CN101205539A - 高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒的构建方法，以及根据该重组质粒构建的遗传工程疫苗及构建方法。根据蓝耳病病毒基因相对保守区的序列设计多对引物，分段扩增蓝耳病病毒基因序列，并依次连接到合适的载体中，获得猪蓝耳病病毒重组质粒。所述疫苗为编码结构蛋白的序列和3’UTR基因被所述重组质粒的相应的编码结构蛋白的序列以及3’UTR基因所替代的弱毒疫苗株。使用本发明的重组质粒构建方法，可以构建具有和野生亲本毒相似的。同时，基于上述重组质粒，构建的疫苗株对猪体具有较好安全性，免疫后可有效诱导产生机体免疫，并提供猪体免疫保护作用，对“猪高致病性蓝耳病”的免疫保护率高达100％。

Description

高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒和遗传工程疫苗，更具体地说，涉及一种高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，又称蓝耳病，是一种由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病。PRRSV基因组为大小约15kb、不分节段的单股正链RNA。由于RNA病毒易于发生遗传及抗原突变，近年来在世界各地出现了致病力增强的PRRSV变异株，另外，因为PRRSV靶细胞为免疫系统重要成员之一的肺泡巨噬细胞，感染猪大多呈现免疫抑制而致继发感染和混合感染。

为了更深入的了解PRRSV的生物学特性和不断变化的现状，最有效的方法之一就是利用反向遗传操作系统对其基因组结构和生物学特性进行相应的研究，从而获取其结构与基因的直接证据。早在1998年Meulenberg就成功构建起欧洲株LV(Lelystad Virus)的重组质粒，而后世界各国的科学家也纷纷构建起不同病毒株的重组质粒，而且试验证据也在不断证明，拯救出来的病毒一般都具有与野毒株相类似的生物学特性，但是这些野毒株和构建的重组质粒大多属于经典PRRSV株，感染率和致死率均不高，不能有效区分强毒株与弱毒株对动物体致病力的差异。

2006年5月以来，中国爆发了高致病性PRRSV引发的所谓“猪高热综合征”，该病以传播迅猛、高致死率为特征，死亡率竟然高达80％-100％。尤其令人吃惊的是，高致病性PRRSV与典型株不同，表现于不仅仅感染仔猪死亡率可达100％，而且77日龄成年感染猪死亡率也高达57％。因此，很有必要构建出高致病性病毒重组质粒株，以便于对高致病性的PRRSV的生物学特性进行研究，同时，开发新型高效的蓝耳病疫苗也成为当务之急。

但是，由于PRRSV基因组很长，是大小约15kb、不分节段的单链正股RNA，编码至少9个开放阅读框(ORF)，而且这些阅读框两两之间具有重叠区域，因此阅读框中的一个碱基的变化就有可能会影响整个基因组的结构从而导致整个全长质粒不具备感染性；此外，因为RNA病毒自身的特点，其基因组并不稳定，因此，利用传统的方法，很难从cDNA直接获得全长重组质粒，从而成为开发新型高效的蓝耳病疫苗的工作的瓶颈。

PRRSV结构蛋白构成外观圆形有囊膜的病毒颗粒，其中，ORF5、ORF6和ORF7所编码的产物为病毒蛋白必需蛋白，而其他糖蛋白GP2、GP3、GP4等在病毒颗粒组装乃至激发机体内免疫过程中的作用还存在争议。GP5被认为是病毒的细胞结合蛋白，同时也是刺激机体产生中和抗体的主要蛋白，核衣壳蛋白N是免疫原性最强的蛋白，因此，针对这些在病毒感染过程中与激发机体免疫极其相关的这些蛋白，开发猪繁殖与呼吸综合征疫苗成为可能。另一方面，不同病毒株间遗传及抗原差异很大，如何提高疫苗毒株的交叉保护性以及研制针对目前优势流行株的高效疫苗是亟待解决的问题。

利用反向遗传操作技术可以构建不同毒株间的嵌合病毒，使其具备多种病毒的免疫学特性；另外，这种嵌合疫苗是在基因水平上按照理想设计改造病原体，即将两种或多种相似的病原体的基因组或片段用基因工程的方法以不同形式连接或置换，从而可以得到减毒活疫苗。因此，利用嵌合疫苗开发新型高效的猪繁殖与呼吸综合征疫苗具有可行性。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒的构建方法。

本发明还有一个目的在于，提供一种高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗。

本发明还有一个目的在于，提供一种高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗的构建方法。

本发明的从病毒cDNA获得高致病性蓝耳病病毒的重组质粒的方法，为根据蓝耳病病毒相对保守区的序列设计多对引物对，利用高致病性猪蓝耳病病毒cDNA为模板，分段扩增蓝耳病病毒基因序列，然后将扩增出的序列依次连接到合适的载体，从而获得了一种高致病性蓝耳病病毒重组质粒。

本发明的高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗，是编码结构蛋白的序列和3’UTR基因被所述重组质粒的相应的编码结构蛋白的序列以及3’UTR基因所替代的弱毒疫苗株。

本发明的高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗的构建方法包括以下步骤：首先扩增出重组质粒的结构蛋白基因；然后将扩增出的结构蛋白基因和弱毒疫苗株进行酶切，最后将酶切后的结构蛋白基因和弱毒疫苗株进行连接，并转化TOP10，然后通过筛选获得遗传工程活疫苗，从而提供了相应的构建方法。

使用本发明的重组质粒构建方法，可以将基于发病猪场获得的血清中分离出来的病毒构建成全长感染性cDNA质粒pJX143，该病毒及其拯救出来的病毒具有和野生亲本毒相似的生物学特性和动物宿主的感染力和致死率。而且后续的试验证实，该重组质粒确实是引起这次“猪无名高热”的主要致病病原。同时，基于上述重组质粒，构建的一株疫苗株pSX12对猪体具有较好安全性，免疫后可有效诱导产生机体免疫，并提供猪体免疫保护作用，对“猪高致病性蓝耳病”的免疫保护率高达100％，安全有效。

附图说明

图1是不同PRRS-F/PRRS-R引物对扩增PRRSV全基因组序列PCR产物电泳检测结果，其中，泳道1为由引物SF1392和SR6589获得的长度约为5kb的PCR片段，泳道2为由引物SF4344和SR9033获得的长度约为5kb的PCR片段，泳道3为由引物SF7682和SR13334获得的长度约为5.5kb的PCR片段，泳道4为引物STL和SR2573获得的长度约为2.5kb的PCR片段，泳道5为由引物SF11422和Qst获得的长度约为2.5kb的PCR片段。

图2是PRRSV基因组全长cDNA质粒构建策略示意图。

图3是全基因组质粒构建示意图。

图4是用重组质粒转染细胞后出现的细胞病变结果。

图5是拯救病毒的N蛋白免疫荧光照片，其中，A是被拯救病毒vJX143的N蛋白免疫荧光照片；B是被拯救病毒vJX143-M的N蛋白免疫荧光照片；C为阴性对照。

图6是对照弱毒株、拯救病毒株与野毒株病毒滴度比较结果。

图7是拯救病毒株、野毒株和阴性对照对猪的体温影响的结果。

图8是嵌合质粒构建示意图。

图9是嵌合病毒构建过程中结构蛋白扩增的电泳结果。

图10是SmaI酶切嵌合质粒pSX12、p5NX12和p56N12的电泳结果，其中，泳道1是SmaI酶切的pSX12，泳道2是SmaI酶切的p5NX12，泳道3是SmaI酶切的p56N12，泳道4是SmaI酶切的阳性对照pAPRRS。

图11是试验及对照组猪在PRRSV SX12株病毒接种及PRRSV JX143株病毒攻毒后每天体温变化。

图12是在vSX12株病毒接种后第0，3，5，7，10，14，21，28天抗体变化图。

具体实施方式

在本发明中，所述猪蓝耳病病毒或猪繁殖与呼吸综合征病毒株指的是，猪繁殖与呼吸综合征病毒vJX143株。

在本发明中，所述重组质粒指的是，利用反向遗传操作技术，由上述野毒株获得的cDNA质粒pJX143。

在本发明中，所述嵌合病毒指的是，利用基因嵌合技术获得的全长重组质粒pSX12、p5NX12和p56N12。

在本发明中，所述的反向遗传操作指的是：相对于经典遗传学而言的，是在获得高致病性蓝耳病基因组全部序列(JX143)的基础上，通过对病毒基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建全长病毒基因组，让其装配出具有生物活性的病毒粒子，研究高致病性蓝耳病基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对病毒的表型、性状有何种影响等方面的内容。

在本发明中，所述北美株和欧洲株代表株指的分别是，北美株经典毒株VR2332(Genbank accession#DQ217415)和欧洲株经典毒株LV(Genbankaccession#M96262)。

在本发明中，所述弱病毒株pAPRRS指的是，参考文献孙志，王金勇，张建武，秦爱健，袁世山，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒3’UTR的反向遗传操作.微生物学报[J]，2007，47(5)：774-778.的方法，利用系列传代获得的一株弱毒株的感染性克隆。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：Marc-145细胞(美国细胞保藏中心ATCC，保存号为：CRL-2378.1)；高致病性的PRRSV病毒vJX143株(中国普通微生物保藏管理中心保存号为：CGMCC No.1964)，利用其感染正常猪仔7～10天后取血清待用。

在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueScript II SK(+)载体购自Invitrogen公司，pBS-T载体、TOP10感受态细胞购自TIANGENE公司。

在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司，DNA胶回收试剂盒和Quant Reverse Transcriptase购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购自Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。

在本发明的实施例中，Marc-145单层细胞采用以下方法制备：

Marc-145细胞在含有6％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍后加入维持液(2％FBS的DMEM)培养基，37℃5％CO₂培养箱中培养。

在本发明的实施例中，细胞回归试验过程如下：利用试验猪体内各组织脏器的病料研磨匀浆上清感染单层Marc-145细胞，然后进行传代，以观察是否可以出现细胞病变，如出现，则证明猪体内各组织脏器中含有具有生物活性的病毒粒子。

实施例1、高致病性蓝耳病病毒重组质粒的构建

根据GenBank登录号为EF488048的高致病性蓝耳病病毒基因JX143的碱基序列，设计出5对引物，分别作为PCR扩增的引物；然后将从使用PRRSV病毒vJX143株感染的猪仔的血清中提取高致病性病毒RNA，反转录合成为野毒株cDNA，以其作为PCR的模板，进行PCR扩增，获得野毒株cDNA的5条特异性片段1-5，并将第5条特异性片段进行突变，获得特异性片段5’；然后将特异性片段1-5或特异性片段1-4+5’依次插入到pBlueScriptII SK(+)载体中，构建获得重组质粒pJX143和pJX143-M，过程如图3所示，然后分别通过细胞实验和动物体实验，验证了获得的重组质粒具有高致病性，具体过程如下：

1.1、引物设计

根据GenBank登录号为EF488048的JX143碱基序列，设计在PRRSV基因组中的相对保守区引物，分别命名为：STL，SF1392，SR2573，SF4344，SR6589，SF7682，SR9033，SF11422，SR13334和Qst，其中，STL和SR2573，SF1392和SR6589，SF4344和SR9033，SF7682和SR13334，SF11422和Qst分别构成相应的引物对，其序列分别如下所示：

STL：5’-ACATGCATGCTAATACGACTCACTATAGGTATGACGTATAGGTGTTGGC-3’

SF1392：5’-GCCGCGCTTTGCCCGTTCGT-3’

SR2573：5’-CTGCCCAGGCCATCATGTCCGAAGTC-3’

SF4344：5’-GCCCCGTCGGTCTCAGTCTTGCCATTTTT-3’

SR6589：5’-ACCGAGGCTGTAAAAGGCAAGTGACC-3’

SF7682：5’-CTTTCCGTTGAGCAGGCCCTTGGTATGA-3’

SR9033：5’-GGCGGCAAACCAGCGGACAA-3’

SF11422：5’-TTTATAAGGCCACTGCCACC-3’

SR13334：5’-TTGCCGCCGTCGACTTGATGCTGGTAAT-3’

Qst：5’-GAGTGACGAGGACTCGAGCGCATGCTTTTTTTTTTTTTT-3’

1.2、高致病性病毒重组质粒的构建

1.2.1、血清样品中病毒RNA的提取

使用vJX143株感染仔猪，然后取发病猪的血清样品140μl，参照QIAamp Viral RNAMini Kit中病毒细胞培养上清的方法，提取病毒的RNA。

1.2.2、高致病性病毒cDNA的合成

取上述获得的病毒RNA 12.5μl，加入dNTP(2.5mM)4μl，10×Buffer 2μl，Qst反转录引物(10mM)0.5μl，Quant Reverse Transcriptase(购自Invitrogen公司)1μl，混合均匀后置37℃水浴1小时，获得高致病性病毒cDNA。

1.2.3、高致病性病毒cDNA片段的PCR扩增

以上述合成的cDNA为模板，每次以一对实施例1.1中相应的上下游引物对作为引物，分别进行PCR扩增，其反应体系如下：

cDNA模板1μl，上下游引物对(10μM)各1μl，10×Buffer 2μl，2.5mM dNTP2μl，rTaq DNA聚合酶5 units，加水至20μl。

PCR反应完成后，将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，根据图1的结果，分别获得了大小为2.5Kb、2.5Kb、5.1Kb、5.3Kb、5.2Kb的目的条带。

