CN102115731B - 制备抗蓝耳病转基因猪的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备抗蓝耳病转基因猪的方法，该方法是通过制备含有编码以蓝耳病病毒ORF1b、ORF5、ORF6或ORF7为干扰靶基因的shRNA的DNA的转基因细胞；以所述的转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得的克隆胚胎；将所述的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因猪。本发明的方法获得的转基因猪具有显著的抗蓝耳病的能力。

Description

制备抗蓝耳病转基因猪的方法
技术领域
本发明涉及动物转基因技术，具体涉及一种制备抗蓝耳病的转基因猪的方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，俗称蓝耳病，是由猪繁殖与综合症病毒(PRRSV)所引起的一种传染性疾病。该病于1987年在美国首次发现，2006年我国部分省市猪群暴发高致病性蓝耳病，且该病毒与经典的蓝耳病病毒相比，基因发生了较大的变异，具有很强的致病性。
在PRRSV的大流行中PRRS造成的经济损失早已经为人们所熟知。据估计PRRS给美国养猪生产者造成的损失每年达5.6亿美元(Cho and Dee，2006)。我国是养猪大国，几乎占世界养猪总量的一半。随着猪集约化和规模化养殖的发展，猪的传染性疾病发病率增高，特别是近几年爆发的“无名高热病”等带来的损失都是每年以亿元为计算单位，给养猪业带来巨大损失，极大地挫伤了养猪者的积极性。同时，2007-2008年猪肉价格一涨再涨，以至使猪肉价格创历史最高记录，极大地影响了人们生活。
目前在病毒防治中主要采用疫苗，许多学者对PRRS病毒进行了较深入的研究，并在此基础上研制了弱毒苗、灭活苗和基因工程疫苗，试图通过免疫途径控制该病，但是由于蓝耳病病毒能导致猪持续感染、病毒血症及免疫性能低下，至今还没有能有效地控制PRRS的技术和措施。此外，PRRSV感染可引起机体的细胞免疫功能低下，而体内高水平的病毒特异性抗体又不足以清除病毒，造成病毒在猪体内的持续性感染(Pirzadeh and Dea，1998)，这给PRRSV的防治带来很大的困难，也对现行的免疫策略和疫苗研制手段提出了严峻的挑战。许多国家包括美国已将蓝耳病列为危害最大和控制最难的猪传染病。
RNA干涉(RNAi)是指双链RNA特异性诱导同源靶基因表达沉默的现象，它具有高度特异性，能快速引发转录后基因沉默。RNA干涉是由21～23个核苷酸组成的双链RNA引发的，小干涉RNA(siRNA)可以在体外化学合成，也可通过表达载体转录而成，它参与降解同源靶基因、抵御病毒入侵、抑制转座子等，将是基因功能研究、病毒防治、疾病治疗和品种改良等的有力工具。
研究证实，RNAi能够抑制病毒基因的复制、阻止病毒粒子的装配及影响病毒与宿主之间的相互作用，RNAi用于抗病毒研究的唯一前提是已知病毒基因组序列，且siRNA能快速、高效、特异地降解同源mRNA而不产生任何副作用，从而成为抗病毒感染的有效手段。并在抗病毒研究方面已经取得了显著成效。
口蹄疫病毒(FMDV)是感染偶蹄动物的危险病毒。Kahana等针对所有FMDV的3个保守区设计了3个特殊的siRNA，细胞结果显示与对照相比，几乎显示了100％的生长抑制作用。Liu等针对FMDV基因组的保守区域5‘NCR，VP4，Vpg，POL，3’NCR设计了siRNA，转染后12h使BHK221细胞系FMDV的效价下降10倍，1000倍，且这种抑制作用可持续至转然后第6d。针对FMDV基因组的保守区设计的siRNA能抑制FMDV病毒的复制，是治疗高基因变化的FMDV病毒的新策略。
禽流感病毒H5N1已经在人类和禽类中引起了广泛的呼吸系统疾病，但目前的疫苗免疫和药物治疗都存在局限。Zhou等针对流感病毒基因组的保守区域设计了特异的siRNA(pBabe-NP、pBabe-PA、pBabe-PB1)，受孕鸡卵和BALB/c小鼠中显示了明显抑制流感病毒的复制增殖。其中pBabe-NP抑制禽流感病毒增殖的特异性最好。RNAi技术提供了预防和治疗禽流感病毒在人类和禽类中传染的方法。
