KR20040105745A - 유전자 재조합 누에를 이용한 생리 활성 단백질 생산법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 바큘로바이러스를 이용할 필요가 없고, 목적 단백질의 정제를 용이하게 할 수 있는 곤충용의 유전자 공학 재료를 제공하는 동시에, 이 유전자 공학 재료를 이용한 외래 단백질의 제조 방법을 제공한다. 견사선에서 작용하는 프로모터에 연결한 사이토카인 유전자 등 외래 단백질 유전자를 누에 염색체에 도입하여 유전자 재조합 누에를 얻는다. 이 누에 또는 그의 자손의 견사선 또는 고치로부터 사이토카인 등 외래 단백질을 추출하여 정제한다. 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분의 DNA 서열과 3' 말단 부분의 DNA 서열을 외래 단백질 유전자에 융합시킨 발현용 유전자 카세트를 견사선 세포 등에 도입함으로써, 대량의 외래 단백질을 견사선 세포내, 견사선 세포외, 또한 견사, 고치까지 생산시키는 것이 가능해진다.

Description

유전자 재조합 누에를 이용한 생리 활성 단백질 생산법 {Process for Producing Physiologically Active Protein Using Genetically Modified Silkworm}

유전자 재조합 기술을 이용한 외래 단백질의 생산은 다양한 산업에 이용되고 있다. 그의 숙주로서 주로 대장균, 효모, 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포 등이 이용되고 있다. 그러나, 모든 외래 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 숙주는 개발되어 있지 않아, 목적하는 단백질마다 생산계를 구축하는 것이 필요하고, 개개 숙주에서의 외래 단백질 생산 기술에 있어서 한층 더 기술 혁신이 요망되고 있다.

대장균 등의 세균 또는 효모계에서는, 번역 후 수식에 문제가 있어 단백질을 충분히 기능하는 형태로 합성할 수 없는 경우가 있다. 또한, 동물 세포는 단백질이 작용하는 형태로 합성할 수 있는 것이 많지만, 일반적으로 증식시키기가 곤란하며 생산량도 낮아 경제적이지 않다.

한편, 곤충 또는 곤충 세포를 이용한 유전자 재조합 단백질의 생산에서는, 효소나 생리 활성을 갖는 유용 단백질 등을 비교적 저가에 양산할 수 있고, 동물에 가까운 단백질의 번역 후 수식이 얻어지는 것이 알려져 있다. 구체적으로는, 외래 단백질 유전자를 조립한 바큘로바이러스를 곤충 또는 곤충 세포에 감염시키는 방법으로, 외래 단백질이 비교적 저가에 양산이 가능하고, 의약품으로서 제품화된 생리 활성 단백질도 알려져 있다(일본 특허 공개 (소)61-9288호 공보, 일본 특허 공개 (소)61-9297호 공보).

면역 조절 작용을 갖는 생리 활성 물질로서 의약 용도로 주목받고 있는 사이토카인류의 생산에 대하여 예를 들면, 일본 특허 공개 (평)3-139276호 공보, 일본 특허 공개 (평)9-234085호 공보에서 각각 고양이 인터페론-ω유전자, 개 인터페론-γ 유전자를 조립한 BmNPV를 누에에 접종하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 인터페론 이외의 단백질의 곤충에서의 생산의 예로서는, 바큘로바이러스를 감염시킨 곤충 세포에 의한 인간 콜라겐의 생산 방법도 알려져 있다(일본 특허 공개 (평)8-23979호 공보).

그러나, 종래의 곤충 또는 곤충 세포를 이용한 재조합 단백질의 생산 기술에서는, 외래 유전자의 도입에 재조합 바이러스를 이용하기 때문에, 안전성의 관점에서 그의 불활성화나 봉입이 필요하다고 하는 과제가 있다. 또한, 재조합 바이러스를 누에에 접종하는 방법에서는 재조합 바이러스의 접종이 번잡하고, 목적하는 외래 단백질이 체액 중에 생산되기 때문에, 목적의 재조합 단백질을 누에 체액 유래의 대량의 협잡 단백질로부터 정제하는 것이 필요하였다. 이 때문에, 고순도의 재조합 단백질을 얻기가 곤란하다는 과제가 있었다.

한편, 최근 곤충 염색체에의 외래 유전자의 재조합이 시도되고, 핵 다핵체 병 바이러스의 일종인 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV)의 DNA를 이용하여, 누에 피브로인 L쇄 유전자에 해파리 녹색 형광 단백질 유전자를 부가한 융합 유전자를 상동 재조합에 의해 누에 염색체 상에 도입하여 발현시키는 방법이 개발되고(Genes Dev.,13, 511-516, 1999), 이 기술을 이용한 인간ㆍ콜라겐 유전자를 도입한 누에 및 그의 제조 방법이 개시되어 있다(일본 특허 공개 2001-161214호 공보). 또한, 최근 외래 유전자를, 인시목 곤충 유래의 트랜스포존 인 piggyBac을 이용하여 누에 염색체에 안정적으로 도입하고, 그의 외래 유전자가 코딩하는 단백질을 발현시키는 방법이 해파리 녹색 형광 단백질을 모델로 하여 연구되어, 교배에 의해 자손으로 유전자가 안정적으로 전해지는 것도 확인되었다(Nature Biotechnology18, 81-84, 2000).

그러나, 상기 AcNPV를 이용한 곤충 염색체에의 외래 단백질 유전자의 도입 방법에서는, 재조합 바큘로바이러스(AcNPV)를 이용하기 때문에 재조합 바이러스의 불활성화나 봉입의 과제가 여전히 남아 있다. 다음으로, 트랜스포존 piggyBac을 이용한 예에서는, 녹색 형광 단백질의 생산량이 충분하지 않으며, 누에 전신에 생산되기 때문에 발현시킨 재조합형 녹색 형광 단백질을 고순도의 형태로 회수하기 위해서는 고도한 정제 기술을 필요로 하기 때문에 경제적으로 문제가 있었다. 또한, 생산된 재조합형 단백질의 생산량은 아직 충분하지 않고, 매우 적다.

즉, 이러한 곤충 세포를 숙주로 한 외래 단백질의 생산 기술에 있어서는, 재조합 바큘로바이러스의 불활성화나 봉입이 필요하거나, 누에를 이용한 경우 등 대량의 협잡 단백질이 존재하는 체액으로부터 목적 단백질을 정제하기가 곤란하며, 목적 단백질의 발현량이 적은 등 몇 가지의 과제가 있다.

지금까지 사이토카인 유전자 등 생리 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 누에 염색체에 도입하여 목적 단백질을 발현시킨 예는 알려져 있지 않다. 또한, 누에 체액 이외의 부위인 견사선이나 누에의 분비물인 견사로부터 재조합형의 사이토카인을 회수하여, 얻어진 사이토카인의 생리 활성을 확인한 예는 없다. 또한, 이러한 성질을 유전할 수 있는 누에에 대해서도 전례는 없다. 또한, 트랜스포존을 이용하여 제조한 재조합 누에에 의해, 견사에 대량의 재조합 단백질을 생산시킨 예는 없다.

본 발명은 사이토카인 유전자가 염색체에 조립된 누에를 이용한 재조합형 사이토카인의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 견사선 또는 고치실에 재조합형 사이토카인을 생산하는 성질을 갖는 유전자 재조합 누에, 및 이 재조합 누에를 제조하기 위한 누에 염색체에의 외래 유전자 도입용 벡터에 관한 것이다. 또한, 곤충 세포에의 유전자 도입 벡터 및 이 벡터를 이용하여 유전자 도입된 곤충 세포, 곤충 조직, 곤충을 이용한 외래 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에서 얻어지는 재조합 누에가 생산한 외래 단백질을 포함하는 견사에 관한 것이다.

도 1은 유전자 도입 벡터 pigSIB의 제한 효소 지도를 나타내는 도면이다.

도 2는 유전자 도입 벡터 pigFIB의 제한 효소 지도를 나타내는 도면이다.

도 3은 트랜스포사제(transposase)를 갖는 플라스미드 pHA3PIG의 제한 효소 지도를 나타내는 도면이다.

도 4는 하기 표 1의 양성 나방구로부터 얻어진 11 마리의 누에(G1)의 게놈 DNA를 EcoRV, XmnI 처리한 후, 고양이 인터페론-ω 유전자를 프로브로 하여 서던블롯팅 해석을 행한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5는 피브로인 H쇄 프로모터에 연결한 고양이 인터페론-ω 유전자를 도입한 재조합 누에의 견사 추출액의 항바이러스 활성을 나타내는 도면이다. 염색되어 있는 레인의 샘플에 활성이 있음을 나타낸다.

도 6은 하기 표 3의 양성 나방구(실험 1로부터 3 나방구, 실험 2로부터 2 나방구)로부터 얻어진 누에 견사선 게놈 DNA를 EcoR I 또는 Bgl II 처리한 후, 고양이 인터페론-ω 유전자를 프로브로 하여 서던 블롯팅 해석을 행한 결과를 나타내는 도면이다.

도 7은 유전자 재조합 누에 중부 견사에서의 고양이 인터페론 mRNA의 발현을 RT-PCR에 의해 검출한 도면이다.

도 8은 세리신 프로모터에 연결한 고양이 인터페론-ω 유전자를 도입한 재조합 누에의 중부 견사선 추출액 및 고치실 추출액의 항바이러스 활성을 나타내는 도면이다. 염색되어 있는 레인의 샘플에 활성이 있음을 나타낸다.

도 9는 PㆍICㆍA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트(construct)의 제조 수법(전반)을 나타내는 도면이다.

도 10은 PㆍICㆍA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트의 제조 수법(후반)을 나타내는 도면이다.

도 11은 HPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트의 제조 수법(전반)을 나타내는 도면이다.

도 12는 HPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트의제조 수법(후반)을 나타내는 도면이다.

도 13은 HUPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트의 제조 수법(전반)을 나타내는 도면이다.

도 14는 HUPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트의 제조 수법(후반)을 나타내는 도면이다.

도 15는 HPㆍICㆍA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트의 제조 수법(전반)을 나타내는 도면이다.

도 16은 HPㆍICㆍA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트의 제조 수법(후반)을 나타내는 도면이다.

도 17은 배양 누에 견사선에서의 β-갈락토시다제의 발현을 웨스턴 해석에 의해 해석한 도면이다. 세포내에서의 단백질의 합성 또는 유전자의 발현에 피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역이 중요한 역할을 하는 것이 명백해졌다. 또한, 세포밖으로의 분비도 확인되었다.

도 18은 누에 견사선 조직에서의 재조합 단백질의 발현을 웨스턴 해석에 의해 해석한 도면이다. 누에 후부 견사선 세포내에서의 재조합 단백질 발현의 비약적인 향상으로, 피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역이 중요한 역할을 하는 것이 재확인되었다. 또한, 피브로인 프로모터 상류 영역 약 5.5 kbp에 단백질 생산량을 향상시키는 유전자 영역이 있음이 분명해졌다.

도 19는 견사에의 재조합 단백질의 생산을 웨스턴 해석에 의해 해석한 도면이다. 견사선 세포내에서 합성된 단백질의 견사에의 분비에는, 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분이 중요한 역할을 하는 것이 분명해졌다. 또한, 피브로인 프로모터 상류 영역 약 5.5 kbp에 단백질 생산량을 향상시키는 유전자 영역이 있음이 재확인되었다.

<발명의 실시 형태>

사이토카인은 여러 세포에 의해 생산되고, 조혈 세포나 면역 세포에 대하여 면역 조절 작용, 항바이러스 작용, 혈구 세포 증식 작용을 갖는 단백질이다. 그 작용은 적절(的確)한 고차 구조를 형성하여 세포막 상의 특이적인 수용체에 결합함으로써 발휘된다. 현재까지 그의 작용의 특징으로부터 인간을 비롯한 동물에 대한 임상 응용이 이루어지고 있다.

본 발명의 사이토카인류로서는 특별히 한정되지 않지만, 누에 체내로 발현하였을 때에 그의 생리 활성이 유지되는 사이토카인류일 수 있고, 면역 조절 작용, 항바이러스 작용, 혈구 세포 증식 작용 등을 갖는 생리 활성 물질이며, 의약ㆍ의료용도로 주목받고 있는 단백질, 예를 들면 인간 인터페론-α, β, γ(J. Interferon Res. 5, 521-526, 1985, Nucleic Acids Res. 10, 2487-2501, 1982), 인간 인터루킨-12(J. Immunol. 146, 3074-3081, 1991), 인간 과립구 콜로니 자극 인자(Nature, 319, 415-418, 1986), 인간 에리스로포이에틴(Nature, 313, 806-810, 1985), 인간 트롬보포에틴(Cell. 77, 1117-1124, 1994), 고양이 인터페론-ω(Biosci. Biotech. Biochem., 56, 211-214, 1992, GenBank 데이타 베이스 등록 번호 E04599), 고양이 에리스로포에틴(GenBank 데이타 베이스 등록 번호 FDU00685), 고양이 과립구 콜로니 자극 인자(Gene, 274, 263-269, 2001), 개 인터페론-γ(GenBank 데이타 베이스등록 번호 S41201), 개 인터루킨-12(일본 특허 공개 (평)10-36397호 공보), 개 과립구 콜로니 자극 인자(미국 특허 제5606024호) 등을 들 수 있다. 사이토카인류로서 바람직하게는 인터페론류 또는 콜로니 자극 인자류이고, 이들에는 인터페론-α, β, γ, ω, τ나 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구ㆍ단구 콜로니 자극 인자, 단구 콜로니 자극 인자, 에리스로포이에틴, 트롬보포이에틴 등이 포함된다. 더욱 바람직하게는 고양이 인터페론-ω, 고양이 과립구 콜로니 자극 인자, 인간 인터페론-β 이다.

고양이 인터페론-ω 유전자는, 예를 들면 E. Coli(pFeIFN1)(미공연조기(微工硏條寄) 제1633호)로부터 추출한 플라스미드로부터 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 또는, 잘라낸 고양이 인터페론-ω 유전자를 누에의 클로닝 벡터(T.Horiuchi 등, Agric. Biol. Chem., 51, 1573-1580, 1987)에 연결하여 제조한 재조합 플라스미드와 누에 다핵체 병 바이러스 DNA를, 누에 수립 세포에 코ㆍ트랜스펙션(cotransfection)하여 제조한 rBNV100으로부터 얻는 것도 가능하다.

고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자는 고양이 신장 유래의 배양 세포인 CRFK 세포를 LPS로 자극한 후, 그 세포로부터 mRNA를 회수하고, 또한 역전사에 의해 얻어진 cDNA를 주형으로 GenBank 데이타 베이스 등록 번호 AB042552를 참고로 설정한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 얻을 수 있다.

인간 인터페론-β 유전자는 그의 cDNA를 코딩하는 플라스미드 p0RF-hIFN-β(인비보겐(Invivogen)사)로부터 추출함으로써 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서 누에 염색체에의 유전자 도입 방법에 대해서는, 유전자가안정적으로 염색체에 조립되어 발현하고, 교배에 의해 자손에도 안정적으로 유전자가 전해지는 것과 같은 유전자 도입 방법일 수 있고, 누에란에 마이크로 주입하는 방법, 유전자 총을 이용하는 방법 등을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 트랜스포사제 유전자를 포함하는 핼퍼 플라스미드(Nature Biotechnology18, 81-84, 2000)와 동시에 목적 유전자를 포함하는 누에 염색체에의 외래 유전자 도입용 벡터를 누에란에 마이크로 주입하는 방법이 채용된다.

목적 유전자는, 마이크로 주입된 누에란으로부터 부화하여 성장한 재조합 누에에서 생식 세포에 도입된다. 이렇게 해서 얻어진 재조합 누에의 자손은 그의 염색체 상에 목적 유전자를 안정적으로 유지하는 것이 가능하다. 본 발명에서 얻어지는 유전자 재조합 누에는 통상의 누에와 동일한 방법으로 계대 유지 가능하다. 즉, 알을 통상의 조건에서 최청(催靑)하여, 부화한 개미 누에를 인공 사료 등으로 소립(掃立)하고, 통상의 누에와 동일한 조건에서 사육함으로써 5령 누에까지 사육할 수 있다.

본 발명에서 얻어지는 유전자 재조합 누에는 통상의 누에와 동일하게 번데기화하여 고치를 만들 수 있다. 번데기 단계에서 자웅을 구별하여 발아(發蛾)한 후 자웅을 교미시키고, 다음날 채란한다. 알은 통상의 누에란과 동일하게 보존하는 것이 가능하다. 본 발명의 유전자 재조합 누에는 이러한 사육을 반복함으로써 계대하는 것이 가능하고, 또한 대량으로 늘리는 것이 가능하다.

