CN102321650A - 一种利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法。在带有家蚕丝素蛋白轻链基因同源臂的载体上，构建与家蚕轻链基因融合表达荧光蛋白和抗菌肽的基因打靶转基因载体，通过转基因方法进行基因打靶，通过荧光筛选和分子生物学鉴定，获得生产荧光抗菌丝的转基因家蚕。本发明方法实现了家蚕蚕丝的丝质改造，延伸了蚕丝的功能，拓展了蚕丝的应用价值，荧光抗菌丝无DNA及其他理化因素污染，不存在转基因生物的潜在危害性，生物安全性高；制备工艺简单，成本低。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法。
背景技术
几千年来，人们利用家蚕能吐丝结茧这一生物机能，大量生产生丝。蚕丝纤维由蛋白质组成，丝素蛋白虽然具有很多优良的使用性能，但相对而言也存在一些缺点，为了使缺陷得以改善，在蚕丝改造方面，主要包括物理、化学（后加工过程）方法和基因改造方法。鉴于蚕丝纤维的特点，人们希望通过遗传与分子设计，在源头——基因水平对蚕丝基因进行改造，以提升蚕丝纤维的性能、拓展蚕丝的功能。通常所述的蚕丝纤维的抗菌作用主要是依赖于真丝面料的过滤作用而抵抗有害细菌的侵入，而研究或生产使用的抗菌丝的制作均采用理化方法获得，即为后加工过程中获得的性能，稳定性无法保证，且用理化材料处理后还存在有潜在的危害。从基因水平对蚕丝蛋白进行改良，获得既能有效杀死细菌，又能发荧光的荧光抗菌丝是发明的创新。
1980年Boman等人首次发现了抗菌肽（antibactetial pepiides），抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽。大部分抗菌肽具有热稳定性，在l00℃下加热10～15 min仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。同时，抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性。此外，部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，同时能加速免疫和伤口愈合过程。根据抗菌肽的结构可将其分为5类，其中Cecropins类对革兰阳性菌、阴性菌都具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒性。Imamuraa等（Insect Biochem Mol Biol, 2006,36(5): 429-434）为研究抗菌肽Cecropin B的启动子，获得了cecropin B启动子驱动绿色荧光蛋白（GFP）表达的转基因蚕，但GFP未与抗菌肽融合。
自2000年首次报道家蚕转基因成功以来，目前家蚕的转基因研究主要以转座子介导的方式进行，虽然在理论上也可以获得丝素蛋白与其他蛋白的融合表达，但不能替换基因组原有丝素蛋白基因，即不能排除基因组原有丝素蛋白基因的表达，最终的蚕丝中带有的野生型丝素蛋白、也带有丝素蛋白与外源蛋白的融合蛋白，具有缺陷的野生型丝素蛋白不能彻底去除，因而该转基因方法在改造蚕丝性能方面具有一定的局限性。1999年Agrawal（Nature Biotech, 1999,17(5):412）用带有家蚕丝心蛋白与GFP融合表达盒的重组杆状病毒感染家蚕，通过同源重组替代家蚕的内源丝心蛋白基因，表明家蚕丝腺和蚕丝都可发出绿色的光泽，这一研究首次表明家蚕基因打靶以及外源基因与丝素蛋白融合表达的可行性。通过基因打靶是获得转基因家蚕的重要途径，但研究报道相对较少，技术体系还较不完善。对外源基因的表达而言，均采用丝蛋白与外源基因的融合分泌表达，其中外源基因采用GFP报告基因或药物蛋白基因，并不是以改造蚕丝蛋白为目的。
通过遗传与分子设计，如何在基因水平对蚕丝基因进行改造，以提升蚕丝纤维的性能、拓展蚕丝的功能，是一个亟待解决的问题。到目前为止，尚无用基于基因打靶的转基因家蚕获得蚕丝蛋白融合抗菌肽及荧光蛋白（即荧光抗菌丝）的方法的报道。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，通过基因打靶技术，使家蚕蚕丝蛋白轻链中融合连接有荧光蛋白和对细菌具有强有力杀伤作用的抗菌肽，通过家蚕的自然吐丝获得荧光抗菌丝。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，包括以下步骤：
(1)在带有家蚕丝素蛋白轻链基因同源臂的载体上，根据读码框，构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体，利用体内同源重组进行基因打靶，通过荧光筛选和分子生物学鉴定，获得生产荧光抗菌丝的转基因家蚕；
(2)按步骤(1)获得基因打靶家蚕饲养获得蚕茧，于80℃～90℃烘干茧后、缫丝生产的荧光抗菌丝。
上述技术方案中，所述的家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因中，荧光蛋白基因选自：GFP绿色荧光蛋白基因、EGFP绿色荧光蛋白基因、DsRed红色荧光蛋白基因或黄色荧光蛋白基因。
上述技术方案中，所述的家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因中，抗菌肽基因选自Cecropins抗菌肽、Moricin抗菌肽或其它有杀菌、抑菌作用的抗菌肽。
上述技术方案中，所述的家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因中，丝素轻链为完整的序列或敲除C－端部分编码序列。
优选的技术方案中，当荧光蛋白为GFP时，当抗菌肽为家蚕Cecropin B，并且当丝素轻链为完整的序列时，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体包括以下步骤：
(a) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第5内含子到第7外显子之间的片段，将该片段克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体的Sac 
/Xba 
位点，获得载体命名为pSK-LL；
(b) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第7外显子及其下游侧翼序列的片段，将该片段克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆到pSK-LL载体的EcoR/Kpn 
位点，获得载体命名为pSK-LL-LR；
(c) 以pIZT/V5-His载体为模板，以SEQ ID No.10和SEQ ID No.8的核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，得到的片段再作为模板，然后以SEQ ID No.10和SEQ ID No.9的核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，获得GFP与cer融合片断，将GFP与cer融合片断克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆pSK-LL-LR载体的Xba /EcoR
