KR102374547B1 - 재배열 로타바이러스의 제조 방법 - Google Patents
재배열 로타바이러스의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102374547B1 KR102374547B1 KR1020210070036A KR20210070036A KR102374547B1 KR 102374547 B1 KR102374547 B1 KR 102374547B1 KR 1020210070036 A KR1020210070036 A KR 1020210070036A KR 20210070036 A KR20210070036 A KR 20210070036A KR 102374547 B1 KR102374547 B1 KR 102374547B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- rotavirus
- seq
- gene segment
- cell line
- mirna
- Prior art date
Links
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 title claims abstract description 169
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 124
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 56
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 12
- 101150000874 11 gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 93
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 77
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 58
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 47
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 34
- 241000617996 Human rotavirus Species 0.000 claims description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 21
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 16
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 241000702673 Bovine rotavirus Species 0.000 claims description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 8
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- 241000702677 Simian rotavirus Species 0.000 claims description 4
- 102100028253 Breast cancer anti-estrogen resistance protein 3 Human genes 0.000 claims description 3
- 241001493036 Canine rotavirus Species 0.000 claims description 3
- 102100038284 Cytospin-B Human genes 0.000 claims description 3
- 101710138767 Non-structural glycoprotein 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031776 SH2 domain-containing protein 3A Human genes 0.000 claims description 3
- 102100021798 SH2 domain-containing protein 3C Human genes 0.000 claims description 3
- 102100031056 Serine protease 57 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710197596 Serine protease 57 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 claims description 3
- 241001137860 Rotavirus A Species 0.000 claims 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 claims 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 abstract description 15
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 103
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 52
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 15
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 13
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 4
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 4
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 206010017913 Gastroenteritis rotavirus Diseases 0.000 description 3
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 3
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 102000047351 Exportin-5 Human genes 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 101000847058 Homo sapiens Exportin-5 Proteins 0.000 description 2
- 241000282561 Macaca nemestrina Species 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000867610 Chlorocebus pygerythrus Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 229940124878 RotaTeq Drugs 0.000 description 1
- 241001493038 Rotavirus G4 Species 0.000 description 1
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2720/12352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Spark Plugs (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
재배열 로타바이러스(reassortant rotavirus)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 재배열 로타바이러스에 대한 선택압(selective pressure)으로서 억제성 RNA을 이용한 역유전학 플랫폼이 제공된다.
Description
재배열 로타바이러스(reassortant rotavirus)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 재배열 로타바이러스에 대한 선택압(selective pressure)으로서 억제성 RNA를 이용한 역유전학 플랫폼이 제공된다.
로타바이러스는 전 세계적으로 영유아 및 소아에서 위장염을 유발하는 가장 흔한 원인으로, 매년 전 세계적으로 5세 이하에서 약 1억명이 로타바이러스 위장염을 앓고 약 60만명이 사망한다. 사망은 주로 개발도상국에서 발생하지만, 개발도상국이나 선진국에서의 유병률은 비슷하다. 따라서 로타바이러스 위장염을 예방하고 로타바이러스 감염에 의한 사망률을 낮추기 위해서는 백신 개발이 무엇보다 중요하다.
로타바이러스는 11개의 dsRNA 분절(segment)로 구성된 유전체를 가지고 있기 때문에, 한 세포에 여러 바이러스 주(strain)가 동시 감염될 경우 서로 다른 주의 RNA 분절들이 뒤섞인 재배열 바이러스(reassortant virus)가 생성될 수 있다. 예를 들어, 사람에게는 병독성이 없는 소(bovine) 로타바이러스의 RNA 분절과 사람에게 로타바이러스 위장염을 유발하는 인간 로타바이러스의 RNA 분절이 섞인 재배열 바이러스가 생성될 수 있다. 이러한 소-인간(bovine-human) 재배열 바이러스 중 사람에 대한 병독성을 나타내는 VP4을 코딩하는 분절은 소(bovine) 로타바이러스의 RNA 분절로, 중화 에피토프를 많이 포함하는 VP7을 코딩하는 분절은 인간 로타바이러스의 RNA 분절로 이루어진 재배열 바이러스의 경우, 사람에게 병독성이 없어서 위장염을 유발하지 않지만 인간 로타바이러스에 대한 중화항체 형성을 유도할 수 있어서 인간 로타바이러스에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 그 예가 소와 인간에서 분리된 로타바이러스를 재배열하여 약독화한 5가 백신인 로타텍(Rotateq®)이다.
재배열 바이러스를 제조하는 일반적인 방법은 하나의 세포주에 두 종류의 로타바이러스를 동시 감염시켜 재배열 바이러스를 얻는 것이나, 역유전학(reverse genetics) 방법을 적용하여 재배열이 일어날 확률을 더 높일 수 있다. 역유전학 방법은 재배열 시키고자 하는 유전자의 mRNA 또는 mRNA로 전사될 수 있는 DNA를 세포에 과량 주입하고 동시에 헬퍼 로타바이러스(helper rotavirus)를 세포에 감염시켜 주입된 mRNA와 헬퍼 로타바이러스의 유전자들이 재배열 되도록 유도하는 방법이다.
그러나 역유전학을 이용하여 재배열이 일어날 확률을 높이더라도, 재배열 바이러스는 야생형(WT) 바이러스에 비해 매우 수가 적고 약독화 되어 있어서 선택압(selective pressure)을 가하지 않으면 계대가 진행될수록 점점 더 비율이 감소하게 되어, 원하는 재배열 바이러스를 분리하고 구제(rescue)하기 매우 어렵다. 따라서 성공적인 재배열 로타바이러스를 얻기 위해서는 적절한 선별(selection) 과정이 필수적으로 도입되어야 한다.
현재, 선별 과정에 사용되는 방법은 교체시킬 유전자(예를 들어, 소 로타바이러스의 VP7 유전자)의 단백질에는 특이적으로 결합하여 중화시키지만 교체된 유전자(예를 들어, 인간 로타바이러스의 VP7 유전자)의 단백질에는 결합하지 않는 단클론 중화항체를 사용하는 방법이다(예를 들어, 미국 특허 4,571,385호). 그러나, 상기 단클론 중화항체를 이용하는 방법은 중화항체 확보에 많은 시간과 비용이 요구되고, 로타바이러스 균주들은 서로 서열, 기능 및 구조가 비슷한 유전자로 구성되기 때문에 특정 균주의 단백질에만 특이적인 중화항체를 확보하기 어려운 문제가 있어, 선택압을 가할 수 있는 별도의 기술에 대한 연구 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 재배열 로타바이러스를 제조하는 방법에 관한 것으로, 재배열 로타바이러스에 대한 선택압으로서 억제성 RNA을 이용한 역유전학 플랫폼을 제공한다.
일 예는, 제1 로타바이러스의 11개 유전자 분절 중 특정 유전자 분절에 대한 억제성 RNA 를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는 단계;
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절의 mRNA, 또는 이를 코딩하는 DNA 또는 cDNA 를 상기 세포주에 도입하는 단계;
상기 세포주를 제1 로타바이러스로 감염시키는 단계; 및
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절을 포함하는 재배열 로타바이러스를 회수하는 단계를 포함하는,
재배열 로타바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 예는, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 표적부위를 억제하는 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
다른 예는, 서열번호 6 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9, 및 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열 쌍으로 형성된 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
다른 예로, 상기 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형 WC3 로타바이러스의 생산이 억제된 세포주 제조용 조성물을 제공한다.
다른 예로, 상기 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 소 로타바이러스의 VP7 단백질 생성이 억제된 세포주 제조용 조성물이 제공된다.
다른 예로, 상기 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드가 도입된, 야생형 WC3 로타바이러스의 생산이 억제된 세포주를 제공한다.
다른 예로, 상기 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드가 도입된, 소 로타바이러스의 VP7 단백질 생성이 억제된 세포주가 제공된다.
본 발명의 한 측면에 따라, 제1 로타바이러스의 11개 유전자 분절 중 특정 유전자 분절에 대한 억제성 RNA 를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는 단계;
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절의 mRNA, 또는 이를 코딩하는 DNA 또는 cDNA 를 상기 세포주에 도입하는 단계;
상기 세포주를 제1 로타바이러스로 감염시키는 단계; 및
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절을 포함하는 재배열 로타바이러스를 회수하는 단계를 포함하는,
재배열 로타바이러스를 제조하는 방법이 제공된다.
일 구현예로, 제1 로타바이러스는 비-인간 로타 바이러스일 수 있고, 예를 들어, 소(bovine) 로타바이러스, 원숭이(simian) 로타바이러스, 돼지(porcince) 로타바이러스, 개(canine) 로타바이러스 또는 흑염소(goat) 로타바이러스일 수 있다. 바람직한 예로, 소(bovine)의 WC3 로타바이러스 주(strain) 또는 이의 후손(progeny)일 수 있다.
일 구현예로, 제2 로타바이러스는 인간(human) 로타바이러스일 수 있고, 예를 들어 P1, P2, G1, G2, G3, G4 또는 G9 인간 로타바이러스 혈청형일 수 있다. 또한, 제2 로타바이러스는 WI79, Wa, D, WISC2, DS-1, WI78, P, HCR3A, Br(Bricout) B, ST-3, BrB-9, WI79-9, SC2-9, 또는 WI78-8 로타바이러스 주 또는 이의 후손일 수 있다.
일 구현예로, 상기 특정 유전자 분절은, VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, 및 NSP5 중에서 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자 분절일 수 있고, 바람직한 예로, VP7 또는 VP4을 코딩하는 유전자 분절일 수 있다.
일 구현예로, 억제성 RNA는 miRNA, siRNA 또는 shRNA 일 수 있다.