近年来，由虹彩病毒引起的爬行动物、两栖动物和鱼类疾病已在美洲、欧洲、亚洲和澳洲等地普遍流行，真鲷虹彩病毒(RSIV)能引起海洋鱼类产生疾病。Dang等构建了靶向RSIV中编码病毒衣壳蛋白基因(MCP)的siRNA，在转染感染了病毒的细胞后的84h和94h后，对病毒MCP基因表达的抑制达到55.2％和97.1％。同时，病毒的增殖也被抑制了，表明针对MCP基因的siRNA干扰作用能特异和有效阻止RSIV的复制，是一种潜在的控制病毒感染引起的疾病的方法。显示了RNAi作为一种基因治疗的手段也可用于水生生物的病毒防治。
传染性法氏囊病(IBD)在鸡群中能引起严重的免疫抑制和高致死率，进而给家禽业带来巨大的经济损失。为研究RNAi是否能有效抑制传染性法氏囊病毒(IBDV)的复制，Gao等针对IBDV保守区域的VP1基因设计了3个短干扰siRNA(siVP1618，siVP11115，和siVP12571)，然后转染感染了IBDV的VERO细胞系，结果显示，siVP12571是最有效的控制IBDV复制的位点，并以该位点设计shRNA，并用鼠U6作为启动子构建了shRNA表达载体pEC2571-shRNA，转染感染了IBDV的VERP细胞，结果显示，该载体对IBDV复制的抑制率达到87.4％，该结果表明DNA载体介导的RNAi能有效抑制IBDV的复制。
猪瘟病是一种高度传染性疾病，已经在全世界范围引起了严重的经济损失。Xu等构建了靶向猪瘟病毒(CSFV)Npro和NS5B基因的不同区域的siRNA。结果显示，转染了siRNA的细胞能使病毒基因组的复制减少4-12倍，设计的3个特异的siRNA抑制病毒增殖持续72h-84h之久。
从当前的研究结果发现，RNAi针对不同基因序列都有效，而且特异性强、效率高，操作方便。RNA干涉的出现为病毒防治提供了一种新的思路。RNAi在抵抗动物病毒，提高动物抗病能力和畜牧业经济效益方面具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备抗蓝耳病转基因猪的方法。
为实现上述目的，本发明首先提供一种转基因细胞，其含有编码以蓝耳病病毒ORF1b、ORF5、ORF6或ORF7为干扰靶基因的shRNA的DNA。优选所述干扰靶基因为SEQ ID No.1、2、3和/或4所示的序列。更优选，所述编码shRNA的DNA序列如序列表SEQ ID No.6&7、SEQ ID No.8&9、SEQ ID No.10&11或SEQ ID No.12&13所示。
通过上述编码shRNA的DNA序列克隆到带有重组酶识别序列的重组载体中，转化宿主细胞，获得转基因细胞。在本发明实施例中，将上述编码shRNA的DNA接入到pPNTIII载体中。
上述细胞为哺乳动物体细胞，例如胎儿成纤维细胞。对于制备抗蓝耳病转基因猪而言，优选选择猪胎儿成纤维细胞。
进一步本发明提供一种制备克隆胚胎的方法，其以上述转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
进而，通过将上述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得抗蓝耳病转基因家畜。
本发明还提供一种优选地对蓝耳病病毒具有显著抑制作用的shRNA，编码该shRNA的DNA序列如序列表SEQ ID No.6&7、SEQ ID No.8&9、SEQ IDNo.10&11或SEQ ID No.12&13所示。将所述DNA序列克隆到表达载体可以获得编码shRNA的重组载体，进而制备得到转基因细胞。结果表明这些细胞具有显著的抗蓝耳病病毒能力。
本发明通过筛选小干扰RNA，获得了对蓝耳病病毒具有显著抑制活性的shRNA；通过将编码所述shRNA的DNA导入表达载体，进而转化宿主细胞，获得了转基因细胞；以所述转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎；将该克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。本发明方法制得的转基因猪具有显著的抗蓝耳病能力。
附图说明
图1为psiCHECKTM-2载体的质粒图谱；
图2为ORF1B、5，6和7连接入pMD19-T Simple载体的PCR鉴定结果，其中，M为DNA分子量标准，泳道1为接入ORF1B的重组载体，泳道2、3为接入ORF5的重组载体，4、5为接入ORF6的重组载体，6、7为接入ORF7的重组载体；
图3为ORF1B、5，6和7连接入pMD19-T Simple载体的酶切鉴定结果；
图4显示的是荧光标记的siRNA转染MARC-145细胞；
图5显示的是siRNA干扰靶点对目标基因表达的抑制率；
