CN103290055A - 一种表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表达牛蛙抗菌肽temporin-1Sd和天蚕素cecropinB2的方法，包括：牛蛙抗菌肽temporin-1Sd和天蚕素cecropinB2基因序列或将其与绿色荧光蛋白（GFP）序列融合克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到转移表达载体；将构建的转移表达载体与杆状病毒DNA在大肠杆菌中进行转座重组，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染家蚕；培养被感染的家蚕表达相应的抗菌肽蛋白及融合蛋白；收获并干燥处理所表达抗菌肽。本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2，用作动物饲料添加剂，具有安全、副反应小、高效、能耗少、成本低、无抗生素引起的耐药性等诸多优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，尤其涉及利用重组杆状病毒在昆虫体内表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，可用于制备饲用抗菌肽添加剂。
背景技术
随着耐药菌和细菌多重耐药现象的不断出现，寻求安全有效的抗生素或其替代品成为医药行业亟待解决的问题。抗菌肽因具有抗菌谱广、热稳定性好、抗菌机制独特、不易产生耐药性等优点，有望成为解决这一难题的有效方法。抗菌肽是一种由多种生物体分泌的、具有广谱抗细菌、真菌、病毒、寄生虫、抗肿瘤和促进伤口愈合及血管新生等作用，且不破坏真核细胞、无免疫原性，极有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源，是很多生物先天非特异性防御系统的重要组成部分。
天蚕素(cecropins)是1980年瑞典科学家Boman等从蚕蛹中分离得到第一个抗菌肽。目前，已发现1700多种抗菌肽，而天蚕素是目前研究最为清楚、效果最为明显的抗菌肽，其中天蚕素cecropin B2研究较为深入。天蚕素一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。天蚕素(cecropins)对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒性。此外，研究表明牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd对多种细菌产生明显的抑制作用，具有较好的应用前景。牛蛙抗菌肽主要存在蛙体皮肤组织的腺体中，当受到病原微生物的侵袭时被分泌到包裹与皮肤外表面从而形成一道天然屏障，目前已从8个属约40多种的蛙皮中提取了抗菌肽。
由于抗菌肽在动物体内含量极微，从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。因此，人们开始转向利用基因工程方法来研究和解决抗菌肽的生产问题。目前，已进入临床应用的基因工程药物多数是采用原核表达系统生产的，但由于抗菌肽对细菌的杀伤作用，不能用原核表达系统直接表达具有生物活性的抗菌肽，而如果采用融合蛋白的形式表达，将给表达产物的后处理带来很大麻烦。因此，国内外的研究者多采用真核表达系统进行抗菌肽基因工程研究。近年来，以酵母为基因工程受体菌的研究引起人们的重视，酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌，但由于酵母菌产生内源蛋白产物的种类多，含量高，给抗原肽的纯化带来很多问题，尚需进一步完善和解决。
现代研究认为家蚕生物反应器基于本身特点有望解决抗原肽的许多生产问题。简而言之，“家蚕生物反应器”是指将特定的重组杆状病毒（基因）植入家蚕的蚕蛹体内进行培养，蚕蛹会主动对植入基因进行转录和翻译，自然生成对人类有用的生物活性物质，以满足疾病的预防、治疗和保健等需求。
近年来，家蚕生物反应器已在医学、兽医学和农业上得到广泛的应用。目前已用家蚕生物反应器成功表达多种人类和动物病毒的抗原蛋白，其中相当一部分正在进行商品化开发。如利用家蚕生物反应器表达不含有病毒的遗传物质病毒样粒子（VLPs），具有的独特结构、展示表位的能力和能有效刺激产生免疫反应，为研究预防多种疾病提供很好的方法。
家蚕杆状病毒表达系统的有关技术已相对成熟，该系统表达外源基因，不仅经济、高效，而且可提供一条新的技术途径。利用家蚕生物反应器共表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2，保证其具有正常的蛋白结构和生物活性；之后，将其家蚕处理添加到饲料中，提高饲料的营养价值和动物的抗病能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供了利用家蚕杆状病毒表达系统在昆虫体内安全、高效的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，包括：牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2基因序列或将其融合蛋白后，将它们克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到转移表达载体；将构建得到的转移表达载体与杆状病毒DNA在大肠杆菌中进行转座重组，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主表达相应的抗菌肽；收获并干燥处理所表达的牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2。
