CN1164871A - 昆虫病毒、其序列、杀昆虫组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够比以前的病毒更快地杀灭至少一种靶有害昆虫的昆虫病毒，以及赋予这种更快杀灭表型的DNA序列。杀灭速度的进一步提高还可以在本发明的病毒含有无功能的egt基因以减少受感染幼虫的摄食、抑制生长和进一步介导受感染昆虫的更早死亡时获得。一种具体的更快杀灭的昆虫病毒是AcMNPV V8株。更快杀灭表型由AcMNPV基因组中1.93-3.27图距单位的MluI至EspI片段携带，其序列在SEQ ID NO：_中提供。V8vEGTDEL是AcMNPV V-8的egt-失活衍生株；将V-8基因型的更高毒性和编码蜕皮甾类葡糖基转移酶基因的失活结合起来，可进一步提供(如感染后至死亡时间更短)。此外，这种egt缺陷杆状病毒可进一步改良以病毒影响蜕化的蛋白质。在本发明中还包括了产生这种更快杀灭的昆虫病毒的方法、改良的杀虫剂组合物和改良的防治昆虫的方法。

Description

昆虫病毒、其序列、杀昆虫组合物及其使用方法
技术领域
本发明涉及使用杆状病毒及其序列以更好地生物防治有害昆虫的方法和组合物。更具体地，本发明涉及在昆虫防治方面具有更好性能的重组的杆状病毒，以及来自该病毒的赋予更佳性能(即使至少一种靶昆虫更快死亡)的片段。本发明还涉及基因修饰的、杀灭性能进一步改善的杆状病毒及其使用方法。
发明背景
由于常规的化学杀虫剂存在缺点，所以导致了对生物防治有害昆虫的兴趣。化学杀虫剂一般会影响有益或有害种类。有害昆虫会获得对这些化学品的抗性，从而会很快地形成新的、抗这些杀虫剂的有害昆虫群。此外，化学残留物会产生环境危害并可能导致健康问题。生物防治是另一种害虫防治方式，它降低了对化学杀虫剂的依赖性。
主要的生物防治策略包括运用天然存在的、使昆虫致病的生物体(昆虫病原体)和开发更抗有害昆虫的作物。方法包括鉴别和定性可作为昆虫防治剂的合适靶目标的昆虫基因或基因产物、鉴别和开发先前未使用过的微生物(包括修饰天然存在的非致病微生物以使它们对昆虫致病)、修饰和优化目前使用的昆虫病原体、以及开发对有害昆虫抗性更高的基因工程作物。
在昆虫群中造成天然家畜流行病的病毒是已开发作物生物杀虫剂的昆虫病原体中一部分。杆状病毒是一大类仅感染节肢动物的病毒(Miller，L.K.(1981)Genetic Engineering in the Plant Science，N.Panopoulous，(ed.)，Praeger Publ.，NewYork，pp.203-224；Carstens，(1980)Trends in Biochemical Science 52：107-110；Harrap and Payne(1979)Advances in Virus Research，Vol.25，Lawfer et al.(eds.)，Academic Press，New York，pp.273-355；The Biology of Baculoviruses，Vol.I andII，Granados and Federici(eds.)，CRC Press，Boca Raton，Florida，1986.)。许多杆状病毒感染昆虫，而这些昆虫是重要经济农业作物和森林作物的害虫。这样的杆状病毒具有作为生物防治剂的潜在价值。四种不同的杆状病毒已由美国环境保护局登记作为杀虫剂使用。在杆状病毒作为生物杀虫剂的众多优点中有一点是其宿主特异性。不仅作为一类的杆状病毒只感染节肢动物，而且各杆状病毒株一般只感染一种或几种昆虫。因此，它们不会对人或环境造成危害，而且使用时也不会危害有益的昆虫种类。
包括AcMNPV在内的杆状病毒，已经发现在约400个跨几个不同昆虫目的不同种中，绝大多数的这些病毒存在于鳞翅目中。已知杆状病毒感染天然生态系统(如森林和草原)和单一培养物的农业生态系统(如棉花田)中的昆虫。
苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyherosisvirus，AcMNPV)是已知的最彻底定性的杆状病毒。AcMNPV属于杆状病毒科(Baculoviridae)，真杆状病毒亚科(Eubaculovirinae)，核型多角体病毒(NuclearPolyhedrosis Virus)属，和多核壳病毒(Multiple Nucleocapsid Virus)亚属，其特征是在受感染的宿主细胞的核中形成病毒包含体(或多角体(polyhedra))。该病毒最初是20多年前，在加利福尼亚州天然发生的家畜流行病感染中从苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)中分离到的。之后，用生物化学和分子技术对该病毒进行广泛地定性，从而知晓了128kbp基因组中的全部DNA序列。AcMNPV已被指定为多核壳病毒亚属的模式种。
杆状病毒亚群包括核型多角体病毒(NPV)、颗粒体病毒(granulosis virus，GV)、和无包含体杆状病毒。在包含体形式的杆状病毒(GV和NPV)中，病毒颗粒(有包膜的核壳)被嵌在结晶的蛋白质基质中。这种结构被称为包涵体或包含体，它是自然界中在生物体外发现的形式，它专司在生物体之间扩散感染。NPV的特征是在每个包含体中嵌有许多病毒颗粒。NPV包含体相对较大(可达5微米)。GV病毒的包含体较小，每个只含有一个病毒颗粒。两种形式包含体的结晶蛋白质基质主要由单个25,000-33,000道尔顿的多肽(称为多角体蛋白(polyhedrin)或颗粒体蛋白(granulin))构成。无包含体亚群的杆状病毒不产生多角体蛋白或颗粒体蛋白，而且也不形成包含体。
在自然界，当昆虫摄入被杆状病毒颗粒(对于NPV如AcMNPV通常是包含体形式)污染的食物时，感染便开始了。包含体在昆虫中肠的碱性条件下发生解体，释放出各病毒颗粒，这些病毒颗粒接着侵入肠道中的上皮细胞。在宿主细胞中，杆状病毒迁移至细胞核，在此处发生复制。起初，在受感染的细胞中通过所谓的“早期基因”的转录和翻译而产生一些特定的病毒蛋白。在其他功能中，需要这些蛋白复制病毒DNA，这在病毒进入细胞后4-6小时开始。最久在感染后(post-infection，pi)24小时左右，进行全部的病毒DNA复制。在感染后约8-20小时，受感染细胞产生大量“晚期病毒基因产物”。其中包括核壳的组份，核壳在形成子代病毒颗粒时将病毒DNA包裹起来。子代病毒颗粒的产生在感染后约12小时开始。最初，子代病毒迁移至细胞膜，在此处当它们从细胞表面出芽时获得包膜。这种无包含体的病毒可接着感染昆虫的其他细胞。在感染后约18小时开始合成多角体蛋白，并且在感染后24小时增加到非常高的水平。此时，出芽病毒颗粒的数目下降，而且子代病毒被嵌入包含体。包含体形成继续进行，直至细胞死亡或裂解。某些杆状病毒可几乎感染宿主昆虫中各种组织，所以在感染过程结束时，整个昆虫被液化，释放出极多的包含体，而这些包含体又将感染扩散给其他昆虫。(参见The Biology of Baculoviruses，Vol.I and II，Granados and Federici(eds.)，CRC Press，Boca Raton，Florida，1986.)。
随着幼虫生长和成熟，它会越来越抗病毒感染。成虫组织和蛹组织似乎抗病毒感染。AcMNPV感染的主要方式似乎是通过横向传播。昆虫一般是通过摄入被污染的食物而获得AcMNPV。包含体在昆虫中肠中解体并释放出病毒颗粒，从而在中肠细胞中形成感染的最初位点。
AcMNPV在环境中生存和传播的能力受多种相关因素的制约(参见Evans，H.(1986)The Biology of Baculoviruses，Ecology and Epizoology of Baculoviruses，Granados，R.R.and Federici，B.A.(eds.)pp.89-132)。诸如昆虫对病毒的相对敏感度以及受发育程度确定的对AcMNPV的敏感度等因素是重要的。宿主密度似乎也在确定杆状病毒的生存和传播方面起重要作用。在确定AcMNPV环境传播和持续性的生物和非生物因素中，存在重要的密切关系。例如，捕食动物与病毒、竞争可供的昆虫宿主，并且通过从环境中去除这些病毒易感宿主而降低潜在的病毒生产力。另一方面，通过增加病毒扩散机会以及通过更有效地利用可供宿主群，捕食动物也间接增加MNPV的存活力和传播。这种捕食动物协助的传播一般是感染性MNPV通过捕食性昆虫、鸟类和哺乳动物的肠而实现。同样，非生物因素(如紫外线(UV)、下雨、温度和pH)对病毒在环境中的存活和传播起重要影响。例如，杆状病毒似乎对紫外线辐射和碱性pH特别敏感。在无紫外线保护下，释放在田野中的病毒只能在田野中存活1-2天。土壤似乎是杆状病毒持续的特别重要的蓄积场所。在土壤中病毒的减少缓慢，已有大量的其持续和存活的报道。在杆状病毒和人以及其他物种之间的因饮食暴露而形成的普遍而无害关系，强调了杆状病毒作为杀昆虫剂的安全性和价值。
使用杆状病毒作为杀虫剂的一个潜在缺点是在病毒摄入和昆虫死亡之间的间隔时间长。在该段时间内，有害昆虫会继续摄食和破坏作物。因为杀虫剂一般仅在虫害明显后才施用，所以减少摄食时间是至关重要的。在通过病毒感染防治昆虫中，一种减少昆虫摄食时间的方法是使用蜕皮甾类葡糖基转移酶(ecdysteroid glucosyl transferase)-缺陷型杆状病毒(O＇Reilly and Miller(1991)Biotechnology 9：1086-1089；美国专利No.5，180,581，Miller和O＇Reilly；美国专利申请No.07/656，179，授权，所有上述文献在此引用作为参考)。其他方法包括将编码昆虫毒素或激素的基因插入病毒基因组(Hammock et al.，(1993)Arch.Insect Biochem.Physiol.22：315-344；McCutchen et al.(1991)Bio/Technology9：848-852；Tomalski and Miller(1991)Nature 352：82-85；Tomalski and Miller(1992)Bio/Technology 10：545-549以及Stewart et al.(1991)Nature 352：85-88)。其他方法是将昆虫特异性的麻痹神经毒素基因整合入杆状病毒基因组(例如参见美国专利No.5,266,317，1993年11月30日授权，Tomalski和Miller，公开了捕食昆虫的螨毒素；美国专利申请No.08/009,625，1993年1月29日申请；加拿大专利申请2,005,658，Zlotkin等人；Zlotkin等人(1971)Toxin 9：1-8，它们公开了Androctonus australis毒素序列。)。