位点，获得基因打靶载体命名为pSK-LL-GFP/Cer-LR；
其中，所述的cec基因序列如SEQ ID No.6所示。
优选的技术方案中，当荧光蛋白为GFP时，当抗菌肽为家蚕Cecropin B时，当丝素轻链为去除C－端部分序列时，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体包括以下步骤：
(a) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.12和SEQ ID No.13的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第5外显子到第6外显子之间的片段，将该片段克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体的Sac 
/Xba 
位点，获得载体命名为pSK-FibLL；
(b) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.14和SEQ ID No.15的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第7外显子及其下游侧翼序列的片段，将该片段克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆到pSK-FibLL载体的Xho 
/Kpn 位点，获得载体命名为pSK-FibLL-FibLR；
(c) 以pIZT/V5-His载体为模板，以SEQ ID No.18和SEQ ID No.16的核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，得到的片段再作为模板，然后以SEQ ID No.18和SEQ ID No.17的核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，获得GFP与cer融合片断，将GFP与cer融合片断克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆pSK-FibLL-FibLR载体的Xba 
/Sma 
位点，获得基因打靶载体命名为pSK-FibLL-GFP/cer-FibLR；
其中，所述的cec基因序列如SEQ ID No.6所示。
进一步优选的技术方案中，为增加基因打靶频率，基因打靶载体中引入负筛选基因——红色荧光报告基因DsRed。当荧光蛋白为GFP，抗菌肽为家蚕Cecropin B，丝素轻链为去除C－端部分序列，并且DsRed为负选择标记基因时，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体还包括以下步骤：
(d) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，扩增得到丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后，与同样酶切的pBluescriptⅡSK(+)载体连接，获得重组载体pSK-polyA；
(e) 以pDsRed1-N1载体为模板，以SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，扩增出约700 bp的片段，该片段经SalⅠ和XhoⅠ双酶切后，与同样酶切的pSK-polyA载体连接，获得重组载体pSK-DsRed-polyA；
(f) 以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板，以SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，PCR产物用HindⅢ、SalⅠ双酶切后，克隆在pSK-DsRed-polyA载体，获得带有DsRed表达盒的载体pSK-IE-DsRed-polyA；以KpnⅠ单酶切pSK-IE-DsRed-polyA载体获DsRed表达盒序列，克隆到基因打靶载体pSK-FibLL-GFP/Cer-FibLR；参照所克隆载体的结构，用相应的酶验证该载体，获pSK-FibLL-GFP-cec-FibLR-DsRed最终基因打靶载体。
优选的技术方案中，当荧光蛋白为GFP时，当抗菌肽为家蚕Moricin，当丝素轻链为去除C－端部分序列时，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体包括以下步骤：
(a) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.12和SEQ ID No.13的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第5外显子到第6外显子之间的片段，将该片段克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体的Sac 
/Xba 
位点，获得载体命名为pSK-FibLL；
(b) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.14和SEQ ID No.15的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第7外显子及其下游侧翼序列的片段，将该片段克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆到pSK-FibLL载体的Xho 
/Kpn 
位点，获得载体命名为pSK-FibLL-FibLR；
(c) 以pIZT/V5-His载体为模板，以SEQ ID No.32和SEQ ID No.30所示核苷酸为引物对，进行PCR获得片断，该片段为模板，再用SEQ ID No.32和SEQ ID No.31所示核苷酸为引物对，进行PCR获得GFP与mor融合片断，克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆pSK-FibLL-FibLR载体的Xba 
/Sma 
位点，获得基因打靶载体命名为pSK-FibLL-GFP/mor-FibLR；
其中，所述mor基因序列如SEQ ID No.28所示；
进一步优选的技术方案中，为增加基因打靶频率，基因打靶载体中引入负筛选基因——红色荧光报告基因DsRed。当荧光蛋白基因为GFP，抗菌肽基因为家蚕moricin基因（mor），丝素轻链基因为去除C－端部分编码序列，并且DsRed为负选择标记基因时，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体还包括以下步骤：