然后参照说明书，使用胶回收试剂盒回收目的片段，获得5条特异性片段，然后对上述5条特异性片段测序，其序列分别如SEQ ID NO：1-5所示。

1.2.4、特异性片断的克隆

将上步获得的各特异性片断，参照pBS-T Mini Kit(TIANGEN公司)中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，通过蓝白斑筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得重组质粒，分另命名为pBS-IN1、pBS-IN2、pBS-IN3、pBS-IN4、pBS-IN5。

获得的5个重组质粒经测序验证，克隆进去的5条特异性片段正确。

1.2.5、病毒全长cDNA重组质粒的构建

利用生物医学软件DNASTAR(http://enfull.com/china/Profession/{E37D28C4-9991-4AA1-B76A-016A046CD62D}.htm)，对pBS-IN1、pBS-IN2、pBS-IN3、pBS-IN4、pBS-IN5中目的片段的重叠区域进行分析后，选取合适的酶切位点(分别为SphI、MfeI、AflII、AgeI、AscI和NotI)进行酶切，如图2所示，使用SphI和MfeI双酶切pBS-IN1，MfeI和AflII双酶切pBS-IN2，AflII和AgeI双酶切pBS-IN3，AgeI和AscI双酶切pBS-IN4，AscI和NotI双酶切pBS-IN5，然后将上述酶切后的片段按照pBS-IN1～pBS-IN5的顺序依次插入到经相同酶切的pBlueScriptIISK(+)载体中，构建成为全长重组质粒。

获得的全长重组质粒用BamH I鉴定，出现了预期大小的片断，然后将该片段测序，结果显示序列如SEQ ID NO：6所示，表明重组质粒构建成功。

同时，还将pBS-IN5上的特异性片段(即SEQ ID NO：5)上对应全长的第14680位的碱基A突变为G，获得pBS-IN5-M片段，然后采用上述相同的方法，将pBS-IN5-M替代pBS-IN5片段插入到pBlueScript II SK(+)载体中，构建了重组质粒pBLJX-5-M。

1.3、病毒RNA的制备

1.3.1、质粒的Not I线性化

于37℃，用Not I分别对质粒pBLJX-5和pBLJX-5-M进行线性化酶切(反应体系为：突变质粒30μL，Not I 2μL，ddH₂O 13μL，10xNEB Buffer2 5μL)，酶切过夜。参考说明书的方法，用QIAquick PCR Purification Kit纯化酶切产物，分别获得纯化的线性化质粒。

1.3.2、体外转录

参考说明书的方法，使用T7 mMESSAGE High Yield Capped RNA Transcription Kit(购自Ambion公司)体外转录纯化后的线性化质粒，并采用RNA电泳鉴定，根据鉴定结果，获得了vJX143和vJX143-M RNA。

1.4、高致病性蓝耳病病毒重组质粒的检测

1.4.1、RNA的转染

接种Marc-145细胞(罗猴肾细胞系，购自美国ATCC)于六孔板中培养，待细胞密度为80-90％时，向每孔中分别加入2μl vJX143和vJX143-M RNA和2μl DMRIE-C转染试剂，在1ml的Opti-MEM中振荡混匀，然后根据转染试剂说明书的方法，转染Marc-145细胞，并且逐日观察细胞病变。

待出现如图4所示的细胞病变(CPE)后，收取上清并传代，上清收取及传代过程具体如下：

Marc-145细胞在含有6％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，吸取转染过后五天的上清液，将其与维持液(含2％FBS的DMEM)按照1∶10的比例接种上清液200μl，置37℃继续培养并采用上述方法继续传代，并收取第五代的病毒上清，然后按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒中的操作方法提取上清病毒RNA，获得病毒vJX143和vJX143-M。

根据上述结果，获得的重组质粒pJX143和pJX143-M具有感染性，能够从单一的基因组序列成功转变为具有活性的病毒粒子并具有相应的病毒感染性。

1.4.2、间接免疫荧光检测

按照实施例1.4.1中的RNA转染步骤，分别以纯化后1000倍稀释的病毒vJX143和vJX143-M，感染单层Marc-145细胞，然后于感染36h后弃去培养基，用冰甲醇固定10min，1％BSA室温封闭30min，PRRSV核衣壳蛋白的特异性单抗(1∶800稀释)室温孵育2h，再加入FITC标记的羊抗鼠的二抗室温孵育1h，PBS洗五遍后，在荧光显微镜下观察，结果如图5所示。

根据图5的结果：pJX143和pJX143-M于转染后第5天出现了明显的CPE，以无限稀释法传代纯化嵌合病毒vJX143和vJX143-M，并且以间接免疫荧光分别检测感染嵌合病毒vJX143或vJX143-M 36h后的Marc-145细胞，出现了特异性荧光。

同时，利用RT-PCR技术检测原代(P₀)和子代(P₅)病毒，结果显示，分子标记依然稳定存在。

上述结果说明：利用反向遗传操作系统获得了和野毒具有相似生长特性的全长重组质粒，而且同时说明在ORF5下游插入的遗传标记并不影响整个病毒的生长，是可行的。

1.4.3、病毒细胞半数感染量(TCID₅₀)测定

参照Pizzi，M.，Sampling variation of the fiftypercent end-point，determinedby the Reed-Muench(Behrens)method，Hum Biol，1950.22(3)：p 151-90.中的方法，用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定。将上述感染细胞后收取的病毒上清用维持液(2％FBS的DMEM)作10倍系列稀释后，将10^-3-10^-9连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的MARC-145单层细胞，每稀释度接种4孔，每孔0.20ml，再设2孔对照(即用维持液代替病毒液)，置37℃5％的二氧化碳培养箱中培养，逐日观察感染细胞，记录出现细胞病变的孔数，当停止出现细胞病变后，停止观察，并按Reed-Muench法计算TCID₅₀，

1.4.4、病毒多步生长曲线的绘制

分别以低剂量(0.1MOI)病毒(野毒、vJX143和vJX143-M)感染MARC-145细胞，分别在感染后不同的时间段(6h、12h、24h、36h、48h、72h、84h、96h、108h、120h)收取细胞上清，并进行病毒滴度的测定，收取的每个时间点病毒用TCID₅₀计算滴度，并根据不同时间点病毒的滴度，绘制病毒多步生长曲线，结果如图6所示，根据该图，在感染10h后病毒形成第一个复制高峰期，随后在第50h出现第二个复制高峰期；野毒株vJX143与嵌合病毒vJX143及vJX143-M之间的差异不显著。结果说明利用反向遗传操作技术，获得的全长重组质粒质粒拯救出来的病毒和野生毒株在病毒的复制，增值，各个时间的病毒滴度等及其平台期，指数增长期，平台期等生长曲线方面具有相似的生物活性。

1.4.5、动物回归试验

将12头35日龄PRRSV血清阴性猪分成4组，每组三头，以鼻腔接种分别接种野毒(A组)、嵌合病毒vJX143(B组)和vJX143-M(C组)及生理盐水(D组)，每头接种1ml(TCID₅₀10⁵/ml)，同时肌肉注射1ml，隔离饲喂，每天测量体温并进行临床症状的观察，结果如图7所示。攻毒25天后，扑杀试验猪，采取肺、肾脏、脾、肠、淋巴结及血清，利用RT-PCR及细胞回归试验检测上述各组织器官中的病毒组分，实验结果如下：

A组和B组试验猪在攻毒5天后体温升高，攻毒猪均见消瘦，腹式呼吸，食欲不振，精神沉郁，有部分猪发现水样稀粪，并伴有咳嗽症状，死亡猪尤其可见消瘦，腹式呼吸。A组猪分别在第13天和第16天死亡，B组猪分别在第14和15天死亡。对死亡猪剖检可见肺部症状明显，淋巴结出血明显，部分猪肾脏有出血点，少数猪伴有整个消化道广泛性出血、水肿，肠内容物为红色，含有大量气泡和粘液。C组猪体温、精神状况均正常，剖检未见上述变化。具体体温变化如图7所示。

上述实验结果，说明拯救出来的病毒与野毒具有相似的生物学特性，而且在动物试验中也证实，这次猪高热综合症的病原确实是由vJX143为代表的病毒。

在实施例1中，通过分子操作技术获得了正在中国大面积爆发的“猪高热综合征”的主要病原-高致病性PRRSV的全长序列，而且在此基础之上成功构建了高致病性全长重组质粒pJX143，并证实拯救出来的病毒与原毒具有相类似的生物学特性，更重要的是在动物回归试验中，该重组质粒pJX143呈现出与亲本毒相似的高致死率。此外，加入了遗传标记MluI的全长质粒具有相似的特征，而且在传代之后依然能够稳定存在，可以成为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标记，从而证实该株PRRSV是引起“猪高热综合征”的主要病原，而且也是中国这次大面积暴发的代表株；同时，根据反向遗传操作系统构建的该重组质粒可以为后续试验及其应用提供有效的操作平台。

实施例2、蓝耳病嵌合病毒构建及检测

2.1、引物设计

根据pJX143株的序列，设计引物SPEF，NDE5F，Qst，SRSOE6，SFSOE7，SF12670，SR14365，SF14413和SR15497，其序列及序列说明如表1所示：

表1、克隆以及测序所用引物

名称	序列(5’-3’)	用途
			SPEF	GCCACTTGACTAGTGTTTACG	位于ORF3末段，含SpeI位点，克隆上游引物，用于构建pSX12、p56N12
NDE5F	CTGTTGGCAGTTTGACATATGTTTAAGTATG	位于ORF4和ORF5之间，含Nde I位点，克隆上游引物，用于构建p5NX12
			Qst	GAGTGACGAGGACTCGAGCGCATGCTTTTTTTTTTTTT	反转录引物；克隆下游引物，含XhoI位点
SRSOE6	TGTTATTTGGCATATTTAACAAGGTTTACCACTCCCTGCT	SOE PCR内引物，用于构建p56N12
			SFSOE7	TTGTTAAATATGCCAAATAACAACGGCAAACAGCAG	SOE PCR内引物，用于构建p56N12
SF12670	CTCTCGGCTACCCATGCTACAC	RT-PCR以及测序引物，用于vSX12、v5NX12、v56N12的鉴定
			SR14365	ACCGCCAACGATAGAGTCTGCCCTTAGTGTCC	RT-PCR以及测序引物，用于vSX12、v5NX12、v56N12的鉴定
SF14413	CTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTG	RT-PCR以及测序引物，用于v56N12的鉴定
			SR15497	CAATTAAATCTTACCCCCACACGGTCG	RT-PCR以及测序引物，用于v56N12的鉴定

2.2、结构蛋白嵌合质粒的构建

以pJX143重组质粒的结构蛋白为对象，通过PCR扩增出pJX143的结构蛋白基因GP4-GP5-M-N和GP5-M-N，然后分别使用SpeI/XhoI和NdeI/XhoI进行双酶切，再与经过相应的内切酶切过的弱病毒株pAPRRS的大片段通过T4 DNA连接酶连接，经测序鉴定后筛选出阳性克隆，获得pSX12和pSNX12，构建策略如图8所示，具体构建步骤如下：

2.2.1、扩增结构蛋白GP4-GP5-M-N基因

以pJX143作为模板，引物SPEF和Qst分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增结构蛋白GP4-GP5-M-N基因，具体如下：

PCR反应体系为：pJX143模板1μl，上下游引物对(10μM)各1μl，10×pfu Buffer5μl，2.5mM dNTP 2μl，PFU Turbo DNA聚合酶5 units，加水至50μl。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸2min30s，共进行35个循环，然后72℃延伸10min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为2.4kb。

2.2.2、扩增结构蛋白GP5-M-N基因

以pJX143作为模板，引物NDE5F和Qst分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增结构蛋白GP5-M-N基因，具体如下：

PCR反应体系为：pJX143模板1μl，上下游引物对(10μM)各1μl，10×pfu Buffer5μl，2.5mM dNTP 2μl，PFU Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μl。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸2min，进行6个循环，再95℃预变性2min，94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸2min，进行25个循环，再72℃延伸10min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为1.6kb。

2.2.3、扩增结构蛋白基因的酶切

利用小量胶回收试剂盒分别纯化实施例2.3.1和2.3.2中获得的PCR产物，然后分别以Spe I/Xho I双酶切GP4-GP5-M-N基因的PCR产物，以Nde I/Xho I双酶切GP5-M-N基因PCR产物，将获得的酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳后，使用胶回收试剂盒纯化酶切产物，获得大小分别为2.4kb的GP4-GP5-M-N基因片段和1.6kb的GP5-M-N基因片段。

2.2.4、载体pAPRRS、p5NDE的双酶切

分别以Spe I/Xho I双酶切pAPRRS，以Nde I/Xho I双酶切p5NDE。再将酶切产物分别以1％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒纯化，分别获得大小分别为16kb的pAPRRS双酶切片段和17kb的p5NDE双酶切片段。

2.2.5、嵌合质粒的连接和鉴定

将回收的PCR双酶切产物和相应的质粒双酶切产物，以T4 DNA连接酶连接，然后转化TOP10，筛选大小合适的阳性质粒，测序鉴定。具体步骤如下：

将PCR产物和相应的载体片段以摩尔比3∶1的比例，以T4 DNA连接酶连接，转化TOP10，挑取独立的菌落进行纯培养，提取质粒DNA，1％凝胶电泳，挑取大小为18kb的质粒进行测序，结果分别如SEQ ID NO：7和8所示。