본 발명에서 사용되는 사이토카인 유전자를 누에 염색체에 도입할 목적으로 사용되는 외래 유전자 도입 벡터는 사이토카인의 발현을 적절하게 제어하도록 설계된다면 특별히 한정되지 않지만, 통상은 사이토카인 유전자에 대하여 견사선 특이적으로 발현하는 프로모터를 상류에, 임의의 폴리 A 서열을 하류에 연결한 구조를 가지고, 이들 유전자 서열의 외측에 1쌍의 트랜스포존 유래의 DNA 서열을 갖는다. 또한, 프로모터와의 사이에 임의의 유전자 유래의 시그널 서열 등을 연결할 수도 있고, 폴리 A와의 사이에도 임의의 유전자 서열을 연결할 수도 있다. 또한, 인공적으로 설계, 합성된 유전자 서열을 연결할 수도 있다. 또한, 필요에 따라서 박테리아 숙주 내에서 복제하기 위한 서열, 항생 물질 내성 유전자, 형광 단백질 유전자, LacZ 유전자 등을 연결할 수도 있다. 예를 들면, 적절한 프로모터 하류에 결합된 녹색 형광 단백질 GFP가 유전자를 1쌍의 트랜스포존 유래 DNA 서열간의 적절한 부위에 도입할 수 있다. 이에 의해 유전자 재조합 누에의 스크리닝을 쉽게 하는 것이 가능하다. 또한, 본 벡터는 pUC9, 19 등, 대장균 유래 플라스미드의 일부 또는 전부를 포함할 수도 있다.

또한, 여기서 사용되는 프로모터는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 생물 유래의 프로모터라도 누에 세포내에서 유효하게 작용하는 프로모터라면 좋지만, 누에 견사선에서 특이적으로 단백질의 발현을 유도하도록 고안된 프로모터가 바람직하다. 예를 들면, 피브로인 H쇄 프로모터, 피브로인 L쇄 프로모터, p25 프로모터, 세리신 프로모터 등의 누에 견사선 단백질의 프로모터를 들 수 있다.

그 밖에 프로모터 이외에 사용되는 유전자 서열에 대해서는, 시그널 서열, 폴리 A 서열이나 기타 유전자의 발현을 제어하는 서열 등을 들 수 있다. 이들은 특정한 것으로 한정되지 않고, 목적 단백질의 발현에 적합한 것을 선택할 수 있다.예를 들면, 고양이 인터페론-ω 등 사이토카인의 시그널 서열이나 폴리 A 서열 등 목적 단백질 유래의 것, 숙주가 되는 누에 등 곤충 단백질의 시그널 서열, 폴리 A 서열을 들 수 있다. 또는, SV40 폴리 A나 소 성장 호르몬 폴리 A 등의 일반적으로 단백질의 발현에 실적이 있는 것 등을 들 수 있다. 상기 프로모터나 기타 사이토카인류 유전자와 연결하는 유전자 서열을 변화시킴으로써, 그의 발현 부위나 발현량을 조작하는 것이 가능하다.

본 발명에서 「외래 단백질의 발현용 유전자 카세트」란, 곤충 세포에 도입된 경우, 그의 외래 단백질 구조 유전자가 코딩하는 단백질이 발현되기 위해서 필요한 DNA의 셋트를 말한다. 이 외래 단백질 발현 카세트는 외래 단백질 구조 유전자와 그 유전자의 발현을 촉진하는 프로모터를 포함한다. 통상은 또한 종결자, 폴리 A 부가 영역을 포함하고, 바람직하게는 프로모터, 외래 단백질 구조 유전자, 종결자, 폴리 A 부가 영역 모두를 포함한다. 또한, 프로모터와의 사이에 외래 단백질 구조 유전자에 결합한 분비 시그널 유전자를 포함할 수 있다. 폴리 A 부가 서열과의 사이에도 임의의 유전자 서열을 연결할 수도 있다. 또한, 인공적으로 설계, 합성된 유전자 서열을 연결할 수도 있다.

또한, 「유전자 도입용 유전자 카세트」란, 양측에 1쌍의 피기백(piggyBac) 트랜스포존의 역위 반복 서열을 갖는 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트이고, 또한 피기백(piggyBac) 트랜스포사제의 작용에 의해 곤충 세포 염색체에 도입되는 DNA 셋트를 말한다.

본 발명에서 사용되는 DNA를 얻는 방법에 특별히 제한은 없다. 기지의 유전자 정보에 기초하여, PCR(polymerase chain reaction)법을 이용하여 필요한 유전자 영역을 증폭 얻는 방법, 기지의 유전자 정보에 기초하여 게놈 라이브러리나 cDNA 라이브러리로부터 상동성을 지표로 하여 스크리닝하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 이들 유전자는 유전적 다형성이나 변이제 등을 이용한 인위적 이변 처리에 의한 변이형도 포함한다. 유전적 다형성이란, 유전자 상의 자연 돌연 변이에 의해 유전자의 염기 서열이 일부 변화되어 있는 것을 말한다.

외래 단백질 발현 카세트에서의 프로모터는 특별히 한정되지 않지만, 외래 단백질 유전자의 발현을 촉진하는 활성이 높은 것이 바람직하다. 예를 들면, 일본 특허 공개 (평)6-261770이나 일본 특허 공개 (소)62-285787에 기재되어 있는 노랑 초파리의 열 쇼크 단백질 유전자의 프로모터나 누에 액틴 유전자의 프로모터(Nature Biotechnobgy18, 81-84, 2000) 등을 들 수 있지만, 피브로인 H쇄 유전자(GenBank 등록 번호 V00094의 염기 번호 255 내지 574번째), 피브로인 L쇄 유전자(Gene, 100:151-158: GenBank 등록 번호 M76430), 세리신 유전자의 프로모터(GenBank 등록 번호 AB007831의 염기 번호 599 내지 1656번째) 등 누에 견사선 세포 중에서 높은 촉진 활성을 갖는 프로모터가 바람직하다.

「외래 단백질 구조 유전자」란, 유전자를 발현시키고자 하는 숙주 세포가 가지고 있지 않는 유전자이고, 숙주 세포가 원래 생산하지 않는 단백질을 코딩하는 유전자로, 특별히 한정되지 않는다. 산업적 가치를 고려하여, 인간이나 포유류가 생산하는 단백질, 예를 들면 성장 호르몬, 사이토카인, 증식 인자 및 세포 골격 단백질의 유전자 등을 들 수 있다. 또한, 미생물, 식물 또는 곤충 등이 생산하는 효소나 다양한 단백질의 유전자 등도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서의 외래 단백질 발현용 유전자 카세트에 있어서, 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분은 프로모터에 의한 외래 단백질 유전자의 발현을 증강하는 작용을 갖는 DNA 서열이고, 피브로인 H쇄 유전자의 제1 엑손와 제1 인트론의 전장 또는 그의 일부 및 제2 엑손의 일부를 포함하는 DNA 서열이다. 이 제2 엑손의 3'측에 외래 단백질 구조 유전자의 5'측을 아미노산 프레임이 일련되도록 융합시킴으로써 외래 단백질의 생산량을 향상시킬 수 있지만, 제2 엑손 부분을 너무 길게 하면 목적하는 외래 단백질의 N 말단측에 여분의 아미노산 잔기가 부가되기 때문에, 목적하는 외래 단백질의 구조나 활성을 잃게 되는 경우도 있으므로, 목적에 따라서 적절한 길이로 하는 것이 필요하다. 많은 경우, 제2 엑손 부분은 피브로인 H쇄 유전자의 분비 시그널 유전자의 직후 또는 수아미노산 잔기까지로 함으로써 바람직한 결과를 얻을 수 있다. 또한, 피브로인 H쇄 유전자 프로모터의 5'측 상류 영역, 즉 약 5.5 kbp 상류 영역 중에는 프로모터 활성을 증강하는 영역이 있다고 생각되기 때문에, 이 영역을 부가함으로써 목적 단백질의 발현량의 증대를 기대할 수 있다.

피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분은, 외래 단백질을 누에 견사선에서 생산시키는 경우에 외래 단백질을 견사선 세포 밖으로 대량 분비시키는 효과를 갖는 DNA 서열이다. 이 견사에의 분비 시그널인 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분을 3'측에 융합시킨 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트를 염색체에 도입한 재조합 누에는 그의 견사 중에 외래 단백질을 생산하는 것이 가능하다. 또한, 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분은 외래 단백질 유전자의 상류, 하류, 외래 단백질 유전자 중 어디에도 존재할 수도 있다.

이 부분에는 적어도 시스테인 잔기가 하나 존재하고 있고, 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단을 그대로 이용한 경우, 시스테인 잔기는 피브로인 H쇄 단백질의 카르복실 말단으로부터 20번째에 위치하게 된다. 이 시스테인은 피브로인 L쇄와 디술피드 결합으로 결합하는 역할을 가지고 있다. 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분의 DNA 서열의 길이는, 피브로인 L쇄와 디술피드 결합의 형성을 저해하는 일이 없는 한 특별히 제한되지 않는다. 피브로인 H쇄는 3' 말단으로부터 약 100 염기 이상 상류에는, DNA의 반복 서열이 계속되기 때문에, 이 상류 부분의 DNA 서열은 제한 효소로 임의의 길이로 절단하거나 가공하는 것이 곤란하다. 따라서, 유전자 공학적 수법의 용이함으로 인해, 피브로인 H쇄 3' 말단 부분은, 피브로인 H쇄 유전자의 반복 DNA 서열이 종료된 3'측의 약 100 염기쌍을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분이 길면, 외래 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 피브로인 H쇄 단백질의 카르복실 말단 유래의 아미노산이 많이 결합하게 되어, 목적하는 외래 단백질의 구조나 활성을 잃게 되는 경우가 있다. 따라서, 목적하는 단백질에 따라서는, 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분의 DNA 서열은 가능한 한 짧게 하는 것이 필요해지는 경우가 있다.

폴리 A 영역에 대해서도 특별히 제한은 없지만, 피브로인 H쇄, 피브로인 L쇄, 세리신 등 견사선에서 대량으로 발현하는 단백질 유전자의 폴리 A 영역을 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에서의 벡터란, 환상 DNA 구조 또는 선형 DNA 구조를 갖는 것을 말한다. 특히, 대장균 내에서도 복제 가능하고, 또한 환상 DNA 구조를 갖는 벡터를 바람직하게 사용할 수 있다. 이 벡터에는 형질 전환체의 선발을 용이하게 할 목적으로, 항생 물질 내성 유전자, 해파리 유래 형광 녹색 단백질 유전자 등 마커 유전자를 조립해 둘 수도 있다.

본 발명에서 사용하는 곤충 세포로는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 인시목 곤충, 보다 바람직하게는 누에(Bombyx mori) 유래 세포, 더욱 바람직하게는누에 견사선 세포 또는 누에(Bombyx mori) 알에 포함되는 세포이다. 견사선 세포에 있어서는, 피브로인 단백질의 합성이 활발하고, 또한 취급이 용이한 누에 5령 유충의 후부 견사선 세포가 바람직하다.

곤충 세포에 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트 및 벡터를 도입하는 방법에는, 특별히 제한은 없다. 곤충 배양 세포에의 도입 방법으로서는 인산 칼슘법, 전기 영동에 의한 방법, 리포솜을 이용하는 방법, 유전자 총을 이용하는 방법, 마이크로 주입하는 방법 등을 사용할 수 있지만, 누에 견사선 세포에의 도입에 있어서는, 예를 들면 누에 5령 유충의 체내로부터 취출한 후부 견사선 조직에 대하여 유전자 총을 이용함으로써 간편하게 유전자를 도입하는 것이 가능하다.

유전자 총에 의한 후부 견사선에의 유전자 도입은, 예를 들면 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트를 포함하는 벡터를 코팅한 금 입자를, 바이오라드(BioRad)사의 파티클건(형번: PDS-1000/He)을 이용하여 한천 플레이트 등에 고정한 후부 견사선에 1,100 내지 1,800 psi의 He 가스압으로 분사시킴으로써 가능하다.

누에(Bombyx mori) 알에 포함되는 세포에 유전자를 도입하는 경우에는, 마이크로 주입하는 방법이 바람직하다. 여기서, 알에 마이크로 주입을 행하는 경우, 알 중의 세포에 직접 마이크로 주입할 필요는 없고, 알 중에 마이크로 주입하는 것만으로 유전자를 도입하는 것이 가능하다.

본 발명의 「유전자 도입용 유전자 카세트」를 갖는 벡터를 누에(Bombyx mori) 알에 마이크로 주입함으로써, 본 발명의 「외래 단백질의 발현용 유전자 카세트」가 염색체에 도입된 재조합 누에를 얻는 것이 가능하다. 예를 들면, 타무라 등의 방법(Nature Biotechnology18, 81-84, 2000)에 따라서, 「유전자 도입용 유전자 카세트」를 갖는 벡터와 누에 액틴 프로모터 제어하에 피기백(PiggyBac) 트랜스포사제 유전자를 배치한 플라스미드를, 동시에 누에 알에 마이크로 주입하여, 부화한 유충을 사육하여 얻어진 성충(GO)을 군 내에서 교배하여 차세대(G1) 누에 유충을 얻는다. 재조합 누에는 이 G1 세대에서 통상 1 내지 2 ％의 빈도로 출현한다.

재조합 누에의 선발은, G1 세대 누에의 조직 일부에서 DNA를 취출하고, 외래 단백질 유전자를 기초로 설계한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 행할 수 있다. 또는, 미리 「유전자 도입용 유전자 카세트」안에, 누에 세포에서 발현 가능한 프로모터 하류에 연결한 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 도입해두면, G1 세대의 누에, 예를 들면 1령 유충에 대해서 자외선하에 녹색 형광을 발하는 개체를 선발함으로써 재조합 누에의 선발을 쉽게 행할 수 있다.

또한, 「외래 단백질의 발현용 유전자 카세트」가 염색체에 도입된 재조합 누에를 얻을 목적으로, 「유전자 도입용 유전자 카세트」를 갖는 벡터를 누에(Bombyx mori) 알에 마이크로 주입하는 데 있어서, 피기백(PiggyBac) 트랜스포사제 단백질을 동시에 마이크로 주입하는 것에 의해서도, 상기와 동일하게 하여 재조합 누에를 얻는 것이 가능하다.

피기백(PiggyBac) 트랜스포존이란, 양쪽 말단에 13 염기쌍의 역위 서열과, 내부에 약 2.1 k 염기쌍의 ORF를 갖는 DNA의 전위 인자이다. 본 발명에서 사용되는 피기백(PiggyBac) 트랜스포존은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 Trichoplusia ni cell line TN-368, Autographa californica NPV(AcNPV), Galleria mellonea NPV(GmMNPV) 유래의 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 Trichoplusia ni cell line TN-368 유래 피기백(PiggyBac)의 일부를 갖는 플라스미드 pHA3PIG와 pPIGA3GFP(Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000)를 이용하여, 그의 유전자 및 DNA 전이 활성을 갖는 피기백 트란스포사제를 제조할 수 있다.

piggBac 유래의 DNA 서열의 구조로서는, TTAA 서열을 포함하는 1쌍의 말단 역위 서열이 필수이고, 그 DNA 서열 사이에 사이토카인 유전자 등 외래 유전자가 삽입된 구조를 갖는 것이다. 트랜스포존 유래의 DNA 서열을 이용하여 외래 유전자를 누에 염색체에 도입하기 위해서는, 또한 트랜스포사제를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, piggyBac 유래의 트랜스포사제를 발현하는 것이 가능한 DNA를 동시에 도입함으로써, 누에 세포내에서 전사ㆍ번역된 트랜스포사제가 그의 2쌍의 말단 역위 서열을 인식하여 그 사이의 유전자 단편을 잘라내고, 누에 염색체로 전이시킴으로써 누에 염색체에 유전자가 도입되는 빈도를 현저히 향상시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 유전자 재조합 누에는, 외래 단백질 유전자가 누에 염색체에 도입된 누에이고, 그 누에 염색체 DNA를 통상법에 따라서 제한 효소 처리한 후, 통상법에 따라서 표지한 외래 단백질 유전자를 프로브로 하여 서던 블롯팅을 행할 때, 적극적인 시그널을 제공하는 누에이다. 사이토카인 유전자가 도입되는 염색체 상이 유전자 좌위는, 누에의 발생, 분화, 성장을 저해하지 않는 부위라면 특별히 제한은 없다. 재조합 누에는 그의 견사선 세포, 견사선 내강(內腔), 및 견사 중에 외래 단백질을 생산하는 능력을 가지고 있다. 또한, 재조합 누에는 정상적으로 발육하여 교배가 가능하고, 도입된 외래 단백질 유전자를 안정적으로 보유하며 자손에게 전하는 것이 가능하다. 따라서, 재조합 누에는 계대하여 마리수를 증가시킴으로써, 외래 단백질의 생산량을 쉽게 스케일 업(scale up)하는 것이 가능하다. 교배에 있어서, 야생형의 누에와 교배시킴으로써 외래 단백질의 생산량을 향상시키는 것도 가능하다. 이 경우, 목적의 외래 단백질 유전자가 도입된 누에를 적절하게 선발하면서 계대하여 갈 필요가 생긴다. 이 경우, 임의의 조직으로부터 얻어진 세포의 DNA를 이용하여, 재조합 누에 선발에 사용한 마커 유전자나 외래 단백질 유전자 존재나 구조를 PCR 서던 블롯팅법 등으로 해석함으로써, 재조합 누에의 유전자를 계승한 자손을 용이하게 판별하는 것이 가능하다.