图6为pGenesil-1载体的质粒图谱；
图7为将表2-1中的DNA克隆入pGenesil-1载体的酶切鉴定结果，M为DNA分子量标准，1～4分别是ORF1B-135、ORF1B-372、ORF 6-135和ORF 6-169；
图8为pGenesil-1+2+3+4载体图谱；
图9为图8载体双酶切(BamHI+MluI)鉴定结果；
图10为pPNTIII载体图谱；
图11为接入hU6+1B-372/6-135的pPNTIII的双酶切鉴定结果；
图12显示的是攻毒后72h细胞病变效应；
图13每组接种病毒稀释液情况；
图14显示的是shRNA在MARC-145细胞中干扰病毒生产情况；
图15显示的是24-96h四个时间段的病毒基因的拷贝数；
图16显示的是72h病毒基因的拷贝数；
图17显示的是pPNTIII 1b-372和pPNTIII6-135转染细胞后24h的PKR和OAS-1的RT-PCR结果，其中OAS-1泳道组从左到右分别为转染浓度为50nM、100nM、150nM的pPNTIII 1b-372和50nM、100nM、150nM的pPNTIII6-135的OAS-1基因的RT-PCR结果，PKR泳道组从左到右分别为转染浓度为50nM、100nM、150nM的pPNTIII 1b-372和50nM、100nM、150nM的pPNTIII6-135的PKR基因的RT-PCR结果，β-actin泳道组从左到右分别为转染浓度为50nM、100nM、150nM的pPNTIII 1b-372和50nM、100nM、150nM的持家基因β-actin的RT-PCR结果；
图18显示的是M蛋白western blot的结果；
图19是pPNTIII-shRNA1B-372和pPNTIII-shRNA6-135，经AatII酶切图；泳道从左到右分别pPNTIII-shRNA1B-372酶切后、酶切前的电泳结果，以及pPNTIII-shRNA6-135酶切后、酶切前的电泳结果；
图20为整合pPNTIII-shRNA1B-372和pPNTIII-shRNA6-135阳性细胞克隆的二次PCR鉴定结果，各泳道为不同细胞克隆点的鉴定情况；
图21为整合pPNTIII-4shRNA联合质粒的阳性细胞克隆的PCR鉴定结果，各泳道为不同细胞克隆点的鉴定情况；
图22为转基因克隆猪；
图23转基因克隆猪PCR扩增结果，从左到右1-7泳道分别是1-7头克隆猪个体的PCR鉴定情况。；
图24为来自转基因猪个体的成纤维细胞攻毒后72h细胞病变效应，其中1号为转基因阴性猪，3-7号为转基因阳性猪；
图25为12-120h九个时间段的病毒基因1b的表达水平，其中1号为转基因阴性猪，3-7号为转基因阳性猪；
图26为1b蛋白western blot的结果，其中1号为转基因阴性猪，3-7号为转基因阳性猪。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂均可从商业途径获得。
材料：
MARC-145细胞购于北京信得威特科技有限公司技术中心；
双荧光素酶报告基因表达载体psiCHECKTM-2购于Promega公司(货号C8021)；
Dual-Luciferase Reporter Assay System购于Promega公司(货号E1910)；
DharmaFECT Duo转染试剂购于Thermo公司(货号T-2010-01)；
pMDTM 19-T Simple Vector购自Takara公司(D104)；
shRNA表达载体pGenesile-1载体购于武汉晶赛生物工程技术有限公司；
引物合成和序列测定由上海生工完成；
T4DNA连接酶为Biolabs公司产品；Taq酶和核酸内切酶为Takara公司产品
质粒纯化及回收试剂盒为Omega公司产品；
酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。
实施例1、RNAi载体的构建
1.siRNA干扰靶点的筛选
1.1RNA干扰靶基因的选择
近五年来，在我国流行的蓝耳病病毒85％以上均属于JXwn毒株型，该毒株属于高致病性毒株。本发明选择该病毒的主要结构蛋白基因(ORF5，6，7)及RNA聚合酶基因(ORF1b)为干扰靶基因。
1.2siRNA序列的设计与合成