일 구현예로, 억제성 RNA는 발현을 억제하고자 하는 상기 특정 유전자 분절의 서로 다른 표적부위를 표적으로 하는 2 이상의 억제성 RNA일 수 있고, 상기 2 이상의 억제성 RNA는 각각의 벡터에 포함되거나 하나의 벡터 내에 포함되어 세포주에 도입될 수 있다.
일 구현예로, 억제성 RNA는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 표적부위로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 표적으로 할 수 있다.
일 구현예로, 억제성 RNA는 miRNA 이고, 상기 세포주는 상기 miRNA 에 대한 pre-miRNA 를 코딩하는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9, 및 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어지는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 서열 쌍으로 형성된 하나 이상의 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
일 구현예로, 상기 벡터는 항시성 프로모터(constitutive promoter)를 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 벡터는 표적부위가 상이한 2종 이상의 miRNA 에 대한 pre-miRNA 를 코딩하는 2종 이상의 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 동시발현 벡터일 수 있다.
일 구현예로, 상기 제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절의 mRNA는, 인 비트로 전사(in vitro transcription)에 의해 수득된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 재배열 로타바이러스의 제조 방법은, 세포주를 제1 로타바이러스로 감염시키는 단계 이후, 계대 배양을 통해 상기 재배열 로타바이러스를 선별하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 세포주는 MRC-5, MA-104, 베로(Vero), BHK-21, COS-7, 293 T, CV-1 또는 TF-104 세포주일 수 있다.
일 구현예로, 상기 재배열 로타바이러스의 제조 방법은, 소(bovine)의 WC3 로타바이러스의 VP7 유전자 분절에 대한 miRNA를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는 단계;
인간 로타바이러스의 VP7 유전자 분절의 mRNA, 또는 이를 코딩하는 DNA 또는 cDNA 를 상기 세포주에 도입하는 단계;
상기 세포주를 WC3 로타바이러스로 감염시키는 단계 ; 및
인간 로타바이러스의 VP7 유전자 분절을 포함하는 재배열 로타바이러스를 회수하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 표적부위를 억제하는 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드가 제공된다.
일 구현예로, 상기 억제성 RNA는 miRNA, siRNA 또는 shRNA 일 수 있다.
다른 구현예로, 상기 억제성 RNA는 miRNA 또는 상기 miRNA 에 대한 pre-miRNA 일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 서열번호 6 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9, 및 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열 쌍으로 형성된 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 전술한 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형 WC3 로타바이러스의 생산이 억제된 세포주 제조용 조성물이 제공된다.
또한, 전술한 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 소 로타바이러스의 VP7 단백질 생성이 억제된 세포주 제조용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 전술한 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드가 도입된, 야생형 WC3 로타바이러스의 생산이 억제된 세포주가 제공된다.
또한, 전술한 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드가 도입된, 소 로타바이러스의 VP7 단백질 생성이 억제된 세포주가 제공된다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료들이 설명된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한 본원에 사용되는 용어 및 관련된 정의는 단지 설명을 목적으로 사용되고 제한하려는 것이 아님을 이해해야 할 것이다.
본원에 사용되는 단수 형태는 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미하다.
본원에 사용된 "약" 은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.
본 명세서에 기재된, "(소정의 성분을) 포함하는" 은 기재된 성분 이외의 성분을 포함할 수 있는 것 (comprising) 또는 기재된 성분을 필수적으로 포함 (consisting essentially of)하는 것을 의미할 수 있다.
본원의 일예는, 로타바이러스의 특정 유전자에 대한 억제성 RNA을 상시 발현하는 세포주를 이용한 역유전학 방법에 의하여, 목적하는 재배열 로타바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
역유전학 방법은 재배열 시키고자 하는 유전자의 mRNA 또는 mRNA로 전사될 수 있는 DNA를 세포에 과량 주입하고 동시에 헬퍼 로타바이러스(helper rotavirus)를 세포에 감염시켜 주입된 mRNA와 헬퍼 로타바이러스의 유전자들이 재배열 되도록 유도하는 방법이다. 후술할 본원의 일 실시예에서는, 헬퍼 바이러스로서 소의 WC3 로타바이러스 주를 사용하고, 재배열 시키고자 주입하는 유전자는 인간 G4 로타바이러스 주인 BrB9 (Bricout B 9)의 RNA 분절 9번인 VP7를 사용하였으며, 상기 헬퍼 바이러스와 주입 유전자의 재배열 결과물로서 WC3/Brb9-VP7 재배열 바이러스를 제조한 예를 보여줄 것이나, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
본원에서 로타바이러스의 특정 유전자에 대한 억제성 RNA을 상시 발현하는 세포주는 목적 재배열 로타바이러스를 선별하고 분리하기 위한 선택압(selective pressure)을 제공한다. 특히, 종래 단클론 중화항체를 사용하여 선택압을 가하는 방법은 중화항체 확보에 많은 시간과 비용이 요구되고, 로타바이러스 균주들은 서로 서열, 기능 및 구조가 비슷한 유전자로 구성되기 때문에 특정 균주의 단백질에만 특이적인 중화항체를 확보하기 어려운 문제가 있으나, 본 발명은 억제성 RNA의 표적 서열이 짧아 (약 21bp) 유사한 균주의 유전자 간에도 서로 다른 부분을 쉽게 찾을 수 있어 선택압을 가하기가 용이하고, 여러 개의 표적부위를 이용할 경우 보다 강한 선택압을 가할 수 있으며, 로타바이러스의 특정 유전자에 대한 억제성 RNA을 상시 발현하는 세포주를 쉽게 제작할 수 있는 장점이 있다.
바람직한 일 구현예로, 본원의 재배열 로타바이러스 제조 방법은 다음의 단계를 포함한다:
제1 로타바이러스의 11개 유전자 분절 중 특정 유전자 분절에 대한 억제성 RNA 를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는 단계;
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스 유래의 유전자 분절의 mRNA, DNA 또는 cDNA 를 상기 세포주에 도입하는 단계;
상기 세포주를 제1 로타바이러스로 감염시키는 단계; 및
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절을 포함하는 재배열 로타바이러스를 회수하는 단계.
일 예로, 상기 특정 유전자가 1종의 유전자일 경우, 이와 같이 제조된 재배열 로타바이러스는 11개의 유전자 분절 중 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 유전자 분절은 제2 로타바이러스 유래의 것이고, 그외 나머지 10개의 유전자 분절은 제1 로타바이러스 유래의 것으로 구성된다.
다른 예로, 특정 유전자가 n종의 유전자일 경우, 이와 같이 제조된 재배열 로타바이러스는 11개의 유전자 분절 중 상기 n종의 특정 유전자 분절에 상응하는 유전자 분절은 제2 로타바이러스 유래의 것이고, 그외 나머지 (11-n개)의 유전자 분절은 제1 로타바이러스 유래의 것으로 구성된다.
로타바이러스는 일반적으로 11개의 유전자 분절, 즉, 구조 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, 및 VP7)을 각각 코딩하는 6개의 유전자 분절과, 비-구조 단백질(NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, 및 NSP5)을 각각 코딩하는 5개의 유전자 분절로 구성된다. 이 중에서, VP7과 VP4는 표면에 존재하는 구조 단백질로 바이러스의 혈청형(serotype)을 결정하며, 특히 VP7은 G 혈청형을 결정하고 VP4는 P 혈청형을 결정한다. 따라서 로타바이러스의 혈청형은 G형과 P형을 같이 표기하며, G형은 혈청형과 유전형이 같기 때문에 혈청형을 숫자로 표기하고 (예를 들어, G1, G2, G3), P형은 혈청형과 유전형이 같지 않기 때문에 혈청형은 숫자로 표기하고 유전자형은 [ ] 안에 숫자로 표기하거나 (예를 들어, P1A[8], P1B[4]) 또는 유전형만을 단독으로 표기하기도 한다 (예를 들어, P[8], P[4]).
일 구체예로, 제1 로타바이러스는 비-인간 로타바이러스이고, 제2 로타바이러스는 인간 로타바이러스일 수 있다. 이는 비-인간 로타바이러스가 인간에서 감소된 독성을 나타낼 수 있다는 아이디어에 근거한 것이다. 그러나 본 발명이 이에 제한되지는 않고, 제1 로타바이러스 및 제2 로타바이러스 모두가 비-인간 로타바이러스 이거나, 모두 인간 로타바이러스일 수도 있다.
