CN117597437A - 用于制备重配轮状病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于制备重配轮状病毒的方法，提供了使用抑制性RNA作为重配轮状病毒的选择压力的反向遗传学平台。通过该方法，重配概率显著增加，从而可以在短时间内以低成本制备期望的重配轮状病毒。
Description
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请基于并要求2021年5月31日提交的韩国专利申请第10-2021-0070036号的优先权，其公开通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于制备重配轮状病毒的方法，提供了使用抑制性RNA作为重配轮状病毒的选择压力的反向遗传学平台。
背景技术
轮状病毒是全球婴幼儿胃肠炎最重要的单一病因。全世界每年约有1亿5岁以下儿童患有轮状病毒胃肠炎，约有60万人死亡。死亡主要发生在发展中国家，但发展中国家和发达国家的患病率相似。因此，为了预防轮状病毒胃肠炎，降低轮状病毒感染引起的死亡率，疫苗的研制至关重要。
由于轮状病毒具有由11段双链RNA(dsRNA)的片段组成的基因组，当多个病毒株共感染一个细胞时，可以产生不同株的RNA片段混合的重配病毒。例如，可以制备重配病毒，其中混合了对人类无毒的牛轮状病毒RNA片段和引起人轮状病毒胃肠炎的人轮状病毒RNA片段。在这些牛-人重配病毒中，其中编码对人显示毒力的VP4的重配病毒片段由来自牛轮状病毒的RNA片段组成，编码VP7的重配病毒片段包含许多中和表位，由来自人轮状病毒的RNA片段组成，对人无毒性，不引起胃肠炎，但它们能诱导抗人轮状病毒中和抗体的形成，因此可用作抗人轮状病毒的疫苗。一个这样的实例为其为通过对从牛和人身上分离的轮状病毒进行重配和减毒而制成的五价疫苗。
制备重配病毒的常见方法是同时用两种类型的轮状病毒感染一个细胞系以获得重配病毒，但可以应用反向遗传学来增加重配的可能性。反向遗传学方法包括将过量的待重配基因的mRNA、或可转录成mRNA的DNA转染到细胞中，同时用辅助轮状病毒感染细胞，以诱导转染的mRNA和辅助轮状病毒的基因的重配。
然而，即使使用反向遗传学增加了重配的可能性，由于重配病毒的数量非常少，并且与野生型(WT)病毒相比减弱，除非施加选择压力，否则随着传代过程的进行，比例逐渐下降，使得分离和挽救所期望的重配病毒变得非常困难。因此，必须引入适当的选择过程才能获得成功的重配轮状病毒。
目前在选择过程中使用的方法是使用特异性结合并中和待替换基因(例如人轮状病毒的VP7基因)的蛋白质，但不结合替换基因(例如，牛轮状病毒的VP7基因)的蛋白质的单克隆中和抗体(例如，美国专利第4,571,385号)。然而，使用单克隆中和抗体的方法需要大量的时间和成本来获得中和抗体，并且由于轮状病毒毒株由具有相似序列、功能和结构的基因组成，因此存在难以获得对特定毒株的蛋白质具有特异性的中和抗体的问题。因此，有必要研究和开发可以施加选择压力的分离技术。
发明内容
技术问题
本发明涉及用于制备重配轮状病毒的方法，提供了使用抑制性RNA作为重配轮状病毒的选择压力的反向遗传学平台。
技术方案
本文所述的实施方案提供了用于制备重配轮状病毒的方法，其包括：提供细胞系，其稳定表达针对第一轮状病毒的11个基因片段中的特定基因片段的抑制性RNA；将对应于第一轮状病毒特定所述基因片段的第二轮状病毒基因片段的mRNA，或编码该mRNA的DNA或cDNA引入细胞系；用第一轮状病毒感染细胞系；和回收重配轮状病毒，该重配轮状病毒包含对应于第一轮状病毒的所述特定基因片段的第二轮状病毒的基因片段。
本文所述的另一实施方案提供了用于制备上述重配轮状病毒的方法的抑制性RNA寡核苷酸，其抑制选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中的任何一个或多于一个靶位点。
本文所述的另一实施方案提供了用于制备上述重配轮状病毒的方法的组合物，该组合物包含抑制选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的中任何一个或多于一个靶位点的抑制性RNA寡核苷酸。
本文所述的另一实施方案提供了用于制备上述重配轮状病毒的方法的双链DNA寡核苷酸，其由选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9、以及SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11中的任何一个或多于一个序列对形成。
本文所述的另一实施方案提供了用于制备上述重配轮状病毒的方法的组合物，该组合物包含由选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9、以及SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11中的任何一个或多于一个序列对形成的双链DNA寡核苷酸。
本文所述的另一实施方案提供了用于制备野生型WC3轮状病毒的生产被抑制的细胞系的组合物，该组合物包含抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸。
本文所述的另一实施方案提供了用于制备牛轮状病毒VP7蛋白质的生产被抑制的细胞系的组合物，该组合物包含抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸。
本文所述的另一实施方案提供了野生型WC3轮状病毒的生产被抑制的细胞系，其中该细胞系被引入抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸。
本文所述的另一实施方案提供了牛轮状病毒VP7蛋白质的生产被抑制的细胞系，其中该细胞系被引入抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸。