需要生物杀虫剂即特异性的昆虫病毒，与已有技术的昆虫病毒相比，它能减少昆虫在死亡前的摄食和/或缩短感染和死亡之间的时间。生物杀虫剂是优选的，因为它比化学杀虫剂造成的环境危害小。利用比已有病毒更快地杀灭昆虫的重组病毒，可以更好地生物防治有害昆虫。
发明概述
本发明具体提供了一种纯化的和分离的重组杆状病毒(此处称为AcMNPVV-8)，它与已有技术的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒株相比具有针对至少一种有害昆虫(该昆虫包括但并不限于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))的更佳杀灭性能。该杆状病毒已保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC VR-2465(American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD)。针对至少一种有害昆虫的更佳杀灭性能指，当至少一种有害昆虫被感染时，在感染和昆虫死亡之间的间隔时间与AcMNPV如AcMNPV E2(ATCC VR-1344)相比更短。
本发明的另一具体目的是AcMNPV V-8衍生病毒，它已经基因工程化以使编码脱皮甾类葡糖基转移酶(ecdysteroid glucosyl transferase，egt)的基因失活。优选例子是V8vEGTDEL，它是AcMNPV V8衍生病毒，其中一部分egt被缺失，结果在病毒感染过程中不产生有功能的脱皮甾类葡糖基转移酶。
本发明的另一目的是当插入到异源昆虫病毒的基因组时会赋予更佳(即更快)杀灭表型的昆虫病毒DNA片段。如具体所示，这种DNA片段是例子AcMNPVV-8基因组中1.93-3.27图距单位的MluI至EspI片段(或来自V1000核型多角体病毒，它似乎与剌金翅夜蛾(Rachiplusia ou)核型多角体病毒更接近或相同)；代表性的V-8片段的DNA序列在图4(SEQ ID NO：..)中给出。该DNA片段携带编码晚期表达因子(lef-2)、和603个氨基酸的多肽(功能不详)以及多角体蛋白基因上游的序列。在V-8的该MluI至EspI片段中是一个更小的、当整合入(重组)AcMNPV基因组时能够赋予更佳杀灭表型的区域；该较小区域位于图4的核苷酸3026-4231(V-8序列)之间。同样在本发明范围之内的是其他重组昆虫病毒，包括杆状病毒，在这些重组昆虫病毒中，这种能赋予更佳杀灭表型的DNA片段被整合入基因组，结果与未经基因工程改造的或原本不含有赋予更强毒性的相关异源DNA片段的相应杆状病毒相比，至少一种有害昆虫在感染后被更快地杀灭。
本发明还提供了改善杆状病毒杀灭性能的方法，即通过将赋予更佳杀灭表型(例如在感染后至少一种有害昆虫的昆虫死亡更快)的DNA片段，以及通过确定基因工程株的LT50(在标准病毒剂量下杀灭50％测试幼虫所需的时间，使用在感染后设定时间内杀灭90％测试幼虫的剂量)短于亲代杆状病毒而证实杀灭性能的改善。基因工程株可通过分子生物学技术，用选自由核型多角体病毒和颗粒体病毒构成的组的昆虫病毒而产生，这些核型多角体病毒包括但并不限于：舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantria dispar NPV)、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica NPV)、Synographa falcifera NPV、Spodoptera lilturalisNPV、甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera exigua NPV)、草地夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera frugiperda NPV)、棉铃虫核型多角体病毒(Heliothisarmigera NPV)、甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mamestra brassicae NPV)、枞色卷蛾核型多角体病毒(Choristoneura fumiferana NPV)、粉纹夜蛾核型多角体病毒(Trichoplusia ni NPV)、Helicoverpa zea NPV和烟草天蛾核型多角体病毒(Manduca sexta NPV)；而颗粒体病毒包括但并不限于：苹果小卷蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella GV)、大菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris brassicae GV)和粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusia ni GV)。来自杆状病毒科的无包含体病毒也可进行基因修饰以改善它们杀灭特定靶昆虫的性能；这种无包含体杆状病毒的例子包括但并不限于：Orcytes rhinoceros和玉米夜蛾(Heliothis zea)无包含体杆状病毒。功能上等价的赋予更佳杀灭性能的序列也可从此处具体所示的病毒之外的其他病毒中分离，并整合入天然不含该序列的病毒基因组中，从而产生具有更佳昆虫防治性能的病毒。
或者，它也可以通过第一种杆状病毒和第二种基因组含有该DNA片段的杆状病毒的共感染而产生，其中该第一种和第二种杆状病毒是足够接近的(即至少在赋予更佳杀灭表型的序列的侧翼区域有限距离内具有足够的DNA序列相同性)从而会发生重组，导致重组杆状病毒的产生，该重组病毒掺入了赋予更佳杀灭表型的DNA。
本发明的另一目的是杀虫剂组合物，它含有针对至少一种有害昆虫的杀灭性能更佳的杆状病毒。优选的病毒包括V8vEGTDEL、AcMNPV V-8、vEcoRIhybI、vEcoRIHybIFS以及如上非限定地所述的核型多角体病毒和颗粒体病毒和无包含体杆状病毒(在这些病毒中赋予更佳杀灭表型的DNA片段被基因工程化或通过重组而整合)。较佳地，本发明的杀虫剂组合物配制成可湿性粉剂。优选的可湿性粉末杀虫剂组合物的组成如下：
    成分                              公称百分比(w/w)
    V8vEGTDEL多角体蛋白包含体         10.0％
    Morwet D425                       30.0％
    Morewet EFW                       20.0％
    高岭土                            16.0％
    Microcel E                        16.0％
        UV-9氧苯酮或木炭                  5.0％
        Eudragit S100                     2.0％
        柠檬酸                            0.9％
        聚乙二醇MW400                     0.1％
任选地，可在配方中加入芪增亮剂以增加感染力或增强昆虫病毒的杀虫效果。
上述的优选组合物的配制如下：
a)制备Eudragit S100的水悬浮液(1％w/v)；
b)通过将步骤(a)的悬浮液的pH增加至9.0-9.5而使Eudragit S100溶解；
c)向步骤(b)的溶液中加入病毒PIB和UV-9氧苯酮或木炭，然后混合形成均匀悬浮液；
d)空气干燥步骤(c)的均匀悬浮液；
e)研磨步骤(d)的干燥材料，产生研磨材料；
f)将步骤(e)的研磨颗粒与Morwet D425、Morewet EFW湿化剂、作为填充剂的高岭土、作为流动剂的Microcell E、柠檬酸和提供研磨材料挠性的聚乙二醇MW400干混合。
附图简述
图1是AcMNPV基因组的示意图，其中显示了egt和各基因的位置。AcMNPV基因组以图距单位(m.u.)标示并以EcoR I和Hind III限制性酶切图形式给出。
图2A是AcMNPV的egt基因区域结构示意图；图2B和2C分别显示了重组病毒vEGTZ和vEGTDEL的对应区域的结构，以及在构建这些重组病毒中所用的pEGTZ和pEGTDEL质粒。图2B中阴影线盒表示lacZ基因。
图3A-3D是AcMNPV株的327 ORF、lef-2、603 ORF和多角体蛋白基因(polh)区域的部分限制性酶切图。图3A是AcMNPV L-1野生型(细线表示L-1DNA)的图。图3B是AcMNPV V-8(粗线表示V-8 DNA)。在lef-2中额外的HindIII位点是V-8的一个区别性(物理)特征。V-8丢失了603 ORF中的两个Mlu I位点和603 ORF与polh之间的EcoR V位点。V-8的603 ORF有一个因插入而产生的早熟终止密码子，预计会产生一个不完整的、无功能的多肽产物(注意在603 ORF上的“X”)。图3C是含有部分V-8基因组(用粗线表示)的vEcoRIHybI重组病毒的图。尽管用于构建该杂合病毒的转化质粒含有直至1.93图距单位处Mlu I位点的V-8序列，但是所示的等位基因置换局限于直至部分lef-2的V-8序列。图3D是含有整个V-8的Mlu I(1.93图距单位)至EspI(3.27图距单位)片段的vEcoRIHybIFS重组病毒的图。在603 ORF中的NaeI位点因4个碱基对缺失而被破坏(星号(*)表示缺失NaeI位点)。
图4是AcMNPV L-1(SEQ ID NO：1)从327 ORF MluI位点(核苷酸2470)至polh EspI位点(核苷酸4186)的DNA序列，它与AcMNPV V-8变异病毒的相应序列(SEQ ID NO：2)对齐排列。与L-1序列相比，V-8序列有多个点突变和4个插入。相同部分用垂直线表示。序列的不同处和插入以粗体表示。lef-2、603 ORF、和polh的起始点用星号(*)表示。L-1的lef-2和603 ORF的天然终止密码子用￡符号表示。在vEcoRIHybI中的交叉发生在核苷酸3003-3027处两个$符号之间的虚线区域。在V-8的603 ORF中因插入而产生的早熟终止密码子用3个连续脱字号“＾”表示。在括号内的序列编号对应于O＇Reilly et al.(1992)Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，W.H.Freeman&Co.，NY中的编号。
