CN103275193B

CN103275193B - 一种重复串联表达gp5优势抗原表位检测prrsv抗体的间接elisa方法

Info

Publication number: CN103275193B
Application number: CN201310201960.XA
Authority: CN
Inventors: 陈如敬; 周伦江; 车勇良; 王隆柏; 吴学敏; 魏宏; 严山; 刘玉涛
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN103275193A

Abstract

本发明涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的间接ELISA方法，即利用pGEX-6p-1原核表达载体，利用已经筛选到的PRRSVGP5蛋白的一个线性保守中和表位（表位B）可被单抗识别又能被猪抗PRRSV中和血清识别；另外一个是高变异性免疫优势表位（A），为提高表达蛋白的抗原活性将两个表位进行重复串联，构建了能够分泌表达GP5蛋白优势抗原表位的基因工程菌BLpGEX-6p-GP5，并将表达的重组蛋白纯化复性后包被ELISA板，建立用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法，用以检测猪血清中PRRSV的抗体水平，结果表明该方法具有重复性好、特异性高的特点，可用于PRRSV血清学调查。

Description

一种重复串联表达GP5优势抗原表位检测PRRSV抗体的间接ELISA方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法，属于动物传染病学领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）是由 PRRS 病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状为特征的高度接触性传染病。该病于1987年在美国首次被报道，并迅速蔓延到世界各地，给生猪养殖业造成巨大的经济损失。我国台湾地区1991年首次发现该病，1996年郭宝清报道我国内的有该病流行，目前仍是危害我国养猪业的重要疫病。

PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒，目前有2个血清型：美洲型和欧洲型。基因组大小约为15kb，包含8个开放阅读框（ORFs）。其中ORF5编码的病毒糖基化囊膜蛋白GP5蛋白是PRRSV的主要结构蛋白，参与病毒入侵宿主细胞的过程，并诱导产生中和抗体。此外，GP5蛋白还具有诱导细胞凋亡、参与病毒粒子结合病毒受体的过程等作用。因此，GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面研究中具有重要意义，是研制基因工程疫苗的最近候选基因。

GP5是由ORF-5编码的N端糖基化囊膜蛋白，GP5蛋白核苷酸序列不同毒株间变异较大。同型毒株间氨基酸的同源性在88-99%之间，而欧洲型和美洲型氨基酸同源性只有55%左右。在成熟病毒粒子中，通常与M蛋白通过二硫键以异二聚体形式存在。GP5的免疫原性与M蛋白、N蛋白相似，只是在PRRSV感染细胞内表达水平较低。体外中和试验均已证明抗GP5抗体具有中和活性，GP5蛋白在诱导PRRSV特异性细胞凋亡有关。

欧洲型和美洲型GP5之间存在有共同抗原表位，也存在型独特性表位。GP5上至少存在2个线性中和表位，但也有构象决定簇。根据GP5特异性单抗抗GP5蛋白缺失突变株及与蛋白3个亲水区序列一致的合成短肽的反应性，确定了2个PRRSV抗原性有重要作用的区域：位于胞外区（aa27-41）和位于C端（aa180-197）。Ostrowshi利用噬菌体展示技术，筛选到2个表位：一个线性保守中和表位（表位B）可被单抗识别又能被猪抗PRRSV中和血清识别；另外一个是高变异性免疫优势表位（A）（Ostrowski M, Galeota J, Jar A, et al. Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain[J]. J Virol, 2002, 76(9):4241-4250.）。此外，有研究发现，GP5蛋白aa170-201与PRRSV阳性血清具有良好的反应性，且该区域在2个PRRSV型间高度保守，可用于快速诊断，针对这个表位的单抗可以中和病毒，降低其致病力。

发明内容

本发明是将表位A和表位B进行重复串联后克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上，进行条件优化表达，成功表达出可溶性的具有GP5优势抗原表位的融合蛋白，并进行纯化。经过Western blot 和间接ELISA结果均表明，所表达的融合蛋白均有较好的生物学活性，可用于PRRSV感染的血清学诊断。