虽然以JXwn毒株型为目标，但为实现所选干扰靶点利用的最大化，避免因不同毒株间的序列差异而限制RNAi效应，因此，siRNA的靶序列尽量选择在不同毒株间较为保守的区域。选择标准以不同毒株间完全一致的序列为最佳，如果达不到该要求，至少满足在不同毒株中21个核苷酸只有至多1个的错配，所设计的siRNA与已知的任何宿主基因都没有同源性。
利用Invitrogen公司在线软件针对每个目标基因设计5条siRNA干扰序列，共20条(如表1-1所示)，合成由上海吉玛制药技术有限公司完成。
表1-1siRNA序列
Figure BSA00000376142900061
Figure BSA00000376142900071
1.3psiCHECK-2-1B，-5，-6，-7载体的构建
psiCHECKTM-2载体为起始优化RNAi提供定量而快速的工具。该载体可以监控与报告基因(海肾萤光素酶)融合的靶基因的表达变化。所研究的基因要克隆在多克隆位点上。针对所研究基因合成的siRNA起始的RNAi过程将导致融合mRNA的切断及其降解。通过测量海肾萤光素酶活性的降低来监控RNAi的效果，该载体的图谱如图1所示。
选择psiCHECKTM-2载体上的XhoI和NotI酶切位点，完成载体双酶切备用。
克隆目标基因1B，5，6和7的引物设计如表1-2所示(这四个基因的PCR引物均设计有XhoI和NotI酶切位点，表中斜体字母)，先将1B，5，6和7连接入pMD19-T Simple载体，经PCR和酶切鉴定(图2和3所示)，片段大小均与目标基因符合，测序。
测序鉴定正确的阳性质粒，经XhoI和NotI酶切，酶切产物亚克隆入经XhoI和NotI酶切的psiCHECK-2载体，最后获得含有目标基因的四种质粒：psiCHECK-2-1b，psiCHECK-2-5，psiCHECK-2-6和psiCHECK-2-7。
表1-2引物序列
1.4 siRNA和psiCHECK-2质粒共转染MARC-145细胞。
siRNA与对应的基因的质粒共转染MARC-145细胞，采用96孔板进行转染实验，转染试剂为DharmaFECT Duo Transfection Reagent，0.3ul转染试剂/well；100ng plasmid/well；100nM siRNA/well。实验设定空白对照(只转质粒)，阴性对照(随机siRNA+质粒)，转染细胞如图4所示。
1.5各干扰靶点对载体表达基因抑制效果的检测
转染48h后，通过萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶-双荧光素酶报告系统，检测各干扰靶点对目标基因的抑制效果，经过标准化变换之后，计算每个siRNA的干扰效率，结果如图5所示，干扰效率在60％以下的未显示。
本实验设计三个重复组，每组包含三个样品孔重复，共计9个样品重复，结果显示组内组间重复性非常好(放弃1/69*3孔)，实验的标准差很小，所得到的结果真实可靠，可以反映siRNA对靶点序列抑制的真实情况(表1-3所示)。
表1-3 siRNA的干扰效率
Figure BSA00000376142900081
上述实验结果表明，10条siRNA对目标基因的干扰效率在60％以上，并且囊括基因1B和基因6的全部靶点。
最后选择抑制效率较好的四个靶点1B-135(89％)，1B-372(89％)，6-135(98％)，6-169(96％)，进行shRNA表达载体的构建。
2.shRNA表达载体的构建
2.1single shRNA表达载体pGenesil-1的构建
单个shRNA载体的构建以pGenesil-1载体为骨架(如图6所示)，首先将该载体进行BamH1和HindIII双酶切处理。
合成4对编码短发夹RNA(shRNA)的DNA单链序列(如表2-1所示)，退火成dsDNA，克隆入经BamH1和HindIII双酶切后的pGenesil-1载体，酶切鉴定如图7所示。
表2-1编码shRNA的DNA单链序列
Figure BSA00000376142900082
Figure BSA00000376142900091
2.2multiple shRNA表达载体的构建
multiple shRNA表达载体以1B-135，1B-372，6-135，6-169为干扰靶点，以hU6，mU6，h7SK，hH1为启动子，该载体如图8所示，酶切鉴定如图9所示(1，2，3：Loxp+ORF1B-135+ORF1B-372+ORF6-135+ORF6-169BamHI+MluI)。
首先分别构建一个载体编码一条shRNA质粒产品，测序，挑选测序正确的产品，亚克隆构建一个载体编码多条shRNA质粒产品，一条载体编码多条shRNA质粒的构建由武汉晶赛生物工程技术有限公司完成。