技术效果
由于根据本发明的轮状病毒重配方法使用反向遗传学方法，因此重配的概率显著高于通过同时感染两种类型的轮状病毒来获得重配病毒的传统方法。因此，预计所需时间可以大大缩短。此外，由于不使用单克隆中和抗体来选择重配病毒，因此可以减少获得单克隆中和抗体所需的成本和时间。因此，使用本发明，可以在比传统方法更短的时间和更低的成本下制备所期望的重配轮状病毒，并且可以用作疫苗。
附图说明
图1a至图1c示出了WC3轮状病毒的VP7基因(SEQ ID NO：1)和Brb9轮状病毒的VP7基因(SEQ ID NO：2)的核酸序列的比对结果。灰色阴影表示两个基因的核酸不同的区域，下划线和粗体文本表示根据本文所述的一个实施方案选择的三个靶位点。
图2示出了选自WC3轮状病毒的VP7基因的miRNA靶位点的序列，其包含编码能够结合(杂交)靶位点的miRNA的pre-miRNA的DNA序列的顶部链、作为其补体的底部链和通过将这两条链与4nt突出端结合而形成的dsDNA寡核苷酸。
图3是根据本文所述的一个实施方案的靶向WC3 VP7基因的三重miRNA表达载体的示意图。
图4是根据本文所述的一个实施方案的用于Brb9 VP7 mRNA的制备的DNA模板的设计示意图。
图5示出了根据本文所述的一个实施方案的用于确认P1(传代1)病毒的重配的RT-PCR结果。
图6示出了根据本文所述的一个实施方案的用于确认通过空斑分离从P1(传代1)分离的10个克隆的重配的RT-PCR结果。泳道1至10代表每个单独的克隆；W代表WC3病毒RNA(PCR阴性对照)；G代表G4病毒RNA(PCR阳性对照)；M代表100bp的DNA梯状条带。
图7示出了根据本文所述的一个实施方案的通过反向遗传学方法制备的G4重配病毒库(通过在MA-104细胞系中培养图6中确定的克隆6和克隆8而获得的重配病毒库)的空斑。
图8示出了使用RT-PCR对G4重配病毒库的重配确认结果。泳道1和泳道2分别表示以重配病毒的RNA为模板，在MA-104细胞系中培养图6中确定的克隆6和克隆8而获得的RT-PCR产物；泳道3表示以WC3病毒RNA(阴性对照)为模板进行的RT-PCR产物；泳道4表示使用Brb9合成DNA和WC3病毒RNA的混合物作为模板进行的RT-PCR产物(PCR反应对照)。
具体实施方案
根据本发明的一个方面，提供了用于制备重配轮状病毒的方法，其包括：提供细胞系，其稳定表达针对第一轮状病毒的11个基因片段中的特定基因片段的抑制性RNA；将对应于第一轮状病毒所述特定基因片段的第二轮状病毒基因片段的mRNA，或编码该mRNA的DNA或cDNA引入细胞系；用第一轮状病毒感染细胞系；和回收重配轮状病毒，该重配轮状病毒包含对应于第一轮状病毒的所述特定基因片段的第二轮状病毒的基因片段。
在一个实施方案中，第一轮状病毒可以是非人轮状病毒，例如牛轮状病毒、猴轮状病毒、猪轮状病毒、犬轮状病毒或山羊轮状病毒。作为优选的实施例，其可以是牛WC3轮状病毒毒株或其后代。
在一个实施方案中，第二轮状病毒可以是人轮状病毒，例如，P1、P2、G1、G2、G3、G4或G9人轮状病毒血清型。此外，第二轮状病毒可以是WI79、Wa、D、WISC2、DS-1、WI78、P、HCR3A、Br(Bricout)B、ST-3、BrB-9、WI79-9、SC2-9或WI78-8轮状病毒毒株或其后代。
在一个实施方案中，特定基因片段可以是编码选自VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP1、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5的蛋白质的基因片段，并且作为优选的实施例，特定基因片段可以是编码VP7或VP4的基因片段。
在一个实施方案中，抑制性RNA可以是miRNA、siRNA或shRNA。
在一个实施方案中，抑制性RNA可以是针对待抑制特定基因片段中不同靶位点的两个或多于两个抑制性RNA，并且两个或多于两个抑制性RNA可以包含在每个载体中或包含在一个载体中并引入细胞系中。
在一个实施方案中，抑制性RNA可以靶向选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5中的至少一个的靶位点。
在一个实施方案中，抑制性RNA可以是miRNA，并且可以将包含编码miRNA的pre-miRNA的双链DNA寡核苷酸的载体引入细胞系。
在一个实施方案中，双链DNA寡核苷酸可以是由选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9以及SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的一个或多于一个序列对形成的一个或多于一个双链DNA寡核苷酸。
在一个实施方案中，载体可以包含组成型启动子。
在一个实施方案中，载体可以是包含两个或多于两个双链DNA寡核苷酸的共表达载体，该双链DNA寡核苷酸编码具有不同靶位点的两个或多于两个miRNA的pre-miRNA。
在一个实施方案中，可通过体外转录获得与第一轮状病毒的特定基因片段相对应的第二轮状病毒的基因片段的mRNA。
在一个实施方案中，用于制备重配轮状病毒的方法还可以包括在用第一轮状病毒感染细胞系的步骤之后通过继代培养来富集重配轮状病毒。
在一个实施方案中，细胞系可以是MRC-5、MA-104、Vero、BHK-21、COS-7、293 T、CV-1或TF-104细胞系。
在一个实施方案中，用于制备重配轮状病毒的方法可以包括提供稳定表达针对牛WC3轮状病毒的VP7基因片段的miRNA的细胞系；将人轮状病毒的VP7基因片段的mRNA或编码该mRNA的DNA或cDNA引入该细胞系；用WC3轮状病毒感染该细胞系；以及回收包含人轮状病毒的VP7基因片段的重配轮状病毒。