图5是AcMNPV L-1和V-8的lef-2基因产物的预期氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：_和SEQ ID NO：_ )。相同部分用垂直线表示。不同处以粗体和不同氨基酸残基间的空挡表示。在L-1和V-8之间的DNA序列差异造成两个lef-2基因产物间的6个氨基酸差别。氨基酸差别在残基14、89、101、114、153和190。重组病毒vEcoRIHybIFS预计含有所有这些lef-2氨基酸差异，而vEcoRIHybI预计只含有残基153和190处的突变。在vEcoRIHybI中的交叉事件发生在编码星号线标出的残基的DNA区域。
图6是AcMNPV DNA在egt基因区域的核苷酸序列。egt开放阅读框的翻译起始密码子(atg)和终止密码子(taa)在序列上方标出。在EGTDEL病毒中缺失的1094bp片段用下划线表示。还标出了用于PCR扩增的寡核苷酸引物(EGTDEL1和EGTDEL2)的位置。
图7是AcMNPV E2(SEQ ID NO：..)、AcMNPV V-8(SEQ ID NO：..)和V1000(SEQ ID NO：..)病毒株的DNA序列，从多角体蛋白上游的Esp31位点开始并延伸入多角体蛋白编码区域。序列来自使用引物PV1 Reverse的链，而且标为N的核苷酸未被确定。
公开实施例的详细描述
因为更快发挥作用的昆虫病毒作为昆虫防治剂是有利的，所以进行研究以寻找具有这种更佳杀灭性能的杆状病毒株。为了该目的，将(昆虫幼虫中)传代数最低的AcMNPV病毒贮存物加以扩增，接种于培养物中以获得克隆分离物，然后检查这些分离物的限制性位点多态性和更高的对昆虫幼虫的毒性。将传代数最低的贮存物用作该测量的原料，部分地是因为已知在细胞培养物中的连续传代会导致突变并可能降低AcMNPV的毒性(例如参见Kumar and Miller(1987)Virus Research 7：335-349)。已知AcMNPV的基因型变异体(Lee and Miller(1987)J.Virol.27：754-767)。AcMNPV被作为寻求更具毒性的(即杀灭更快的)变异体的杆状病毒，因为已知它可感染较大数目的在农业上具有特别经济重要性的有害昆虫。
AcMNPV V-8分离株是10个在SF-21单细胞层上纯化的病毒克隆噬斑中的一个，该SF-21单细胞层用通过口服感染原始Vail AcMNPV分离株(Vail et al.，(1971)Proc.IV Int.Collog.Insect Pathology，College Park，MD pp.297-304)最低传代数贮存物的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)幼虫的稀释血淋巴接种。所有10个病毒分离株V-1至V-10，最初用BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、PstI和XhoI限制性内切酶分析进行定性研究，并与AcMNPV L-1进行比较。V-10的图谱与L-1的图谱相同。V-1、V-2、V-3、V-6、V-7、V-8和V-9都缺少约8.5kb的Hind III-F片段，取而代之含有两个新的约7.4kb和1.1kb的片段。两个分离株V-4和V-5的限制性图谱介于前两种病毒类型之间(含有亚摩尔(submolar)量的HindIII-F片段和两个7.4kb和1.1kb的新片段)。存在亚摩尔的片段暗示，V-4和V-5是没有完全纯化的病毒贮存物。因为所有的样品是仅纯化一次以保留分离株毒性的噬斑。用BamHI、BglII、EcoRI、PstI和XhoI消化时，在这10个克隆中任一个和L-1之间没有检测到限制性图谱的差别。
AcMNPV的V-8分离株被选为10个分离株的优势基因型的代表，并进一步用草地夜蛾新生幼虫生物分析进行定性。评估口服感染力(LC50)和毒性(LT50)的代表性生物分析的数据列于表1。LC50是在感染10天后50％受感染幼虫死亡的病毒数量。LT50是暴露于LC90的病毒(除非下面另有说明)，50％受感染幼虫死亡时，感染后经过的时间。在草地夜蛾和粉纹夜蛾新生幼虫中，L-1和V-8 AcMNPV株的LC50非常相似，但是在草地夜蛾新生幼虫中LT50明显不同。对于AcMNPV株E-2和L-1，感染导致的死亡一般约在感染后的相同时间发生，但是V-8在感染后造成的死亡比L-1和E2株快。在V8对L-1或E-2的比较中，不同试验中死亡前的实际时间有差别，但是死亡前时间的百分比差异比较结果在各试验中是一致的。在草地夜蛾新生幼虫中，在LC90 V-8分离株下的平均LT50始终比L-1的平均LT50短约12％。
使用一系列不同的限制性内切酶(BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、PstI和XhoI)，对AcMNPV V-8和AcMNPV L-1的最初限制性酶切分析仅显示出上述的HindIII限制性多态性。用于定性AcMNPV V-8的6个限制性内切酶识别AcMNPV基因组中的总共95个部位，将每个EcoRI hr区域(6个具有高度重复DNA序列和多个EcoRI位点的短区域)作为一个部位。因为每个识别位点是6聚核苷酸，所以用限制性内切酶分析已筛选了总计570bp是否有突变。在该筛选中发现的唯一差别是lef-2中的HindIII限制性多态性(0.18％突变率(1/570))。后来发现V-8株缺少位于多角体蛋白翻译起始点上游约90bp处的EcoRV位点(例如参见图7)。
对HindIII多态性附近区域的约1.72kb的序列分析揭示，在L-l和V-8序列中，在lef-2、603 ORF和多角体蛋白基因(polh)之中和附近(1.93图距单位(m.u.)至3.27图距单位)有许多核苷酸差别(图2)。在1.72kb测序区域中有73个核苷酸变化。在V-8中的HindIII限制性多态性是由核苷酸3243处的C突变为T而造成的。在603 ORF中的MluI位点(3389处)和多角体蛋白基因和603 ORF之间的EcoRV位点(4001处)都因为单核苷酸变化而被破坏(图4和5)。在该区域中的几个核苷酸置换导致预计的lef-2多肽产物中氨基酸的变化，而插入和置换大大改变了603 ORF。在lef-2中的6个氨基酸变化示于图5。在603 ORF中的26bp插入导致在603 ORF开放阅读框中形成一个终止密码子，并且预计会造成603ORF翻译的成熟前终止。在327 ORF中远至上游MluI位点之内没有发现序列差别。在V-8和E-1之间仅在polh中发现3个DNA序列差别。它们是第三碱基对的变化，因而不改变编码的氨基酸。在polh的多角体蛋白翻译起始点上游约90bp的区域一般未改变，尽管在L-1中存在的EcoRV位点在V-8中是缺失的。
因此，根据序列和限制性分析，使用L-1作为野生型对照，则V-8的该区域含有异乎寻常的高密度的突变。在不希望局限于任一特定理论情况下，推测AcMNPV V-8是由于AcMNPV和与AcMNPV相关较远的某一病毒的重组而形成的。此外，考虑到V-8在该区域内的突变密度，在V-8的核苷酸2703和4194处的差别可能是该重组的界限，因为在远至从图4所示polh中核苷酸4264(即SEQ ID NO：_中的核苷酸_)处开始的BamHI位点下游和远至在核苷酸2470处的327 ORF MluI位点上游(从SEQ ID NO：_中核苷酸_开始)(图2)的范围内没有发现序列差别。大多数突变集中于603 ORF中，少量在lef-2中。此外，对相对较远的504 ORF(位于0.0图距单位和0.4图距单位之间的磷酸酯酶基因)在V-8和L-1中的完全序列分析揭示，在V-8和L-1之间没有差别。
在美国氰胺农业研究中心(Princeton，NJ)的烟芽夜蛾集落来自1966年的一田野分离物(Stoneville，MS)，并且自1966年起一直被维持。空气、水和食物在与烟芽夜蛾接触之前没有充分灭菌。已发现在该集落中有偶尔的病毒爆发。从该集落中已分离出病毒，称为V1000，并且确定了部分基因组DNA序列而且定性了该病毒的多种特性。根据限制性内切酶分析，V1000核型多角体病毒似乎与剌金翅夜蛾核型多角体病毒(Rachiplusia ou Nuclear Polyhedrosis Virus，RoNPV)最接近。
根据V-8和V1000多角体蛋白区域的序列比较，但又不希望局限于任何特定的理论情况下，假定AcMNPV V-8株是AcMNPV和V1000病毒的重组病毒。对AcMNPV E-2(ATCC VR-1344，American Type Culture Collection，12301Parklawn Drive，Rockville，MD)、V1000和AcMNPV V-8的序列比较示于图7。在AcMNPV V-8和E-2株之间的最后的序列差别出现在多角体蛋白编码序列的第20个密码子处。
通过等位基因置换(参见实施例3和图2)而构建两个重组病毒vEcoRIHybI和vEcoRIHybIFS，以确定AcMNPV V-8的LT50下降是否与lef-2区域观察到的序列差别相关。建立序列分析，其中V-8的特征序列与具有下列等位基因重组的重组病毒不同。两种重组病毒都重组了polh中KpnI位点下游部分，正如其包含体阳性表型所证实的那样。亲代病毒vSynVIgal缺失KpnI位点上游的polh序列。病毒vEcoRIHybIFS含有整个1.72kb的MluI至EspI片段(1.93-3.27图距单位)，并且具有603 ORF中NaeI位点处的4bp缺失。在V-8 603 ORF中的缺失用于破坏603 ORF产物的功能，但是随后的序列分析揭示V-8 603 ORF早已瓦解。因此，预计该缺失对病毒感染力和毒性没有额外影响。在产生vEcoRIHybI的等位基因置换事件中的交叉发生在图4的AcMNPV序列核苷酸3003和3027(图4和6中SEQ ID NO：_中核苷酸_和_之间)之间的某个位置并且在多角体蛋白基因的KpnI位点之前。所以，预计vEcoRIHybI的lef-2基因产物是杂合蛋白，它含有位于交叉上游的L-1样的氨基酸残基和位于交叉下游的V-8样残基(图4和6)。
对草地夜蛾新生幼虫进行生物分析，以确定病毒L-1、V-8、vEcoRIHybI和vEcoRIHybIFS的感染力和毒性。对每种病毒用概率单位分析法(Daum(1970)Bulletin of the Entomological Society of America 16：10-15)计算其LC50和LT50(表1)。所有4种病毒的LC50在统学计上等价。如前所述，在LC90时V-8的LT50比L-1短12.4％，这反映毒性增加。在LC90时的V-8、vEcoRIHybI和vEcoRIHybIFS，LT50的差别在统计学上不显著。然而，在LC90时的L-1和3种含有V-8 DNA的病毒中每一种之间的LT50差别在统计学上是显著的；V-8和两种杂合病毒都具有明显短于L-1的LT50。杂合病毒vEcoRIHybI仅含有从lef-2中间至polh 5＇端的一小段V-8序列，但是具有更高的、V-8特有的毒性。事实上，vEcoRIHybI的lef-2基因产物具有L-1样氨基端和V-8的羧基端但仍保留V-8毒性表型，这表明V-8的更高的毒性(LT50降低)的造成是由于一个或两个lef-2羧基端氨基酸差别、或由于缺少有功能的603 ORF基因产物、或由于它们的某种组合。或者，V-8更快的杀灭(毒性增加)表型是由于顺式作用的序列效应所造成的。