将GP4-GP5-M-N嵌合的全长质粒(即SEQ ID NO：7对应的质粒)命名为pSX12，GP5-M-N嵌合的全长质粒(即SEQ ID NO：8对应的质粒)命名为p5NX12。

2.3、GP5-M的嵌合质粒质粒的构建及鉴定

参考Karin L Heckman et al.Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlapextension.NATURE PROTOCOLS.2007 VOL.2 NO.4，通过SOE PCR法，把p5NX12的N蛋白以及3’UTR基因置换成弱毒疫苗株全长重组质粒pAPRRS的相应部分，从而获得GP5-M的嵌合质粒，具体步骤如下：

在M蛋白和N蛋白基因重叠区域设计SOE PCR内引物(即SRSOE6和SFSOE7)，外引物采用SPEF和Qst。

以p5NX12为模板，SPEF和SRSOE6为上下游引物，采用SOE PCR扩增，其中：

PCR反应体系为：p5NX12模板1μl，上下游引物对(10μM)各1μl，10×pfu Buffer5μl，2.5mM dNTP 2μl，PFU Turbo DNA聚合酶5 units，加水至50μl。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸2min，共进行35个循环，然后72℃延伸10min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图9所示，然后用胶回收试剂盒回收，获得大小为1.9kb目的片段。

然后，以pAPRRS为模板，SFSOE7和Qst为上下游引物，PCR扩增，其中：

PCR反应体系为：pAPRRS模板1μl，上下游引物对(10μM)各1μl，10×pfu Buffer5μl，2.5mM dNTP 2μl，PFU Turbo DNA聚合酶5 units，加水至50μl。

PCR反应循环参数为：95℃预变性2min，94℃变性45s，68℃退火延伸2min，共进行35个循环，然后72℃延伸10min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图9所示，然后用胶回收试剂盒回收，获得大小为0.5kb目的片段。

最后，以上述两个PCR产物为模板，SPEF和Qst为上下游引物，PCR扩增，其中：

PCR反应体系为：模板各1μl，上下游引物对(10μM)各1μl，10×pfu Buffer5μl，2.5mM dNTP 2μl，PFU Turbo DNA聚合酶5 units，加水至50μl。

PCR反应循环参数为：95℃预变性2min，94℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸2min 45s，共进行35个循环，然后72℃延伸10min。

将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图9所示，然后用胶回收试剂盒回收，获得大小约为2.5kb目的片段。

将回收获得的PCR产物和pAPRRS经Spe I/Xho I双酶切后连接，通过1％凝胶电泳筛选，将获得的大小约为18kb的质粒，命名为p56N12并进行测序，结果如SEQ ID NO：9所示，根据该结果，p56N12构建成功。

pSX12，p5NX12，p56N12以SmaI酶切鉴定，结果如图10所示，根据该结果，这三个嵌合质粒的SmaI酶切图谱与预期的一致，没有发生结构缺失。

根据上述实验结果，通过反向遗传操作，以pJX143株重组质粒pAPRRS质粒为基础构建了把JX143株GP4-GP5-M-N基因置换入pAPRRS而得到三个嵌合质粒的pSX12、p5NX12和p56N12。经SmaI酶切鉴定，与pAPRRS比较，无缺失；经测序分析显示质粒SX12的序列为SEQ ID NO：7，质粒5NX12的序列为SEQ ID NO：8，质粒56N12的序列为SEQ ID NO：9，根据该结果成功获得了3个变异株结构蛋白嵌合的嵌合质粒。

2.5、嵌合质粒的拯救

2.5.1、嵌合质粒转染细胞

将MARC-145细胞传代至六孔板上，使每孔细胞数达到2×10⁵个，当细胞密度达到60％～80％左右时即可进行转染。将pSX12，p5NX12，p56N12按Roche公司FUGene HD转染试剂的方法转染MARC-145细胞，然后置37℃，5％CO₂培养箱中培养，并观察细胞病变，待细胞病变达80％时，收集细胞上清。

2.5.2、转染上清的传代与RNA的提取

MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，将细胞病变上清与维持液(2％FBS的DMEM)按照1∶10的比例接种上清液200μL，置37℃继续培养。传代5次以后，待产生80％CPE后，吸取病毒上清，按照QIAgen公司Viral RNA mini Kit说明书的方法，提取病毒RNA。

2.5.3、RT-PCR鉴定

将提取的3个嵌合病毒上清RNA模板，按AMV(购自Takara公司)和rTaq(购自Takara公司)说明书进行RT-PCR反应，获得病毒cDNA序列，其中，cDNA第一链合成引物是Qst，PCR引物是SX12以SF12670、SR14365为上下游引物、5NX12以SF14413、SR15497为上下游引物、56N12分别以SF12670、SR14365和SF14413、SR15497为上下游引物进行PCR扩增，并测序鉴定，根据测序结果，3个嵌合病毒构建成功。

将嵌合病毒在MARC-145细胞上连续传代5次后，取细胞上清用于抽提病毒基因组，并进行RT-PCR扩增重组质粒与弱毒重组质粒的嵌合交叉区域。经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统可见并测序，采用DNAstar软件与亲本重组质粒pAPRRS序列进行比对，结果显示3个嵌合病毒变异株序列都能稳定存在。

根据实施例2，本发明在高致病性蓝耳病重组质粒和经典弱毒蓝耳病重组质粒的基础之上，将高致病蓝耳病病毒的GP4-GP5-M-N，GP5-M，GP5-M-N基因分别替换到经典弱毒蓝耳病重组质粒中，从而构建出3个嵌合质粒，经病毒拯救，获得了活病毒，经RT-PCR鉴定，嵌合病毒能够稳定的传代而不发生缺失，因此，上述3个嵌合病毒，可作为新型蓝耳病疫苗。

从上述三个嵌合病毒中，任取一个进行动物实验，以验证其对蓝耳病具有免疫作用，在本发明的实施例3中，使用的是pSX12。

实施例3、蓝耳病嵌合病毒免疫保护性试验

3.1试验猪的选择及分组

选取29日龄健康仔猪10头，经采集血清进行PRRSV抗体及抗原检测，确定为PRRSV抗体阴性和抗原阴性，称重后随机将其分为2组，5头/组，隔离饲养。

3.2蓝耳病嵌合病毒接种

选取TCID₅₀为10^6.0的PRRSV SX12株病毒的Marc-145细胞培养物，用灭菌PBS液做100倍稀释后，颈部肌肉接种一组5头试验仔猪，10^4.0TCID₅₀/ml，2ml/头；另一组5头猪颈部肌肉接种灭菌PBS液作为对照，2ml/头。

3.3蓝耳病嵌合病毒免疫后的攻毒

试验组仔猪在PRRSV SX12株病毒接种后28天，接种PRRSV vJX143株病毒用灭菌PBS液做10倍稀释的Marc-145细胞培养物，10^4.7TCID₅₀/ml，颈部肌肉接种3ml/头。对照组5头猪也做同样剂量和途径的接种。

3.4试验猪的体温测定

试验及对照组猪在PRRSV SX12株病毒接种后至用PRRSV vJX143株病毒攻毒14天后，每天进行体温测定，测定结果如图11所示。

根据测定结果，试验组在接种PRRSV SX12株病毒后未出现可观察到的体温反应；PRRSVvJX143株病毒攻毒后SX12株病毒接种组出现一过性体温升高，而对照组则出现明显的体温升高，并且比SX12株病毒接种组的高体温水平持续更长的时间。

3.5试验猪血清抗体的测定

在PRRSV SX12株病毒接种后第0，3，5，7，10，14，21，28天对SX12株病毒接种组采集血清，并利用IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒(购自美国Herd Chek IDEXX)进行抗体检测，同时对未免疫组定期采集血清，并进行抗体检测作为对照，结果如图12所示，根据该结果，试验组在接种PRRSV SX12株病毒后第10天抗体开始产生，14天达到阳性值(ELISA S/P≥≥0.4)，攻毒后抗体继续升高并达到峰值，到剖杀时(免疫后52天)，抗体一直维持在高水平(ELISA S/P≥3)，说明PRRSV SX12株有良好的免疫原性，可刺激机体产生很强的免疫反应。

在PRRSV vJX143株病毒接种后第0，2，4，6，8，10，14天对SX12株病毒接种组和未免疫攻毒组采集血清并利用IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒进行抗体检测，结果如图12所示，根据该结果，PRRSV vJX143株攻毒后，可有效刺激机体的免疫记忆细胞，使机体产生更高水平的抗体。

3.6试验猪攻毒后的症状观察

试验及对照组猪在PRRSV SX12株病毒接种后至用PRRSV vJX143株病毒攻毒后21天，每天进行症状观察。

根据观测结果，试验组在接种PRRSV SX12株病毒后未出现可观察到的症状反应；PRRSVvJX143株病毒攻毒后SX12株病毒接种组5头中有两头出现轻微的呼吸症状和咳嗽，未出现典型的腹式呼吸；而对照组5头猪则出现严重的呼吸症状和咳嗽，呈现典型的腹式呼吸；并有一头猪在攻毒后14天死亡。

3.7试验猪的各组织器官的病理学观察

在PRRSV vJX143株病毒攻毒后21天，剖杀试验组和对照组的仔猪，其中对照组5头猪均出现肺脏水肿，部分猪出现有坏死；其中2头猪出现心、肺粘连和腹膜炎；全部猪腹股沟淋巴结和扁桃体淋巴结出现不同程度的出血；部分猪肝脏出现有黄白色的坏死灶；部分猪脾脏出现边缘性梗死；肾脏很少见到出血点，部分猪脑有出血，但未见肠道等消化系统的病变。而试验组仔猪，除2头仔猪出现轻微的肺部水肿外，未见到其他组织器官眼观病理变化。

同时，观察其肺部病变，根据Halbur P G，Paul P S，Frey M L，et al，Comparisonof the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virusisolates with that of the Lelystad virus.Vet Pathol，1995，32：648-660.的方法，对肺部的肺炎病变进行评估，结果如表2所示。

表2、PRRSV SX12株肺脏的病理学评价

组别	攻毒后时间(天)
			14	21
	SX株免疫组	ND			12.00±8.37a
未免疫组			80.00b	55.00±12.91c

注：表中数据为肺炎病变部位占整个肺脏比例百分比的平均数±标准差；其中，“ND”指没有评价，a为SX12株免疫攻毒后5头猪的肺脏的病理学评价，b为未免疫组攻毒后14天死亡猪的肺脏的病理学评价，c为未免疫组攻毒后21天剖杀其余4头猪的肺脏的病理学评价。

根据表2的评价结果，PRRSV SX12株免疫组肺部病变得分为12.00±8.37，远低于未免疫对照组的肺部病变得分(55.00±12.91)，说明PRRSV SX12株对成活猪保护性也很高，肺部病变轻微，说明该毒株对强毒的攻击有良好的保护作用。

在实施例3中，对构建的蓝耳病嵌合病毒SX12株对29日龄仔猪进行了免疫保护性试验，其中SX12株病毒接种组在接种SX12后，未出现明显的体温反应和呼吸症状，说明该PRRSV SX12对猪致病力很低，PRRSV抗体在SX12株免疫后10天开始上升，14天达到并超过阳性水平(ELISA S/P＞0.4)，说明该PRRSV SX12对猪有良好的免疫原性，能刺激机体产生很强的免疫反应。在攻毒PRRSV vJX143株后，SX12株病毒接种组出现一过性体温升高，出现轻微的呼吸症状，剖检各组织脏器未出现明显的病理变化；而未免疫攻毒组则持续更长时间的体温升高，出现严重的呼吸症状和咳嗽，呈现典型的腹式呼吸；剖检可见典型的肺部病理变化，其他组织脏器部分可见典型的损伤，说明PRRSV SX12株免疫后可抗击强毒PRRSV vJX143株的攻击，具有明显的保护作用。

综上所述，基于发病猪场获得的血清中分离出来的病毒构建的全长感染性cDNA质粒pJX143及其拯救出来的病毒具有和野生亲本毒相似的生物学特性和动物宿主的感染力和致死率。而且后续的试验证实，该重组质粒确实是引起这次“猪无名高热”的主要指病病原。基于上述重组质粒，构建了数株疫苗候选株(pSX12，p5NX12，p56N12)，其中的一株疫苗株pSX12对猪体具有较好安全性，免疫后可有效诱导产生机体免疫，并提供猪体免疫保护作用，对“猪高致病性蓝耳病”的免疫保护率高达100％，安全有效。

                           序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗

<130>P5071073

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2600

<212>DNA

<213>蓝耳病病毒

<400>1

atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt     60

ggcacagccc aaaacttgct gcacgggaac accctcctgt gacagccctc ttcaggggga    120

ttaggggtct gtccctaaca ccttgcttcc ggagttgcac tgttttacgg tctctccacc    180

cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc tggggtgttt    240

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aatctccaag ttcctgagct tggggtgttg ggtttttttt ataggcccga agagccactc    360

cggtggacgt tgccacgtgc tttccccact gtcgagtgct cccccgccgg ggcctgttgg    420

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actctacaag tttatgaacg gggttgtcgc tggtacccca ttgtcgggcc cgtccctggg    600

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gtgttaacca acttgccgct cccgcagagg cccaaacctg aggacttttg cccttttgag    720

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ttgaagttgg ttgcgaaccg actccacacc tccttcccgc cccatcacgt agtggacatg     900