根据本发明的另一方面，提供了抑制选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5中的任何一个或多于一个靶位点的抑制性RNA寡核苷酸。
在一个实施方案中，抑制性RNA可以是miRNA、siRNA或shRNA。
在另一个实施方案中，抑制性RNA可以是miRNA或miRNA的pre-miRNA。
根据本发明的另一方面，提供了由选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的任何一个或多于一个序列对形成的双链DNA寡核苷酸。
在另一个实施方案中，双链DNA寡核苷酸用于制备重配轮状病毒的上述方法。
根据本发明的另一个方面，提供了用于制备野生型WC3轮状病毒的生产被抑制的细胞系的组合物，该组合物包含上述抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸。
本文还提供了用于制备牛轮状病毒VP7蛋白质的生产被抑制的细胞系的组合物，该组合物包含上述抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸。
根据本发明的另一个方面，提供了野生型WC3轮状病毒的生产被抑制的细胞系，其引入了上述抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸。
本文还提供了牛轮状病毒VP7蛋白质的生产被抑制的细胞系，其引入了上述抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸。
在下文中，将更详细地描述本发明。
尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的任何方法和材料相似或等同的方法，但现在描述优选的方法和材料。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域的技术人员通常理解的相同含义。应当理解，本文所用的术语和相关定义仅用于解释目的，并不意指用于限制。
如本文所用，单数形式指一个或多于一个(即至少一个)语法对象。例如，“要素”表示一个要素或多于一个要素。
本文所用的术语“约”通常指给定值或范围的偏差在20％以内，优选偏差在10％以内，更优选偏差在5％以内。
如本文所述，“包含(特定的组分)”可能意味着它可以包含所列组分以外的其他组分(“包含”)，或者它可能基本上含有所列的组分(“基本上组成为”)。
本发明的一个实施方案提供了使用持续表达轮状病毒特定基因的抑制性RNA的细胞系，通过反向遗传学方法制备期望的重配轮状病毒的方法。
反向遗传学方法包括将过量的待重配基因的mRNA、或可转录成mRNA的DNA转染细胞，同时用辅助轮状病毒感染细胞，以诱导转染的mRNA和辅助轮状病毒的基因的重配。在后面描述的本申请的一个实施方案中，提供了将牛WC3轮状病毒毒株用作辅助病毒，并将编码VP7的RNA片段，即人G4轮状病毒BrB9株(Bricout B9)的RNA片段9，用作待转染的基因进行重配的实施例，从而作为辅助病毒和待转染基因的重配的结果而产生WC3/Brb9-VP7重配病毒。然而，这样的实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不受实施例的限制。
在本申请中，持续表达轮状病毒特定基因的抑制性RNA的细胞系为选择和分离期望的重配轮状病毒提供了选择压力。特别地，传统的使用单克隆中和抗体施加选择压力的方法需要大量的时间和成本来获得中和抗体，并且由于轮状病毒毒株由具有相似序列、功能和结构的基因组成，因此存在难以获得对特定毒株的蛋白质具有特异性的中和抗体的问题。然而，本发明具有以下优点：由于抑制性RNA的靶序列较短(约21bp)，即使在相似毒株的基因之间也很容易发现不同的部分，从而易于施加选择压力。此外，当使用多个靶位点时，可以施加更强的选择压力。此外，可以容易地制备持续表达轮状病毒特定基因的抑制性RNA的细胞系。
在优选的实施方案中，用于制备重配轮状病毒的方法包括以下步骤：
提供的细胞系，其稳定表达针对第一轮状病毒的11个基因片段中的特定基因片段的抑制性RNA；
将对应于第一轮状病毒所述特定基因片段的第二轮状病毒基因片段的mRNA，或编码该mRNA的DNA或cDNA引入细胞系；
用第一轮状病毒感染细胞系；和
回收重配轮状病毒，其包含对应于第一轮状病毒的所述特定基因片段的第二轮状病毒的基因片段。
在一个实施方案中，如果特定基因是单基因，制备的重配轮状病毒将具有11个基因片段，其中与特定基因片段对应的基因片段来自第二轮状病毒，其余10个基因片段来自第一轮状病毒。
在另一个实施方案中，如果特定基因是“n”基因，制备的重配轮状病毒将具有11个基因片段，其中与特定基因片段对应的“n”基因片段来自第二轮状病毒，其余“11-n”基因片段来自第一轮状病毒。
轮状病毒通常具有由11个基因片段组成的基因组：6个基因片段分别编码结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7)，5个基因片段分别编码非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5)。其中，VP7和VP4是存在于病毒表面的结构蛋白，并决定了病毒的血清型。特别地，VP7决定G血清型，VP4决定P血清型。因此，轮状病毒的血清型同时被认为是G型和P型。对于G型，由于血清型和基因型相同，用数字表示血清型(例如，G1、G2、G3)；对于P型，由于血清和基因型不相同，用开放数字表示血清型，用闭括号表示基因型(例如，P1A[8]、P1B[4])，或者单独表示基因(例如，P[8]、P[4])。
在一个实施方案中，第一轮状病毒可以是非人轮状病毒，第二轮状病毒可以是人轮状病毒。这是基于非人轮状病毒对人类的毒力可能会降低的观点。然而，本发明不限于此，第一轮状病毒和第二轮状病毒都可以是非人轮状病毒，或者两者都可以是人轮状病毒。