바람직한 일 구체예로, 제1 로타바이러스는, 비-인간 로타바이러스, 예를 들어 소(bovine), 원숭이(simian) 로타바이러스, 돼지(porcince) 로타바이러스, 개(canine) 로타바이러스 또는 흑염소(goat) 로타바이러스일 수 있다. 소 로타바이러스의 예로는, 로타바이러스 주 NCDV, WC3 또는 UK 등을 들 수 있고, 원숭이 로타바이러스의 예로는 리서스(rhesus) 원숭이 로타바이러스(RRV) 주 TUCH, MMU 18006 또는 MMU17959, 버빗 원숭이(vervet monkey) 로타바이러스 주 SA11, 또는 돼지꼬리원숭이(pig-tailed macaque) 로타바이러스 주 PTRV (Macaca nemestrina) 또는 YK-1 (macaques) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
바람직한 다른 구체예로, 제2 로타바이러스는, 인간 로타바이러스일 수 있고, 이들은 임의의 P 혈청형 또는 G 혈청형을 가질 수 있으나, 바람직하게는 질병을 주로 일으키는 혈청형인 P1, P2, G1, G2, G3, G4 또는 G9 혈청형일 수 있다. G1 혈청형의 인간 로타바이러스로는 로타바이러스 주 WI79, Wa, D 등을 예시할 수 있고, G2 혈청형의 인간 로타바이러스로는 로타바이러스 주 WISC2 또는 DS-1 등을 예시할 수 있고, G3 혈청형의 인간 로타바이러스로는 로타바이러스 주 WI78, P 또는 HCR3A 등을 예시할 수 있고, G4 혈청형의 인간 로타바이러스로는 로타바이러스 주 Br(Bricout) B 또는 ST-3 등을 예시할 수 있고, G9 혈청형의 인간 로타바이러스로는 로타바이러스 주 WI61 등을 예시할 수 있고, P1 혈청형의 인간 로타바이러스로는 로타바이러스 주 WI79, WI78, WI61 또는 Wa 등을 예시할 수 있고, P2 혈청형의 인간 로타바이러스로는 로타바이러스 주 DS-1 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 제1 로타바이러스 또는 제2 로타바이러스 또는 둘 다는 종래 공지된 재배열 바이러스일 수 있으며, 예를 들어 BrB-9 (GenBank Accession No. GU565093), WI79-9 (GenBank Accession No. GU565060), SC2-9 (GenBank Accession No. GU565071), WI78-8 (GenBank Accession No. GU565082), 또는 WI79-4 (GenBank Accession No. GU565049) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 억제성 RNA는 표적 유전자의 발현을 서열 특이적으로 억제 내지 감소시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 억제성 RNA는 표적 유전자 또는 이의 mRNA 에 결합(혼성화)하여 전사 및/또는 발현을 억제 내지 감소시키기 위해, 표적 유전자 또는 이의 mRNA 에 충분히 상보적일 수 있다. 억제성 RNA는 RNAi (RNA interference)를 통해 표적 유전자의 전사 및/또는 발현을 억제 내지 감소시킨다. 바람직한 구체예로, 억제성 RNA는 siRNA (short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 또는 miRNA (microRNA) 일 수 있다.
RNAi 란 짧은 길이(보통 12 ~ 21 mer)의 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의해 서열 특이적으로 유전자 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이들 dsRNA 는 이와 상보적인 표적 mRNA를 선택적으로 분해함으로써 표적 유전자의 전사 및/또는 단백질 합성을 중단시킬 수 있다. 따라서 RNAi는 원하는 유전자를 침묵(silencing)시키기 위해 널리 사용된다. RNAi 를 일으키는 대표적인 작은(small) RNA 인 siRNA와 miRNA는 dsRNA-특이적 엔도뉴클레이즈(endonuclease)인 RNase III 그룹에 속하는 다이서(dicer) 효소가 dsRNA 전구체를 잘라내는 과정에서 생성된다.
siRNA 는 약 21개의 뉴클레오티드로 구성된 dsRNA로 약 19개의 염기쌍과 3' 쪽에 존재하는 2개의 뉴클레오티드 돌출 부위(overhang)로 구성된다. 이 3' 돌출 부위는 RNAi 과정에서 중간 매개체로 기능한다. siRNA는 트랜스포존(transposon), 바이러스 또는 생체 내 유전자로부터 길이가 긴 dsRNA가 만들어지거나 외부에서 인위적으로 dsRNA를 세포 내로 주입했을 때 생성된다. 이후 siRNA 는 단일 가닥으로 분리되어 RISC (RNA induced silencing complex)에 포함되게 되며, RISC 에 통합된 이후 표적 mRNA 에 상보적인 쌍을 이루는데 표적 mRNA 와의 상보성 정도에 따라 mRNA 를 절단 및 분해하거나 mRNA 번역을 억제하게 된다. siRNA를 이용한 RNAi는 시험관 내에서 표적 염기서열에 대한 dsRNA를 직접 세포에 핵산전달 감염(transfection)시킴으로써 특정 핵산서열에 의한 유전자 발현 억제 효과를 나타낼 수 있다.
shRNA 를 이용한 RNAi의 경우, 합성 dsRNA를 직접 주입하는 대신 헤어핀 구조의 단일가닥 RNA를 전사하는 플라스미드 DNA를 이용한다. 세포 안으로 주입된 DNA로부터 전사된 shRNA는 RNA 폴리머라제 III 프로모터로 조절되는 플라스미드가 표적세포의 핵에서 짧은 헤어핀(short hairpin) 형태의 단일가닥 RNA로 전사된 후, 엑스포틴-5(exportin-5)에 의하여 세포질로 이동하여 다이서(dicer)에 의한 처리 과정을 거치면서 siRNA로 변환된다.
miRNA 는 세포 내에서 자연적으로 만들어지는데, 단백질을 생성하는 유전정보를 갖지 못한 RNA이다. miRNA의 형성 과정은 다음과 같다: 핵에서 유전자에 의해 pri-miRNA(primary miRNA)로 전사된 후 드로샤(drosha)에 의해 절단되어 짧은 헤어핀(short hairpin) 형태의 pre-miRNA(precursor miRNA)가 되고, 이후 엑스포틴-5(exportin-5)에 의하여 핵에서 세포질로 이동한다. 세포질 내에서 pre-miRNA 는 다이서(dicer) 효소에 의하여 3' 쪽에 2nt 돌출 부위(overhang) 구조를 가지는 약 ~22nt 의 dsRNA 로 절단되고, 이후 RISC 에 포함된 후 단일 가닥의 성숙(mature) miRNA 로 전환되어 표적 mRNA 에 상보적인 쌍을 이루는데 표적 mRNA 와의 상보성 정도에 따라 mRNA 를 절단 및 분해하거나 mRNA 번역을 억제하게 된다.
일예로, 본원의 억제성 RNA는 조작된(engineered) miRNA 일 수 있으며, 표적부위와 완전히 상보적이어서(fully complement) 표적 mRNA 를 절단할 수 있다. 조작된 miRNA 는 세포 내에 안정적으로 발현될 수 있도록, 이를 코딩하는 DNA 를 포함하는 벡터를 통해 세포 내에 도입될 수 있다. "안정적 발현" 이란 일시적 발현에 대비되는 것으로, 목적하는 핵산이 상시 발현, 항시적 발현, 또는 영구적 발현되는 것을 말한다.
바람직한 구체예로, 본원의 억제성 RNA가 조작된 miRNA 이고, 상기 miRNA 에 대한 조작된 pre-miRNA 를 코딩하는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 통해 세포에 도입될 수 있다. 상기 벡터는 세포에 도입된 후 전사되어 pre-miRNA 를 발현하는데, pre-miRNA 는 내인성 pre-miRNA 구조와 유사한 헤어핀 형태의 스템-루프 구조를 형성하며, 전술한 바와 같은 miRNA의 발현 및 작용 기작을 통해 성숙한 형태의 miRNA 로 전환되어 표적 mRNA 를 절단 및 분해하여 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
일예로, 상기 pre-miRNA 를 코딩하는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는, 다음과 같이 구성될 수 있다 : (i) 벡터에 클로닝하기 위한 5' 말단 돌출 부위(overhang) ; (ii) 표적부위에 상보적인 안티센스 서열(즉, 성숙 miRNA 서열) 코딩 부위 ; (iii) 말단 루프(terminal loop) 구조를 형성하기 위한 스페이서 서열 ; (iv) 스템 구조를 형성하기 위한, 부위 (ii) 에 상보적인 서열 코딩 부위 (즉, 표적부위에 대한 센스 서열) ; 및 (v) 벡터에 클로닝하기 위한 3' 말단의 돌출 부위(overhang). 선택적으로, 부위 (iv)는 유전자 발현 억제 효율을 보다 높이기 위하여, 일부 뉴클레오티드(예를 들어, 약 2nt)가 결실되어 짧은 내부 루프(internal loop)를 형성할 수 있다.
또한 상기 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 위와 같이 구성된 상부 가닥(top strand)과 이의 상보체인 하부 가닥 (bottom strand)으로 형성될 수 있다.
일예로, 본원의 벡터는 억제성 RNA 를 안정적으로 발현하기 위하여, 항시성 프로모터(constitutive promoter)를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 RNA 폴리머라제 II 의존성 프로모터일 수 있다. 그 외에도, 벡터는 통상적인 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 어댑터 또는 링커, 인핸서, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커), 복제가능단위, 폴리아데닐화(polyA) 신호서열, 정제용 태그 또는 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합을 등을 적절하게 포함할 수 있다.
miRNA 는 표적 서열에 따라 RNAi 효과의 효율성이 결정되는데 지난 수 년 간 수 많은 miRNA의 염기서열과 그에 따른 RNAi 효율을 조사한 data base를 기초로 functional miRNA를 디자인 할 수 있는 알고리즘이 개발되어 여러 웹 사이트(www.ambion.com, www.oligoengine.com, www.vectorcorea.com)를 통해 서비스 되고 있다. 그러나 알고리즘을 통해 결정된 miRNA가 꼭 표적 mRNA를 효과적으로 분해시킬 수 있는 것은 아니며, 효율적인 억제를 위해 1개 표적부위만으로는 불충분할 수도 있기 때문에 한 유전자 당 2군데 이상의 표적부위를 선정하여 miRNA를 제조하는 것이 유전자 억제 실험의 성공 확률을 높일 수 있다.
이에, 본원의 벡터는, 표적부위가 상이한 2종 이상의 miRNA 에 대한 pre-miRNA 를 코딩하는 2종 이상의 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 각각 포함하는 2 이상의 벡터이거나 ; 또는 표적부위가 상이한 2종 이상의 miRNA 에 대한 pre-miRNA 를 코딩하는 2종 이상의 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 동시발현 벡터일 수 있다.
벡터로는 당업계 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들어 pcDNA(Invitorgen사), 또는 바이러스 벡터를 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 세포에의 도입은 당업계 공지된 방법, 예를 들면, 인산칼슘법, 또는 각종 트랜스펙션 시약(예를 들면, 올리고펙타민(oligofectamine), 리포펙타민(lipofectamine), 또는 리포펙틴(lipofection) 등)을 이용한 방법에 의해 적절히 행할 수 있다.
본원의 일실시예에 따른 비-제한적인 예시로, 억제성 RNA는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 표적부위를 표적으로 할 수 있다.