至于是两个羧基端的lef-2氨基酸差别，还是无功能的603 ORF或是这些差别的组合造成V-8毒性增加，仍有待确定。Gearing和Possee((1990)J.Gen.Virol.71：251-262)确定，603 ORF并不是在细胞培养物中产生出芽病毒、产生多角体或AcMNPV感染力(LC50)所必需的。然而，Gearing和Possee没有给出与毒性相关的数据(如测量603 ORF缺失突变体的LT50而得出的毒性)，所以不知道破坏603 ORF会对突变病毒的毒性产生何种效果。Passarelli和Miller((1993)J.Virol.67：2149-2158)报道，在瞬时表达分析中lef-2及其630氨基酸表达产物是晚期和后晚期基因表达所需的。在不希望局限于任一特定理论情况下，假设V-8的lef-2和603 ORF等位基因中的一个或两个会影响病毒复制速度，进而影响病毒毒性。有可能V-8株的更快杀灭性能是由于顺式或反式效应造成的。据信该表型由图4所示的V-8序列中核苷酸3027-4231之间的区域携带。
表1A.AcMNPV变异体在草地夜蛾新生幼虫中感染力的生物分析
      病毒                                       基准界限
        LC50         上限        下限    斜率
      L-1       4.6×105       6.8×105      3.0×105    0.81
     V-8       3.0×105       4.3×105      2.0×105    0.97
   vEcoRIHybI       5.5×105       1.3×106      1.9×105    0.96
  vEcoRIHybIFS       2.1×105       2.9×105      1.4×105    1.06
L-1、V-8、vEcoRIHybI和vEcoRIHybIFS的LC50(#PIB/ml食物；多角体蛋白包含体/毫升)在统计学上是等价的。
表1B.AcMNPV变异体在草地夜蛾新生幼虫中毒性的生物分析
     病毒                         基准界限
    LC50     上限     下限    斜率
     L-1    129.4    134.1    125.7   12.35
     V-8    113.3    116.1    110.8   14.39
  vEcoRIHybI    116.9    120.7    113.7   10.64
 vEcoRIHybIFS    115.0    117.9    112.3   13.50
(B)在LC90时的V-8、vEcoRIHybI和vEcoRIHybIFS的LT50(以小时计)比在LC90时的L-1时的LT50快10-12％；该差别在统计学上是显著的，如基准界限的上限和下限所示。
基本上按美国专利No.5，180,581中所述的相同程序，基因修饰AcMNPVV-8以失活egt基因(egt编码蜕皮甾类葡糖基转移酶)。用草地夜蛾新生幼虫测定AcMNPV L-1、L-1的egt-缺陷型衍生病毒(vEGTDEL)、AcMNPV V-8和egt基因被失活的V-8衍生病毒(V8vEGTDEL)的LT50值。结果示于表2和3。很明显，AcMNPV V-8的杀灭快于L-1，而V8vEGTDEL的杀灭甚至比AcMNPV V-8更快。
表2草地夜蛾新生幼虫生物分析
A.剂量：2×107PIB/ml(100％死亡率)
  病毒    V8  V8vEGTDEL分离株1     L1   vEGTDEL   V8vEGTDEL分离株2
  上限    90     75.7    106     86.8      77
  LT50    84     70.6    103.6     81.5      72
  下限    84      66    101     76.5      68
B.剂量：5×106 PIB/ml(92％-100％死亡率)
  病毒    V8  V8vEGTDEL分离株1     L1   vEGTDEL  V8vEGTDEL分离株2
  上限   91.8      83    109    101     85.5
  LT50   86.4     76.5    105     93      79
  下限    81     70.6    102    85.6      73
表3在草地夜蛾新生幼虫中V8、L-1和egt缺失的LT50生物分析
A.
    病毒    上限    LT50    下限    杀灭％
  V8vEGTDEL    81.6    75.4    69.8      96
      V8    99.6     95     91      90
B.
   病毒    上限    LT50   下限   杀灭％
   L-1    106    102    98     90
 vEGTDEL    89.7    84.2   78.9     96
在使用第二龄草地夜蛾幼虫的食物重迭生物分析中，V8vEGTDEL的LT50值低于相应的V-8病毒，而V-8病毒的LT50值低于L-1株。vEGTDEL和V-8具有相似的LT50值，而V8vEGTDEL的LT50低于vEGTDEL(L-1)。用第二龄Helicoverpa zea幼虫进行的食物重迭试验中，V8vEGTDEL表现出的杀灭明显快于AcMNPV E2。在昆虫幼虫试验中，V8vEGTDEL似乎比AcMNPV L-1 egt-缺失型株(vEGTDEL)更快地杀灭被感染的昆虫。在AcMNPV野生型株(E2或L-1)的食物重迭生物分析中，在PIB/16平方厘米场所上计算出的LC50值对草地夜蛾和H.zea为1×105至1×106；对灰翅夜蛾(S.eridania)为1×1O3至1×104；对粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和烟芽夜蛾为1×101至1×102。
因此，优选的昆虫防治病毒携带赋予更高毒性表型的遗传区域和使蜕皮甾类葡糖基转移酶编码基因失活的基因修饰。优选的携带更高毒性表型的区域来自RoNPV基因组的603 ORF区域和lef-2的区域。来自其他杆状病毒的该区域的功能等同区域可以用此处公开的内容和本领域中公知的技术方便地鉴别、分离和操作。
灰翅夜蛾属昆虫在从卵发育为成虫的过程中会经历一系列已充分研究的事件(具体细节参见Comprehensive Insect Physiology，Biochemistry andPharmacology Vol 7and 8，Kerkut and Gilbert(eds.)，Pergamon Press，Oxford，1984)。在孵化后，昆虫幼虫进入了广泛的摄食阶段，在此期间它会蜕皮数次以便继续生长。在连续的蜕皮之间的阶段称为“龄”。在幼虫生长阶段的末期，幼虫蛹化并最后以成虫出现。蜕皮和蛹化过程(总称为蜕化)通过几组不同的激素协同作用而加以调节。最初的刺激是由某些脑细胞释放促前胸腺激素(prothoracicotropic hormone，PTTH)。这刺激前胸腺产生和分泌蜕皮甾类，常被称为昆虫蜕皮激素。在保幼激素存在时，幼虫蜕皮会继续，而在保幼激素缺乏时，幼虫会蛹化。羽化激素在介导与蜕化相关的数种行为变化中也至关重要。
被用作许多杆状病毒研究的模型体系的AcMNPV，它会干扰昆虫发育的过程。被AcMNPV感染的昆虫幼虫不再能蜕皮或蛹化，因为AcMNPV指导一种称为蜕皮甾类UDP-葡糖基转移酶(EGT)的酶合成，该酶特异性地通过将昆虫蜕皮甾类在体内偶联于半乳糖(O＇Reilly et al.(1991)Insect Biochem.Molec.Biol.22：313-320)或在体外偶联于葡萄糖(O＇Reilly et al.Science 245：1110-1112)而使其失活。其他杆状病毒也携带egt基因。
编码EGT的AcMNPV基因在AcMNPV基因组上从8.1图距单位延伸至9.6图距单位(图1和2)。图2显示了基因组egt区域的限制性图谱。AcMNPV(L1株)egt基因的核苷酸序列和推导的506个氨基酸的氨基酸序列分别示于SEQ IDNO：1和2。egt的编码序列从核苷酸149延伸至约核苷酸1670。
在本发明的一个优选例子中，AcMNPV V-8株的egt基因通过用编码β-半乳糖苷酶的细菌序列置换一部分egt基因而使AcMNPV V-8株的egt基因失活。该重组杆状病毒在此处被称为V8vEGTDEL。在另一优选例子中，一部分AcMNPV V8株的egt基因被无置换地缺失掉，例如通过从egt编码序列中缺失EcoRI/XbaI片段(参见图6；美国专利No.5,180,581；下面的实施例7)。另一种使昆虫病毒egt基因失活的方法是插入可在受该昆虫病毒感染的昆虫细胞中表达的某个基因(该基因编码影响蜕化的昆虫激素、使影响蜕化的昆虫激素失活的酶)或者昆虫特异性毒素基因。
使用AcMNPV egt基因作为探针时，已在杆状病毒Orgyia pseudotsugata核型多角体病毒(Orgyia pseudotsugata nuclear polyhedrosis virus，OpMNPV)中鉴别到egt基因。在阅读此处的公开内容后，本领域的技术人员知道，任何杆状病毒的egt基因都可用类似于AcMNPV的方法进行定性和分离(例如参见美国专利No.5,180,581，该专利在此引用作为参考)。与图6中核苷酸149-1666的egt编码序列至少70％核苷酸序列同源性的egt基因被认为是该序列的等同序列，只要这些同源基因编码蜕皮甾类UDP-葡糖基转移酶，使用提供的序列和分析信息并结合本领域公知的内容，技术人员可方便地对它们进行鉴别、分离和操作。
egt基因的功能等价物是那些能够催化蜕皮甾类如蜕皮素失活的酶，即通过将UDP-葡萄糖的葡萄糖或半乳糖部分转移给蜕皮甾类而使其失活。egt的那些功能等价物可用此处公开的测试方法进行鉴别。