2.3.pPNTIII载体的构建
选择含有loxp位点的载体pPNTIII(图10)，将测序正确的pGenesil-1质粒进行EcoR1和HindIII双酶切，将切下的目标片段(启动子hU6+1B-372/6-135)插入到pPNTIII载体的EcoR1和HindIII双酶切位点，酶切鉴定如图11所示。类似的方法分别获得质粒pPNTIII-shRNA-1b-135、pPNTIII-shRNA-1b-372、pPNTIII-shRNA-6-135、pPNTIII-shRNA-6-169及pPNT III-4shRNA。
3shRNA对病毒基因抑制效果研究
3.1.细胞病变效应(CPE)
为了研究shRNA对细胞病变效应(CPE，cytopathic effect)的影响，将质粒pPNTIII-shRNA-1b-135、pPNTIII-shRNA-1b-372、pPNTIII-shRNA-6-135、pPNTIII-shRNA-6-169及pPNTIII-4shRNA转染MARC-145细胞，每孔转染4.0ug(6孔板)，每个质粒三个重复，质粒pPNTIII-shRNA empty(无shRNA插入)和pPNTIII-shRNA scrambled(表达非特异shRNA)为阴性对照，并做相同处理，转染试剂为LipofectamineTM 2000。转染5小时后，细胞感染JXWN毒株第5代，该毒株的TCID50为104.5，每孔接种PRRSV 0.35MOI(6孔板)，每天显微镜下观察细胞形态，攻毒后72h，病毒感染细胞以及转染阴性对照细胞开始出现明显的拉网状和细胞脱落的病变，而转染shRNA表达质粒的细胞未见明显病变效应，如图12所示。
3.2.病毒滴度(Tissue culture infectious dose，TCID50)检测
感染前24h在96孔培养板接种MARC-145细胞(104细胞/孔)，收集3.1实验中病毒感染72h的细胞培养液，并进行倍比稀释(10-1-10-10)，接种到96孔板(100ul/孔)，每个稀释度接种8个孔。平行设定只接种病毒未转染shRNA以及转染阴性shRNA的对照组，共五组(1B-135+V，1B-372+V，6-135+V，6-169+V，4shRNA+V)，每组接种情况如图13所示。观察细胞病变，连续监测7天，TCID50计算方法参考Reed-Munch法。
结果表明：4shRNA(TCID50为101.5)、1B-372(TCID50为101.7)、1B-135(TCID50为102.3)、6-135(TCID50为104.14)及6-169(TCID50为104.27)转染组中病毒滴度比病毒对照组(TCID50为104.5)分别降低了1000倍、600倍、150倍、2.3倍及1.7倍。该结果证实了的shRNAs能有效抑制MARC-145细胞中病毒复制，如图14所示。
3.3.反转录及Real-time PCR分析
为了检测shRNAs能否在MARC-145细胞中有效抑制病毒基因mRNA表达，pPNTIII 1b-135、pPNTIII 1b-372、pPNTIII6-135、pPNTIII6-169、pPNTIII scrambled、pPNTIII empty质粒分别转染6孔板细胞，转染后4h进行PRRSV攻毒实验，非转染细胞施行同样的病毒感染处理。
感染后24-96h，提取各时间段细胞总RNA，操作过程参照Rneasy Micro Kit(Qiagen，USA)，少量的污染的DNA通过RNase-Free DNase Set(Qiagen，USA)除去，根据Promega反转录程序，总体系25ul，42℃反应1h，上海生工合成Taq-Man探针和引物(如表3-1所示)。
表3-1引物和探针序列
Figure BSA00000376142900111
bPRRSV 1b，5，6，7的引物和探针序列
c持家基因β-actin的引物和探针序列序列，F，R和P分别代表正向引物，反向引物和探针GCGGCCGG，NotI酶切位点；CTCGAG，XhoI酶切位点；cc和tt，保护性碱基FAM和TAMRA，荧光标记物
荧光定量PCR在ABI Prism7900HT检测系统(Applied Biosystems，USA)运行，使用TaqMan universal PCR master混合物(Takara，Japan)，反应条件为50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。