所述的抗菌肽基因序列及融合绿色荧光蛋白的序列如SEQ ID NO1（序列表中的序列1）、 SEQ ID NO2（序列表中的序列2）所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO3（序列表中的序列3）SEQ ID NO4（序列表中的序列4）相应的氨基酸序列。所述的杆状病毒运载载体选自pfastbac-dul双启动子，可以同时表达两种抗菌肽或同一种抗菌肽的两个拷贝。
所构建的转移表达载体是带有抗菌肽基因原始序列的载体pfastbac-temporin-1Sd-cecropin B2，和带有抗菌肽融合蛋白序列的载体pfastbac-dul-temporin-1Sd-gfp-cecropin B2
所述的杆状病毒DNA为BmNPV。
所述的重组杆状病毒选自以下任意一种重组病毒：（1）重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-temporin-1Sd-cecropin B2；（2）重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-temporin-1Sd-gfp-cecropin B2；（3）重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-gfp temporin-1Sd -cecropin B2。
所述的昆虫宿主包括家蚕（Bombyx mori）、蓖麻蚕（Philosamia cynthia ricim）、樗蚕（Philosamia cynthia pryeri）、樟蚕（Dictyoplca japanica）、日本柞蚕（Antheraea yamamai）、柞蚕（Antheraea pernyi）、野蚕（Bombyx mandarina）、野天蚕（Antheraea polyphymus）等。
所述的昆虫宿主是家蚕幼虫和蛹（Bombyx mori）；所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体，优选为：将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；所述的最优蛹体为1-2天的早期嫩蛹。
本发明采用基因重组技术，牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2基因及融合蛋白gfp克隆到杆状病毒运载载体pfastbac-dul，在多角体启动子和p10启动子强启动子控制之下，通过体外重组，使抗菌肽的原始序列及融合后的序列整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒；重组病毒可通过表皮感染1-5龄（最优时间为四或五龄）的昆虫幼虫或蛹体（最优时间为1-2天的早期嫩蛹），表达生产牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2。
本发明方法采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中安全、高效的生产牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2，原生态能源消耗极少。由于家蚕已经被我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗菌肽，安全性极高，可直接制作给动物食用。
本发明方法可以大幅度降低牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的生产成本，而且同时可获得两种不同的抗菌肽，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。
附图说明
图1：基因克隆方案图
图2：重组载体pMD- cecropin B2和pMD- temporin-1Sd 双酶切鉴定图：
图3：pMD-gfp重组质粒载体的单酶切鉴定图
图4：重组载体的双酶切鉴定结果图
图5： 重组构建的蓝白斑筛选图
图6：Bmn细胞感染杆状病毒后的病变图：
图7：重组细胞的荧光显微镜鉴定结果图
图8：喷雾干燥的制剂对从医院临床病例分离的大肠埃希菌（耐药）和溶血葡萄球菌的抑菌实验结果
具体实施方式
下面给出一系列具体实验方法，来进一步阐述本发明，该部分实验方法不是对本发明的进一步限制。
1．有关溶液和培养基的配置
溴化乙锭(EB)母液：将EB配成浓度为10 mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器储存于室温即可。
IPTG储液：1 mol/L，超纯水配制后用0.2μm滤器过滤除。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH值到7.0（固体培养基含1.5%琼脂），121℃高温高压蒸汽灭菌15 min。
2．基因的克隆与测序
2.1 抗菌肽基因由上海英俊生物公司合成，两侧加酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ，及SphI和XhoI。
2.2 目的基因的检测引物设计,大写字母部分为酶切位点
cecropin-f: GGATCCatgaatttcgcaaagatcctatc (BamHI)
cecropin-r: TCTAGAtcattttcctatggctttagctg (XbalI)