(d) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，扩增得到丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后，与同样酶切的pBluescriptⅡSK(+)载体连接，获得重组载体pSK-polyA；
(e) 以pDsRed1-N1载体为模板，以SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，扩增出约700 bp的片段，该片段经SalⅠ和XhoⅠ双酶切后，与同样酶切的pSK-polyA载体连接，获得重组载体pSK-DsRed-polyA；
(f) 以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板，以SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，PCR产物用HindⅢ、SalⅠ双酶切后，克隆在pSK-DsRed-polyA载体，获得带有DsRed表达盒的载体pSK-IE-DsRed-polyA；以KpnⅠ单酶切pSK-IE-DsRed-polyA载体获DsRed表达盒序列，克隆到基因打靶载体pSK-FibLL-GFP/mor-FibLR；参照所克隆载体的结构，用相应的酶验证该载体，获pSK-FibLL-GFP-mor-FibLR-DsRed最终基因打靶载体。
进一步的技术方案中，所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法还包括：将步骤(1)获得的转基因家蚕通过常规育种技术，结合分子生物学鉴定获得稳定遗传的转基因家蚕，然后饲养获得蚕茧，于80℃～90℃烘干茧后、缫丝生产的荧光抗菌丝。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1．实现了家蚕蚕丝的丝质改造，延伸了蚕丝的功能，拓展了蚕丝的应用价值。
2．本发明的技术方案和采用理化方法（如公开号为CN1904159中国发明专利申请公布说明书）制作抗菌丝的现有技术相比，在蚕丝后加工过程中用理化方法获得的抗菌性能不稳定，本发明所述方法得到的蚕丝的抗菌性能更稳定。
3．本发明由于采用转基因家蚕表达的蚕丝，表达产物无DNA及其他理化因素污染，不存在转基因生物的潜在危害性，生物安全性高；由于荧光蛋白和抗菌肽的自身特性，不需要特殊的蚕丝加工技术，即可使蚕丝带有特殊性能，其制备工艺简单，成本低。
4．本发明采用的抗菌肽基因的产物具有多种作用，可以赋予蚕丝蛋白具有抗细菌、真菌、原虫、病毒及癌细胞等的性能。
5．本发明为了提高转基因家蚕筛选效率，在基因打靶载体中同源臂外侧使用了负筛选报告基因。
附图说明
图1是实施例一步骤3中基因打靶载体pSK-LL-GFP/Cer-LR酶切鉴定结果图；
图2是实施例一步骤5中转基因家蚕的PCR鉴定结果图；
图3是实施例一步骤6中转基因家蚕中发绿色荧光的蚕茧茧层图；
图4是实施例一步骤6中转基因家蚕中发绿色荧光的蚕丝图；
图5是实施例二步骤3中测序验证结果图；
图6是实施例二步骤6中转基因家蚕中发绿色荧光的蚕茧茧层图；
图7是实施例三步骤6中荧光蚕蛹图；
图8是实施例三步骤5中转基因家蚕的PCR鉴定结果图；
图9是实施例四步骤7中转基因家蚕中发绿色荧光的蚕丝图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种转基因家蚕生产荧光抗菌丝的（表达完整Fib-L，并融合GFP和家蚕Cecropin B的转基因家蚕）方法
技术操作过程如下：
1．基因打靶载体左臂的克隆
根据已公开的丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第5内含子到第7外显子之间设计基因打靶载体的1.2 kb左臂引物序列LL（SEQ ID No.1：ggt gag ctc gat caa act gca cac ggt gtg，下划线为Sac 
位点）和LR（SEQ ID No.2：ggt tct aga gac gtg aac ctg gct ggc tg，下划线为Xba 
位点），以家蚕基因组DNA为模板，通过PCR获得的片段克隆到pMD19-T载体（方法参照《分子克隆》，1989，科学出版社），测序验证后，克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体（Stratagene公司产品）的Sac 
/Xba 位点，获得载体命名为pSK-LL。
2．基因打靶载体右臂的克隆
根据已公开的丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第7外显子及其下游侧翼序列设计基因打靶载体的0.5 kb右臂引物序列RL（SEQ ID No.3：ggt gaa ttc gcc agg ttc acg tct aaa taa，下划线为EcoR
位点）和RR（SEQ ID No.4：ggt ggt acc gca tga caa cag tac cga aat，下划线为Kpn 
位点），以家蚕基因组DNA为模板，通过PCR获得的片段克隆到pMD19-T载体（TaKaRa公司产品），测序验证后，克隆到pSK-LL载体的EcoR
/Kpn 
位点，获得载体命名为pSK-LL-LR。
3．基因打靶载体的构建
根据根据已公开的家蚕Cecropin B基因（cer）的序列（如SEQ ID No.5所示）（登录号：D11113），参考家蚕对密码子的偏好性，并考虑到避免DNA合成的差错，设计了具有抗菌肽活性区，长度为105 bp的cecropin基因（cec）序列（其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示）。
合成下列引物：CL（SEQ ID No.8：cac aat acc gtc tct aat gtt tct acc cat ctt ttc aat ctt ctt gaa gat ttt cca tct atc cat gcc atg tgt aat cc）和CR（SEQ ID No.9：gaa ttc caa tag ctt tag ctg aac cta aga ctt cga tag ccg gac cag ctt tca caa tac cgt ctc taa tg，下划线示EcoR位点）。GFP基因通过pIZT/V5-His载体（Invitrogen公司产品）序列设计引物GL（SEQ ID No.10：ggg tct aga aaa gga gaa gaa ctt ttc act gga，下划线为Xba 
位点）。
pIZT/V5-His载体为模板，引物GL和CL进行PCR获得片断，该片段为模板，再用引物GL和CR进行PCR获得GFP基因与cer基因融合的DNA片断，克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆pSK-LL-LR载体的Xba 
/EcoR
位点，获得基因打靶载体命名为pSK-LL-GFP/Cer-LR。
pSK-LL-GFP/Cer-LR载体分别用Sac 