위의 세가지 표적부위는 제1 로타바이러스와 제2 로타바이러스의 염기서열 간에 서로 상동성(%)이 낮은 염기서열 부위만을 선별하여 선정된 것으로, 다른 표적부위를 타겟하는 억제성 RNA를 사용할 경우, 서열 상동성(%)이 높아져 표적부위에 대한 발현 억제 효과가 더 낮아지거나 없을 수 있다.
본원의 일실시예에 따른 비-제한적인 예시로, 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9, 및 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어지는 그룹에서 선택되는 하나 이상의 서열 쌍으로 형성된 하나 이상의 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 제1 로타바이러스의 11개 유전자 분절 중 특정 유전자 분절에 대한 억제성 RNA 를 안정적으로 발현하는 세포주는, 로타바이러스에 대해 높은 감수성을 가지는 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포주는 MRC-5, MA-104, 베로(Vero), BHK-21, COS-7, 293 T, CV-1 또는 TF-104 세포주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본원의 재배열 바이러스 제조 방법에서, 제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절의 mRNA, DNA 또는 cDNA 를 상기 세포주에 도입된다.
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절의 mRNA가 세포에 도입되는 경우, 상기 mRNA는 당업계 공지된 방법에 의해 합성되거나, 또는 인 비트로 전사(in vitro transcription)에 의해 수득될 수 있다. 이 경우, 천연 로타바이러스의 mRNA 가 5' 말단에 캡 구조를 가지고 있어 게놈의 복제와 번역에 영향을 미치는 점을 고려하여, 수득한 mRNA 를 캡핑(capping) 하는 것이 바람직하다.
대안적으로, 제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 RNA 분절을 코딩하는 DNA 또는 cDNA 가 세포에 도입되는 경우, 일반적으로는 T7 RNA 중합효소에 의해 인식되는 T7 프로모터를 사용할 수 있다. 그러나 그 외에도 다양한 RNA 중합효소에 의해 인식되는 프로모터를 사용할 수 있으며, 예를 들어 T3 RNA 중합효소 또는 Sp6 RNA 중합효소 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 또는 cDNA 는 공지의 벡터를 이용해 도입될 수 있다. 예를 들어, T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 사용할 경우 공지된 T7발현 벡터를 사용할 수 있으며, 시판의 pBluescriptII SK(+/-)(Stratagene사), pCRII(Invitrogen사), pGEM(Promega사), pET(Novagene사), pcDNA(Invitorgen사) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기와 같이 DNA 또는 cDNA 가 세포에 도입되는 경우, 이를 세포에 도입하기 전 또는 후에 RNA 중합효소를 발현하는 핵산 컨스트럭트를 도입할 수 있으며, 바람직하게는 RNA 중합효소를 공급하기 위해 사용하는 핵산 컨스트럭트 내에 캡핑 효소를 코딩하는 서열이 발현 가능한 상태로 포함될 수 있다.
제2 로타바이러스의 유전자 분절이 세포에 도입된 후, 상기 세포는 헬퍼 바이러스로서 제1 로타바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 천연에 존재하는 야생형 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 천연에 존재하는 변이형 바이러스 또는 인위적으로 유전자 변경을 실시한 재조합 바이러스도 가능하다. 바람직한 구체예로, 감염을 촉진하기 위해 트립신 또는 키모트립신의 존재 하에 감염을 수행할 수 있다.
본원의 재배열 바이러스 제조 방법은, 세포주를 제1 로타바이러스로 감염시키는 단계 이후, 계대 배양을 통해 상기 재배열 로타바이러스를 농화시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본원의 방법은 로타바이러스의 특정 유전자에 대한 억제성 RNA을 상시 발현하는 세포주를 사용하기 때문에, 이를 통해 재배열 로타바이러스를 선별하고 분리하기 위한 선택압(selective pressure)이 가해진다. 구체적으로, 본원의 세포는 억제성 RNA 에 의하여 제1 로타바이러스의 특정 유전자 분절의 mRNA 량이 저하되어 있고, 이에 상응하는 제2 로타바이러스의 특정 유전자 분절은 과량 도입된 상태이기 때문에, 바이러스의 복제 및 조립 과정에서 제2 로타바이러스의 특정 유전자 분절의 mRNA가 제1 로타바이러스의 특정 유전자 분절의 mRNA 대신 사용되어 재배열 바이러스가 발생할 확률이 증가한다. 또한 계대가 계속되면서 세포가 발현하는 miRNA에 의해 헬퍼 바이러스(예를 들어, 야생형 WC3 바이러스)는 계속 복제가 저해되지만 재배열 바이러스는 영향을 받지 않기 때문에 재배열 바이러스가 농화될 수 있다.
재배열 바이러스의 회수는 배양 후의 배양액 및/또는 세포 파쇄액을 회수함으로써 수행할 수 있다. 선택적으로, 회수된 배양액 및/또는 세포 파쇄액을 또 다른 숙주 세포(제2 숙주 세포, 제3 숙주 세포)에 첨가(접종)함으로써 바이러스를 재감염시켜 계대 배양한 후 회수할 수 있다. 바이러스의 회수는 플라크 분리(plaque isolation)를 통해 수행될 수 있으며, 회수된 재조합 바이러스는 필요에 따라 정제될 수 있다. 예를 들어, 원심분획, 밀도구배 원심분리, 컬럼 크로마토그래피 등을 적절히 조합해 바이러스의 정제를 할 수 있다.
본원의 일 실시예에 따른 예시는,
소(bovine)의 WC3 로타바이러스의 VP7 유전자 분절에 대한 miRNA를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는 단계;
인간 로타바이러스의 VP7 유전자 분절의 mRNA, 또는 이를 코딩하는 DNA 또는 cDNA 를 상기 세포주에 도입하는 단계;
상기 세포주를 WC3 로타바이러스로 감염시키는 단계 ; 및
인간 로타바이러스의 VP7 유전자 분절을 포함하는 재배열 로타바이러스를 회수하는 단계를 포함하는, 재배열 바이러스의 제조방법을 제공하며, 각 단계에 대한 구체적인 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명은 또한 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 표적부위를 억제하는 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직한 구체예로, 상기 억제성 RNA는 miRNA, siRNA 또는 shRNA 일 수 있다. 바람직한 다른 구현예로, 상기 억제성 RNA는 miRNA 또는 상기 miRNA 에 대한 pre-miRNA 일 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 6 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9, 및 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열 쌍으로 형성된 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 ; 상기 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형 WC3 로타바이러스의 생산이 억제된 세포주 제조용 조성물 ; 상기 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 소 로타바이러스의 VP7 단백질 생성이 억제된 세포주 제조용 조성물; 상기 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드가 도입된, 야생형 WC3 로타바이러스의 생산이 억제된 세포주 ; 및 상기 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드가 도입된, 소 로타바이러스의 VP7 단백질 생성이 억제된 세포주를 제공하며, 이들은 전술한 바와 같은 재배열 바이러스의 제조방법에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 로타바이러스 재배열 (reassortment) 방법은 역유전학 방법을 사용하므로, 하나의 세포주에 두 종류의 로타바이러스를 동시 감염시켜 재배열 바이러스를 얻는 고전적인 방법에 비해 재배열 확률이 비약적으로 높아 소요 시간을 매우 단축시킬 수 있을 것으로 기대된다. 또한 재배열 바이러스를 선별(selection) 할 때 단클론 중화항체를 사용하지 않기 때문에 단클론 중화항체를 확보하는데 걸리는 비용과 시간을 줄일 수 있다. 따라서 본 발명을 이용하여 기존 방법에 비해 짧은 시간과 저 비용으로 원하는 재배열 로타바이러스를 제조할 수 있고 이를 백신으로 활용할 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 WC3 로타바이러스의 VP7 유전자(서열번호 1)와 Brb9 로타바이러스의 VP7 유전자(서열번호 2) 핵산 서열의 정렬 결과를 나타낸다. 회색 음영은 두 유전자의 핵산이 상이한 부위를 나타내고, 밑줄과 볼드체는 본원의 일 실시예에 따라 선택별된 표적부위 3곳을 나타낸다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른, WC3 로타바이러스의 VP7 유전자에서 선별된 miRNA 표적부위의 서열, 상기 표적부위에 결합(혼성화)할 수 있는 miRNA 에 대한 pre-miRNA 를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 상부 가닥(top strand)과 이의 상보체인 하부 가닥 (bottom strand), 및 상기 두 가닥이 4nt 오버행(overhang)을 갖도록 결합시켜 형성된 dsDNA 올리고를 나타낸다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른, WC3 VP7 유전자를 표적으로 하는 삼중(triple) miRNA 발현 벡터의 모식도이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른, Brb9 VP7 mRNA 제작을 위한 DNA 주형의 디자인 모식도이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 P1(Passage 1) 바이러스의 재배열 확인을 위한 RT-PCR 결과이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 P1(Passage 1)을 플라크 분리(plaque isolation)로 분리한 10개 클론의 재배열 확인을 위한 RT-PCR 결과이다. Lane 1 내지 10은 각 단일 클론을 나타내고; W는 WC3 바이러스 RNA (PCR 음성 대조군)을 나타내고; G는 G4 바이러스 RNA를 나타내고 (PCR 양성 대조군); M은 100bp DNA ladder를 나타낸다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 역유전학 방법으로 제조된 G4 재배열 바이러스 스톡(도 6에서 확인된 6번과 8번 클론을 MA-104 세포주에서 배양하여 확보한 재배열 바이러스 스톡)의 플라크 형성을 나타낸다.
