CN101914570A - 家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征疫苗蛋白gp5 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用家蚕表达猪呼吸与繁殖综合征疫苗蛋白GP5，按照如下方法制备而得：1)、转座质粒pFastBacHTbORF5的构建：以PRRSV全基因组序列为模板、以pE1、pE2为引物进行扩增；扩增产物E经BamHI、KpnI酶切后克隆到pFastBacHTb的BamHI、KpnI位点之间；2)、重组病毒的获得：先以pFastBacHTbORF5转化DH10Bac感受态；然后于SOC培养基上培养；选择PCR鉴定为阳性的菌接种，提取Bacmid；所提取的Bacmid为重组病毒rBmNPVBacmid/ORF5。本发明为深入研究GP5基因的功能以及研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及用家蚕表达猪呼吸与繁殖综合征疫苗蛋白GP5(E蛋白)。具体地讲，本发明涉及Bac-to-Bac表达系统和构建一个重组的针对BmNPV的bacmid。Bac-to-Bac表达系统有两大系统元件：第一大元件是pFastBac供体质粒(donor plasmid)；第二大元件是宿主菌DH10BacE.cli。DH10BacE.cli细胞中含有杆状病毒穿梭载体Bacmid和辅助质粒(helper plasmid)，其中Bacmid包含有细菌单拷贝数mini-F复制子、卡那霉素抗性筛选标记、细菌转座子Tn7的靶位点(mini-attTn7)及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段。
背景技术
1993年Luckow等根据F因子载体原理，用类似于酵母体内重组的方法构建了一种新型杆状病毒穿梭载体(baculovirus shuttle vector)，取Baculovirus和plasmid的字头字尾命名为Bacmid，意为杆状病毒质粒。他的意义在于突破了多年来必需在活细胞内重组病毒基因组的束缚。由于从细菌(Bacteria)到杆状病毒(Baculovirus)的全部操作都在细菌中进行，所以这一策略又称Bac-to-Bac策略。
Bac-to-Bac基本原理为：将一个改造后的AcMNPV基因组转化入大肠杆菌，使它像普通质粒一样能够在细菌内复制，并可通过位点特异性转座，在大肠杆菌内完成病毒基因组的重组。将杆状病毒穿梭载体(130Kb)转化入大肠杆菌DH10β，获得转化子DH10Bac。Bacmid像大质粒一样在细菌中复制，并使细菌获得卡那霉素抗性，同时与存在于细菌自身染色体上的LacZa缺失产生互补，形成蓝斑(LacZa+)。
将目的基因插入到启动子下游的多克隆位点生成重组pFastBac供体质粒。重组的供体质粒转化进入含有helper plasmid和Bacmid的DH10Bac中，通过供体质粒上的mini-Tn7转座子，并在helper plasmid所表达的转座酶作用下将供体质粒上的表达框插入到Bacmid中靶位点mini-attTn7，破坏LacZa基因的表达。在含有X-gal和IPTG的培养基上培养筛选，重组的Bacmid菌斑呈现白色，而非重组则为蓝色。因此可以通过菌斑颜色不同进行重组病毒的筛选。通过单克隆菌斑的挑选培养，抽提得到重组的BacmidDNA用于转染昆虫细胞或幼虫以或得重组蛋白质。
PRRSV属动脉炎病毒科，是单股正链RNA病毒，基因组大小为15kb，包括8个开放阅读框架，可编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白，其中ORF5编码病毒的糖基化包膜蛋白(又称E蛋白和gp5)，是主要的结构蛋白，也是一种多功能蛋白，参与细胞免疫与体液免疫，是发展新型疫苗的良好目标基因。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用家蚕表达猪呼吸与繁殖综合征疫苗蛋白GP5(E蛋白)。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用家蚕表达猪呼吸与繁殖综合征疫苗蛋白GP5(E蛋白)，其按照如下方法制备而得：
1)、转座质粒pFastBacHTbORF5的构建：
以PRRSV全基因组序列为模板、以pE1、pE2为引物进行扩增；扩增产物E经BamHI、KpnI酶切后克隆到pFastBacHTb的BamHI、KpnI位点之间，所得重组质粒命名为pFastBacHTbORF5；
2)、重组病毒的获得：
先以pFastBacHTbORF5转化DH10Bac感受态；然后于SOC培养基上培养；选择PCR鉴定为阳性的菌接种，提取Bacmid；所提取的Bacmid为重组病毒rBmNPVBacmid/ORF5。
本发明通过对目前广泛应用的杆状病毒Bac-to-Bac表达系统进行改造，建立了能简便、快速获得重组杆状病毒的表达系统，并通过这一改造的系统使猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因在家蚕细胞中获得高效融合表达，为深入研究GP5基因的功能以及研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1转座质粒pFastBacHTbORF5结构图；
