CN102174480B - 斜纹夜蛾基因工程病毒2号及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，特别是一种能够防治斜纹夜蛾等农林害虫的斜纹夜蛾基因工程病毒，该病毒由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号是CCTCCNO:V201028。本发明利用基因工程方法对野生型病毒进行缺失和重组，其基因组中缺失了egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的东亚钳蝎毒(BmKITa1)基因和由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的标记基因—增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因。本发明比野生型病毒具有更快的杀虫速度、更少的剂量效应和更好的田间应用效果等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是一种能够防治斜纹夜蛾等农林害虫的斜纹夜蛾基因工程病毒，即“斜纹夜蛾基因工程病毒2号” (SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp)，分类名称是“斜纹夜蛾核型多角体病毒基因工程株2号”(Genetically modified Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus No.2)。该病毒由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2010年12月15日 ，保藏号是CCTCC NO：V201028。
背景技术
斜纹夜蛾是农作物的主要害虫之一，国内各省区均有分布。该虫食性极广，已知可危害的寄主植物达99科290多种。近年来随着农业耕作制度的改变和城市化进程的快速发展，蔬菜、花卉、绿化草坪等旱地作物的种植面积越来越多，斜纹夜蛾的为害也日益猖獗。当前生产上采用的化学防治往往达不到预期效果，而且容易造成环境污染、农药残留和人畜中毒等。
随着国民经济的不断发展和人民生活水平的日益提高，人们对于各种农产品的质量要求越来越高，特别是产品的安全性问题已受到广泛的关注和重视。目前，在各种农作物病虫害的防治工作中，过度依赖化学农药的情况仍然十分严重，由此带来了害虫抗性、再猖獗和环境污染等问题，直接影响到人类的食品安全和生存环境。因此，大力发展高效、广谱、与环境相容性好的无公害生物农药是农业可持续发展的需要。
斜纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus， SpltMNPV)已用于斜纹夜蛾的防治。但由于它存在杀虫速度慢的缺陷，影响了其推广应用。为了改变野生型昆虫杆状病毒杀虫速度慢的缺陷，上世纪90年代以来，国内外已有多种重组昆虫杆状病毒问世，如文献中公开的美国重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(rAcMNPV Stewart L M D et al 1991.Nature,352:85-88)，公开号为CN1109105C的中国发明专利“中国棉铃虫基因工程病毒”(rHaSNPV，)。然而，迄今为止，国内外尚未见有关斜纹夜蛾核型多角体基因工程病毒构建成功的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效提高野生病毒杀虫速度和效果的斜纹夜蛾核型多角体基因工程病毒及其构建方法。
本发明的目的是按下述方案实现的：提供一种斜纹夜蛾基因工程病毒，是对野生型病毒SpltMNPV 
进行缺失和重组得到的斜纹夜蛾基因工程病毒，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号：CCTCC NO:V201028；分类命名：斜纹夜蛾基因工程病毒2号(SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp )；在其基因组中缺失了egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒SpltMNPV 
的多角体蛋白基因ph启动子控制的东亚钳蝎毒BmK ITa1基因和由野生型病毒SpltMNPV 
的多角体蛋白基因ph启动子控制的标记基因即增强型绿色荧光蛋白egfp基因。
构建上述斜纹夜蛾基因工程病毒2号的方法，包括以下步骤：
（1）构建重组质粒 pSK-△egt-Pph- egfp：
以SpltMNPV 
DNA为模板，分别扩增出同源重组臂egt上游非编码端（Egt up）和 egt 3′端的部分序列及其下游非编码端(Egt down)。扩增产物回收纯化后分别经Kpn I /Xho I， Xba I/ Sac I双酶切后依次克隆到载体pBluescript II SK(+)上。获得中间质粒pSK- Egtup- Egtdown；