본 발명의 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트가 도입된 곤충 세포나 누에 견사선은, 각각 배양에 적합한 배양액에서 배양함으로써 그의 배양 상청이나 세포 중에 외래 단백질을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 발현용 유전자 카세트가 도입된 누에 난소 유래 세포인 BmN 세포는, TC-100 배지(파민젠사 제조)에서 27 ℃로 배양함으로써, 배양 3일 내지 4일에 목적하는 외래 단백질을 생산한다. 또한, 누에 후부 견사선은, 예를 들면 5령 유충으로부터 무균적으로 적출한 후, 그레이스ㆍ인섹트 배지(Grace's insect medium) 중에서 25 ℃로 배양함으로써 외래 단백질을 생산한다. 견사선에서 단백질 생산을 행하는 경우에는, 배지 중의 용존 산소 농도를 높게 유지하는 것이 바람직하고, 또한 배지 중에 축적되는 저분자의 단백질 합성을 저해하는 인자를, 예를 들면 한외 여과막 등으로 제거하면서 배양하는 것이 바람직하며, 장시간의 단백질 합성이 가능해진다.

본 발명의 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분을 융합시킨 외래 단백질 유전자를 도입한 견사선은, 목적의 외래 단백질을 배양 상청에 대량으로 생산하는 것이 가능하다. 견사선 배양 상청 중의 협잡 단백질은 거의 피브로인 뿐이기 때문에, 견사선 배양 상청에서의 목적 단백질의 정제가 용이하고, 그 결과 고순도의 목적 단백질을 얻는 것이 가능해진다.

본 발명에서 얻어지는 재조합 누에는 통상의 누에와 동일하게 사육이 가능하고, 통상의 조건에서 사육함으로써 외래 단백질을 생산시키는 것이 가능하다. 목적하는 외래 단백질에 따라서, 특히 5령 시기의 배양 온도, 습도, 먹이 공급 조건 등을 최적화함으로써 외래 단백질의 생산량을 향상시키는 것도 가능하다.

본 발명의 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분을 융합시킨 외래 단백질 유전자를 도입한 재조합 누에는, 그의 고치 중에 목적하는 외래 단백질을 대량으로 생산하는 것이 가능해진다. 얻어진 고치로부터 목적 외래 단백질을 쉽게 정제, 회수하는 것이 가능해진다. 또한, 생산시킨 외래 단백질의 기능에 따라서는, 얻어진 외래 단백질을 포함하는 견사를 그대로의 형태 또는 일부 가공한 형태로, 각종 산업 용도로 이용할 수 있다.

본 발명에서 얻어지는 재조합 누에의 견사선 또는 고치실로부터 적당한 추출 조작에 의해 외래 단백질을 얻을 수 있다. 외래 단백질을 견사선 또는 고치실로부터 추출하기 위해서 사용하는 용매에 대해서는 특별히 제한은 없지만, 많은 경우 수용매계가 바람직하다. 추출에 사용되는 수용액은 외래 단백질의 추출을 촉진시키기 위해서 적절한 용질을 포함하는 것이 가능하다. 예를 들면, 인산 등의 무기 산, 아세트산, 시트르산, 말산 등의 유기 산이나, 식염, 요소, 염산 구아니딘, 염화칼슘 등의 염류, 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤 등의 극성 유기 용매 등을 들 수 있다. 또한, 추출 용액의 pH도 특별히 한정되지 않고, 목적하는 외래 단백질의 기능을 실활시키지 않는 pH라면 임의의 pH를 사용할 수 있다.

추출된 외래 단백질을 단리ㆍ정제하기 위한 방법으로 특별히 한정되지 않고, 통상의 단백질의 정제 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 목적하는 유용 단백질이 원래 갖는 기능을 지표로 하면서, 실리카 겔 담체, 이온 교환성 담체, 겔 여과 담체, 킬레이트성 담체, 색소 담지 담체 등을 이용한 크로마토그래피나, 한외 여과, 겔 여과, 투석, 염석 등에 의한 탈염, 농축을 조합함으로써 정제하여 단리할 수 있다. 예를 들면, 고양이 인터페론-ω는 고양이 인터페론-ω의 유전자를 도입한 누에의 견사선 또는 고치실을, 20 mM 인산 완충액(pH 7.0)을 이용하여 균질화하고, 얻어지는 가능성 분획으로 회수할 수 있다. 또한, 얻어진 추출액을, 예를 들면 블루 세파로스 담체에 흡착시키고, 세정한 후 염류를 포함하는 완충액으로 용출함으로써 고양이 인터페론-ω의 순도를 올릴 수 있다.

이와 같이 제조된 사이토카인류는, 종래의 다른 제조 방법으로 제조된 사이토카인과 동일하게 의약 용도나 각종 측정, 진단 용도에 사용할 수 있다. 이 경우, 각종 첨가제를 첨가한 혼합물로서 사용할 수도 있다. 또한, 사이토카인류를 발현한 누에의 조직 또는 고치실은 그대로 또는 가공하여 의료용 또는 의료용 섬유로서 사용할 수 있다. 또한, 효소류를 발현한 재조합 누에의 조직 또는 견사는 그대로 효소 반응에 사용하는 것도 가능하다.

<발명의 개시>

곤충을 이용한 재조합형 단백질의 생산 기술은 활발하게 연구되고 있지만, 외래 단백질 유전자를 조립한 재조합 바큘로바이러스의 불활성화나 봉입의 필요가 있으며, 재조합 바이러스의 접종이 번잡한 등의 과제가 있다. 또한, 재조합 바큘로바이러스를 이용한 누에에서의 외래 단백질의 생산에서는, 대량의 협잡물을 포함하는 체액으로부터 목적 단백질을 추출, 정제하기가 곤란하다는 과제가 있었다.

누에 염색체에 외래 단백질 유전자를 도입하는 재조합 단백질의 제조 기술의검토가 행해지고 있지만, 목적하는 외래 단백질의 생산량은 낮으며, 누에 체액으로부터 목적 단백질을 정제하기가 곤란하다는 과제도 있다.

본 발명은 이러한 상황을 감안하여, 재조합 바큘로바이러스를 이용할 필요가 없으며 생리 활성을 갖는 목적 단백질의 정제를 쉽게 할 수 있는 곤충용의 유전자 공학 재료를 제공함과 동시에, 이 유전자 공학 재료를 이용한 외래 단백질의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자가 누에 견사선 특이적으로 발현하는 프로모터의 하류에 결합한 구조를 갖는 DNA 서열을, 트랜스포존 유래의 DNA를 이용하여 누에 염색체에 도입함으로써, 목적 단백질이 견사선 또는 고치실 중에 생리 활성을 유지한 형태로 생산되는 것을 발견하고, 본 발명에 이르렀다. 본 발명에서는, 재조합 단백질은 대량의 협잡물을 포함하지 않는 견사선 또는 견사로부터 회수하는 것이 가능하기 때문에, 목적 단백질의 정제가 용이하다는 이점이 있다. 또한, 바큘로바이러스와 같은 바이러스를 사용하지 않기 때문에, 바이러스의 불활성화가 불필요하고, 간편하면서 안전하게 재조합 단백질의 생산을 실시하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명자들은 누에 견사선, 특히 후부 견사선이 견 단백질의 70 내지 80 ％를 차지하는 피브로인을 대량으로 생산하고, 견사선 세포밖으로 분비하는 점에 착안하여 예의 검토한 결과, 견사선에서 발현하는 프로모터의 하류에 피브로인 H쇄 유전자의 제1 인트론을 포함하는 5' 말단 부분의 3' 말단측에 외래 단백질 유전자의 5' 말단측을 아미노산 프레임이 일련되도록 연결한 유전자 카세트를 견사선세포에 도입함으로써, 외래 단백질의 생산량이 비약적으로 향상되는 것을 발견하였다. 또한, 외래 단백질 유전자의 3'측에 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분을 아미노산 프레임이 일련되도록 연결한 융합 유전자를 견사선에서 발현하는 프로모터 제어하에 발현시켰을 때에, 외래 단백질이 견사선 세포 밖으로 대량 분비 생산되는 것을 발견하였다. 또한, 외래 단백질 유전자의 5'측에 피브로인 H쇄 유전자의 제1 인트론을 포함하는 5' 말단 부분의 DNA 서열을, 3'측에 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분의 DNA 서열을, 각각 아미노산 프레임이 일련되도록 설계한 유전자 카세트를 제조하여, 이 유전자 카세트를 염색체에 도입한 재조합 누에를 제조한 결과, 이 재조합 누에가 견사 중에 목적 단백질을 대량으로 생산하는 것을 발견하였다.

본 발명자들은 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분의 DNA 서열과 3' 말단 부분의 DNA 서열을 외래 단백질 유전자에 융합시킨 발현용 유전자 카세트를 견사선 세포 등에 도입함으로써, 대량의 외래 단백질을 견사선 세포내, 견사선 세포밖 및 견사에 생산시키는 것에 성공하여, 재조합 바큘로바이러스를 이용하지 않고, 견사선을 이용하여 외래 단백질 생산을 생산시킴으로써 정제를 용이하게 하는 외래 단백질 생산 기술을 확립할 수 있었다.

즉, 본 발명은 염색체에 사이토카인 유전자를 조립한 유전자 재조합 누에를 제조하여, 그의 견사선 또는 고치실로부터 사이토카인을 회수하는 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 사이토카인 유전자가 조립된 유전자 재조합 누에, 누에에의 사이토카인 유전자 도입에 이용되는 유전자 재조합 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 이하에 나타내는 유전자 카세트, 벡터 등 곤충에서의 외래 단백질 생산에 이용 가능한 유전자 공학 재료, 형질 전환체, 이 형질 전환체를 이용한 외래 단백질의 제조 방법 및 외래 단백질을 포함하는 견사에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 1) (1) 견사선에서 발현하는 프로모터와, (2) 상기 (1)의 하류에 연결된 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분을 외래 단백질 구조 유전자의 5'측에 융합시킨 유전자를 포함하는 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트를 제공한다.

본 발명은 또한 2) (1) 견사선에서 발현하는 프로모터와, (2) 상기 (1)의 하류에 연결된 종지 코돈을 포함하지 않는 외래 단백질 구조 유전자의 3'측에 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분을 융합시킨 유전자를 포함하는 외래 단백질의 발현 카세트, 또는 (1) 견사선에서 발현하는 프로모터와, (2) 상기 (1)의 하류에 연결된 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분의 3'측에 외래 단백질 구조 유전자를 융합시킨 유전자를 포함하는 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트를 제공한다.

본 발명은 또한 3) (1) 견사선에서 발현하는 프로모터와, (2) 상기 (1)의 하류에 연결된 종지 코돈을 포함하지 않는 외래 단백질 구조 유전자의 5'측에 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분을 융합시키고, 또한 상기 구조 유전자의 3'측에 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분을 융합시킨 유전자를 포함하는 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트를 제공한다.

본 발명은 또한 4) 상기 1) 내지 3) 중 어느 한 항의 외래 단백질의 발현 유전자 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포용 발현 벡터.

본 발명은 또한 5) 상기 4)에 기재된 곤충 세포용 벡터를 곤충 세포에 도입하는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 6) 상기 1) 내지 3)에 기재된 것 중 어느 하나의 외래 단백질 발현용 유전자 카세트를 염색체에 조립한 재조합 누에를 제조하고, 얻어진 재조합 누에의 견사선 또는 견사에 외래 단백질을 생산시킨 후, 그의 견사선 또는 견사로부터 외래 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 7) 상기 1) 내지 3)에 기재된 것 중 어느 하나의 외래 단백질의 발현 유전자 카세트가 염색체에 도입되고, 또한 견사선 또는 견사에 외래 단백질을 생산하는 능력을 갖는 재조합 누에를 제공한다.

본 발명은 또한 8) 상기 7)에 기재된 누에가 생산한 외래 단백질을 포함하는 견사를 제공한다.

이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예의 기재로 한정되는 것은 아니다.

<참고예>

항바이러스 활성 측정법

인터페론의 생리 활성은 항바이러스 활성으로서 이하의 방법에 의해 행하였다.

바이러스로서 Vesicular Stomatitis Virus(VSV)를 이용하고, 감수성 세포로서는 고양이 인터페론-ω의 경우에는 고양이 Fc9 세포(J. K. Yamamoto 등; Vet. Immnunol. and Immnnopathol.,11, 1-19, 1986)를, 인간 인터페론-β에는 인간 FL 세포를 이용하여 CPE 법에 의해 측정하였다. 즉, 96웰 마이크로플레이트 상에 컨플루언트(confluent)가 될 때까지 37 ℃에서 배양된 감수성 세포에 샘플의 희석액을 상단행에 첨가하고, 하단을 향해 2배씩 단계 희석하였다.

37 ℃에서 20 내지 24 시간 배양한 후, VSV를 첨가하여 37 ℃에서 16 내지20 시간 더 배양하였다. 생존하여 마이크로플레이트 상에 부착되어 있는 감수성 세포를 20 ％ 포르말린을 포함하는 크리스탈 바이올렛 염색액으로 염색하여, 마이크로플레이트 상의 크리스탈 바이올렛량을 570 nm에서의 흡광도를 측정함으로써, 스탠다드와의 비교에 의해 항바이러스 활성을 구하였다. 스탠다드로서는 고양이 인터페론-ω에는 인터캣트(도레이(주) 제조)를 세포 배양용 배지에서 1000 Unit/㎖로 조정한 것을, 인간 인터페론-β에는 페론(도레이(주) 제조)을 세포 배양용 배지에서 1000 Unit/㎖로 조정한 것을 이용하였다. 또한, 샘플은 세포 배양용 배지에서 15배 희석한 후, 항바이러스 활성 측정에 이용하였다.

<실시예 1>누에(Bombyx mori) 게놈 DNA의 제조

5령 3일째의 누에를 해부하여 후부 견사선 조직을 취출하였다. 1×SSC로 세정한 후, DNA 추출 완충액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM EDTA pH 8.0, 100 mM NaCl) 200 ㎕를 첨가하였다. 프로테나아제 K(최종 200 ㎍/㎖)를 첨가하여 조직을 분쇄기에서 충분하게 완전히 분쇄하고, DNA 추출 완충액를 350 ㎕, 10 ％ SDS 60 ㎕를 더 첨가하여 혼합한 후, 50 ℃에서 2 시간 보온하였다. Tris-HCl 포화 페놀 pH 8.0 500 ㎕를 첨가하여 10 분 혼합한 후, 10,000 rpm 15 분 4 ℃에서 원심 분리하여 상청을 회수하였다. 상청에 등량의 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25:24:1)를 첨가하여 혼합한 후, 원심 분리하였다. 다시 페놀/클로로포름/이소아밀알코올을 첨가하여, 원심 분리 후 상청을 회수하였다. 등량의 클로로포름/이소아밀알코올(24:1)을 첨가하여 혼합한 후, 원심 분리한 상청에 다시 클로로포름/이소아밀알코올을 첨가하여, 원심 분리 후 상청을 회수하였다. 얻어진 상청에 1/10량의 3 M 아세트산 나트륨(pH 5.2)을 첨가하여 혼합하고, 2.5배량의 냉에탄올을 더 첨가하여 -80 ℃에서 30 분 정치한 후, 15,000 rpm 10 분 4 ℃에서 원심 분리하여 게놈 DNA를 침전시켰다. 70 ％ 에탄올로 DNA의 침전을 세정한 후, 풍건시켰다. RNase가 들어간 멸균수로 100 ㎍/㎖가 되도록 용해, 희석하여 게놈 DNA 용액을 제조하였다.

<실시예 2>유전자의 제조

사용된 유전자는 기지의 서열을 이용하여, 그의 양쪽 말단 서열의 프라이머를 제조하고, 적당한 DNA 소스를 주형으로 하여 PCR함으로써 얻었다. 프라이머의 말단측에는 이후의 유전자 구축 조작을 위해 제한 효소 부위를 부가하였다.

고양이 인터페론-ω 유전자(GenBank 등록 번호 S62636의 염기 번호 9 내지 593번째)는 고양이 인터페론-ω 유전자를 코딩하는 바큘로바이러스 rBNV100을 주형으로 프라이머 3(서열번호 3)과 프라이머 4(서열번호 4) 2종류의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 얻었다. rBNV100은, 예를 들면 E.Coli(pFeIFN1)(미공연조기 제1633호)로부터 추출한 플라스미드로부터 FeIFN의 유전자를 잘라내어, 누에의 클로닝 벡터(T.Horiuchi 등, Agric. Biol. Chem., 51, 1573-1580, 1987)에 연결하여 제조한 재조합 플라스미드와 누에 다핵체 병 바이러스 DNA를, 누에 수립 세포에 코ㆍ트랜스펙션하여 제조할 수 있다.