temporin-f: CTCGAGttccttgggaccatcaacttat (XhoI)
temporin-r: GCATGCgacatctgttgagcatttagcca (SphI)
gfp-cec-f: GGATCCatggtgagcaagcagatcctg (BamHI)
gfp-cec-r: GGATCCcacccactcgtgcaggctgc (BamHI)
gfp-tem-f: CTCGAGatggtgagcaagcagatcctg (XhoI)
gfp-tem-r: CTCGAGcacccactcgtgcaggctgc (XhoI)
2.3 PCR扩增反应合成基因序列
PCR扩增结束后，取5.0μL反应产物进行1.0%的TAE琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含有0.5μg/mL的溴化乙锭，电泳缓冲液为0.5×TAE，100V，大约20min后于紫外凝胶成像系统观察片段大小，与标准的DNA Marker比较，结果显示成功扩增抗菌肽基因大小与预期一致。
2.4 基因片段回收试剂盒回收DNA片段
PCR产物或酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的DNA条带；操作依据说明书。将DNA溶液保存于-20℃备用。凝胶电泳检测回收成功。
2.5 DNA片段与克隆载体连接
按说明书要求进行。连接体系：1μL pMD18-T vector，4μL目的片段，5μL Ligation solutionⅠ，16℃连接30min以上。
2.6 E.coli热激感受态细胞的小量制备
-70℃冻藏的E. coli甘油菌在LB平板上划线复苏；挑取单菌落，接种到4 mL不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；取1/100体积培养过夜的菌液接种到新鲜不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h，使OD600值达到0.6左右；同时将CaCl2（75mmol/L）与EP管置于冰上预冷；将1mL菌液收集到预冷好的无菌1.5mL EP管中，冰上放置5min，4℃，4000r/min离心5 min，弃上清；菌体重悬于800μl预冷的75mmol/L CaCl2溶液中，冰浴30min；4℃，4000 r/min离心5min，弃上清；沉淀中加入200μL预冷的含10％甘油的75mmol/L CaCl2溶液，用枪头轻轻将菌体吹起，使混合均匀；冰上放3～4 h后用于转化。
2.7 连接产物的热激转化
取连接产物加入感受态细胞中，冰浴30 min；42℃热激90s，迅速置冰上2min；加入1mL平衡至室温的LB液体培养基，37℃温育培养1h；5000r/min离心3min，去部分上清后（留150～200μL）涂布于含适当抗生素的LB平板上；37℃倒置培养过夜。
2.8 菌液PCR鉴定重组质粒
分别挑取多个单菌落转化子接种于1mL含100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；取1μL菌液于Eppendorf管中，空载质粒作为阴性对照，加入PCR mix 和特异性检测引物，PCR扩增20ul提醒，琼脂糖凝胶电泳观察结果。
2.9 碱法少量快速抽提质粒DNA
收集3mL菌液于Ep管内，5000rpm离心5min收集菌体；详细操作按照Xygen质粒小体试剂盒说明书，用100μL 0.1×TE (pH8.0)溶解质粒DNA ，-20℃保存备用。
2.10 重组质粒的酶切鉴定
酶切体系如下：
| ddH2O | 15μl |
| 10×Buffer E | 2μl |
| 重组质粒DNA | 2μl |
| BamHⅠ | 0.5μl |
| XbaⅠ | 0.5μl |
| 总体积 | 20μl |
| ddH2O | 15μl |
| 10×Buffer E | 2μl |
| 重组质粒DNA | 2μl |
| SphI | 0.5μl |
| XhoI | 0.5μl |
| 总体积 | 20μl |
37℃反应1～2h，琼脂糖凝胶电泳检测切出目的条带gfp、cecropin B2 和temporin-1Sd，如图2、图3所示，图2中M为DNA Marker ；1为:pMD- cecropin B2 的BamHI 和XbalI双酶切产物；2为: pMD- temporin-1Sd 的XhoI和SphI双酶切产物。图3中Ｍ为DNA Marker DL2000；泳道1：pMD-gfp的BamHI单酶切产物；泳道2：pMD-gfp的XhoI单酶切产物。由图2与图3结果说明目的基因已成功连接到pMD-18T载体上。
2.11 重组质粒的测序鉴定以及分析
取少量鉴定为阳性克隆菌液送至上海英俊生物技术有限公司测序部进行测序，测序结果用DNAStar、DNAMAN等软件对序列进行比对分析。结果显示PCR扩增的序列与理论序列一致，没有移码或突变。
3. 重组杆状病毒转移载体pfast-dul的构建
3.1 目的片段及载体的获得
测序鉴定正确的重组质粒pMD- cecropin B2用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切。酶切体系如下：
| ddH2O | 23μl |
| 10×Buffer B | 5μl |
| 重组质粒DNA | 20μl |
| BamHI | 1μl |
| XbaⅠ | 1μl |
| 总体积 | 50μl |
37℃反应2~4h，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。