本发明提供一种重组蛋白，以及一种基于该重组蛋白的用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法，即：利用pGEX-6p-1原核表达载体，利用已经筛选到的PRRSV GP5蛋白的一个线性保守中和表位（表位B）可被单抗识别又能被猪抗PRRSV中和血清识别；另外一个是高变异性免疫优势表位（A），为提高表达蛋白的抗原活性将两个表位进行重复串联，构建了能够分泌表达GP5蛋白优势抗原表位的基因工程菌BLpGEX-6p-GP5，并将表达的重组蛋白纯化复性后包被ELISA板，用以检测猪血清中PRRSV的抗体水平，结果表明该方法具有重复性好、特异性高的特点，可用于PRRSV血清学调查。

本发明提供的技术方案为一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1：

NASNDSSSHLGSGSTRVSAEQWGRPGGGSNASNDSSSHLGSGSTRVSAEQWGRP。

其制备方法为：

1）获得一种重组DNA，该重组DNA具有如权利要求1所述氨基酸序列反翻译过来并经密码子优化的核苷酸序列的，其序列如SEQ ID No.2所示。SEQ ID No.2为：

GAATTCAACGCCTCCAACGACTCTTCTTCCCACCTGGGTTCTGGCTCCACTCGTGTTTCCGCGGAGCAGTGGGGTCGTCCGGGTGGTGGTAGCAACGCATCTAATGATAGCAGCTCTCATCTGGGCAGCGGCTCTACCCGCGTGTCTGCTGAACAGTGGGGCCGTCCATAACTCGAG；碱基序列是根据氨基酸序列反翻译过来并经密码子优化的（有下划线的碱基部分是EcoRI/XhoI位点）。

获得步骤1)所述重组DNA的方法是：根据已经鉴定的PRRSV抗原线性保守表位（GP530）和高变异性优势表位（GP5190）的氨基酸特征，设计2个拷贝数的重复序列进行串联表达，并在序列中引入EcoRI限制性酶切位点和XhoI限制性酶切位点。

2）将步骤1）的重组DNA利用基因工程重组技术构建能够分泌表达GP5蛋白优势抗原表位的基因工程质粒pGEX-6p-GP5；

3）将质粒pGEX-6p-GP5转入宿主大肠杆菌BL21成为基因工程菌BLpGEX-6p-GP5，将BLpGEX-6p-GP5在LB培养基中培养，利用IPTG诱导表达并进行条件优化，所表达的蛋白经分析该重组蛋白为分泌表达型；

4）将重组蛋白通过亲和层析柱进行纯化后复性。

获得步骤1)所述重组DNA的方法是：根据已经鉴定的PRRSV抗原线性保守表位（GP530）（即表位B）和高变异性优势表位（GP5190）（即表位A）的氨基酸特征，设计2个拷贝数的重复序列进行串联表达，并在序列中引入EcoRI限制性酶切位点和XhoI限制性酶切位点。

一种测定猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA方法，其特征在于所述ELISA方法是以上述的重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白为包被抗原。

具体测定步骤为：

a、包被：将重组蛋白用抗原包被液稀释至含重组蛋白7.5ug/mL的终浓度，每个ELISA孔加入100uL，4℃包被过夜，PBS-T缓冲液洗涤5min，重复三次；所述的抗原包被液为0.05mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液；所述BPS-T缓冲液为含终浓度0.01% Tween-20的PBS缓冲液。

b、封闭：每空加入5%脱脂奶粉的PBS-T封闭液100uL，37℃作用2h，PBS-T缓冲液洗涤5min，重复三次；

c、加待检血清：每孔加入100uL用抗体稀释液1:100倍稀释的猪血清，37℃作用2h，PBST缓冲液洗涤5min，重复三次；

d、加酶标二抗：每孔加入100uL用抗体稀释液以1：3000稀释的兔抗猪IgG/辣根酶（HRP），37℃作用2h，PBST缓冲液洗涤5min，重复三次；

e、加显色液：每孔加入100uL含1mg/mL四甲基邻苯二胺的显色液，37℃作用15min；

f、加终止液：每孔加入100uL终止液，用酶标仪测定OD450值；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；