세리신-1 유전자의 프로모터(GenBank 등록 번호 ABO07831의 염기 번호 599 내지 1656번째)는 누에 염색체 DNA를 주형으로 프라이머 5(서열번호 5)과 프라이머 6(서열번호 6)의 2종류의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 얻었다. 피브로인 H쇄유전자의 프로모터(GenBank 등록 번호 V00094의 염기 번호 255 내지 574번째)는 누에 염색체 DNA를 주형으로 프라이머 7(서열번호 7)과 프라이머 8(서열번호 8)의 2종류의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 얻었다. 소 성장 호르몬 유전자 폴리 A(pcDNA3.1(+)서열 1011 내지 1253번째)는 플라스미드 pcDNA3.1(+) 벡터(인비트로겐(Invitrogen)사 제조)를 주형으로 프라이머 9(서열번호 9)과 프라이머 10(서열번호 10)의 2종류의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 얻었다.

PCR은 KODplus(도요보(주) 제조)를 이용하여 첨부하는 프로토콜에 따라서 수행하였다. 즉, 각각의 주형을, 플라스미드인 경우에는 10 ng, 염색체 DNA인 경우에는 100 ng 첨가하고, 각 프라이머를 30 pmol, 첨부하는 10×PCR 완충액을 10 ㎕, 1 mH MgCl₂, 0.2 mM dNTPs, 2 단위 K0Dplus가 되도록 각 시약을 첨가하여, 전체량 100 ㎕로 만든다. DNA의 변성 조건을 94 ℃, 15 초, 프라이머의 어닐링 조건을 55 ℃, 30 초, 신장 조건을 68 ℃, 30 초 내지 60 초의 조건에서 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)사의 DNA 서멀 사이클러를 이용하여 30 사이클 반응시켰다.

이들 반응액을 1 내지 1.5 ％ 아가로스겔로써 전기 영동하여, 각각 고양이 인터페론-ω 유전자에서는 약 580 bp, 세리신-1 프로모터에서는 약 1 kbp, 피브로인 H쇄 프로모터에서는 약 320 bp, 소 성장 호르몬 폴리 A에서는 약 230 bp의 DNA 단편을 통상법에 따라서 추출, 제조하였다. 이들 DNA 단편을 폴리뉴클레오티드 키나제(다까라슈죠(주) 제조)에 의해 인산화한 후, Hinc II로 절단한 후 탈인산화 처리한 pUC19 벡터에 다까라슈죠(주)의 DNA Ligation Kit Ver.2를 이용하여 16 ℃,밤새 반응을 행하여 연결하였다. 이들을 이용하여 통상법에 따라서 대장균을 형질 전환하여, 얻어진 형질 전환체에 PCR 단편이 삽입되어 있는 것을, 얻어진 콜로니를 상술한 바와 동일한 조건에서 PCR함으로써 확인하고, PCR 단편이 삽입된 플라스미드를 통상법에 의해서 제조하였다. 이들 플라스미드를 시퀀싱(sequencing)함으로써, 얻어진 단편이 각각의 유전자의 염기 서열인 것을 확인하였다.

<실시예 3>유전자 도입용 플라스미드의 제조

유전자 도입용 플라스미드에는 pigA3GFP(Nature Biotechnology18, 81-84, 2000)를 이용하였다. 즉, 미국 특허 제6218185호에 개시되는 플라스미드 p3E1.2로부터 트랜스포사제를 코딩하는 영역을 제거하고, 그 부분에 A3 프로모터(GenBank 등록 번호 U49854의 염기 번호 1764 내지 2595번째) 및 pEGFP-N1 벡터(클론테크사 제조) 유래의 GFP 및 SV40 유래 폴리 A 부가 서열(GenBank 등록 번호 U55762의 염기 번호 659 내지 2578번째)을 삽입한 벡터가 pigA3GFP이다(Nature Blotechnology18, 81-84, 2000). 그 A3 프로모터의 상류측에 있는 Xho I 부위에 고양이 인터페론-ω 유전자의 발현 단위를 삽입하였다. 도입하는 유전자의 발현 단위로서는, 세리신-1 유전자 프로모터-고양이 인터페론-ω-소 성장 호르몬 폴리 A 부가 서열(서열번호 1), 또는 피브로인 H쇄 유전자 프로모터-고양이 인터페론-ω-소 성장 호르몬 폴리 A 부가 서열(서열번호 2)을 이용하였다. 이하에 구체적인 방법을 나타낸다.

실시예 2에서 제조한 플라스미드로부터, 미리 프라이머 내에 설정해 놓은 제한 효소 부위를 이용하여 유전자를 잘라내었다. 즉, 세리신-1 유전자 프로모터 및피브로인 H쇄 유전자 프로모터에서는 EcoR I, Sal I을 이용하여, 고양이 인터페론-ω 유전자에서는 Sal I, Xba I를 이용하고, 소 성장 호르몬 폴리 A에서는 Xba I, BamH I를 이용하여 인서트 단편을 잘라내어, 1 내지 1.5 ％ 아가로스겔로써 전기 영동한 후, 통상법에 의해 단편을 추출, 정제하였다.

세리신-1 유전자 프로모터 단편 200 ng, 고양이 인터페론-ω 유전자 단편 100 ng, 소 성장 호르몬 폴리 A 50 ng을 혼합하고, 등량의 다까라슈죠(주)의 DNA Ligation Kit Ver.2를 첨가하여 16 ℃에서 밤새 반응을 행하였다. 반응액 0.5 ㎕를 프라이머 11(서열번호 11)과 프라이머 12(서열번호 12)를 이용하여 실시예 2와 동일한 조건에서 신장 조건 2 분으로 PCR을 행한다. 이들 반응액을 1 ％ 아가로스겔로써 전기 영동하여, 증폭한 약 1.9 kb의 DNA 단편(SIB 단편)을 통상법에 따라서 추출, 제조하였다.

동일하게 피브로인 H쇄 유전자 프로모터 단편 70 ng, 고양이 인터페론-ω 유전자 단편 100 ng, 소 성장 호르몬 폴리 A 50 ng을 혼합하고, 등량의 다까라슈죠(주)의 DNA Ligation Kit Ver.2를 첨가하여 16 ℃에서 밤새 반응을 행하였다. 반응액 0.5 ㎕를 프라이머 13(서열번호 13)과 프라이머 12(서열번호 12)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건에서 신장 조건 2 분으로 PCR을 행하였다. 이들 반응액을 1 ％ 아가로스겔로써 전기 영동하여, 증폭한 약 1.15 kb의 DNA 단편(FIB 단편)을 통상법에 따라서 추출, 제조하였다.

이들 단편을 Xho I에 의해 소화한 후, Xho I로 절단한 후 탈인산화 처리한 pigA3GFP에 다까라슈죠(주)의 DNA Ligation Kit Ver.2를 이용하여 16 ℃에서 밤새반응을 행하여 연결하였다. SIB 단편을 삽입한 플라스미드를 pigSIB(도 1), FIB 단편을 삽입한 플라스미드를 pigFIB(도 2)라 하고, 염화세슘법에 의해 초원심 2회로 정제하여 유전자 도입 실험에 이용하였다.

<실시예 4>유전자 재조합 누에의 제조(피브로인 H쇄 유전자 프로모터)

pigFIB와 핼퍼 플라스미드 pHA3PIG(도 3, Nature Biotechnology18, 81-84, 2000)를 각각 200 ng/㎖의 농도로 0.5 mM 인산 완충액(pH 7.0), 5 mM KCl 중에서 제조하여, 15 내지 20 nl를 산란 후 4 시간 이내의 누에란에 대하여 마이크로 주입하였다.

그 누에란으로부터 부화한 유충을 사육하여 얻어진 성충(G0)을 군 내에서 교배하여 얻어진 차세대(G1)를 고양이 인터페론-ω 유전자와 동시에 도입한 녹색 형광 단백질의 형광을 관찰함으로써, 고양이 인터페론-ω 유전자의 염색체에의 도입된 누에를 스크리닝하였다. 유전자 도입 누에가 얻어진 나방구의 비율을 하기 표 1에 나타낸다. 누에란에의 주입을 2회 실시하고, 2회째에서 1 나방구로부터 유전자 재조합 누에가 얻어졌다.

유전자 재조합 누에의 취득 상황(피브로인 중쇄 프로모터)

실험구	주사란 수	부화란 수	성충 수	동포 교배 나방 수	고양이 인터페론-ω유전자 양성 나방구 수
1	1215	292	220	100	0
2	1326	374	250	123	1

그 나방구로부터 얻어진 유전자 도입 누에의 서던 블롯팅의 결과를 도 4에나타낸다. 서던 블롯팅법은 G1 세대의 나방으로부터 염색체 DNA를 추출하여 제한 효소 처리한 샘플을 전기 영동 후, DNA를 전사시킨 멤브레인을 고양이 인터페론-ω 특이적인 핵산 프로브를 이용하여 AlkPhos Direct Labelling and Detection System(아마샴 파마시아(Amersham pharmacia))를 이용한 화학 발광에 의해 검출하였다.

G1 나방 11 마리를 조사한 바, 10 마리의 누에에 고양이 인터페론-ω 유전자가 도입되어 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 5>고양이 인터페론 생산의 확인(피브로인 H쇄 유전자 프로모터)

고양이 인터페론-ω는 항바이러스 활성을 갖기 때문에, 그의 역가로부터 고양이 인터페론-ω의 존재를 알 수 있다. 실시예 4에서 얻어진 양성 나방구의 누에(G1)를 야생 누에와 교배하여 얻어진 세대(G2) 중, 고양이 인터페론-ω 유전자의 도입이 확인된 누에의 5령 유충의 중부 견사선 및 후부 견사선을 적출하였다. 이들을 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0)을 이용하여 균질화하여, 얻어진 추출액을 고양이 세포를 이용한 항바이러스 활성 측정계에 의해 측정하였다. 그 결과, 유전자 도입 누에의 견사선 추출액으로부터는 중부 견사선, 후부 견사선 모두 항바이러스 활성이 검출되었지만, 대조군이 되는 야생 누에의 견사선 추출액으로부터는 검출되지 않았다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.

피브로인 H쇄 프로모터 제어하에서는, 고양이 인터페론-ω는 주로 후부 견사선에 발현되었다고 생각되고, 그 후 피브로인과 동일하게 중부, 전부(前部) 견사선으로 이동한다고 생각되며, 생리 활성의 분포도 그것과 일치하는 것으로 생각된다.한편, 유전자를 도입하지 않은 누에로부터는 항바이러스 활성은 전혀 검출되지 않았다. 이로부터 고양이 인터페론-ω 유전자 도입 누에에서는 고양이 인터페론-ω 단백질이 생리 활성을 유지한 채로 발현하고 있음이 명백해졌다.

<실시예 6>고양이 인터페론-ω의 정제

실시예 5에서 얻어진 G2 세대 5령 누에의 후부 견사선의 추출액으로부터 고양이 인터페론의 정제를 행하였다. 추출액 1 ㎖를 HiTrap Bluesepharose 컬럼(아마샴 파마시아사 제조)에 통과시키고, 그 후 10 ㎖의 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0)로 세정하였다. 계속해서 10 ㎖의 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 8.0)-0.5 M NaCl, 또한 10 ㎖의 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH8.0)-1M NaCl으로 용출하였다. 세정 분획, 0.5 M 용출 분획 및 1 M 용출 분획을 분취하고, 탈염ㆍ농축을 행하여 약 1 ㎖로 만들었다. 추출액 및 각 정제 분획의 항바이러스 활성 및 단백질 정량한 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

블루 세파로스 크로마토에 의한 고양이 인터페론-ω의 정제

	항바이러스 활성(U/ml)	단백질량(mg/ml)	비활성(U/mg)
추출 샘플	523	0.37	1401
통과 세정 분획	23	2.91	8
NaCl 0.5M 용출 분획	1494	0.85	1758
NaCl 1M 용출 분획	6270 이상	0.41	15293 이상

정제 조작에 의해, 1 M 용출 분획에 항바이러스 활성, 즉 고양이 인터페론-ω를 회수할 수 있고, 그의 비활성은 추출액에 비해 약 10배가 되었다.

<실시예 7>유전자 재조합 누에의 제조(세리신 1 프로모터)

pigSIB와 핼퍼 플라스미드를 각각 200 ng/㎖의 농도로 0.5 mM 인산 완충액(pH 7.0), 5 mM KCl 중에서 제조하여, 15 내지 20 nl를 산란 후 4 시간 이내의 누에란에 대하여 마이크로 주입하였다. 그 누에란으로부터 부화한 유충을 사육하여, 얻어진 성충(GO)을 군 내에서 교배하여 얻어진 차세대(G1)로부터 녹색 형광 단백질의 형광을 관찰함으로써, 고양이 인터페론-ω 유전자의 염색체에의 도입을 조사하였다. 2회의 실험에서, 각각 1218 및 1375개의 알에 세리신 프로모터에 연결한 고양이 인터페론-ω 유전자를 포함하는 유전자 재조합 벡터를 마이크로 주입하여, 각각 12 나방구씩의 양성 나방구를 얻을 수 있었다(표 3).

유전자 재조합 누에의 취득 상황(세리신 프로모터)

실험구	주사란 수	부화란 수	성충 수	동포 교배 나방 수	고양이 인터페론-ω유전자 양성 나방구 수
1	1218	500	320	158	12
2	1375	540	500	225	12

얻어진 양성 나방구 중, 1회째 실험의 3 나방구, 2회째 실험의 2 나방구로부터 각각 1 마리씩 유전자의 도입이 확인된 누에(G1)를 선택하여, 그의 견사선으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 이들을 EcoR I 또는 Bgl II 처리한 후, 고양이 인터페론-ω 유전자를 프로브로 하여 서던 블롯팅 해석을 행한 결과를 도 6에 나타낸다. 그 결과, 모든 누에의 게놈 중에 고양이 인터페론-ω 유전자의 도입이 확인되었다. 또한, 검출 위치의 차이에 의해, 나방구에 따라 게놈에의 유전자 도입 부위가 다른 것을 알았다.

다음으로 고양이 인터페론-ω 유전자의 mRNA 발현을 조사하였다. 서던 블롯팅으로 고양이 인터페론-ω 유전자의 도입이 확인된 G1 세대 누에를 임의로 7 마리선택하고, 그의 mRNA를 추출하여 RT-PCR에 의해 고양이 인터페론-ω 유전자 mRNA의 발현을 조사하였다. mRNA의 추출ㆍ정제에는 ISOGEN(닛본진) 및 올리고텍스 dT-30(로슈디아그노스틱스)을, cDNA 합성에는 Ready-To-Go T-Primed First-Strand Kit(아마샴 파마시아)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라서 수행하였다. PCR은 실시예 2의 고양이 인터페론-ω 유전자 취득시의 조건에서 행한 결과, 전체 마리로부터 고양이 인터페론-ω 유전자의 mRNA의 발현이 확인되었다(도 7).

<실시예 8>중부 견사선 및 고치실에서의 고양이 인터페론 생산의 확인

실시예 7에서 얻어진 유전자 재조합 누에 3 마리, 야생 누에 1 마리의 중부 견사선을 적출하고, 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0)를 이용하여 균질화하고, 원심 분리하여 추출액을 제조하였다. 또한, 유전자 재조합 누에 및 야생 누에 유래의 고치 1개씩에 대해서도 동일하게 추출하였다. 이들 추출액의 항바이러스 측정한 결과, 전체 마리가 유전자 재조합 누에의 중부 견사선으로부터 항바이러스 활성이 검출되었고, 야생 누에의 견사선으로부터는 검출되지 않았다. 또한. 유전자 재조합 누에의 고치로부터도 항바이러스 활성이 검출되었다(도 8).

이로부터, 유전자 재조합 누에에서는, 고양이 인터페론-ω가 생리 활성을 유지한 채로 발현하고 있고, 그의 활성은 실로서 토사(吐絲)되더라도 또한 잔존하고 있음을 알았다.

<실시예 9>인간 인터페론-β 유전자 도입용 플라스미드의 제조

인간 인터페론-β 유전자 도입용 플라스미드의 제조는, 실시예 2 내지 4에 나타낸 고양이 인터페론-ω 유전자의 경우와 동일한 방법에 의해 행하였다.

