CN1119933C - 用遗传工程生物杀虫剂控制昆虫的方法 - Google Patents

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Abstract

昆虫类害虫可以采用重组病毒和有机杀虫剂相结合的方法处理害虫或其活动场所而得到控制。重组病毒优选为杆状病毒。将重组的杆状病毒与化学杀虫剂相结合的方法，能在害虫(如昆虫)中产生剂量-反应，其作用强于加性效应。本发明的优选治理方法是使用能表达一种外源蛋白或毒素的重组杆状病毒和拟除虫菊酯杀虫剂。用本发明治理对拟除虫菊酯有抗性的害虫特别有效。

Description

用遗传工程生物杀虫剂 控制昆虫的方法
本发明一般性地涉及到用能表达外源蛋白的重组表达载体来控制昆虫，具体来说，是利用昆虫的病原体，优选为重组体，结合使用合成的化学杀虫剂以增强昆虫的杀灭率。
本发明得到政府支持，资助号No.5-T32-ES 07059，由国立卫生研究院(NIH)拔款，政府对本发明拥有一定权利。
鳞翅目昆虫中的夜蛾科(Noctuidae)包括一些在农业上最具破坏性的害虫，如棉铃虫属(Heliothis)、Heliocoverpa属、斜纹夜蛾属(Spodoptera)和Trichoplusia属。例如，在这一科中有烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、棉铃虫(Heliocoverpa zea)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、八字地老虎(Amathesc-nigrum)、透翅切根夜蛾(Crymodes devastator)、青铜地蚕(Nephelodesemmedonia)、草地贪夜蛾(Laphygma frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、豆杂色夜蛾(Peridroma saucia)。人们通常采用拟除虫菊酯杀虫剂来控制上述及其它的昆虫。野生型的杆状病毒在商业上的成功运用仍十分有限。
拟除虫菊酯杀虫剂目前在杀虫剂市场上占据着主导地位，销量每年在几十亿美元。然而，其销售已开始出现停滞的局面，部分原因是由于害虫对这些化合物普遍出现抗性。单就棉花来说，抗拟除虫菊酯(pyr-R)的棉铃虫(Heliothis spp.)已经开始造成每年上百万美元的损失。实际上，已有几例拟除虫菊酯杀虫剂完全不能控制棉铃虫属(Heliothis)幼虫侵害棉花的灾害发生，结果导致作物的彻底被毁。因而，人们已进行了大量努力以控制棉花中的抗拟除虫菊酯的棉铃虫。
农业生产者有时通过减少使用拟除虫菊酯杀虫剂，即等到生长后期才使用的方法来防止拟除虫菊酯抗性出现。因此，他们只得转向使用效果较差而价格更高的有机磷酸盐和氨基甲酸酯杀虫剂，而这些杀虫剂也同样受到抗性问题的困扰。因此，研制一种新型高效的杀虫剂来控制抗拟除虫菊酯的害虫，在任何管理策略中都有着极其重要的意义。
农业害虫对杀虫剂的抗性也导致了环境和人类健康所面临的危害，这些问题的出现是由于农业生产者对拟除虫菊酯(及其它杀虫剂)抗性的另一个反应造成的。他们采用增加杀虫剂的量、更多地使用非选择性和有毒化合物的方法，以克服害虫的抗性。而这产生了破坏性的恶性循环。
然而，合成化学药剂的使用，以拟除虫菊酯为例，已成为现代农业中一个组成部分，并且在维持我们目前的农业生产水平方面可能是必要的。尽管其它的控制剂，如前面提到的重组的昆虫病原体正被研究以用于害虫的控制。
最近，对杆状病毒科中的苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)通过遗传修改的方法，使其表达昆虫选择性毒素，以加快杀灭昆虫的速度。将昆虫选择性毒素导入昆虫病原性病毒，能使该昆虫宿主的致死时间缩短约30％。其描述见美国专利申请号08/229,417(1994年4月15日申请)，该专利是美国专利申请号07/629,603(1990年12月19日申请)的部分继续申请，包含(部分)一般性转让。
在这些建议使用的、控制昆虫的特异性毒素中，有来自苏云金芽孢杆菌(Baacillus thuringiensis)的毒素，蝎类的中Buthus eupeus的毒素和Androctonusaustralis的毒素，和螨类的虱状蒲螨(Pyemotes tritici)毒素。更进一步，Hammock等(“自然”(Nature)，344，pp 458-461，1990)描述了用JHE控制昆虫，见美国专利申请号No.07/927,851(1992年8月10日申请)和美国专利5,098,706，1992年3月24日公布，两者均为一般性转让。
一种新的能控制带抗性的以及易感性的有害昆虫群体的方法将是很有必要的。
本发明的其中一个方面提供了一种控制害虫的方法。适合于本发明控制的害虫例如有群聚昆虫、蜱螨类和线虫。对这些害虫(或它们的活动场所)采用将重组病毒和有机杀虫剂协同作用的方法进行处理。重组病毒优选为重组的杆状病毒，它在感染后的害虫细胞中能表达一种外源蛋白或其功能性衍生物。
本发明的处理方式可以是同时进行的(如将重组病毒和有机杀虫剂预混合后使用)。也可以先用病毒处理害虫或其活动场所，然后在约24小时内再用有机杀虫剂处理。
图1说明了蕃茄植株在受昆虫幼虫侵袭前后的变化情况，以阐述结合运用重组杆状病毒进行昆虫控制的特性。
本发明是利用遗传工程的昆虫病毒，结合使用合成的化学杀虫剂的方法来治理害虫，如昆虫。虽然是用杆状病毒作为例子贯穿全文来说明，但这一发明可采用不同的昆虫病毒来实施，包括DNA病毒和RNA病毒。通过将杆状病毒作为昆虫病毒的一个例子，我们发现重组病毒和化学杀虫剂相结合有一相互作用，其效果强于仅用单一方法的效果。我们首先来描述适合于实施本发明的重组杆状病毒。
用“杆状病毒”杀虫剂，指的是杆状病毒科中的任何杆状病毒，如核型多角体病毒(NPV)。杆状病毒是进化上相关的一大类病毒，只感染节肢动物(anthropods)。的确，有些杆状病毒只感染一些侵害有重要经济价值的衣林作物的害虫，而其它一些杆状病毒已知能专一性地感染别的昆虫类害虫。由于杆状病毒只感染节肢动物，因此，对人或环境危害很小或没有危害。
在适合的DNA病毒中，除了杆状病毒科的病毒外，还有昆虫痘病毒(EPV)。例如Melolontha melonothaEPV、桑灯蛾(Amsacta moorei) EPV、亚洲飞蝗(Locusta migratoria)EPV、血黑蝗(Melanoplus sanguinipes)EPV、沙漠蝗(Schistocerca gregaria)EPV、埃及伊蚊(Aedes aogypti)EPV和Chironomusluridus EPV。其它适合的DNA病毒为颗粒体病毒(GV)。合适的RNA病毒包括披膜病毒、黄病毒、小RNA病毒、质型多角体病毒(CPV)等等。双链DNA的Eubaculovirinae亚科包括两类：核型多角体病毒(NPVs)和颗粒体病毒(GVs)。由于它们在生活史中产生包涵体，因而在生物控制方面特别有用。颗粒体病毒(GVs)的例子包括苹蠹蛾(Cydia pomonella)GV、大菜粉蝶(Pierisbrassicae)GV、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)GV、菜粉蝶(Artogeia rapae)GV和印度谷螟(Plodia interpunctella)GV。