和Xba 
、EcoR
和Kpn 
、Xba 和EcoR
双酶切鉴定，结果图如图1所示，其中，M为DNA marke；A1：Sac 
和Xba 
酶切；B1：EcoR
和Kpn 酶切；C1：Xba 
和EcoR
酶切。图1可知：酶切产生的条带数目、分子量大小与理论值一致。
4．精子介导法获得带有荧光报告基因GFP和抗菌肽的转基因家蚕
家蚕品种为菁松品种，正常饲养至化蛾。
将pSK-LL-GFP/Cer-LR质粒（浓度2 μg/μL），用毛细管玻璃针以1.5~2.0 μL/只注入处女蛾交尾囊，正常交配，产卵，孵化后的蚁蚕（G0）正常饲养后幼虫，荧光倒置显微镜检测，筛选出带有荧光蛋白报告基因的家蚕，保留具有明显荧光显示的家蚕（转基因家蚕），进行基因检测和常规家蚕育种。
5．转基因家蚕的GFP基因PCR检测
针刺取少量荧光家蚕的血淋巴（约20 μL血淋巴/每头），加500 μL TE缓冲液（pH8.0），加500 μL过饱和苯酚（pH8.0）作用10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，再用过饱和酚提取一次，加氯仿:异戊醇（24:1）作用10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清加2倍体积无水冷乙醇，混合均匀，置-20℃，2小时后再用12 000 r/min离心10 min，弃上清，用70%乙醇洗沉淀，12 000 r/min离心1 min，弃上清，自然干燥，沉淀用10 μL TE缓冲液溶解，获家蚕基因组总DNA。
以提取蚕血淋巴总DNA作为模板，用GFP基因的特异性引物GL和GR（SEQ ID No.11：ggg gaa ttc tta ttt gta tag ttc atc cat gcc，下划线为EcoR
位点）进行PCR检测，同时设正常家蚕为阴性对照，pIZT/V5-His质粒DNA为阳性对照。PCR检测显示，在G0、G1、G2、G3等代均可扩增出0.7 kb左右的GFP特异片段，阴性对照无该片段产生，表明GFP基因已进入家蚕基因组，并稳定遗传。
图2为G3代转基因家蚕的PCR鉴定结果图，其中A1和B1：GL和GR引物扩增出GFP特异片段；A2：以引物RR和GL可扩增到GFP/cec与打靶载体右臂的片段；B2：以引物GR和LL可扩增到GFP与打靶载体左臂的片段；M：DNA marker。PCR产生的条带分子量大小与理论值一致
6．转基因家蚕的蚕丝荧光检测
对各代转基因蚕的蚕茧用荧光倒置显微镜检测，正常非转基因菁松品种为对照，可发现转基因蚕的茧层有明显荧光。80℃－90℃烘干茧后，正常缫丝，荧光显微镜可观察到茧丝有明显荧光。
图3为分别剪取非转基因蚕蚕茧和G3代转基因家蚕结茧，剪取的茧层在荧光显微镜下的正常光（A）与荧光（B）对照显示结果，其中绿色荧光表明为G3代转基因家蚕蚕茧。
图4为G3代转基因蚕茧，经人工缫丝后，以正常非转基因菁松品种为对照，置于荧光显微镜下观察，可看到转基因蚕丝有明显荧光。
7．转基因家蚕的蚕丝抗菌检测
将绿色荧光转基因家蚕的蚕茧切成小圆片，置于1.5 mL微量离心管，加ddH2O，90℃－100℃水浴5－10 min后进行常规抑菌试验，与正常非转基因蚕蚕茧为对照。转基因蚕蚕茧对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有明显的抑菌作用。
实施例二：一种转基因家蚕生产荧光抗菌丝的（表达部分Fib-L基因，并融合GFP和家蚕Cecropin B的转基因家蚕）方法
技术操作过程如下：
1．基因打靶载体左臂的克隆
根据已公开的丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第5外显子到第6外显子之间设计基因打靶载体的1.2 kb左臂引物序列Fib-L-L1（SEQ ID No.12：ttc gag ctc gtc gga cca gcc ctg ggt tg，下划线为Sac 
位点）和Fib-L-L2（SEQ ID No.13：ctg tct aga ttg acg atg cag tac tct tc，下划线为Xba 
位点，以家蚕基因组DNA为模板，PCR获得的片段克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体（Stratagene公司产品）的Sac 
/Xba 
位点，获得载体命名为pSK-FibLL。
2．基因打靶载体右臂的克隆
根据已公开的丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第7外显子及其下游侧翼序列设计基因打靶载体的0.5 kb右臂引物序列Fib-L-R1（SEQ ID No.14：ggt gaa ttc gcc agg ttc acg tct aaa taa，下划线为Xho 
位点）和Fib-L-R2（SEQ ID No.15：ggt ggt acc cac tgt cca atc cac cg，下划线为Kpn 
位点），以家蚕基因组DNA为模板，PCR获得的片段克隆到pMD19-T载体（TaKaRa公司产品），测序验证后，克隆到pSK-FibLL载体的Xho 
/Kpn 
位点，获得载体命名为pSK-FibLL-FibLR。
3．基因打靶载体的构建
根据实施实例一中3，分别合成下列引物：CL（SEQ ID No.16：cac aat acc gtc tct aat gtt tct acc cat ctt ttc aat ctt ctt gaa gat ttt cca tct atc cat gcc atg tgt aat cc）和CR-2（SEQ ID No.17：ccc ggg caa tag ctt tag ctg aac cta aga ctt cga tag ccg gac cag ctt tca caa tac cgt ctc taa tg，下划线示SmaⅠ位点）。GFP基因通过pIZT/V5-His载体（Invitrogen公司产品）序列设计引物FGL（SEQ ID No.18：gcg tct aga gat ggc tag caa agg aga ag，下划线示XbaⅠ位点）。
pIZT/V5-His载体为模板，引物FGL和CL进行PCR获得片断，该片段为模板，再用引物FGL和CR-2进行PCR获得GFP与cer融合片断，克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆pSK-FibLL-FibLR载体的Xba 
/Sma 
位点，获得基因打靶载体命名为pSK-FibLL-GFP/cer-FibLR。
图5是PCR获得GFP与cer融合片断，克隆到pMD19-T载体，测序验证结果（部分序列），其中760-864为cer基因片断。
4．精子介导法获得带有荧光报告基因GFP和抗菌肽的转基因家蚕
同实施实例一中4。
5．转基因家蚕的GFP基因PCR检测
同实施实例一中5，所用引物为FGL和FGR（SEQ ID No.19：acg ccc ggg cat cca tgc cat gtg taa tcc，下划线示SmaⅠ位点）。
