CN102876699B

CN102876699B - 靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立方法

Info

Publication number: CN102876699B
Application number: CN 201210365489
Authority: CN
Inventors: 缪云根; 周芳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2032-09-27
Also published as: CN102876699A

Abstract

本发明公开了一种靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法，设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。本发明还同时公开了重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，包括设计靶向基因shRNA--ORF6-6e，通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将ORF6-6e的shRNA酶切连接到pMD18-T Simple载体上，并通过酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上。本发明还同时公开了该转基因细胞系的用途：对PRRSV型病毒具有抑制作用。

Description

靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立方法

技术领域

本发明设计一种抗猪蓝耳病病毒转基因细胞系的构建；具体地讲，本发明设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的Marc-145细胞克隆。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症于上世纪80年代末首次在美国发现，其致病病原为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRS virus，PRRSV)，主要造成母猪繁殖障碍和大量仔猪死亡，仔猪发病率100%，死亡率50%以上，母猪流产率达30%以上，是一种重要的动物疫病。

近年猪蓝耳病在我国大面积暴发，防治高致病性蓝耳病的根本有效措施主要依靠疫苗，但成本高、手续烦琐，而且价格非常昂贵，极大的增加了养殖成本，增加了猪农的负担，应用范围受到极大限制。

猪蓝耳病（PRRS）是严重危害养猪业的病毒性传染病，死亡率极高，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。虽然国内外对PRRS的疫苗研究非常活跃，但到目前为止，仍没有一种疫苗可对猪体产生完全安全的保护，普遍存在难以诱发较早和较高的抗体水平等问题。

Marc-145细胞来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续传代培养。Marc-145细胞是目前对PRRSV最敏感的细胞系之一。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种靶向基因shRNA干扰猪生殖与呼吸综合症病毒增殖和复制的转基因细胞系的构建方法及相应的重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，为开辟控制猪PRRS感染和减少其危害提供技术支持。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，包括以下步骤：

1）、设计靶向基因shRNA：

ORF6-6e：

5'-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3'

3'-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5'；

2）、构建重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA：

通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将ORF6-6e 所述的shRNA酶切（EcoRI-BamHI

）连接到pMD18-T Simple载体上，并通过BglII-EcoRV酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上，构建了重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA。

本发明还同时提供了一种靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法：设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA（即，ORF6-6e），并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。

作为本发明的转基因细胞系的构建方法的改进，利用重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA进行细胞转染，包括以下步骤：

将重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA用lipofectin2000(Invitrogen)转染试剂转染Marc-145细胞；

到细胞增长接近汇合时按1：10密度（即细胞密度稀释10倍）传代，继续培养；培养基为含有10%（体积浓度）胎牛血清的DMEM（Gibco）基本培养基；即，该培养基的制备方法为：在每升DMEM（Gibco）基本培养基中加入100ml的胎牛血清；

待细胞密度增至50％～70％汇合时，加入G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基，每3-5天更换一次G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基；当有大量细胞死亡（即超过80%的细胞死亡）时，改用G418浓度为600μg/ml的筛选培养基维持筛选（即，将G418浓度减半进行筛选）；每3-5天更换一次G418浓度为600μg/ml的筛选培养基；筛选10～14天后，有抗性的克隆细胞出现，改用含有10%（体积浓度）胎牛血清的DMEM（Gibco）基本培养基进行培养（即停药培养），待克隆细胞逐渐增大后，将克隆细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆；从而获得靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系；

上述培养和筛选的条件均为：于37℃，5% CO₂培养箱中培养。

G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基的制备方法为：培养基中加入G418直至G418的浓度为1200μg/ml，该培养基为含有10%（体积浓度）胎牛血清的DMEM（Gibco）基本培养基。

G418浓度为600μg/ml的筛选培养基的制备方法为：培养基中加入G418直至G418的浓度为600μg/ml，该培养基为含有10%（体积浓度）胎牛血清的DMEM（Gibco）基本培养基。