通过蜕皮甾类葡糖基转移酶的影响而抑制蜕皮和蛹化，野生型的AcMNPV感染事实上可延长幼虫的摄食时间。缺失功能性egt基因的杆状病毒不会延长幼虫的摄食时间。用egt-缺陷型杆状病毒感染的幼虫可以蛹化，而且它们比用相应的野生型病毒感染的幼虫更快地死于病毒感染。用野生型AcMNPV和vEGTZ感染新孵化的第一龄幼虫时，可最明显地看出缺少功能性egt基因的杆状病毒的更快杀灭能力。用vEGTZ感染的幼虫比用野生型AcMNPV感染的幼虫早死亡3-4天。因此，缺少功能性egt基因的杆状病毒能作为比野生型杆状病毒有效得多的昆虫防治剂。结合此处的公开内容，明显地对本领域的技术人员而言，用本领域已知的任何方法可使任何杆状病毒中的egt基因无功能。
尽管在用缺少功能性egt基因的杆状病毒感染的幼虫中积聚子代病毒的时间长度有所缩短而且受感染的昆虫表现出减少的生长，但是子代病毒的产量已足够多。在用vEGTZ感染晚龄幼虫后，从每个幼虫获得的病毒数目为用野生型病毒时获得数目的约15-50％。这足以成本有效地进行大量病毒颗粒的制备。
在本发明的另一例子中，缺少功能性egt基因的杆状病毒用遗传工程技术进行修饰，即通过整合入第二个基因(其产物影响昆虫发育)而进一步提高其作为生物防治剂的有效性。
可将编码PTTH(一种肽激素)的基因插入病毒基因组，使egt基因失活并使PTTH以足够高的水平表达以影响蜕化。用这种病毒感染的昆虫幼虫会在发育的激素调控方面发生崩溃。这些昆虫会很快得病，造成生长和发育的严重受损、摄食减少、和更早死亡。PTTH序列在Kawakami等人(1990)Science 247：1333中有描述。
羽化激素也是小肽激素，其基因可与无功能的egt基因一起用本领域已知的技术插入病毒基因组。因为羽化激素控制与蜕化相关的许多行为变化，所以被可产生足够高水平的该激素的Egt病毒感染的昆虫会表现出行为和/或发育异常，如减少摄食。羽化激素序列在Horodyski等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8123-8127中有描述。
在昆虫中保幼激素效价的主要调节物是酶：保幼激素酯酶，它使保幼激素失活。缺少功能性egt基因并表达足够高水平保幼激素酯酶的重组病毒可有害地影响昆虫行为和/或发育。保幼激素酯酶序列在Hanzlik等人(1989)J.Biol.Chem.264：12419中有描述，而且已经通过遗传工程而强化(Hammock et al.(1990)Nature 344：458-461；Hammock et al.(1993)Arch.Biochem.Biophys.307：231-241)。
应注意，尽管所有上述基因都可用此处和/或美国专利5,180,581的公开内容以及本领域公知技术将其插入野生型病毒的基因组中，但是预计它们不会明显影响野生型病毒的昆虫行为，因为野生型病毒egt基因的表达会使蜕皮甾类蜕皮激素失活，从而防止蜕化，而不论其他激素的产生与否。因此，产生干扰昆虫蜕化的病毒的成功策略取决于优先使egt基因失活。
本领域的技术人员理解，缺少完整的egt基因或不能表达有功能的egt产物的突变生物体，以及进一步基因修饰以表达其他激素修饰酶或肽发育激素的突变生物体是作为昆虫防治剂而包括在本发明内的。
分离的和纯化的昆虫病毒是例如已经通过组织培养物的噬斑纯化而克隆的病毒，或者从单一病毒基因型而制备的病毒。如本文所用，重组昆虫病毒是至少一部分基因型来自异源昆虫病毒(即分类上病毒种类不同的昆虫病毒)的病毒。重组昆虫病毒的产生可通过用一种病毒种类之外的病毒共感染一种昆虫细胞或昆虫，或者可以通过将昆虫病毒基因组DNA和异源昆虫DNA病毒片段引入同一昆虫或昆虫细胞，结果一部分异源DNA通过重组过程而整合入昆虫病毒基因组而形成。应理解，这种重组病毒在本领域中可通过限制性内切酶分析、至少一部分假定重组基因组的DNA测序或表型改变识别出。如此处具体给出的那样，重组昆虫病毒可通过与亲代昆虫病毒相比较，依据对至少一种靶昆虫的毒性增加(LT50降低)的表型而识别出。具有更快杀灭表型的重组昆虫病毒表型可进一步基因修饰和进一步地作为昆虫防治剂而改良，例如通过使蜕皮甾类修饰酶失活。
如此处所用，杀虫剂组合物含有至少一种活性成分，该活性成分对有害昆虫有不利影响，最好是杀死该昆虫。本发明涉及使用重组昆虫病毒，该病毒已被分离或已用异源昆虫病毒DNA片段进行基因工程改造从而与相应的野生型相比它能更快地杀灭至少一种有害昆虫。异源昆虫病毒DNA片段是与亲代重组病毒基因组一般不相关的片段。如此处所述，一部分杆状病毒基因组已被分离出并鉴别，并且当插入AcMNPV L-1基因组，以草地夜蛾为靶昆虫时，显示出可赋予更快杀灭昆虫的表型(如LT50分析所测得)。当使用该重组昆虫病毒的Egt-缺陷型衍生株时，因为昆虫egt-缺陷型重组病毒而造成昆虫摄食减少，正常的昆虫蜕化被破坏并且与等基因的野生型株(即带有功能性egt)相比昆虫的死亡被进一步加速。本发明的重组病毒也可以是经基因工程改造从而使编码蜕皮甾类修饰酶的基因失活的昆虫病毒，或者是进一步改造以表达异源基因(该基因编码影响昆虫发育的蛋白)从而缩短昆虫摄食时间或造成病毒感染后更快死亡的病毒。
本领域的技术人员知道，有害昆虫可用常规方法暴露于本发明的病毒，其中包括摄入、吸入或直接接触昆虫防治剂。
本发明的重组的和/或基因工程改造的杆状病毒的主要用途是作为施用于植物以生物防治植物有害昆虫的农业组合物中的活性成分。制备这种用于防治昆虫的、适合农用的组合物的许多改变方法是本领域中已知的。本发明的杀虫剂组合物的典型施用剂量为2.4×108至2.4×1012PIB/公顷的重组昆虫病毒。
适合施用于植物以防治有害昆虫的杀虫剂组合物含有农业上合适的载体和昆虫防治剂即昆虫病毒，更佳地为杆状病毒。本领域技术人员已知的常规配制方法可用于制备本发明的组合物。组合物可以是可湿性粉剂、可散发颗粒制剂、颗粒、悬浮液、乳剂、气雾剂溶液、饵剂或其他常规的杀虫剂制剂形式。湿化剂、涂覆剂、增加物理挠性的试剂、UV保护剂、分散剂和粘附剂等至少在某些配方中是有用的添加剂。组合物一般含有无活性的载体，它可以是液体如水、醇、烃或其他有机溶剂，或矿物油、动物油或植物油，或者粉末如滑石粉、粘土、硅酸盐或硅藻土。养分如糖也可加入以增加摄食行为和/或吸引昆虫。流动剂例如基于粘土的流动剂，可以加入以减少可湿性粉剂或其他干制剂在储藏中的结块。施用本发明的杀虫剂组合物可以通过减少其摄食和杀灭易感昆虫而保护植物防止有害昆虫的危害。
熟练技术人员知道如何选择一种适合防治某一特定有害昆虫的昆虫病毒。产生用于保护植物的杀虫有效性农业组合物所需的昆虫防治剂的浓度取决于作物的类型、靶昆虫、所用的病毒基因型和组合物的配方。杀虫剂组合物可以配制成例如可湿性粉剂，其中含有约10％(w/w)多角体蛋白包含体。在组合物中的昆虫防治剂的杀虫有效浓度可由本领域的一般技术人员通过试验而确定。
农业组合物必须适合农业应用而且在田地中分散。一般，组合物的组份必须是无植物毒性的而且不危害包含体病毒的完整性。叶面施用必须不破坏或损坏植物叶子。除了合适的固体或更佳的液体载体之外，农业组合物可含有粘着剂和粘附剂、乳化剂和湿化剂，但是不含有阻止昆虫摄食或任何病毒功能的组份。最好加入保护昆虫防治剂免受UV失活的组份。用于防止有害昆虫的农业组合物也可含有刺激昆虫摄食的物质。
已有描述生物昆虫防治剂的施用方法和农业应用方面的综述。例如参见Couch and Ignoffo(1981)，Microbial Control of Pests and Plant Disease 1970-1980，Burges(eds.)，34章，pp.621-634；Corke and Rishbeth，ibid，chapter 39，pp.717-732；Brockwell(1980)Methods for Evaluating Nitrogen Fixation，Bergersen(ed.)pp.417-488；Burton(1982)Biological Nitrogen Fixation Technology for TropicalAgriculture，Graham and Harris(eds.)pp.105-114；以及Roughley(1982)ibid，pp.115-127；The Biology of Baculoviruses，Vol.II，supra。
在Arizona州的秋天生长季节，进行了田野试验，其中测试了AcMNPV E-2、V8vEGTDEL和市售的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、kurstaki亚种杀虫剂(DIPEL 2X，Abbott Laboratories，Chicago，IL)。尽管害虫灾害较轻，该研究的结果显示，V8vEGTDEL在幼莴苣中能有效地防治粉纹夜蛾(表4)。在第4次施用处理(约5天间隔)后，1×1011和1×1012PIB/A的V8vEGTDEL比类似剂量的AcMNPV-E2野生型提供了更佳的防治粉纹夜蛾的效果。此外，1×1011和1×1012PIB/A的V8vEGTDEL提供了与1磅/A DIPEL 2X相同水平的防治粉纹夜蛾灾害的效果。然而，基于仅施用3次后获得的数据，DIPEL 2X的防治害虫的效果优于两种杆状病毒。
在数据收集完成之后，用1％(v/v)漂白粉水溶稀释液喷洒测试场所(以及10英尺宽的周围)。测试的作物以及10英尺宽的周围再用安装拖拉机的耕地设备破坏。约3周后，在测试场所100英尺内的数个位点收集土壤样品。在场所位点周围的土壤中没有检测到V8vEGTDEL病毒，没有采取进一步措施。
表4.选定的杆状病毒处理莴苣中的粉纹夜蛾的有效性
   处理1     剂量/A2   平均#幼虫/10植株3DA3T时    平均#幼虫/10植株5DA4T时
 V8vEGTDEL    1×1010PIB1×1011PIB1×1012PIB        15ab320a12b          20a2c7bc
 AcMNPV E2    1×1010PIB1×1011PIB1×1012PIB         10b18a12b          18a20a10b
  DIPEL 2X    1磅形式          0c          7bc
未处理    -         20a         18a
1.杆状病毒组合物被配制成水溶性可湿性粉剂(1×1011PIB/10gm)。
2.在第15天按1×109、1×1011和1×1013PIB/A施用杆状病毒组合物，但是由于1×1013剂型的混合及喷洒特性差，在第5、10和15天的所有随后施用中，两种杆状病毒的用量为1×1010、1×1011和1×1012PIB/A。DIPEL 2X也在第1、5、10和15天施用。
3.在列中跟随相同字母的平均值是无显著差别的(DMRT，P＝0.05)。
在第二次新泽西州的秋天田野试验中，测试了V8vEGTDEL、AcMNPV E2和市售的苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种杀虫剂(DIPEL 2X，Abbott Laboratories，Chicago，IL)对卷心菜尺蠖的有效性。病毒杀虫剂组合物被配制成可湿性粉剂。