在优选的实施方案中，第一轮状病毒可以是非人轮状病毒，如牛轮状病毒、猴轮状病毒、猪轮状病毒、犬轮状病毒或山羊轮状病毒。牛轮状病毒的实例包括轮状病毒毒株NCDV、WC3或UK等。猴轮状病毒的实例包括恒河猴轮状病毒(RRV)毒株TUCH、MMU 18006或MMU17959、黑长尾猴猴轮状病毒毒株SA11、或豚尾猴轮状病毒毒株PTRV(Macacanemesrina)或YK-1(macaques)等，但不限于此。
在另一个优选的实施方案中，第二轮状病毒可以是人轮状病毒，其可以具有任何P血清型或G血清型，但优选为P1、P2、G1、G2、G3、G4或G9血清型，这是主要引起疾病的血清型。G1血清型的人轮状病毒的实例包括轮状病毒毒株WI79、Wa、D等，G2血清型的人轮状病毒的实例包括轮状病毒毒株WISC2、DS-1等，G3血清型的人轮状病毒的实例包括轮状病毒毒株WI78、P、HCR3A等，G4血清型的人轮状病毒的实例包括轮状病毒毒株Br(Bricout)B、ST-3等，G9血清型的人轮状病毒的实例包括轮状病毒毒株WI61等，P1血清型的人轮状病毒的实例包括轮状病毒毒株WI79、WI78、WI61、Wa等，以及P2血清型的人轮状病毒的实例包括轮状病毒毒株DS-1等，但不限于此。
或者，第一轮状病毒或第二轮状病毒或两者都可以是先前已知的重配病毒，例如BrB-9(GenBank登录号GU565093)、WI79-9(GenBank登录号GU565060)、SC2-9(GenBank登录号GU565071)、WI78-8(GenBank登录号GU565082)或WI79-4(GenBank登录号GU565049)，但不限于此。
如本文所用，抑制性RNA指能够序列特异性地抑制或减少靶基因的表达的核酸分子。抑制性RNA可以与靶基因或其mRNA充分互补，以结合(杂交)靶基因或其mRNA，从而抑制或降低转录和/或表达。抑制性RNA可通过RNA干扰(RNAi)抑制或降低靶基因的转录和/或表达。在优选的实施方案中，抑制性RNA可以是短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)或微小RNA(miRNA)。
RNAi指基因表达被短长度(通常为12mer至21mer)双链RNA(dsRNA)序列特异性抑制的现象。这些dsRNA可以选择性地降解与之互补的靶mRNA，从而停止靶基因的转录和/或蛋白质合成。因此，RNAi被广泛用于沉默感兴趣的基因。siRNA和miRNA是导致RNAi的代表性的小RNA，在属于RNase III组的dsRNA特异性内切酶的dicer酶切割dsRNA前体时产生。
siRNA是由约21个核苷酸组成的dsRNA，由约19个碱基对和3’侧的两个核苷酸突出端组成。这些3’突出端在RNAi过程中充当中间介质。当转座子、病毒或体内基因产生长dsRNA时，或者当dsRNA从外部被人工转染到细胞中时，就会产生siRNA。然后，将siRNA分离成单链，并将其包含在RNA诱导沉默复合体(RISC)中，整合到RISC中后，它与靶mRNA形成互补对，并根据与靶mRNA的互补程度切割mRNA、降解mRNA或抑制mRNA翻译。使用siRNA的RNAi可以通过在体外将针对靶序列的dsRNA直接转染细胞来抑制特定核酸序列的基因表达。
在使用shRNA的RNAi的情况下，使用转录具有发夹结构的单链RNA的质粒DNA，而不是用合成的dsRNA直接转染细胞。具体地，由RNA聚合酶III启动子控制的质粒在靶细胞的细胞核中转录成短发夹单链RNA，然后由输出蛋白-5移动至细胞质中，经dicer处理，从而将shRNA转化为siRNA。
miRNA是在细胞中自然产生的，是不具备产生蛋白质的遗传信息的RNA。
miRNA是自然存在于细胞中的RNA，不包含产生蛋白质的遗传信息。miRNA的形成过程如下：在细胞核中，初级miRNA(pri-miRNA)从基因组转录，然后通过drosha切除以形成短发夹状的前体miRNA(pre-miRNA)，其通过输出蛋白-5从细胞核输出到细胞质。在细胞质中，pre-miRNA被dicer酶切割成大约-22nt的dsRNA，在3’侧具有2nt的突出端结构，然后包含在RISC中以形成单链的成熟miRNA。成熟miRNA可以与靶mRNA形成互补对，并且根据与靶mRNA的互补程度，它可以切割并降解mRNA或抑制mRNA翻译。
在一个实施方案中，本文的抑制性RNA可以是工程化的miRNA，其与靶位点完全互补，并且可以切割靶mRNA。工程化的miRNA可通过含有编码该miRNA的DNA的载体引入细胞中，并在细胞内稳定表达。
载体在被引入细胞后被转录以表达pre-miRNA。pre-miRNA形成类似于内源性pre-miRNA结构的发夹形式的茎环结构，miRNA的表达和作用机制如上所述。它通过靶mRNA的切割和降解转化为成熟形式的miRNA，从而抑制靶基因的表达。“稳定表达”指目标核酸的持续、组成型或永久表达，与瞬时表达相反。
在优选的实施方案中，本文的抑制性RNA是工程化的miRNA，并且可以通过含有编码为miRNA工程化的pre-miRNA的双链DNA寡核苷酸的载体被引入细胞中。将载体引入细胞中后，转录载体以表达pre-miRNA，形成类似内源性pre-miRNA结构的发夹状的茎环结构。通过上述miRNA的表达和作用机制，将pre-miRNA转化为成熟形式的miRNA，切割并降解靶基因，从而抑制靶基因的表达。
在一个实施方案中，编码pre-miRNA的双链DNA寡核苷酸可以如下构建：(i)用于克隆到载体中的5’末端突出端；(ii)与靶区域互补的反义序列(即，成熟的miRNA序列)编码区域；(iii)形成末端环结构的间隔序列；(iv)与区域(ii)互补以形成茎结构的序列编码区域(即靶位点的正义序列)；(v)用于克隆到载体中的3’末端突出物。任选地，在区域(iv)中，可以删除一些核苷酸(例如，约2nt)以形成一个短的内环，以提高抑制基因表达的效率。
