实施例2)，以感染复数5的剂量分别感染BmN细胞(加入病毒后，用新鲜培养基补足，确保总体积一致，减少误差)。感染1h后，去除感染液，用培养基清洗两次，加入2mL的新鲜培养基，培养箱中正常培养。以加入2mL的新鲜培养基的时间点定位0时，不同时间点定点取样(0h，12h，24h，48h，72h)，依次取出病毒样品60μl，4℃保存。对所有的时间点取样的病毒样品，利用终点稀释法测定滴度，绘制病毒的生长曲线，如图1所示，图1说明获得的重组杆状病毒感染细胞后子代病毒量高于对照病毒。
实施例5
细胞感染后EGFP量测定
取105的对数生长期的BmN细胞传代入6孔板(每个待测病毒3个重复)。贴壁后，取上述两种病毒，BmBac-egfp(实施例1)和BmBac-egfp-GP(实施例2)，以感染复数5的剂量分别感染BmN细胞(加入病毒后，用新鲜培养基补足，确保总体积一致，减少误差)。感染2h后，去除感染液，加入2mL的新鲜培养基，培养箱中正常培养。培养72h后，收集细胞，悬浮于1mlPBS，超声破碎4min，12000转离心5min，上清用于光谱分析，结果如图2所示，图2光谱分析结果显示BmBac-egfp-GP重组病毒表达EGFP量明显高于对照病毒BmBac-egfp，统计结果表明二者有显著差异。
最后应当说明的是：以上所述的实施例和实施方式重组病毒的构建方法及某一杆状病毒仅用于说明性目的而非限制，但本领域的普通技术人员应当理解，在分子生物学水平也可以运用其他杆状病毒或者利用其他重组方法比如同源重组将GP蛋白基因插入其他杆状病毒基因组上其他位置，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围，并被包括在本申请的精神和范围之内。
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 一种增强杆状病毒感染性的方法及其重组杆状病毒和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgctctagaa tgggcgttac aggaatattg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaagcttc taaaagacaa atttgcatat 30
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcaggcctg acagatattt aaataagcca aac 33
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgctctagat gaggcatctt atatacccga 30
Claims (7)
1.一种增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，将埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，提高杆状病毒感染性。
2.根据权利要求1所述的增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上，即可显著提高杆状病毒的滴度，进而提高其感染性。
3.根据权利要求1所述的增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上优选具体为：扩增埃博拉GP蛋白基因，插入到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的pFastBacDUAL系列质粒中，用构建的携带埃博拉GP蛋白基因的pFastBacDUAL质粒转化含有杆状病毒Bac-to-Bac系统及辅助质粒表达转座酶的DH10B感受态细胞，使得埃博拉GP蛋白基因转座到杆状病毒Bac-to-Bac系统中的Tn7转座插入位点。
4.根据权利要求1所述的增强杆状病毒感染性的方法，其特征在于，所述埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上具体为：扩增埃博拉GP蛋白基因，构建重组打靶载体，载体中在埃博拉GP蛋白基因两侧克隆打靶的同源臂，将构建好的载体和复制缺陷型的杆状病毒DNA共同转染昆虫细胞，通过空斑筛选重组病毒，即通过同源重组使得复制缺陷的病毒重新获得复制能力，使得埃博拉GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上。
5.一种高感染性重组杆状病毒，其特征在于，将埃博拉的GP蛋白基因重组到杆状病毒基因组上。
6.根据权利要求5所述的高感染性重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒的一步生长曲线显著升高，外源基因的表达量显著增加。
7.一种高感染性重组杆状病毒在制备快速生物杀虫剂中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN1241216A (zh) * | 1996-09-11 | 2000-01-12 | 综合医院公司 | 具有改变的外壳蛋白的非哺乳动物dna病毒 |
| CN104911201A (zh) * | 2015-06-24 | 2015-09-16 | 江苏大学 | 一种提高杆状病毒杀虫效率的遗传改造方法 |
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