도 8은 RT-PCR을 이용한 G4 재배열 바이러스 스톡의 재배열 확인 결과를 나타낸다. Lane 1 및 Lane 2 는 각각 도 6에서 확인된 6번과 8번 클론을 MA-104 세포주에서 배양하여 확보한 재배열 바이러스의 RNA 를 주형으로 하여 수행한 RT-PCR 산물을 나타내고; Lane 3은 WC3 바이러스 RNA (음성 대조군) 를 주형으로 하여 수행한 RT-PCR 산물을 나타내고; Land 4는 Brb9 합성 DNA 및 WC3 바이러스 RNA의 혼합물을 주형으로 하여 수행한 RT-PCR 산물 (PCR 반응 대조군)을 나타낸다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른, WC3 로타바이러스의 VP7 유전자에서 선별된 miRNA 표적부위의 서열, 상기 표적부위에 결합(혼성화)할 수 있는 miRNA 에 대한 pre-miRNA 를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 상부 가닥(top strand)과 이의 상보체인 하부 가닥 (bottom strand), 및 상기 두 가닥이 4nt 오버행(overhang)을 갖도록 결합시켜 형성된 dsDNA 올리고를 나타낸다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른, WC3 VP7 유전자를 표적으로 하는 삼중(triple) miRNA 발현 벡터의 모식도이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른, Brb9 VP7 mRNA 제작을 위한 DNA 주형의 디자인 모식도이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 P1(Passage 1) 바이러스의 재배열 확인을 위한 RT-PCR 결과이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 P1(Passage 1)을 플라크 분리(plaque isolation)로 분리한 10개 클론의 재배열 확인을 위한 RT-PCR 결과이다. Lane 1 내지 10은 각 단일 클론을 나타내고; W는 WC3 바이러스 RNA (PCR 음성 대조군)을 나타내고; G는 G4 바이러스 RNA를 나타내고 (PCR 양성 대조군); M은 100bp DNA ladder를 나타낸다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 역유전학 방법으로 제조된 G4 재배열 바이러스 스톡(도 6에서 확인된 6번과 8번 클론을 MA-104 세포주에서 배양하여 확보한 재배열 바이러스 스톡)의 플라크 형성을 나타낸다.
도 8은 RT-PCR을 이용한 G4 재배열 바이러스 스톡의 재배열 확인 결과를 나타낸다. Lane 1 및 Lane 2 는 각각 도 6에서 확인된 6번과 8번 클론을 MA-104 세포주에서 배양하여 확보한 재배열 바이러스의 RNA 를 주형으로 하여 수행한 RT-PCR 산물을 나타내고; Lane 3은 WC3 바이러스 RNA (음성 대조군) 를 주형으로 하여 수행한 RT-PCR 산물을 나타내고; Land 4는 Brb9 합성 DNA 및 WC3 바이러스 RNA의 혼합물을 주형으로 하여 수행한 RT-PCR 산물 (PCR 반응 대조군)을 나타낸다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. WC3 야생형 로타바이러스에서 VP7 유전자의 전사 및 발현 억제를 위한 표적부위의 선별
WC3/Brb9-VP7 재배열 바이러스(reassortant virus) 제작을 위하여 로타바이러스에 대해 높은 감수성을 가지는 세포에 형질전환을 일으켜 재배열되지 않은 소(bovine) WC3 야생형(wild type) 바이러스 생산을 억제할 수 있는 안정한 세포주(stable cell line)의 구축을 수행하였다. 상기 형질전환은 WC3 바이러스의 VP7 유전자를 표적으로 하는 RNAi (RNA interference) 기술을 이용하였다.
구체적으로, WC3 로타바이러스의 VP7 유전자 내에서 WC3에 특이적이며 인간 로타바이러스인 BrB9의 VP7에는 특이성을 보이지 않는 miRNA 표적부위 3곳을 선정하였다. 본원에서 구축하고자 하는 안정한 세포주는 이들 표적부위에 대한 miRNA 를 상시 발현하도록 의도된다. 상기 miRNA (성숙 형태)는 RNAi 표적부위에 대해 완전히 상보적인 안티센스 서열에 해당하는 21bp의 짧은 간섭(short interfering) RNA 유형이며, 이들은 WC3 VP7 유전자의 전사와 발현을 억제하게 된다. miRNA 선별 시 RNAi 발현을 위해 사용한 벡터 시스템에서 제공하는 Invitrogen사의 Stealth RNAi™ Pre-Designed siRNAs web-tool (www.invitrogen.com/rnaiexpress)을 사용하였다. WC3 VP7 유전자는 GenBank AY050272 (서열번호 1)을, Brb9 VP7 유전자는 GenBank GU565090 (서열번호 2)를 참고로 하였다. 도 1은 WC3 VP7 유전자(서열번호 1)와 Brb9 VP7 유전자(서열번호 2) 핵산 서열의 정렬 결과를 나타낸다. 도 1에 나타난 바와 같이, WC3 VP7 유전자(서열번호 1)와 Brb9 VP7 유전자(서열번호 2) 핵산 서열의 상동성은 74.3% (1062bp 중 789bp 일치)인데 표적부위 부분은 이보다 낮은 상동성을 보이는 부분에서 선별하였다. 구체적으로, 도 1에서 표적부위로 선별한 3곳을 밑줄친 볼드체로 표시하였으며, 5' 에서 3' 방향으로 순서대로 표적부위 1 (서열번호 3)은 71.4% (15/21), 표적부위 2 (서열번호 4)는 66.7% (14/21), 및 표적부위 3 (서열번호 5)은 61.9% (13/21)의 서열 상동성을 가진다.
실시예 2. miRNA 발현 벡터의 제작
실시예 1에서 선별한 3곳의 miRNA 표적부위에 대한 miRNA 를 발현시키기 위하여 이의 pre-miRNA 를 코딩하는 서열을 각각 miRNA 발현 벡터인 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (Invitrogen사)에 각각 제조사의 매뉴얼에 따라 클로닝하였다. 이를 위하여, 먼저 각 표적부위에 결합할 수 있는 miRNA에 대한 pre-miRNA 가 전사될 수 있는 DNA 서열과 이에 상보적인 서열을 4nt 의 오버행(overhang)을 갖도록 디자인 및 합성하고 어닐링(annealing) 하여 dsDNA 올리고를 제작하였다 (표 1 및 도 2).
[표 1]
그 후, 제조사의 매뉴얼에 따라 4nt 오버행을 가지는 dsDNA 올리고와 선형화된 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 벡터 (Invitrogen) 를 연결(ligation) 하고 E.coli에 형질전환한 후 콜로니를 선별하고 서열을 분석해서 완성된 miRNA 발현 플라스미드를 얻었으며, 각각 pcDNA-GFP/mr1, pcDNA-GFP/mr2, 및 pcDNA-GFP/mr3로 명명하였다.
실시예 3. 삼중(triple) miRNA 발현 벡터 제작
하나의 벡터에서 3개의 miRNA가 동시에 전사될 수 있는 발현 벡터를 디자인하고 제작사의 매뉴얼에 따라 클로닝 하였다. 먼저 pcDNA-GFP/mr1를 BamHI과 XhoI 제한 효소로 절단하고 약 151bp의 삽입 단편(insert fragment)을 정제하였다. pcDNA-GFP/mr2는 BglII와 XhoI 제한 효소로 절단하고 약 5.6kb의 벡터 단편를 정제하였다. 삽입 단편과 벡터 단편을 연결(ligation)하고 E.coli에 형질전환 한 후 콜로니를 얻어 서열 분석한 후 완성된 이중(dual) miRNA 발현 벡터를 제작하였다. 그 후, 이중 miRNA 발현 벡터를 BamHI과 XhoI 제한 효소로 절단하고 약 250bp의 삽입 단편2를 정제하고, pcDNA-GFP/mr3을 BglII와 XhoI 제한 효소로 절단하고 약 5.6kb의 벡터 단편2를 정제하였다. 삽입 단편2와 벡터 단편2를 연결하고 E.coli에 형질전환한 후 콜로니를 얻어 서열분석한 후 완성된 삼중(triple) miRNA 발현 벡터를 제작하였다. 제작한 삼중 miRNA 발현 벡터를 DraI 제한 효소로 절단하고 EmGFP 단편을 제거한 뒤 다시 연결하여 GFP 유전자가 없는 삼중 miRNA 발현 벡터를 제작하고 pcDNA-Tri-miRNA로 명명하였다 (도 3).
실시예 4. 삼중(triple) miRNA를 안정적으로 발현하는 세포주의 제작 및 WC3 감염 저해 테스트
삼중 miRNA가 안정하게(stable) 발현되는 세포주를 얻기 위하여, TF-104 (African green monkey epithelial cell line) 세포주에 상기 pcDNA-Tri-miRNA 플라스미드를 트랜스펙션하고 벡터 내에 포함된 블라스티시딘(blasticidin) 항생제 저항성 유전자를 이용하여 miRNA를 발현하는 단일 세포를 선별하였다. 항생제인 블라스티시딘 에스(Blasticidin S)를 트랜스펙션한 세포에 10~20 ug/㎖의 농도로 처리하여 트랜스펙션 되지 않은 세포의 성장을 저해하고 트랜스펙션된 세포를 선별하는 과정을 수 차례 반복하여 블라스티시딘에 저항성이 있는 단일 세포 콜로니 중 44개 콜로니를 확장 계대하여 44개의 클론을 확보하였다.
24-웰 플레이트에 상기 각 클론 및 야생형(WT) TF-104 세포를 90% 컨플루언시로 플레이팅하고 WC3 바이러스를 웰 당 100pfu, 1pfu 감염시켰다. 감염 후 3일과 5일 뒤 세포변성효과(CPE: Cytopathic effect)를 비교하여 WT TF-104에 비해 감염이 저해된 클론을 선별하였다. 그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 6, 13, 14, 19, 31, 44번 클론이 WC3 감염을 효과적으로 저해하고 있으며 특히 44번 클론이 가장 저해 효과가 큰 것으로 나타났다.