适宜于实施本发明的杆状病毒可以是有包涵体病毒，也可以没有。核型多角体病毒(NPV)是杆状病毒中的一个带包膜的亚群。即核型多角体病毒群的一个显著特征是许多病毒颗粒包埋在晶状的蛋白质基质中，这种基质称为“包涵体”。核型多角体病毒的例子有卷叶蛾(Lymantria dispar)核型多角体病毒(gypsy moth NPV)，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(MNPV)、芹菜夜蛾(Anagrapha falcifera)核型多角体病毒(celery looper NPV)、Spodoptera litturalis NPV，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)NPV、棉铃虫(Heliothis armigera)NPV、Mamestra brassicae NPV、云杉卷叶蛾(Choristoneura fumifrana)NPV、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)NPV、美洲棉铃虫(Heliocoverpa zea)NPV和Rachiplusia ou NPV。在田间使用中，以带包膜的病毒为优选，这是由于病毒的多角体包膜为其内部具传染性的核壳提供了保护，因而使它更为稳定。
能说明实施本发明有效的杆状病毒为：芹菜夜蛾(Anagrapha falcifera)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、油桐尺蠖(Buzura suppressuria)、苹蠹蛾(Cydia pomonella)、美洲棉铃虫(Heliocoverpa zea)、棉铃虫(Heliothisarmigera)、Manestia brassicae、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、Spodoptera littoralis和Spodoptera litura杆状病毒。实施本发明一个特别有用的“NPV”杆状病毒是AcNPV，它是来自苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)的核型多角体病毒，该病毒引起人们特别感兴趣的原因是斜纹夜蛾属(Spodoptera)、Trichoplusia属和棉铃虫属(Heliothis)中的主要害虫易感染上该病毒。
这些杆状病毒可以通过遗传工程手段，构建成具有更强杀虫效果的病毒，即可以将编码一种外源蛋白(例如昆虫毒素)的基因，克隆到杆状病毒的基因组上。用于说明的毒素来自蝎类的Buthus eupeus、Androctonus anstralis和螨类的虱状蒲螨(Pyemotes tritici)。
表达的外源蛋白(可以是糖蛋白)，优选为杀虫毒素，特别是节肢动物或其它无脊椎动物的毒素，如蝎毒素、黄蜂毒素、蜗牛毒素或蜘蛛毒素。有用的蝎子毒素如来源于Androctonus australis的毒素。有用的蜗牛毒液为来自蜗牛的芋螺毒素(锥壳蜗牛毒素)，它是由蜗牛口释放的，其中有些毒素显出对包括昆虫在内的节肢动物有选择性。如参阅Olivera等的“Conus属的神经肽的多样性”(Diversity of Conus Neuropeptides)(“科学”(Science)，249：257-263(1990)。
来自Androctonus australis的兴奋性毒素(AaIT)的氨基酸序列已被确定，并发表在1982年Darbon，AaIT毒素对昆虫有毒性，而对等足类(isopods)和哺乳动物无毒。
其它的不同种类的蝎毒素，如Buthoid scarpion的毒素也可以应用。例如LqqIT2毒素，这是从Leiurus quinquestriatus quinquestriatus获得的一种抑制性毒素。获取这种神经毒素的纯化方法已由Zlotkinn等发表在“生物化学和生物物理学文献”(Archives of Biochem.Biophys.)240：877-887(1985)上。
BjIT2是另一种抑制性昆虫毒素，来自Buthotus judaicus，纯化方法由Lester等发表在“生物化学和生物物理学报”(Biochem.Biophys.Acta)701：370-38l(1982)上。BjIT2以两种异构体形式存在，其差别在于氨基酸序列的位置15上，异构体I在该位置上为异亮氨酸，异构体II则为缬氨酸。
LqhIT2是来自Leiurus quinquestriatus hebraeus的另一种抑制性昆虫毒素，其纯化是经过反相高效液相色谱而获得的。
还发现一种“中间态”的毒素，它能影响昆虫的钠通道，作用方式同α毒素影响哺乳动物钠通道的方式非常相似。这一种神经毒素是由黄色的Leuirus quinquestriatus hebraeus蝎(Buthinae，Bnthidae)产生的，本文中称之为Lqhp35。该毒素的鉴定和纯化见Citan等的描述，见“源自Lenirusquinquestriatus hebraeus毒液的昆虫毒素”(Toxin to Insects Derived from theVenom of the Leiurus quinquestriatus hebraeus)一文，发表在“生物化学”(Biochemistry)，29，5941-5947(1990)，并更名为LqhαIT。
从Chactoid scorpion(Scorpio maurus palmatus)的毒液中纯化的其它毒素，也能应用。如SmpIT2毒素，是从Chactoid scorpion(Scorpio mauruspalmatus)中得到的抑制性昆虫毒素，其纯化见Lazarovici等的报道(“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)257：8397-8404(1982))。
其它的从Chactoid scorpion(Scorpio maurus palmatns)的毒液中纯化得到的毒素还有SmpCT2和SmpCT3，以及甲壳类毒素，它们的纯化见Lazarovici的博士论文(耶路撒冷Hebrew大学，1980)“Scorpio maurus palmatus蝎(Scovpionidae)毒液组成和作用的研究”。
为控制昆虫而构建重组的杆状病毒时，需优选包含一段分泌信号序列。这一序列可以来源于细菌、酵母、真菌或高等真核生物(包括动物和植物)的蛋白质(如参考Watson在“核酸研究”(Nucl.Ac.Res.)12：5145-5164(1984)中的文章)。较优选的是来源于昆虫蛋白的分泌信号序列，象来自惜古比天蚕蛾(Hyalophora cecropia)的杀菌肽B的分泌信号序列(见Van Hofsten等在“国家科学院院刊”(PNAS)，82：2240-2243(1985)的文章)，以及烟草天蛾(Manducasexta)的脱壳激素(Horodyski等“国家科学院院刊”(PNAS)，86：8123-8127(1989))。优选的还有与蝎毒素天然相连的分泌信号序列，这些序列可以通过分析mRNA、cDNA或基因组DNA来确定。其中更为优选的是AaIT的天然分泌信号序列(见Bougis等“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)，264：19259-19265(1989))。