真核表达载体质粒pfast-dul作同样酶切处理，质粒的量减少为4μl，反应结束后于65℃灭活10分钟，-20℃保存备用。
3.2 酶切产物的回收
同2.4。
3.3 目的片段与载体连接
酶切回收的cecropin B2目的片段与酶切后的转移载体pfast-dul连接。连接体系如下：
| T4 DNA连接酶 | 1μl |
| 10×连接Buffer | 1μl |
| 回收的目的片段 | 6μl |
| 载体 | 2μl |
| 总体积 | 10μl |
16℃反应8小时后用于转化。
3.4 重组质粒的转化与鉴定。
参照2.1中的相关方法将连接产物转化感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒。重组质粒经酶切和基因测序进行鉴定，如图4所示，图中Ｍ为DNA Marker；1泳道:pastbac-gfp-cecropin B2的 BamHI和PstI双酶切产物；4泳道:pastbac-gfp-temporin-1Sd 的XhoI和KpnI双酶切产物。鉴定正确的重组质粒命名为pastbac-temporin-cecropin ，以相同的方式获得重组质粒pastbac-gfp-temporin--cecropin，pastbac-temporin-gfp-cecropin。
4、重组家蚕核多角体病毒的获得及病毒DNA的制备
4.1 供体质粒与杆状病毒BmNPV基因组转座重组
冰浴30min，42℃热激45s，迅速转移至冰水混合物中冰浴2-3min，加入1ml LB培养基，37℃、200rpm孵育4h，做10-1、10-2、10-3连续稀释，从10-2、10-3稀释液中各取100μl涂板（含抗生素、X-gal），37℃培养36-48h。
结果如图5所示，其中白斑为重组阳性菌，图中1为阴性对照；2是pfast-temporin-1Sd
-cecropin B2；3 是pfast -temporin-1Sd-gfp-cecropin B2；4是pfast - gfp -temporin-1Sd -cecropin B2转化DH10-bac。
4.2 重组杆状病毒BmNPV基因组基因组抽提及PCR鉴定
在蓝白斑平板上挑取白斑菌落至含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环霉素的LB培养基中震荡培养，37℃培养12h，以溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ方法提取Bacmid DNA，以此为模板，M13上下游引物PCR鉴定是否为阳性克隆。
4.3细胞转染及重组病毒鉴定
提取重组Bacmid，转染昆虫细胞：⑴1μg重组Bacmid DNA加入100μl双无（无血清、无双抗）TC-100培养液中；⑵将6μl脂质体加入到100μl双无（无血清、无双抗）TC-100培养液中混匀；⑶将⑴和⑵溶液混合，室温放置15-45min；⑷将昆虫细胞（覆盖70-80%面积）用双无培养液系三次，脂质体和DNA混合物再加入800μl双无TC-100培养液，混合，加入细胞中，27℃，静置5h；⑸去除脂质体、DNA复合物液体，加入2ml完全（含有双抗、血清）TC-100培养液继续培养3-4d，收取上清。重组病毒命名为rBmNPV-temporin-1Sd-cecropin B2；rBmNPV-temporin-1Sd-gfp-cecropin B2；rBmNPV-gfp temporin-1Sd -cecropin B。重组病毒在细胞上的病变照片如图6所示，图中1为正常Bmn细胞；2为感染了重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV（temporin-1Sd-cecropin B2）；3为感染了重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV（temporin-1Sd-gfp-cecropin B2）；4为感染了重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV（gfp temporin-1Sd -cecropin B2）48h后的病变图。
4.4 重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl NaOH（0.5 mol/L）后混匀，再加入20μl（8 mol/L）的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。
取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应体系与反应条件同2.3。取15μl反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。
5. 重组病毒表达外源蛋白检测
准备昆虫细胞Bmn（覆盖70-80%面积），将获得的的重组杆状病毒rBmNPV-temporin-1Sd-cecropin B2；rBmNPV-temporin-1Sd-gfp-cecropin B2；rBmNPV-gfp temporin-1Sd -cecropin B分别感染Bmn细胞，48h后观察荧光结果如图7所示，图中1为 Bmn细胞对照；2为重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV（temporin-1Sd-gfp-cecropin B2）感染Bmn细胞48h荧光图；3为重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV（gfp -temporin-1Sd -cecropin B2）感染Bmn细胞48h荧光图。