此外，双链DNA寡核苷酸可以由如上构建的顶部链和与作为其补体的的底部链组成。
在一个实施方案中，本文的载体可以包含组成型启动子以稳定表达抑制性RNA。启动子可以是依赖RNA聚合酶II的启动子。此外，载体可以包含常规的表达控制序列。例如，可以适当地包含衔接子或接头、增强子、选择性标志物(例如，抗生素抗性标志物)、可复制单元、多腺苷酸化(polyA)信号序列、用于纯化的标签、或用于调节基因表达或诱导在原核或真核细胞或病毒中表达的任何已知序列及其各种组合。
miRNA的RNAi效应的效率由靶序列决定。在过去的几年中，已经开发了设计基于数据库的功能miRNA的算法，该数据库已经研究了许多miRNA的碱基序列和由此产生的RNAi效率，并且可在几个网站上获得(例如，www.ambion.com、www.oligoengine.com、www.vectorcorea.com)。
然而，通过算法确定的miRNA不一定能够有效地降解靶mRNA，并且单独一个靶位点可能不足以有效抑制。因此，通过选择每个基因的两个或多于两个靶位点来制造miRNA可以增加基因抑制实验的成功概率。
因此，本文的载体可以是两个或多于两个载体，每个载体包含两个或多于两个双链DNA寡核苷酸，编码具有不同靶位点的两个或多于两个miRNA的pre-miRNA；或者可以是包含两个或多于两个双链DNA寡核苷酸的共表达载体，编码具有不同靶位点的两个或多于两个miRNA的pre-miRNA。
载体可以是本领域已知的质粒载体如pcDNA(Invitorgen)或病毒载体，但不限于此。通过本领域已知的方法进行向细胞中的引入，例如磷酸钙法，或可以适当地进行使用各种转染试剂(例如，寡转染胺(oligofectamine)、脂转染胺(lipofectamine)或lipofection等)的方法。
作为根据本发明的一个实施方案的非限制性实例，抑制性RNA可以靶向选自SEQID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中的一个或多于一个靶位点。
通过筛选第一轮状病毒和第二轮状病毒的核苷酸序列之间具有低同源性(％)的核苷酸序列区域来选择上述三个靶位点。如果使用靶向不同靶位点的抑制性RNA，则序列同源性(％)增加，因此抑制靶位点表达的效果可能较低或不存在。
作为根据本发明的一个实施方案的非限制性实例，双链DNA寡核苷酸可以是由选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9以及SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11中的一个或多于一个序列对形成的一个或多于一个双链DNA寡核苷酸。
本文所用的稳定表达针对第一轮状病毒的11个基因片段中的特定基因片段的抑制性RNA的细胞系可以是对轮状病毒高度敏感的细胞。例如，细胞系可以是MRC-5、MA-104、Vero、BHK-21、COS-7、293 T、CV-1或TF-104细胞系，但不限于此。
同时，在本文制备重配病毒的方法中，将对应于第一轮状病毒的特定基因片段的第二轮状病毒的基因片段的mRNA、DNA或cDNA引入细胞系中。
当对应于第一轮状病毒的特定基因片段的第二轮状病毒的基因片段的mRNA被引入细胞中时，该mRNA可以通过本领域已知的方法合成或通过体外转录获得。在这种情况下，考虑到天然轮状病毒mRNA在5’端具有影响基因组复制和翻译的帽结构，优选将获得的mRNA加帽。
或者，当编码对应于第一轮状病毒的特定基因片段的第二轮状病毒的RNA片段的DNA或cDNA被引入细胞中时，通常可以使用由T7 RNA聚合酶识别的T7启动子。然而，也可以使用各种RNA聚合酶识别的其他启动子，例如，T3 RNA聚合酶或Sp6 RNA聚合酶，但不限于此。可以使用已知的载体引入DNA或cDNA。例如，作为T7 RNA聚合酶启动子，可以使用已知的T7表达载体，如商业上可获得的pBluescriptII SK(+/-)(Stratagene)、pCRII(Invitgen)、PGEM(Promega)、pET(Novagene)、pcDNA(Invitorgen)等，但不限于此。此外，当如上所述将DNA或cDNA引入细胞中时，可以在将DNA或cDNA引入细胞之前或之后引入表达RNA聚合酶的核酸结构。优选地，用于提供RNA聚合酶的核酸结构可以包含编码处于可表达状态的加帽酶的序列。
将第二轮状病毒的基因片段引入细胞中后，第一轮状病毒作为辅助病毒感染细胞。辅助病毒可以是自然界中存在的野生型病毒，但不限于此，也可以是自然界中存在的突变病毒或经过人工遗传修饰的重组病毒。在优选的实施方案中，可以在存在胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的情况下进行感染，以促进感染。
在用第一轮状病毒感染细胞系之后，本文用于制备重配轮状病毒的方法还可以包括通过继代培养来富集重配轮状病毒。
由于本文的方法使用持续表达针对特定轮状病毒基因的抑制性RNA的细胞系，所以施加选择压力来选择和分离重配轮状病毒。具体地，在本文所用的细胞中，第一轮状病毒的特定基因片段的mRNA水平被抑制性RNA降低，同时引入过量的第二轮状病毒的相对应的特定基因片段。因此，在病毒的复制和组装过程中，使用第二轮状病毒的特定基因片段的mRNA而不是第一轮状病毒的特定基因片段的mRNA，从而增加了发生重配病毒的概率。此外，随着传代的继续，辅助病毒(例如，野生型WC3病毒)的复制继续被细胞表达的miRNA抑制，但重配病毒不受影响，因此重配病毒可能会被富集。
重配病毒的回收可以通过在培养后回收培养基和/或细胞裂解物来进行。任选地，可以通过将回收的培养基和/或细胞裂解物添加(接种)到另一宿主细胞(第二宿主细胞、第三宿主细胞)，继代培养，然后回收来重新感染病毒。病毒回收可以通过空斑分离来进行，如果需要，可以纯化回收的重组病毒。例如，病毒可以通过适当组合离心、密度梯度离心、柱层析等来纯化。