外源蛋白或毒素可以表达为该毒素的功能性衍生物。毒素的“功能性衍生物”是具有生物活性(功能上或结构上)的一种化合物，其活性与该毒素的生物学活性大致相同。“功能性衍生物”一词意在包括一个分子的“片段”、“变体”、“类似物”和“化学衍生物”。一个毒素类分子的“片段”指该分子的任何多肽类附属结构。一个毒素类分子的“变体”是指结构上或功能上与整个毒素分子或其片段大致相同的分子。“大致相同”是指两个分子在结构上大致相同，或者具有类似的生物活性。因此，假如两个分子有相似活性，按照上述定义，即使其中一个分子的结构在另一分子中没有，或者即使氨基酸残基的序列不完全相同，那么也认为它们是“变体”。一个毒素类分子的“类似物”是指一个分子同另一个分子的整体或部分片段具有大致相同的功能。按这里的定义，当一个分子包含额外的化学结构，而该结构在正常情况下不属于另一分子的一部分时，就称该分子为另一分子的“化学衍生物”。
这些结构可以提高分子的可溶性、吸收作用和生物半衰期等。具有这些作用的结构揭示在Remington的“制药科学”(Pharmaceutical Sciences)(1980)。将这些结构连到分子上的技术已是广为人知。
毒素的表达，一般来说要包括一段启动子片段，其长度足于引导RNA合成的起始。杆状病毒的一个基因是编码多角体蛋白的。由于多角体蛋白是已知的真核基因中表达率最高的，因此，尽管其它启动子和杂合的启动子序列也可以应用，但仍以多角体蛋白启动子为优选。
如后面将要进一步说明的，我们从苜蓿银纹夜蛾(Aulographa californica)构建了一个特殊的重组杆状病毒，即把来自Androctonous australis(Hector)的一个编码昆虫毒素的基因克隆到AcNPV的基因组上，而毒素的表达受多角体蛋白的启动子控制。(这一重组体构建也描述在美国专利申请号No08/229,417(已注明参考书目)和“生物技术”(Bio/Technohgy)，9：848-852，1991中)。我们把这一特殊的用于说明具体实施的杆状病毒称为“AcAaIT”。但有人用“HIT”代替“IT”来指毒素(如见Loret等Biochemistry,29，pp1492-1501(1990)，作者把蝎子中几种有活性的神经毒素描述为“Androctonous australis Hector”。我们运用了这一重组的杆状病毒(比如与称为“WtAcNPV”的野生型AcNPV比较)，以下将有详细描述。然而，应该了解的是，尽管AcAaIT作为特殊优选，但本发明并不局限于这一用来例证的特殊的重组杆状病毒。
因此，以上描述的重组杆状病毒是实施本发明的一个部分或一个方面，而用本发明可以治理的害虫为群聚昆虫、蜱螨类和线虫类。可用以说明治理的昆虫类害虫有烟芽夜蛾、棉铃虫、棉叶波纹夜蛾、八字地老虎、透翅切根夜蛾、青铜地蚕、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾和豆杂色夜蛾。实施本发明的另一部分或方面，是将这些已描述的重组杆状病毒与化学杀虫剂相结合。
可实施本发明方法的合成有机杀虫剂包括：钠离子通道兴奋剂(如拟除虫菊酯)、钠离子通道阻断剂(如吡唑啉)、乙酰胆碱酯酶抑制剂(如：有机磷酸盐和氨基甲酸酯)、烟酰乙酰胆碱结合剂(如：咪蚜胺)、γ-氨基丁酸能的结合剂(如：emamectin和fipronil)、真蛸胺的兴奋剂或拮抗剂(如：甲脒)以及氧化磷酸化的解偶联剂(如：吡咯杀虫剂)。
如下文中实验部分将要进一步举例说明的，我们运用了低剂量的氯氰菊酯(II型拟除虫菊酯)或丙烯除虫菊酯(I型拟除虫菊酯)，与野生型的AcNPV(WtAcNPV)或AcAaIT(大于99％致死的浓度)相结合，处理烟芽夜蛾(H.virescens)幼虫以说明本发明。
将重组的AcAaIT与上述提到的任何一种拟除虫菊酯(即使是小剂量的)相结合使用，能产生一个剂量-反应，其效果大于增效作用。因此，使用本发明重组的AcAaIT与丙烯除虫菊酯或氯氰菊酯相结合作用于昆虫幼虫时，能比用野生型WtAcNPV分别减少半致死时间54.8％和64.6％。这些数据说明了一个令人惊奇的特性和本发明的优点。也就是说，拟除虫菊酯和AaIT相互作用能产生超过增效作用的杀灭速度，也提高了AcAaIT的杀灭速度(即其效果大于单一效果的代数和)。更令人惊奇的结果是：烟芽夜蛾的抗性品系比杀虫剂易感品系对重组杆状病毒更为敏感，证明了本发明有着潜在的应用价值。
抛开理论束缚，我们认为同时使用AaIT和拟除虫菊酯能对钠通道产生协同作用。那些与重组杆状病毒结合使用时能产生协同作用的毒素，似乎可以根据其作用机理进行推测。根据其作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的活性预测的有机磷酸盐和氨基甲酸酯，结果也都发现有协同作用。
因此，在实施本发明中，所控制的害虫(和/或处理的活动场所)是采用重组杆状病毒和有机杀虫剂相结合的方法进行处理，而该有机杀虫剂能按其作用机理预测其协同作用。采用两者相结合处理害虫时，也可以简便地用单一混合制剂的方法。
本发明还提供一种治理抗有机杀虫剂的害虫的方法，包括：
确定有机杀虫剂的第一量，害虫对该杀虫剂有抗性，所述的第一量要足以杀死至少约一半的昆虫；以及
对所述害虫的活动场所，用所述有机杀虫剂接第二量用药，结合重组杆状病毒，该病毒能够在所述害虫的感染细胞中表达一种外源蛋白，所述第二量低于决定用量步骤中的第一量，而有机杀虫剂和重组杆状病毒结合使用杀死速度要快于单用杀虫剂或杆状病毒的杀死速度。
众所周知，有机杀虫剂的使用可以采用喷洒、喷雾、撒粉、散射或倾倒等方法，也可按配方制成粉剂、粉末、颗粒状或装入聚合物胶囊。在实施本发明时，可以运用上述常规的方法，而优选的方法是将有机杀虫剂和重组的杆状病毒按照所需的比例混合，典型的可以添加入惰性的载体。如粘土、乳糖、脱脂豆粉等以助于使用。
但也可以将每一组分分开来使用，即先用杆状病毒处理，然后用有机杀虫剂(最好在48小时之内)。当先用杆状病毒(接着用有机杀虫剂)时，可以采用象喷洒这样的常规方法。先使用杆状病毒的一个优点是能产生“掉落”特性，这将在下文的实施例3中进行描述。
                     实施例1
实验中用到的重组体AcAaIT是以重组转移载体pAcUW2(B)·AaIT形式构建的，它能通过口传染并能表达一种昆虫选择性毒素(AaIT)，该毒素是从蝎类的Androc tonus autralis中分离到的，受p10启动子控制。这一重组体的构建较早报道在“生物技术”(Bio/Technology)，9：848-852(1991年9月)中。简要地说，转移载体pBK283中的AaIT毒素基因(在此有时也称AaHIT)用SacI和XbaI消化，切下完整的AaIT基因，这其中包含了一段分泌所需的家蚕素的信号序列，将DNA片段插在pTZ-18R质粒的SacI和XbaI位点之间。用SacI切开该质粒，并将SacI-BamHI-SacI人工接头插在该位点上。最后得到的质粒含有2个BamHI位点，一个靠近毒素cDNA的5′末端，另一个位于终止密码子和起始片段的XbaI酶切位点之间。连接头和AaIT基因的插入用BamHI酶切、1％琼脂糖凝胶电泳和筛选所得300 bp片段的方法来证实。实验中采用Gene Clean(Biol 01)的方案以便回收约30％的毒素片段，用于插入转移载体。