图2转座位点示意图；
图3家蚕体内表达ORF5的SDS-PAGE分析图，图中：1为Marker，2为对照蚕血淋巴上清，3为野生NPV感染家蚕的血淋巴上清，4为重组病毒液感染家蚕的血淋巴上清。
具体实施方式
实施例1、转座质粒pFastBacHTbORF5的构建：
以PRRSV全基因组序列为模板，pE1、pE2为引物，PCR扩增出约0.6kb左右的片段，为E。
用于扩增E的引物：
pE1(+)tct GGA TCC Atg ttg ggg aag tgc ttg BamHI (SEQ ID NO：1)
pE2(-)tct GGT ACC ctA gag acg acc cca ttg KpnI (SEQ ID NO：2)
扩增体系如下：
PRRSV基因片段(1ng) 1μl
10×PCR Buffer 5μl
10mM dNTP Mix 1μl
50mM MgCl2 1.5μl
PCR引物(10μM) 2.5μi(各1.25μl)
去离子水 38.5μl
Taq酶(5units/μl) 0.5μl
Total 50μl
PCR程序设置：
扩增产物E经BamHI，KpnI酶切后克隆到pFastBacHTb的BamHI，KpnI位点之间，重组质粒命名为pFastBacHTbORF5(结构图见图1)。
实施例2、重组病毒的获得：
pFastBacHTbORF5转化DH10Bac感受态。取出分装好-70℃冷冻保存的E.coli BmDH10Bac感受态细胞，置冰上15min，使细胞在低温下融化。加入pFastBacTMHTB-GP5、pFastBacTMHTB-M重组供体质粒(donor)各1μl(约1ng)，轻轻摇动后，置冰上30min。42℃水浴热冲击90s。迅速取出置冰上冷却2min。加入0.4ml已于37℃预热的SOC培养基。37℃，225rpm振荡培养4h。吸取20μl涂板(含卡那霉素50μg/ml、庆大霉素7μg/ml、四环素10μg/ml、X-gal 100μg/ml、IPTG 40μg/ml)，37℃恒温倒置培养48h。48h后可见四环素-卡那霉素-庆大霉素三抗平皿(含X-gal和IPTG)上有大量单个蓝白菌落生长，挑取菌落形态较大的白斑划线纯化一次，并通过PCR鉴定，然后选择PCR鉴定为阳性的菌接种，5mL四环素-卡那霉素-庆大霉素三抗液体培养基，提取Bacmid，电泳显示BacmidDNA完整。所提取的Bacmid即为重组病毒rBmNPVBacmid/ORF5。
在pFastBacTMHT载体中含有一个转座子表达盒，在Tn7转座子左右两臂之间具有作为筛选标记的庆大霉素抗性和带有多角体启动子的多克隆位点。将约1ng纯pFastBacTMHTB-ORF5重组供体质粒转化进入E.coli Bm DH10Bac感受态细胞，转座子Tn7在Helper质粒编码的转座酶作用下，将供体质粒携带的E基因转座入到Bacmid中靶位点mini-attTn7，破坏LacZa基因的表达。在含有X-gal和IPTG的培养基上培养筛选，重组的Bacmid菌斑呈现白色，而非重组则为蓝色。从而快速简便筛选获得重组病毒。
转座位点示意图如图2。
实施例3、家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征疫苗蛋白GP5
用重组病毒(rBmNPVBacmid/ORF5)液感染五龄起蚕作为实验组，以不作感染处理的同等五龄起蚕作为对照组。感染第二天的蚕食欲减退，蚕沙形状不正常。感染四天后，蚕四处爬逸，皮肤失去弹性，体态松弛柔软，环节节间膜处呈黄褐色。感染第五天，蚕体明显缩小，体色呈暗黑色。因此，应在感染后的第五天，及时抽取家蚕的血淋巴，500×g离心5min以除去杂质，上清中因含大量病毒，4℃临时储存或者-80℃长期储存备用。
分别取对照组和实验组的50μl血淋巴，对应加入到等体积的2×SDS样品缓冲液的清洁离心管中，100℃水浴煮5～8分钟，取出于-20℃冰箱放置1h或者过夜。4℃，14000rpm，离心5min，进行10％SDS-PAGE鉴定。鉴定结果如图3所示。
图3中，1为Marker，2为对照蚕血淋巴上清，3为野生NPV感染家蚕的血淋巴上清，4为重组病毒液感染家蚕的血淋巴上清。图3所示在第四泳道中，出现一条大约40KD的明显条带，其分子量与E大小相当。再根据WESTERN杂交分析证明E蛋白在家蚕中得到很好的表达。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO：1
tctggatcca tgttggggaa gtgcttg 27
SEQ ID NO：2
tctggtaccc tagagacgac cccattg 27
Claims (1)
1.用家蚕表达猪呼吸与繁殖综合征疫苗蛋白GP5，其特征是按照如下方法制备而得：
1)、转座质粒pFastBacHTbORF5的构建：
以PRRSV全基因组序列为模板、以pE1、pE2为引物进行扩增；扩增产物E经BamHI、KpnI酶切后克隆到pFastBacHTb的BamHI、KpnI位点之间，所得重组质粒命名为pFastBacHTbORF5；
2)、重组病毒的获得：
先以pFastBacHTbORF5转化DH10Bac感受态；然后于SOC培养基上培养；选择PCR鉴定为阳性的菌接种，提取Bacmid；所提取的Bacmid为重组病毒rBmNPVBacmid/ORF5。
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