上述结果说明gfp蛋白融合蛋白表达正常，由此可说明在相同位置上克隆的temporin-1Sd和cecropin B2都可以顺利高效表达。
6. 重组病毒在家蚕蛹和蚕体中高效表达
所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1（由本实验室保存）。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》（上海科学技术出版社，1991）的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105 rBmNPV，4-5天后收集发病蚕血及蚕蛹， -20℃冻存用于检测。
7. 喷雾干燥
将产生抗菌肽的家蚕或蚕蛹用10000rpm/min 匀浆器制成匀浆，将匀浆输入喷雾干燥器，物料流速为0.5kg/min；喷雾干燥条件：热空气温度130-135℃，排气温度60-65℃，物料在喷雾干燥中15-40秒内完成干燥，过滤40目筛网，得到含抗菌肽的蚕粉或蚕蛹粉，作为饲料添加剂使用，检验其抗菌活性如图8所示，图中：1表示氨苄青霉素的抗菌活性；2为阴性对照ddH2O；3、4、5、6、7为喷雾干燥的制剂中抗菌肽的抗菌活性。该产品对从临床分离的致病菌大肠埃希菌（耐药）和溶血葡萄球菌均有明显的抗菌活性。
< 110> 广州格拉姆生物科技有限公司
< 120>一种表达牛蛙抗菌肽temporin-1Sd和天蚕素cecropinB2的方法
< 160> 4
< 210> 1
< 211> 192
< 212> DNA
< 213> 惜古比天蚕（Hyatophora cecropia）
< 220>
< 221> mat peptide
< 222>（1）…（192）
< 400> 1
ATG AAT TTC GCA AAG ATC CTA TCC TTC GTC TTC GCT CTG 39
Met Asn Phe Ala Lys Ile Leu Ser Phe Val Phe Ala Leu
5 10
GTG CTG GCT TTG AGC ATG ACC AGT GCT GCT CCC GAG CCC 78
Val Leu Ala Leu Ser Met Thr Ser Ala Ala Pro Glu Pro
15 20 25
AGG TGG AAG ATC TTC AAG AAA ATT GAA AAA ATG GGC AGG 117
Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg
30 35
AAC ATC CGT GAC GGC ATC GTC AAA GCG GGC CCG GCG ATC 156
Asn Ile Arg Asp Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile
40 45 50
GAG GTC CTC GGT TCA GCT AAA GCC ATA GGA AAA TGA 192
Glu Val Leu Gly Ser Ala Lys Ala Ile Gly Lys
55 60
< 210> 2
< 211> 243
< 212> DNA
< 213> 牛蛙(Rana catesbeiana)
< 220>
< 221> mat peptide
< 222>（1）…（243）
< 400> 2
TTC CTT GGG ACC ATC AAC TTA TCT CTC TGT GAG CAA GAG 39
Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys Glu Gln Glu
5 10
AGA GAT GCC GAT GAA GAA AAA AGA GAC GAG CCA GAT GAA 78
Arg Asp Ala Asp Glu Glu Lys Arg Asp Glu Pro Asp Glu
15 20 25
AGT GAT GTT GAA GTA GAA AAA CGA TTT TTA CCA GCA GCC 117
Ser Asp Val Glu Val Glu Lys Arg Phe Leu Pro Ala Ala
30 35
CTT GCA GGT ATT GGA GGA ATT TTG GGT AAA CTT TTC GGC 156
Leu Ala Gly Ile Gly Gly Ile Leu Gly Lys Leu Phe Gly
40 45 50
A AA AAC CCA AAA ATG TTG AAA CTT TGG AAA TGG AAT TGG 195
Lys Asn Pro Lys Met Leu Lys Leu Trp Lys Trp Asn Trp
55 60 65
AAA TCA TCT GAC GTG GAA TAT CAT TTG GCT AAA TGC TCA 234
Lys Ser Ser Asp Val Glu Tyr His Leu Ala Lys Cys Ser
70 75
ACA GAT GTC 243
Thr Asp Val
80
< 210> 3
< 211> 63
< 212> PRT
< 213> 惜古比天蚕（Hyatophora cecropia）
< 220>
< 221> mat peptide
< 222>（1）…（63）
< 400> 3
Met Asn Phe Ala Lys Ile Leu Ser Phe Val Phe Ala Leu
5 10
Val Leu Ala Leu Ser Met Thr Ser Ala Ala Pro Glu Pro