将pAcUW2(B)质粒载体酶切和去磷酸化，把酶切下来的AaIT基因片段连接到该质粒载体的BglII克隆位点上，再转化到大肠杆菌JM101菌株中。连接的结果去除了BglII和BamHI位点，所得的质粒进行筛选，看是否含单一SacI位点。用1％琼脂糖凝胶电泳从60个克隆中鉴定出3个SacI阳性克隆。插入的方向是通过SacI(其酶切位点在AaIT基因的5′末端)和BamHI(酶切位点在转移载体上多角体蛋白基因的编码序列中)的双酶切来验证。3个重组转移载体中的2个以正确的方向携带了AaIT基因，并且有一段长度约1.6kb片段诱导正确定位。这样构建的质粒最后导致AaIT的cDNA序列，插在复制的p10蛋白启动子的下游序列和多角体蛋白基因5的上游序列之间，由此构成了重组质粒pAcUW2(B)·AaIT。
                  重组AcNPV的分离
在补充了2.5％的胎牛血清的ExCell 400(JR Scientific)培养基上培养草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(Sf-9)。将Sf-9细胞连同pAcUW2(B)质粒和多角体蛋白阴性AcNPV DNA一起，用钙沉淀法进行共转染。感染5天之后鉴定、收集多角体蛋白的感染细胞，重组病毒用挑取多角体蛋白阳性噬斑的方法进行纯化。纯化时用1％SDS(十二烷基磺酸钠)处理每次噬斑纯化后的细胞，以排除多角体蛋白阴性的非重组病毒，从而加速纯化过程。在重组病毒的初次噬斑试验之后，对单个噬斑再连续进行3轮纯化，培养最终所得的纯的重组体培养，并保存在4℃和-80℃。
        重组体AcUW2(B)·AaIT生物学活性的筛选
重组病毒经初次噬斑试验纯化后，总共分离到6个噬斑，将它们悬浮于500μl加了25％胎牛血清的ExCell培养基中。在35mm培养皿上生长的Sf-9细胞中(75％单层细胞)接种100μl(含约106噬斑形成单位)的悬液，感染7天后收集细胞。将收集起来的单个培养物在1000g下离心5分钟，收集上清液，并与沉淀的细胞分离开。再将细胞重悬于双蒸水，用1％SDS处理，震荡5分钟，洗涤三遍。粗略计算上清液中每毫升的噬斑形成单位数。
                      实施例2
具体死亡率的研究用2龄烟芽夜蛾(H.virescens)幼虫进行，详尽的描述见较早引用的论文(“生物技术”(Bio Technolgy)，Vol.9)中的实验方案。致死时间来自用重组体和野生型AcNPV处理2龄烟芽夜蛾(H.virescens)幼虫所得的结果，采用的剂量为常用的每片食物中含250个多角体蛋白包涵体(PIBs)。
表1给出了用AcUW2(B)AaIT(AcAIT)和野生型AcNPV处理烟芽夜蛾(H.virescens)2龄幼虫的剂量-反应和死亡时间。
                   表1 处理                      LD(PIBs)         LT(小时)
                    10   50   90    10    50    90重组体AcUW2(B)  AaIT    1.56  13.3  113    59.8a 88.0a 129a野生型AcNPV             2.72  21.9  175    91.4   125    172a表示与其它处理方式有显著差异-POLO概率值分析程序(C.I.0.95)PIBs＝多角体蛋白包涵体LT＝致死时间；    LD＝致死剂量
这些数据证明了AcUW2(B)·AaIT对烟芽夜蛾(H.virescens)幼虫的杀灭速度明显快于野生型的AcNPV。
                      实施例3
感染了重组体AcAaIT的幼虫，在死亡之前的10-15小时典型地出现麻痹的症状，并开始停止摄食。因此，可把这些幼虫看成为功能性死亡。用AcAaIT处理幼虫寄主比用野生型AcNPV的杀死时间减少40％。
我们设计了实验来评价烟芽夜蛾(H.virescens)的幼虫受病毒感染后，摄食蕃茄植株所造成的植株损害的差异。各植株都用2条4龄幼虫，三组幼虫分别是未经感染的对照组(I)、48小时前感染野生型AcNPV组(II)和感染重组体AcAaIT组(III)。这些幼虫可以在植株上连续摄食直至死亡。
经AcAaIT处理的幼虫对植株的摄食损伤明显要少。然而，不明显的是感染了AcAaIT的幼虫不能给蕃茄植株造成更多的危害，因为这些幼虫从植株上掉落下来。事实上，我们观察到在感染AcAaIT的8条4龄和5龄幼虫中，有5条在感染120小时后从植株上掉落下来。这些幼虫显然已不能爬回植株，因为它们已开始出现麻痹症状，这一现象有时被称为“掉落”特性，说明见图1。
在图1中，A组照片显示的是受幼虫侵害之前的蕃茄植株。因此，图IA为幼虫侵害之前的对照组植株，IB表示该植株在受无病毒感染的幼虫自由摄食、直至实验停止时的状况。如图(图片是按照片复制)所示，对照组的蕃茄植株被幼虫严重摄食。图IIA也是未引入幼虫时的蕃茄植株，IIB是该植株中引入了已感染野生型AcNPV的幼虫，经190-200小时的摄食，幼虫死亡、实验终止时的情况(此时IB、IIB、IIIB实验都终止)。尽管IIB植株经受幼虫死亡之前200小时左右的摄食侵害，但仍可看出它比IB组的状况有很大改善。当我们比较IIIA(实验开始)和IIIB(实验结束)时，可以看出IIIB植株在实验结束时的叶子还相当多。这是由于新构建的杆状病毒AcAaIT感染幼虫后，幼虫的行为在死亡之前受到严重影响，结果8条幼虫中的5条经120小时摄食之后，从植株上掉下来。其余3条不久之后也从植株上掉落下来。
表2证实了昆虫受到刺激之后大量时间不摄食，或爬离食物基质的情况。
                     表2感染期间烟芽夜蛾幼虫离开食物基质的时间百分比。食物基质   AcAaIT   野生型病毒棉花        80.40％    13.30％长叶莴苣    64.20％    15.40％玻璃生菜    85.90％    13.20％食物        59.90％    11.00％
为获得如表2所概括的资料，新生幼虫用含病毒包涵体2000 PIBs/μl的浓度小滴喂养，并每隔6-8小时检查，幼虫按是否在食物基质上分别计数，并概括成上述表2。在感染后64小时，所有烟芽夜蛾幼虫中有超过57％不在食物基质上，而野生型的比例为32％(此时还未表现出症状)。这一实验的目的是为了证实感染了AcAaIT的幼虫在死亡之前已处于麻痹状态(或其摄食行为已终止)，而在野生型病毒感染的昆虫中，没有这一现象。有可能的是，低浓度的神经毒素AaIT在感染幼虫早期会刺激幼虫宿主，从而出现“掉落”或摄食终止现象。尽管幼虫仍有摄食和危害的可能性，但它已不能接近植株。由于麻痹作用而使幼虫宿主减少了危害时间和提前出现活动抑制。AcAaIT有效地减少了宿主的食物消耗，因而也就可解释为对植株摄食危害的减小。