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ggctgcctcc ctgctgacac tgtccctgaa ggaaactgct ggtggcgctt gtttgactcg    1020

ctcccaccgg aagttcagta caaagaaatt cgccatgcta accaatttgg ctatcaaacc    1080

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<210>2

<211>4881

<212>DNA

<213>蓝耳病病毒

<400>2

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ccgctattcc attccgagct cctttctttc ccgctggagt gaaagttgat cctgagtgca    2820

gaatcgtggt tgatcccgat acttttacta cagccctccg gtctggctat tccaccgcga    2880

acctcgtcct tggtacgggg gactttgccc agctgaatgg actaaagatc aggcaaattt    2940

ccaagccttc agggggaggc ccacacctca ttgctgcctt gcatgttgcc tgctcgatgg    3000

cgttacacat gcttgctggt gtttatgtaa ctgcagtggg gtcctgcggt accggtacca    3060

acgatccgtg gtgcactaac ccgtttgccg tccctggcta cggacctggc tctctttgca    3120

cgtctagatt gtgcatctcc caacacggcc tcaccttgcc cttgacagca cttgtggcgg    3180

gattcggcct tcaagagatt gccttggtcg ttttgatttt tgtctccatc ggaggcatgg    3240

ctcataggtt gagttgtaag gctgacatgt tgtgcatctt actcgcaatc gctagttatg    3300

tttgggtacc tcttacctgg ttgctttgtg tgtttccttg ttggttgcgc tgtttctctt    3360t    gcaccccct caccatccta tggttggtgt ttttcttgat ttctgtaaat ataccctcag    3420

gagtcttggc cgtggtgttg ttgatttctc tctggctttt aggtcgttat actaacgttg    3480

ctggtcttgt cactccctat gacattcatc attacaccag tggcccccgc ggtgttgccg    3540

ccttggctac cgcaccagat gggacctact tggccgctgt ccgccgcgct gcgctgactg    3600

gtcgtaccat gctgttcacc ccgtctcagc tcgggtccct ccttgagggc gctttcagaa    3660

ctcaaaagcc ctcactgaac accgttaatg tggtcgggtc ctccatgggc tctggcggag    3720

tgttcactat tgacgggaaa atcaagtgcg tgactgccgc acatgtcctt acgggtaact    3780

cagctagggt ttccggggtc ggcttcaatc aaatgcttga ctttgatgta aaaggggact    3840

tcgccatagc tgattgcccg aattggcaag gggttgctcc caaggcccag ttctgcgagg    3900

atgggtggac tggtcgcgcc tattggctga catcctctgg cgttgaaccc ggtgttattg    3960

ggaatgggtt cgccttctgc ttcaccgcgt gtggcgactc tggatcccca gtgattaccg    4020

aagccggtga gcttgtcggc gttcacacag gatcaaacaa acaaggagga ggcattgtca    4080

cgcgcccctc aggccagttt tgtaatgtga agcccatcaa gctgagcgag ttgagtgaat    4140

tcttcgctgg acctaaggtc ccgctcggtg atgtgaaaat tggcagtcac ataattaaag    4200

acacatgcga ggtgccttca gatctttgtg ccctgcttgc tgccaaaccc gaactggaag    4260

gaggcctttc cacagttcaa cttctgtgtg tgtttttcct cctgtggaga atgatggggc    4320

atgcttggac gcccttggtt gctgtggggt ttttcatcct gaatgagatt ctcccagctg    4380

tcctggttcg gagtgttttc tcctttggga tgtttgtgct atcttggctc acaccatggt    4440

ctgcgcaagt cctgatgatc aggcttctga cagcagccct taacagaaac agatggtctc    4500

ttggttttta cagccttggt gcagtaacca gttttgtcgc agatcttgcg gtaactcaag    4560

ggcatccgtt acaggtggta atgaacttaa gcacctatgc cttcctgccc cggatgatgg    4620

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tgtacttgtt taagtaccgc tgccttcaca atgtccttgt tggcgatggg gtgttctctt    4740

cggctttctt cttgcgatac tttgccgagg gaaagttgag ggaaggggtg tcgcaatcct    4800

gcgggatgag tcatgagtcg ctgactggtg ccctcgccat gagactcact gacgaggact    4860

tggatttcct tacgaaatgg a                                              4881

<210>3

<211>4777

<212>DNA

<213>蓝耳病病毒

<400>3

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agcttatgtg ctttctcaag gtaggtgtaa aaagtgctgg ggatcttgtg taagaactgc     120

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cgacctgtgc gatcggtttt gcgcaccaaa aggcatggac cccatttttc tcgccactgg     240

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tcccaaccag gccgtaaagt gcttgcgggt attacaggcg ggtggggcga tggtggccga     420

ggcagtccca aaagtggtca aagtttccgc tattccattc cgagctcctt tctttcccgc     480

tggagtgaaa gttgatcctg agtgcagaat cgtggttgat cccgatactt ttactacagc     540

cctccggtct ggctattcca ccgcgaacct cgtccttggt acgggggact ttgcccagct     600

gaatggacta aagatcaggc aaatttccaa gccttcaggg ggaggcccac acctcattgc     660

tgccttgcat gttgcctgct cgatggcgtt acacatgctt gctggtgttt atgtaactgc     720

agtggggtcc tgcggtaccg gtaccaacga tccgtggtgc actaacccgt ttgccgtccc     780

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cttgcccttg acagcacttg tggcgggatt cggccttcaa gagattgcct tggtcgtttt     900

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catcttactc gcaatcgcta gttatgtttg ggtacctctt acctggttgc tttgtgtgtt    1020

tccttgttgg ttgcgctgtt tctctttgca ccccctcacc atcctatggt tggtgttttt    1080

cttgatttct gtaaatatac cctcaggagt cttggccgtg gtgttgttga tttctctctg    1140

gcttttaggt cgttatacta acgttgctgg tcttgtcact  ccctatgaca ttcatcatta   1200

caccagtggc ccccgcggtg ttgccgcctt ggctaccgca ccagatggga cctacttggc    1260

cgctgtccgc cgcgctgcgc tgactggtcg taccatgctg ttcaccccgt ctcagctcgg    1320

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catcctgaat gagattctcc cagctgtcct ggttcggagt gttttctcct ttgggatgtt    2100

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agcccttaac agaaacagat ggtctcttgg tttttacagc cttggtgcag taaccagttt    2220

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tgtcgttgac ccaacccccg cacccccacc cgtacctgtg cccatccctc tcccaccgaa    2940

agttctggag aacggtccca atgcctgggg ggatgaggac cgtttgaaca agaaaaagag    3000

gcgcaggatg gaagccgtcg gcatttttgt catggacggg aagaagtacc agaaattttg    3060

ggacaagaat tccggtgatg tgttttatga ggaggtccat attagcacag acgagtggga    3120

gtgccttaga actggcgacc ctgtcgactt tgatcctgag acagggattc agtgtgggca    3180

tatcaccatt gaagacaagg tttacaatgt cttcacctcc ccatctggta ggagattctt    3240

ggtccccgcc aaccccgaga atagaagagc tcagtgggaa gccgccaagc tttccgtgga    3300

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gaaaagaata attgacaaac tccagggtct gactaaggag cagtgtttaa actgctagcc    3420

gccagcggct tgacccgctg tggtcgcggc ggcttagttg ttactgagac agcggtaaaa    3480

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gaggttgagc taaaagacgc ggttgagcac aaccaacatc cggttgccag accggttgat    3600

ggtggtgttg tgctcctgcg ctctgcagtt ccttcgctta tagatgtctt gatctccggc    3660

gctgatgcat ctcctaagtt actcgcccgc cacgggccgg gaaacactgg gattgatggc    3720

acgctttggg attttgaggc cgaggctact aaagaggaag ttgcactcag tgcgcaaata 3780

atacaggctt gtgatattag gcgcggcgac gcgcctgaaa ttggtctccc ttataagttg 3840

taccctgtta ggggcaaccc tgagcgggta aaaggagttt tacagaatac aaggtttgga 3900

gacatacctt acaaaacccc cagtgacact ggaagcccgg tgcacgcggc tgcctgcctc 3960

acgcctaatg ctactccggt gactgatggg cgctccgtct tggctacaac catgccctct 4020

ggctttgagt tgtatgtgcc gaccattcca gcgtccgtcc ttgattatct tgattctagg 4080

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tccaagtatg atttgtccac ccaaggcttt gttttgcctg gagttcttcg cctcgtgcgg 4200

aagtacctgt tcgcccacgt gggtaagtgc ccgcccgttc atcggccttc cacttaccct 4260

gctaagaatt ctatggctgg aataaatggg aacaggtttc caaccaagga cattcagagc 4320

gtccctgaaa tcgacgttct gtgcgcacag gctgtgcgag aaaactggca aactgttacc 4380

ccttgtaccc tcaagaaaca gtactgtggg aagaagaaga ctaggacaat acttggcacc 4440

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ccggtcctag gcaggtgcct tgaagctgat cttgcgtcct gcgatcgatc cacacctgca 4620

attgtccgct ggtttgccgc caatcttctt tatgaactcg cctgtgctga ggagcatcta 4680

ccgtcgtacg tgctgaactg ctgccacgac ttactggtca cgcagtccgg cgcggtgact 4740

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<210>4

<211>5609

<212>DNA

<213>蓝耳病病毒

<400>4

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ttgtatgtgc cgaccattcc agcgtccgtc cttgattatc ttgattctag gcctgactgc     660

cctaaacagt taacagagca cggttgtgag gatgctgcat taagagacct ctccaagtat     720

gatttgtcca cccaaggctt tgttttgcct ggagttcttc gcctcgtgcg gaagtacctg     780

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atcgacgttc tgtgcgcaca ggctgtgcga gaaaactggc aaactgttac cccttgtacc     960

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tatgcacagc acatggtgct cagttacttc aaaagtggtc accctcatgg ccttctgttt    1440

ctgcaagacc agctaaagtt tgaggacatg ctcaaggttc aacccctgat cgtctattcg    1500

gacgaccttg tgctgtatgc cgagtctccc tccatgccaa actaccactg gtgggttgaa    1560

catctgaatc ttatgctggg tttccagacg gacccaaaga agacaaccat cacagactca    1620

ccatcattcc taggttgcag gataataaat gggcgccagc tagtccctaa ccgtgacagg    1680

atcctcgcgg ccctcgccta ccacatgaag gcaagtaatg tttctgaata ctacgcctcg    1740

gcggctgcaa tactcatgga cagctgtgct tgtttagagt atgatcctga atggtttgaa    1800

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<213>蓝耳病病毒

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caccgttctt cttgtccatg tgggaaaaac tcaggtccaa tcatgagggg aagaagtcca    9540

gaatgtgcgg gtactgcggg gccccggctc cgtacgccac tgcctgtggt ctcgatgtct    9600

gtgtttacca cacccacttc caccagcatt gtcctgttat aatctggtgt ggccacccgg    9660

cgggttctgg ttcttgtagt gagtgcgaac cccccctagg aaaaggcaca agccctctag    9720

atgaggtgtt agaacaagtt ccgtacaagc ctccgcggac tgtgatcatg catgtggagc    9780

agggtctcac ccctcttgac ccaggtagat atcagactcg ccgcggatta gtctccgtta    9840

ggcgtggcat taggggaaat gaagtcgacc taccagacgg tgattacgct agcaccgcct    9900

tgctccctac ttgtaaagag atcaacatgg tcgctgtcgc ctctaacgtg ttgcgcagca    9960

ggtttatcat cggcccaccc ggtgctggga aaacacactg gcttcttcaa caagtccagg   10020

atggtgatgt catttacacg ccaactcacc agaccatgct cgacatgatt agggctttgg   10080

ggacgtgccg gttcaacgtt ccagcaggta caacgctgca attccctgcc ccctcccgta   10140

ccggcccatg ggttcgcatc ttggccggcg gttggtgtcc tggcaagaac tccttcctgg   10200

atgaagcggc gtattgcaat caccttgatg tcttgaggct tctcagtaaa acaactctca   10260

cttgcctagg agact tcaaa caactccacc ctgtgggttt tgactcccat tgctatgtat  10320

ttgacatcat gcctcagacc caattaaaga ccatctggag gttcgggcag aatatctgtg  10380

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atttgcccac taaagattca ctcaacaggc aaagagctct tgttgctatc accagggcaa  10620

gacatgctat cttcgtgtat gacccacaca ggcaattgca gagcatgttt gatcttcccg  10680

cgaaaggcac acccgtcaac ctcgcagtgc accgtgacga acagctgatc gtattagaca  10740

gaaacaacag agaaatcacg gttgctcagg ctctaggcaa tggagataaa ttcagggcca  10800

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catactatct cacaaaattt gttagaggcg aggctcaagt gcttccggag acagtcttca  11160

gcaccggccg aattgaggta gattgtcgag agtatcttga tgatcgggag cgagaagttg  11220

ctaagtccct cccacatgcc ttcatcggcg atgtcaaagg taccaccgtt gggggatgtc  11280

atcacgttac ctccaaatac cttccgcgct tccttcccaa ggaatcagtt gcggtggtcg  11340

gggtttcgag ccccgggaaa gccgcgaaag cagtttgcac attgacggat gtgtacctcc  11400

cagaccttga agcgtacctc cacccagaga cccagtccag gtgctggaaa gtgatgttgg  11460

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attctactgt gtacttggac ccctgcatgg gccctgctct ttgcaacaga agggttgtcg  11640

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agttctcgct tgatgaccca gtaaggtaca aacacacctg gggatttgaa tcggatacag  11820