在这两个片段之间，采用分子克隆技术插入SpltMNPV 
的多角体蛋白基因启动子启动Pph控制的增强型绿色荧光蛋白基因egfp，获得重组质粒 pSK-△egt-Pph- egfp；
（2）构建重组转移载体pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk：
在BmK ITa1基因前引入AcMNPV BV膜融合蛋白GP64的同系物，SpltMNPV 
的F蛋白的信号肽signalP序列；以SpltMNPV 
DNA为模板，扩增出signalP序列，克隆到pBacPAK8中，得到pBacPAK8-signalP；再将SpltMNPV 
的多角体蛋白基因启动子Pph克隆到pBacPAK8-signalP中，得到中间质粒pBacPAK8-Pph-signalP；
以pMD18-BmK ITa1为模板，采用PCR扩增出BmK ITa1片段，克隆到pBacPAK8-Pph-signalP中，得到pBacPAK8-Pph-signalP-BmK；
以Sma I和Xba I双酶切，切下Pph-signalP-BmK 片段并插入到pSK-△egt-Pph- egfp 中的egfp基因和egt3’非编码端之间，得到重组转移载体pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk；
（3）共转染、纯化，得到基因工程病毒SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp ：
将pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk和SpltMNPV 
基因组DNA共转染斜纹夜蛾Spli细胞，通过基因等位交换，获缺失egt基因的以绿色荧光蛋白为标记的表达BmK ITa1的重组病毒SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp；经多轮荧光斑法纯化处理，得到纯的重组病毒即斜纹夜蛾基因工程病毒2号（SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp）CCTCC NO:V201028。
本发明在具有毒力的野生病毒 (Spodoptera lituranucleopolyhedrovirus 
,SpltMNPV 
, GenBank 登录号：NC-011616 ) 基础上，通过缺失和重组的基因工程方法，构建了重组斜纹夜蛾核型多角体病毒，即斜纹夜蛾基因工程病毒2号(SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp)， CCTCC NO:V201028，其基因组中缺失了蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(Ecdysteroid UDP-glucosyltransferase，简称egt)基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的东亚钳蝎毒(BmK ITa1)基因和由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的标记基因——增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因。
本发明具有以下明显优点：
1、本发明所提供的斜纹夜蛾基因工程病毒，由于其基因组中缺失egt基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的东亚钳蝎毒(BmK ITa1)基因和由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的标记基因——增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因，与现有的野生病毒相比，具有更快的杀虫速度、更少的剂量效应和更好的田间应用效果等优点。
2、本发明提供的基因工程病毒可以通过虫体培养方法大批量增殖，配置成可湿性粉剂或悬乳剂等剂型病毒杀虫剂，用于农作物、蔬菜、花卉和草坪等植物上斜纹夜蛾的防治，保留了野生斜纹夜蛾病毒杀虫剂不伤害天敌，对环境安全以及害虫不易产生抗药性等优点。
附图说明
图1是本发明提供的斜纹夜蛾基因工程病毒2号的结构示意图；
图2是本发明提供的斜纹夜蛾基因工程病毒2号的构建过程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步描述。
实施例一：
本发明通过基因工程方法，在具有强毒力的野生病毒SpltMNPV (Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus 
，GenBank 登录号：NC-011616 )的基础上进行缺失和重组，提供一种斜纹夜蛾基因工程病毒，构建了重组斜纹夜蛾核型多角体病毒，即斜纹夜蛾基因工程病毒2号(SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp) CCTCC NO:V201028。