[표 2]
삼중 miRNA를 발현하는 클론의 WC3 감염 저해 테스트
* ++: 완전한 CPE, +: 부분적인 CPE, N: CPE 없음
WC3 바이러스를 감염시킨 6, 13, 14, 19, 31, 44 클론의 배지를 제거하고 EMEM, 10% FBS, 10ug/ml 블라스티시딘 배지로 갈아주고 확장 계대 배양을 진행하여 바이러스에 감염되지 않은 세포를 구제(rescue)했으며 각각 TK6r, TK13r, TK14r, TK19r, TK31r, TK44r로 명명하였다.
실시예 5. G4 Brb9 VP7 mRNA 제작
재배열에 사용될 인간 로타바이러스 G4 Brb9의 VP7 유전자는 인 비트로 전사(in vitro transcription) 과정과 캡핑(capping) 과정을 거쳐 mRNA로 만든 후 mRNA를 형질도입하는 방식으로 진행하였다. 플라스미드 DNA 형태로 바로 형질도입할 수도 있지만, 이 경우 효율적인 전사를 위해 일반적으로 T7 프로모터를 사용한다. T7 프로모터는 특이적이고 강력하며 세포질(cytosol)에서도 전사가 가능하기 때문에 플라스미드가 핵내까지 전달되지 않고 세포질에 머물러도 전사가 된다는 장점이 있지만, 이를 위해 T7 폴리머라제를 발현할 수 있는 발현 벡터를 먼저 세포에 형질도입해야 한다는 점과 세포질에서 전사된 RNA는 캡핑이 되지 않기 때문에 불안정하다는 단점을 가지고 있다. Brb9 VP7 유전자의 재배열 효율을 높이려면 바이러스 mRNA와 동일한 형태인 캡핑이 되어 있는 형태가 유리하기 때문에, 본 실시예에서는 플라스미드 DNA를 형질도입하는 방법 대신 시험관 내에서 바이러스 mRNA와 동일한 형태로 전사를 하고 이 mRNA를 도입하는 방식을 선택하였다.
G4 Brb9의 VP7 유전자의 mRNA를 인 비트로 전사하기 위한 DNA 주형을 디자인하였다. 로타바이러스의 3’UTR 서열은 번역 과정에 중요하기 때문에 정확한 부분에서 전사가 시작되고 끝나야 한다. T7 프로모터의 전사 시작점은 매우 정확한 편이지만 끝나는 지점은 T7 터미네이터가 존재하더라도 다소 헤테로지니어스(heterogeneous) 하기 때문에 T7 터미네이터 앞에 델타 간염 바이러스 (HDV) 라이보자임 서열을 도입하여 VP7 유전자가 끝나는 위치에서 정확한 잘리도록 디자인하였다 (서열번호 12 및 도 4 참조). 디자인된 DNA 주형을 합성하고 EcoRI/BamHI 제한효소로 절단하여 pUC57 벡터에 클로닝하고 pUC57-T7-Brb9-VP7으로 명명하였다.
mMESSAGE mMACHINE 키트 (Ambion) 및 pUC57-T7-Brb9-VP7 DNA 주형을 사용하여 제작자의 매뉴얼에 따라 인 비트로 전사 및 5’캡핑 과정을 통해 Brb9 VP7 mRNA를 제작하였다.
실시예 6. G4 Brb9 VP7 mRNA 트랜스펙션 및 WC3 바이러스 감염
인 비트로 전사된 G4 Brb9 VP7 mRNA를, 실시예 4에서 수득한 TK14r 세포주에 리포좀 (리포펙타민 2000; Thermo Fisher) 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 과정은 제작사의 매뉴얼에서 제공하는 통상적인 방법을 사용하였다. 트랜스펙션 후 4 시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포를 배양하고 이 후 완전 성장 배지 (10% FBS 함유 EMEM)로 배지를 교환하였다.
트랜스펙션 수행 24시간 뒤 배지를 감염 배지(0.5㎍/㎖ 트립신 함유 무혈청 EMEM)로 교체해 주고, 트립신(Sigma, T0303, 10㎍/㎖)을 사용해 37℃에서 30분간 활성화시킨 WC3 (ATCC VR-2102) 바이러스를 MOI 1.0으로 세포에 감염시켰다. 감염 후 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 48 시간 인큐베이션하며 세포변성효과(CPE)를 확인하였다.
TK14r 세포는 miRNA를 이용해 WC3의 VP7 유전자의 전사와 발현을 억제하여 감염된 세포 내에서 WC3 VP7 mRNA 량은 저하되어 있으며, BrB9 VP7 mRNA는 과량 도입된 상태이기 때문에, 바이러스의 복제 및 조립 과정에서 BrB9 VP7의 mRNA가 WC3 VP7 mRNA 대신 사용되어 재배열 바이러스가 발생할 확률이 증가한다. 또한 계대가 계속되면서 세포가 발현하는 miRNA에 의해 WC3 WT 바이러스는 계속 복제가 저해되지만 재배열 바이러스는 영향을 받지 않기 때문에 재배열 바이러스가 농화된다.
실시예 7. WC3/Brb9 VP7 재배열 바이러스의 확인
전술한 과정을 통해 CPE가 발생한 세포를 3회 동결-융해(freezing-thawing)하고 세포 파편(cell debris)을 제거한 뒤 상층액을 확보하고 이를 Passage 0 (P0)로 하였다. P0를 TK14r 세포주 또는 MA-104 세포주에 재감염 시킨 후 48시간 뒤에 세포를 3회 동결-융해하고 세포 파편을 제거한 뒤 상층액을 확보하고 이를 Passage 1 (P1)으로 하였다.
재조합 시킨 시료내의 재배열을 확인하기 위하여 WC3 VP7, BrB9 VP7, 그리고 WC3 VP4를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였고 교차 반응성(cross activity) 또는 위양성(false positive) 및 위음성(false negative) 결과는 확인되지 않음을 확인하였다 (표 3).
[표 3]
WC3 VP7, BrB9 VP7, 및 WC3 VP4 검출을 위한 RT-PCR 올리고 조합
상기 프라이머를 사용하여 시료내의 재배열을 확인하기 위하여 RT-PCR 반응을 수행하였다. WC3 VP7, BrB9 VP7, 그리고 WC3 VP4는 각각 422bp, 406bp, 394bp 사이즈의 RT-PCR 산물로 증폭되며, 사용한 RT-PCR 조건은 다음과 같다 (표 4).
[표 4]
VP7 및 VP4 유전자 검출을 위한 RT-PCR 반응 조건
TK14r 세포주 또는 MA-104 세포주에 P0 시료를 감염시킨 뒤 얻은 두 종류의 P1 시료에서 바이러스 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. 5번의 시도에서 2번은 TK14r 세포주를 사용하여 P1을 제조하였고 (도 5, Lane 1, 4), 3번은 MA-104 세포주를 사용하여 P1을 제조하였다 (도 5, Lane 2, 3, 5). 그 결과 4번과 5번 시도에서 얻은 P1에서 BrB9 VP7 특이적인 약 400bp 크기의 밴드를 확인하였다 (도 5, Lane 4와 Lane 5).
VP4의 경우 백본 바이러스인 WC3에 공통적으로 있는 것으로 RT-PCR 수행에서는 내부 대조군(internal control)의 의미로 사용되었다. BrB9 VP7 이 WC3 바이러스에 재배열 되었다면 시료로부터 BrB9 VP7과 WC3 VP4 신호가 동시에 확인되고, WC VP7은 검출되지 않아야 한다. 따라서 4번과 5번은 성공적으로 BrB9 VP7 이 WC3 바이러스에 재배열 되었음을 확인하였다.
실시예 8. 재배열 바이러스의 분리
P0, P1 단계의 바이러스는 단일 클론이 아닌 혼합된 클론으로 존재하기 때문에 재배열된 단일 클론 바이러스를 분리하기 위해 도 5의 Lane 4에 해당하는 P1 시료를 이용하여, 플라크 분리(plaque isolation)를 수행하였다. 형성된 플라크를 육안으로 관찰하기 위하여 뉴트럴 레드(neutral red)로 세포 단층을 염색하여 바이러스의 증식을 확인하였다.
60 ~ 100개의 플라크를 피킹(picking) 하여 분석하였으며, 재배열 플라크를 찾기 위하여 일련의 과정을 3회 이상 지속적으로 반복하였다. 플라크 피킹 과정은 다음과 같다: 1) 현미경 또는 육안으로 재배열 플라크 후보에 표시한다; 2) 피킹할 개수만큼 EMEM (무혈청)을 e-튜브에 각각 300ul씩 분주한다; 3) 멸균된 팁으로 피킹하여 2)에 넣는다; 4) -70℃ 보관하거나 트립신 (T0303, 1ug/mL)을 첨가하여 감염에 사용한다. 플라크 분석 수행 후 확인된 10개의 플라크를 분리하였다. 플라크 분리한 단일 클론은 TK14r 세포주 (24well, 1×10E5/well)에 감염한 후 3일간 배양 또는 CPE가 확인될 때까지 배양한 후 수확한다. 수확한 시료로부터 viral RNA를 추출하고 그를 주형으로 하여 RT-PCR 분석방법을 이용하여 재배열된 바이러스인지 분석하였다. 그 결과, 6번 클론과 8번 클론이 재배열된 클론으로 확인되었다(도 6 참조). G4 재배열 플라크로 확인된 6번과 8번 클론을 MA-104 세포주에서 배양하여 재배열바이러스 스톡(stock)을 확보하였다 (도 7 및 도 8 참조).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> SK bioscience Co., Ltd.