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ccccgggccc tgtcattgaa ccaactttag gcctgaattg aaatgaaatg gggtctatgc  12000

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ccattgttga tatcatcata tttttggcca ttttgtttgg cttcacaatc gccggttggc  12120

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accctgagca attacagaag atcttatgag gcctttcttt ctcagtgtca ggtggacatt  12240

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tggaaacagg tggtgagcga ggctacattg tctcgcatta gtggtttgga tgtggtggct  12420

cactttcaac atcttgccgc tattgaagcc gagacttgta aatatttggc ctcccggcta  12480

cccatgctgc acaacctgcg cttgacaggg tcaaatgtaa ccatagtgta taatagtact  12540

ttggatcagg tgtttgccat tttcccaacc cctggttccc ggccaaagct tcatgatttt  12600

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ctttttgttg tgctgtggtt gcgaattcca atgctaagtt ctgtttttgg tttccgctgg  12720

ttaggggcaa cttttctttt gaactcatgg tgaattacac ggtatgcccg ctttgcccaa  12780

cccggcaggc agccgctgag atccttgaac ccggcaagtc tttttggtgc aggatagggc  12840

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ccagcgaagg ccacttgacc agtgtttacg cctggttggc gttcctgtcc ttcagctaca  12960

cggcccagtt ccatcccgag atatttggga tagggaatgt gagtcaagtt tatgttgaca  13020

tcaagcacca attcatttgc gctgttcacg acggggataa cgccaccttg cctcgccatg  13080

acaatatttc agccgtattt cagacctact accaacacca ggtcgacggc ggcaattggt  13140

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ttctcaggcg ttcgcctgca aaccatgttt cagttcgagt ctttcggaca tcaaaaccaa  13260

caccaccgca gcatcagact tcgttgtcct ccaggacatc agctgcctta ggcatggcga  13320

ctcgtcctct ccgacgattc gcaaaagttc tcagtgccgc acggcgatag ggacgcccgt  13380

gtacatcacc atcactgcca atgtcacaga tgaaaattat ctgcattctt ctgatctcct  13440

catgctttct tcttgccttt tctatgcttc cgagatgagt gaaaagggat tcaaagtggt  13500

gtttggcaat gtgtcaggca tcgtggctgt gtgcgtcaac tttaccagct acgtccaaca  13560

cgtcaaggag ttcacccaac gctccttagt ggtcgatcat gtgcgactgc ttcatttcat  13620

gacacctgag accatgaggt gggcaaccgt tttagcctgt ctttttgcca tcctactggc  13680

aatttgaatg tttaagtatg ttggggaagt gcttgaccgc gtgctgttgc tcgcgattgc  13740

tttttttgtg gtgtatcgtg ccgttttatc ttgctgtgct cgtcaacgcc agcaacaaca  13800

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ctgtgtccac cgccggatat tatcacgggc ggtatgtctt gagtagcatt tacgcagtct  14040

gtgctctggc tgcgctgatt tgctttgtca ttaggcttgc gaagaactgc atgtcctggc  14100

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agatcatcgc ccaacaaaac cagtccagag gcaagggacc ggggaagaaa aataggaaga  14940

aaaacccgga gaagccccat ttccctctag cgactgaaga tgacgtcagg catcacttta  15000

cccctagtga gcggcaattg tgtctgtcgt cgatccagac tgccttcaat cagggcgctg  15060

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ttctttggca cctcagtgtt agaattggga gaatgtgtgg tgaatggcac tgattgacac  15240

tgtgcctcta agtcacctat tcaattaggg cgaccgtgtg ggggtaaagt ttaattggcg  15300

agaaccatgc ggccgtaatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  15360

aaaaaaaaaa aaa                                                     15373

<210>7

<211>15575

<212>DNA

<213>蓝耳病病毒

<400>7

atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg acatttgtat tgtcaggagc tgtgatcatt     60

gacacagccc aaagcttgct gcacagaaac acccttctgt gacagcctcc ttcaggggag    120

tttaggggtc tgtccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac     180

ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt     240

catggcggag ggccaagtct actgcacacg atgcctcagt gcacggtctc tccctcctct     300

gaatctccaa gttcctgaac tcggggtgct gggcctattc tataggcccg aagagccact     360

ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gagcctgctg     420

gctttctgcc atctttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aatctgaact ttcaacaaag     480

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gactctacaa gtttatgaac ggggttgcca ctggtacccc attgttggac ctgttcctgg     600

agtggccgtt tatgccaact ccctacatgt gagtgataaa cctttcccgg gagcaactca     660

cgtgttaacc aacctgccgc tcccgcagag acccaagcct gacgattttt gcccctttga     720

gtgtgctatg gctactgtct atgacattgg tcatgacgcc gtcatgtatg tggccgaaga     780

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gtctaagttc accttcacag cccctgggcg tggtgtttct atgcgggtcg aacgccaaca     960

cggctgcctc cccgctgaca cagttcctga aggcaactgc tggtggagct tgttcaactt    1020

gctcccactg gaagttcaga acaaagaaat tcgtcatgcc ggccaatttg gctaccagac    1080

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agtaactgac ctaaatggac ctatcgtcgt acagtgcttc tccgttaagg agagttggat    1200

ccgccacttg aaactggcgg aagaacccag ctaccctggg tttgaggacc tcctcagaat    1260

aagggttgag cccaacacgt cgccattggc tgacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg    1320

caatcacaag tggtatggcg ctggaaagag agcaaggaaa gcacgctcta gtgcgactgc    1380

tacagtcgct ggccgcgctt tgcccgttcg tgaaacccgg caggtcgagg agcacgaggt    1440

tgccggcgcc aacaaggctg agcacctcaa acactactcc ccgcctgccg aagggaattg    1500

tggttggcac tgcatttccg ccatcggcaa ccggatgttg aattccaaat ttgaaaccac    1560

ccttcccgaa agagtgagac ctccagatga ctgggctact gatgaggatc ttgtgaatgc    1620

catccaaatc ctcagactcc ctgcggcctt ggacaggaac ggtgcttgtg ctagcgccaa    1680

gtacgtactt aagctggaag gtgagcattg gactgtcact gtgacccctg ggatgtcccc    1740

ttctttgctc cctcttgaat gtgttcaggg ctgttgcgag cataagggcg gtcttggttc    1800

cccagatgca gtcgaggttt tcggatttga ccctgcctgc cttgactggc tggctgaggt    1860

gatgcacttg cctagcaatg ccatcccagc cgctctggcc gaaatgtccg gcgattccaa    1920

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ggctaactac tactaccgcg cgcaaggtga cgaagttcgt caccgtgaaa gactaaccgc    2400

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cttgctgaaa ctggctaacg cccagatgac ttcggacatg atggcctggg cagtcgagca    2580

ggttgaccta aaaacttggg tcaagaacta tccgcggtgg acaccaccac ctcctccgcc    2640

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gcgcaatacg tctgttcacc aggcgtctcg caccttggac gacagattta agtttctccc    3480

gaagatgata cttgaaacac cgccgcccta cccgtgtggg ttcgtgatga tgcctcgcac    3540

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gtttgccgtc cctggctacg gacctggctc tctctgcacg tccagattgt gcatctccca    5220

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cttggttatt ttgatttttg tttctatcgg aggcatggct catagattga gttgcaaggc    5340

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gctcggtgat gtgaaagttg gcagccacat aattgaagac gtaggcgagg tgccttcaga    6300

tctttgcgcc ttgcttgctg ccaaacctga actggaagga ggcctctcca ccgttcaact    6360

tctgtgtgtg tttttcctcc tgtggagaat gatgggacat gcctggacgc ccttggttgc    6420

cgtagggttt tttatcttga atgaggtcct cccagctgtc ctggtccgga gtgttttctc    6480

ctttggaatg tttgtgctat cctggctcac accatggtct gcgcaagttc tgatgatcag    6540

gcttctaaca gcagctctta acaggaatag atggtcactt gccttttaca gcctcggtgc    6600

aatgactggt tttgtcgcag atctcgcggc tactcagggg tatccgttgc aggcagtgat    6660

gagtttgagc acttatgcat tcctgcctcg gataatggtt gtgacttcac cagtcccagt    6720

ggttgcgtgt ggtgttgtgc acctacttgc catcattttg tacttgttta agtaccgctg    6780

cctgcacaac atccttgttg gcgatggagt gttctctgcg gctttcttcc tgcgatattt    6840

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tgatttcaag tgctttgttt ctgcgtccaa catgagaaat gctgcgggcc aattcatcga    7020

ggctgcctat gctaaagcac ttagagtaga acttgcccag ttggtgcagg ttgataaggt    7080

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cggtgacatt gttgtcgctc ttggccatac gcctgttggc agtatcttcg acctgaaggt    7200

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ccagaaattt tgggacaaga attccggtga cgtgttttat gaggaggtcc ataacaacac    7500

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gggatcgatg gcacgctctg ggattttgag tccgaagcca ctaaagagga agtcgcactc    8160

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caaactgtta ccccttgtac cctcaagaaa cagtattgtg ggaagaagaa gactaggacc    8820

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caacccctaa tcgtctattc ggacgacctc gtgctgtatg ccgagtctcc caccatgcca    9360

aactaccatt ggtgggttga acatctgaat ttgatgctgg ggtttcagac ggacccaaag    9420

aaaacagcca taacagactc gccatcattt ctaggctgta gaataataaa tgggcgccag    9480

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ggctacagct ttcccggcac gccgttcttc atgtccatgt gggaaaaact caggtccaat   9720

tatgagggga agaagtcgag agtgtgcggg tactgcgggg ccccggcccc gtacgctact   9780

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catagtatat aatggtactt tgaatcaggt gtttgccatt ttcccgaccc ctggttcccg  12780

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agcaaagtct atgttgacat caaacaccaa ttcatctgcg ctgttcatga tgggcagaac  13260

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tttcagacat taagaccaac accaccgcag cagcgggctt tgctgtcctc caggacatca  13500

gctgccttag gcatggcgac ccgtcctctg cggcgattcg caaaagctct cagtgccgca  13560

cggcgatagg gacacccgtg tatatcacca ttacagccaa tgtgacagat gagaattatt  13620

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ttaccagcta cgtccaacat gtcagggact tcacccaacg ctccttggtg gtcgatcatg  13800

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ggaaattcat cacctccaga tgccgtttgt gcttgctagg ccgcaagtac attctggccc  14820

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ccctcagcat gatgggctgg cattctttgg cacctcagtg ttagaattgg gagaatgtgt  15420

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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                             15575

<210>8

<211>15572

<212>DNA

<213>蓝耳病病毒

<400>8

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ggcaacacct ctgagtgagc cgatccctgt gcccgcaccg cgacgcaagt ttcagcaggt    3000

agaaaaagtg aatccggcgg cggcaaccct ggggtgccaa gacgagtttc cagatttgtc    3060

tgcatcctcg catactgaat atgaggcgtc tccccttgta ctaccgcaga acggggacgt    3120

tcttgaagtg gaggagcggg aagctgagga aatcctgagt ggaatctcag acatactgga    3180

tgccatcaaa ccggcatctg catcatcaag cagctccctg tcaagtgtgg cgatcacacg    3240

cccgaaatac tcagctcaag ccatcattga ctcgggtggg ccctacagcg ggcatctcca    3300

agaggtgaag gaaacatgcc taagcatcat gagtgaggca tgtgatgtga ccaagcttga    3360

tgaccctgcc acgcaggaat ggctttctcg catgtgggat agggtggaca tgctgacttg    3420

gcgcaatacg tctgttcacc aggcgtctcg caccttggac gacagattta agtttctccc    3480

gaagatgata cttgaaacac cgccgcccta cccgtgtggg ttcgtgatga tgcctcgcac    3540

acctgcaccc tccgtgggtg cggagagcga cctcactatt ggctcagtcg ctactgagga    3600

cgttccacgc atcttcggga aagtaaatga tgtctgcaag atgatcgacc agagaccctt    3660

ggtactcttt gaaaatgagc tggcagatga ccaacctgcc agagatcctc ggacatcatc    3720

gcagaggttt gacgggagca caccagctcc gcccgcaggc acggatggca ccggtttggc    3780

ttcgggccct ggagtgagag aagtggattc atgtgaggcg agctcaaccg agaaaattga    3840

acagcccttc gtgttgaacg gcggcgccag cacacaggcg tcaacgttta ccaatttgcc    3900

gcctccaggc ggtatagatg cgggcgggag tgggccgtta caaacggtgc gaaagaaggc    3960

tgaacggttc tttgacctac taagccgtca ggtttttaat ctcgtctccc atctccctgt    4020

tttcttctca cgccttttca aacctggcgg tgactattct ccgggtgatt ggggttttgc    4080

agcttttact ttattgtgcc tctttttgtg ttacagttac ccggcctttg gtgctgttcc    4140

cctcttgggt gtattttctg ggtcttctcg gcgtgttcga atggggtttt ttggctgctg    4200

gttggctttt gctgttagtc tgttcaaacc tgtgtccgac ccagtcggcg ctgcttgtga    4260

atttgattcg ccagagtgta gaaacatcct tcattctttt gagcttctca aaccttggga    4320

ccctgttcgc ggccttgttg tgggccccgt cggtctcagt cttgccattt ttggcaggtt    4380

attgggcggg gcacgccaca tctggcactt tttgcttagg tttggcattg ttgcagattg    4440

tatcttggct ggagcttatg tgctttctca aggcaggtgt aaaaagtgct ggggatcttg    4500

tataagaact gctcctaatg aggtcgcctt taacgtgttt ccttttacac gtgcgaccag    4560

gtcgtcactt atcgacctgt gcaatcggtt ttgcgcgcca aaaggtatgg accccatttt    4620

cttcgccact gggtggcgcg ggtgctggac cggccgaagc cccattgagc aaccctctga    4680

aaaacccatc gcgtttgccc agttggatga aaaaaagatt acggctagga ctgtggtcgc    4740

ccagccctat gaccccaacc aagctgtaaa atgcttgcgg gtattgcagg cgggcggggt    4800

gatggtggct gaggcagtcc caaaagtggt caaagtttct gctgtcccat tccgagcccc    4860

cttctttccc accggagtga aagttgatcc tgaatgcagg attgtggttg accccgacac    4920

tttcactgca gccctccgat ctgggtactc caccacaaac ctcgtccttg gtgtggggga    4980

ctttgcccag ctgaatggat taaaaatcag gcaaatttcc aagccttcag ggggaggtcc    5040

acacctcatg gctgccctgc atgttgcttg ctctatggct ctgcacatgc ttgttgggat    5100

ttatgtgact gctgtgggtt cttgcggcac cggcactaac gatccgtggt gcgccaaccc    5160

gtttgccgtc cctggctacg gacctggctc tctctgcacg tccagattgt gcatctccca    5220

acatggcctt accctaccct tgacagcact tgtggcggga ttcggctttc aggaaattgc    5280

cttggttatt ttgatttttg tttctatcgg aggcatggct catagattga gttgcaaggc    5340

tgatatgctg tgtattttgt ttgcaatcgc cagctatgtt tgggtacctc ttacctggtt    5400

gctttgtgtg tttccttgct ggttgcgctg tttttcgttg caccccctca ccatcctatg    5460

gttggtgttt ttcctgattt ctgtaaatat gccttcagga atcttggcct tggtgttgtt    5520

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gtctcagctc gggtcccttc ttgagggcgc tttcagaact cgaaagccct cactgaacac    5760