15 20 25
Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg
30 35
Asn Ile Arg Asp Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile
40 45 50
Glu Val Leu Gly Ser Ala Lys Ala Ile Gly Lys
55 60
< 210> 4
< 211> 81
< 212> PRT
< 213> 牛蛙(Rana catesbeiana)
< 220>
< 221> mat peptide
< 222>（1）…（81）
< 400> 4
Phe Leu Gly Thr Ile Asn Leu Ser Leu Cys Glu Gln Glu
5 10
Arg Asp Ala Asp Glu Glu Lys Arg Asp Glu Pro Asp Glu
15 20 25
Ser Asp Val Glu Val Glu Lys Arg Phe Leu Pro Ala Ala
30 35
Leu Ala Gly Ile Gly Gly Ile Leu Gly Lys Leu Phe Gly
40 45 50
Lys Asn Pro Lys Met Leu Lys Leu Trp Lys Trp Asn Trp
55 60 65
Lys Ser Ser Asp Val Glu Tyr His Leu Ala Lys Cys Ser
70 75
Thr Asp Val
80
Claims (10)
1.一种表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，包括：牛蛙抗菌肽temporin-1Sd和天蚕素cecropinB2基因序列或将其与绿色荧光蛋白融合后，将它们克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到转移表达载体；将构建的转移表达载体与杆状病毒DNA在大肠杆菌中进行转座重组，获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主表达相应的牛蛙抗菌肽temporin-1Sd和天蚕素cecropinB2；收获并干燥处理所表达的抗菌肽。
2.按照权利要求1所述的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，其特征在于所述的抗菌肽牛蛙抗菌肽temporin-1Sd和天蚕素cecropinB2的核苷酸序列如序列表中的序列1和序列2所示，相应的氨基酸序列如序列表中的序列3和序列4所示。
3.按照权利要求1所述的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，其特征在于所述的杆状病毒运载载体选自pfastbac-dul双启动子，可以同时表达两种抗菌肽或同一种抗菌肽的两个拷贝。
4.按照权利要求1所述的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，其特征在于所述构建得到的转移表达载体是带有抗菌肽基因原始序列的载体pfast-temporin-1Sd-cecropinB2，和带有抗菌肽融合蛋白序列的载体pfast-temporin-1Sd-gfp-cecropinB2，pfast-temporin-1Sd-gfp-cecropinB2。
5.按照权利要求1所述的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，其特征在于所述的杆状病毒DNA为BmNPV。
6.按照权利要求1所述的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，其特征在于所述的重组杆状病毒选自以下任意一种重组病毒：重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV- temporin-1Sd-cecropin B2；重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV- temporin-1Sd-gfp-cecropin B2；重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV- gfp temporin-1Sd -cecropin B2。
7.按照权利要求1所述的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，特征在于所述的昆虫宿主包括家蚕、蓖麻蚕、樗蚕、樟蚕、日本柞蚕、柞蚕、野蚕、野天蚕及相应的昆虫细胞。
8.按照权利要求1所述的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，其特征在于所述的昆虫宿主是家蚕幼虫和蛹；所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体。
9.按照权利要求8所述的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，其特征在于，所述的感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆。
10.按照权利要求9所述的表达牛蛙抗菌肽 temporin-1Sd和天蚕素cecropin B2的方法，其特征在于所述的蛹体为1-2天的早期嫩蛹。
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