本发明的一个实施方案的实例提供制备重配轮状病毒的方法，其包括：提供稳定表达针对牛WC3轮状病毒的VP7基因片段的miRNA的细胞系；将人轮状病毒的VP7基因片段的mRNA或编码该mRNA的DNA或cDNA引入该细胞系；用WC3轮状病毒感染该细胞系；以及回收包含人轮状病毒的VP7基因片段的重配轮状病毒。每个步骤的详细描述如上所述。
本发明还涉及抑制选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中的任何一个或多于一个靶位点的抑制性RNA寡核苷酸。在优选的实施方案中，抑制性RNA可以是miRNA、siRNA或shRNA。在另一个优选的实施方案中，抑制性RNA可以是miRNA或miRNA的pre-miRNA。
本发明还提供了由选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的任何一个或多于一个序列对形成的双链DNA寡核苷酸；用于制备野生型牛WC3轮状病毒的生产被抑制的细胞系的组合物，该组合物包含抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸；用于制备牛轮状病毒VP7蛋白质的生产被抑制的细胞系的组合物，该组合物包含上述抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸；野生型WC3轮状病毒的生产被抑制的细胞系，其引入抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸；牛轮状病毒VP7蛋白质的生产被抑制的细胞系，其引入了上述抑制性RNA寡核苷酸或双链DNA寡核苷酸。它们可用于上述制备重配病毒的方法中。
实施例
在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，在不脱离本公开的基本要点的情况下，可以对下述实施例进行修改。
实施例1.用于抑制WC3野生型轮状病毒中VP7基因的转录和表达的靶位点的选择
为了制备WC3/Brb9-VP7重配病毒，转化对轮状病毒高度易感的细胞，以建立能够抑制未重排的牛WC3野生型病毒产生的稳定细胞系。该转化使用针对WC3病毒的VP7基因的RNA干扰(RNAi)技术。
具体地，在WC3轮状病毒的VP7基因中，选择了三个对WC3特异但对人轮状病毒BrB9的VP7不特异的miRNA靶位点。本文建立的稳定细胞系意指组成型的表达这些靶位点的miRNA。miRNA(成熟形式)是21bp的短干扰RNA，对应于与RNAi靶位点完全互补的反义序列，并抑制WC3 VP7基因的转录和表达。为了选择miRNA，使用由用于RNAi表达的载体系统提供的Invitrogen’s Stealth RNAiTM预设计siRNA网络工具(www.invitrogen.com/maiexpress)。WC3 VP7基因参考GenBank AY050272(SEQ ID NO：1)，Brb9 VP7基因参考GenBank GU565090(SEQ ID NO：2)。图1示出了WC3 VP7基因(SEQ ID NO：1)和Brb9 VP7基因(SEQ ID NO：2)的核酸序列的比对结果。如图1所示，WC3 VP7基因(SEQ ID NO：1)和Brb9VP7基因(SEQ ID NO：2)的核酸序列之间的同源性为74.3％(1062bp中有789bp相同)，靶位点选自显示较低同源性的区域。具体地，图1中，三个选定的靶位点用下划线标出，并用粗体表示。按照从5’到3’方向的顺序，靶位点1(SEQ ID NO：3)的序列同源性为71.4％(15/21)，靶位点2(SEQ ID NO：4)的序列同源性为66.7％(14/21)，靶位点3(SEQ ID NO：5)的序列同源性为61.9％(13/21)。
实施例2.miRNA表达载体的构建
为了表达针对实施例1中选择的三个miRNA靶位点的miRNA，根据制造商的手册，将编码它们的pre-miRNA的序列克隆到每个miRNA表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(Invitrogen)中。为此，首先，设计并合成能够转录能够结合每个靶位点的每个miRNA的pre-miRNA的DNA序列及其互补序列，以具有4nt的突出端，然后退火以产生dsDNA寡核苷酸(表1和图2)。
[表1]
然后，根据制造商的手册，将具有4nt突出端的dsDNA寡核苷酸和线性化的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR vector(Invitrogen)连接，转化入大肠杆菌中，然后选择菌落并进行序列分析以获得完整的miRNA表达质粒，分别命名为pcDNA-GFP/mr1、pcDNA-GFP/mr2和pcDNA-GFP/mr3。
实施例3.三重miRNA表达载体的构建
根据制造商的手册，设计并克隆了能够在单个载体中同时转录三种miRNA的表达载体。首先，用BamHI和XhoI限制性内切酶对pcDNA-GFP/mr1进行消化，纯化出约151bp的插入片段。用BglII和XhoI限制性内切酶对pcDNA-GFP/mr2进行消化，纯化出约5.6kb的载体片段。将插入片段与载体片段连接后转化入大肠杆菌中，选择菌落并进行序列分析，以制备完整的双miRNA表达载体。然后用BamHI和XhoI限制性内切酶对双miRNA表达载体进行消化，纯化出约250bp的插入片段2，并用BglII和XhoI限制性内切酶对pcDNA-GFP/mr3进行消化，纯化出约5.6kb的载体片段2。将插入片段2与载体片段2连接后转化入大肠杆菌中，选择菌落并进行序列分析，以制备完整的三重miRNA表达载体。将制备好的三重miRNA表达载体用DraI限制性内切酶进行消化，去除EmGFP片段，然后再连接，构建了不含GFP基因的三重miRNA表达载体，命名为pcDNA-Tri-miRNA(图3)。