6．转基因家蚕的蚕丝荧光检测
同实施实例一中6。
图6为分别剪取非转基因蚕蚕茧和转基因家蚕结茧，剪取的茧层在荧光显微镜下的正常光（A）与荧光（B）对照显示结果，其中绿色荧光表明为转基因家蚕蚕茧。
7．转基因家蚕的蚕丝抗菌检测
同实施实例一中7。
实施例三：一种转基因家蚕生产荧光抗菌丝的（表达部分Fib-L基因，并融合GFP和家蚕Cecropin B的转基因家蚕，DsRed为负选择标记基因）方法
技术操作过程如下：
1．基因打靶载体左臂的克隆
同实施实例二中1。
2．基因打靶载体右臂的克隆
同实施实例二中2。
3．基因打靶载体的构建
同实施实例二中3。
4．带有负选择标记基因的基因打靶载体的构建
为增加基因打靶频率，基因打靶载体中引入负筛选基因——红色荧光报告基因DsRed。根据GenBank已公开的序列（M76430）设计特异性引物TPFib-L-3（SEQ ID No.20：ggc tcg agc aaa ttg tgt ttg cgt tag g，下划线为XhoⅠ位点）和TPFib-L-4（SEQ ID No.21：gcg gta ccc act gtc caa tcc acc gtc，下划线为KpnⅠ位点），以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，扩增出约290 bp的片段，测序证明为丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后，与同样酶切的pBluescriptⅡSK(+)载体（Stratagene公司产品）连接，获得重组载体pSK-polyA。
根据pDsRed1-N1（Clontech公司）设计特异性引物Red-1（SEQ ID No.22：ccg tcg acg cca cca tgg tgc gct cct cc，下划线为SalⅠ位点）和Red-2（SEQ ID No.23：ggc tcg agcta cag gaa cag gtg gtg gc，下划线为XhoⅠ位点），以pDsRed1-N1载体为模板，扩增出约700 bp的片段，该片段经SalⅠ和XhoⅠ双酶切后，与同样酶切的pSK-polyA载体连接，获得重组载体pSK-DsRed-polyA。
根据家蚕核型多角体病毒基因组序列（登录号：L33180），设计ie-1基因启动子的特异性引物对GT-IE3（SEQ ID No.24：ttc aag ctt ggt acc gat ttg cag ttc ggg ac，下划线为HindⅢ和KpnⅠ位点）和GT-IE2（SEQ ID No.25：gcg gtc gac agt cgt ttg gtt gtt ca，下划线为SalⅠ位点），以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用HindⅢ、SalⅠ双酶切后，克隆在pSK-DsRed-polyA载体，获得带有DsRed表达盒的载体pSK-IE-DsRed-polyA；以KpnⅠ单酶切pSK-IE-DsRed-polyA载体获DsRed表达盒序列，克隆到基因打靶载体pSK-FibLL-GFP/Cer-FibLR。参照所克隆载体的结构，用相应的酶验证该载体，获最终基因打靶载体pSK-FibLL-GFP-cec-FibLR-DsRed。
5．精子介导法获得带有荧光报告基因GFP和抗菌肽的转基因家蚕
比较实施实例一中4，只筛选绿色荧光家蚕，淘汰既表现绿色荧光又表现红色荧光，或只表现红色荧光的转基因家蚕。增加的负选择报告基因可以选择淘汰随机插入型或单同源臂插入型的转基因家蚕。
图7为转基因家蚕的2个蚕蛹在荧光显微镜下观察结果。其中A为正常光下观察；B为观察绿色荧光，显示存在绿色荧光家蚕蚕蛹（B右）；C为观察红色荧光，显示右边的蛹不存在负选择报告基因，基本表明为基因打靶的转基因家蚕。
6．转基因家蚕的GFP基因PCR检测
同实施实例一中5，所用引物为FGL和FGR（SEQ ID No.26：acg ccc ggg cat cca tgc cat gtg taa tcc，下划线示SmaⅠ位点）。
图8为发绿色荧光的转基因家蚕蚕蛾的PCR鉴定，其中泳道1：FGL和FGR引物扩增出GFP特异片段；M：DNA marker。PCR产生的条带分子量大小与理论值一致。
7．转基因家蚕的蚕丝荧光检测
同实施实例一中6。
8．转基因家蚕的蚕丝抗菌检测
同实施实例一中7。
实施例四：一种转基因家蚕生产荧光抗菌丝的（表达部分Fib-L基因，并融合GFP和家蚕Moricin的转基因家蚕，DsRed为负选择标记基因）方法
技术操作过程如下：
1．基因打靶载体左臂的克隆
同实施实例二中1。
2．基因打靶载体右臂的克隆
同实施实例二中2。
3．基因打靶载体的构建
同实施实例二中3，其中家蚕抗菌肽基因为moricin（mor）（如SEQ ID No.27所示），Moricin抗菌肽对革兰氏阳性菌与阴性菌均具有较强的抗菌能力。根据已公开的（登录号：AB014092）的成熟肽序列，依据家蚕密码子的偏好性，并考虑到避免DNA合成的差错，设计了具有抗菌肽活性区，长度为126 bp的mor基因序列（其核苷酸序列如SEQ ID No.28所示，氨基酸序列如SEQ ID No.29所示）：
设计引物ML（SEQ ID No.30：gct agc aat gtt aat agc tct caa acc ttt acc cac agc ttt acc cac agt ctt aat agc ttt aat agg aat ttt agc atc cat gcc atg tgt aat cc）和MR（SEQ ID No.31：ccc ggg cgt gct ttc tct tct tag gtt tca gga agt tga aca cgt cgt tag ctg tgc tag caa tgt taa tag ctc，下划线示SmaⅠ位点）。GFP基因通过pIZT/V5-His载体（Invitrogen公司产品）序列设计引物FGL（SEQ ID No.32：gcg tct aga gat ggc tag caa agg aga ag，下划线示XbaⅠ位点）。
pIZT/V5-His载体为模板，引物FGL和ML进行PCR获得片断，该片段为模板，再用引物FGL和MR进行PCR获得GFP与mor融合片断，克隆到pMD19-T载体，测序验证后，克隆pSK-FibLL-FibLR载体的Xba 
/Sma 位点，获得基因打靶载体命名为pSK-FibLL-GFP/mor-FibLR。
4．带有负选择标记基因的基因打靶载体的构建
同实施实例三中4，获pSK-FibLL-GFP-mor-FibLR-DsRed的最终基因打靶载体。
5．精子介导法获得带有荧光报告基因GFP和抗菌肽的转基因家蚕
同实施实例三中5。
6．转基因家蚕的GFP基因PCR检测
同实施实例三中6。
7．转基因家蚕的蚕丝荧光检测
同实施实例一中6。
图9为转基因蚕茧，缫丝后，以正常非转基因菁松品种为对照（A-左），置于荧光显微镜下观察，可看到转基因蚕丝有明显荧光（B-右）。图A正常光，图B荧光。
8．转基因家蚕的蚕丝抗菌检测