本发明还同时提供了利用上述方法构建而得的靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的用途：对PRRSV型病毒具有抑制作用。

本发明的具体技术方案如下：

步骤(1) 、设计能有效阻止猪蓝耳病病毒的增殖和复制的靶向基因shRNA：

1-1 靶向基因shRNA设计：

根据PRRSV病毒的基因组序列，以ORF5和ORF6为目的基因，选取一段19bp长的核酸序列。该序列不要在5’和3’非翻译区，以及起始密码子后75bp；将候选的19bp核酸序列，与相应的基因组进行比对，以确定该序列是特异性的只针对目的基因，与其他基因没有相似性。根据以上原则分别设计了5对针对PRRSV-ORF5基因和5对针对PRRSV-ORF6基因的shRNA。

1-2 体外shRNA活性检测：

设计合成的shRNA序列经退火反应形成具有粘性末端的双链，直接连接到线性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上，构建成RNA干扰载体；将上述质粒DNA，分别在转染试剂介导下导入Marc-145细胞，24小时后进行荧光观察，确定转染效率（图1）。转染24小时后对细胞接种PRRSV病毒，接毒72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测细胞中病毒相对表达量，分析所设计的shRNA对PRRSV型病毒的抑制作用（图2）。由图2可见，针对ORF5和ORF6设计的共10对shRNA均表现出抑制PRRSV病毒增殖复制的作用，但不同shRNA的抑制效果存在差异（0.71%-67.52%）。其中ORF6-6e的病毒相对表达量仅为0.71%，表现出较显著的对PRRSV病毒复制与增殖的抑制作用，可作为转基因的候选shRNA序列。

步骤(2) 抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因载体构建：

2-1抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因载体构建。经体外shRNA活性检测，筛选出有效阻止PRRSV感染的shRNA，构建转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA（图3）。

2-2抗猪蓝耳病病毒活性检测。将构建好的上述质粒DNA，在转染试剂介导下导入Marc-145细胞，24小时后进行荧光观察，确定转染效率。转染24小时后对细胞接种PRRSV病毒，接毒48-72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测病毒感染后，细胞中病毒相对表达量，分析转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA对PRRSV型病毒的抑制作用。

步骤(3) 抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立：

3-1 建立转基因细胞系：

将上述转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA和helper质粒用lipofectamine 2000转染试剂转染Marc-145细胞。转染后培养24小时，观察荧光蛋白的表达情况。到细胞增长接近汇合时按1：10密度传代（即细胞密度稀释10倍），继续培养。待细胞密度增至50％～70％汇合时，加入按最佳筛选浓度配制好的G418（1200μg/ml）筛选培养基。根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3-5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选（也需每3-5天更换一次筛选培养基）；筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；将细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆（图4）。在荧光显微镜下观察这些克隆GFP的表达情况。

3-2 抗猪蓝耳病病毒活性检测：

对转基因细胞系接种PRRSV病毒，接毒48-72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测细胞中病毒相对表达量，分析转基因细胞系对PRRSV型病毒的抑制作用（图5）。

步骤(4) 抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞基因组中目标插入基因检测：

4-1 抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞基因组中GFP和Neomycin^r插入片段的检测：

以转基因细胞系为材料抽提细胞基因组（模板），分别设计GFP引物（1400bp）和Neomycin^r引物序列（≈2000bp）进行PCR扩增。PCR扩增的条件为94℃预变性5 分钟, 再以 94℃/45sec，55℃/45sec，72℃/3min，共35个循环，最后72℃延长10分钟。可从转基因细胞系的基因组中扩增获得GFP基因和Neomycin^r基因，表明该两基因分别被重组到猪基因组中（图6）。

4-2 抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞cDNA中GFP和Neomycin^r插入片段的检测：

以转基因细胞系为材料抽提细胞RNA进行反转录合成cDNA（模板），分别设计GFP引物（1400bp）和Neomycin^r引物序列（≈2000bp）进行PCR扩增。PCR扩增的条件为94℃预变性5 分钟, 再以 94℃/45sec，55℃/45sec，72℃/3min，共35个循环，最后72℃延长10分钟。可从转基因细胞系的cDNA中扩增获得GFP基因和Neomycin^r基因，表明该两基因分别被重组到猪基因组中（图7）。