                         实施例4
人们常常引用致死慢和由此造成作物损害，来说明病毒杀虫剂在商业上成功的主要局限。能在24小时至48小时内使害虫致死是经典杀虫剂的共同目标。因此，在本项研究中我们重点研究用致死时间(LTs)表示的杀灭速度。相似的方法也可以用来确定致死剂量，而该指标有着重要的经济意义。
如表3A和3B所概括的那样，我们研究了六种杀虫剂在小剂量时(24小时死亡率10-20％的浓度，见表4)，同野生型AcNPV或重组AcAaIT(＞LC99)相结合使用对新生的烟芽夜蛾(H.virescens)幼虫的作用。例如，两种研究的化合物为拟除虫菊酯和丙烯除虫菊酯(I型拟除虫菊酯)。在研究中，我们发现低浓度的丙烯除虫菊酯或氯氰菊酯(cypermethrin)与野生型AcNPV相结合使用时，产生次加性反应(subadditive response)。因此，将丙烯除虫菊酯和野生的AcNPV相结合能使半致死时间缩短至71.9小时，比单独使用AcNPV的时间减了17.9％(理论上加性效应的时间为53.1小时)；同样，氯氰菊酯同野生型AcNPV相结合产生的半致死时间为65.8小时，比单用野生型AcNPV所需时间减少了24.2％(理论上两者结合的半致死时间为52.1小时)。这些结果表明：拟除虫菊酯和野生型AcNPV在作用上是相互独立的，但产生一个次加性反应，因为两者结合使用时产生正效应，尽管其作用大小要明显低于理论值(加性效应)。
            表3A  杀虫剂与野生型和重组杆状病毒结合化合物         通用名          类型        作用方式       来源丙烯除虫菊酯    Cinerine，    I型拟除虫菊酯  钠通道兴奋剂   RousselUclafDiv
            Alleviate，                                 Agrovetennaire，
            Bioallethrin                                Paris，France氯氰菊酯        Ammo，       II型拟除虫菊酯  钠通道兴奋剂   ICIAmcricas(Zeneca)
            Cymbush，                                   Goldsboro，NC
            Cynoff，
            Cyperkill，
            Fenom，
            Arrivo二氯二苯        DDT          氯代烃         钠通道兴奋剂    由加州大学Davis分校的三氯乙烷                                                    B.D.Hammock合成硫丹            Thiodan，    环二烯类       GABA通道兴奋剂  FMC Corp
            Cyclodan，                                  Ag Chemical Group
            Thiosulfan.                                 Middleport，NY
            Malix，
            Thionex，
            Tiovel灭多虫          Lannatc，    氨基甲酸酯     AChE抑制剂     E.I.DuPont de Nemours&Co
            Nudrin                                     Wilmington DE溴丙磷    Curacon，Polycron  有机磷酸盐     AChE抑制剂     Ciba-Geigy Greensboro，NC
            SelecronGABA，γ-氨基丁酸；AChE，乙酰胆碱酯酶
                         表3B新生的烟芽夜蛾幼虫对重组体或野生型AcNPV和低浓度的经典杀虫剂的时间-反应
处理方式 a  数目    斜率±       LT 10 (h：95％       LT 50 (h：95％           LT 90 (h：95％ 标准误差     置信极限)           置信极限)              置信极限)WtAcNPV      204   9.26±0.41   64.9(59.0-69.7)      89.8(85.0-93.4)          123(115-134)AcAalT       276   7.73±0.25   47 9(44.8-50.6)      70.2(68.0-72.4)          103(98.3-109)AcJHE.KK     90    7.14±0.53   50.5(24.1-62.7)      76.3(60.8-99.7)          115(91.5-266)丙烯除虫菊酯 114   1.46±0.19   17.3(11.5-22.5)      132(106-185)             1000(552-2680)丙烯除虫菊酯 125   3.54±0.20   17.5(12.6-21.7)      40.2(34.9-45.5)          92.5(78.2-118)+AcAaIT丙烯除虫菊酯 129   2.31±0.19   20.0(16.1-23.5)      71.9(65.5-80.0)          258(205-354)+WtAcNPV氯氰菊酯     110   1.49±0.24   17.1(7.99-24.8)      124(97.5-195)            902(436-4190)氯氰菊酯     112   3.19±0.27   12.5(5.60-18.5)      31.5(22.7-38.1)          79.0(65.3-111)+AcAaIT氯氰菊酸     109   2.09±0.23   16.0(10.9-20.7)      65.8(59.3-73.8)          270(203-418)+WtAcNPV氯氰菊酯     83    3.81±0.27   24.2(18.7-28.8)      52.5(47.3-58.0)          114(97.8-142)+AcJHE.KKDDT          80    1.45±0.30   12.6(3.90-23.8)      96.7(73.5-165)           740(318-10320)DDT+AcAaIT   80    3.12±0.32   16.0(7.84-23.0)      41.2(31.4-48.7)          107(84.6-160)DDT+NPV      80    