同实施实例一中7。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州大学
<120> 一种利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
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ggtgagctcg atcaaactgc acacggtgtg 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggttctagag acgtgaacct ggctggctg 29
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggtgaattcg ccaggttcac gtctaaataa 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ggtggtaccg catgacaaca gtaccgaaat 30
<210> 5
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
aggtggaaga tcttcaagaa aattgaaaaa atgggcagga acattcgtga cggcatcgtc 60
aaagcgggcc cggcgatcga ggtccttggt tcggctaaag ctata 105
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<211> 105
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agatggaaaa tcttcaagaa gattgaaaag atgggtagaa acattagaga cggtattgtg 60
aaagctggtc cggctatcga agtcttaggt tcagctaaag ctatt 105
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<213> 人工合成
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Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg
1 5 10 15
Asp Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Glu Val Leu Gly Ser Ala
20 25 30
Lys Ala Ile
35
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cacaataccg tctctaatgt ttctacccat cttttcaatc ttcttgaaga ttttccatct 60
atccatgcca tgtgtaatcc 80
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<213> 人工合成
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gaattccaat agctttagct gaacctaaga cttcgatagc cggaccagct ttcacaatac 60
cgtctctaat g 71
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
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gggtctagaa aaggagaaga acttttcact gga 33
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ggggaattct tatttgtata gttcatccat gcc 33
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ttcgagctcg tcggaccagc cctgggttg 29
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<212> DNA
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<400> 13
ctgtctagat tgacgatgca gtactcttc 29
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<212> DNA
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atccatgcca tgtgtaatcc 80
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<212> DNA
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cccgggcaat agctttagct gaacctaaga cttcgatagc cggaccagct ttcacaatac 60
cgtctctaat g 71
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<400> 18
gcgtctagag atggctagca aaggagaag 29
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ccgtcgacgc caccatggtg cgctcctcc 29
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<213> 人工合成
<400> 23
ggctcgagct acaggaacag gtggtggc 28
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
ttcaagcttg gtaccgattt gcagttcggg ac 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
gcggtcgaca gtcgtttggt tgttca 26
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
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<400> 26
acgcccgggc atccatgcca tgtgtaatcc 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gcaaaaatac ctatcaaggc cattaagact gtaggaaagg cagtcggtaa aggtctaaga 60