cgttaatgtg gtcgggtcct ccatgggctc tggcggggtg ttcatcatcg acgggaaaat    5820

taagtgcgta actgctgcac atgtccttac gggtaattca gctagggttt ccggggttgg    5880

cttcaatcaa atgcttgact tcgatgtgaa aggagacttc gccatagccg attgcccaga    5940

ctggcaaggg gctgctccca agacccaatt ctgcgaggaa ggatggactg gccgggccta    6000

ttggctaacg tcttctggtg tcgaacccgg cgtcattgga aaaggattcg ccttctgctt    6060

caccgcgtgc ggcgattccg gatccccagt aatcaccgag gccggcgagc ttatcggcgt    6120

tcacacgggg tcaaataaac aaggaggagg catcgtcacg cgcccctcag gccagttttg    6180

tagtgtggca cccgtcaaat taagcgaact aagtgaattc tttgcagggc ctaaggtccc    6240

gctcggtgat gtgaaagttg gcagccacat aattgaagac gtaggcgagg tgccttcaga    6300

tctttgcgcc ttgcttgctg ccaaacctga actggaagga ggcctctcca ccgttcaact    6360

tctgtgtgtg tttttcctcc tgtggagaat gatgggacat gcctggacgc ccttggttgc    6420

cgtagggttt tttatcttga atgaggtcct cccagctgtc ctggtccgga gtgttttctc    6480

ctttggaatg tttgtgctat cctggctcac accatggtct gcgcaagttc tgatgatcag    6540

gcttctaaca gcagctctta acaggaatag atggtcactt gccttttaca gcctcggtgc    6600

aatgactggt tttgtcgcag atctcgcggc tactcagggg tatccgttgc aggcagtgat    6660

gagtttgagc acttatgcat tcctgcctcg gataatggtt gtgacttcac cagtcccagt    6720

ggttgcgtgt ggtgttgtgc acctacttgc catcattttg tacttgttta agtaccgctg    6780

cctgcacaac atccttgttg gcgatggagt gttctctgcg gctttcttcc tgcgatattt    6840

tgccgaggga aagttgaggg agggggtgtc gcaatcctgc gggatgaatc atgagtcact    6900

taccggtgcc ctcgctatga gactcaatga cgaggacttg gatttcctca cgaaatggac    6960

tgatttcaag tgctttgttt ctgcgtccaa catgagaaat gctgcgggcc aattcatcga    7020

ggctgcctat gctaaagcac ttagagtaga acttgcccag ttggtgcagg ttgataaggt    7080

tcggggtact ttggccaaac ttgaagcttt tgccgacacc gtggcacccc aactctcgcc    7140

cggtgacatt gttgtcgctc ttggccatac gcctgttggc agtatcttcg acctgaaggt    7200

tggtaacacc aagcacactc tccaagccat cgagaccagg gtccttgctg ggtccaaaat    7260

gaccgtggcg cgcgtcgtcg atccgacccc cacgctccca cccgcacccg tgcccatccc    7320

cctcccaccg aaggttttgg agaacggtcc aaacgcttgg ggggatgaag accgtttgaa    7380

taaaaagagg aggcgcagga tggaagccct cggcatctat gttatgggcg ggaaaaagta    7440

ccagaaattt tgggacaaga attccggtga cgtgttttat gaggaggtcc ataacaacac    7500

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tttgtgtggg catgtcacca ttgaagatag ggcttaccat gtttacacct ccccatctgg    7620

taagaaattc ctagtccccg tcaacccaga gaacggaaga gttcaatggg aggctgcaaa    7680

gctttccgtt gagcaggccc ttggtatgat gaacgtcgac ggcgagctga ctgccaagga    7740

actggagaaa ctgaaaagaa taattgacaa actccagggc ctgactaagg agcagtgttt    7800

aaactgctag ccgctagcgg cttgacccgc tgtggtcgcg gcggcttggt tgttactgag    7860

acagcggtaa aaatagtcaa atttcacaac cggaccttca ccttgggacc tgtaaattta    7920

aaagtggcta gtgaggttga gctaaaagac gcggtcgagc acaaccaaca cccggttgct    7980

agaccagtcg atggtggtgt tgtgctcatg cgttccgcgg ttccctcgct tatagatgtc    8040

ctgatctccg gtgctgatgc atctcccaaa ttacttgccc atcacggacc gggcaacacc    8100

gggatcgatg gcacgctctg ggattttgag tccgaagcca ctaaagagga agtcgcactc    8160

agcgcgcaaa taatacaggc ttgtgacatt aggcgcggcg acgcacctga aattggtctc    8220

ccttacaagc tgtaccctat taggggcaac cctgagcggg taaagggagt tttacggaat    8280

acaaggtttg gagacatacc ttataaaacc cccagtgaca ctggaagccc agtgcacgcg    8340

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accatgccct ccgggtttga gttgtatgta ccgaccatac cagcgtctgt ccttgactat    8460

cttgattcta ggcccgactg ccctaaacag ttgacggagc acggctgtga agatgccgca    8520

ctgagagacc tctccaagta tgacttgtcc acccaaggct ttgttttgcc tggagttctt    8580

cgccttgtgc ggaagtacct gtttgcccat gtgggcaaat gcccgcccgt tcatcggcct    8640

tccacttacc ctgccaagaa ttctatggct ggaataaatg ggaacaggtt tccaaccaag    8700

gacatccaga gcgtccctga aatcgacgtt ctgtgcgcac aggctgtgcg agaaaattgg    8760

caaactgtta ccccttgtac cctcaagaaa cagtattgtg ggaagaagaa gactaggacc    8820

atactcggca ccaataactt tatagcgctg gctcaccgtg cagcgttgag tggtgtcacc    8880

cagggcttca tgaaaaaggc gtttaactcg cctatcgccc tcgggaaaaa caaatttaag    8940

gagctacaga ctccggtcct aggcaggtgc cttgaagctg atcttgcatc ctgcgatcga    9000

tctacacctg caattgtccg ctggtttgcc gccaatcttc tttataagct tgcctgtgct    9060

gaagagcatc taccgtcgta tgtgctgaac tgctgtcacg acttactggt cacgcagtcc    9120

ggtgcagtga ctaagagagg cggcctgtcg tctggcgacc cgataacctc tgtgtctaat    9180

accatttaca gcttggtgat ctatgcacag cacatggtac ttagttgctt caaaagtggt    9240

cacccccatg gccttctgtt cttacaagac caactaaagt ttgaggacat gctcaaggtt    9300

caacccctaa tcgtctattc ggacgacctc gtgctgtatg ccgagtctcc caccatgcca    9360

aactaccatt ggtgggttga acatctgaat ttgatgctgg ggtttcagac ggacccaaag    9420

aaaacagcca taacagactc gccatcattt ctaggctgta gaataataaa tgggcgccag    9480

ctagtcccca accgtgacag gattctcgcg gccctcgcct accacatgaa ggcgagtaat    9540

gtttctgaat actacgcctc agcggctgca atactcatgg acagctgtgc ttgtttggag    9600

tatgatcctg aatggtttga agaacttgta gttgggatag cgcagtgcgc ccgcaaagac    9660

ggctacagct ttcccggcac gccgttcttc atgtccatgt gggaaaaact caggtccaat    9720

tatgagggga agaagtcgag agtgtgcggg tactgcgggg ccccggcccc gtacgctact    9780

gcctgtggcc tcgacgtctg catttaccac acccacttcc accagcattg tccagtcaca    9840

atctggtgtg gccatccagc gggttctggt tcttgtagtg agtgcaaatc ccctgtatgg    9900

aaaggcacaa gccctttaga cgaggtgctg gaacaagtcc cgtataagcc cccacggacc    9960

gttatcatgc atgtggagca gggacttacc ccccttgacc caggtagata ccagactcgc  10020

cgcggattag tctctgtcag gcgtggaatc aggggaaatg aagttgaact accagacggt  10080

gattatgcta gtaccgcctt gctccctacc tgtaaagaga tcaacatggt cgctgtcgct  10140

tctaatgtat tgcgcagcag gttcatcatc ggtccacccg gtgctgggaa aacatactgg  10200

ctccttcaac aggttcagga tggtgatgtt atttacacac caactcacca gaccatgctt  10260

gacatgatta gagctttggg gacgtgccgg ttcaacgttc cggcaggcac aacgctgcaa  10320

ttccccgtcc cctcccgtac cggtccgtgg gttcgcattc tagccggcgg ttggtgtcct  10380

ggcaagaatt ccttcctgga tgaagcagca tattgcaatc accttgatgt tttgaggctt  10440

cttagcaaaa ctaccctcac ctgtctagga gacttcaaac aactccaccc agtgggtttt  10500

gattctcatt gctatgtttt tgacatcatg cctcaaactc aactgaagac catctggagg  10560

tttggacaga atatctgtga tgccatccag ccagattaca gggacaaact catgtccatg  10620

gtcaacacaa cccgtgtgac ctacgtggaa aaacctatca ggtatgggca agtcctcacc  10680

ccctaccaca gagaccgaga ggacgacgcc atcactattg actccagtca aggcgccaca  10740

ttcgatgtgg ttacactgca tttgcccact aaagattcac tcaacaggca aagagccctt  10800

gttgctatca ccagggccag acatgctatc tttgtgtatg acccacacag gcagctgcag  10860

agcttgtttg atcttcctgc aaaaggcaca cccgttaacc tcgcagtgca ccgcgacggg  10920

cagctgatcg tgctggatag aaataacaaa gaatgcacgg ttgctcaagc tctaggcaac  10980

ggggataaat ttagggccac agacaagcgt gttgtagatt ctctccgcgc tatttgtgct  11040

gacctagaag ggtcgagctc tccgctcccc aaggtcgcac acaacttggg attttatttc  11100

tcacctgatt taacacagtt tgccaaactc ccagcagaac ttgcacctca ctggcctgtg  11160

gtgacaaccc agaacaatga aaagtggcca gatcggctgg ttgccagcct tcgtcctatc  11220

catgagtata gccgcgcgtg catcggtgcc ggctatatgg ttggcccctc ggtgtttata  11280

ggcacccccg gggtcgtgtc atactatctc acaaaatttg ttaagggcga ggctcaagtg  11340

cttccgaaga cggtcttcag caccggccga attgaggtag attgccggga atatcttgac  11400

gatcgggagc gagaagttgc tgcgtccctc ccacatgcct tcattggcga cgtcaaaggc  11460

actaccgttg gaggatgtca tcatgtcacc tccagatacc tcccgcgctt cctccccaag  11520

gaatcagttg ctgtggtcgg ggtttcaagt cccggaaaag ccgcgaaagc attgtgcaca  11580

ctgacagatg tgtacctccc agaccttgaa gcctatctcc acccggagac ccagtccaag  11640

tgctggaaaa tgatgttgga cttcaaggaa gttcgactaa tggtctggaa agacaaaaca  11700

gcctatttcc aacttgaagg acgctatttc acctggtatc agcttgctag ctatgcctcg  11760

tacatccgtg ttcctgtcaa ctctactgtg tacttggacc cctgcatggg ccccgccctt  11820

tgcaacagga gagtcgttgg gtccactcac tggggggctg acctcgcagt caccccttat  11880

gattacggcg ctaaaattat cctgtctagc gcgtaccatg gtgaaatgcc ccccggatac  11940

aaaattctgg cgtgcgcgga attctcgttg gatgacccag tcaagtacaa acatacttgg  12000

gggtttgaat cggatacagc gtatctgtat gagttcaccg gaaacggtga ggattgggag  12060

gattacaatg atgcgtttcg tgcgcgccag gaagggaaaa tttataaggc cactgccacc  12120

agcatgaagt tttattttcc cccgggccct gtcattgaac caactttagg cctgaattga  12180

aatgaaatgg ggtccatgca aagccttttt gacaaaattg gtcaactttt tgtggatgct  12240

ttcacggaat tcttggtgtc cattgttgat atcatcatat ttttggccat tttgtttggc  12300

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ccagtgtcag gtggacattc ccacctgggg aatcaaacat cctctggggg tgctttggca  12480