参见附图1，它是本实施例提供的一种斜纹夜蛾基因工程病毒，即斜纹夜蛾基因工程病毒2号的结构示意图；图中，egt为蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因；Pph为多角体蛋白基因启动子；BmK ITa1为东亚钳蝎毒基因；egfp为增强型绿色荧光蛋白基因；SignalP为SpltMNPV 
F蛋白信号肽序列。由图1可以看出，其基因组中缺失egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的东亚钳蝎毒(BmK ITa1)基因和由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的标记基因——增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因。
参见附图2，它是本实施例提供的斜纹夜蛾基因工程病毒2号的构建过程示意图；其中，egt为蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因；Pph为多角体蛋白基因启动子；SignalP为SpltMNPV F蛋白信号肽序列；BmK ITa1为东亚钳蝎毒基因； egfp为强型绿色荧光蛋白基因；egt 5′为含egt基因5′端的上游序列；egt 3′为含egt基因3′端的部分序列及其上游序列；Bluescript 
SK(＋)为通用载体；pBacPAK8为通用载体；pBacPAK8Pph-SP为含Pph和 SignalP的中间载体；pBacPAK8Pph-SP-BmK为含Pph、SignalP和BmK ITa1的中间载体； pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk为含缺失egt基因并插入BmK ITa1基因和egfp基因的重组转移载体； SpltMNPV 
为野生型病毒； SpltMNPV 
-△egt- BmK ITa1-egfp为缺失egt基因并插入BmK ITa1基因和egfp基因的斜纹夜蛾核型多角体病毒基因工程株，即斜纹夜蛾基因工程病毒2号(SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp) CCTCC NO:V201028。
该斜纹夜蛾基因工程病毒的构建过程包括如下步骤：
一、构建重组质粒 pSK-△egt-Pph- egfp：
以SpltMNPV DNA为模板，分别扩增出同源重组臂egt上游非编码端（Egt up）和 egt 3′端的部分序列以及下游非编码端(Egt down)。扩增产物回收纯化后分别经Kpn I /Xho I， Xba I/ Sac I双酶切后依次克隆到载体pBluescript II SK(+)上。获得中间质粒pSK- Egtup- Egtdown。
在这两个片段之间，利用分子克隆技术插入SpltMNPV 
多角体蛋白基因启动子启动（Pph）控制的增强型绿色荧光蛋白基因（egfp），获得重组质粒 pSK-△egt-Pph- egfp。
二、在pSK-△egt-Pph- egfp的基础上构建重组转移载体pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk：
(1) 在BmK ITa1基因前引入了AcMNPV BV膜融合蛋白GP64的同系物，SpltMNPV F(Fusion)蛋白的信号肽（signalP）序列，便于东亚钳蝎毒的分泌表达。以SpltMNPV 
DNA以模板，扩增出signalP序列，并克隆到pBacPAK8上（pBacPAK8-signalP），然后将SpltMNPV 多角体蛋白基因启动子（Pph）克隆到pBacPAK8-signalP中，得到中间质粒pBacPAK8-Pph-signalP。
(2) 以pMD18-BmK ITa1为模板，PCR扩增出BmK ITa1片段并克隆到pBacPAK8-Pph-signalP中，得到pBacPAK8-Pph-signalP-BmK。
(3) 最后以Sma I和Xba I双酶切，切下Pph-signalP-BmK 片段并插入到pSK-△egt-Pph- egfp 中egfp基因和egt3’非编码端之间，得到重组转移载体pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk。
三、共转染、纯化，得到基因工程病毒SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp ：
将pSK-△egt-Pph- egfp-Pph-Bmk和SpltMNPV 
基因组DNA共转染斜纹夜蛾（Spli）细胞，通过基因等位交换，获缺失egt基因的，以绿色荧光蛋白为标记的，表达BmK ITa1的重组病毒SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp。通过多轮荧光斑法纯化，得到纯的重组病毒即工程病毒2号CCTCC NO:V201028。