由于虫灾较轻，在防治粉纹夜蛾幼虫的处理之间的差别非常微小(而且一般在统计学上是不显著的)。然而，所有处理的与未处理的卷心菜相比，其活幼虫明显更少而且植物落叶更少(表5)。在最后一次施用处理后7天，未处理地块平均落叶率为18％，而用V8vEGTDEL或AcMNPV-E2“野生型”(剂量为1×109、1×1011和1×1012PIB/A)的平均落叶率为8-10％，而DIPEL 2X(1磅/A)处理的卷心菜的平均落叶率为4％。在最后一次施用后12天，未处理地块平均值为6.5条活幼虫/10株植株，而用杆状病毒(1×1011和1×1012PIB/A)和DIPEL 2X处理的地块的平均值＜2条幼虫/10株植株。
在数据收集完成之后，用1％(v/v)漂白粉水溶液喷洒测试场所(以及10英尺宽的周围)。测试作物以及10英尺宽的周围再用安装拖拉机的耕作设备破坏。在漂白粉处理约5个月后，再次在测试场所100英尺内的数个位点收集土壤样品。并在这一天，用AcMNPV E2“野生型”按1×1012PIB/A处理测试位点。在这些新土壤中没有检测到V8vEGTDEL病毒。
表5.选定的杆状病毒处理卷心菜中的粉纹夜蛾的有效性
   处理1    剂量/A2    平均#幼虫/10植株7DA3T时   平均#幼虫/10植株12DA3T时
 V8vEGTDEL    1×109PIB1×1011PIB1×1012PIB          10b311b7bc         2.0b1.2bc1.7bc
 AcMNPV E2   1×109PIB1×1011PIB1×1012PIB          8bc8bc11b         2.0b0.8bc0.8bc
 DIPEL 2X   1磅形式           4c         0.2c
未处理   -           8a         6.5c
1.两种类型的杆状病毒都被配制成水溶性可湿性粉剂(1×1011PIB/10gmWP)。
2.“EGT缺失型”和“野生型”(1×109和1×1011PIB/A)和DIPEL 2X都施用3次。由于使用计划的1×1013PIB/A杆状病毒剂量时，发生喷嘴的严重阻塞，所以在第一次施用时没有“高剂量”的杆状病毒，而V8vEGTDEL和AcMNPV E2的施用量为1×1012PIB/A，并且随后施用2次(5天和10天后)。
3.在列中跟随相同字母的平均值是无显著差别的(DMRT，P＝0.05)。
在春天于Florida州进行的第三次田野试验中，测试了V8vEGTDEL、AcMNPV E2和市售的苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种杀虫剂(Xentari，AbbottLaboratories，Chicago，IL)防治莴苣中粉纹夜蛾的有效性。
数据总结于表5。V8vEGTDEL提供明显快于AcMNPV V8的粉纹夜蛾防治效果。在用V8vEGTDEL处理(1×1012PIB/A)后5天，造成100％幼虫死亡率，而同样剂量的V8只造成29％的幼虫死亡率(第7天可达97％)。而且，V8vEGTDEL(1×1011PIB/A)表现出与1×1012PIB/A的V8等同的幼虫防治效果。
在第4天时，市售的苏云金芽孢杆菌产品Xentari(1磅/A)提供了76％幼虫死亡率，而V8vEGTDEL(1×1012PIB/A)仅为40％幼虫防治。但是在第5天时，V8vEGTDEL(1×1012PIB/A)和Xentari(1磅/A)分别表现出100％和89％的幼虫死亡率。
表6.田野施用V8vE GTDEL和AcMNPV V8(“野生型”)对莴苣中粉纹夜
蛾的有效性
   处理1       剂量每英亩             平均幼虫死亡率％2
  第4天   第5天  第6天 第7天
 V8vEGTDEL    1×1011PIB    0     35    88    100
 V8vEGTDEL    1×1012PIB    40    100     -     -
 AcMNPV V8    1×1012PIB    4     29    68     97
  Xentari    1磅    76     89    92     95
1.杆状病毒组合物被配制成水溶性可湿性粉剂。
2.处理物被施用于6片真叶的莴苣上(4块地/每个处理，设计成RCT)。在施用后约3小时，从试验地中收获叶子，分别置于含有用水浸湿的滤纸的Petri培养皿中，并放置3天大小的粉纹夜蛾幼虫(约10条幼虫/叶)。2天后，将幼虫置于含未处理的Stoneville合成食物的CD-International盘中(1条幼虫/食物孔)，在处理后几天中每天计算死亡率百分比。
此处提供的实施例使用了分子生物学、在植物组织中操作重组DNA及转基因植物的培养和再生领域的技术人员所众所周知和可使用的许多技术。酶是从市售渠道获得并按供应商建议或本领域已知的改变条件下使用。试剂、缓冲剂和培养条件是本领域中已知的。提供标准分子生物学程序的参考文献包括：Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Plainview，NY；R.Wu(ed.)(1993)Methods in Enzymology 218；Wu eta1.(eds.)Methods in Enzymology 100，101；Glover(ed.)(1985)DNA Cloning，Vols.I and II，IRL Press，Oxford，UK；以及Hames and Higgins(eds.)(1985)Nucleic AcidHybridization，IRL Press，Oxford，UK。所用的缩写和术语是本领域中标准的和在专业刊物(如此处提及的刊物)中通常使用的。所有在本申请中提及的文献都清除地以参考地形式进行引用。
本发明通过下列实施例进行阐述，这些实施例不以任何方式限定本发明的范围。应理解，可以有各种例子、变动形式或等价形式，在阅读此处的描述之后这些形式对本领域技术人员而言是不言而喻的，它们都符合本发明的主旨和/或在所附权利要求的范围之内。
实施例
实施例1.分离AcMNPV V-8
将来自Pat Vail分离的原始AcMNPV(Vail et al.(1971)Proc.IV Int.colloq.Insect Pathology，College Park，MD pp.297-304)的传代数最少的AcMNPV贮存物在来自美国氰胺公司(Princeton，NJ)烟芽夜蛾群的烟芽夜蛾幼虫上繁殖。烟芽夜蛾在28℃，恒定荧光下，于大豆-小麦种子琼脂基食物上培养。接着，病毒在烟芽夜蛾幼虫上进一步繁殖。从最新感染的烟芽夜蛾幼虫的稀释血淋巴中通过噬斑纯化病毒克隆。用于噬斑分析、噬斑纯化、病毒扩增和病毒DNA制备的方法描述于O＇Reilly et al.(1992)Baculovirus Expression Vectors；A LaboratoryManual，W.H.Freeman&Co.，New York，NY。除非另外注明，病毒在IPLB-SF-21细胞系(SF-21)(Vaughn et al.，(1977)In Vitro 13：213-217)用补充有0.26％胰蛋白胨和10％胎牛血清(Intergen，Purchase，NY)的TC100培养基(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)上繁殖。SF-21细胞市场上有售(如Invitrogen Corporation，SanDiego，CA)。从各分离株制备DNA，并与从AcMNPV L-1株(该株描述于Lee andMiller(1978)J.Virol.27：754)制备的DNA一起平行地进行限制性内切酶分析定性。
实施例2.AcMNPV lef-2区域的分析
使用前述的分子生物学技术(Maniatis et al.，1989)。质粒pRI-I含有克隆在pBR322的EcoRI位点处的7.33kb AcMNPV L-1的EcoRI-I片段。质粒pEcoRI-IV8含有Bluescript KS+(Stratagene，La Jolla，CA)的EcoRI位点处的V-8 EcoRI-I片段。通过用相应的来自V-8的片段置换L-1 EcoRI-I片段中1.72kb的MluI至EspI片段(1.93-3.27图距单位)而构建质粒pEcoRIHybI。再将杂合的EcoRI-I片段克隆入pUC19载体，产生pUC19HybI，一个在603 ORF中只有一个NaeI位点的质粒。在该NaeI位点发生移码突变的质粒pUC19HybIFS的产生是通过：用NgoAIV(产生粘性末端的NaeI同裂酶)消化pUCl9HybI，用绿豆核酸酶使粘性末端平整化，将平整末端重新连接起来，形成4个碱基对的缺失，该缺失破坏了NaeI位点并破坏了603 ORF阅读框。通过双脱氧核苷酸测序(United StatesBiochemical Corp.Sequenase试剂盒，Cleveland，OH)证实了该移码，在发表的AcMNPV L-1 DNA序列(Prossee et al.，(1991)Virology 185：229-241)基础上，可预计会导致603 ORF翻译在缺失下游14个氨基酸处的成熟前终止。
实施例3.病毒生物学鉴定
按前述方法(O＇Reilly et al.，1992)，同时从受感染的粉纹夜蛾幼虫中制备L-1、V-8、vEcoRIHybI和vEcoRIHybIFS的多角体包涵体(polyhedral inclusionbody，PIB)。在草地夜蛾幼虫上进行新生幼虫生物分析，并收集LC50数据(使一半幼虫在感染后10天死亡所需的病毒浓度[PIB/毫升食物])和LT50数据(在特定病毒浓度下，一半幼虫死亡所需的时间)。新生幼虫在含有各种浓度测试病毒PIB的食物上摄食24小时，然后转入含有食物但不含病毒的各个杯中。每种测试病毒的7个剂量是5×104、2×105、5×105、1×106、2×106、5×106、和2×107PIB/毫升。每个剂量分析60条幼虫。在感染后(p.i.)48、72、84、90、96、102、108、120、132和144小时记录幼虫死亡率。在感染后第10天进行最终死亡率的计数。用概率单位分析法(Daum(1970)Bulletin of theEntomological Society of America 16：10-15)确定LC50和LT50值。
