CN112094952A - 一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对及其应用 - Google Patents

一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对及其应用 Download PDF

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刘霄
赵谦
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Abstract

本发明公开了一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对及其应用，包括12对引物，通过12引物进行(1)感染猪蓝耳病毒的样品预处理，(2)核酸提取，(3)扩增，(4)分析，本发明不仅可用于猪蓝耳病毒全基因组的扩增与测序，而且还可用于蓝耳病毒的快速检测与鉴定，具有操作简便、特异性强、灵敏度高和准确性好的优点，也为蓝耳病毒的进化分析、分子流行病学研究及科学防控提供了有力的技术手段。

Description

一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对及其应用
技术领域
本发明涉及检测领域，更具体的说，是一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起一种猪的传染病疾病，并且在世界范围内给养猪业造成巨大经济损失。1987年，美国首次报道了PRRS的发生，随后几年内PRRS便在全球范围内流行，给养猪业造成巨大经济损失，在欧美等国的一次大流行就造成了上百万头猪的死亡。
我国最早于1995年发现该病。随后PRRS先后在全国各地相继发生，造成危害的范围持续扩大，流行态势呈上升趋势。2006年夏季，我国江西、江苏、安徽、浙江等地部分猪场相继暴发了高发病率和高死亡率的“高热病”，农业部迅即组织专家联合攻关，研究发现新的变异PRRSV引起了以持续高热为主要特征的高致病性PRRS，定名为“高致病性猪蓝耳病”(HP-PRRS)。至2007年8月，全国共有26个省份发病累计病猪25.7万头、病死6.8万头、扑杀17.5万头(农业部新闻发布会)。2009年和2010年在中国及周边东南亚国家再次发生PRRS疫情，给养猪业造成了巨大的经济损失。HP-PRRSV占国内流行毒株的比例在2006至2011年期间，从78.0％上升到88.9％，成为国内优势毒株。2013年，国内发现了在Nsp2基因存在111+1+19个氨基酸不连续缺失的PRRSV毒株，与美国流行毒株NADC30毒株类似，因此将该类毒株命名为NADC30-like毒株，随后NADC30-like毒株逐步在我国流行。
因此，建立一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物，不仅可以用于临床快速检测与鉴定，而且也为蓝耳病毒的进化分析、分子流行病学研究及科学防控提供了有力的技术手段。
发明内容
本发明提供了一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对及其应用。
本发明的方案是：
一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对，包括12对引物，12对引物分别为1引物片段、2引物片段、3引物片段、4引物片段、5引物片段、6引物片段、7引物片段、8引物片段、9引物片段、10引物片段、11引物片段和12引物片段，1引物片段包括引物序列1F：5’-ATGACGTATTGGTGTTGGCTC-3’和1R：5’-CACCATGCTTGGTTTGATAGCC-3’；2引物片段包括引物序列2F：5'-GTGCTATGGCTGACGTCTATGACA-3’和2R：5'-AAGACTTGTTGCACCACGGAGGTA-3’；3引物片段包括引物序列3F：5'-CAAGTTATTGAGGATTGCTGCTGC-3’和3R：5'-CGTGTGAGGTAACATCACAAACCC-3’；4引物片段包括引物序列4F：5'-CATGTGGGATAGGGTTGACATGCT-3’和4R：5'-CTGATCTTTAGTCCGTTCAGCTGG-3’；5引物片段包括引物序列5F：5'-ACTGTGGTCGCTCAGCCTTATGAT-3’和5R：5'-TTCCAGTTCAGGTTTGGCAGCAA-3’；6引物片段包括引物序列6F：5'-CAGGCCAGTTTTGTAATGTG-3’和6R：5'-GCGGCTAGCAGTTTAAACACTGCT-3’；7引物片段包括引物序列7F：5'-GCCCTTGGTATGATGAACGT-3’和7R：5'-AGATGTTCAACCCACCAGTGGT-3’；8引物片段包括引物序列8F：5'-CAGCACATGGTGCTCAGTTACT-3’和8R：5'-TCTGCAATTGCCTGTGTGGGTCAT-3’；9引物片段包括引物序列9F：5'-ACTCCAGTCAAGGCGCCACATT-3’和9R：5'-CTTCTGTAATTGCTCAGGGTGAACG-3’；10引物片段包括引物序列10F：5'-TCGGATACAGCGTATCTGTACGAG-3’和10R：5'-AGCCACGATGCCTGACACATT-3’；11引物片段包括引物序列11F：5'-GACATCAGCTGCCTTAGGCAT-3’和11R：5'-AACAGCTTTTCTGCCACCCAACACG-3’；12引物片段包括引物序列12F：5'-TGATAACCACGCATTTGTCGTCCG-3’和12R：5'-AATTACGGCCGCATGGTTCTCGCCA-3’。
本发明还提供一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对的应用，包括下列步骤：
(1)感染猪蓝耳病毒的样品预处理，剪取感染猪蓝耳病毒的猪仔的组织病料新鲜切面处约2～3cm3大小，在已预冷的研钵内进行研磨，研磨充分后取病料置于离心管内备用；
(2)核酸提取，将盛有病料的离心管通过病毒病毒提取试剂盒提取RNA；
(3)扩增，取步骤(2)中提取的RNA为模板用权利要求1中每对所述引物进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物，每对引物的片段扩增3次；
(4)分析，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统上观察并拍照，并对观察到的结果进行统计和分析。
作为优选的技术方案，所述步骤(3)中的RT-PCR扩增反应的猪蓝耳病毒特异性基因扩增反转录体系为：在离心管中配制模板RNA/引物混合液，2×ES Reaction Mix 5μL，2×ES Reaction Mix 5μL，EasyScriptTMⅡRT/RI Emzyme Mix 4μL，下游引物1μL，模板RNA2μL，反应体系为12μL，42℃反应30min，然后85℃恒温5min，得到的cDNA用于PCR扩增。
作为优选的技术方案，所述步骤(3)中RT-PCR扩增反应的PCR反应体系为：2×PCRMix 12.5μL，10μmol/L的上游引物与10μmol/L的下游引物各0.5μL，反转录产物1μL，ddH2O10.5μL，反应体系为25μL。
作为优选的技术方案，所述步骤(3)中RT-PCR反应程序：1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，59℃退火30s，共计30个循环；3)72℃延伸60s；4)72℃终延伸5min。
作为优选的技术方案，还包括步骤(5)目的片段的纯化，将步骤(3)中通过双倍体系的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统拍照鉴定后，用刀片将对应阳性PCR产物的琼脂糖凝胶切下来，然后通过胶回收试剂盒进行胶回收，并用琼脂糖凝胶电泳鉴定回收结果；
(6)目的基因与pMD-18T载体的连接、转化，将纯化后的胶回收PCR产物与pMD-18T载体连接，并将重组质粒转入感受态细胞DH5α，筛选、扩大培养后提取质粒；
(7)重组质粒的酶切鉴定，将抽提的重组质粒使用酶切鉴定，37℃水浴作用1.5～3h；取9μL酶切产物和1μL 10×Loading Buffer混合后，加入1.0％琼脂糖凝胶中，在120V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上观察结果；酶切结果符合预期后送出测序；
(8)氨基酸遗传进化分析，将酶切鉴定正确的质粒进行测序，利用DNAStar5.0软件将12段测序结果进行拼接；利用Editseq与SeqMan软件将拼接成功的全基因序列与参考毒株全基因序列进行比对，利用Megalign、MEGA7.0软件做同源性比较、遗传进化分析、关键氨基酸位点变异分析。
作为优选的技术方案，所述步骤6)中与pMD-18T载体连接体系如下：T4 DNALigase 1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5μL，50ng/μL的pMD-18T Vector 1μL，胶回收PCR产物8μL，去离子水12.5μL，总反应体系25μL。
由于采用了上述技术方案，一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对及其应用，(1)感染猪蓝耳病毒的样品预处理，剪取感染猪蓝耳病毒的猪仔的组织病料新鲜切面处约2～3cm3大小，在已预冷的研钵内进行研磨，研磨充分后取病料置于离心管内备用；(2)核酸提取，将盛有病料的离心管通过病毒病毒提取试剂盒提取RNA；(3)扩增，取步骤(2)中提取的RNA为模板用权利要求1中每对所述引物进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物，每对引物的片段扩增3次；(4)分析，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统上观察并拍照，并对观察到的结果进行统计和分析。
发明优点：本发明成套引物共包括12对引物，所述猪蓝耳病毒全基因组测序是以感染猪蓝耳病毒仔猪样品的RNA为模板，利用12对引物对进行RT-PCR扩增与测序，同时公开了RT-PCR反应体系、反应条件、pMD-18T载体的连接、转化体系。本发明12对引物所有体系一致、退火温度一致，扩增条件一致的特点，省去了一个引物一个最适退火温度的操作，使操作方法更加简便，省时、省力，同一反应程序可以同时扩增多种基因片段，可快速获得猪蓝耳病毒的基因组全长序列。
本发明的方法不仅可用于猪蓝耳病毒全基因组的扩增与测序，而且还可用于蓝耳病毒的快速检测与鉴定，具有操作简便、特异性强、灵敏度高和准确性好的优点。也为蓝耳病毒的进化分析、分子流行病学研究及科学防控提供了有力的技术手段。
附图说明
图1为PRRSV基因扩增结果；M：DL5000 DNA分子质量标准；1至12引物片段：PRRSV各片段PCR扩增结果；M:DL5000 DNA Marker；1-12:PCR amplification results of PRRSV。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对及其应用，以解决上述背景技术中的问题。
一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对，包括12对引物，12对引物分别为1引物片段、2引物片段、3引物片段、4引物片段、5引物片段、6引物片段、7引物片段、8引物片段、9引物片段、10引物片段、11引物片段和12引物片段，1引物片段包括引物序列1F：5’-ATGACGTATTGGTGTTGGCTC-3’和1R：5’-CACCATGCTTGGTTTGATAGCC-3’；2引物片段包括引物序列2F：5'-GTGCTATGGCTGACGTCTATGACA-3’和2R：5'-AAGACTTGTTGCACCACGGAGGTA-3’；3引物片段包括引物序列3F：5'-CAAGTTATTGAGGATTGCTGCTGC-3’和3R：5'-CGTGTGAGGTAACATCACAAACCC-3’；4引物片段包括引物序列4F：5'-CATGTGGGATAGGGTTGACATGCT-3’和4R：5'-CTGATCTTTAGTCCGTTCAGCTGG-3’；5引物片段包括引物序列5F：5'-ACTGTGGTCGCTCAGCCTTATGAT-3’和5R：5'-TTCCAGTTCAGGTTTGGCAGCAA-3’；6引物片段包括引物序列6F：5'-CAGGCCAGTTTTGTAATGTG-3’和6R：5'-GCGGCTAGCAGTTTAAACACTGCT-3’；7引物片段包括引物序列7F：5'-GCCCTTGGTATGATGAACGT-3’和7R：5'-AGATGTTCAACCCACCAGTGGT-3’；8引物片段包括引物序列8F：5'-CAGCACATGGTGCTCAGTTACT-3’和8R：5'-TCTGCAATTGCCTGTGTGGGTCAT-3’；9引物片段包括引物序列9F：5'-ACTCCAGTCAAGGCGCCACATT-3’和9R：5'-CTTCTGTAATTGCTCAGGGTGAACG-3’；10引物片段包括引物序列10F：5'-TCGGATACAGCGTATCTGTACGAG-3’和10R：5'-AGCCACGATGCCTGACACATT-3’；11引物片段包括引物序列11F：5'-GACATCAGCTGCCTTAGGCAT-3’和11R：5'-AACAGCTTTTCTGCCACCCAACACG-3’；12引物片段包括引物序列12F：5'-TGATAACCACGCATTTGTCGTCCG-3’和12R：5'-AATTACGGCCGCATGGTTCTCGCCA-3’。
本发明还提供一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对的应用，包括下列步骤：
(1)感染猪蓝耳病毒的样品预处理，剪取感染猪蓝耳病毒的猪仔的组织病料新鲜切面处约2～3cm3大小，在已预冷的研钵内进行研磨，研磨充分后取病料置于离心管内备用；
(2)核酸提取，将盛有病料的离心管通过病毒病毒提取试剂盒提取RNA；
(3)扩增，取步骤(2)中提取的RNA为模板用权利要求1中每对所述引物进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物，每对引物的片段扩增3次；
(4)分析，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统上观察并拍照，并对观察到的结果进行统计和分析。
所述步骤(3)中的RT-PCR扩增反应的猪蓝耳病毒特异性基因扩增反转录体系为：在离心管中配制模板RNA/引物混合液，2×ES Reaction Mix 5μL，2×ES Reaction Mix 5μL，EasyScriptTMⅡRT/RI Emzyme Mix 4μL，下游引物1μL，模板RNA 2μL，反应体系为12μL，42℃反应30min，然后85℃恒温5min，得到的cDNA用于PCR扩增。
所述步骤(3)中RT-PCR扩增反应的PCR反应体系为：2×PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的上游引物与10μmol/L的下游引物各0.5μL，反转录产物1μL，ddH2O 10.5μL，反应体系为25μL。
所述步骤(3)中RT-PCR反应程序：1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，59℃退火30s，共计30个循环；3)72℃延伸60s；4)72℃终延伸5min。
还包括步骤(5)目的片段的纯化，将步骤(3)中通过双倍体系的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统拍照鉴定后，用刀片将对应阳性PCR产物的琼脂糖凝胶切下来，然后通过胶回收试剂盒进行胶回收，并用琼脂糖凝胶电泳鉴定回收结果；
(6)目的基因与pMD-18T载体的连接、转化，将纯化后的胶回收PCR产物与pMD-18T载体连接，并将重组质粒转入感受态细胞DH5α，筛选、扩大培养后提取质粒；
(7)重组质粒的酶切鉴定，将抽提的重组质粒使用酶切鉴定，37℃水浴作用1.5～3h；取9μL酶切产物和1μL 10×Loading Buffer混合后，加入1.0％琼脂糖凝胶中，在120V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上观察结果；酶切结果符合预期后送出测序；
(8)氨基酸遗传进化分析，将酶切鉴定正确的质粒进行测序，利用DNAStar5.0软件将12段测序结果进行拼接；利用Editseq与SeqMan软件将拼接成功的全基因序列与参考毒株全基因序列进行比对，利用Megalign、MEGA7.0软件做同源性比较、遗传进化分析、关键氨基酸位点变异分析。
所述步骤6)中与pMD-18T载体连接体系如下：T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 DNALigase Buffer 2.5μL，50ng/μL的pMD-18T Vector 1μL，胶回收PCR产物8μL，去离子水12.5μL，总反应体系25μL。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例：
主要分子生物试剂
病毒DNA/RNA提取试剂盒购自无锡百泰克生物技术有限公司，primeScriptTM OneStep RT-PCR Kit Ver.2、核酸染色剂、DNA Marker1000和6×Loading Buffer购自大连宝生物技术有限公司；胰蛋白胨(TRYPTONE)、酵母提取物(YEAST EXTRACT)购自OXOID公司；氨苄青霉素购自上海生物工程有限公司；pMDTM 18-T Vector、E.coli Competent Cells DH5α、BamH I、Hind III、T4 DNA ligase、DNA Marker DL2000等均购自大连宝生物技术有限公司；胶回收纯化试剂盒购自北京百泰克公司。
常规试剂
氯仿、异丙醇、乙醇(无水乙醇和75％、95％乙醇)、电泳液、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉、Tris饱和酚、异戊醇、醋酸钠均为分析纯，由楚雄州动物疫病预防控制中心提供。
主要仪器设备
1300ERIES A2生物安全柜(Thermo Scientific公司)；Forma SoriesⅡ型二氧化碳培养箱(Thermo公司)；生物倒置显微镜(OLYMPUS公司)；DHG-9240A型电热恒温型鼓风干燥箱(上海中友仪器设备有限公司)；立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；移液器(DRAGON公司)；5430R型高速冷冻离心机(Eppendorf)；721BR14290凝胶成像系统(Bio-RAD)；电泳仪(北京六一仪器厂)；C1000TouchPCR仪(MJ Bio-RAD)；恒温培养摇床(上海一恒科学仪器有限公司)；电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂)；NP968-S全自动核酸提取仪(西安天隆科技有限公司)PHS-3D型PH计(上海精密科学仪器有限公司)，由楚雄州动物疫病预防控制中心提供。
参考序列
将欧洲型参考毒株LV、美洲型参考毒株VR-2332、弱毒疫苗株RespPRRS、国内经典代表毒株CH-1a和HP-PRRSV代表毒株JXA1等33条国内外已发表的基因序列作为参考序列。毒株名称、GenBank登录号及来源见表1。
表1参考毒株及其来源信息
Figure BDA0002747324630000071
Figure BDA0002747324630000081
续表2.1
Figure BDA0002747324630000082
PRRSV检测引物设计
根据GenBank公布的PRRSV毒株序列，利用Primer 5.0软件设计扩增PRRSV全基因的引物，共12对(PRRSV 1-12)，见表2。
表2引物序列
Figure BDA0002747324630000091
样品病料处理
剪取组织病料新鲜切面处约2～3cm3大小，在已预冷的研钵内进行研磨，研磨充分后取200mg左右的病料置于1.5ml离心管内备用。
核酸提取
按照试剂盒说明书进行提取。
RT-PCR检测
将提取的RNA采用设计的引物进行扩增，每个片段扩增3次，体系和程序如下：(1)在200μL离心管中配制下列表3模板RNA/引物混合液，反应体系为12μL。
表3 PRRSV特异性基因扩增反转录体系
Figure BDA0002747324630000101
42℃反应30min，然后85℃恒温5min，得到的cDNA即可用于PCR扩增。
(2)PCR反应体系按下列表4组成配制PCR反应液，反应体系为25μL。
表4 PRRSV特异性基因PCR扩增体系
Figure BDA0002747324630000102
(3)PCR扩增程序：
Figure BDA0002747324630000103
PCR反应结束后，在120V电压下进行30min电泳，在凝胶成像系统上观察并拍照，并对观察到的阳性结果进行统计和分析。
目的片段的纯化
将双倍体系的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统拍照鉴定后，用刀片将对应阳性PCR产物的琼脂糖凝胶切下来，然后按照胶回收试剂盒操作说明书进行胶回收，并用琼脂糖凝胶电泳鉴定回收结果。
目的基因与pMD-18T载体的连接、转化
将纯化后的上述所有PCR产物与pMD-18T载体连接，并将重组质粒转入感受态细胞DH5α，筛选、扩大培养后提取质粒。反应体系如下：
表5 pMD-18T载体连接体系
Figure BDA0002747324630000111
重组质粒的酶切鉴定
将抽提的重组质粒使用酶切鉴定。37℃水浴作用1.5～3h。取9μL酶切产物和1μL10×Loading Buffer混合后，加入1.0％琼脂糖凝胶(含0.2％EB)中，在120V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上观察结果。酶切结果符合预期后送出测序。
氨基酸遗传进化分析
将酶切鉴定正确的质粒送到生工生物工程(上海)有限公司进行测序，利用DNAStar5.0软件将12段测序结果进行拼接。利用Editseq和SeqMan软件将拼接成功的全基因序列与GenBank参考毒株全基因序列进行比对，利用Megalign、MEGA7.0软件做同源性比较、遗传进化分析、关键氨基酸位点变异分析。
结果
PRRSV全基因组扩增结果
将获得20株PRRSV毒株的Marc-145细胞培养物，使用表2.5所列的PRRSV全基因扩增引物对PRRSV全基因进行分段扩增，结果表明1-12段分别能够扩增出1090bp、1414bp、1421bp、1511bp、1608bp、1646bp、1689bp、1653bp、1678bp、1717bp、1475bp和652bp条带，与预期大小相符。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对，其特征在于：包括12对引物，12对引物分别为1引物片段、2引物片段、3引物片段、4引物片段、5引物片段、6引物片段、7引物片段、8引物片段、9引物片段、10引物片段、11引物片段和12引物片段，1引物片段包括引物序列1F：5’-ATGACGTATTGGTGTTGGCTC-3’和1R：5’-CACCATGCTTGGTTTGATAGCC-3’；2引物片段包括引物序列2F：5'-GTGCTATGGCTGACGTCTATGACA-3’和2R：5'-AAGACTTGTTGCACCACGGAGGTA-3’；3引物片段包括引物序列3F：5'-CAAGTTATTGAGGATTGCTGCTGC-3’和3R：5'-CGTGTGAGGTAACATCACAAACCC-3’；4引物片段包括引物序列4F：5'-CATGTGGGATAGGGTTGACATGCT-3’和4R：5'-CTGATCTTTAGTCCGTTCAGCTGG-3’；5引物片段包括引物序列5F：5'-ACTGTGGTCGCTCAGCCTTATGAT-3’和5R：5'-TTCCAGTTCAGGTTTGGCAGCAA-3’；6引物片段包括引物序列6F：5'-CAGGCCAGTTTTGTAATGTG-3’和6R：5'-GCGGCTAGCAGTTTAAACACTGCT-3’；7引物片段包括引物序列7F：5'-GCCCTTGGTATGATGAACGT-3’和7R：5'-AGATGTTCAACCCACCAGTGGT-3’；8引物片段包括引物序列8F：5'-CAGCACATGGTGCTCAGTTACT-3’和8R：5'-TCTGCAATTGCCTGTGTGGGTCAT-3’；9引物片段包括引物序列9F：5'-ACTCCAGTCAAGGCGCCACATT-3’和9R：5'-CTTCTGTAATTGCTCAGGGTGAACG-3’；10引物片段包括引物序列10F：5'-TCGGATACAGCGTATCTGTACGAG-3’和10R：5'-AGCCACGATGCCTGACACATT-3’；11引物片段包括引物序列11F：5'-GACATCAGCTGCCTTAGGCAT-3’和11R：5'-AACAGCTTTTCTGCCACCCAACACG-3’；12引物片段包括引物序列12F：5'-TGATAACCACGCATTTGTCGTCCG-3’和12R：5'-AATTACGGCCGCATGGTTCTCGCCA-3’。
2.一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对的应用，其特征在于，包括下列步骤：
(1)感染猪蓝耳病毒的样品预处理，剪取感染猪蓝耳病毒的猪仔的组织病料新鲜切面处约2～3cm3大小，在已预冷的研钵内进行研磨，研磨充分后取病料置于离心管内备用；
(2)核酸提取，将盛有病料的离心管通过病毒病毒提取试剂盒提取RNA；
(3)扩增，取步骤(2)中提取的RNA为模板用权利要求1中每对所述引物进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物，每对引物的片段扩增3次；
(4)分析，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统上观察并拍照，并对观察到的结果进行统计和分析。
3.如权利要求2所述的一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对的应用，其特征在于，所述步骤(3)中的RT-PCR扩增反应的猪蓝耳病毒特异性基因扩增反转录体系为：在离心管中配制模板RNA/引物混合液，2×ES Reaction Mix 5μL，2×ES Reaction Mix 5μL，EasyScriptTMⅡRT/RI Emzyme Mix 4μL，下游引物1μL，模板RNA 2μL，反应体系为12μL，42℃反应30min，然后85℃恒温5min，得到的cDNA用于PCR扩增。
4.如权利要求2所述的一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对的应用，其特征在于，所述步骤(3)中RT-PCR扩增反应的PCR反应体系为：2×PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的上游引物与10μmol/L的下游引物各0.5μL，反转录产物1μL，ddH2O 10.5μL，反应体系为25μL。
5.如权利要求2所述的一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对的应用，其特征在于，所述步骤(3)中RT-PCR反应程序：1)94℃预变性5min；2)94℃变性30s，59℃退火30s，共计30个循环；3)72℃延伸60s；4)72℃终延伸5min。
6.如权利要求2所述的一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对的应用，其特征在于:还包括步骤(5)目的片段的纯化，将步骤(3)中通过双倍体系的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统拍照鉴定后，用刀片将对应阳性PCR产物的琼脂糖凝胶切下来，然后通过胶回收试剂盒进行胶回收，并用琼脂糖凝胶电泳鉴定回收结果；
(6)目的基因与pMD-18T载体的连接、转化，将纯化后的胶回收PCR产物与pMD-18T载体连接，并将重组质粒转入感受态细胞DH5α，筛选、扩大培养后提取质粒；
(7)重组质粒的酶切鉴定，将抽提的重组质粒使用酶切鉴定，37℃水浴作用1.5～3h；取9μL酶切产物和1μL 10×Loading Buffer混合后，加入1.0％琼脂糖凝胶中，在120V电压下电泳30min，在凝胶成像系统上观察结果；酶切结果符合预期后送出测序；
(8)氨基酸遗传进化分析，将酶切鉴定正确的质粒进行测序，利用DNAStar5.0软件将12段测序结果进行拼接；利用Editseq与SeqMan软件将拼接成功的全基因序列与参考毒株全基因序列进行比对，利用Megalign、MEGA7.0软件做同源性比较、遗传进化分析、关键氨基酸位点变异分析。
7.如权利要求6所述的一种用于猪蓝耳病毒全基因组测定的成套引物对的应用，其特征在于，所述步骤6)中与pMD-18T载体连接体系如下：T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 DNALigase Buffer 2.5μL，50ng/μL的pMD-18T Vector 1μL，胶回收PCR产物8μL，去离子水12.5μL，总反应体系25μL。
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