gccatcaata tcgccagtac agccaacgat gttttcaatt tcttgaaacc gaagaaaaga 120
aagcat 126
<210> 28
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
gctaaaattc ctattaaagc tattaagact gtgggtaaag ctgtgggtaa aggtttgaga 60
gctattaaca ttgctagcac agctaacgac gtgttcaact tcctgaaacc taagaagaga 120
aagcac 126
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<211> 42
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 29
Ala Lys Ile Pro Ile Lys Ala Ile Lys Thr Val Gly Lys Ala Val Gly
1 5 10 15
Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile Ala Ser Thr Ala Asn Asp Val Phe
20 25 30
Asn Phe Leu Lys Pro Lys Lys Arg Lys His
35 40
<210> 30
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
gctagcaatg ttaatagctc tcaaaccttt acccacagct ttacccacag tcttaatagc 60
tttaatagga attttagcat ccatgccatg tgtaatcc 98
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
cccgggcgtg ctttctcttc ttaggtttca ggaagttgaa cacgtcgtta gctgtgctag 60
caatgttaat agctc 75
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
gcgtctagag atggctagca aaggagaag 29
Claims (9)
1.一种利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 在带有家蚕丝素蛋白轻链基因同源臂的载体上，根据读码框，构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体，利用体内同源重组进行基因打靶，通过荧光筛选和分子生物学鉴定，获得生产荧光抗菌丝的转基因家蚕；
(2) 按步骤(1)获得基因打靶家蚕饲养获得蚕茧，于80℃～90℃烘干茧后、缫丝生产的荧光抗菌丝。
2. 根据权利要求1所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，其特征在于，所述的家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因中，荧光蛋白基因选自：绿色荧光蛋白基因GFP、增强型绿色荧光蛋白基因EGFP、红色荧光蛋白基因DsRed或黄色荧光蛋白基因YFP。
3. 根据权利要求1所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，其特征在于，所述的家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因中，抗菌肽基因选自Cecropins抗菌肽基因cec、Moricin抗菌肽基因mor。
4. 根据权利要求1所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，其特征在于，当荧光蛋白为GFP时，当抗菌肽为家蚕Cecropin B时，并且当丝素轻链为完整的序列时，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体包括以下步骤：
(a) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第5内含子到第7外显子之间的片段，将该片段克隆到pMDTM19-T载体，测序验证后，克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体的Sac 
/Xba 
位点，获得载体命名为pSK-LL；
(b) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第7外显子及其下游侧翼序列的片段，将该片段克隆到pMDTM19-T载体，测序验证后，克隆到pSK-LL载体的EcoR
/Kpn 
位点，获得载体命名为pSK-LL-LR；
(c) 以pIZT/V5-His载体为模板，以SEQ ID No.10和SEQ ID No.8的核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，得到的片段再作为模板，然后以SEQ ID No.10和SEQ ID No.9的核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，获得GFP与cer融合片断，将GFP与cer融合片断克隆到pMDTM19-T载体，测序验证后，克隆到pSK-LL-LR载体的Xba 
/EcoR位点，获得基因打靶载体命名为pSK-LL-GFP/Cer-LR；
其中，所述cec基因序列如SEQ ID No.6所示。
5. 根据权利要求1所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，其特征在于，当荧光蛋白为GFP时，当抗菌肽为家蚕Cecropin B时，当丝素轻链为敲除C－端部分序列时，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体包括以下步骤：
(a) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.12和SEQ ID No.13的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第5外显子到第6外显子之间的片段，将该片段克隆到pMDTM19-T载体，测序验证后，克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体的Sac 
/Xba 
位点，获得载体命名为pSK-FibLL；
(b) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.14和SEQ ID No.15的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第7外显子及其下游侧翼序列的片段，将该片段克隆到pMDTM19-T载体，测序验证后，克隆到pSK-FibLL载体的Xho 