其他的毒力试验如下进行：从C-D International，Inc.购得盘，每个盘含有32个单独区域。每个4×4厘米(16平方厘米)区域含有5毫升合适的合成食物。从C-D International，Inc.购得的透明排气粘性顶盖将昆虫在处理和虫害发生后封闭在区域中。这些透明顶盖便于方便地计数。Stonevill(大豆/小麦种子食物)或菜豆(Bio-Serv，Inc.，Frenchtown，NJ Diet#9393)食物的表面用0.4毫升病毒水溶液污染。稀释浓度范围为1×108至1×101PIB/ml，按10倍进行稀释，这取决于所测试的昆虫种类。施用时通过转动盘而均匀分散，然后在层流罩中使溶液干燥。在研究期间，生物分析盘在28℃保持于连续荧光下。每天进行二次读数以观察感染的起始时间。用BASIC对数/概率单位统计软件包并根据在处理后第8天的死亡率对剂量计算LC50值。T0(在0小时时的时间)基于幼虫暴露于处理过食物的平均起始时间。用BASIC对数/概率单位统计软件包并根据死亡率对小时计算LT50值。计算的LT50值衍生自LD95值(基于这样的一个剂量，它最好小于比LC50大2个对数的剂量)。
实施例4.重组病毒的构建
基本上按O＇Reilly等人((1992)同上)的方法制备重组病毒。重组病毒vEcoRIHybI和vEcoRIHybIFS的构建是通过：用vSynVIgal DNA(Wang etal.(1991)Gene 100：131-137)与pUC19HybI质粒DNA(用于vEcoRIHybI)或pUC19HybIFS质粒DNA(用于vEcoRIHybIFS)(参见实施例2)一起共感染SF-21细胞。病毒vSynVIgal表达大肠杆菌lacZ基因(代替多角体蛋白基因)因而在生色的β-半乳糖苷酶指示剂X-gal存在下形成包含体阴性(OCC-)的、蓝色噬斑。pUC19HybI和pUC19HybIFS都含有多角体蛋白；因此在来自多角体蛋白区域的质粒DNA和病毒DNA之间的重组会产生白色的包含体阳性(OCC+)病毒噬斑。形成白色OCC+噬斑的病毒已通过等位基因置换丢失lacZ基因并获得了功能性多角体蛋白基因。
实施例5.杆状病毒变异体的田野试验
田野试验计划用于评估V8vEGTDEL相对AcMNPV野生型对危害蔬菜的重要的灰翅夜蛾属害虫的防治有效性。在这些田地试验中选定的害虫生物体包括：卷心菜尺蠖粉纹夜蛾；甜菜黏虫甜菜夜蛾；秋黏虫草地夜蛾；南方黏虫灰翅夜蛾；烟草芽虫烟芽夜蛾；螟蛉Helicoverpa zea；菱背蛾(diamondbackmoth)Plutella xylostella；卷心菜虫菜粉蝶。每个测试都在目前用于生长/生产作物的田地(即农用或研究用的农场)上进行。用于每个测试的作物是带叶蔬菜(如莴苣)或十字花科(如卷心菜)。每个田地试验由下列8个处理所构成：1×109、1011和1013PIB/英亩的V8vEGTDEL(见下面的实施例6和7)；1×109、1011和1013PIB/英亩的AcMNPV，和未处理的对照。在给定的试验中，施用于作物的每个处理不超过6次；处理按“需要”进行施用(即以害虫群为准，间隔可能为5至14天。
在每个测试中，每种处理的最大施用次数为6次。在每个试验中将处理施用于场地是通过使用地面设备或者是小型拖拉机喷洒器或二氧化碳驱动的背式喷洒器。处理物在水中稀释并通过标准的农业液压喷洒吊杆和喷嘴而施用。在每个测试中处理地块的最大尺寸(即重复单元)为0.018英亩(即4行宽×60英尺长，行间距40英寸)。每个测试中每种处理的地块(即重复单元)的最大数目为4。在研究中基于至少一周间距监测各测试。这些试验中的每个试验都在保护下的私人农场或研究农场(未经许可的个人不可穿越)中进行。在各试验结束时，测试区域和10英尺宽的未处理周围内“摧毁作物”(即被处理的作物及其相邻作物被粉碎并耕入地下，而不是收获用于商业用途。)。
土壤可能是病毒在环境中持续的最重要的根据地。监测计划包括在测试地点和测试区域外100英尺的区域内收集4个土壤样品(每个深7.6厘米)，总计500克。样品约在测试中间采集。在所有的消毒程序(如下所述)完成后，在测试结束时采集第二套样品。
监测活的、有感染力的病毒是至关重要的，因为免疫检测和PCR方法不能区分有感染力的包含体和无活力的病毒颗粒残留物。唯一可靠的确定在土壤样品中是否存在活的、有感染力的病毒的方法是，在高度易感的昆虫宿主如烟芽夜蛾上进行样品的生物分析。在每个500克的土壤样品中，在生物分析中使用25克。使用标准方法从土壤中分离病毒包含体。该方法可有效地从土壤中回收约46％多角体。对烟芽夜蛾，在我们的标准食物重迭测试中AcMNPV的LC50为300-1000多角体/区域。因此，如果待生物分析的每个幼虫供给来自1克土壤的分离物，那么该测试可以可靠地检测600-2000个病毒包含体/每克待分析土壤。在生物分析中表现出典型的病毒感染症状的幼虫用光学显微镜检查是否存在包含体。如果观察到多角体，那么从死虫上分离它们以便从包含体分离出DNA，然后用vEGTDEL缺失两侧的引物(例如见实施例6)进行标准的PCR分析(在实验室中常规进行)。DNA回收和PCR测试的有效性接近100％。如果存在的病毒是vEGTDEL，那么会观察到特定大小的DNA片段。从而可以毫无疑问地确定病毒为vEGTDEL。其他病毒会形成大小不同的DNA片段。
在egt基因中有缺失的AcMNPV变异病毒也可在自然界自发产生，而这种病毒有严重的复制缺陷，使其在环境中不能有效地与土生的病毒竞争。此外，因为egt失活的病毒在成功的感染后产生的多角体少30-50％，因此其环境持续性进一步受到危害。在测试地点中污染的植株和10英尺周围内的缓冲液、工具和农用工具都用1％漂白粉洗涤而局部消毒以防止病毒杀虫剂的不必要的扩散。
用于田地试验计划的V8vEGTDEL制剂是可湿性粉剂形式。按重量：重量计，该制剂的成分如下：
       成分                                重量％
       V8vEGTDEL                            10.00
       Eudragit S100                         0.45
       UV-9氧苯酮                            2.50
       聚乙二醇MW400                         0.10
       MiraSperse                           39.10
       REAX ATN磺酸木质素                    4.90
       10X糖                                19.45
       Morewet EFW                          19.60
       Microcel E                            3.90
                                           100.00
Eudragit S100(Rohm Pharma Co.)含有甲基甲基丙烯酸(methyl methacrylic)和甲基丙烯酸甲酯。它是pH依赖型填料，将UV9固定在PIB上，而且稍延长制剂的光稳定性。UV-9氧苯酮(Cytech Ind.)也提供了制剂的部分光稳定性。聚乙二醇MW400(Aldrich Chemical Co.)提供UV-保护涂层的挠性。MiraSperse(Staley Co.)是基于淀粉的“粘着剂”，它提供了制剂施用于作物后的雨附着性(rainfastness)。REAX ATN(West Waco Co.)是磺酸木质素，它被用作分散剂并保持颗粒分散于液相中(即在水稀释液中)。糖作为昆虫摄食剌激剂和/或引诱剂。Morewet EFW(Witco Co.)是湿化剂，从而使制剂能更有效地通过处理过的叶子表面扩散。Microcel E(Manville Co.)是基于粘土的流动剂，它防止可湿性粉剂在储藏中结块。
为了用于测试制剂，PIB(多角体包涵体)被气磨至尺寸小于10微米，并且涂覆含有Eudragit S100、UV-9和MW400的有机溶液。其他的上述惰性材料被混合并Fitz-研磨，制得预混合物。将涂覆的PIB和预混合物混合在一起，然后Fitz-研磨，再包装制剂。在制剂中不存在外来微生物，因为组织培养生产需要使用无菌程序。在每10克可湿性粉剂中，有1克(2×1011PIB)V8vEGTDEL。
一种优选的可湿性粉剂杀虫剂组合物如下：
    成分                             公称百分比(w/w)
    V8vEGTDEL多角体蛋白包含体        10.0％
    Morwet D425                      30.0％
    Morewet EFW                      20.0％
    高岭土                           16.0％
    Microcel E                       16.0％
    UV-9氧苯酮或木炭                 5.0％
    Eudragit S100                    2.0％
    柠檬酸                           0.9％
    聚乙二醇MW400                    0.1％
活性成分是V8vEGTDEL。Morewet D425被用作分散剂，它保持颗粒分散于液相中(即在水稀释液中)。Morewet EFW(Witco Co.)是湿化剂，从而使制剂能更有效地通过处理过的叶子表面扩散。高岭土是填料。Microcel E(Manville Co.)是流动剂，它防止可湿性粉剂结块。UV-9(或木炭)提供了制剂的部分光稳定性。Eudragit S100(Rohm Pharma Co.)也提供了制剂的少量光稳定性。柠檬酸被用作pH调节剂。MW400(Aldrich Chemical Co.)提供UV-保护涂层的挠性。
在另一优选的可湿性粉剂中，任选地加入芪增亮剂(约5％，w/w)并相应调节其他惰性成分的百分比。芪提供了抗UV失活的某些保护并且增加或提高病毒感染力，尤其在对病毒较不易感的昆虫中，例如参见美国专利No.5,246,936(1993年12月21  授予Treacy等人)，该文献在此引用作为参考。
在该制剂中，PIB先用水性涂覆程序进行涂覆。制备Eudragit S100在水中的1％(w/v)悬浮液。通过将pH调至9.0-9.5而使Eudragit溶解。加入适当比例的病毒PIB、Blankophor BBH(芪增亮剂，Miles Inc；如果使用)和UV-9氧苯酮或木炭。共混混合物形成均匀的悬浮液，然后空气干燥。干燥的涂覆PIB再气磨形成小颗粒。该材料再与上述数量的Morwet D425、Morewet EFW、高岭土、Microcel E、柠檬酸和聚乙二醇MW400一起干混，然后包装成最终制剂。混合后的材料的优选颗粒尺寸为小于20微米。