实施例4.稳定表达的三重miRNA细胞系的构建及WC3感染抑制试验
为了获得稳定表达的三重miRNA的细胞系，将pcDNA-Tri-miRNA质粒转染入TF-104(非洲绿猴上皮细胞系)中，利用载体中含有的抗生素抗性基因筛选出表达miRNA的单细胞。用浓度为10μg/ml至20μg/ml的抗生素杀稻瘟素S处理转染的细胞，并重复几次抑制未转染细胞的生长和选择转染细胞的过程。结果，在抗杀稻瘟素的单细胞菌落中，扩增了44个菌落并传代以获得44个克隆。
将上述克隆和野生型(WT)TF-104细胞中的每个以90％融合度接种在24孔板中，并以每孔100pfu和每孔1pfu感染WC3病毒。在感染3天和5天后比较致细胞病变效应(CPE)，并选择与WT TF-104相比具有感染被抑制的克隆。结果，如表2所示，克隆6、13、14、19、31和44有效地抑制了WC3感染，特别是克隆44显示出最大的抑制作用。
[表2]
表达三重miRNA的克隆的WC3感染抑制试验
*++：完全CPE、+：部分CPE、N：无CPE
去除被WC3病毒感染的克隆6、13、14、19、31和44的培养基，用含有10％FBS和10μg/ml杀稻瘟素的EMEM培养基代替，进行延长的继代培养以挽救未被病毒感染的细胞。这些细胞分别被命名为TK6r、TK13r、TK14r、TK19r、TK31r和TK44r。
实施例5.G4 Brb9 VP7 mRNA的构建
通过体外转录和加帽过程将用于重配的人轮状病毒G4 Brb9的VP7基因转录成mRNA，然后转导该mRNA。它可以直接以质粒DNA的形式转导，但在这种情况下，T7启动子通常用于高效转录。由于T7启动子是特异性的和强大的，即使在胞浆中也可以转录，因此其具有即使质粒保留在细胞质中而不是被递送到细胞核中也允许转录的优点。然而，其具有必须首先将能够表达T7聚合酶的表达载体转导到细胞中，而且在细胞质中转录的RNA不稳定的缺点，因为其没有加帽。为了提高B1b9 VP7基因的重排效率，使用与病毒mRNA相同的帽状结构是有利的。因此，在这个实施例中，不是转导质粒DNA，而是在体外进行转录，以具有与病毒mRNA相同的形式，并且该mRNA被引入。
设计DNA模板以在体外将G4Brb9的VP7基因转录成mRNA。由于轮状病毒的3’非编码区序列对翻译过程很重要，转录必须在正确的位置开始和结束。尽管T7启动子的转录起点非常精确，但即使存在T7终止子，终点也有一定的异质性。因此，通过在T7终止子之前引入δ肝炎病毒(HDV)核酶序列，DNA模板被设计成在VP7基因末端的位置被准确切割(参见SEQ IDNO：12和图4)。合成设计的DNA模板，经EcoRI/BamHI限制性内切酶消化后克隆至pUC57载体，命名为pUC57-T7-Brb9-VP7。
使用mMESSAGE mMACHINE试剂盒(Ambion)和pUC57-T7-Brb9-VP7 DNA模板，根据制造商的手册通过体外转录和5’加帽制备Brb9 VP7 mRNA。
实施例6.G4 Brb9 VP7 mRNA转染和WC3病毒感染
将体外转录的G4 B1b9 VP7 mRNA脂质体(Lipofectamine 2000；Thermo Fisher)转染到实施例4中获得的TK14r细胞系中。根据制造商的手册提供的常规方法进行转染过程。转染后，细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养4小时，然后用完全生长培养基(含10％FBS的EMEM)替换培养基。
转染24小时后，用感染培养基(含0.5μg/ml胰蛋白酶的无血清EMEM)替换培养基，并用WC3病毒(ATCC VR-2102)感染MOI为1.0的细胞，所述WC3病毒用胰蛋白酶(Sigma，T0303，10μg/ml)在37℃活化30分钟。感染后，将细胞在37℃、5％CO2的培养箱中培养48小时，并确认致细胞病变效应(CPE)。
在TK14r细胞中，通过使用miRNA抑制WC3 VP7基因的转录和表达来降低WC3VP7mRNA的水平，同时引入过量的BrB9 VP7 mRNA。因此，在病毒的复制和装配过程中，使用了BrB9 VP7 mRNA而不是WC3 VP7 mRNA，从而增加了发生重配病毒的概率。此外，随着传代的继续，WC3 WT病毒的复制继续被细胞表达的miRNA抑制，但重配病毒不受影响，因此，重配病毒可以被富集。
实施例7.WC3/Brb9 VP7重配病毒的鉴定
通过上述过程，将发生CPE的细胞冻融3次，除去细胞碎片，并获得上清液，将其指定为第0代(P0)。在TK14r细胞系或MA-104细胞系再次感染P0后48小时，将细胞冻融三次，除去细胞碎片，并获得上清液，将其指定为第1代(P1)。
为了确认重组样品中的重配，制备了能特异性检测WC3 VP7、BrB9 VP7和WC3 VP4的引物组。没有观察到交叉活性或假阳性和假阴性结果(表3)。
[表3]
用于检测WC3 VP7、BrB9 VP7和WC3 VP4的RT-PCR寡核苷酸组合
使用上述引物进行RT-PCR反应以确认样品中的重配。WC3 VP7、BrB9 VP7和WC3VP4分别扩增为422bp、406bp和394bp的RT-PCR产物，使用的RT-PCR条件如下(表4)。
[表4]
用于检测VP7和VP4基因的RT-PCR反应条件
用P0样品感染TK14r细胞系和MA-104细胞系后，从两个P1细胞株中提取病毒RNA，进行RT-PCR。在5次尝试中，使用TK14r细胞系制备了两次P1(图5，泳道1和4)，并用MA-104细胞系制备P1三次(图5，泳道2、3和5)。结果，在第4次和第5次尝试中获得的P1中证实了大小约为400bp的BrB9VP7特异性条带(图5，泳道4和泳道5)。
在进行RT-PCR时，使用对于WC3主干病毒常见的VP4作为内部对照。如果BrB9 VP7被重配到WC3病毒中，BrB9 VP7和WC3 VP4信号应该从样品中同时被确认，而WC VP7应该没有被检测到。因此，#4和#5成功地证实了BrB9 VP7被重配到WC3病毒中。