4-3 抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞基因组中shRNA插入片段的检测：

以转基因细胞系为材料抽提基因组，设计shRNA PCR扩增引物序列（≈310bp ）：F：AAGTAACAAAACTTTTATCG和R：ATTCCTTCATATTTGCATA。该扩增序列包含载体序列LTR、shRNA(6e)和U6启动子的序列。转基因细胞系可从基因组中扩增获得shRNA基因（图8）。

本发明的有益效果如下：

利用RNA干扰技术，建立一种能有效抑制猪蓝耳病靶向基因增殖的转基因细胞系，为从遗传的角度根除猪蓝耳病病毒的感染提供理论依据和试验基础。减少养猪的疫病控制成本，为生命科学研究提供科学依据，同时，利用转基因技术，转基因细胞系的建立从育种的角度为开辟控制猪蓝耳病病毒感染和减少其危害的技术奠定基础，是未来的重要发展趋势。

附图说明

图1是含PRRSV-ORF6e-shRNA表达质粒转染Marc-145细胞24 h后的荧光观察图（100μm）；

左图代表含shRNA的重组质粒转染Marc-145细胞荧光蛋白表达情况；右图代表对照组Marc-145细胞。

图2 是pSIREN-shRNA抗病毒能力检测图；

图中Control代表对照，即未经RNA干扰载体转染；

5b~5e、6a~6e分别代表用于转染的RNA干扰载体含有PRRSV-ORF5b\5c\5d\5e和PRRSV-ORF6a\6b\6c\6d\6e shRNA序列。

图3 转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建示意图。

图4 具有抑制PRRSV增殖能力的转基因细胞系；

上图左（50μm）为：转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA转染Marc-145细胞后采用G418筛选10日的细胞；

上图右（100μm）为：Marc-145细胞转染后继续通过G418筛选30天，观察到阳性细胞单克隆化形成的单个细胞岛；

下图（100μm）为：将上述单克隆细胞逐步扩大培养筛选得到的形态和活力都较好的单克隆细胞株。

图5是转基因细胞系抑制PRRSV增殖效果图；

对照（Control），即未经RNA干扰载体转染的Marc-145细胞PRRSV攻毒后的病毒表达量；

Xl-BacⅡ-FRT-EGFP-NEO-N:阳性对照，即经Xl-BacⅡ-FRT-EGFP-NEO-N 阳性干扰载体转染的Marc-145细胞PRRSV攻毒后的病毒表达量；

Xl-BacⅡ-FRT-EGFP-NEO-6e: 经Xl-BacⅡ-FRT-EGFP-NEO-6e干扰载体转染的Marc-145细胞PRRSV攻毒后的病毒表达量。

图6 转基因细胞系基因组中扩增获得GFP和Neomycin^r基因序列。

图7 转基因细胞系cDNA中扩增获得GFP和Neomycin^r基因序列。

图8 转基因细胞系基因组中扩增获得shRNA基因序列；

6e代表含PRRSV-ORF6e-shRNA转基因细胞系扩增获得shRNA基因序列（≈310bp ）；

阴代表模板采用对照细胞系；

H2O代表PCR反应体系中添加水，不加模板；

阳代表以转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA为模板；

M代表DNA分子量标记。

具体实施方式

实施例1、针对猪蓝耳病病毒的增殖和复制的靶向基因shRNA的设计、合成、载体构建

根据PRRSV-ORF5和PRRSV-ORF6蛋白基因的结构序列和shRNA序列设计原则，分别针对PRRSV-ORF5和PRRSV-ORF6各设计了5对shRNA序列；这10对shRNA序列具体如下表1和表2所述：