2.25±0.29   17.7(5.78-28.2)      66.0(49.9-84.6)          245(159-688)硫丹         80    1.51±0.27   10.4(3.75-17.3)      73.3(61.0-90.3)          514(296-1580)硫丹         80    4.23±0.35   23.8(16.5-29.7)      47.7(40.6-54.2)          95.4(81.6-121)+AcAaIT硫丹         80    2.57±0.30   24.7(14.5-33.0)      78.1(66.7-93.6)          247(176-460)+WtAcNPV灭多虫       125   0.69±0.20   4.84(0.12-13.1)      358(182-4070)         26563(2870-1.25×108)灭多虫       125   3.27±0.28   13.7(9.16-17.8)      34.3(29.2-38.8)          85.7(73.3-108)+AcAaIT灭多虫       125   2.37±0.22   14.6(8.34-20.2)      50.3(42.5-58.1)          173(132-276)+WtAcNPV溴丙磷       150   0.76±0 19   8.10(2.61-17.5)      401(260-676)          19810(9472-1.88×104)溴丙磷       150   3.81±0.23   24.5(20.3-28.2)      53.2(49.2-57.1)          115(103-133)+AcAaIT溴丙磷       150   2.33±0.19   16.5(108-21.6)       58.5(52.0-65.2)          208(163-302)+WtAcNPV
a剂量反应曲线是根据烟芽夜蛾的新生幼虫对经典杀虫剂的反应作出的，用NPV感染新生幼虫是采用小滴喂养法让幼虫感染2000个多角体蛋白的包涵体，三种使用的NPV包括WtAcNPV，AcAalT和AcJHE.KK。要与杀虫剂结合处理的幼虫要立即转到经过10-20％致死浓度(24小时)处理过的小瓶子中。死亡率每隔8-12小时记录，数据用log概率值分析程序(POLO-PC)进行分析。
然而，如表5的数据所示，将重组的AcAaIT同小剂量的一种拟除虫菊酯相结合，能产生大于加性效应的剂量-反应。因此，我们观察到AcAaIT同丙烯除虫菊酯或氯氰菊酯(cypermethrin)相结合能使半致死时间比单独用AcAaIT分别减少30.0％和38.7％。将AcAaIT与丙烯除虫菊酯或氯氰菊酯相结合处理的半致死时间分别为感染后40.2小时和31.5小时(表3)，两者都分别低于45.8小时和44.8小时的理论值(加性效应)。这些数据提示拟除虫菊酯和AaIT之间能相互作用产生快于增强作用(potentiation)的杀灭速度，并且协同增强了AcAaIT的杀灭速度(增补协同作用(supplemental synergism)-即作用效果快于单个效果的代数和)。
将另一个重组体病毒AcJHE.KK用作重组体NPV和AcAaIT的对照。AcJHE.KK表达保幼激素酯酶的修饰态。该酶来源于昆虫，并在许多鳞翅目昆虫中有着重要的调节发育的作用。修饰后的JHE显示出对几种鳞翅目昆虫有杀灭效果(Bonning和Hammock，1994)。尽管JHE.KK的作用模式尚未完全了解。但我们认为它并不干扰昆虫的神经系统。我们发现，当AcJHE.KK与氯氰菊酯共同作用于昆虫时，半致死时间减少了23.8％，为52.5小时，显著高于47.2小时这一两者共同作用的理论时间，表明它是一种次加性效应(subadditive)，而非增补协同效应(supplemental effect)(见表5)。由于AcJHE.KK同AcAaIT有着相近的半致死时间，这些数据表明拟除虫菊酯并非无选择性地增强任何杆状病毒杀灭昆虫的速度。因此，进一步支持了重组病毒AcAaIT和拟除虫菊酯杀虫剂之间有着增补协同关系。
如表3B所示，另一种钠通道兴奋剂DDT也被选来与NPV病毒一起作用。将DDT和野生型AcNPV结合使用能比单独用野生型AcNPV缩短24％的半致死时间，为66.0小时(表3B)。数据显示，这一结合作用产生了次加性效应(理论时间为46.7小时)。将DDT与AcAaIT相结合比单用AcAaIT减少29.0％的半致死时间(为41.2小时)。这两者结合使用显示出纯粹的加性效应(即理论值＝实际值)，因为理论的半致死时间为40.8小时，与实际时间非常接近。
另一杀虫剂硫丹(环二烯类)也被用来与NPV结合，以研究两者的相互作用。有趣的是，当硫丹与野生型AcNPV结合作用时显示出拮抗作用，两者结合时的半致死时间为78.1小时，比单独使用杀虫剂的73.3小时的半致死时间长，表明了有拮抗反应。而当AcAaIT与硫丹结合作用时，半致死时间为47.7小时，明显快于单用AcAaIT或硫丹作用所需时间，表明为次加性反应。
另外还用氨基甲酸酯(灭多虫methomyl)和有机磷酸盐(溴丙磷profenofos)杀虫剂分别结合AcNPV或AcAaIT进行研究。有趣的是，两种杀虫剂与野生型AcNPV结合使用时产生增补协同作用。灭多虫和野生型AcNPV相结合作用的半致死时间为50.3小时，而理论的反应时间为71.9小时(表3)。同样，溴丙磷同野生型AcNPV结合使用的半致死时间的58.5小时，而理论的加性反应时间为73.5小时。类似地，灭多虫或溴丙磷同AcAaIT结合也产生增补协同反应。灭多虫或溴丙磷与AcAaIT结合的半致死时间分别为34.3小时和53.2小时。AcAaIT和灭多虫结合作用时的杀灭速率比单用野生型AcNPV快61.8％，比单用重组AcAaIT也快36.0％。溴丙磷同AcAaIT结合使用比单用野生型AcNPV和重组的AcAaIT的杀灭时间分别缩短了40.8％和17.0％。
总之，我们的数据表明，拟除虫菊酯杀虫剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂似乎为重组病毒AcAaIT在田间使用中的增效作用提供了最大可能，因此，使用重组的AcAaIT成为特别优选。但其它表达AaIT基因的重组杆状病毒株也为优选(即HzAaIT或SfAaIT)。对拟除虫菊酯来说，这些数据提示，同时使用AaIT和拟除虫菊酯会对昆虫钠通道产生协同反应。基于这些结果，应该将不同剂量的拟除虫菊酯同AcAaIT或其它能表达AaIT基因的重组病毒结合起来试验，以确定田间使用效果。我们所建议的低剂量拟除虫菊酯，应对有益的节肢动物的作用尽量小，从而不会影响病毒对寄主的专一性。相信将两者相结合的方法在对付抗性的策略上是有用的。
氨基甲酸酯和有机磷酸盐杀虫剂都对周围神经系统有毒害作用。这些化合物抑制了乙酰胆碱酯酶，导致乙酰胆碱在神经突触区积聚，从而产生神经反应过多，导致昆虫麻痹。因此，将杀虫剂和肽毒素同时使用可产生增补协同反应。这一反应很难用病毒本身的原因来说明，即便病毒本身是有作用的。但是，核多角体病毒NPV能够感染神经细胞，并最终导致神经细胞裂解。可以想象得出，神经细胞由于NPV的侵染而裂解后，会造成周围神经系统中神经递质的增加，并导致神经肌肉的异常。这一作用可以解释野生型和重组NPV同灭多虫或溴丙磷结合使用时都会观察到的增补协同效应。