즉, 인간 인터페론-β 유전자를 코딩하는 플라스미드 pORF-hIFN-β(인비보겐 사)를 주형으로 프라이머 14(서열번호 14) 및 프라이머 15(서열번호 15)을 이용하여 PCR을 행하고, 인간 인터페론-β 유전자 단편을 얻었다. 이 단편을 제한 효소 Sal I 및 Xba I 처리한 후, 5' 말단측에 피브로인 H쇄 유전자 프로모터 또는 세리신 유전자 프로모터를, 3' 말단측에 소 성장 호르몬 유전자 유래의 폴리 A 시그널을 연결한 유전자 발현용 서열(피브로인 H쇄 유전자 프로모터-인간 인터페론-β 유전자-소 성장 호르몬 유전자 폴리 A 시그널(FhIB): 서열번호 16, 세리신 유전자 프로모터-인간 인터페론-β-소 성장 호르몬 유전자 폴리 A 시그널(ShIB): 서열번호 17)을 포함하는 플라스미드를 구축하였다.

이들 플라스미드로부터 상기 유전자 발현용 서열 FhIB 및 ShIB를 각각 Xho I 처리에 의해 잘라내어, Xho I로 절단한 후 탈인산 처리한 pigA3GFP에 연결하였다. FhIB 단편을 삽입한 플라스미드를 pigFhIB, ShIB 단편을 삽입한 플라스미드를 pigShIB라 하고, 염화세슘법에 의해 초원심 2회로 정제하여 유전자 도입 실험에 이용하였다.

<실시예 10>인간 인터페론-β 유전자 재조합 누에의 제조

인간 인터페론-β 유전자 재조합 누에의 제조는, 실시예 9에서 제조한 유전자 도입용 플라스미드를 이용하여 실시예 4에 나타낸 고양이 인터페론-ω 유전자재조합 누에의 제조와 동일한 방법에 의해 행하였다.

즉, pigFhIB 및 pigShIB를 각각 헬퍼 플라스미드 pHA3PIG와 동시에 누에란에 대하여 마이크로 주입하여, 얻어진 성충을 교배한 차세대를 스크리닝하였다. 각각 600개씩의 알에 주입한 결과, pigFhIB 도입 누에에서는 7 나방구, pigShIB 도입 누에에서는 5 나방구로부터 녹색 형광 양성의 누에가 얻어지고, PCR에 의해 염색체에의 유전자 도입이 확인되었다. 이들 누에의 견사선 및 견사를 채취하고, 그 추출액을 이용하여 인간 인터페론-β의 생리 활성인 항바이러스 활성을 측정하였다. 값은 샘플 중의 전체 단백질 농도로 보정하여 표기하였다.

인간 인터페론-β 유전자 재조합 누에 조직 추출액 중의 항바이러스 활성

프로모터	나방구 번호 - 개체 번호	항바이러스 활성 (Unit/g 단백질)
		후부 견사선	중부 견사선	견사
피브로인 H쇄	3-1	599723	82591	미실험
	3-2	656110	41545
	11-1	502750	19859
	11-2	115560	39130
세리신	1-1	미실험	53884	42187
	1-2		648953	101713
	5-1		437291	133288
	5-2		541106	92749
정상 누에	검출되지 않음	검출되지 않음	검출되지 않음

검출한계는 약 1000 Unit/g 단백질

그 결과, pigFhIB 도입 누에의 후부 견사선 및 중부 견사선으로부터 항바이러스 활성이 검출되고, pigShIB 도입 누에의 중부 견사선 및 견사로부터 항바이러스 활성이 검출되었기 때문에, 인간 인터페론-β의 누에 견사선 조직에서의 생산이 확인되었다.

<실시예 11>고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자 도입용 플라스미드의 제조

고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자 도입용 플라스미드의 제조는, 실시예 2 내지 4에 나타낸 고양이 인터페론-ω 유전자의 경우와 동일한 방법에 의해 행하였다.

고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자는, 야마모토(Yamamoto) 등의 보고(Gene, 274,263-269, 2001)에 따라서 10 ㎍/㎖의 LPS로 24 시간 자극한 CRFK 세포로부터 얻어진 cDNA로부터, 프라이머 18(서열번호 18) 및 프라이머 19(서열번호 19)을 이용하여 PCR을 행하고, 고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자 단편을 얻었다. 이 단편을 제한 효소 Sal I 및 Xba I 처리한 후, 5' 말단측에 피브로인 H쇄 유전자 프로모터 또는 세리신 유전자 프로모터를, 3' 말단측에 소 성장 호르몬 유전자 유래의 폴리 A 시그널을 연결한 유전자 발현용 서열(피브로인 H쇄 유전자 프로모터-고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자-소 성장 호르몬 유전자 폴리 A 시그널(FGB). 서열번호 20, 세리신 유전자 프로모터-고양이 과립구 콜로니 자극 인자-소 성장 호르몬 유전자 폴리 A 시그널(SGB): 서열번호 21)을 포함하는 플라스미드를 구축하였다.

이들 플라스미드로부터 상기 유전자 발현용 서열 FGB 및 SGB를 각각 Xho I 처리에 의해 잘라내어, Xho I로 절단한 후 탈인산 처리한 pigA3GFP에 연결하였다.FGB 단편을 삽입한 플라스미드를 pigFGB, SGB 단편을 삽입한 플라스미드를 pigSGB라 하고, 염화세슘법에 의해 초원심 2회로 정제하여 유전자 도입 실험에 이용하였다.

<실시예 12>고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자 재조합 누에의 제조

고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자 재조합 누에의 제조는, 실시예 11에서 제조한 유전자 도입용 플라스미드를 이용하여 실시예 4에 나타낸 고양이 인터페론-ω 유전자 재조합 누에의 제조와 동일한 방법에 의해 행하였다.

즉, pigFGB 및 pigSGB를 각각 헬퍼 플라스미드 pHA3PIG와 동시에 누에란에 대하여 마이크로 주입하여, 얻어진 성충을 교배한 차세대를 스크리닝하였다. 각각 600개씩의 알에 주입한 바, pigFGB 도입 누에에서는 3 나방구, pigSGB 도입 누에에서는 7 나방구로부터 녹색 형광 양성의 누에가 얻어지고, PCR에 의해 염색체에의 유전자 도입이 확인되었다. 이들 누에의 견사선 및 견사를 채취하고, 그 추출액을 이용하여 고양이 과립구 콜로니 자극 인자의 생리 활성인 NFS-60 세포(ATCC)의 증식 촉진 활성을 측정하였다.

증식 촉진 활성의 측정은 이하와 같이 행하였다. 우선 NFS-60 세포를 M-CSF 비존재하에 96웰 플레이트에 2×10⁴개씩 접종하고, 30 분 후에 샘플 10 ㎕를 첨가하여 배양을 24 시간 더 행한 후에, Cell Counting Kit-8(도진도(Dojindo))를 이용하여 세포 증식 활성을 측정하였다. 증식 촉진 최대 효과의 50 ％를 제공하는 샘플량(ED50)을 1 Unit/㎖로 하고, 희석 배수를 곱하여 샘플 중의 생리 활성을 산출하였다. 값은 샘플 중의 전체 단백질 농도로 보정하여 표기하였다.

고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자 재조합 누에 조직 추출액 중의 증식 촉진 활성

프로모터	나방구 번호 - 개체 번호	증식 촉진 활성 (Unit/g 단백질)
		후부 견사선	중부 견사선	견사
피브로인 H쇄	9-1	36	검출되지 않음	미실험
	9-2	412	113
	16-1	326	226
	16-2	4030	53
세리신	3-1	미실험	4330	590
	3-2		2277	524
	8-1		3966	846
	8-2		2137	211
정상 누에	검출되지 않음	검출되지 않음	검출되지 않음

검출한계는 약 20 Unit/g 단백질

그 결과, pigFGB 도입 누에의 후부 견사선 및 중부 견사선으로부터 증식 촉진 활성이 검출되고, pigSGB 도입 누에의 중부 견사선 및 견사로부터 증식 촉진 활성이 검출되었기 때문에, 고양이 과립구 콜로니 자극 인자의 누에 견사선 조직에서의 생산이 확인되었다.

<실시예 13>유전자의 제조

이후, 고양이 인터페론-ω을 생리 활성 단백질의 모델로서, 견사선 조직 및 견사에서의 생산량 향상의 검토를 진행하였다.

사용된 유전자는 기지의 서열을 이용하여, 그의 양쪽 말단 서열의 프라이머를 제조하고, 적당한 DNA 소스를 주형으로 하여 PCR을 행함으로써 얻었다. 프라이머의 말단에는 후의 유전자 조작을 위해 제한 효소 절단 부위를 부가하였다.

피브로인 H쇄 프로모터(GeneBank 등록 번호 AF226688의 염기 번호 62118 내지 62437번째: 이하 P 영역)는 누에(Bombyx mori) 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 25(서열번호 25)과 프라이머 26(서열번호 26)의 2종류의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 얻었다.

피브로인 H쇄 프로모터ㆍ피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역(GeneBank 등록 번호 AF226688의 염기 번호 62118 내지 63513번째ㆍ이하 HP 영역)은 누에(Bombyx mori) 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 25(서열번호 25)과 프라이머 31(서열번호 31)의 2종류의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 얻었다.

피브로인 H쇄 상류 프로모터ㆍ피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론 영역(GeneBank 등록 번호 AF226688의 염기 번호 57444 내지 62927번째: 이하 HUP 영역)은 누에(Bombyx mori) 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 33(서열번호 33)과 프라이머 34(서열번호 34)의 2종류의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 얻었다.

고양이 인터페론-ω 유전자(GeneBank 등록 번호 S62636의 염기 번호 9 내지 593번째: 이하 IC 영역)는 고양이 인터페론-ω 유전자를 코딩하는 바큘로바이러스 rBNV100을 주형으로 프라이머 27(서열번호 27)과 프라이머 28(서열번호 28)의 2종류의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 얻었다. rBNV100은, 예를 들면 E. Coli(pFeIFN1)(미공연조기 제1633호)에서 추출한 플라스미드로부터 고양이 인터페론-ω의 유전자를 추출하고, 누에의 클로닝 벡터(T. Horiuchi 등, Agric. Biol.Chem., 51, 1573-1580, 1987)에 연결하여 제조한 재조합 플라스미드와 누에 다핵체 병 바이러스 DNA를 누에 수립 세포에 코ㆍ트랜스펙션하여 제조할 수 있다.

피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역(GeneBank 등록 번호 AF226688의 염기 번호 79201 내지 79995번째: 이하 A 영역)은 누에(Bombyx mori) 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 29(서열번호 29)과 프라이머 30(서열번호 30)의 2종류의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 얻었다.

피브로인 H쇄 C 말단 영역 유전자ㆍ피브로인 H쇄 A 시그널 영역(GeneBank 등록 번호 AF226688의 염기 번호 79099 내지 79995번째: 이하 HA 영역)은 누에(Bombyx mori) 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 32(서열번호 32)과 프라이머 30(서열번호 30)의 2종류의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 얻었다.

β-갈락토시다제(β-gal) 유전자는 pβgal-Basic vector(클론테크(Clontech)사)를 주형으로 프라이머 37(서열번호 37)과 프라이머 38(서열번호 38)의 2종류의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 얻었다.

PCR은 KODplus(도요보(주) 제조)를 이용하여 첨부하는 프로토콜에 따라서 수행하였다. 즉, 각각의 주형을, 누에(Bombyx mori) 게놈 DNA의 경우에는 100 ng, 누에(Bombyx mori) 후부 견사선 cDNA 및 pβgal-Basic vector의 경우에는 10 ng 첨가하고, 각 프라이머를 50 pmol, 첨가되는 10×PCR 완충액을 10 ㎕, 1 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTPs, 2 단위 KODplus가 되도록 각 시약을 첨가하여 전체량 100 ㎕로 만든다. DNA의 변성 조건을 94 ℃, 15 초, 프라이머의 어닐링 조건을 55 ℃, 30 초,신장 조건을 68 ℃, 60 초 내지 300 초의 조건에서 퍼킨-엘머사의 DNA 서멀 사이클러를 이용하여 30 사이클 반응시켰다.

이들 반응액을 1 ％ 아가로스겔로써 전기 영동하여, 각각 P 영역에서는 약 0.3 kbp, HP 영역에서는 약 1.4 kbp., HUP 영역에서는 약 5.5 kbp., IC 영역에서는 약 580 bp., A 영역에서는 약 0.8 bp, HA 영역에서는 약 0.9 bp, β-gal 유전자로서는 약 3.2 kbp의 DNA 단편을 통상법에 따라서 추출, 제조하였다. 이들 DNA 단편을 폴리뉴클레오티드 키나제(다까라슈죠(주) 제조)에 의해 인산화한 후, Hinc II로 절단한 후 탈인산 처리한 pUC19 벡터에 다까라슈죠(주)의 DNA Ligatlon Kit Ver.2를 이용하여 16 ℃에서 밤새 반응을 행하여 연결하였다. 이들을 이용하여 통상법에 따라서 대장균을 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체에 PCR 단편이 삽입되어 있는 것을, 얻어진 콜로니를 상술한 것과 동일한 조건에서 PCR함으로써 확인하고, PCR 단편의 삽입된 플라스미드를 통상법에 의해 제조하였다. 이들 플라스미드를 시퀀싱함으로써, 얻어진 단편이 각각의 유전자의 염기 서열인 것을 확인하였다.

<실시예 14>β-갈락토시다제 발현용 플라스미드의 제조

실시예 13에서 제조한 β-gal 유전자를 갖는 플라스미드를 Sal I과 Hind III에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 프로모터를 갖는 플라스미드로부터 Sal I과 Hind III에 의해 잘라낸 약 0.3 kbp.단편(P 영역)을 삽입하였다. 또한, 이것을 BamH I에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역을 갖는 플라스미드로부터 BamH I에 의해 잘라낸 약 0.8 kbp.단편(A 영역)을 삽입하여, 얻어진 β-gal 유전자를 갖는 플라스미드를 QIAGEN Plasmid Maxi Kit를 이용하여, 첨부하는프로토콜에 따라서 정제하였다. 얻어진 플라스미드를 pPgalA라 명명하고, PCR 및 시퀀싱에 의해 목적하는 플라스미드임을 확인하였다.

동일하게 실시예 13에서 제조한 β-gal 유전자를 갖는 플라스미드를 Sal I과 Hind III에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 프로모터ㆍ피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역을 갖는 플라스미드로부터 Sal I과 Hind III에 의해 잘라낸 약 1.4 kbp.단편(HP 영역)을 삽입하였다. 이것을 BamH I에 의해 더 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 C 말단 영역ㆍ피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역을 갖는 플라스미드로부터 BamH I에 의해 잘라낸 약 0.9 kbp.단편(HA 영역)을 삽입하며, 얻어진 β-gal 유전자를 갖는 플라스미드를 QIAGEN Plasmid Maxi Kit를 이용하여 첨부하는 프로토콜에 따라서 정제하였다. 얻어진 플라스미드를 pHPgalHA라 명명하고, PCR 및 시퀀싱에 의해 목적하는 플라스미드임을 확인하였다.

<실시예 15>유전자 도입용 플라스미드의 제조

유전자 도입용 플라스미드에는 pigA3GFP(Nature Biotechnology18, 81-84, 2000)를 이용하였다. 즉, 미국 특허 제6218185호에 개시되는 플라스미드 p3E1.2로부터 트랜스포사제를 코딩하는 영역을 제거하고, 그 부분에 A3 프로모터(GenBank 등록 번호 U49854의 염기 번호 1764 내지 2595번째) 및 pEGFP-N1 벡터(클론테크사 제조) 유래의 GFP 및 SV40 유래 폴리 A 부가 서열(GenBank 등록 번호 U55762의 염기 번호 659 내지 2578번째)을 삽입한 벡터가 pigA3GFP이다. 그 A3 프로모터의 상류측에 있는 Xho I 부위를 평활화하여 고양이 인터페론-ω 유전자의 발현 카세트를 삽입하였다. 본 실시예에서의 유전자 발현 카세트의 구성은, 피브로인 H쇄 프로모터ㆍ고양이 인터페론-ωㆍ피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역(PㆍICㆍA), 또는 피브로인 H쇄 프로모터ㆍ피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역ㆍ고양이 인터페론-ωㆍ피브로인 H쇄 C 말단 영역ㆍ피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역(HPㆍICㆍHA), 또는 피브로인 H쇄 상류 프로모터ㆍ피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역ㆍ고양이 인터페론-ωㆍ피브로인 H쇄 C 말단 영역ㆍ피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역(HUPㆍICㆍHA) 또는 피브로인 H쇄 프로모터ㆍ피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역ㆍ고양이 인터페론-ωㆍ피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역(HPㆍICㆍA)이다.

이하에 구체적인 방법을 나타낸다.