表1、针对PRRSV-ORF5的shRNA设计

Figure 2012103654893100002DEST_PATH_IMAGE001

表2、针对PRRSV-ORF6的shRNA设计

Figure 2012103654893100002DEST_PATH_IMAGE002

这10对shRNA序列经退火反应形成具有粘性末端的双链，分别直接连接到线性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上，从而构建成10种RNA干扰载体；将质粒（即上述10种RNA干扰载体）的DNA，分别在转染试剂介导下导入Marc-145细胞，24小时后进行荧光观察，确定转染效率。转染24小时后对细胞接种PRRSV病毒，接毒48-72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过免疫荧光的方法分别测上清和细胞中病毒的TCID₅₀，分析所设计的shRNA对PRRSV病毒的抑制作用。

PRRSV病毒为猪蓝耳病病毒PRRSV分离株JX株（GenBank登录号AF046869.1）。

图1结果表明：所构建的载体转染细胞24小时（具体为：含PRRSV-ORF6e-shRNA表达质粒转染Marc-145细胞24 h）后用荧光显微镜均可观察到绿色荧光蛋白；说明构建成功。

备注说明：其余9种RNA干扰载体转染细胞24小时用荧光显微镜，也均可观察到绿色荧光蛋白。

图2所示分别代表用于转染的RNA干扰载体含有上表中PRRSV-ORF5b\5c\5d\5e和PRRSV-ORF6a\6b\6c\6d\6e shRNA序列。

根据图2，我们得知基因名称为pSIREN-6e的shRNA序列表现出对PRRSV病毒复制增殖的抑制作用，可作为转基因的候选shRNA序列。

实施例2、抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立

将载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA和helper分别用lipofectamine 2000、FuGENE

HD和Lipofectamine LTX & PLUS 三种转染试剂转染Marc-145细胞，比较转染效率、克隆形成率以及阳性克隆率，从而筛选出一个适合shRNA高效率转染的筛选方法。

具体如下：

2.1 重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建

如图2所示，通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，并将shRNA（6e）酶切（EcoRI-BamHI

）连接到pMD18-T Simple载体上，并通过BglII-EcoRV酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上，构建重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA，构建的重组载体通过酶切和测序鉴定，确认带有新霉素筛选标记NEO以及绿色荧光蛋白基因zsGFP。

备注说明：ZsGFP是以通过市购的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体为模板，经PCR 扩增获得（为公知技术）； PXL-BAC2为市购的通用转座载体。

2.2 采用核酸抽提试剂盒提取PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA和Helper质粒DNA。PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA质粒用EcoR V 37℃酶切4h，将酶切产物通过乙醇沉淀回收获得需转染的目的基因，测其核酸浓度，-20℃保存备用。Helper质粒如上操作。

2.3 G418对Marc-145细胞毒性试验

将Marc-145细胞稀释至1000个cell/ml，24孔板中每孔加100μl。每孔中的氨基糖苷类抗生素G418浓度分别为300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，800μg/ml，900μg/ml，1000μg/ml，1100μg/ml，1200μg/ml，1300μg/ml，1400μg/ml，同时设立不加G418做为空白对照。每3天换一次液，同时补加G418至同样浓度，每天观察细胞生长或死亡情况。选择出在筛选10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度作为最佳筛选浓度。

在本发明中，在筛选14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度为1200μg/ml，因此，最佳筛选浓度为1200μg/ml。

2.4 细胞转染

将步骤2.2所得的目的基因--载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA和helper分别用lipofectin2000(Invitrogen)转染试剂转染Marc-145细胞。转染方法分别按lipofectin2000(Invitrogen)说明书进行。到细胞增长接近汇合时按1：10密度传代，继续培养；培养条件为：于37℃，5% CO₂培养箱中传代培养；培养基为含有10%胎牛血清（FBS, GibcoBRL Life Technologies）的DMEM（Gibco）基本培养基；即，在每升DMEM（Gibco）基本培养基中加入100ml的胎牛血清。待细胞密度增至50％～70％汇合时，加入按最佳筛选浓度配制好的G418（1200μg/ml）筛选培养基。根据筛选培养基的颜色和细胞生长情况，每3-5天更换一次G418（1200μg/ml）筛选培养基。当有大量细胞死亡（即超过80%的细胞死亡）时，可以把G418浓度减半（即，改用G418（600μg/ml）筛选培养基）维持筛选，每3-5天更换一次G418（1200μg/ml）筛选培养基。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，如图3所示，停药培养（即，在含有10%胎牛血清（FBS, GibcoBRL Life Technologies）的DMEM（Gibco）基本培养基中培养），待其逐渐增大后，将细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆；从而获得靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系。