如前面所提到的，这些研究强调的是病毒和化学杀虫剂在联合使用时，对昆虫半致死时间的影响，但同样的方法也可以应用于研究剂量。在这里我们使用杀虫剂在24小时致死百分之十的剂量(LD10s)，以减少直接由化学杀虫剂造成的症状和死亡(表4)。在实际中，有多种因素会影响到使用的剂量，包括费用、生物和化学杀虫剂是否能得到、环保问题、田间种群的抗性水平和其它控制害虫所需考虑的问题。
                     实施例5
在这项研究中，我们比较了野生型和AcAaIT分别对拟除虫菊酯敏感和抗性(PEG)的烟芽夜蛾(H.viresceus)幼虫的致死时间(LTs)。从敏感的和抗性的新生幼虫对野生型AcNPV和重组的AcAaIT的反应看，非常相似。数据的统计分析(POLO-PC)表明，在斜率(PEG斜率为9.51，敏感幼虫为9.82，95％CL)和截距上无明显差异。而当这些病毒作用在拟除虫菊酯抗性幼虫上，以试验其效果时，出现了如下令人惊奇的结果，数据分析表明：野生型和重组AcAaIT之间的斜率(斜率PEG为13.9，敏感幼虫为7.73，95％CL)和截距有着明显差异。但我们的结果却显示：抗性品系而不是敏感品系更及时地被杀灭。Stoneville品系的90％致死时间(LT90)为感染后103小时，而PEG品系为78.1小时，表明杀死抗性品系的速率明显快了24.1％。
这些结果表明，重组的杆状病毒，如AcAaIT，可能对田间抗拟除虫菊酯的烟芽夜蛾幼虫比对易感性幼虫更为有效，因而可有效对付拟除虫菊酯抗性问题。
因此，本发明一方面是利用AcAaIT来控制对拟除虫菊酯有抗性的害虫类昆虫的暴发。而且，AcAaIT可以作为对付抗性的策略之一，延缓或防止田间拟除虫菊酯抗性的出现。除了减少抗性种群外，这一策略应扩展到提高拟除虫菊酯杀虫剂的功效。
                     实施例6
我们研究了几种杀虫剂在低剂量下与野生型AcNPV病毒或AcAaIT(＞LC99)配合使用对烟芽夜蛾新生幼虫的作用(24小时的LC10-LC20，表4)。所研究的两种化合物为拟除虫菊酯类的丙烯除虫菊酯(拟除虫菊酯I型)和氯氰菊酯(拟除虫菊酯II型)。研究发现，当低剂量的丙烯除虫菊酯或氯氰菊酯同野生型AcNPV结合使用时有次加性反应。
                     表4 化合物           数量   每小瓶中杀虫剂量(μg)   24小时的死亡率(%)丙烯除虫菊酯      121            0.05                   14.0氯氰菊酯          110            0.008                  11.8滴高涕            80             0.02                   18.8硫丹              80             0.002                  17.5灭多虫            125            0.02                   20.8溴丙磷            150            0.06                   16.3杀虫剂的致死浓度(LC10-LC20)摘自Campanhola和Plapp(1989)的结果。
参看以下表5，将丙烯除虫菊酯和野生型AcNPV结合使用，能使半致死时间减少到71.9小时(理论上的加性效应为53.1小时)，比单用野生型AcNPV缩短了17.9％。同样，当氯氰菊酯同野生型AcNPV结合作用，能使半致死时间为65.8小时(理论上为52.1小时)，这比单用野生型AcNPV缩短了24.2％。这些结果提示，拟除虫菊酯与野生型AcNPV相互独立作用，但能产生一个次加性反应，因为尽管两者相结合所产生的效果比理论上的相互作用(即加性效应)明显要小，但仍然为正效应。
将重组NPV(即AcAaIT)病毒同低剂量的拟除虫菊酯配合使用，能产生一个大于加性效应的剂量-反应。我们观察到，AcAaIT同丙烯除虫菊酯或氯氰菊酯相结合使用时，比单用AcAaIT分别减少30.0％和38.7％的半致死时间(LT50s)。将AcAaIT与丙烯除虫菊酯和氯氰菊酯配合使用时，半致死时间分别为感染后40.2小时和31.5小时(表5)。这两个半致死时间都分别低于45.8小时和47.2小时的理论致死时间(加性效应)，这说明它们之间有协同增强效应。
                               表5
    重组体或野生型AcNPV同低浓度经典杀虫剂的相互作用
   处理 a  实际杀死时间  理论杀死时间 b   与WtAcNPV   与RecNPV   作用 c (LT 50 )(小时)   (小时)       相比减少的  相比减少的 时间％    时间％WtAcNPV        70.2            ---           21.8        ---         ---AcAaIT         89.8            ---           ---         ---         ---AcJHE.KK       76.2            ---           15.0        ---         ---丙烯除虫菊酯   132             ---           ---         ---         ---丙烯除虫菊酯   40.2            45.8          55.2        30.0      增补作用+AcAalT丙烯除虫菊酯   71.9            53.8          17.9        ---       次加性效应+WtAcNPV氯氰菊酯       124             ---           ---         ---         ---氯氰菊酯       31.5            44.8          64.9        38.7      增补作用+AcAaIT氯氰菊酯       65.8            52.1          24.2        ---       次加性效应+AcJHE.KK氯氰菊酯       52.5            47.2          41.2        23.8      次加性效应+WtAcNPVDDT            96.7            ---           ---         ---         ---DDT+AcAaIT     41.2            40.8          54.1        29.0      加性效应DDT+WtAcNPV    66.0            46.7          24.0        ---       