Real-time PCR结果表明：随时间的增加，未转染shRNA的攻毒组的病毒1b和6基因的表达量增加，而转染shRNA1b-135和1b-372的攻毒组在攻毒后24h就产生了抑制效果，在攻毒后72h，与对照组相比，1b-135，1b-372，6-135，6-169使病毒表达量分别减少了99.4％，99.5％，82％，54％。图15为24，48，72，96h四个时间段的病毒基因的表达情况。
另外，1B-135和1B-372两个靶点在减少1B基因表达的同时，也明显减少了5，6和7基因的表达，如图16所示。
3.4.RNAi特异性检测
双链RNA能被细胞识别并诱发细胞中干扰素的释放，后者能被临近细胞作为一种信号，进而启动病毒防御措施，依赖RNA的蛋白激酶(PKR)及2’-5’寡腺甘酸合成酶(OAS-1)也能通过结合双链而被激活，进而导致mRNA降解以致翻译抑制。研究认为PKR和OAS-1的激活需要至少30nt长的序列。
dsRNA(21-23nt)引发RNAi并能避免PKR和OAS-1的激活，为排除干扰素系统的抗病毒活性，本实验以检测PKR和OAS-1的表达水平为目标，以293-FT为宿主细胞，mRNA为转染pPNTIII 1b-372和pPNTIII6-135(3个浓度分别为50nM，100nM，150nM)24h后的细胞裂解物，图17为RT-PCR检测结果，随shRNA浓度浓度的增加，PKR和OAS-1的转录本水平未明显增加
随后，进行了PKR和OAS-1转录本的实时荧光定量PCR检测，表3-2为Taqman探针序列，real-time PCR结果显示最高浓度的shRNA(150nM)确实增加了这两个转录本的表达，然而，与对照相比，无统计学意义。该结果证实了PRRSV基因表达减少是RNAi引起的，并非干扰素相关的防御机制的作用。
表3-2Taqman探针序列
3.5病毒蛋白翻译的抑制
为了研究shRNA表达载体对病毒蛋白翻译的抑制效果，对pPNTIII-shRNA质粒转染后72h的细胞提取总蛋白，然后执行M蛋白的western blot分析，病毒感染细胞，阴性对照(包括pPNTIII negative和pPNTIII empty)细胞组均呈现大小为18-19kDa的M蛋白带，对比之下，转染shRNA表达质粒(pPNTIII1b-135，pPNTIII1b-372，pPNTIII6-135，pPNTIII6-169，pPNTIII4-shRNA)的细胞组没有目标带出现，如图18所示。
4.体细胞核移植生产抗PRRSV转基因猪
4.1.RNAi载体pPNTIII的单酶切、线性化
两个高效的干涉靶点质粒，包括pPNTIII-shRNA1B-372和pPNTIII-shRNA6-135，经AatII酶切(37℃酶切3h)，线性化，回收，目的是线性目标片段整合到基因组，图19为两质粒单酶切图。
4.2.转RNAi载体阳性细胞的筛选与鉴定
将线性化的pPNTIII-shRNA1B-372、pPNTIII-shRNA6-135及pPNTIII-4shRNA转染大白猪的胎儿成纤维细胞系NDB1和PCB1(NDB1F0，新美系大白♂；PCB1F0，新美系长白♀)，进行大约8d左右的G418筛选，消化单克隆点，对转基因阳性的细胞克隆点进行目的基因整合的PCR检测，扩增引物及PCR鉴定结果如下：
整合pPNTIII-shRNA1B-372和pPNTIII-shRNA6-135的阳性细胞鉴定引物为Positive Sense primer：CTGTTCCACATACACTTCATT CT；Positive Antisenseprimer：CACAGATGCGTAAGGAGAAA，扩增长度为739bp。扩增结果显示第一批转染共获得了9个转基因阳性克隆点(6-135：1，2，3，6，20，23，46；1B-372：7，35)，将第一次PCR结果阳性的细胞克隆点进行二次PCR鉴定，如图20所示。
整合pPNTIII-4shRNA联合质粒的阳性细胞鉴定引物为MS2-sense：5-CAGTTAGGGTGGGTTTCC-3；MS2-antisense：5-GAAGATGGCTGTGAGGGA-3，扩增长度为784bp，筛选的全部细胞克隆点均为阳性，如图21所示。
4.3.转基因猪制备
转基因猪制备方法可以采用显微注射法、体细胞克隆法、精子载体法等方法。本发明优选体细胞核移植法制备转基因猪，但不限于体细胞核移植法。