PㆍICㆍA 컨스트럭트의 제조는 이하의 수법에 의해 행하였다. 실시예 13에서 제조한 고양이 인터페론-ω(IC 영역)을 갖는 플라스미드를 Sal I과 Hind III에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 프로모터를 갖는 플라스미드로부터 Sal I과 Hind III에 의해 잘라낸 약 0.3 kbp.단편(P 영역)을 삽입하였다. 또한, 이것을 BamH I에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역을 갖는 플라스미드로부터 BamH I에 의해 잘라낸 약 0.8 kbp.단편(A 영역)을 삽입하였다. 이 PㆍICㆍA를 갖는 플라스미드를 Asc I로 절단하고, 잘라낸 약 1.7 kbp 단편을 다까라슈죠(주) T4 DNA 폴리머라제에 의해 평활화한 것과, Xho I로 절단한 후 평활화, 탈인산화 처리한 pigA3GFP를 연결하여, PㆍICㆍA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트를 제조하였다. 그 수법을 도 9 및 도 10에 나타낸다.

HPㆍICㆍHA 컨스트럭트의 제조는 이하의 수법에 의해 행하였다. 실시예 13에서 제조한 고양이 인터페론-ω(IC 영역)을 갖는 플라스미드를 Sal I과 Hind III에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 프로모터ㆍ피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역을 갖는 플라스미드로부터 Sal I과 Hind III에 의해 잘라낸 약 1.4 kbp.단편(HP 영역)을 삽입하였다. 또한, 이것을 BamH I에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 C 말단 영역ㆍ피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역을 갖는 플라스미드로부터 BamH I에 의해 잘라낸 약 0.9 kbp.단편(HA 영역)을 삽입하였다. 이 HPㆍICㆍHA를 갖는 플라스미드를 Asc I로 절단하고, 잘라낸 약 2.9 kbp 단편을 다까라슈죠(주) T4 DNA 폴리머라제에 의해 평활화한 것과, Xho I로 절단한 후 평활화, 탈인산화 처리한 pigA3GFP를 연결하여, HPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트를 제조하였다. 그 수법을 도 11 및 도 12에 나타낸다.

HUPㆍICㆍHA 컨스트럭트의 제조는 이하의 수법에 의해 행하였다. HPㆍICㆍHA 컨스트럭트 1 ng을 템플릿으로 프라이머 35(서열번호 35)과 프라이머 36(서열번호 36)의 2종류의 프라이머를 이용한 PCR에 의해, 피브로인 H쇄 제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역ㆍ고양이 인터페론-ωㆍ피브로인 H쇄 C 말단 영역ㆍ피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역 2.1 kbp.를 얻었다. 이것을 Xho I와 Sph I에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 상류 프로모터ㆍ피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론을 갖는 플라스미드로부터 Xho I와 Sph I에 의해 잘라낸 약 5.5 kbp.단편(HUP 영역)을 삽입하였다. 이 HUPㆍICㆍHA를 갖는 플라스미드를 Asc I로 절단하고, 잘라낸 약 7.6 kbp 단편을 다까라슈죠(주) T4 DNA 폴리머라제에 의해 평활화한 것과, Xho I로 절단한 후 평활화, 탈인산 처리한 pigA3GFP를 연결하여, HUPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트를 제조하였다. 그 수법을 도 13 및 도 14에 나타낸다.

HPㆍICㆍA 컨스트럭트의 제조는 이하의 수법에 의해 행하였다. 실시예 13에서 제조한 고양이 인터페론-ω(IC 영역)을 갖는 플라스미드를 Sal I과 Hind III에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 프로모터ㆍ피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역을 갖는 플라스미드로부터 Sal I과 Hind III에 의해 잘라낸 약 1.4 kbp.단편(HP 영역)을 삽입하였다. 또한, 이것을 BamH I에 의해 절단하고, 여기에 피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역을 갖는 플라스미드로부터 BamH I에 의해 잘라낸 약 0.8 kbp.단편(A 영역)을 삽입하였다. 이 HPㆍICㆍA를 갖는 플라스미드를 Asc I로 절단하고, 잘라낸 약 2.8 kbD 단편을 다까라슈죠(주) T4 DNA 폴리머라제에 의해 평활화한 것과, Xho I로 절단한 후 평활화, 탈인산화 처리한 pigA3GFP를 연결하여, HPㆍICㆍA 유전자 카세트를 포함하는 유전자 도입용 컨스트럭트를 제조하였다. 그 수법을 도 15 및 도 16에 나타낸다.

PㆍICㆍA 유전자 도입용 컨스트럭트, HPㆍICㆍHA 유전자 도입용 컨스트럭트, HUPㆍICㆍHA 유전자 도입용 컨스트럭트, HPㆍICㆍA 유전자 도입용 컨스트럭트를 QIAGEN Plasmid Maxi Kit를 이용하여, 첨부하는 프로토콜에 따라서 정제하였다.

<실시예 16>누에 견사선에서의 β-갈락토시다제의 발현

직경 1.6 um의 금 입자를 100 ％ 에탄올로 세정 멸균하여, 멸균 증류수 중에 현탁(60 mg/㎖)하였다. 누에 견사선에의 β-gal 유전자 발현 카세트의 도입은 유전자 총을 이용하여 행하였다. 즉, 금 입자 50 ul(0.3 mg), 실시예 14에서 얻어진 발현용 플라스미드 pPgalA 또는 pHPgalHA 10 ug과, 2.5 M 염화칼슘 50 ul, 0.1 M 스펠미딘 20 ul를 순서대로 혼합하여, 실온에서 30 분간 방치한 후에 원심 분리로 pHgalC가 코팅된 금 입자를 회수하였다. 얻어진 금 입자를 70 ％ 에탄올로 2회 세정 후, 100 ％ 에탄올 50 ul 중에 분산하였다. 마이크로 캐리어 상에 10 ul의 금 입자 현탁액을 적재하여 건조시켰다. 유전자 총은 BI0-RAD 제조 PDS-1000/He를 이용하였다. 5령 3일째의 누에 유충으로부터 적출한 후부 견사선을 PBS로 가볍게 2회 세정한 후, 1 ％ 한천 플레이트 상에 설치하고, 1,100 psi의 압력으로 DNA를 코팅한 금 입자를 분사시켰다. DNA 도입 후, 견사선을 20 ㎖ 그레이스ㆍ인섹트 배지에 옮겨 25 ℃에서 2 일간 배양하였다. 배양 후, 배양 상청 및 견사선 세포를 회수하여 β-gal의 발현을 확인하였다.

발현의 확인은 웨스턴 해석에 의해 행하였다. 견사선 세포를 PBS 중에서 균질화하여 세포 내용물을 추출하였다. 배양 상청 및 세포 추출액을 모두 총 단백질 농도가 1.0 mg/㎖가 되도록 제조하여, 이들을 샘플로 하여 SDS-PAGE를 행하였다. 멤브레인에 블롯팅한 후, ECL PlusTM Western blotting Kit(아마샴 파마시아사 제조)를 이용하여, 첨부하는 프로토콜에 따라서 β-gal 단백질의 검출을 행하였다. 즉, 블롯팅한 멤브레인을 블록킹 용액(5 ％ 스킴 밀크ㆍ0.1 ％ 트윈 20ㆍPBS) 중에서 4 ℃ 밤새 블록킹하였다. 멤브레인을 TPBS(0.1 ％ 트윈 20ㆍPBS)로 2회 세정하고, TPBS로 1000배 희석한 항β-gal 단백질 항체(시그마사 제조)로 실온에서 1 시간 처리하였다. 멤브레인을 TPBS로 2회 세정하고, TPBS로 5 분간 3회 더 세정하였다. 그 후 TPBS로 10000배 희석한 후, HRP 라벨 항 래빗 IgG 항체로 실온에서 1 시간 처리하였다. 멤브레인을 TPBS로 2회 세정하고, TPBS로 5 분간 3회 더 세정한 후, ECL PlusTM Western blotting Detection System(아마샴 파마시아사 제조)의 검출 시약(용액 A+용액 B)을 첨가하였다. 발광을 HyperfilmTMECLTM에 노광, 현상하였다.

pHPgalHA를 도입한 견사선 세포 및 배양 상청에만 β-gal 단백질이 검출되었기 때문에, 세포내에서의 단백질의 합성 또는 유전자의 발현에 피브로인 H쇄 프로모터 이외의 영역, 즉 피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역이 중요한 역할을 하고 있음이 명백해졌다. 또한, 세포밖으로의 분비도 확인되었다. 이 결과를 도 17에 나타낸다.

<실시예 17>유전자 재조합 누에의 제조

실시예 15에 기재된 유전자 도입용 플라스미드와 피기백 트랜스포사제 단백질을 생산하는 DNA(pHA3PIG)를 각 200 ㎍/㎖ 포함한 0.5 mM 인산 완충액(pH 7.0)ㆍ5 mM KCl 용액을 제조하여, 3 내지 20 nl를 산란 후 4 시간 이내의 누에란 500개에 대하여 마이크로 주입하였다.

그 누에란으로부터 부화한 유충을 사육하여 얻어진 성충(GO)을 군 내에서 교배하여 차세대(G1) 해파리 녹색 형광 단백질의 형광을 관찰함으로써, 해파리 녹색 형광 단백질 유전자가 염색체에 도입된 누에를 스크리닝하였다. 그 결과, 해파리 녹색 형광 단백질의 작용에 의해 형광을 발하는 유전자 재조합 누에가 얻어졌다.

<실시예 18>웨스턴 해석에 의한 견사선 조직 중의 재조합 단백질의 발현해석

비형질 전환 누에, 형질 전환 누에(HPㆍICㆍA 형질 전환 누에, HPㆍICㆍHA 형질 전환 누에, HUPㆍICㆍHA 형질 전환 누에)의 후부 견사선 조직을 회수하여, 조직 중에서의 고양이 인터페론 ω의 발현을 웨스턴 해석에 의해 조사하였다. 누에 후부 견사선을 100 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0) 중에서 균질화하고, 원심 분리 후 상청을 회수하여 샘플로 하고, ECL PlusTM Western blotting Kit(아마샴 파마시아사 제조)를 이용하여, 첨부하는 프로토콜에 따라서 고양이 인터페론의 검출을 행하였다. 즉, 블롯팅한 멤브레인을 블록킹 용액(5 ％ 스킴 밀크ㆍ0.1 ％ 트윈 20ㆍPBS) 중 4 ℃에서 밤새 블록킹하였다. 멤브레인을 TPBS(0.1 ％ 트윈 20ㆍPBS)로 2회 세정하고, TPBS로 1000배 희석한 항고양이 인터페론 항체로 실온에서 1 시간 처리하였다. 멤브레인을 TPBS로 2회 세정하고, TPBS로 5분간 3회 더 세정하였다. 그 후 TPBS로 10000배 희석한 후, HRP 라벨 항래빗 IgG 항체로 실온에서 1 시간 처리하였다. 멤브레인을 TPBS로 2회 세정하고, TPBS로 5분간 3회 더 세정한 후, ECL PlusTM Western blotting Detection System(아마샴 파마시아사 제조)의 검출 시약(용액 A+용액 B)을 첨가하였다. 발광을 HypetfilmTMECLTM에 노광, 현상하였다. 그 결과 비형질 전환 누에 및 P·IC·A 컨스트럭트 도입 형질 전환 누에의 후부 견사선 조직으로부터는 시그널이 검출되지 않지 않은 데 반하여, HPㆍICㆍA 컨스트럭트, HPㆍICㆍHA 컨스트럭트 및 HUPㆍICㆍHA 컨스트럭트 도입 형질 전환 누에의 견사선 조직으로부터는 시그널이 검출되었다. 본 실험의 결과로부터, 누에 후부 견사선 세포내에서의 단백질의 합성 또는 유전자 발현의 비약적인 향상으로, 피브로인 H쇄 프로모터 이외의 영역, 즉 피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손ㆍ제1 인트론ㆍ제2 엑손 영역이 중요한 역할을 하는 것이 재확인되었다. 이 결과를 도 18에 나타낸다. 피브로인 H쇄 5' 말단 프로모터 영역 5.5 kbp와 고양이 인터페론 유전자와 피브로인 H쇄의 3' 말단을 포함하는 HUPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 형질 전환 누에에서의 고양이 인터페론의 후부 견사선 조직 내에서의 축적량은, 피브로인 H쇄 5' 말단 프로모터 영역과 고양이 인터페론 유전자와 피브로인 H쇄의 3' 말단을 포함하는 HPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 형질 전환 누에에서의 고양이 인터페론의 후부 견사선 조직 내에서의 축적량보다 높았다. H쇄 5' 말단 상류 영역에 단백질 생산량을 향상시키는 유전자 영역이 있다고 생각된다.

<실시예 19>웨스턴 해석에 의한 견사 중의 재조합 단백질의 측정

다음으로 견사에의 외래 단백질, 즉 고양이 인터페론 ω의 분비를 조사하였다.

비형질 전환 누에, 형질 전환 누에(HPㆍICㆍA 유전자 도입 형질 전환 누에, HPㆍICㆍHA 유전자 도입 형질 전환 누에, HUPㆍICㆍHA 유전자 도입 형질 전환 누에)의 고치를 각 10 mg을 칭량하고, 60 ％ LiSCN 4 ㎖를 첨가하여 교반한 후 밤새 실온에서 정치하여 고치를 용해시켰다. 이것을 8 M 요소ㆍ2 ％ SDSㆍ5 ％ 2-머캅토에탄올로 10배 희석한 것을 샘플로 하고, ECL PlusTM Western blotting Kit(아마샴 파마시아사 제조)를 이용하여 첨부하는 프로토콜에 따라서 고양이 인터페론의 검출을 행하였다. 그 결과를 분자 이메저(imager)(바이오라드사 제조)를 이용하여 시그널 강도를 측정하고, 농도를 이미 알고 있는 고양이 인터페론의 시그널 강도와비교하여 단백질 함량을 측정하였다.

그 결과, 비형질 전환 누에 및 HPㆍICㆍA 유전자 도입 형질 전환 누에의 고치로부터는 시그널이 검출되지 않지 않은 데 반하여, HPㆍICㆍHA 유전자 도입 형질 전환 누에 및 HUPㆍICㆍHA 유전자 도입 형질 전환 누에의 고치로부터는 시그널이 검출되고, 고양이 인터페론 단백질이 견사 중으로 분비되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 그의 함량은 HPㆍICㆍHA 형질 전환 누에에서는 약 0.8 내지 2.0 ％이고, HUPㆍICㆍHA 형질 전환 누에에서는 약 1.8 내지 5.4 ％였다. 이것은 누에 1 마리당 중량으로 환산하면 0.4 내지 2 mg이었다.

본 실험의 결과로부터, 후부 견사선 세포내에서 합성된 단백질의 견사에의 분비에는, 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분이 중요한 역할을 하는 것이 명백해졌다. 이 결과를 도 19에 나타낸다. 피브로인 H쇄의 5' 말단 프로모터 영역 5.5 kbp와 고양이 인터페론 유전자와 피브로인 H쇄의 3' 말단을 포함하는 HUPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 형질 전환 누에에서의 고양이 인터페론의 생산량은, 피브로인 H쇄의 5' 말단 프로모터 영역과 고양이 인터페론 유전자와 피브로인 H쇄의 3' 말단을 포함하는 HPㆍICㆍHA 유전자 카세트를 포함하는 형질 전환 누에에서의 고양이 인터페론의 생산량보다 높았다. H쇄 5' 말단 상류 영역에 단백질 생산량을 향상시키는 유전자 영역이 있다고 생각된다.

<실시예 20>ELISA 법에 의한 견사 중의 재조합 단백질의 측정

견사 중의 고양이 인터페론 ω의 정량을 ELISA법에 의해 행한 비형질 전환 누에, 형질 전환 누에(HPㆍICㆍA 유전자 도입 형질 전환 누에, HPㆍICㆍHA 유전자도입 형질 전환 누에, HUPㆍICㆍHA 유전자 도입 형질 전환 누에)의 고치를 각 10 ㎍ 칭량하고, 60 ％ LiSCN 4 ㎖를 첨가하여 교반한 후, 밤새 실온에서 정치하여 고치를 용해시켰다. 이것을 PBS로 8배 또는 16배로 희석하고, 마이크로타이터 플레이트에 적용하였다. 스탠다드로서 농도를 이미 알고 있는 고양이 인터페론을 PBS로 차례로 희석하여 이용하였다.

그 결과, 견사 중의 고양이 인터페론 ω는 HPㆍICㆍA 유전자 도입 형질 전환 누에에서는 검출되지 않고, HPㆍICㆍHA 유전자 도입 형질 전환 누에에서는 약 1.1 내지 2.2 ％이고, HUPㆍICㆍHA 유전자 도입 형질 전환 누에로서는 약 1.0 내지 4.9％였다.

사이토카인 유전자를 누에 견사선에서 작용하는 프로모터와 연결한 플라스미드 벡터를 제조하고, 누에 염색체로 유전자 도입함으로써 얻어진 유전자 재조합 누에의 견사선 또는 고치실로부터, 사이토카인을 생리 활성을 유지한 채로 대량으로 회수하는 것이 가능해졌다. 또한, 얻어진 사이토카인 추출액은 협잡 단백질이 적고, 종래법과 비교하여 정제가 용이해진다.