<120> Method for producing reassortant rotavirus
<130> DPP20211429KR
<160> 18
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1062
<212> DNA
<213> Rotavirus strain WC3
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1062)
<223> V7 gene segment (AY050272)
<400> 1
ggctttaaaa gagagaattt ccgtctggct agcggttagc tccttttaat gtatggtatt 60
gaatatacca caattctaat cttcttgaca tcgattacat tattaaatta tatcttaaaa 120
tcaataacga gaataatgga ctatataatt tatagatttt tgcttatggt agtgatcttg 180
gccaccataa taaatgcgca aaactatgga gtaaatttgc caattacagg ttcaatggat 240
actgcgtatg caaactctac acaaagtgag ccatttttga catcaaccct ttgtttgtat 300
tatcctgttg aggcatcaaa cgaaatagct gatactgaat ggaaagatac cttatcacaa 360
ctgttcttaa caaaaggatg gccaacagga tcagtgtact ttaaagaata tgctgatata 420
gcggcctttt cagtggaacc acagttatac tgtgattata atttagtttt aatgaaatat 480
gactctacac aaaaactaga tatgtctgaa ttggccgatc ttatattgaa tgaatggctg 540
tgcaatccaa tggacataac gctatattat tatcagcaga ctgatgaggc aaataaatgg 600
atatcgatgg gctcttcttg caacgttaaa gtgtgtccat taaatacaca aacacttggt 660
attggatgtc taataactaa tccagacacg tttgaaacag ttgcgacaac ggagaaatta 720
gtgattacag atgttgtaga tggtgtcaac cacaaattaa acgtcacaac ggcaacgtgc 780
accatacgca actgtaaaaa gttaggacca agggagaacg tagcagtcat acaggtaggc 840
ggcgcgaaca ttttagacat cacagctgat ccaacaacta caccacagac agagagaatg 900
atgcgaataa attggaaaaa atggtggcaa tgtttttaca cggtagtgga ttacgtcaat 960
caaataattc agacagtatc caaaagatct agatcgctta attcgtcggc gttctactat 1020
agagtgtagg tgcatcttag attagaattg tatgatgtga cc 1062
<210> 2
<211> 1062
<212> DNA
<213> Rotavirus strain Brb9
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1062)
<223> VP7 gene segment (GU565090)
<400> 2
ggctttaaaa gagagaattt ccgtttggct agcggatagc tccttttaat gtatggtatt 60
gaatatacca cagttctatt ttatttgata tcgttcgttc ttgtgagtta tattctgaaa 120
actatgataa agataatgga ctatttaatt tatagaataa catttgtaat tgtagtatta 180
tcagtattat cgaatgcaca aaattatgga ataaatttgc caattactgg atctatggat 240
acagcatatg ctaactcaac acaagacaat aattttttat cttcaacttt atgtctatat 300
tatccatcag aagctccaac tcaaattagt gacactgaat ggaaagatac actatctcaa 360
ctgtttttaa ccaaaggatg gccgacaggt tcagtttatt ttaatgaata ttcaaacgtt 420
ttagaatttt ccatcgaccc aaagctatac tgtgattata atgttgtgtt aattagattc 480
gcttctggtg aggagttgga cgtatctgaa ttagctgatc taatactcaa tgagtggtta 540
tgtaatccaa tggatataac attatattat tatcaacaaa ctggagaggc aaataagtgg 600
atatcaatgg gatcatcatg taccgttaaa gtgtgtccat taaatactca gacattagga 660
attggatgtc aaacgacaga tactgctact tttgaaacag ttgctgacag cgaaaaattg 720
gcattaattg atgttgttga caacgtaaat cataaattag atgttacatc tactacgtgt 780
acaatacgga attgtaataa actaggacct agagaaaatg tggctataat acaggttggc 840
ggttctaata tattagatat aacagctgat cccacaactt ctccacaaac agaacgaatg 900
atgcgcgtaa actggaaaaa atggtggcaa gtattctata ctgtagttga ttacattaat 960
caaatagtaa aagtaatgtc caaaagatca agatcgttag attcgtcatc tttctattat 1020
agagtataga tatatcctaa aatagaactg tttgatgtga cc 1062
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miRNA target site 1
<400> 3
caattctaat cttcttgaca t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miRNA target site 2
<400> 4
ttgtttgtat tatcctgttg a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miRNA target site 3
<400> 5
tggtgtcaac cacaaattaa a 21
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pre-miRNA top strand against target site 1
<400> 6
tgctgatgtc aagaagatta gaattggttt tggccactga ctgaccaatt ctacttcttg 60
acat 64
<210> 7
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pre-miRNA bottom strand against target site 1
<400> 7
cctgatgtca agaagtagaa ttggtcagtc agtggccaaa accaattcta atcttcttga 60
catc 64
<210> 8
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pre-miRNA top strand against target site 2
<400> 8
tgctgtcaac aggataatac aaacaagttt tggccactga ctgacttgtt tgttatcctg 60
ttga 64
<210> 9
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pre-miRNA bottom strand against target site 2
<400> 9
cctgtcaaca ggataacaaa caagtcagtc agtggccaaa acttgtttgt attatcctgt 60
tgac 64
<210> 10
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pre-miRNA top strand against target site 3
<400> 10
tgctgtttaa tttgtggttg acaccagttt tggccactga ctgactggtg tcacacaaat 60
taaa 64
<210> 11
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pre-miRNA bottom strand against target site 3
<400> 11
cctgtttaat ttgtgtgaca ccagtcagtc agtggccaaa actggtgtca accacaaatt 60
aaac 64
<210> 12
<211> 1228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA template for BrB9 VP7 mRNA in vitro transcription
<400> 12
gaattctaat acgactcact actataggct ttaaaagaga gaatttccgt ttggctagcg 60
gatagctcct tttaatgtat ggtattgaat ataccacagt tctattttat ttgatatcgt 120
tcgttcttgt gagttatatt ctgaaaacta tgataaagat aatggactat ttaatttata 180
gaataacatt tgtaattgta gtattatcag tattatcgaa tgcacaaaat tatggaataa 240
atttgccaat tactggatct atggatacag catatgctaa ctcaacacaa gacaataatt 300
ttttatcttc aactttatgt ctatattatc catcagaagc tccaactcaa attagtgaca 360
ctgaatggaa agatacacta tctcaactgt ttttaaccaa aggatggccg acaggttcag 420
tttattttaa tgaatattca aacgttttag aattttccat cgacccaaag ctatactgtg 480
attataatgt tgtgttaatt agattcgctt ctggtgagga gttggacgta tctgaattag 540
ctgatctaat actcaatgag tggttatgta atccaatgga tataacatta tattattatc 600
aacaaactgg agaggcaaat aagtggatat caatgggatc atcatgtacc gttaaagtgt 660
gtccattaaa tactcagaca ttaggaattg gatgtcaaac gacagatact gctacttttg 720
aaacagttgc tgacagcgaa aaattggcat taattgatgt tgttgacaac gtaaatcata 780
aattagatgt tacatctact acgtgtacaa tacggaattg taataaacta ggacctagag 840
aaaatgtggc tataatacag gttggcggtt ctaatatatt agatataaca gctgatccca 900
caacttctcc acaaacagaa cgaatgatgc gcgtaaactg gaaaaaatgg tggcaagtat 960
tctatactgt agttgattac attaatcaaa tagtaaaagt aatgtccaaa agatcaagat 1020
cgttagattc gtcatctttc tattatagag tatagatata tcctaaaata gaactgtttg 1080
atgtgaccgg gtcggcatgg tcccagcctc ctcgctggcg ccggctgggc aacattccga 1140
ggggaccgtc ccctcggtaa tggcgaatgg gacgcatagc ataacccctt ggggcctcta 1200
aacgggtctt gaggggtttt ttggatcc 1228
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WC3V7_F primer
<400> 13
tcttgacatc gattacatta ttaaa 25
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WC3V7_R primer
<400> 14
catatctagt ttttgtgtag agtcatatt 29
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Brb9V7_F primer
<400> 15
ttcgttcttg tgagttatat tctg 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Brb9V7_R primer
<400> 16
gtccaactcc tcaccagaag 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WC3V4_F primer
<400> 17
gtcgttcgat ctaccagtag ga 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WC3V4_R primer
<400> 18
gtcactatat ggccttacct caact 25
Claims (23)
- 제1 로타바이러스의 11개 유전자 분절 중 특정 유전자 분절에 대한 억제성 RNA 를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는 단계;
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절의 mRNA, 또는 이를 코딩하는 DNA 또는 cDNA 를 상기 세포주에 도입하는 단계;
상기 세포주를 제1 로타바이러스로 감염시키는 단계; 및
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절을 포함하는 재배열(reassortant) 로타바이러스를 회수하는 단계를 포함하는,
재배열(reassortant) 로타바이러스를 제조하는 방법. - 제1항에 있어서,
제1 로타바이러스가 비-인간 로타바이러스, 소(bovine) 로타바이러스, 원숭이(simian) 로타바이러스, 돼지(porcince) 로타바이러스, 개(canine) 로타바이러스 또는 흑염소(goat) 로타바이러스인, 방법. - 제2항에 있어서,
제1 로타바이러스가 WC3 로타바이러스 주(strain) 또는 이의 후손(progeny)인, 방법. - 제1항에 있어서,
제2 로타바이러스가 인간 로타바이러스인, 방법. - 제4항에 있어서,
제2 로타바이러스가 P1, P2, G1, G2, G3, G4 또는 G9 인간 로타바이러스 혈청형인, 방법. - 제1항에 있어서,
제2 로타바이러스가 WI79, Wa, D, WISC2, DS-1, WI78, P, HCR3A, Br(Bricout) B, ST-3, BrB-9, WI79-9, SC2-9, 또는 WI78-8 로타바이러스 주(strain) 또는 이의 후손(progeny)인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 특정 유전자 분절이, VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, 및 NSP5 중에서 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자 분절인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 특정 유전자 분절이, VP7 또는 VP4를 코딩하는 유전자 분절인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 억제성 RNA가 miRNA, siRNA 또는 shRNA 인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 억제성 RNA가 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 표적부위로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 표적으로 하는 것인, 방법. - 제10항에 있어서,