g、结果判定：待检血清OD450值≧0.254时，判定为PRRSV抗体阳性；待检血清OD450值﹤0.212，判定为PRRSV抗体阴性；0.212≦待检血清OD450值﹤0.254时，判为可疑，需重新检测；若重新检测待检血清OD450值仍然为在0.212≦待检血清OD450值﹤0.254时，判为阴性。

附图说明

图1：重组蛋白表达的SDS-PAGE分析; pGEX-6p-GP5的原核表达，其中M: 蛋白质分子量标准; 1: 没有异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导; 2: 菌体; 3: 超声裂解上清; 4:超声裂解沉淀

图2：蛋白纯化的SDS-PAGE分析； pGEX-6p-GP5的蛋白的纯化

图3：表达目的蛋白纯化后的western blot结果；其中 M: 预染的蛋白质分子量标准; 1: 目的蛋白;

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例 1

1）根据已经鉴定的PRRSV抗原线性保守表位（GP530）和高变异性优势表位（GP5190）氨基酸特征，设计2个拷贝数的重复序列进行串联表达，并在序列中引入EcoRI限制性酶切位点和XhoI限制性酶切位点，得到重组DNA。氨基酸序列为：NASNDSSSHLGSGSTRVSAEQWGRPGGGSNASNDSSSHLGSGSTRVSAEQWGRP，其中GGGS为linker。

重组DNA的序列为SEQ ID No.2所示。

2）阳性重组质粒pGEX-6p-GP5的构建

将基因合成的重组DNA和原核表达载体pGEX-6p-1用EcoRI和XhoI进行双酶切后用T4 DNA连接酶进行连接过夜，转化DH5α感受态细胞后，挑菌摇菌后提取质粒进行双酶切鉴定，将阳性重组质粒送宝生物工程有限公司进行序列测定。测序鉴定为阳性的重组质粒即为阳性重组质粒pGEX-6p-GP5。

3）目的蛋白的表达

将鉴定的阳性重组质粒pGEX-6p-GP5转化BL21大肠杆菌感受态细胞中，挑取单个菌落接种LB培养基基，培养过夜。取100μL菌液加入到5mL LB培养基中震荡培养至OD值为0.5（0.4-0.6左右）时，加入IPTG（0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM、1.6mM）

，取不同时间段（诱导表达1h、2h、3h、4h）表达产物1mL，超声裂解后进行SDS-PAGE。结果如图1所示；

4）表达产物的纯化

按照步骤3）中优化的条件进行大规模培养，按照GST蛋白纯化说明书进行纯化。纯化后同样进行SDS-PAGE。结果如图2所示；

5）纯化蛋白的western blot分析

将纯化的蛋白进行western blot分析，一抗为GST Mab（1:1000），酶标二抗为羊抗鼠IgG/辣根酶（HRP）（1:3000），按常规步骤做western-blot，用DAB显色观察结果。结果如图3所示。

6） ELISA方法的建立

用纯化后的重组蛋白为包被抗原制备ELISA平板，检测猪血清中PRRSV抗体水平，并对影响实验的各种条件进行优化选择。

a) 抗原包被浓度与血清最佳稀释度

采用矩阵滴定法，横排选择抗原浓度（30 ug/mL 、15 ug/mL 、7.5ug/mL、3.75 ug/mL），纵排选择抗体稀释度（1:50、1:100、1:200、1:400），每个稀释度重复1次，取平均值。结果，当抗原浓度为7.5ug/mL，待检血清1:100稀释时，P/N值最大，因此，最近抗原包被浓度为7.5ug/mL，抗体最佳稀释度为1:100。