피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분의 DNA 서열과 3' 말단 부분의 DNA 서열을 외래 단백질 유전자에 융합시킨 발현용 유전자 카세트를 견사선 세포 등에 도입함으로써, 대량의 외래 단백질을 견사선 세포내, 견사선 세포밖, 또한 견사까지 생산시키는 것이 가능해졌다. 이 새로운 방법에 의해 재조합 바큘로바이러스를 이용하지 않고, 견사선을 이용하여 외래 단백질 생산을 생산시킴으로써 정제가 용이한외래 단백질 생산 기술을 확립하였다.

SEQUENCE LISTING <110>Toray Industries, Inc. <110>National Institute of Agrobiological Science <120>Process for production of physiologically active proteins using recombinant silkworm <130> <160>38 <210>1 <211>1910 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <221>CDS <222>(1071)...(1652) <221>sig_peptide <222>(1071)...(1139) <221>mat_peptide <222>(1140)...(1652) <400>1 ctcgagggtc agaaaccttg ttaaccaata gagccaaata tagttaacac aatagaaatt 60 tatccaaata ttattcgtgt attgtttata gcctttgtca agtcttttac aaggcaagat 120 aataagtaat attccgtgat tggacgtaac atttcccgga agatccttag ccgataagtc 180 gaagagccgc atgtggctag agagacgcgg gtttccgacc actggcttag gcgcttattc 240 cgccataata gatgtacgtg ttcacaatta gcacccgaaa ttcgtaatag ctacgagaag 300 tatcgaatat caaaaatcta tatattaata cgtgaagcaa aaactttgta tcccttttta 360 cgaaaattgc gaggacggag gagtatgaaa tttcccacac ttatagagaa tacagagaag 420 aagtgcacaa tgctaatatt tttttaaaat aatgcataaa agatacttta aatcaataaa 480 gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta 540 ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg 600 tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat agaagtataa 660 aatacaatca taatagtgta caaacttaca attcccaatt aattatagtc gaatttcgac 720 tactgcggga cctctagtat taataattct ctttaaaaaa aaacagagca tcaaatactg 780 tcacaaatgt caagcgggtc tcaacgagcc atgaataaat tagaaatcaa ttaataacat 840 aaaataggca aacaaaataa aaccatttac atagagaacg tttgttgaac aaaaacaata 900 acttgtatac attgtttgca caaatgtttg aaccgaaaat ttattactct ctacgtaagc 960 ttgatcaaac ttcgttttcg tataaaacgc gttggcccaa ccactttggc atagtcgtct 1020 tatcatcggg tctctaagga tcaagcgatc caaagaccgc caacgtcgac atg gcg 1076 Met Ala 1 ctg ccc tct tcc ttc ttg gtg gcc ctg gtg gcg ctg ggc tgc aac tcc 1124 Leu Pro Ser Ser Phe Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Cys Asn Ser 5 10 15 gtc tgc gtg ctg ggc tgt gac ctg cct cag acc cac ggc ctg ctg aac 1172 Val Cys Val Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Gly Leu Leu Asn 20 25 30 agg agg gcc ttg acg ctc ctg gga caa atg agg aga ctc cct gcc agc 1220 Arg Arg Ala Leu Thr Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Pro Ala Ser 35 40 45 50 tcc tgt cag aag gac aga aat gac ttc gcc ttc ccc cag gac gtg ttc 1268 Ser Cys Gln Lys Asp Arg Asn Asp Phe Ala Phe Pro Gln Asp Val Phe 55 60 65 ggt gga gac cag tcc cac aag gcc caa gcc ctc tcg gtg gtg cac gtg 1316 Gly Gly Asp Gln Ser His Lys Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val 70 75 80 acg aac cag aag atc ttc cac ttc ttc tgc aca gag gcg tcc tcg tct 1364 Thr Asn Gln Lys Ile Phe His Phe Phe Cys Thr Glu Ala Ser Ser Ser 85 90 95 gct gct tgg aac acc acc ctc ctg gag gaa ttt tgc acg gga ctt gat 1412 Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Glu Glu Phe Cys Thr Gly Leu Asp 100 105 110 cgg cag ctg acc cgc ctg gaa gcc tgt gtc ctg cag gag gtg gag gag 1460 Arg Gln Leu Thr Arg Leu Glu Ala Cys Val Leu Gln Glu Val Glu Glu 115 120 125 130 gga gag gct ccc ctg acg aac gag gac att cat ccc gag gac tcc atc 1508 Gly Glu Ala Pro Leu Thr Asn Glu Asp Ile His Pro Glu Asp Ser Ile 135 140 145 ctg agg aac tac ttc caa aga ctc tcc ctc tac ctg caa gag aag aaa 1556 Leu Arg Asn Tyr Phe Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys 150 155 160 tac agc cct tgt gcc tgg gag atc gtc aga gca gaa atc atg aga tcc 1604 Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser 165 170 175 ttg tat tat tca tca aca gcc ttg cag aaa aga tta agg agc gag aaa 1652 Leu Tyr Tyr Ser Ser Thr Ala Leu Gln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Lys 180 185 190 tga tctagaccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg 1705 ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 1765 cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 1825 gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 1885 atgcggtggg ctctatggcc tcgag 1910 <210>2 <211>1172 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <221>CDS <222>(333)...(914) <221>sig_peptide <222>(333)...(401) <221>mat_peptide <222>(402)...(914) <400>2 ctcgagggga gaaagcatga agtaagttct ttaaatatta caaaaaaatt gaacgatatt 60 ataaaattct ttaaaatatt aaaagtaaga acaataagat caattaaatc ataattaatc 120 acattgttca tgatcacaat ttaatttact tcatacgttg tattgttatg ttaaataaaa 180 agattaattt ctatgtaatt gtatctgtac aatacaatgt gtagatgttt attctatcga 240 aagtaaatac gtcaaaactc gaaaattttc agtataaaaa ggttcaactt tttcaaatca 300 gcatcagttc ggttccaact ctcaaggtcg ac atg gcg ctg ccc tct tcc ttc 353 Met Ala Leu Pro Ser Ser Phe 1 5 ttg gtg gcc ctg gtg gcg ctg ggc tgc aac tcc gtc tgc gtg ctg ggc 401 Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Cys Asn Ser Val Cys Val Leu Gly 10 15 20 tgt gac ctg cct cag acc cac ggc ctg ctg aac agg agg gcc ttg acg 449 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Gly Leu Leu Asn Arg Arg Ala Leu Thr 25 30 35 ctc ctg gga caa atg agg aga ctc cct gcc agc tcc tgt cag aag gac 497 Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Pro Ala Ser Ser Cys Gln Lys Asp 40 45 50 55 aga aat gac ttc gcc ttc ccc cag gac gtg ttc ggt gga gac cag tcc 545 Arg Asn Asp Phe Ala Phe Pro Gln Asp Val Phe Gly Gly Asp Gln Ser 60 65 70 cac aag gcc caa gcc ctc tcg gtg gtg cac gtg acg aac cag aag atc 593 His Lys Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Thr Asn Gln Lys Ile 75 80 85 ttc cac ttc ttc tgc aca gag gcg tcc tcg tct gct gct tgg aac acc 641 Phe His Phe Phe Cys Thr Glu Ala Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn Thr 90 95 100 acc ctc ctg gag gaa ttt tgc acg gga ctt gat cgg cag ctg acc cgc 689 Thr Leu Leu Glu Glu Phe Cys Thr Gly Leu Asp Arg Gln Leu Thr Arg 105 110 115 ctg gaa gcc tgt gtc ctg cag gag gtg gag gag gga gag gct ccc ctg 737 Leu Glu Ala Cys Val Leu Gln Glu Val Glu Glu Gly Glu Ala Pro Leu 120 125 130 135 acg aac gag gac att cat ccc gag gac tcc atc ctg agg aac tac ttc 785 Thr Asn Glu Asp Ile His Pro Glu Asp Ser Ile Leu Arg Asn Tyr Phe 140 145 150 caa aga ctc tcc ctc tac ctg caa gag aag aaa tac agc cct tgt gcc 833 Gln Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala 155 160 165 tgg gag atc gtc aga gca gaa atc atg aga tcc ttg tat tat tca tca 881 Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Tyr Tyr Ser Ser 170 175 180 aca gcc ttg cag aaa aga tta agg agc gag aaa tga tctagaccgc 927 Thr Ala Leu Gln Lys Arg Leu Arg Ser Glu Lys 185 190 tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 987 ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 1047 gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 1107 aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggcc 1167 tcgag 1172 <210>3 <211>31 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>3 acgcgtcgac atgggcgctg ccctcttcct t 31 <210>4 <211>30 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>4 ctagtctaga tcatttctcg ctccttaatc 30 <210>5 <211>29 <212>DNA <223>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>5 ccggaattcg gtcagaaacc ttgttaacc 29 <210>6 <211>30 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>6 acgcgtcgac gttggcggtc tttggatcgc 30 <210>7 <211>29 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>7 ccggaattcg ggagaaagca tgaagtaag 29 <210>8 <211>30 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>8 acgcgtcgac cttgagagtt ggaaccgaac 30 <210>9 <211>30 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>9 ctagtctaga ccgctgatca gcctcgactg 30 <210>10 <211>30 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>10 cgcggatccg ccatagagcc caccgcatcc 30 <210>11 <211>34 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>11 gacctcgagg gtcagaaacc ttgttaacca atag 34 <210>12 <211>30 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>12 gacctcgagg ccatagagcc caccgcatcc 30 <210>13 <211>29 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>13 gacctcgagg ggagaaagca tgaagtaag 29 <210>14 <211>31 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>14 acgcgtcgac atgaccaaca agtgtctcct c 31 <210>15 <211>30 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>15 ctagtctaga tcagtttcgg 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tac tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag 524 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu 50 55 60 att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc 572 Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80 tat gag atg ctc cag aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct 620 Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95 agc act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aat gtc 668 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110 tat cat cag ata aac cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag 716 Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 aaa gaa gat ttc acc agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa 764 Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt 812 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 cac tgt gcc tgg acc ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac 860 His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175 ttc att aac aga ctt aca ggt tac ctc cga aac tga tctagaccgc 906 Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185 tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 960 ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 1026 gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 1086 aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggcc 1146 tcgag 1151 <210>17 <211>1849 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <221>CDS <222>(1071)...(1631) <221>sig_peptide <222>(1071)...(1133) <221>mat_peptide <222>(1134)...(1631) <400>17 ctcgagggtc agaaaccttg ttaaccaata gagccaaata tagttaacac aatagaaatt 60 tatccaaata ttattcgtgt attgtttata gcctttgtca agtcttttac aaggcaagat 120 aataagtaat attccgtgat tggacgtaac atttcccgga agatccttag ccgataagtc 180 gaagagccgc atgtggctag agagacgcgg gtttccgacc actggcttag gcgcttattc 240 cgccataata gatgtacgtg ttcacaatta gcacccgaaa ttcgtaatag ctacgagaag 300 tatcgaatat caaaaatcta tatattaata cgtgaagcaa aaactttgta tcccttttta 360 cgaaaattgc gaggacggag gagtatgaaa tttcccacac ttatagagaa tacagagaag 420 aagtgcacaa tgctaatatt tttttaaaat aatgcataaa agatacttta aatcaataaa 480 gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta 540 ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg 600 tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat agaagtataa 660 aatacaatca taatagtgta caaacttaca attcccaatt aattatagtc gaatttcgac 720 tactgcggga cctctagtat taataattct ctttaaaaaa aaacagagca tcaaatactg 780 tcacaaatgt caagcgggtc tcaacgagcc atgaataaat tagaaatcaa ttaataacat 840 aaaataggca aacaaaataa aaccatttac atagagaacg tttgttgaac aaaaacaata 900 acttgtatac attgtttgca caaatgtttg aaccgaaaat ttattactct ctacgtaagc 960 ttgatcaaac ttcgttttcg tataaaacgc gttggcccaa ccactttggc atagtcgtct 1020 tatcatcggg tctctaagga tcaagcgatc caaagaccgc caacgtcgac 1070 atg acc aac aag tgt ctc ctc caa att gct ctc ctg ttg tgc ttc tcc 1118 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 act aca gct ctt tcc atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga 1166 Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg 20 25 30 agc agc aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg 1214 Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg 35 40 45 ctt gaa tac tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag 1262 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu 50 55 60 att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc 1310 Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80 tat gag atg ctc cag aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct 1358 Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95 agc act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aat gtc 1406 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110 tat cat cag ata aac cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag 1454 Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 aaa gaa gat ttc acc agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa 1502 Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt 1550 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 cac tgt gcc tgg acc ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac 1598 His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175 ttc att aac aga ctt aca ggt tac ctc cga aac tga cagccatctg 1644 Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185 ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt 1704 cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg 1764 gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 1824 atgcggtggg ctctatggcc tcgag 1849 <210>18 <211>28 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>18 acgcgtcgac atgaagctga ccgccctg 28 <210>19 <211>28 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <223>Synthesized oligonucleotide <400>19 ctagtctaga tcagggcttg gtgaagtg 28 <210>20 <211>1175 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <221>CDS <222>(333)...(917) <221>sig_peptide <222>(333)...(401) <221>mat_peptide <222>(402)...