次加性效应硫丹           73.3            ---           ---         ---         ---硫丹+AcAaIT    47.7            36.0          46.9        22.6      次加性效应硫丹+WtAcNPV   78.1            40.7          11.9        ---       拮抗作用灭多虫         358             ---           ---         ---         ---灭多虫+AcAaIT  34.3            59.5          61.8        36.0      增补作用灭多虫+WtAcNPV 50.3            71.9          39.5        ---       增补作用溴丙磷         401             ---           ---         ---         ---溴丙磷+AcAaIT  53.2            59.9          40.8        17.0      增补作用溴丙磷+WtAcNPV 58.5            73.5          31.3        ---       增补作用
LT＝致死时间；RecNPV＝重组NPV
a剂量反应曲线是用烟芽夜蛾的新生幼虫对经典杀虫剂的反应作出的，用NPV感染幼虫是采用小滴喂养法让幼虫感染2000个多角体病毒包涵体。幼虫立即转移到经10-20％致死浓度(24小时)处理过的小瓶子中，每隔8-12小时计数一次。
b理论杀死时间＝1/[1/单用病毒的半致死时间+1/单用杀虫剂的半致死时间]
c作用-增补协同作用：实际时间＞理论时间；加性协同作用：实际时间＝理论时间；次加性作用：单独使用的最快时间＜实际时间＜理论时间；桔抗作用：实际时间＜单独使用的最快时间
前述例子用以说明本发明的部分具体实施方案，并无意限制本发明的范围。本发明的范围由所附的权利要求书限定。

Claims (33)

1、一种控制包括群聚昆虫、蜱螨类和线虫类害虫的方法，包括：
采用重组昆虫病毒和有机杀虫剂相结合的方法处理所述害虫或它们的活动场所，重组的昆虫病毒感染所述的害虫细胞后能够表达一种外源蛋白，将两者相结合的方法能有效地加快杀灭害虫的速度。
2、权利要求1的方法，其中该外源蛋白是一种昆虫毒素，或者是该昆虫毒素的功能性衍生物，对所述害虫具有活性。
3、权利要求2的方法，其中该昆虫毒素是一种蝎毒素。
4、权利要求1的方法，其中该昆虫病毒是杆状病毒。
5、权利要求4的方法，其中该杆状病毒是核型多角体病毒。
6、权利要求5的方法，其中该杆状病毒来自苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)、芹菜夜蛾(Anagrapha falcifera)、黎豆夜蛾(Anticarsiagemma talis)、油桐尺蠖(Buzura suppressuria)、苹囊蛾(Cydiapomonella)、美洲棉铃虫(Heliocoverpa zea)、棉铃虫(Heliothisarrigera)、Mariestia brassicae、小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、Spodoptera littoralis或Spodopteralitura。
7、权利要求1或5的方法，其中该有机杀虫剂是钠通道兴奋剂。
8、权利要求7的方法，其中该钠通道兴奋剂是拟除虫菊酯。
9、权利要求1或5的方法，其中该有机杀虫剂为乙酰胆碱酯酶抑制剂。
10、权利要求9的方法，其中该乙酰胆碱酯酶抑制剂是有机磷酸盐。
11、权利要求9的方法，其中该乙酰胆碱酯酶抑制剂是氨基甲酸酯。
12、权利要求1或5的方法，其中该有机杀虫剂是一种钠通道阻断剂。
13、权利要求12的方法，其中该钠通道阻断剂是吡唑啉。
14、权利要求1或5的方法，其中该有机杀虫剂是一种烟酰乙酰胆碱结合剂。
15、权利要求1或5的方法，其中该有机杀虫剂是γ-氨基丁酸能的结合剂。
16、权利要求1或5的方法，其中该有机杀虫剂是真蛸胺(octapamine)的兴奋剂或拮抗剂。
17、权利要求1或5的方法，其中该有机杀虫剂是氧化磷酸化的解偶联剂。
18、权利要求1或5的方法，其中该有机杀虫剂是结合到阳离子通道上的药剂。
19、权利要求18的方法，其中该有机杀虫剂是一种肽。
20、一种控制抗杀虫剂的害虫的方法，包括：
用重组昆虫病毒处理所述害虫或其活动场所，结合应用一定量的害虫对其有抗性的杀虫剂处理其活动场所，该重组病毒能在所侵染的害虫细胞中表达一种外源蛋白，杀虫剂的用量不超过应用于非抗性害虫的量，将重组昆虫病毒和杀虫剂有效结合能提高杀死所述害虫的速度。
21、权利要求20的方法，其中该昆虫病毒是杆状病毒。
22、一种治理抗有机杀虫剂的害虫的方法，包括：
确定有机杀虫剂的第一量，害虫对该杀虫剂有抗性，所述的第一量要足以杀死至少约一半的昆虫；以及
对所述害虫的活动场所，用所述有机杀虫剂按第二量用药，结合重组杆状病毒，该病毒能够在所述害虫的感染细胞中表达一种外源蛋白，所述第二量低于决定用量步骤中的第一量，而有机杀虫剂和重组杆状病毒结合使用杀死速度要快于单用杀虫剂或杆状病毒的杀死速度。
23、权利要求20或22的方法，其中该杀虫剂是拟除虫菊酯。
24、权利要求22的方法，其中该杆状病毒是一种核型多角体病毒。
25、权利要求24的方法，其中该核型多角体病毒为苜蓿银纹夜蛾(Autographa califonica)。
26、权利要求24的方法，其中该外源蛋白是一种昆虫选择性毒素。
27、权利要求26的方法，其中该毒素来源于Androctonus australis。
28、权利要求26的方法，其中该害虫属于斜纹夜蛾属(Spodoptera)、Trichoplusia属或棉铃虫属(Heliothis)。
29、权利要求26的方法，其中该害虫是烟芽夜蛾(Heliothis virescens)或美洲棉铃虫(Heliocoverpa zea)。
30、权利要求28的方法，其中该杀虫剂是拟除虫菊酯。
31、权利要求5的方法，其中该杆状病毒是能表达来源于Androctonusaustralis的毒素的苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒，而杀虫剂为拟除虫菊酯或乙酰胆碱酯酶抑制剂。
32、权利要求20的方法，其中该昆虫病毒为苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒，它能表达来源于Androctonus arstralis的毒素，所述杀虫剂为拟除虫菊酯。
33、权利要求22的方法，其中该杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒，它能表达来源于Androctonus australis的毒素，所述杀虫剂是拟除虫菊酯。
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