b) 抗原包被时间的确定

用最佳抗原浓度包被酶标板，包被条件为：37℃作用2h、37℃作用4h、4℃作用过夜，结果4℃作用过夜包被效果最好。

c) 血清最佳反应时间

加入血清后，反应时间为30min、60min、90min、120min和150min，进行ELISA检测，结果作用120min效果最好。

d) 酶标二抗最佳反应时间

加入酶标二抗后，反应时间为30min、60min、90min、120min和150min，进行ELISA检测，结果作用120min效果最好。

e) 底物最佳反应时间的确定

加入底物（TMB）后，反应时间为5min、10min、15min、20min和30min，进行ELISA检测，结果作用15min效果最好。

f) 最佳ELISA临界值的确定

在最佳工作浓度条件下，对收集的30份PRRSV抗体阴性的猪血清进行间接ELISA方法检测，确定阴阳性临界值（X±3SD）值为0.254，（X±2SD）值为0.212。

g) 间接ELISA的特异性和重复性试验

利用所表达的可溶蛋白作为诊断抗原包被ELISA方法检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）阳性血清、猪伪狂犬病毒（PRV）阳性血清、猪瘟病毒（CSFV）阳性血清、猪圆环病毒（PCV2）阳性血清、猪细小病毒（PPV1）阳性血清，所检测OD₄₅₀值均小于0.212，检测结果均为阴性，表明所建立的方法与上述病毒无交叉反应，特异性好。对PRRSV抗体效价高、中、低的三份血清进行测定，计算板内、板间的变异系数，结果均在5%以内，表明所建立的间接ELISA方法有较好的重复性。

h) 临床样品的检测

利用a）-g）步骤所优化好的条件包被ELISA平板，并对15份未免疫PRRSV疫苗的猪血清，70份采自某大型猪场已免疫勃林格茵格发猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（Ingelvac:emoji: PRRS MLV），结果可见，15份未免疫猪血清检测OD₄₅₀值均小于0.212，70份采自某大型猪场已免疫勃林格茵格发猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（Ingelvac:emoji: PRRS MLV）4周后猪血清检测OD₄₅₀值均大于0.85以上，符合实验预期，表明本专利建立的ELISA方法可用于PRRSV的临床检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种重复串联表达GP5优势抗原表位检测PRRSV抗体的间接ELISA方法

<160> 2

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 54

<212> PRT

<213> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<400> 1

Asn Ala Ser Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gly Ser Gly Ser Thr Arg

1 5 10 15

Val Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro Gly Gly Gly Ser Asn Ala Ser

20 25 30

Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gly Ser Gly Ser Thr Arg Val Ser Ala

35 40 45

Glu Gln Trp Gly Arg Pro

50

<210> 2

<211> 177

<212> DNA

<213> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<220>

<221> source

<222> 1..177

<223> /organism="福建省农业科学院畜牧兽医研究所"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 2

gaattcaacg cctccaacga ctcttcttcc cacctgggtt ctggctccac tcgtgtttcc 60

gcggagcagt ggggtcgtcc gggtggtggt agcaacgcat ctaatgatag cagctctcat 120

ctgggcagcg gctctacccg cgtgtctgct gaacagtggg gccgtccata actcgag 177

Claims

1.一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述的重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白的制备方法，具体为以下步骤：

1）获得一种重组DNA，该重组DNA具有如权利要求1所述氨基酸序列反翻译过来并经密码子优化的核苷酸序列，其序列如SEQ ID No.2所示；

4）将重组蛋白通过亲和层析柱进行纯化后复性。

3.如权利要求2所述的一种重复串联表达GP5优势抗原的重组蛋白的制备方法：其特征在于获得步骤1)所述重组DNA的方法是：根据已经鉴定的PRRSV抗原线性保守表位GP530和高变异性优势表位GP5190的氨基酸特征，设计2个拷贝数的重复序列进行串联表达，并在序列中引入EcoRI限制性酶切位点和XhoI限制性酶切位点。