备注说明：上述筛选和培养均在37℃，5% CO₂的培养箱中进行。

G418（1200μg/ml）筛选培养基的制备方法为：培养基中加入G418直至G418的浓度为1200μg/ml，该培养基为含有10%胎牛血清（FBS, GibcoBRL Life Technologies）的DMEM（Gibco）基本培养基。

G418（600μg/ml）筛选培养基的制备方法为：培养基中加入G418直至G418的浓度为600μg/ml，该培养基为含有10%胎牛血清（FBS, GibcoBRL Life Technologies）的DMEM（Gibco）基本培养基。

2.5转基因细胞系抗猪蓝耳病病毒活性检测

对转基因细胞系接种PRRSV病毒，接毒48-72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测细胞中病毒相对表达量，分析转基因细胞系对PRRSV型病毒的抑制作用。

由图5可见，转基因细胞系（即，转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA转染Marc-145细胞后采用G418筛选所得的细胞系，特指含PRRSV-ORF6e shRNA序列的转基因细胞系）抗PRRSV病毒增殖能力检测，与对照组（未经转染的Marc-145细胞系）相比，其中含PRRSV-ORF6e shRNA序列的转基因细胞系抑制病毒增殖能力高达99%。

实施例3、抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞中目标基因整合及表达检测

3.1转基因细胞系基因组中GFP和Neomycin^r插入片段的检测

以实施例2获得的转基因细胞系为材料抽提基因组为模板，分别设计上下游引物，具体为：如SEQ ID NO 1所述的GFP引物序列（PCR扩增产物包含CMV+GFP，预测分子量为1400bp）和如SEQ ID NO 2所述的Neomycin^r引物序列（以此引物经PCR扩增后产物分子量预测为2000bp）进行PCR扩增。

SEQ ID NO 1：转基因细胞系GFP扩增引物序列（CMV+GFP≈1400bp）

EGFP-F: 5’-GagatctgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG-3’

EGFP-R: 5’-GaagcttTTCACCGTCATCACCGAAA-3’

SEQ ID NO 2：转基因细胞系Neomycin^r扩增引物序列（≈2000bp）：

Neo-F: 5’-GaagcttATGAGACAATAACCCTGATAAATG-3’

Neo-R: 5’-GgatatcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcCAGACATGATAAGATACATTGATGA-3’

备注说明：CMV为巨细胞病毒启动子基因。

PCR扩增体系：基因组DNA 1μl，上下游引物（浓度10μM）各1μl，Premix ExTaq 10μl，加ddH₂O至终体积为20μl。

PCR扩增的条件为：PCR扩增的条件为94℃预变性5 分钟, 再以 94℃/45sec，55℃/45sec，72℃/3min，共35个循环，最后72℃延长10分钟。

如图6所示：可从转基因细胞系基因组中扩增获得GFP基因和Neomycin ^r基因，表明该两基因分别被重组到猪基因组中，转基因成功。

3.2 转基因细胞系cDNA中GFP和Neomycin^r插入片段的检测

以实施例2获得的转基因细胞系为材料抽提细胞RNA，进行反转录合成cDNA（模板），分别设计同上文的上下游引物：GFP引物序列（PCR扩增产物包含CMV+GFP，预测分子量为1400bp）和Neomycin^r引物序列（以此引物经PCR扩增后产物分子量预测为2000bp）进行PCR扩增。