以上述转基因阳性细胞为核移植供体细胞，以体外成熟的初情期前母猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞，经电融合与激活，构建成克隆胚胎，挑选形态优良的克隆胚胎用非手术法移入自然发情的经产母猪子宫内进行妊娠，非手术法胚胎移植步骤为用无巴比妥略作麻醉后，从受体母猪阴道向子宫颈管道插入外径10毫米的粗导管，然后将直径5毫米的细导管插入粗导管内侧，伸入到子宫体或一侧子宫角。将克隆胚胎连同2毫升保存液一起通过细导管移植进去，具体是用干冰产生出来的二氧化碳经过导管将胚胎吹入到子宫内1-3分钟。胚胎移植后30天B型超声波检测妊娠与否。
移植日期，移植胚胎数等见表4-1所示。
表4-1核移植情况
Figure BSA00000376142900131
4.4.克隆猪出生状况
2010年4月24、25日，共出生7头克隆猪，健康状况良好，克隆猪图片见22所示。
4.5转基因克隆猪阳性检测
保留克隆猪脐带组织，然后提取其基因组，根据表4-1的记录可知，转染的RNAi载体是1B-372，利用鉴定阳性细胞克隆的PCR引物(1B-372)对克隆猪进行PCR检测，目标片段大小为739bp，结果如图23所示。该结果证实目的基因整合到克隆猪的基因组中。目前共获得转基因阳性猪5头。
5.阳性转基因克隆猪的抗病能力检测
5.1.构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合症特异性shRNA转基因猪胎儿成纤维细胞系
对生产的转基因猪仔(1号，3-7号)，其中3-7号为转基因阳性猪(实验猪)，1号为转基因阴性猪(对照猪)，在不超过1日龄时分别取其耳组织，建立成纤维细胞系。
5.2.细胞感染实验
分别对1号，3-7号猪来源的胎儿成纤维细胞系，进行攻毒实验，感染毒株代次、TCID50、以及每孔接种量(6孔板，0.35MOI/孔)均与3.1中所述一致，镜下观察细胞形态，攻毒后72h，对照1号猪来源的成纤维细胞出现明显细胞毒症状(拉网状和细胞脱落)，而3-7号猪来源的胎儿成纤维细胞未见明显病变效应，如图24所示。
5.3.1b基因表达水平分析
对1号、3-7号猪来源的细胞，分别收取病毒感染后12-120h的细胞，提取各时间段细胞总RNA，引物探针以及操作过程见3.3所述。
Real-time PCR结果如图25所示：随时间增加，1号攻毒组细胞的病毒1b基因的表达量增加，而3-7号在攻毒后24h就产生了抑制效果，在攻毒后72h，与对照组1号相比，3-7号细胞的病毒1b基因表达分别减少了61.19％，66.21％，58.07％，54.80％，76.35％。
5.4 1b蛋白翻译水平检测
对1号、3-7号猪来源的细胞，病毒感染72h，提取细胞总蛋白，然后执行1b蛋白的western blot分析，1号猪(转基因阴性)呈现明显的1b蛋白带，对比之下，3-7号猪的细胞没有目标带出现，如图26所示。
Figure ISA00000376143100011
Figure ISA00000376143100021
Figure ISA00000376143100031
Figure ISA00000376143100041
Figure ISA00000376143100051

Claims (3)

1.一种转基因细胞，其为除胚胎细胞外的猪体细胞，含有编码以蓝耳病病毒ORF1b为干扰靶基因的shRNA的DNA，所述编码shRNA的DNA序列为：
ORF1B-135 Top：
GATCCGGACATGCTCAAGGTTCAAttcaagagaTTGAACCTTGAGCATGTCCTTTTTABottom：
AGCTTAAAAAGGACATGCTCAAGGTTCAAtctcttgaaTTGAACCTTGAGCATGTCCG。
2.一种制备克隆胚胎的方法，其以权利要求1所述的转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
3.一种编码shRNA的DNA，其核苷酸序列为：
ORF1B-135 Top：
GATCCGGACATGCTCAAGGTTCAAttcaagagaTTGAACCTTGAGCATGTCCTTTTTABottom：
AGCTTAAAAAGGACATGCTCAAGGTTCAAtctcttgaaTTGAACCTTGAGCATGTCCG。
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