ccataaggtg tcaaccctga ttgatgaaat ggtgtcgcgt cgaatgtacc gcatcatgga  12540

aaaagcagga caggctgcct ggaaacaggt ggtgagcgag gccacgctgt ctcgcattag  12600

tagtttggat gtggtggctc attttcaaca tcttgccgcc gttgaagccg agacctgtaa  12660

atatttggtc tctcggctac ccatgctaca caacctgcgc atgacggggt caaatgtaac  12720

catagtatat aatggtactt tgaatcaggt gtttgccatt ttcccgaccc ctggttcccg  12780

gccaaagctt catgattttc agcaatggct gatagctgtg cattcgtcca tattttcctc  12840

tgttgcagct tcttgtactc tgtttgttgt actgtggttg cgggtcccaa tgctacgtac  12900

tgtttttggt ttccgctggt taggggcaat ttttccttcg agctcttggt gaattacacg  12960

gtgtgcccac cttgcctcac ccggcaagca gccgcacagc gctacgaacc tggcaaggct  13020

ctttggtgca gaattgggta cgatcgatgt gaggaggacg atcacgacga gctagggttc  13080

gtgataccgt ctggcctctc cagcgaaggc cacttgacta gtgtttacgc ctggttggcg  13140

ttcctgtcct tcagctacac ggcccagttc catcccgaga tatttgggat agggaatgtg  13200

agtcaagttt atgttgacat caagcaccaa ttcatttgcg ctgttcacga cggggataac  13260

gccaccttgc ctcgccatga caatatttca gccgtatttc agacctacta ccaacaccag  13320

gtcgacggcg gcaattggtt tcacctggaa tggctgcgcc ctttcttttc ctcttggttg  13380

gttttaaatg tttcgtggtt tctcaggcgt tcgcctgcaa accatgtttc agttcgagtc  13440

tttcggacat caaaaccaac accaccgcag catcagactt cgttgtcctc caggacatca  13500

gctgccttag gcatggcgac tcgtcctctc cgacgattcg caaaagttct cagtgccgca  13560

cggcgatagg gacgcccgtg tacatcacca tcactgccaa tgtcacagat gaaaattatc  13620

tgcattcttc tgatctcctc atgctttctt cttgcctttt ctatgcttcc gagatgagtg  13680

aaaagggatt caaagtggtg tttggcaatg tgtcaggcat cgtggctgtg tgcgtcaact  13740

ttaccagcta cgtccaacac gtcaaggagt tcacccaacg ctccttagtg gtcgatcatg  13800

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tttttgccat cctactggca atttgaatgt ttaagtatgt tggggaagtg cttgaccgcg  13920

tgctgttgct cgcgattgct ttttttgtgg tgtatcgtgc cgttttatct tgctgtgctc  13980

gtcaacgcca gcaacaacaa cagctctcat attcagttga tttataactt aacgctatgt  14040

gagctgaatg gcacagattg gctggcacaa aaatttgact gggcagtgga gacttttgtc  14100

atcttccccg tgttgactca cattgtttcc tatggggcac tcaccaccag ccatttcctt  14160

gacacagttg gtctggccac tgtgtccacc gccggatatt atcacgggcg gtatgtcttg  14220

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aagaactgca tgtcctggcg ctactcttgt accagatata ccaacttcct tctggacact  14340

aagggcagac tctatcgttg gcggtcgccc gtcattgtgg agaaaggggg taaggttgag  14400

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gtgcttttac cttcgggtac atgacattcg tgcactttga gagcacaaat agggtcgcgc  14700

tcactatggg agcagtagtt gcacttcttt ggggagtgta ctcagccata gaaacctgga  14760

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ttgtcgtccg gcgtcccggc tccactacgg tcaacggcac attggtgccc gggttgaaaa  14940

gcctcgtgtt gggtggcaga aaagctgtta agcagggagt ggtaaacctt gttaaatatg  15000

ccaaataaca acggcaagca gcaaaagaaa aagaagggga atggccagcc agtcaatcag  15060

ctgtgccaaa tgctgggtaa gatcatcgcc caacaaaacc agtccagagg caagggaccg  15120

gggaagaaaa ataggaagaa aaacccggag aagccccatt tccctctagc gactgaagat  15180

gacgtcaggc atcactttac ccctagtgag cggcaattgt gtctgtcgtc gatccagact  15240

gccttcaatc agggcgctgg aacttgtgcc ctgtcagatt cagggaggat aagttacact  15300

gtggagttta gtttgccgac gcaacatact gtgcgtctga tccgcgccac agcatcaccc  15360

tcagcatgat gggctggcat tctttggcac ctcagtgtta gaattgggag aatgtgtggt 15420

gaatggcact gattgacact gtgcctctaa gtcacctatt caattagggc gaccgtgtgg 15480

gggtaaagtt taattggcga gaaccatgcg gccgtaatta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 15540

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa                               15572

<210>9

<211>15428

<212>DNA

<213>蓝耳病病毒

<400>9

atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg acatttgtat tgtcaggagc tgtgatcatt   60

gacacagccc aaagcttgct gcacagaaac acccttctgt gacagcctcc ttcaggggag  120

tttaggggtc tgtccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac  180

ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt  240

catggcggag ggccaagtct actgcacacg atgcctcagt gcacggtctc tccctcctct  300

gaatctccaa gttcctgaac tcggggtgct gggcctattc tataggcccg aagagccact  360

ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gagcctgctg  420

gctttctgcc atctttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aatctgaact ttcaacaaag  480

aatggtgcgg gtcgcagctg agctttacag agccggccag ctcacccctg cagtcttgaa  540

gactctacaa gtttatgaac ggggttgcca ctggtacccc attgttggac ctgttcctgg  600

agtggccgtt tatgccaact ccctacatgt gagtgataaa cctttcccgg gagcaactca  660

cgtgttaacc aacctgccgc tcccgcagag acccaagcct gacgattttt gcccctttga  720

gtgtgctatg gctactgtct atgacattgg tcatgacgcc gtcatgtatg tggccgaaga  780

gaaagtctcc tgggcccctc gtggcgggga tgaagtgaaa ttcgaacctg tccccgggga  840

gttgaagttg attgcgaacc gactccgcac ctccttcccg ccccaccacg cagtggacat  900

gtctaagttc accttcacag cccctgggcg tggtgtttct atgcgggtcg aacgccaaca  960

cggctgcctc cccgctgaca cagttcctga aggcaactgc tggtggagct tgttcaactt    1020

gctcccactg gaagttcaga acaaagaaat tcgtcatgcc ggccaatttg gctaccagac    1080

taagcatggt gtctctggca agtacctaca gcggaggctg caagttaatg gtcttcgagc    1140

agtaactgac ctaaatggac ctatcgtcgt acagtgcttc tccgttaagg agagttggat    1200

ccgccacttg aaactggcgg aagaacccag ctaccctggg tttgaggacc tcctcagaat    1260

aagggttgag cccaacacgt cgccattggc tgacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg    1320