/Kpn 
位点，获得载体命名为pSK-FibLL-FibLR；
(c) 以pIZT/V5-His载体为模板，以SEQ ID No.18和SEQ ID No.16的核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，得到的片段再作为模板，然后以SEQ ID No.18和SEQ ID No.17的核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，获得GFP与cer融合片断，将GFP与cer融合片断克隆到pMDTM19-T载体，测序验证后，克隆到pSK-FibLL-FibLR载体的Xba 
/Sma 
位点，获得基因打靶载体命名为pSK-FibLL-GFP/cer-FibLR；
其中，所述的cec基因序列如SEQ ID No.6所示。
6. 根据权利要求5所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，其特征在于，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体还包括以下步骤：
(d) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，扩增得到丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后，与同样酶切的pBluescriptⅡSK(+)载体连接，获得重组载体pSK-polyA；
(e) 以pDsRed1-N1载体为模板，以SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，扩增出约700 bp的片段，该片段经SalⅠ和XhoⅠ双酶切后，与同样酶切的pSK-polyA载体连接，获得重组载体pSK-DsRed-polyA；
(f) 以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板，以SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，PCR产物用HindⅢ、SalⅠ双酶切后，克隆在pSK-DsRed-polyA载体，获得带有DsRed表达盒的载体pSK-IE-DsRed-polyA；以KpnⅠ单酶切pSK-IE-DsRed-polyA载体获DsRed表达盒序列，克隆到基因打靶载体pSK-FibLL-GFP/Cer-FibLR；参照所克隆载体的结构，用相应的酶验证该载体，获pSK-FibLL-GFP-cec-FibLR-DsRed最终基因打靶载体。
7. 根据权利要求1所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，其特征在于，当荧光蛋白为GFP时，当抗菌肽为家蚕Moricin时，当丝素轻链为敲除C－端部分序列时，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体包括以下步骤：
(a) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.12和SEQ ID No.13的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第5外显子到第6外显子之间的片段，将该片段克隆到pMDTM19-T载体，测序验证后，克隆到pBluescriptⅡSK(+)载体的Sac 
/Xba 
位点，获得载体命名为pSK-FibLL；
(b) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.14和SEQ ID No.15的核苷酸序列为引物对，通过PCR扩增，得到丝蛋白轻链基因的序列（登录号：M76430）的第7外显子及其下游侧翼序列的片段，将该片段克隆到pMDTM19-T载体，测序验证后，克隆到pSK-FibLL载体的Xho 
/Kpn 
位点，获得载体命名为pSK-FibLL-FibLR；
(c) 以pIZT/V5-His载体为模板，以SEQ ID No.32和SEQ ID No.30所示核苷酸为引物对，进行PCR获得片断，该片段为模板，再用SEQ ID No.32和SEQ ID No.31所示核苷酸为引物对，进行PCR获得GFP与mor融合片断，克隆到pMDTM19-T载体，测序验证后，克隆到pSK-FibLL-FibLR载体的Xba /Sma 
位点，获得基因打靶载体命名为pSK-FibLL-GFP/mor-FibLR；
其中，所述mor基因序列如SEQ ID No.28所示。
8. 根据权利要求7所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，其特征在于，步骤(1)中构建能表达家蚕丝素轻链－荧光蛋白－抗菌肽融合基因的打靶载体具体还包括以下步骤：
(d) 以家蚕基因组DNA为模板，以SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，扩增得到丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后，与同样酶切的pBluescriptⅡSK(+)载体连接，获得重组载体pSK-polyA；
(e) 以pDsRed1-N1载体为模板，以SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，扩增出约700 bp的片段，该片段经SalⅠ和XhoⅠ双酶切后，与同样酶切的pSK-polyA载体连接，获得重组载体pSK-DsRed-polyA；
(f) 以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板，以SEQ ID No.24和SEQ ID No.25所示核苷酸序列为引物对进行PCR扩增，PCR产物用HindⅢ、SalⅠ双酶切后，克隆在pSK-DsRed-polyA载体，获得带有DsRed表达盒的载体pSK-IE-DsRed-polyA；以KpnⅠ单酶切pSK-IE-DsRed-polyA载体获DsRed表达盒序列，克隆到基因打靶载体pSK-FibLL-GFP/mor-FibLR；参照所克隆载体的结构，用相应的酶验证该载体，获pSK-FibLL-GFP-mor-FibLR-DsRed最终基因打靶载体。
9. 根据权利要求1所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法，其特征在于，所述利用转基因家蚕生产荧光抗菌丝的方法还包括：将步骤(1)获得的转基因家蚕通过常规育种技术，结合分子生物学鉴定获得稳定遗传的转基因家蚕，然后饲养获得蚕茧，于80℃～90℃烘干茧后、缫丝生产的荧光抗菌丝。
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