本发明实施例提供的斜纹夜蛾基因工程病毒2号(SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp) CCTCC NO:V201028，其基因组中缺失egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的东亚钳蝎毒(BmK ITa1)基因和由野生型病毒多角体蛋白基因(ph)启动子控制的标记基因—增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因。该重组病毒的标记基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP，在工程病毒2号的纯化和增殖过程中均可通过绿色荧光蛋白产生的绿色荧光进行监测和鉴定。
本发明实施例提供的斜纹夜蛾基因工程病毒即斜纹夜蛾基因工程病毒2号已于2010年12月15日提供保藏，保藏单位是位于武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC NO:V201028，保藏名称是“斜纹夜蛾基因工程病毒2号” (SpltMNPV-△egt- BmK ITa1-egfp)。所提供的病毒培养物为昆虫病毒多角体，只能采用活体增殖。增殖方法：以1×106多角体/ml的浓度感染3龄斜纹夜蛾幼虫，然后置27～28℃培养5～7天，收集病死虫。检测存活亦要求生物测定，即检测病毒感染斜纹夜蛾的活性。
本实施例提供的斜纹夜蛾基因工程病毒的鉴定方法如下：
（1）利用限制性核酸内切酶初步鉴定该病毒的正确性；
（2）设计合适引物，利用聚合酶链反应(PCR)的方法进一步确定该病毒中egt基因的大部分编码序列已被删除，外源基因(BmK ITa1和egfp)已正确插入；
（3）设计合适引物，利用RT-PCR方法可确认BmK ITa1基因已转录；
（4）分析该病毒的蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的活性，确定egt基因已失活；
（5）室内生物活性测定以及田间药效试验确定病毒的效果。
本发明提供的斜纹夜蛾基因工程病毒可以通过虫体培养方法大批量增殖，配置成可湿性粉剂或悬乳剂等剂型病毒杀虫剂，用于农作物、蔬菜、花卉和草坪等植物上斜纹夜蛾的防治。该杀虫剂保留了野生斜纹夜蛾病毒杀虫剂不伤害天敌，对环境安全以及害虫不易产生抗药性等优点。
表1是本实施例提供的斜纹夜蛾基因工程病毒2号（简称工程病毒2号）与野生型病毒和工程病毒1号的生物测定结果对比（使用剂量均为107个多角体/条幼虫）。所述工程病毒1号为按本实施例步骤一构建得到的重组质粒 pSK-△egt-Pph- egfp和SpltMNPV 
基因组DNA共转染斜纹夜蛾Spli细胞，通过基因等位交换，获缺失egt基因的并表达绿色荧光蛋白的重组病毒SpltMNPV-△egt-egfp，即斜纹夜蛾基因工程病毒1号(SpltNPV-△egt -egfp) CCTCC NO:V201027。
表1
表2是本实施例提供的斜纹夜蛾基因工程病毒2号（简称工程病毒2号）与野生型病毒、工程病毒1号的大田生物测定结果对比（使用浓度均为107个多角体/mL）。
表2
由表1的结果表明，在使用剂量为107个多角体/条 幼虫的情况下，工程病毒2号对3龄斜纹夜蛾的半致死时间(LT50)比野生病毒缩短25.5 %。由表2的结果表明，工程病毒2号对3龄斜纹夜蛾的半致死剂量(LD50)仅为野生病毒的27.0 % 。田间试验结果表明，工程病毒2号比野生病毒的杀虫效果明显提高。
Claims (1)
1.一种斜纹夜蛾基因工程病毒，其特征在于：是对野生型病毒SpltMNPV 进行缺失和重组得到的斜纹夜蛾基因工程病毒，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号：CCTCC NO:V201028；分类命名：斜纹夜蛾基因工程病毒2号；在其基因组中缺失了egt基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失egt基因的位点处，插入由野生型病毒SpltMNPV 
的多角体蛋白基因ph启动子控制的东亚钳蝎毒BmK ITa1基因和由野生型病毒SpltMNPV的多角体蛋白基因ph启动子控制的标记基因即增强型绿色荧光蛋白egfp基因。
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| 薛贵收."SpltMMPV 重组病毒的构建和SpltMNPV-JP-G_(1-2)iap基因的克隆".《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》.2009,正文第29页最后一段,第46页第2段. * |
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