PCR扩增体系：cDNA 1μl，上下游引物（浓度10μM）各1μl，Premix ExTaq 10μl，加ddH₂O至终体积为20μl。

如图7所示,可从转基因细胞系的cDNA中扩增获得GFP基因和Neomycin^r基因，该结果说明GFP基因和Neomycin^r基因不仅已转座到猪基因组中，而且能转录成mRNA。

3.3 转基因细胞系基因组中shRNA插入片段的检测。

以实施例2获得的转基因细胞系为材料抽提基因组为模板，设计如SEQ ID NO 3所述的 shRNA插入片段扩增引物序列，进行PCR扩增。该扩增产物，包括载体序列LTR、shRNA(6e)和U6启动子的序列，预测分子量≈ 310bp。

SEQ ID NO 3：转基因细胞系shRNA插入片段扩增引物序列（≈310bp）：

F：AAGTAACAAAACTTTTATCG

R：ATTCCTTCATATTTGCATA

如图8所示，转基因细胞系可从基因组中扩增获得shRNA基因。表明本发明设计合成的shRNA已经转到猪基因组中，证实能产生RNA干扰作用，干扰和抑制PRRSV病毒的增殖。

对比实验：

本发明是针对猪蓝耳病病毒增殖相关基因ORF5和ORF6设计shRNA,通过RNA干扰作用，抑制猪蓝耳病病毒（PRRSV）的增殖，从而表现出抗病毒作用。由于其靶向基因是猪蓝耳病病毒增殖相关基因ORF5和ORF6，因此仅对猪蓝耳病病毒有用，而对别的病毒不起作用；从而具有靶向性。具体如下：

将本发明所得的转基因细胞系（即，转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA转染Marc-145细胞后采用G418筛选所得的细胞系，特指含PRRSV-ORF6e shRNA序列的转基因细胞系）分别接种猪圆环病毒Ⅰ（PCV-Ⅰ）和猪圆环病毒Ⅱ(PCV-Ⅱ)，接毒48-72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测细胞中病毒相对表达量，分析转基因细胞系分别对上述病毒的抑制作用。

结果表明：含PRRSV-ORF6e shRNA序列的转基因细胞系对上述猪圆环病毒Ⅰ（PCV-Ⅰ）和猪圆环病毒Ⅱ(PCV-Ⅱ)病毒的增殖均无抑制作用。

Claims

1.重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）、设计靶向基因shRNA：

ORF6-6e：

5'-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3'

3'-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5'；

2）、构建重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA：

通过PCR扩增EGFP和NEO片段，将步骤1）所述的靶向基因shRNA利用EcoRI-BamHI酶切连接到pMD18-T Simple载体上，并通过BglII-EcoRV酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上，构建了重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA。

2.靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法，其特征在于：设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系；

靶向基因shRNA：

ORF6-6e：

5'-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3'

3'-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5'；

构建重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA：

3.根据权利要求2所述的转基因细胞系的构建方法，其特征在于：利用重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA进行细胞转染，包括以下步骤：

将重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA用lipofectin2000转染试剂转染Marc-145细胞；

到细胞增长接近汇合时按1：10密度传代，继续培养；培养基为含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基；

待细胞密度增至50％～70％汇合时，加入G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基，每3~5天更换一次G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基；当有超过80%的细胞死亡时，改用G418浓度为600μg/ml的筛选培养基维持筛选，每3~5天更换一次G418浓度为600μg/ml的筛选培养基，筛选10～14天后，有抗性的克隆细胞出现，改用含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基进行培养，待克隆细胞逐渐增大后，将克隆细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆；从而获得靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系；

上述培养和筛选的条件均为：于37℃，5% CO₂培养箱中培养；

G418浓度为1200μg/ml的筛选培养基的制备方法为：培养基中加入G418直至G418的浓度为1200μg/ml，该培养基为含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基；

G418浓度为600μg/ml的筛选培养基的制备方法为：培养基中加入G418直至G418的浓度为600μg/ml，该培养基为含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基。

4.根据权利要求2或3所述方法构建而得的靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的用途，其特征是：靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系对PRRSV型病毒具有抑制作用。