实施例8.重配病毒的分离
由于P0和P1阶段的病毒以混合克隆而不是单克隆的形式存在，因此使用对应于图5泳道4的P1样品进行空斑分离，以分离重配的单克隆病毒。为了直接地观察形成的空斑，用中性红对细胞单层进行染色以确认病毒的增殖。
挑选并分析60个至100个空斑，连续重复这一系列过程三次或多于三次，以找到重配的空斑。空斑挑选过程如下：1)在显微镜下或用肉眼标记重配的空斑的候选物；2)根据要挑选的数量，将300μl的EMEM(无血清)分装到每个e管中；3)用消毒过的尖端挑取并放入2)中；4)保存在-70℃或加入胰蛋白酶(T0303，1μg/mL)用于感染。在进行空斑测定后，分离出10个已鉴定的空斑。在用TK14r细胞系(24孔，1×10E5/孔)感染后收获空斑分离的单克隆，并培养3天或直到确认CPE。从收获的样品中提取病毒RNA，并使用它作为模板通过RT-PCR分析，以确定它是否是重配病毒。结果，确认克隆#6和#8为重配克隆(图6)。鉴定为G4重配空斑的克隆#6和#8在MA-104细胞系中培养以获得重配病毒库存(图7和图8)。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开可以以不同的具体形式实施，而不改变其技术精神或基本特征。在该方面，应当理解，上述实施方案在所有方面都不是限制性的，而是说明性的。本公开的范围由所附权利要求而不是由其前面的描述来定义，因此落入权利要求的标准和界限或这些标准和界限的等同的所有改变和修改旨在被权利要求所包含。
Claims (19)
1.一种用于制备重配轮状病毒的方法，其包括：
提供细胞系，其稳定表达针对第一轮状病毒的11个基因片段中的特定基因片段的抑制性RNA；
将对应于第一轮状病毒所述特定基因片段的第二轮状病毒基因片段的mRNA，或编码该mRNA的DNA或cDNA引入细胞系；
用第一轮状病毒感染细胞系；和
回收重配轮状病毒，其包含对应于第一轮状病毒的所述特定基因片段的第二轮状病毒的基因片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中第一轮状病毒为非人轮状病毒、牛轮状病毒、猴轮状病毒、猪轮状病毒、犬轮状病毒或山羊轮状病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其中第一轮状病毒为WC3轮状病毒毒株或其后代。
4.根据权利要求1所述的方法，其中第二轮状病毒是入轮状病毒。
5.根据权利要求4所述的方法，其中第二轮状病毒是P1、P2、G1、G2、G3、G4或G9人轮状病毒血清型。
6.根据权利要求1所述的方法，其中第二轮状病毒是WI79、Wa、D、WISC2、DS-1、WI78、P、HCR3A、Br(Bricout)B、ST-3、BrB-9、WI79-9、SC2-9或WI78-8轮状病毒毒株或其后代。
7.根据权利要求1所述的方法，其中特定基因片段是编码选自VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP1、NSP2、NSP3、NSP4和NSP5的蛋白质的基因片段。
8.根据权利要求1所述的方法，其中特定基因片段是编码VP7或VP4的基因片段。
9.根据权利要求1所述的方法，其中抑制性RNA是miRNA、siRNA或shRNA。
10.根据权利要求1所述的方法，其中抑制性RNA靶向选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中的至少一个的靶位点。
11.根据权利要求10所述的方法，其中抑制性RNA是miRNA，并且将包含编码miRNA的pre-miRNA的双链DNA寡核苷酸的载体引入细胞系。
12.根据权利要求11所述的方法，其中双链DNA寡核苷酸是由选自SEQ ID NO：6和SEQID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9以及SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的一个或多于一个序列对形成的一个或多于一个双链DNA寡核苷酸。
13.根据权利要求11所述的方法，其中载体是包含两个或多于两个双链DNA寡核苷酸的共表达载体，所述双链DNA寡核苷酸编码具有不同靶位点的两个或多于两个miRNA的pre-miRNA。
14.根据权利要求1所述的方法，其中通过体外转录获得与第一轮状病毒的特定基因片段相对应的第二轮状病毒的基因片段的mRNA。
15.根据权利要求1所述的方法，在用第一轮状病毒感染细胞系之后，该方法还包括通过继代培养来富集重配轮状病毒。
16.根据权利要求1所述的方法，其中细胞系是MRC-5、MA-104、Vero、BHK-21、COS-7、293T、CV-1或TF-104细胞系。
17.根据权利要求1所述的方法，其包括：
提供细胞系，其稳定表达针对牛WC3轮状病毒的VP7基因片段的miRNA；
将人轮状病毒的VP7基因片段的mRNA或编码该mRNA的DNA或cDNA引入该细胞系；
用WC3轮状病毒感染该细胞系；以及
回收包含人轮状病毒的VP7基因片段的重配轮状病毒。
18.一种用于根据权利要求1所述的制备重配轮状病毒的方法的抑制性RNA寡核苷酸，其抑制选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中的任何一个或多于一个靶位点。
19.一种用于根据权利要求1所述的制备重配轮状病毒的方法的双链DNA寡核苷酸，其由选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：10和SEQID NO：11中的任何一个或多于一个序列对形成。
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