상기 억제성 RNA가 miRNA 이고, 상기 세포주는 상기 miRNA 에 대한 pre-miRNA 를 코딩하는 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 것인, 방법. - 제11항에 있어서,
상기 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9, 및 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열 쌍으로 형성된 하나 이상의 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드인, 방법. - 제11항에 있어서,
상기 벡터는 표적부위가 서로 상이한 2종 이상의 miRNA 에 대한 pre-miRNA 를 코딩하는 2종 이상의 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 동시발현 벡터인, 방법. - 제1항에 있어서,
제1 로타바이러스의 상기 특정 유전자 분절에 상응하는 제2 로타바이러스의 유전자 분절의 mRNA가, 인 비트로 전사(in vitro transcription)에 의해 수득된 것인, 방법. - 제1항에 있어서,
세포주를 제1 로타바이러스로 감염시키는 단계 이후, 계대 배양을 통해 상기 재배열 로타바이러스를 농화시키는 단계를 더욱 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 세포주가 MRC-5, MA-104, 베로(Vero), BHK-21, COS-7, 293 T, CV-1 또는 TF-104 세포주인, 방법. - 제1항에 있어서,
소(bovine)의 WC3 로타바이러스의 VP7 유전자 분절에 대한 miRNA를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는 단계;
인간 로타바이러스의 VP7 유전자 분절의 mRNA, 또는 이를 코딩하는 DNA 또는 cDNA 를 상기 세포주에 도입하는 단계;
상기 세포주를 WC3 로타바이러스로 감염시키는 단계 ; 및
인간 로타바이러스의 VP7 유전자 분절을 포함하는 재배열 로타바이러스를 회수하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 표적부위를 억제하는 억제성 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는,
제1항에 따른 재배열(reassortant) 로타바이러스를 제조하는 방법에 사용하기 위한 조성물. - 서열번호 6 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9, 및 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어지는 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열 쌍으로 형성된 이중가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는,
제1항에 따른 재배열(reassortant) 로타바이러스를 제조하는 방법에 사용하기 위한 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210070036A KR102374547B1 (ko) | 2021-05-31 | 2021-05-31 | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 |
| PCT/KR2022/004185 WO2022255607A1 (ko) | 2021-05-31 | 2022-03-25 | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 |
| EP22816270.7A EP4349974A1 (en) | 2021-05-31 | 2022-03-25 | Method for preparing reassortant rotavirus |
| CN202280038675.8A CN117597437A (zh) | 2021-05-31 | 2022-03-25 | 用于制备重配轮状病毒的方法 |
| JP2023573626A JP2024520113A (ja) | 2021-05-31 | 2022-03-25 | 再集合体ロタウイルスの製造方法 |
| AU2022284639A AU2022284639A1 (en) | 2021-05-31 | 2022-03-25 | Method for preparing reassortant rotavirus |
| CONC2023/0018587A CO2023018587A2 (es) | 2021-05-31 | 2023-12-28 | Método para preparar rotavirus reagrupado |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210070036A KR102374547B1 (ko) | 2021-05-31 | 2021-05-31 | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102374547B1 true KR102374547B1 (ko) | 2022-03-14 |
Family
ID=80823891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210070036A KR102374547B1 (ko) | 2021-05-31 | 2021-05-31 | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4349974A1 (ko) |
| JP (1) | JP2024520113A (ko) |
| KR (1) | KR102374547B1 (ko) |
| CN (1) | CN117597437A (ko) |
| AU (1) | AU2022284639A1 (ko) |
| CO (1) | CO2023018587A2 (ko) |
| WO (1) | WO2022255607A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022255607A1 (ko) * | 2021-05-31 | 2022-12-08 | 에스케이바이오사이언스(주) | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4571385A (en) | 1983-06-27 | 1986-02-18 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Genetic reassortment of rotaviruses for production of vaccines and vaccine precursors |
| JP2818760B2 (ja) * | 1987-11-30 | 1998-10-30 | ザ・ウィスター・インスティチュート・オブ・アナトミー・アンド・バイオロジー | ロータウィルス組換体ワクチン及びその製造方法 |
| JP2007215466A (ja) * | 2006-02-16 | 2007-08-30 | Fujita Gakuen | レオウイルス科ウイルス由来の組換えウイルスを調製する方法、及び組換えロタウイルス調製用のｄｎａコンストラクト |
| US20080292660A1 (en) * | 2005-07-07 | 2008-11-27 | Kapikian Albert Z | Hexavalent Bovine Rotavirus Reassortant Composition Designed for Use in Developing Countries |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11707516B2 (en) * | 2016-09-27 | 2023-07-25 | Osaka University | Method for producing artificial recombinant rotavirus |
| KR102374547B1 (ko) * | 2021-05-31 | 2022-03-14 | 에스케이바이오사이언스(주) | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 |
-
2021
- 2021-05-31 KR KR1020210070036A patent/KR102374547B1/ko active IP Right Grant
-
2022
- 2022-03-25 CN CN202280038675.8A patent/CN117597437A/zh active Pending
- 2022-03-25 AU AU2022284639A patent/AU2022284639A1/en active Pending
- 2022-03-25 JP JP2023573626A patent/JP2024520113A/ja active Pending
- 2022-03-25 EP EP22816270.7A patent/EP4349974A1/en active Pending
- 2022-03-25 WO PCT/KR2022/004185 patent/WO2022255607A1/ko active Application Filing
-
2023
- 2023-12-28 CO CONC2023/0018587A patent/CO2023018587A2/es unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4571385A (en) | 1983-06-27 | 1986-02-18 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Genetic reassortment of rotaviruses for production of vaccines and vaccine precursors |
| JP2818760B2 (ja) * | 1987-11-30 | 1998-10-30 | ザ・ウィスター・インスティチュート・オブ・アナトミー・アンド・バイオロジー | ロータウィルス組換体ワクチン及びその製造方法 |
| US20080292660A1 (en) * | 2005-07-07 | 2008-11-27 | Kapikian Albert Z | Hexavalent Bovine Rotavirus Reassortant Composition Designed for Use in Developing Countries |
| JP2007215466A (ja) * | 2006-02-16 | 2007-08-30 | Fujita Gakuen | レオウイルス科ウイルス由来の組換えウイルスを調製する方法、及び組換えロタウイルス調製用のｄｎａコンストラクト |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PNAS, 2010, vol. 107, no. 43, pp. 18652-18657.* * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022255607A1 (ko) * | 2021-05-31 | 2022-12-08 | 에스케이바이오사이언스(주) | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CO2023018587A2 (es) | 2024-03-07 |
| JP2024520113A (ja) | 2024-05-21 |
| CN117597437A (zh) | 2024-02-23 |
| WO2022255607A1 (ko) | 2022-12-08 |
| EP4349974A1 (en) | 2024-04-10 |
| AU2022284639A1 (en) | 2023-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9453219B2 (en) | Cosmetic designs and products using intronic RNA | |
| US20060228800A1 (en) | Novel Transgenic Methods Using intronic RNA | |
| WO2005117557A2 (en) | Expression system | |
| TWI516592B (zh) | 用於在原核細胞內使用真核第二型聚合酶啟動子驅動之轉錄作用的可誘導之基因表現組成物及其應用 | |
| US6943015B2 (en) | Large scale production of packaged alphavirus replicons | |
| WO2023030246A1 (zh) | 一种用于治疗或预防非洲猪瘟的重组prrsv及其药物组合物 | |
| CN109196102B (zh) | 增加双链rna产生的方法和组合物 | |
| Zheng et al. | Recombinant PRRSV expressing porcine circovirus sequence reveals novel aspect of transcriptional control of porcine arterivirus | |
| KR102374547B1 (ko) | 재배열 로타바이러스의 제조 방법 | |
| JP7440045B2 (ja) | 核酸封入ａａｖ中空粒子 | |
| JP2023002469A (ja) | 抗ウイルス及び抗がんワクチンに用いる新規なｍＲＮＡ組成物及びその製造方法 | |
| JP5744375B2 (ja) | イントロンｒｎａ技術を用いる組み換え型核酸組成物及び同組み換え型核酸組成物を含む化粧品 | |
| US20080207539A1 (en) | Self-Processing Rna Expression Cassette | |
| CN110117579B (zh) | 表达16型蓝舌病病毒vp2基因的重组病毒及其构建方法和应用 | |
| NO342179B1 (no) | cDNA construct of Salmonidae alphavirus | |
| WO2023183794A2 (en) | Direct production of sirnas in saccharomyces boulardii and packaging in extracellular vesicles (evs) for targeted gene silencing | |
| KR101420564B1 (ko) | ＴＧＦ－β２ 발현을 억제하는 ｓｈＲＮＡ | |
| CN105200059A (zh) | 靶向抑制小鼠UCP2基因表达的siRNA及其表达载体的构建 | |
| CN111235150B (zh) | 用于抑制非洲猪瘟病毒复制的shRNA及其用途 | |
| JP7575761B2 (ja) | 核酸封入ａａｖ中空粒子の製造方法 | |
| WO1998050405A1 (en) | An infectious clone for human parainfluenza virus type 3 | |
| KR101434218B1 (ko) | 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 siRNA 를 코딩하는 뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터, 및 이에 의하여 형질 전환된 오이 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 가지는 식물 | |
| CN102876699B (zh) | 靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立方法 | |
| JP2022189717A (ja) | ｉＰＳ細胞の生成に使用される新規ＲＮＡ組成物およびその製造方法 | |
| US20170226550A1 (en) | Inhibitory rna for enhanced protein production in recombinant mammalian cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |