CN102304496B - 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株GDr株的致弱培育 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株GDr株的致弱培育。本发明是将由我国分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒株经过全面鉴定后，再将其在Marc145细胞中连续传代后使其毒力减弱获得弱毒疫苗株GDr株病毒(其保藏编号为CGMCC No.3599)，回传至猪毒力不返强，遗传性能稳定；本毒株可在Marc145细胞上高效增殖；该毒株毒力低该毒株具有良好的免疫原性，最小免疫剂量可达104TCID50，接种猪后的免疫持续期可达4个月。
Description
技术领域
本发明涉及一种用细胞传代致弱技术培育高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的致弱培育，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)对猪造成的危害是一个世界性难题，特别是2006年在我国出现高致病性PRRS，给我国养猪业造成了严重的经济损失。
随着猪蓝耳病的发现，猪蓝耳病的疫苗研究也就随之开展，尽管大家对现有猪蓝耳病疫苗的免疫效果评价不一。目前国内外已经商品化的猪蓝耳病疫苗有灭活疫苗和弱毒活疫苗两类。基因工程疫苗研究也已出现积极发展的趋势。
在经典猪蓝耳病弱毒活疫苗方面，美国Boehringer Ingleheim公司于1995年首次推出商品化减毒疫苗Resp PRRS/ReproTM，已获准用于3～18周龄猪的预防接种。随后多个单位均推出了猪蓝耳病弱毒疫苗。目前西班牙、荷兰、美国和中国已研制出猪蓝耳病弱毒活疫苗并商品化。可供各阶段猪群使用，但主要供3～18周龄的仔猪接种使用，用于防制猪蓝耳病的呼吸障碍。据报道，接种猪蓝耳病弱毒疫苗后第110天用同源强毒攻击，动物可得到完全保护，而且对强毒攻击的保护甚至是终生的。架子猪接种7天后就激发保护性免疫应答，并可持续16周以上，与未接种的对照猪相比，接种猪攻毒后排毒时间减少，肺部病变减轻，生长发育良好。然而，多数报道认为猪蓝耳病弱毒活疫苗存在安全问题。Botner等报道，在丹麦，对1000多头猪蓝耳病血清学阴性猪使用了弱毒疫苗，可是不久后猪群发生了猪蓝耳病，而且从流产胎儿和死胎中分离到了疫苗病毒，发现疫苗病毒可经胎盘感染胎儿，并向未接种的母猪传播，有些猪群则表现出急性猪蓝耳病样综合症状。也有研究者用该疫苗接种公猪，随后以强毒攻击，发现有精液排毒和精液质量下降等现象。
在高致病蓝耳病减毒活疫苗方面，目前，虽然我国有多家单位在通过细胞传代致弱的方式研究高致病蓝耳病减毒活疫苗，并取得良好的进展，但它们的安全性需要做进一步观察。
在经典猪蓝耳病灭活疫苗方面，Bayer公司于1997年推出了灭活疫苗PRRomiSet M，此后西班牙、荷兰、加拿大和中国都已研制出猪蓝耳病灭活疫苗并商品化。主要用于预防后备母猪和经产母猪感染猪蓝耳病所造成的繁殖障碍。灭活疫苗的优点是安全性好，但主要刺激猪体产生体液免疫反应，对清除感染巨噬细胞中的猪蓝耳病病毒无能为力，因此仅靠灭活苗免疫不能使猪产生牢固的免疫力。灭活疫苗免疫后的缺点是免疫剂量大、免疫次数多、免疫力产生期较长，因而不适合仔猪免疫。据报道，灭活疫苗免疫后攻毒不能保护仔猪对猪蓝耳病病毒的感染，病毒感染后病毒血症的持续时间和病毒的滴度与非免疫组无显著差别。仔猪和架子猪带毒是猪场猪蓝耳病病毒持续存在的最重要原因，因此，通过灭活疫苗难以控制和根除猪蓝耳病病毒在猪场的存在和流行。
在高致病蓝耳病灭活疫苗方面，2006年夏季以来，我国部分地区陆续发生猪高致病性蓝耳病疫情，农业部组织了中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所联合研制等有关单位，进行了高致病性蓝耳病灭活疫苗研究，该疫苗于2007年5月正式投产。此疫苗利用流行的高致病性蓝耳病变异毒株NVDC-JXA1株作为种毒，这疫苗是目前唯一获得临时批准文号并作为政府招标采购紧急预防用的灭活疫苗，但使用结果表明：该疫苗存在与其它灭活疫苗同样的问题。
猪蓝耳病是由动脉炎病毒属猪繁殖与呼吸综合征病毒(Arterivirus porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前后仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。宁宜宝等经过大量的实验证实了变异了的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染是导致2006年在我国发生的高热病的主要原因，根据国际上各国控制该病经验，种猪疾病净化和疫苗免疫接种是最常用的方法。目前在我国猪蓝耳病普遍流行的情况下，要单纯靠净化开控制PRRS这种疾病，无论是从经济上，还是从技术上，难度都太大，而用疫苗疫苗接种来控制本病无疑是一种非常可行的方法。当然，疫苗的安全和免疫效力又是我们最为关注的问题，灭活疫苗就病原扩散和毒力返强毒方面而言，无疑是最安全的，但其免疫效力较差，弱毒活疫苗在免疫效力方面具有明显的优势，但安全性普遍认为不如灭活疫苗好。实践证明：高致病PRRS灭活疫苗免疫猪早期产生的抗体不但不能有效抵抗强毒的攻击，而且对感染的强毒还有一种免疫依赖增强作用，使之更易受到感染和发病。而活疫苗在这方面则要好得多，用弱毒疫苗免疫猪，其免疫效力明显好于灭活疫苗。安全性也没有出现问题。本专利申报的PRRS GD株弱毒疫苗，具有两很好的免疫原性，没有猪对强毒的免疫保护力达到90％-100％，疫苗种毒对猪不致病，将其用猪连续回传五代毒力不返强。用该疫苗免疫接种猪客有效控制高致病性PRRS的发生和流行，对保证我国养猪业的健康发展具有重要作用。
目前，我国还有多家单位在研究高致病蓝耳病活疫苗，但它们都在研究之中，尚未投放市场使用。
目前正在实验室研制的猪蓝耳病新型疫苗种类很多，主要有亚单位疫苗、基因工程重组/嵌合疫苗和DNA疫苗，虽然所取得的进展是喜人的，但他们基本都处在研究阶段。目前对猪蓝耳病病毒各结构蛋白免疫原性的研究已比较清楚，猪蓝耳病病毒感染猪体后，血清中抗猪蓝耳病病毒的免疫球蛋白主要是针对N蛋白和M蛋白，GP3虽不能刺激中和抗体的产生，但可对仔猪提供保护。GP4、GP5和M蛋白可产生中和抗体，GP5比GP4产生中和抗体的能力更强。
Gagnon等通过对GP5及M蛋白等基因进行了重组表达，构建基因工程重组疫苗的研究，为猪蓝耳病新型疫苗的研究开辟了新领域。用猪蓝耳病病毒人工制备重组病毒的工作也已展开，Verheije等构建了猪蓝耳病病毒LV株的感染性cDNA克隆、得到人工突变的猪蓝耳病病毒，并进行了突变株安全性及免疫保护效力进行了检测。
尽管目前针对PRRS的疫苗研究种类繁多，但没有任何一种疫苗可对猪体产生理想的安全保护作用。
发明内容
本发明的目的是利用本发明人分离的PRRS病毒，通过人工致弱的方法，获得一株PRRS弱毒株病毒，以控制高致病性PRRS的发生与流行。
本发明是利用从我国分离到的PRRS GD株，使其适应Mark145细胞后，然后在该细胞上人工传至160代使其致弱，其间两次做蚀斑筛选，获得了一株免疫原性好，致病力弱的疫苗株GDr；用该毒株制造疫苗。
一、毒株
动脉炎病毒属猪繁殖与呼吸综合征病毒(Arterivirus porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)GDr株弱毒株，本病毒已于2010年02月02日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号CGMCC No.3599。
1.猪繁殖与呼吸综合征病毒GD株的分离鉴定
(1)病料来源 本发明人取自我国广东地区某猪场患高致病蓝耳病死亡猪的肺组织。
(2)分离方法 将组织匀浆液通过Marc145细胞培养适应传代的方法，分离到致细胞病变的毒株。
(3)鉴定
1)不同细胞系适应性试验 该毒株只在MA104和Marc145细胞中生长，在其他传代细胞系中增殖极差或不增殖。
2)对鸡胚的致病性 接种鸡胚对鸡胚不致病。无血凝活性。
3)血清中和试验 特异的PRRSV单克隆抗体(杨汉春教授惠赠)能中和病毒的活性，使其丧失对细胞的感染性。
4)病毒形态 电子显微镜观察，为典型的猪繁殖与呼吸综合征病毒的形态，其大小为40nm左右。
5)纯净性检测 用PCR和RT-PCR等方法对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、细小病毒、经典PRRSV及圆环病毒等外源病原检测，所有检测结果均为阴性，血凝试验检测阴性。结果证明无外源病毒污染。
6)PRRSV全基因序列测定 用特定的PRRSV引物，对分离物作全基因序列扩增和测序，结果证明该毒株基因序列为PRRSV毒株，在NSP2区域连续缺失30个氨基酸。为PRRSV变异毒株。PRRSV GD株第5代全基因序列见GENE BANK EU825724。
7)毒力测定 将分离株分别感染30、40、60日龄猪，该毒株能感染猪60％以上出现死亡，死亡猪肺脏出现典型的出血性实变，试验表明：该毒株为猪繁殖与呼吸综合症病毒变异株，对猪具有高致病性。
8)鉴定结果 经过系统鉴定后的该毒株取名为高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒GD株。
2.猪繁殖与呼吸综合征病毒GD株的毒力致弱
(1)传代致弱方法
将PRRSV GD株在Marc145细胞中连续传代，传代温度为37℃，每次用于PRRSV GD株传代的Marc细胞的代次一般不超过20代。当细胞病变达到70％-80％时，收获病毒，经-20以下反复冻融2次以上，再往下继续传代；第50代、80代分别选取单个蚀斑进行克隆。在细胞上每传5代做一次全基因序列测定，和第5代原始毒作基因结构比较；在80代以前，细胞上每传10代，将传代的PRRSV GD毒用猪做一次毒力测定。80代以后每10代，同时将传代的PRRSV GD毒用猪做致病性和免疫原性测定(详见表1和表2)。
表1高致病性猪蓝耳病GD株不同代次对猪的致病性测定
| 组别 | 接种猪(头) | 体温情况 | 发病、死亡猪数 |
| GDF30原液 | 5 | 5/5体温升高(40.7～41.2℃) | 5/5发病，2/5死亡 |
| GDF40原液 | 5 | 5/5体温升高(41.2～42.6℃) | 5/5发病，3/5死亡 |
| GDF50原液 | 5 | 5/5体温升高(41.2～41.9℃) | 5/5死亡 |
| GDF60原液 | 6 | 6/6体温升高(40.8～41.4℃) | 4/6死亡 |
| GDF50 10倍稀释 | 10 | 10/10体温升高(40.5～41.2℃) | 7/10死亡 |
| GDF60 10倍稀释 | 10 | 10/10体温升高(40.4～41.5℃) | 3/10死亡 |
| 对照 | 5 | 5/5活 | |
| GDF70原倍1ml/头 | 5 | 2头死亡，解剖肺部均有病变. | |
| GDF91原倍1ml/头 | 8 | ≥41.0℃(2头)；≥40.5℃(6头) | 1头死亡。7/8活，解剖肺部无病变 |
| GDF105原倍1ml/头 | 3 | ≥40.5℃(1头)；≤40.0(2头) | 3/3存活，解剖2头肺部有实变。 |
| GDF105-10倍稀释1ml/头 | 5 | ≥40.5℃(5头)， | 5/5活，解剖2头肺部有轻微实变。 |
| GDF115原倍1ml/头 | 5 | ≥41.0℃(2头1天)；≥40.5℃(2头)；1头正常 | 5/5存活，解剖3头肺部有实变。 |
| GDF120原倍1ml/头 | 5 | ≥41.0℃(1头1天)，≥40.5℃(3头)1头正常 | 5/5活，解剖1头肺部有实变。 |
| GDF120原液1ml/头 | 5 | 40.1℃(2头)，≤40.0℃(3头) | 5/5健活，解剖4头肺部无病变，1头有绿豆状肉变 |
| GDF120 10倍稀释1ml/头 | 5 | 40.1℃(2头)，≤40.0℃(3头) | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF120 100倍稀释1ml/头 | 5 | 41℃(1头1天)，4头正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF120 1000倍稀释1ml/头 | 5 | 5/5正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF125原倍1ml/头 | 5 | 41℃(2头1灭)；≤40.5℃(2头)；1头正常 | 5/5健活，解剖2头肺部有绿豆状大小肉变 |
| GDF125原倍1ml/头 | 5 | 5/5正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF110原倍1ml/头 | 5 | 40.1℃-40.5℃(2头3天)；3头正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF130原倍1ml/头 | 5 | 40.1℃-40.5℃(2头2天)；3头正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF140原倍1ml/头 | 5 | 40.1℃-40.5℃(2头2天)3头正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF140原倍3ml/头 | 5 | 5/5正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF150原倍3ml/头 | 5 | 5/5正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF160原倍3ml/头 | 5 | 5/5正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF160 10倍稀释1ml/头 | 5 | 5/5正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
| GDF180原倍3ml/头 | 5 | 5/5正常 | 5/5健活，解剖肺部无病变 |
2)细胞传代对PRRSV GD株特性的影响
1)细胞传代对病毒致细胞病变能力的影响将PRRSV GD株在Marc145细胞中反复传代，传代温度为37℃，从5代至20代，细胞培养液中GD株病毒接种量为1/10，毒株致细胞出现病变的时间为96小时左右，从21～50代，细胞培养液中GD株病毒接种量为1/20～1/50，毒株致细胞出现病变的时间为72小时左右，51～80代，细胞培养液中GD株病毒接种量为1/50～1/100，毒株致细胞出现病变的时间为72小时左右。90代以后，细胞培养液中GD株病毒接种量为1％，病毒致细胞出现病变的时间为50小时左右。随着传代次数的增多，病毒对细胞的适应性越强，细胞出现病变的时间越短。
2)细胞传代对病毒在细胞中增殖滴度的影响：将PRRSV GD株在Marc145细胞中反复传代，传代温度为37℃，在5代以前，细胞培养液中GD株的病毒滴度为105；20至50代，细胞养液中GD株的病毒滴度为106-6.2；50代以后，细胞培养液中GD株病毒滴度为106.5-7.0，随着传代次数的增多，病毒对细胞的适应性越强，细胞中病毒滴度越高。
3)细胞传代对病毒致病力的影响PRRSV GD株式高致病性毒株，对猪具有很强的致病性。感染猪主要临床特征表现为高热和急性发病死亡，肢体末端和耳朵严重出血。病理变化主要表现为肺部出血性、胰样性病变，淋巴结出血、严重时伴有膀胱和肠管出血。发病率可达100％和病死率达50％以上。本发明在对传代GD株每10代的测毒结果表明：在60代以前，该毒株对30日龄小猪均为高致病性毒株，70代以后毒力开始出现下降，120代仍然有一定毒力。130代对猪基本上不致病，140代以后对猪呈现疫苗弱毒的特性，常规免疫剂量和超剂量免疫均对30日左右的试验猪不发病。试验证明：通过细胞传代可以逐渐将PRRSV GD株的毒力减弱。
4)细胞传代对病毒GD株免疫原性的影响将GD株在细胞中连续传代165代，在80代以后，每10代分别将其接种猪，28天用强毒攻击，测定免疫原性，以确定细胞传代对免疫原性的影响。结果证明：80代至180代的GD株免疫猪均能有效抵抗强毒的攻击，疫苗免疫猪既无明显的体温升高变化，又无临床症状和肺部病变，证明细胞传代165代对PRRSV GD株免疫原性没有影响。
5)细胞传代对病毒基因结构的影响：
将GD株在细胞上连续传160代，每传5代做一次全基因序列测定，和第5代原始毒作基因结构比较，结果表明：在100代之前，随着传代次数的增加，GD株的基因序列结构也在发生变化，主要变化表现在非结构蛋白上，而到100代之后，基因序列结构逐渐趋于稳定。
(3)人工传代致弱GDr株疫苗的特性
1)PRRSV GDr株在细胞上的特性：在早期的分离阶段，该毒株在5代以前，对细胞的致病力相对较弱，一般需要5～7天才产生拉网式细胞病变，以后对细胞产生的病变越来越明显，时间也逐渐缩短，从5代到30代，细胞出现病变的时间缩短到3.5～5天，40代以后，细胞出现病变的时间进一步缩短，到50代时，细胞出现病变的时间缩短到72小时左右，到100代左右时可缩短到60小时左右。同时，随着传代次数的增加，接种量也逐渐减少，细胞中病毒滴度逐渐增加。随着细胞传代，在90代以前，基因结构变化较快，而在90代以后，基因结构逐渐趋于稳定，变化较小。
2)PRRSV GDr株的安全性试验
试验证明：60代以前，对猪均为强致病性，70代以后毒力开始减弱，但用91代以内的传代毒株感染猪，仍可出现1/8死亡。但直到115代，感染的5头猪中3头仍可见到轻微的肺部病变。直到125代以后，感染猪才见不到肺部病变。将140、150和180代分别以超剂量感染猪，观察21天，感染猪既无临床症状，也无体温上升，经解剖观察，所有猪均无肺部肉眼病变。
3)PRRSV GDr株的稳定性试验
将PRRSV GDr株GDF160连续在猪体内传5代，每头猪接种原血毒3ml，各代次均未见猪发病，标明PRRSV GDr株毒力不返强。
4)PRRSV GDr株免疫原性试验
将PRRSV GDF100、GDF110、GDF120、GDF125、GDF130、GDF140、GDF160、GDF165和GDF180代作为种毒分别制成疫苗(将以上各代次病毒分别接种到生长成单层的Marc145细胞上，37℃继续培养，当细胞出现细胞病变达到70％时收获感染的细胞培养物，经反复3次冻融后加入常规的冻干保护剂后，再经真空冷冻干燥而成)，分别免疫猪一组，每头测温，贯彻临床反应，28天后用强毒攻击，攻毒后每天观察临床症状，每天测一次体温，记录死亡情况。免疫前后和攻读前后分别作体重称重比较。21天后解剖观察肺部病变。结果表明：在强毒攻击后，在体温变化、死亡和临床症状方面，除GDF125代的保护率为3/5、GDF130保护率为4/5之外，其余各组均为5/5全部保护。在体重增加方面，在强毒攻击后，所有免疫猪的体重增加均明显高于非免疫对照猪(见表2)。证明细胞传代可以降低毒株的毒力，但没有降低疫苗制造用毒株。同时结果表明：所有这些毒株感染猪均没有表现体温升高，也没有出现临床症状和死亡。证明PRRSV GDr株具有良好的免疫原性。用其制造疫苗，可有效保护猪不感染PRRSV。
表2PRRSV GDr株免疫原性试验
5)经试验证实用本发明所涉及的PRRSV GDr株对本动物猪的最小免疫剂量可达104TCID50，制备的疫苗接种猪后的免疫持续期可达4个月。
本发明的积极意义
本发明涉及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株GDr株的致弱培育。本发明是将由我国分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒株经过全面鉴定后，再将其在Marc145细胞中连续传代使其毒力减弱，回传至猪毒力不返强，遗传性能稳定；本毒株可在Marc145细胞上高效增殖；该毒株毒力低该毒株具有良好的免疫原性，最小免疫剂量可达104TCID50，接种猪后的免疫持续期可达4个月。
序列表
<110>中国兽医药品监察所
<120>高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株GDr株的致弱培育
<160>1
<210>1
<211>15336
<212>DNA
<213>PRRSV GD株第160代
<220>
<400>1
ATGACGTATA GGTGTTGGCT CTATGCCACG GCATTTGTAT TGTCAGGAGC TGTGACCATT 60
GGCACAGCCC AAAACTTGCT GCACGGGAAC ACCCTCCTGT GACAGCCCTC TTCAGGGGGA 120
TTAGGGGTCT GTCCCTGACA CCTTGCTTCC GGAGTTGCAC TGCTTTACGG TCTCTCCACC 180
CCTTTAACCA TGTCTGGGAT ACTTGATCGG TGCACGTGTA CCCCCAATGC CAGGGTGTTT 240
GTGGCGGAGG GCCAGGTCTA CTGCACACGA TGTCTCAGTG CACGGTCTCT CCTTCCTCTG 300
AATCTCCAAG TTCCTGAGCT TGGGGTGCTG GGTCTATTTT ATAGGCCCGA AGAGCCACTC 360
CGGTGGACGT TGCCACGTGC ATTCCCCACT GTCGAGTGCT CCCCCGCCGG GGCCTGCTGG 420
CTTTCTGCGA TTTTTCCGAT TGCACGAATG ACTAGTGGAA ACCTGAACTT TCAACAAAGA 480
ATGGTGCGGG TCGCAGCTGA AATCTACAGA GCCGGCCAAC TCACCCCTAC AGTTCTAAAG 540
ACTCTACAAG TTTATGAACG GGGTTGTCGT TGGTACCCCA TTGTCGGGCC CGTCCCTGGG 600
GTGGGCGTTT ACGCCAACTC CCTGCATGTG AGTGACAAAC CTTTCCCGGG AGCAACTCAT 660
GTGTTAACCA ACTTGCCGCT CCCGCAGAGG CCCAAACCTG AGGACTTTTG CCCTTTTGAG 720
TGTGCTATGG CTGACGTCTA TGACATTGGT CGTGGCGCCG TCATGTATGT GGCCGGAGGA 780
AAGGTCTCTT GGGCCCCTCG TGGTGGGAAT GAAGTGAAAT TTGAACCTGT CCCCAAGGAG 840
TTGAAGTTGG TTGCGAACCG ACTCCACACC TCCTTCCCGC CCCATCACGT AGTAGACATG 900
TCCAGGTTTG CTTTCATGAC CCCTGGGAGT GGTGTCTCCA TGCGGGTTGA GTACCAATAC 960
GGCTGCCTCC CCGCTGACAC TGTCCCTGAA GGAAACTGCT GGTGGCGCTT GTTTGACTCG 1020
CTCCCACCGG AAGTTCAGTA CAAAGAAATT CGCCATGCTA ACCAATTTGG CTATCAAACC 1080
AAGCATGGTG TCCCTGGCAA GTATCTACAG CGGAGGCTGC AAGTTAATGG TCTTCGAGCA 1140
GTGACCGACA CACATGGACC TATCGTCATA CAGTGTTTCT CTGTTAAGGA GAGTTGGATC 1200
CGCCACCTGA GGTTGGTGGA AGAACCCAGC CTCCCCGGGT TTGAGGATCT CCTCAGAATC 1260
AGGGTTGAGC CCAATACGTC ACCACTGGCT GGAAAGGATG AGAAGATTTT CCGGTTTGGC 1320
AGTCATAAGT GGTACGGTGC CGGAAAAAGA GCAAGGAAAA CACGCTCTGG TGCGACTACT 1380
ATGGTCGCTC ATCACGCTTC GTCCGCTCAT GAAACCCGGC AGGCCACGAA ACACGAGGGT 1440
GCCGGCGCTA ACAAGGCTGA GCATCTCAAG CGCTACTCTC CGCCTGCCGA AGGGAACTGT 1500
GGTTGGCACT GCATTTCCGC CATCGCCAAC CGGATGGTGA ATTCCAACTT TGAGACCACC 1560
CTTCCTGAAA GAGTAAGGCC TTCAGATGAC TGGGCCACTG ACGAGGATCT TGTGAACACC 1620
ATCCAAATCC TCAGGCTCCC TGCGGCCTTG GACAGGAACG GCGCTTGCGG TAGCGCTAAG 1680
TACGTGCTTA AACTGGAGGG TGAGCATTGG ACTGTCTCTG TGATCCCTGG GATGTCCCCT 1740
ACTTTGCTCC CCCTTGAATG TGTTCAGGGT TGTTGTGAGC ATAAGGGCGG TCTTGTTTCC 1800
CCGGATGCGG TCGAAATTTC CGGATTTGAT CCTGCCTGCC TTGACCGACT GGCTAAGGTA 1860
ATGCACTTGC CTAGCAGTAC CATCCCAGCC GCTCTGGCCG AATTGTCCGA CGACTCCAAC 1920
CGTCCGGTTT CCCCGGCCGC CACTACGTGG ACTGTTTCGC AATTCTATGC TCGTCATAGA 1980
GGAGGAGATC ATCATGACCA GGTGTGCTTG GGGAAAATCA TCAGCCTTTG TCAAGTTATT 2040
GAGGATTGCT GCTGCCATCA GAATAAAACC AACCGGGCTA CTCCGGAAGA GGTCGCGGCA 2100
AAGATTGATC AGTACCTCCG TGGCGCAACA AGTCTTGAGG AATGCTTGGC CAAACTTGAG 2160
AGGGTTTCCC CGCCGAGCGC TGCGGACACC TCCTTTGATT GGAATGTTGT GCTTCCTGGG 2220
GTTGAGGCGG CGAATCAGAC AACCGAACAA CCTCATGTCA ACTCATGCTG CACCCTGGTC 2280
CCTCCCGTGA CTCAAGAGCC TTTGGGCAAG GACTCGGTCC CTCTGACCGC CTTCTCACTG 2340
TCCAATTGCT ATTACCCTGC ACAAGGTGAC GAGGTTCATC ACCGTGAGAG GTTAAATTCC 2400
GTACTCTCTA AGTTGGAAGG GGTTGTCCTG GAAGAATATG GGCTCATGTC CACTGGACTT 2460
GGCCCGCGAC CCGTGCTGCC GAGCGGGCTC GACGAGCTTA AAAACCAGAT GGAGGAGGAT 2520
CTGCTAAAAC TAGCCAACAC CCAGGCGACT TCAGAAATGA TGGCCTGGGC GGCTGAGCAG 2580
GTCGATTTAA AAGCTTGGGT CAAGAGCTAC CCGCGGTGGA CACCACCACC CCCTCCACCA 2640
AGAGTTCAAC CTCGAAGAAC AAAGTCTGTC AAAAGCTTGC CAGAGGGCAA GCCTGTCCCT 2700
GCTCCGCGCA GGAAGGTCAG ATCCGATTGC GGCAGCCCGG TTTTGATGGG CGACAATGTC 2760
CCTAACGGTT CGGAAGAAAC TGTCGGTGAT CCCCTCAATT TCCCGACACC ATCCGAGCCG 2820
ATGAAACCCA TGAGTGAGCC CGTACTTATG CCCGCGTCGC GACGTGTCCC CAAGCTGATG 2880
AAACCTTTGA GTGGGTCGGC ACCAGTTCCT GCACCGCGTA GAACTGTGAC AACAACGCTG 2940
ACGCACCAGG ATGAGCCTCT GGATTTGTCT GCGTCCTCAC AGACGGAATA TGGGGCTTTC 3000
CCCCTAGCAC CATCGCAGAA CATGGGCATC CTGGAGGCGG GGGGGCAAGA AGTTGAGGAA 3060
GTCCTGAGTG AAATCTCGGA TATACTAAAT GACACCAACC CTGCACCTGT GTCATCAAGC 3120
AGCTCCCTGT CAAGTGTTAA GATCACACGC CCAAAATACT CAGCTCAAGC CATCATCGAC 3180
TCTGGCGGGC CTTGCAGTGG GCATCTCCAA AAGGAAAAAG AAGCATGCCT CAGCATCATG 3240
CGTGAGGCTT GTGATGCGTC CAAGCTTGGT GATCCTGCTA CGCAGGAGTG GCTCTCTCGC 3300
ATGTGGGATA GGGTTGACAT GCTGACTTGG CGCAACACGT CTGCTTACCA GGCGTTTCGC 3360
ATCTTAAATG GCAGGCTTGA GTTTCTCCCA AGGATGATTC TCGAGACACC GCCGCCCCAC 3420
CCGTGCGGGT TTGTGATGTT ACCTCGCACG CCTGCACCTT CCGTGAGTGC AGAGAGTGAC 3480
CTCACCATTG GTTCAGTGGC CACCGAGGAT GTTCCACGCA TCCTCGGGAA AATAGGAGAC 3540
ACTGACGAGC TGCTTGACCG GGGTCCCTCG GCACCCTCCA AGGGAGGACC GGTCTGTGAC 3600
CAACCTGCCA AAGATCCCCG GATGTCGCCG CGGGAGTCTG ACGAGAGCAT GATAGTTCCG 3660
CCCGCAGATA CAGGTGGTGT CGGCTCATTC ACTGATTTGC CGTCTTCAGA TGGTGTGGAT 3720
GTGGACTGGG GGGGGCCGTT AAGAACGGTA AAAACAAAAG CAGGGAGGCT CTTAGACCAA 3780
CTGAGCTGCC AGGTTTTCAG CCTCGTTTCC CATCTCCCTA TTTTCTTCTC ACACCTCTTC 3840
AAATCTGACA GTGGTTATTC TCCGGGTGAT TGGGGTTTTG CAGCTTTTAC TCTATTTTGC 3900
CTCTTTCTAT GTTACAGTTA CCCATTCTTT GGTTTTGCTC CCCTCTTGGG TGTATTTTCT 3960
GGGTCTTCTC GGCGTGTGCG AATGGGGGTT TTTGGCTGCT GGTTGGCTTT TGCTGTTGGT 4020
CTGTTCAAGC CTGTGTCCGA CCCAGTCGGC ACTGCTTGTG AGTTTGACTC GCCAGAGTGT 4080
AGGAACGTCC TTCATTCTTT TGAGCTTCTC AAACCTTGGG ACCCTGTCCG CAGCCTTGTT 4140
GTGGGCCCCG TCGGTCTCGG CCTTGCCATT CTTGGCAGGT TACTGGGCGG GGCACGCTAC 4200
ATCTGGCACT TTTTGCTTAG GCTTGGCATT GTTGCAGACT GTATCTTGGC TGGAGCTTAT 4260
GTGCTTTCTC AAGGTAGGTG TAAAAAGTGC TGGGGATCGT GTGTAAGAAC TGCTCCTAAT 4320
GAGATCGCCT TCAACGTGTT CCCTTTTACA CGTGCGACCA GGTCGTCACT CATCGACCTG 4380
TGCGATCGGT TTTGCGCACC AAAAGGCATG GACCCCATTT TTCTCGCCAC TGGGTGGCGT 4440
GGGTGCTGGA CCGGCCGGAG TCCCATTGAG CAACCTTCTG AAAAACCCAT CGCGTTCGCC 4500
CAGCTGGATG AGAAGAGGAT TACGGCTAGA ACTGTGGTCG CTCAGCCTTA TGATCCCAAC 4560
CAGGCCGTAA AGTGCTTGCG GGTATTACAG GCGGGTGGGG CGATGGTGGC CGAGGCAGTC 4620
CCAAAAGTGG TCAAAGTTTC CGCTATTCCA TTCCGAGCTC CTTTCTTTCC CGCTGGAGTG 4680
AAAGTTGATC CTGAGTGCAG AATCGTGGTT GATCCCGATA CTTTTACTAC AGCCCTCCGG 4740
TCTGGCTATT CCACCGCGAA CCTCGTCCTT GGTACGGGGG ACTTTGCTCA GCTGAATGGA 4800
CTAAAGATCA GGCAAATTTC TAAGCCTTCA GGGGGAGGCC CACACCTCAT TGCTGCCTTG 4860
CATGTTGCCT GCTCGATGGC GTTACACATG CTTGCTGGTG TTTATGTGAC TGCGGTGGGG 4920
TCCTGCGGTA CCGGTACCAA CGATCCGTGG TGCACTAACC CGTTTGCCGT CCCTGGCTAC 4980
GGACCTGGCT CTCTTTGCAC GTCTAGATTG TGCATCTCCC AACACGGCCT CACCTTGCCC 5040
TTGACAGCAC TTGTGGCGGG ATTCGGCCTT CAAGAGATTG CCTTGGTCGG TTTGATTTTT 5100
GTCTCCATCG GAGGCATGGC TCATAGGTTG AGTTGTAAGG CTGACATGTT GTGCATCTTA 5160
CTCGCAATCG CTAGTTATGT TTGGGTACCT CTTACCTGGT TGCTTTGTGT GTTTCCTTGT 5220
TGGTTGCGCT GGTTCTCTTT GCACCCCCTC ACCATCCTGT GGTTGGTGTT TTTCTTGATT 5280
TCTGTAAATA TACCCTCGGG AATCTTGGCC GTGGTGTTAT TGGTTTCTCT CTGGCTTTTA 5340
GGTCGTTATA CTAACATTGC TGGTCTCGTC ACCCCCTATG ACATTCATCA TTACACCAGT 5400
GGCCCCCGCG GTGTCGCCGC CTTGGCCACC GCACCAGATG GAACCTACCT GGCTGCCGTC 5460
CGCCGTGCTG CGCTGACTGG TCGTACCATG CTGTTCACCC CGTCTCAGCT CGGGTCCCTC 5520
CTTGAGGGCG CTTTCAGAAC TCAAAAGCCC TCACTGAACA CCGTCAATGT GGTCGGGTCC 5580
TCCATGGGCT CTGGCGGAGT GTTCACTATT GACGGGAAAA TCAAGTGCGT GACTGCCGCA 5640
CATGTCCTTA CGGGTAACTC AGCTAGGGTT TCTGGGGTCG GCTTCAATCA AATGCTTGAC 5700
TTTGATGTAA AAGGGGACTT CGCCATAGCT GATTGCCCGA ACTGGCAAGG GGTCGCTCCC 5760
AAGGCCCGGT TCTGCGAGGA TGGGTGGACT GGTCGCGCCC ATTGGCTGAC ATCCTCTGGT 5820
GTTGAACCCG GTGTTATTGG GAATGGGTTC GCCTTCTGCT TCACCGCGTG TGGCGATTCT 5880
GGATCCCCAG TGATTACCGA AGCCGGTGAG CTTGTCGGCG TTCACACAGG ATCAAACAAA 5940
CAAGGAGGAG GCATTGTCAC GCGCCCCTCA GGCCAGTTTT GTAATGTGAA GCCCATCAAG 6000
CTGAGCGAGT TGAGTGAATT CTTCGCTGGA CCTAAGGTCC CGCTCGGTGA TGTGAAAATT 6060
GGCAGTCACA TAATTAAAGA CACATGCGAG GTGCCTTCAG ATCTTTGTGC CCTGCTTGCT 6120
GCCAAACCCG AACTGGAAGG AGGCCTTTCC ACAGTTCAAC TTCTGTGTGT GTTTTTCCTC 6180
CTGTGGAGAA TGATGGGGCA TGCCTGGACG CCCTTGGTTG CTGTGGGGTT TTTCATCCTG 6240
AATGAGATTC TCCCAGCTGT CCTGGTCCGG AGTGTTTTCT CCTTTGGGAT GTTTGTGCTA 6300
TCTTGGCTCA CACCATGGTC TGCACAAGTC CTGATGATCA GGCTTCTGAC AGCAGCCCTT 6360
AACAGAAACA GATGGTCTCT TGGTTTTTAC TGCCTTGGTG CAGTAACCAG TTTTGTCGCA 6420
GATCTTGCGG TAACTCAAGG GCATCCGTTA CAGGTGGTAA TGACCTTAAG CACCTATGCC 6480
TTCCTGCCCC GGATGATGGT TGTGACCTCG CCAGTCCCAG TGATCGCGTG TGGTGTTGTG 6540
CACCTCCTTG CCATAATTTT GTACTTGTTT AAGTACCGCT GCCTTCACAA TGTCCTTGTT 6600
GGCGATGGGG TGTTCTCTTC GGCTTTCTTC TTGCGATACT TTGCCGAGGG AAAGTTGAGG 6660
GAAGGGGTGT CGCAATCCTG CGGGATGAGT CATGAGTCGC TGACTGGTGC CCTCGCCATG 6720
AGACTCACCG ACGAGGACTT GGATTTCCTT ACGAAATGGA CTGATTTCAA GTGCTTTGTT 6780
TCTGCGTCCA ACATGAGGAA TGCAGCGGGC CAATTTATCG AGGCTGCTTA TGCAAAAGCA 6840
CTAAGAATTG AACTTGCTCA GTTGGTACAG GTTGATAAGG TCCGAGGCAC CATGGCCAAA 6900
CTCGAGGCTT TTGCCGATAC CGTGGCACCC CAACTCTCGC CCGGTGACAT TGTTGTTGCC 6960
CTTGGCCACA CGCCTGTTGG CAGCATTTTC GACCTAAAGG TTGGTAGCGC CAAGCATACT 7020
CTCCAAGCCA TTGAGACTAG AGTCCTTGCC GGGTCCAAAA TGACTGTGGC GCGTGTCGTT 7080
GACCCAACCC CCGCACCCCC ACCCGTACCT GTGCCCATCC CTCTCCCACC GAAAGTTCTG 7140
GAGAACGGTC CCAATGCCTG GGGGGATGAG GACCGTTTGA ACAAGAAGAA GAGGCGCAGG 7200
ATGGAAGCCG TCGGCATTTT TGTCATGGAC GGGAAAAAGT ACCAGAAATT TTGGGACAAG 7260
AATTCCGGTG ATGTGTTTTA TGAGGAGGTC CATATTAGCA CAGACGAGCG GGAGTGCCTT 7320
AGAACTGGCG ACCCTGTCGA CTTTGATCCT GAGACAGGGA TTCAGTGTGG GCATATCACC 7380
ATTGAAGATA AGGTTTACAA TGTCTTCACC TCCCCATCTG GTAGGAGATT CTTGGTCCCC 7440
GCCAACCCCG AGAATAGAAG AGCTCAGTGG GAAGCCGCCA AGCTTTCCGT GGAGCAAGCC 7500
CTTGGTATGA TGAACGTCGA CGGCGAACTG ACTGCCAAAG AACTGGAGAA ACTGAAAAGA 7560
ATAATTGACA AACTCCAAGG CCTGACTAAG GAGCAGTGTT TAAACTGCTA GCCGCCAGCG 7620
GCTTGACCCG CTGTGGTCGC GGCGGCTTAG TTGTTACTGA GACAGCGGTG AAAATAGTCA 7680
AATTTCACAA CCGGACCTTC ACCCTAGGAC CTGTGAACTT AAAAGTGGCC AGTGAGGTTG 7740
AGCTAAAAGA CGCGGTTGAG CACAACCAAC ATCCGGTTGC CAGACCGGTT GATGGTGGTG 7800
TTGTGCTCCT GCGCTCTGCA GTTCCTTCGC TTATAGATGT CTTGATCTCC GGCGCTGATG 7860
CATCTCCTAA GTTACTCGCC CGCCACGGGC CGGGAAACAC TGGGATTGAT GGCACGCTTT 7920
GGGATTTTGA GGCCGAGGCT ACTAAAGAGG AAGTTGCACT CAGTGCGCAA ATAATACAGG 7980
CTTGTGATAT TAGGCGCGGC GACGCGCCTG AAATTGGTCT CCCTTATAAG TTGTACCCTG 8040
TTAGGGGCAA CCCTGAGCGG GTAAAAGGAG TTTTACAGAA TACAAGGTTT GGAGACATAC 8100
CTTACAAAAC CCCTAGTGAC ACTGAAAGCC CGGTGCACGC GGCTGCCTGC CTCACGCCTA 8160
ATGCTACTCC GGTGACTGAT GGGCGTTCCG TCTTGGCTAC AACCATGCCC TCTGGCTTTG 8220
AGTTGTATGT GCCGACCATT CCAGCGTCCG TCCTTGATTA TCTTGATTCT AGGCCTGACT 8280
GCCCTAAACA GTTAACAGAG CACGGTTGTG AGGATGCTGC ATTAAGAGAC CTCTCCAAGT 8340
ATGATTTGTC CACCCAAGGC TTTGTTTTGC CTGGAGTTCT TCGCCTCGTG CGGAAGTACC 8400
TGTTCGCCCA CGTGGGTAAG TGCCCGTCCG TTCATCGGCC TTCCACTTAC CCTGCTAAGA 8460
ATTCTATGGC TGGAATAAAT GGGAACAGGT TTCCAACCAA GGACATTCAG AGCGTCCCTG 8520
AAATCGACGT TCTGTGCGCA CAGGCTGTGC GAGAAAACTG GCAAACTGTT ACCCCTTGTA 8580
CCCTCAAGAA ACAGTACTGT GGGAAGAAGA AGACTAGGAC AATACTTGGC ACCAATAACT 8640
TCATTGCGTT GGCCCATCGG GCAGCGCTGA GTGGTGTTAC CCAGGGCTTC ATGAAAAAAG 8700
CGTTCAACTC GCCCATCGCC CTCGGGAAAA ACAAATTTAA GGAGCTACAA GCCCCGGTCC 8760
TAGGCAGGTG CCTTGAAGCT GATCTTGCGT CCTGCGATCG ATCCACACCT GCAATTGTCC 8820
GCTGGTTTGC CGCCAATCTT CTTTATGAAC TCGCCTGTGC TGAGGAGCAT CTACCGTCCT 8880
ACGTGCTGAA CTGCTGCCAC GACTTACTGG TCACGCAGTC CGGCGCGGTG ACTAAGAGAG 8940
GTGGCCTGTC GTCTGGCGAC CCGATTACCT CTGTGTCAAA CACCATTTAC AGCTTAGTGA 9000
TATATGCACA GCACATGGTG CTCAGTTACT TCAAAAGTGG TCACCCTCAT GGCCTTCTGT 9060
TTCTTCAAGA CCAGCTAAAG TTTGAGGACA TGCTCAAGGT TCAACCCCTG ATCGTCTATT 9120
CGGACGACCT TGTGCTGTAT GCCGAGTCTC CCTCCATGCC AAACTACCAC TGGTGGGTTG 9180
AACATCTGAA TCTTATGCTG GGTTTTCAGA CGGACCCAAA GAAGACAACC ATCACAGACT 9240
CACCATCATT CCTAGGTTGC AGGATAATAA ATGGTCGCCA GCTAGTCCCT AACCGTGACA 9300
GGATCCTCGC GGCCCTCGCC TACCATATGA AGGCAAGTAA TGTTTCTGAA TACTACGCCT 9360
CGGCGGCTGC AATACTCATG GACAGCTGTG CTTGTTTAGA GTATGATCCT GAATGGTTTG 9420
AAGAGCTCGT GGTTGGGATA GCGCAGTGCG CCCGCAAGGA CGGCTACAGC TTTCCTGGCC 9480
CACCGTTCTT CTTGTCCATG TGGGAAAAAC TCAGGTCCAA TCATGAGGGG AAGAAGTCCA 9540
GAATGTGCGG GTACTGCGGG GCCCCGGCTC CGTACGCCAC TGCCTGTGGT CTCGATGTCT 9600
GTGTTTACCA CACCCACTTC CACCAGCACT GTCCTGTTAT AATCTGGTGT GGCCACCCGG 9660
CGGGTTCTGG TTCTTGTAGT GAGTGCGAAC CCCCCCTAGG AAAAGGCACA AGCCCTCTAG 9720
ATGAGGTGTT AGAACAAGTT CCGTACAAGC CTCCGCGGAC TGTGATCATG CACGTGGAGC 9780
AGGGTCTCAC CCCTCTTGAC CCAGGTAGAT ACCAGACTCG CCGCGGATTA GTCTCCGTTA 9840
GGCGTGGCAT CAGGGGAAAT GAAGTCGACC TACCAGACGG TGATTACGCT AGTACCGCCT 9900
TGCTCCCTAC TTGTAAAGAG ATCAACATGG TCGCTGTCGC CTCTAACGTG TTGCGCAGCA 9960
GGTTTATCAT CGGCCCACCC GGTGCTGGGA AAACACACTG GCTTCTTCAA CAAGTCCAGG 10020
ATGGTGATGT CATTTACACG CCAACTCACC AGACCATGCT CGACATGATT AGGGCTTTGG 10080
GGACGTGCCG GTTCAACGTT CCAGCAGGTA CAACGCTGCA ATTCCCTGCC CCCTCCCGTA 10140
CCGGCCCATG GGTTCGCATC TTGGCCGGCG GTTGGTGTCC TGGCAAGAAC TCCTTCCTGG 10200
ATGAAGCGGC GTATTGCAAT CACCTTGATG TCTTGAGGCT TCTCAGTAAA ACAACTCTCA 10260
CTTGCCTAGG GGACTTCAAA CAACTCCACC CTGTGGGTTT TGACTCCCAT TGCTATGTAT 10320
TTGACATCAT GCCTCAGACC CAATTAAAGA CCATCTGGAG GTTCGGGCAG AATATCTGTG 10380
ATGCCATTCA ACCAGATTAC AGGGACAAAC TTATGTCCAT GGTCAACACG ACCCGTGTGA 10440
CCTACGTGGA CAAACCTGTC AGGTATGGGC AAGCCCTCAC CCCCTACCAC AGGGACCGAG 10500
AGGACGGCGC CATTACTATC GACTCCAGTC AAGGCGCCAC ATTTGATGTG GTTACACTGC 10560
ATTTGCCCAC TAAAGATTCA CTCAACAGGC AAAGAGCTCT TGTTGCTATC ACCAGGGCAA 10620
GACATGCTAT CTTCGTGTAT GACCCACACA GGCAATTGCA GAGCATGTTT GATCTCCCCG 10680
CGAAAGGCAC GCCCGTCAAC CTCGCAGTGC ACCGTGACGA ACAGCTGATC GTATTAGACA 10740
GAAACAACAG AGAAATCACG GTTGCTCAGG CTCTAGGCAA TGGAGATAAA TTCAGGGCCA 10800
CAGATAAGCG CGTTGTAGAT TCTCTCCGCG CTATTTGCGC AGACCTGGAA GGGTCGAGCT 10860
CCCCGCTCCC CAAGGTCGCG CATAACTTGG GATTCTATTT CTCACCTGAT TTGACTCAGT 10920
TCGCTAAACT CCCGGCAGAA CTTGCACCCC ACTGGCCCGT GGTGACAACC CAGAACAATG 10980
AAAGGTGGCC AGATCGGCTG GTAGCCAGCC TTCGCCCTAT CCATAAATAT AGCCGTGCGT 11040
GCATTGGTGC CGGCTATATG GTGGGCCCCT CGGTGTTTTT AGGCACCCCT GGGGTTGTGT 11100
CATACTATCT CACAAAATTT GTTAGAGGCG AGGCTCAAAT GCTTCCGGAT ACAGTCTTCA 11160
GCACCGGCCG AATTGAGGTA GATTGCCGAG AGTATCTTGA TGATCGGGAG CGAGATGTTG 11220
CTGAGTCCCT CCCACATGCC TTCATCGGCG ATGTCAAAGG TACCACCGTT GGGGGATGTC 11280
ATCACGTTAC CTCCAAATAC CTTCCGCGCT TCCTTCCCAA GGAATCAGTT GCGGTGGTCG 11340
GGGTTTCGAG CCCCGGGAAA GCCGCGAAAG CAGTTTGCAC ATTGACGGAT GTGTACCTCC 11400
CAGACCTTGA AGCGTACCTC CACCCAGAGA CCCAGTCCAG GTGCTGGAAA GTGATGTTGG 11460
ACTTTAAGGA GGTTCGGCTG ATGGTATGGA AAGACAAGAC GGCCTATTTT CAACTTGAAG 11520
GCCGCCATTT TACCTGGTAT CAACTTGCAA GCTACGCCTC ATACATCCGA GTTCCTGTTA 11580
ATTCTACTGT ATACTTGGAC CCCTGCATGG GCCCTGCTCT TTGCAACAGA AGGGTTGTCG 11640
GGTCCACCCA TTGGGGAGCT GACCTCGCAG TCACCCCTTA TGATTACGGT GCCAAAATCA 11700
TTCTGTCTAG TGCATACCAT GGTGAAATGC CTCCAGGTTA CAAAATTCTG GCGTGCGCGG 11760
AGTTCTCGCT TGATGATCCA GTAAGGTACA AACACACCTG GGGATTTGAA TCGGATACAG 11820
CGTATCTGTA CGAGTTTACT GGAAATGGTG AGGACTGGGA GGATTACAAT GATGCGTTTT 11880
GGGCGCGCCA GAAAGGGAAA ATTTATAAAG CTAATGCCAC CAGCATGAGG TTTCATTTTC 11940
CCCCGGGCCC TGTCATTGAA CCAACTTTAG GCCTGAATTG AAATGAAATG GGGTCTATGC 12000
AAAGCCTCTT TAACAAAATT GGCCAACTTT TTGTGGATGC TTTCACGGAA TTTCTGGTGT 12060
CCATTGTTGA TATCATCATA TTTTTGGCCA TTTTGTTTGG CTTCACAATC GCCGGTTGGC 12120
TGGTGGTCTT TTGCATCAGA CTGGTTTGCT CCGCGGTACT CCGTGCGCGC TCTACCGTTC 12180
ACCCTGAGCA ATTACAGAAG ATCTTATGAG GCCTTTCTTT CTCAGTGTCA GGTGGACATT 12240
CCCACCTGGG GCGTCAAACA CCCTTTGGGG GTGCTTTGGC ACCATAAGGT GTCAACCCTG 12300
ATTGATGAAA TGGTGTCGCG TCGAATGTAC CGCGTCATGG ACAAAGCAGG GCAGGCTGCC 12360
TGGAAACAGG TGGTGAGCGA GGCTACATTG TCTCGCATTA GTGGTTTGGA TGTGGTGGCT 12420
CACTTTCAAC ATCTTGCCGC TATTGAAGCC GAGACTTGTA AATATTTGGC TTCCCGGCTA 12480
CCCATGCTGC ACAACCTGCG CTTGACAGGG TCAAATGTAA CCATAGTGTA TAATAGTACT 12540
TTGGATCAGG TGTTTGCCAT TTTCCCAACC CCTGGTTCCC GGCCAAAGCT TCACGATTTT 12600
CAGCAATGGC TAATAGCTGT ACATTCCTCC ATATTTTCCT CTGTTGCAGC TTCTTGTACT 12660
CTTTTTGTTG TGCTGTGGTT GCGAATTCCA ATGCTACGTT CTGTTTTTGG TTTCCGCTGG 12720
TTAGGGGCAA CTTTTCTTTT GAACTCATGG TGAATTACAC GGTATGCCCG CTTTGCCCAA 12780
CCCGGCAGGC AGCCGCTGAG ATCCTTGAAC CCGGCAAGTC TTTTTGGTGC AGGATAGGGC 12840
ATGACCGATG TAGTGAGAAC GATCATGACG AACTAGGGTT CATGGTTCCG CCTGGCCTCT 12900
CCAGCGAAGG CCACTTGACC AGTGTTTACG CCTGGCTGGC GTTCCTGTCC TTCAGCTACA 12960
CGGCCCAGTT CCATCCCGAG ATATTTGGGA TAGGGAATGT GAGTCGAGTT TATGTTGACA 13020
TCAAGCACCA AGTCATCTGC GCTGTTCATG ACGGGGATAA CGCCACCTTG CCTCGCCATG 13080
ACAATATTTC AGCCGTATTT CAGACCTACT ACCAACACCA GGTCGACGGC GGCAATTGGT 13140
TTCACCTGGA ATGGCTGCGT CCTTTCTTTT CCTCTTGGTT GGTTTTAAAT GTTTCGTGGT 13200
TTCTCAGGCG TTCGCCTGCA AGCCATGTTT CAGTTCGAGT CTTTCGGACA TCAAAACCAA 13260
CACCACCGCA GCATCAAACT TTGTTGTCCT CCAGGACATC AGCTGCCTTA GGCATGGCGA 13320
CTCGTCCTCT CCGACGATTC GCAAAATTTC TCAGTGCCGC ACGGCGATAG GGACGCCCGT 13380
GTACATCACC ATCACTGCCA ATGTCACAGA TGAAAATTAT CTACATTCTT CTGATCTCCT 13440
CATGCTTTCT TCTTGCCTTT TCTATGCTTC CGAGATGAGT GAAAAGGGAT TCAAAGTGGT 13500
GTTTGGCAAT GTGTCAGGCA CTGTGGCTGT GTGCGTCAAC TTTACCAGCT ACGTCCAACA 13560
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AGAACCATGC GGCCGTAATT AAAAAAAAAA AAAAAA 15336
Claims (1)
1.一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株GDr株，其特征在于：
（1）该弱毒疫苗株是由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD株强毒株病毒通过在Marc145细胞上连续传代后获得的；
（2）该弱毒疫苗株含有序列表中序列1所述的核酸序列；
（3）该高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株GDr株病毒，已于2010年02月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.3599；
（4）该毒株可用于制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。
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