caatcacaag tggtatggcg ctggaaagag agcaaggaaa gcacgctcta gtgcgactgc    1380

tacagtcgct ggccgcgctt tgcccgttcg tgaaacccgg caggtcgagg agcacgaggt    1440

tgccggcgcc aacaaggctg agcacctcaa acactactcc ccgcctgccg aagggaattg    1500

tggttggcac tgcatttccg ccatcggcaa ccggatgttg aattccaaat ttgaaaccac    1560

ccttcccgaa agagtgagac ctccagatga ctgggctact gatgaggatc ttgtgaatgc    1620

catccaaatc ctcagactcc ctgcggcctt ggacaggaac ggtgcttgtg ctagcgccaa    1680

gtacgtactt aagctggaag gtgagcattg gactgtcact gtgacccctg ggatgtcccc    1740

ttctttgctc cctcttgaat gtgttcaggg ctgttgcgag cataagggcg gtcttggttc    1800

cccagatgca gtcgaggttt tcggatttga ccctgcctgc cttgactggc tggctgaggt    1860

gatgcacttg cctagcaatg ccatcccagc cgctctggcc gaaatgtccg gcgattccaa    1920

tcgtccggct tccccggtca ccaccgtgtg gactgtttcg cagttcttag cccgccacaa    1980

cggagggaat caccctgacc aaatacgctt agggaaaatt atcagccttt gtcaggtgat    2040

tgaggactgc tgctgttccc agaacaaaac caaccgggtc accccggagg aggtcgcagc    2100

aaagattgac ctgtacctcc gtggtgcaac aaatcttgaa gaatgcttgg ccaggcttga    2160

gaaagcgcgc ccgccacgcg taatggacac ctcctttgat tgggatgttg tgctccctgg    2220

ggttgaggcg gcaactcaaa cgaccgaact gccccaagtc aaccagtgtc gcgctctggt    2280

ccctgttgtg actcaaaagt ccttggacaa caactcggtc cctctgaccg ccttttcact    2340

ggctaactac tactaccgcg cgcaaggtga cgaagttcgt caccgtgaaa gactaaccgc    2400

cgtgctctct aagttggaag gggttgttcg agaagaatac gggctcatgc caaccgggcc    2460

tggtccacgg cccacactgc cacgcgggct cgacgaactc aaggaccaga tggaggtgga    2520

cttgctgaaa ctggctaacg cccagatgac ttcggacatg atggcctggg cagtcgagca    2580

ggttgaccta aaaacttggg tcaagaacta tccgcggtgg acaccaccac ctcctccgcc    2640

aatagttcag cctcgaaaaa cgaagcttgt caagagctta ccagagagca agcctgttcc    2700

tgcaccgcgt aggaaggtca ggtccgattg tgactgcccc accctatcgg gcaacaatct    2760

tcctgacagt tgggaagatt tggctgttgg ttgcccctct gatctcccta cctcacctga    2820

gccggtaaca cctttgagtg agccggcatc tgtgtccgca ccgcgacgct cttttaggcc    2880

ggtgaagcct ttgagtgaac cagtcccagt ccctgcaccg cgcaagactg tgtcccgacc    2940

ggcaacacct ctgagtgagc cgatccctgt gcccgcaccg cgacgcaagt ttcagcaggt    3000

agaaaaagtg aatccggcgg cggcaaccct ggggtgccaa gacgagtttc cagatttgtc    3060

tgcatcctcg catactgaat atgaggcgtc tccccttgta ctaccgcaga acggggacgt    3120

tcttgaagtg gaggagcggg aagctgagga aatcctgagt ggaatctcag acatactgga    3180

tgccatcaaa ccggcatctg catcatcaag cagctccctg tcaagtgtgg cgatcacacg    3240

cccgaaatac tcagctcaag ccatcattga ctcgggtggg ccctacagcg ggcatctcca    3300

agaggtgaag gaaacatgcc taagcatcat gagtgaggca tgtgatgtga ccaagcttga    3360

tgaccctgcc acgcaggaat ggctttctcg catgtgggat agggtggaca tgctgacttg    3420

gcgcaatacg tctgttcacc aggcgtctcg caccttggac gacagattta agtttctccc    3480

gaagatgata cttgaaacac cgccgcccta cccgtgtggg ttcgtgatga tgcctcgcac    3540

acctgcaccc tccgtgggtg cggagagcga cctcactatt ggctcagtcg ctactgagga    3600

cgttccacgc atcttcggga aagtaaatga tgtctgcaag atgatcgacc agagaccctt    3660

ggtactcttt gaaaatgagc tggcagatga ccaacctgcc agagatcctc ggacatcatc    3720

gcagaggttt gacgggagca caccagctcc gcccgcaggc acggatggca ccggtttggc    3780

ttcgggccct ggagtgagag aagtggattc atgtgaggcg agctcaaccg agaaaattga    3840

acagcccttc gtgttgaacg gcggcgccag cacacaggcg tcaacgttta ccaatttgcc    3900

gcctccaggc ggtatagatg cgggcgggag tgggccgtta caaacggtgc gaaagaaggc    3960

tgaacggttc tttgacctac taagccgtca ggtttttaat ctcgtctccc atctccctgt    4020

tttcttctca cgccttttca aacctggcgg tgactattct ccgggtgatt ggggttttgc    4080

agcttttact ttattgtgcc tctttttgtg ttacagttac ccggcctttg gtgctgttcc    4140

cctcttgggt gtattttctg ggtcttctcg gcgtgttcga atggggtttt ttggctgctg    4200

gttggctttt gctgttagtc tgttcaaacc tgtgtccgac ccagtcggcg ctgcttgtga    4260

atttgattcg ccagagtgta gaaacatcct tcattctttt gagcttctca aaccttggga    4320

ccctgttcgc ggccttgttg tgggccccgt cggtctcagt cttgccattt ttggcaggtt    4380

attgggcggg gcacgccaca tctggcactt tttgcttagg tttggcattg ttgcagattg    4440

tatcttggct ggagcttatg tgctttctca aggcaggtgt aaaaagtgct ggggatcttg    4500

tataagaact gctcctaatg aggtcgcctt taacgtgttt ccttttacac gtgcgaccag    4560

gtcgtcactt atcgacctgt gcaatcggtt ttgcgcgcca aaaggtatgg accccatttt    4620

cttcgccact gggtggcgcg ggtgctggac cggccgaagc cccattgagc aaccctctga    4680

aaaacccatc gcgtttgccc agttggatga aaaaaagatt acggctagga ctgtggtcgc    4740

ccagccctat gaccccaacc aagctgtaaa atgcttgcgg gtattgcagg cgggcggggt    4800

gatggtggct gaggcagtcc caaaagtggt caaagtttct gctgtcccat tccgagcccc    4860

cttctttccc accggagtga aagttgatcc tgaatgcagg attgtggttg accccgacac    4920

tttcactgca gccctccgat ctgggtactc caccacaaac ctcgtccttg gtgtggggga    4980

ctttgcccag ctgaatggat taaaaatcag gcaaatttcc aagccttcag ggggaggtcc    5040

acacctcatg gctgccctgc atgttgcttg ctctatggct ctgcacatgc ttgttgggat    5100

ttatgtgact gctgtgggtt cttgcggcac cggcactaac gatccgtggt gcgccaaccc    5160

gtttgccgtc cctggctacg gacctggctc tctctgcacg tccagattgt gcatctccca    5220

acatggcctt accctaccct tgacagcact tgtggcggga ttcggctttc aggaaattgc    5280

cttggttatt ttgatttttg tttctatcgg aggcatggct catagattga gttgcaaggc    5340

tgatatgctg tgtattttgt ttgcaatcgc cagctatgtt tgggtacctc ttacctggtt    5400

gctttgtgtg tttccttgct ggttgcgctg tttttcgttg caccccctca ccatcctatg    5460

gttggtgttt ttcctgattt ctgtaaatat gccttcagga atcttggcct tggtgttgtt    5520

gatttctctc tggcttcttg gtcgttatac caacgttgcc ggtcttgtca ctccctatga    558Q

cattcatcat tacaccagtg gcccccgcgg tgttgccgcc ttggctaccg caccagatgg    5640

gacctacttg gccgctgtcc gccgcgccgc gttgactggt cgcaccatgc tgtttacccc    5700

gtctcagctc gggtcccttc ttgagggcgc tttcagaact cgaaagccct cactgaacac    5760

cgttaatgtg gtcgggtcct ccatgggctc tggcggggtg ttcatcatcg acgggaaaat    5820

taagtgcgta actgctgcac atgtccttac gggtaattca gctagggttt ccggggttgg    5880

cttcaatcaa atgcttgact tcgatgtgaa aggagacttc gccatagccg attgcccaga    5940

ctggcaaggg gctgctccca agacccaatt ctgcgaggaa ggatggactg gccgggccta    6000

ttggctaacg tcttctggtg tcgaacccgg cgtcattgga aaaggattcg ccttctgctt    6060

caccgcgtgc ggcgattccg gatccccagt aatcaccgag gccggcgagc ttatcggcgt    6120

tcacacgggg tcaaataaac aaggaggagg catcgtcacg cgcccctcag gccagttttg    6180

tagtgtggca cccgtcaaat taagcgaact aagtgaattc tttgcagggc ctaaggtccc    6240

gctcggtgat gtgaaagttg gcagccacat aattgaagac gtaggcgagg tgccttcaga    6300

tctttgcgcc ttgcttgctg ccaaacctga actggaagga ggcctctcca ccgttcaact    6360

tctgtgtgtg tttttcctcc tgtggagaat gatgggacat gcctggacgc ccttggttgc    6420

cgtagggttt tttatcttga atgaggtcct cccagctgtc ctggtccgga gtgttttctc    6480

ctttggaatg tttgtgctat cctggctcac accatggtct gcgcaagttc tgatgatcag    6540

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gagtttgagc acttatgcat tcctgcctcg gataatggtt gtgacttcac cagtcccagt    6720

ggttgcgtgt ggtgttgtgc acctacttgc catcattttg tacttgttta agtaccgctg    6780

cctgcacaac atccttgttg gcgatggagt gttctctgcg gctttcttcc tgcgatattt    6840

tgccgaggga aagttgaggg agggggtgtc gcaatcctgc gggatgaatc atgagtcact    6900

taccggtgcc ctcgctatga gactcaatga cgaggacttg gatttcctca cgaaatggac    6960

tgatttcaag tgctttgttt ctgcgtccaa catgagaaat gctgcgggcc aattcatcga    7020

ggctgcctat gctaaagcac ttagagtaga acttgcccag ttggtgcagg ttgataaggt    7080

tcggggtact ttggccaaac ttgaagcttt tgccgacacc gtggcacccc aactctcgcc    7140

cggtgacatt gttgtcgctc ttggccatac gcctgttggc agtatcttcg acctgaaggt    7200

tggtaacacc aagcacactc tccaagccat cgagaccagg gtccttgctg ggtccaaaat    7260

gaccgtggcg cgcgtcgtcg atccgacccc cacgctccca cccgcacccg tgcccatccc    7320

cctcccaccg aaggttttgg agaacggtcc aaacgcttgg ggggatgaag accgtttgaa    7380

taaaaagagg aggcgcagga tggaagccct cggcatctat gttatgggcg ggaaaaagta    7440

ccagaaattt tgggacaaga attccggtga cgtgttttat gaggaggtcc ataacaacac    7500

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tttgtgtggg catgtcacca ttgaagatag ggcttaccat gtttacacct ccccatctgg    7620

taagaaattc ctagtccccg tcaacccaga gaacggaaga gttcaatggg aggctgcaaa    7680

gctttccgtt gagcaggccc ttggtatgat gaacgtcgac ggcgagctga ctgccaagga    7740

actggagaaa ctgaaaagaa taattgacaa actccagggc ctgactaagg agcagtgttt    7800

aaactgctag ccgctagcgg cttgacccgc tgtggtcgcg gcggcttggt tgttactgag    7860

acagcggtaa aaatagtcaa atttcacaac cggaccttca ccttgggacc tgtaaattta    7920

aaagtggcta gtgaggttga gctaaaagac gcggtcgagc acaaccaaca cccggttgct    7980

agaccagtcg atggtggtgt tgtgctcatg cgttccgcgg ttccctcgct tatagatgtc    8040

ctgatctccg gtgctgatgc atctcccaaa ttacttgccc atcacggacc gggcaacacc    8100

gggatcgatg gcacgctctg ggattttgag tccgaagcca ctaaagagga agtcgcactc    8160

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ccttacaagc tgtaccctat taggggcaac cctgagcggg taaagggagt tttacggaat    8280

acaaggtttg gagacatacc ttataaaacc cccagtgaca ctggaagccc agtgcacgcg    8340

gctgcctgcc tcacgcctaa caccactccg gtgactgacg ggcgctccgt cttggccacg    8400

accatgccct ccgggtttga gttgtatgta ccgaccatac cagcgtctgt ccttgactat    8460

cttgattcta ggcccgactg ccctaaacag ttgacggagc acggctgtga agatgccgca    8520

ctgagagacc tctccaagta tgacttgtcc acccaaggct ttgttttgcc tggagttctt    8580

cgccttgtgc ggaagtacct gtttgcccat gtgggcaaat gcccgcccgt tcatcggcct    8640

tccacttacc ctgccaagaa ttctatggct ggaataaatg ggaacaggtt tccaaccaag    8700

gacatccaga gcgtccctga aatcgacgtt ctgtgcgcac aggctgtgcg agaaaattgg    8760

caaactgtta ccccttgtac cctcaagaaa cagtattgtg ggaagaagaa gactaggacc    8820

atactcggca ccaataactt tatagcgctg gctcaccgtg cagcgttgag tggtgtcacc    8880

cagggcttca tgaaaaaggc gtttaactcg cctatcgccc tcgggaaaaa caaatttaag    8940

gagctacaga ctccggtcct aggcaggtgc cttgaagctg atcttgcatc ctgcgatcga    9000

tctacacctg caattgtccg ctggtttgcc gccaatcttc tttataagct tgcctgtgct    9060

gaagagcatc taccgtcgta tgtgctgaac tgctgtcacg acttactggt cacgcagtcc   9120

ggtgcagtga ctaagagagg cggcctgtcg tctggcgacc cgataacctc tgtgtctaat   9180

accatttaca gcttggtgat ctatgcacag cacatggtac ttagttgctt caaaagtggt   9240

cacccccatg gccttctgtt cttacaagac caactaaagt ttgaggacat gctcaaggtt   9300

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aactaccatt ggtgggttga acatctgaat ttgatgctgg ggtttcagac ggacccaaag   9420

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tatgatcctg aatggtttga agaacttgta gttgggatag cgcagtgcgc ccgcaaagac   9660

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ggcaagaatt ccttcctgga tgaagcagca tattgcaatc accttgatgt tttgaggctt  10440

cttagcaaaa ctaccctcac ctgtctagga gacttcaaac aactccaccc agtgggtttt  10500

gattctcatt gctatgtttt tgacatcatg cctcaaactc aactgaagac catctggagg  10560

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gtcaacacaa cccgtgtgac ctacgtggaa aaacctatca ggtatgggca agtcctcacc  10680

ccctaccaca gagaccgaga ggacgacgcc atcactattg actccagtca aggcgccaca  10740

ttcgatgtgg ttacactgca tttgcccact aaagattcac tcaacaggca aagagccctt  10800

gttgctatca ccagggccag acatgctatc tttgtgtatg acccacacag gcagctgcag  10860

agcttgtttg atcttcctgc aaaaggcaca cccgttaacc tcgcagtgca ccgcgacggg  10920

cagctgatcg tgctggatag aaataacaaa gaatgcacgg ttgctcaagc tctaggcaac  10980

ggggataaat ttagggccac agacaagcgt gttgtagatt ctctccgcgc tatttgtgct  11040

gacctagaag ggtcgagctc tccgctcccc aaggtcgcac acaacttggg attttatttc  11100

tcacctgatt taacacagtt tgccaaactc ccagcagaac ttgcacctca ctggcctgtg  11160

gtgacaaccc agaacaatga aaagtggcca gatcggctgg ttgccagcct tcgtcctatc  11220

catgagtata gccgcgcgtg catcggtgcc ggctatatgg ttggcccctc ggtgtttata  11280

ggcacccccg gggtcgtgtc atactatctc acaaaatttg ttaagggcga ggctcaagtg  11340

cttccgaaga cggtcttcag caccggccga attgaggtag attgccggga atatcttgac  11400

gatcgggagc gagaagttgc tgcgtccctc ccacatgcct tcattggcga cgtcaaaggc  11460

actaccgttg gaggatgtca tcatgtcacc tccagatacc tcccgcgctt cctccccaag  11520

gaatcagttg ctgtggtcgg ggtttcaagt cccggaaaag ccgcgaaagc attgtgcaca  11580

ctgacagatg tgtacctccc agaccttgaa gcctatctcc acccggagac ccagtccaag  11640

tgctggaaaa tgatgttgga cttcaaggaa gttcgactaa tggtctggaa agacaaaaca  11700

gcctatttcc aacttgaagg acgctatttc acctggtatc agcttgctag ctatgcctcg  11760

tacatccgtg ttcctgtcaa ctctactgtg tacttggacc cctgcatggg ccccgccctt  11820

tgcaacagga gagtcgttgg gtccactcac tggggggctg acctcgcagt caccccttat  11880

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ccgaaatt                                                           15428

Claims (11)

1.一种高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：根据蓝耳病病毒基因相对保守区的序列设计多对引物，利用高致病性猪蓝耳病病毒cDNA为模板，分段扩增蓝耳病病毒基因序列，然后将扩增出的序列依次连接到合适的载体中，获得猪蓝耳病病毒重组质粒。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述蓝耳病病毒基因分为5段扩增，序列分别如SEQ ID NO：1-5所示。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述载体为pBlueScript II SK(+)。

4.如权利要求1-3中任一项所述重组质粒构建的遗传工程疫苗，其特征在于，所述疫苗为编码结构蛋白的序列和3’UTR基因被所述重组质粒的相应的编码结构蛋白的序列以及3’UTR基因所替代的弱毒疫苗株。

5.如权利要求4所述的遗传工程疫苗，其特征在于，所述弱毒疫苗株为pAPRRS。

6.如权利要求4所述的遗传工程疫苗，其特征在于，所述结构蛋白为ORF4、ORF5、ORF6、ORF7或ORF5、ORF6、ORF7所编码的结构蛋白。

7.如权利要求6所述的遗传工程疫苗，其特征在于，所述ORF4的序列如SEQ ID NO：6的位点13151-13687所示，ORF5的序列如SEQ ID NO：6的位点13698-14300所示。

8.如权利要求4所述的遗传工程疫苗，其特征在于，所述3’UTR序列如SEQ ID NO：6的位点15171-15373所示。

9.如权利要求4所述的遗传工程疫苗，其特征在于，所述疫苗序列选自SEQ IDNO：11-13中任一序列。

10.如权利要求4-9中任一项所述的疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)扩增出重组质粒的结构蛋白基因；

B)酶切扩增出的结构蛋白基因和弱毒疫苗株；

C)连接酶切后的结构蛋白基因和弱毒疫苗株。

11.如权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述方法还包括转化宿主菌和阳性克隆的筛选步骤。

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