实施例6
在AcMNPV基因组中egt基因的位置示于图2B。在图1A中AcMNPV基因组图的上方给出了图距单位的刻度。已确定了AcMNPV L-1 egt基因和侧翼区域的核苷酸序列(图6，SEQ ID NO：)。图1显示了用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切后AcMNPV L-1基因组的线性图。图1B是AcMNPV基因组中从7.6-11.1图距单位的放大图，显示了egt基因的位置。AcMNPV L-1株已经被描述(Lee and Miller(1978)J.Virol.27：754)。克隆的L-1 DNA片段和形成的质粒的名称示于图1C。片段1，它从7.6图距单位的PstI位点延伸至11.1图单位处的BamHI位点，被克隆入质粒载体pUC19中；片段2和3(分别从PstI(7.6图距单位)至EcoRI(8.65图距单位)以及从EcoRI(8.65图距单位)至SalI(10.5图距单位))两者被克隆入载体Bluescript M13+和Bluescript M13-(Stratagene，San Diego，California)。片段5(BstEII(8.35图距单位)至BstEII(8.7图距单位))被克隆入载体Bluescript M13+。
实施例7
为了构建能够表达功能性egt基因的AcMNPV重组病毒(如V-8)，需要对实施例I中描述的质粒克隆进行进一步的操作。用限制性内切酶EcoRI和XbaI(在egt基因中的位点可参见图3)酶切质粒pUCBCPsB，丢弃小片段。再将从pSKS104(Casadaban et al.(1983)Methods Enzymol.100：293-303)中用EcoRI和AhaIII切取的大肠杆菌LacZ基因，在XbaI粘性末端用T4 DNA聚合酶被填平之后，插入EcoRI和XbaI位点之间。形成的质粒命名为pEGTZ。在该质粒中，插入的lacZ基因处于前面的egt编码序列的阅读框中。或者，通过简单地将EcoRI和XbaI位点连接在一起(在两个位点都被填平之后)并且不在其中间插入任何序列，从而构建质粒pEGTDEL。
用Miller等人(1986，同上)的方法，再将质粒pEGTZ与AcMNPV V-8DNA一起共转染SF细胞，该程序允许在病毒和质粒DNA之间发生同源重组，导致质粒的egt-lacZ融合基因置换病毒的egt基因。因为保留的egt编码序列和lacZ处于阅读框中，所以这种重组病毒会产生一种融合蛋白，它含有连于β-半乳糖苷酶的egt的前84个氨基酸。该重组病毒被称为vEGTZ，它可以被鉴别，因为β-半乳糖苷酶的病毒在生色的β-半乳糖苷酶指示剂如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)存在下会产生蓝色病毒噬斑。
重组病毒V8vEGTDEL的获得是通过：将质粒pEGTDEL和来自病毒vEGTZ的DNA共感染入SF细胞中。同源重组导致来自pEGTDEL的缺失的egt基因置换V8vEGT中的egt-lacZ融合基因。重组病毒vEGTDEL通过它们在X-gal存在下不能形成蓝色噬斑而鉴别出。
在egt被失活的AcMNPV V-8病毒的一个特定例子中，在AcMNPV物理图上7.6-11.1图距单位的DNA片段被克隆入美国专利No.5,180,581中所述的质粒载体中，该专利在此引用作为参考。
该AcMNPV片段含有egt基因和侧翼的病毒DNA。在egt基因内造成内部缺失，并且将大肠杆菌lacZ基因融合在阅读框内。用该融合质粒通过细胞重组机制介导的等位基因重组而置换AcMNPV中的egt基因，从而构建出最初的egt-缺失病毒，命名为vEGTZ。lacZ基因的存在便于通过在合适的生色指示剂存在下噬斑分析中的蓝色而鉴别出重组病毒。另一种egt缺失病毒vEGTDEL的构建是通过：从含有AcMNPV基因组中7.6-11.1图距单位区域的质粒载体中通过PCR介导的诱变而缺失egt基因的内部部分序列。egt编码序列和侧翼序列的序列和PCR引物的位置示于图6。在图3所示的准确位点处的缺失导致在缺失接头处形成两个新的和易定性的限制性酶位点(EcoRI和XhaI)。该缺失质粒再被用于置换egt-缺失的lacZ基因。
实施例8
egt酶活性蛋白可如下加以确定：如前用egt缺失的病毒感染SF细胞。在感染后12小时收集细胞和细胞外培养基，并分开处理。未感染的细胞平行进行处理。按O＇Reilly和Miller(1989)Science 245：1110-1112中所述方法，将细胞裂解液或细胞外培养基在lmM UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和0.25μCi[3H]蜕皮素存在下孵育。在细胞裂解液或细胞外培养基中的蜕皮甾类UDP-葡糖基转移酶活性可催化葡萄糖从UDP-葡萄糖转移至蜕皮素，形成蜕皮素-葡萄糖偶合物。通过氧化硅凝胶薄层色谱(Bansal and Gessner(1988)Anal.Biochem.109：321)，将蜕皮素和蜕皮素-糖偶合物相互分开。只有在分析野生型AcMNPV感染的细胞裂解液或细胞外培养基时才形成蜕皮素-糖偶合物(G)。在使用未感染的或egt-失活的病毒感染的细胞裂解液或细胞外培养基时没有观察到偶合物，这表明该活性是由于egt表达造成的。活性的绝大多数位于细胞外培养基中。
应理解，上述内容仅涉及本发明的优选例子，在不偏离所附权利要求中所述的本发明的主旨和范围下，可以进行各种改动和变动。

Claims (23)

1.一种分离的DNA分子，其特征在于，它含有图4中从核苷酸3002-4231的V-8序列的核苷酸序列，其中当该核苷酸序列被整合入昆虫病毒基因组中时该核苷酸序列会赋予更快杀灭至少一种有害昆虫的性能。
2.如权利要求1所述的分离的DNA分子，其特征在于，它含有图4中从核苷酸2469-4231的核苷酸序列。
3.一种昆虫病毒，它具有针对至少一种有害昆虫的更快的杀灭性能，其特征在于，该昆虫病毒被基因工程改造以含有权利要求1或2所述的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的昆虫病毒，其特征在于，它是杆状病毒。
5.如权利要求4所述的昆虫病毒，其特征在于，该杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。
6.如权利要求5所述的昆虫病毒，其特征在于，该基因工程改造的杆状病毒是vEcoRIHybI和vEcoRIHybIFS之一。
7.如权利要求3所述的昆虫病毒，其特征在于，它被进一步基因工程改造以使编码蜕皮甾类葡糖基转移酶的基因失活。
8.如权利要求7所述的杆状病毒，其特征在于，该蜕皮甾类葡糖基转移酶通过缺失其至少一部分而失活。
9.一种分离和纯化的重组杆状病毒，其特征在于，该重组杆状病毒在其基因组中整合有一段异源的昆虫病毒DNA片段，该片段可赋予更快的杀灭性能，其中与缺失该DNA片段的同基因的亲代杆状病毒相比，该重组杆状病毒对至少一种有害昆虫的杀灭更快。
10.如权利要求9所述的分离和纯化的重组杆状病毒，其特征在于，它是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。
11.如权利要求10所述的重组杆状病毒，其特征在于，该DNA片段衍生于剌金翅夜蛾核型多角体病毒V1000。
12.如权利要求11所述的重组杆状病毒，其特征在于，该DNA片段含有图4中从核苷酸3002-4231的核苷酸序列。
13.如权利要求11所述的重组杆状病毒，其特征在于，该DNA片段含有图4中从核苷酸2469-4231的核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的杆状病毒，其特征在于，它是AcMNPV V-8。
15.如权利要求9所述的杆状病毒，其特征在于，作为昆虫防治剂，它通过失活编码蜕皮甾类葡糖基转移酶的基因而被进一步改良。
16.如权利要求15所述的杆状病毒，其特征在于，在其中编码蜕皮甾类葡糖基转移酶的基因被失活的杆状病毒是AcMNPV V-8。
17.一种杀虫剂组合物，其特征在于，它含有有效量的权利要求9所述的杆状病毒和合适的载体。
18.如权利要求17所述的杀虫剂组合物，其特征在于，该杆状病毒的更快的杀灭性能通过感染该有害昆虫的新生幼虫和一半受感染的幼虫死亡之间的时间短于在苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒中观察到的时间而确定。
19.如权利要求18所述的杀虫剂组合物，其特征在于，该杆状病毒是至少AcMNPV V-8和V8vEGTDEL之一。
20.如权利要求18所述的杀虫剂组合物，其特征在于，该杆状病毒是进一步基因工程改造以使编码蜕皮甾类葡糖基转移酶的基因失活的AcMNPV V-8。
21.一种可湿性粉剂杀虫剂组合物，其特征在于，它含有V8vEGTDEL多角体包涵体，10重量％；甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯pH依赖型填料，0.45重量％(w/w)；UV-9氧苯酮，2.5重量％(w/w)；聚乙二醇，分子量400，0.10重量％(w/w)；淀粉基粘着剂，39.1重量％(w/w)；磺酸木质素，4.9重量％(w/w)；糖，19.45重量％(w/w)；湿化剂，19.60重量％(w/w)；和粘土基流动剂，3.9重量％(w/w)。
22.制备权利要求21所述的杀虫剂组合物的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
a)气磨V8vEGTDEL多角体包涵体至尺寸小于10微米；
b)用含有pH依赖型涂料、氧苯酮和聚乙二醇分子量400的有机溶液涂覆步骤(a)中的气磨的多角体包涵体；
c)混合淀粉基粘着剂、磺酸木质素、糖、湿化剂和粘土基流动剂，制得预混合物；以及
d)将步骤(b)中的涂覆颗粒和步骤(c)中的预混合物混合在一起，从而形成可湿性粉剂杀虫剂组合物。
23.一种可湿性粉剂杀虫剂组合物，其特征在于，它含有V8vEGTDEL多角体包涵体，10重量％；甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯pH依赖型填料，2.0重量％(w)；UV-9氧苯酮或木炭，5.0％(w)；聚乙二醇，分子量400,0.10重量％(w/w)；湿化剂，20％(w/w)；和高岭土填料，16.0％(w/w)；柠檬酸，0.9％(w/w)；分散剂，30.0％(w/w)；和粘土基流动剂，16.0％(w/w)。
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