(917) <400>20 ctcgagggga gaaagcatga agtaagttct ttaaatatta caaaaaaatt gaacgatatt 60 ataaaattct ttaaaatatt aaaagtaaga acaataagat caattaaatc ataattaatc 120 acattgttca tgatcacaat ttaatttact tcatacgttg tattgttatg ttaaataaaa 180 agattaattt ctatgtaatt gtatctgtac aatacaatgt gtagatgttt attctatcga 240 aagtaaatac gtcaaaactc gaaaattttc agtataaaaa ggttcaactt tttcaaatca 300 gcatcagttc ggttccaact ctcaaggtcg ac 332 atg aag ctg acc gcc ctg cag ctg ctg ctg tgg cac agc gca ctc tgg 380 Met Lys Leu Thr Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp 1 5 10 15 atg gtg caa gaa gcc acc ccc ttg ggc cct acc agc tcc ctg ccc cag 428 Met Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Thr Ser Ser Leu Pro Gln 20 25 30 agc ttc ctg ctc aag tgc tta gaa caa gtg agg aag gtc cag gct gat 476 Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Val Gln Ala Asp 35 40 45 ggc aca gcg ctg cag gag agg ctg tgc gcc gcc cac aag ctg tgc cac 524 Gly Thr Ala Leu Gln Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His 50 55 60 cct gag gag ctg gtg ctg ctt ggg cac gct ctg ggc atc ccc cag gct 572 Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ala Leu Gly Ile Pro Gln Ala 65 70 75 80 ccc ctg agc agc tgc tcc agc cag gcc ctg cag ctg acg ggc tgc ctg 620 Pro Leu Ser Ser Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu 85 90 95 cgt caa ctc cac agt ggc ctc ttc ctc tac cag ggc ctc ctg cag gcc 668 Arg Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala 100 105 110 ctg gca ggg ata tcc ccc gag tta gcc ccc acc ctg gac atg ctg cag 716 Leu Ala Gly Ile Ser Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Met Leu Gln 115 120 125 ctg gac atc acc gac ttt gct atc aac atc tgg cag cag atg gaa gac 764 Leu Asp Ile Thr Asp Phe Ala Ile Asn Ile Trp Gln Gln Met Glu Asp 130 135 140 gtg ggg atg gcc cct gca gtg ccg ccc acc cag ggc acc atg cca acc 812 Val Gly Met Ala Pro Ala Val Pro Pro Thr Gln Gly Thr Met Pro Thr 145 150 155 160 ttc acc tcg gcc ttc cag cgc cgg gca gga ggc acc ctg gtt gcc tcc 860 Phe Thr Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Ala Ser 165 170 175 aac ctg cag agc ttc ctg gag gtg gca tac cgt gct ctg cgc cac ttc 908 Asn Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Phe 180 185 190 acc aag ccc tga tctagaccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc 960 Thr Lys Pro 195 cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 1020 actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 1080 attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 1140 catgctgggg atgcggtggg ctctatggcc tcgag 1175 <210>21 <211>1873 <212>DNA <213>Artificial sequence <220> <221>CDS <222>(1071)...(1655) <221>sig_peptide <222>(1071)...(1139) <221>mat_peptide <222>(1140)...(1655) <400>21 ctcgagggtc agaaaccttg ttaaccaata gagccaaata tagttaacac aatagaaatt 60 tatccaaata ttattcgtgt attgtttata gcctttgtca agtcttttac aaggcaagat 120 aataagtaat attccgtgat tggacgtaac atttcccgga agatccttag ccgataagtc 180 gaagagccgc atgtggctag agagacgcgg gtttccgacc actggcttag gcgcttattc 240 cgccataata gatgtacgtg ttcacaatta gcacccgaaa ttcgtaatag ctacgagaag 300 tatcgaatat caaaaatcta tatattaata cgtgaagcaa aaactttgta tcccttttta 360 cgaaaattgc gaggacggag gagtatgaaa tttcccacac ttatagagaa tacagagaag 420 aagtgcacaa tgctaatatt tttttaaaat aatgcataaa agatacttta aatcaataaa 480 gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta 540 ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg 600 tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat agaagtataa 660 aatacaatca taatagtgta caaacttaca attcccaatt aattatagtc gaatttcgac 720 tactgcggga cctctagtat taataattct ctttaaaaaa aaacagagca tcaaatactg 780 tcacaaatgt caagcgggtc tcaacgagcc atgaataaat tagaaatcaa ttaataacat 840 aaaataggca aacaaaataa aaccatttac atagagaacg tttgttgaac aaaaacaata 900 acttgtatac attgtttgca caaatgtttg aaccgaaaat ttattactct ctacgtaagc 960 ttgatcaaac ttcgttttcg tataaaacgc gttggcccaa ccactttggc atagtcgtct 1020 tatcatcggg tctctaagga tcaagcgatc caaagaccgc caacgtcgac 1070 atg aag ctg acc gcc ctg cag ctg ctg ctg tgg cac agc gca ctc tgg 1118 Met Lys Leu Thr Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp 1 5 10 15 atg gtg caa gaa gcc acc ccc ttg ggc cct acc agc tcc ctg ccc cag 1166 Met Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Thr Ser Ser Leu Pro Gln 20 25 30 agc ttc ctg ctc aag tgc tta gaa caa gtg agg aag gtc cag gct gat 1214 Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Val Gln Ala Asp 35 40 45 ggc aca gcg ctg cag gag agg ctg tgc gcc gcc cac aag ctg tgc cac 1262 Gly Thr Ala Leu Gln Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His 50 55 60 cct gag gag ctg gtg ctg ctt ggg cac gct ctg ggc atc ccc cag gct 1310 Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ala Leu Gly Ile Pro Gln Ala 65 70 75 80 ccc ctg agc agc tgc tcc agc cag gcc ctg cag ctg acg ggc tgc ctg 1358 Pro Leu Ser Ser Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu 85 90 95 cgt caa ctc cac agt ggc ctc ttc ctc tac cag ggc ctc ctg cag gcc 1406 Arg Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala 100 105 110 ctg gca ggg ata tcc ccc gag tta gcc ccc acc ctg gac atg ctg cag 1454 Leu Ala Gly Ile Ser Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Met Leu Gln 115 120 125 ctg gac atc acc gac ttt gct atc aac atc tgg cag cag atg gaa gac 1502 Leu Asp Ile Thr Asp Phe Ala Ile Asn Ile Trp Gln Gln Met Glu Asp 130 135 140 gtg ggg atg gcc cct gca gtg ccg ccc acc cag ggc acc atg cca acc 1550 Val Gly Met Ala Pro Ala Val Pro Pro Thr Gln Gly Thr Met Pro Thr 145 150 155 160 ttc acc tcg gcc ttc cag cgc cgg gca gga ggc acc ctg gtt gcc tcc 1598 Phe Thr Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Ala Ser 165 170 175 aac ctg cag agc ttc ctg gag gtg gca tac cgt gct ctg cgc cac ttc 1646 Asn Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Phe 180 185 190 acc aag ccc tga cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 1698 Thr Lys Pro 195 ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 1758 gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg 1818 attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggcc tcgag 1873 <210>22 <211>1396 <212>DNA <213>Bombyx mori <400>22 gggagaaagc atgaagtaag ttctttaaat attacaaaaa aattgaacga tattataaaa 60 ttctttaaaa tattaaaagt aagaacaata agatcaatta aatcataatt aatcacattg 120 ttcatgatca caatttaatt tacttcatac gttgtattgt tatgttaaat aaaaagatta 180 atttctatgt aattgtatct gtacaataca atgtgtagat gtttattcta tcgaaagtaa 240 atacgtcaaa actcgaaaat tttcagtata aaaaggttca actttttcaa atcagcatca 300 gttcggttcc aactctcaag atgagagtca aaacctttgt gatcttgtgc tgcgctctgc 360 aggtgagtta attattttac tattatttca gaaggtggcc agacgatatc acgggccacc 420 tgataataag tggtcgccaa aacgcacaga tatcgtaaat tgtgccattt gatttgtcac 480 gcccgggggg gctacggaat aaactacatt tatttattta aaaaatgaac cttagattat 540 gtaacttgtg atttatttgc gtcaaaagta ggcaagatga atctatgtaa atacctgggc 600 agacttgcaa tatcctattt caccggtaaa tcagcattgc aatatgcaat gcatattcaa 660 caatatgtaa aacaattcgt aaagcatcat tagaaaatag acgaaagaaa ttgcataaaa 720 ttataaccgc attattaatt tattatgata tctattaaca attgctattg cctttttttc 780 gcaaattata atcattttca taacctcgag gtagcattct gttacatttt aatacattgg 840 tatgtgatta taacacgagc tgcccactga gtttctcgcc agatcttctc agtgggtcgc 900 gttaccgatc acgtgataga ttctatgaag cactgctctt gttagggcta gtgttagcaa 960 attctttcag gttgagtctg agagctcacc tacccatcgg agcgtagctg gaataggcta 1020 ccagctaata ggtagggaaa acaaagctcg aaacaagctc aagtaataac aacataatgt 1080 gaccataaaa tctcgtggtg tatgagatac aattatgtac tttcccacaa atgtttacat 1140 aattagaatg ttgttcaact tgcctaacgc cccagctaga acattcaatt attactatta 1200 ccactactaa ggcagtatgt cctaactcgt tccagatcag cgctaacttc gattgaatgt 1260 gcgaaattta tagctcaata ttttagcact tatcgtattg atttaagaaa aaattgttaa 1320 cattttgttt cagtatgtcg cttatacaaa tgcaaacatc aatgattttg atgaggacta 1380 ttttgggagt gatgtc 1396 <210>23 <211>6070 <212>DNA <213>Bombyx mori <400>23 tcaagacatc cttgattaag gcagctgccg atattgacat ggacctcgtt cgtgctgcga 60 tagacgactg gccgcgcaga ttgaaggcct gtattcaaaa tcacggaggt cattttgaat 120 aaactttagt gtcataagaa tctatgtttt gttaagttca ttttggtata tgaatggtta 180 cataatgaat aaacttgttt caattatttt acattaaaca tgtgacagaa tttatgacct 240 gactaggtag gtacaaacag cctttttgat attagaaaac taagtaaaat agcctacggt 300 cacatctctt tccgtgggtg tcgttaaagg gcgacttaga gaaccaccaa gaacgtagca 360 gaatcctcag agtgtcatac cagcatacag ccatcgctaa ctgctattta ctggtaatag 420 ggcacattgt aatctcactt aaccatactg tcgggccacc atctagccta tttctgccac 480 gaatcaatcg tgagtgatgg acatagagaa actattagtt gagaagaaaa caagagcact 540 aaaggtttga tattgacaaa aatctacttc gccgtcactc cataggttta ttgtctctca 600 ttagtccaga acagcagtta cagacgtaag cttttacgca caaactacag ggttgctctt 660 tattgtatcg aaaatatggg acctgaataa gggcgatttt gacgcgtcct gcccgcccat 720 tcccgatcct acggacagaa tggcaagcag tcgacgtcgc cccaaacacg tcatttcgga 780 tcctcacgat ccactaacgg tgctttaggt acctcaagca ccggtcatcg ttctcgtcgg 840 acccgtcgct tgcgacgaag ggctcgacga gcaaattaac cctcagacac agcccactga 900 gtttctcgcc ggatcttctc agcgggtcgc gtttccgatc cggtggtaga ttctgcgaag 960 cacggctctt gctaggattc gtgttagcaa cgtcgtcagg tttgagcccc gtgagctcac 1200 ttactagtta aggttacgct gaaatagcct ctcaaggctc tcagctaggt aggaaacaaa 1080 aaaaaaagtc ctgcccttaa caccgttgcg atggcttgtc ttctgcagcg tactgtcgtg 1140 gcagggcggt accgcaccat ctttttcgac gccaccttgt gatctgaagg cgaagatact 1200 cgaccttaat gattgaggca agagcgtaat acctcgcgct ccctagacga gtagatctcg 1260 tggaagattc ggcacacggc acacaaaaat agcttttgag atagccttca atgtaattat 1320 gtttttatat atatttacta gctgacccgg caaacgttgt gttgccttaa ataagatttc 1380 tagggaaatt ctagtgtaga aaaataacct cattcaacca cataatacct cattataacc 1440 aaaaaaaaat aatatccaaa aaataaaaat ataaaataaa tgtttggggt ggacaaccct 1500 tatcacatag gggtatgaaa attagatagt agccgattct cagacctact gaacatacta 1560 ttgatacaca aataaaacca aaaaaacatg gctgaaaaat gtatagtagg tattgtatta 1620 ttaagtgtat aatctatgat gtatatgagt aagtaagaca ggagaccggc ttcgtcctca 1680 tccgtcataa aaaccgtcat aaaaatcaaa cccgcaaaat tataatttgc gtaattactg 1740 gtggctggtg gtaggacctt cttgtgagtc cgcgcgggta ggtaccacca tctgactatt 1800 ctgccgtgaa gcagtaatgg gtttcggttt gaagggcggg acagccgttg taactatact 1860 tgagacctta gaacttatat ctcaatgtgg gtggcgcatt tttttacggt aggcagcggc 1920 ttggctctgc ccctggcatt gctgaagtcc ataggcgacg gttaccactc accatcaggt 1980 gggccgtatg gccgtctgcc tacaaaatca ataaaaaaaa aataaaaaat ttacgttgta 2040 gatgtctatg ggctccagta accacttaac accaggcggg ctgtgagctc gtccacccat 2100 ctaagcaata aaaataaata aatagatagt tgatcagtag tggaccggcg agggcgggag 2160 atcaaattga atttaaaata aaacataatt aaaggaattt gaaactataa actctgaata 2220 ataatttatc gtactacaat tataatattt gattgccatc ttgcaacctt attgcggatc 2280 tgtgaataga aaaaaaaaaa aaatcgggat ggaaaaatag gggttgatcg tataagagtg 2340 aaaattgaga gtaatatgga atttttttat tttaagtcat gacaaaataa aaataagatc 2400 ttgccaaaaa aatttaagtt tattattaaa ttaagtttaa caaataaaaa attggggttg 2460 atcgcagagg ggtgaaaatt tagggtttta tgtatttttg tatgctgtat cataaaaaaa 2520 taaaaacaaa aaataaaaat agggggatga aaaataaatg ttgttcgatt ctcaaccctg 2580 gccgatatgc acgctaagat tcacaaaaat cggtcgagcc gtttcggagg agttcaatca 2640 cgcaccccgt cacacgagaa ttttatttat tagatttaga agagctgaaa gataaatcga 2700 tatttaattt tgtaagttgt cttgatgata cattttttcg tttgtcattc tttcctgcag 2760 ttagaacata atataaaatg caaatgaaaa atagaaatat aataaataat aataaataaa 2820 taataaatat ttactaacaa tcacgctacg ttaactggtc ccgtgataag ttcgtaaaga 2880 acttgtgtta caggtaccag ataacggata taaatgtaag atttttatta tacacataca 2940 tatatttcat atacattcat aaccctggaa aatacattta tatttatcat acaaatatct 3000 tcccttggcg ggattcgaac ccgcgacccc cttgtgtagt gacaatgtca cttaccacta 3060 caccctctgg cattgctggg cgacggtaac cacccaccat taggtgggcc atatgctcgt 3120 ctgcctacaa gggaaataaa aaaaatatcc taatataaat tgcattaatt tttttaaacc 3180 gactttcaat cacaatgaag acagattctc gtcgaagttt gtttttgaaa ctatatcaat 3240 aacttttcat tatccgttct tcgtcttttg tctttttttc gcaaacaaaa cgaacaaaac 3300 gttctaattc gaaagatgtt ttgtacggaa agtttgaata agtgcttaat tgcaagtaac 3360 gtaacaatgt tttagggttc ggtcctcaat aaattcgacc aataaaccat acaaattctt 3420 taacattttt ttaatcttat actagctgac ccggcagact tcgtggtgcc tcaatcgata 3480 aataaaatac ctatgcttct gtataaaata aacataaaac aaacaaaagg aatccgtccg 3540 acgggagaca catcaaagga aaaacatctt ttttattttt ttacctttta aaccttctct 3600 ggacttccac aaataattta agaccaaaat tagccaaatc ggtctagcat tttcgagttt 3660 tagcgagact aacgaacagc aattcatttt tatatacaca gatttatgtt accggggtct 3720 agtgacctaa acgacttcag ctctaacact aggctaactc aggcttagta gcctggtcct 3780 agtgttagat ttgaagtcgt ctaatgcaaa gattattgga tctgatggat ccgtaaggac 3840 gtgtctagag cgtcgacggt gactagctcc tgcgtgatca ggaaaaatgt ggaaagctta 3900 acgattttgt cacattttac ttatcacaac ttgtttttat aataattcgc ttaaatgagc 3960 agctattact taatctcgta gtggtttttg acaaaatcag cttctttaga actaaaatat 4020 catttttttc gtaatttttt taatgaaaaa tgctctagtg ttataccttt ccaaaatcac 4080 cattaattag gtagtgttta agcttgttgt acaaaactgc cacacgcatt tttttctcca 4140 ctgtaggttg tagttacgcg aaaacaaaat cgttctgtga aaattcaaac aaaaatattt 4200 tttcgtaaaa acacttatca 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ttcagaaggt ggccagacga tatcacgggc cacctgataa 5100 taagtggtcg ccaaaacgca cagatatcgt aaattgtgcc atttgatttg tcacgcccgg 5160 gggggctacg gaataaacta catttattta tttaaaaaat gaaccttaga ttatgtaact 5220 tgtgatttat ttgcgtcaaa agtaggcaag atgaatctat gtaaatacct gggcagactt 5280 gcaatatcct atttcaccgg taaatcagca ttgcaatatg caatgcatat tcaacaatat 5340 gtaaaacaat tcgtaaagca tcattagaaa atagacgaaa gaaattgcat aaaattataa 5400 ccgcattatt aatttattat gatatctatt aacaattgct attgcctttt tttcgcaaat 5460 tataatcatt ttcataacct cgaggtagca ttctgttaca ttttaataca ttggtatgtg 5520 attataacac gagctgccca ctgagtttct cgccagatct tctcagtggg tcgcgttacc 5580 gatcacgtga tagattctat gaagcactgc tcttgttagg gctagtgtta gcaaattctt 5640 tcaggttgag tctgagagct cacctaccca tcggagcgta gctggaatag gctaccagct 5700 aataggtagg gaaaacaaag ctcgaaacaa gctcaagtaa taacaacata atgtgaccat 5760 aaaatctcgt ggtgtatgag atacaattat gtactttccc acaaatgttt acataattag 5820 aatgttgttc aacttgccta acgccccagc tagaacattc aattattact attaccacta 5880 ctaaggcagt atgtcctaac tcgttccaga tcagcgctaa cttcgattga atgtgcgaaa 5940 tttatagctc aatattttag cacttatcgt attgatttaa gaaaaaattg ttaacatttt 6000 gtttcagtat gtcgcttata caaatgcaaa catcaatgat tttgatgagg actattttgg 6060 gagtgatgtc 6070 <210>24 <211>99 <212>DNA <213>Bombyx mori <400>24 cgcagttacg actattctcg tcgtaacgtc cgcaaaaact gtggaattcc tagaagacaa 60 ctagttgtta aattcagagc actgccttgt gtgaattgc 99 <210>25 <211>28 <212>DNA <213>Artificial sequence <400>25 ggcgcgccgg gagaaagcat gaagtaag 28 <210>26 <211>26 <212>DNA <213>Artificial sequence <400>26 gtcgaccttg agagttggaa ccgaac 26 <210>27 <211>24 <212>DNA <213>Artificial sequence <400>27 gtcgacatgg cgctgccctc ttcc 24 <210>28 <211>26 <212>DNA <213>Artificial sequence <400>28 tgtggatcct ttctcgctcc ttaatc 26 <210>29 <211>32 <212>DNA <213>Artificial sequence <400>29 ggatcctaat ttttaatata aaataaccct tg 32 <210>30 <211>35 <212>DNA <213>Artificial sequence <400>30 cttggcgcgc cacgacgtag acgtatagcc atcgg 35 <210>31 <211>31 <212>DNA <213>Artificial sequence <400>31 cttgtcgacg 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Claims (41)

1. 염색체에 사이토카인 유전자를 조립한 유전자 재조합 누에를 제조하고, 얻어진 유전자 재조합 누에의 견사선 또는 고치실에서 재조합 사이토카인 단백질을 생산시킨 후, 그 견사선 또는 고치실로부터 사이토카인을 회수하는 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 프로모터의 하류에 결합된 사이토카인 유전자를 염색체에 조립하는 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
3. 제2항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 프로모터가 세리신 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
4. 제2항에 있어서, 견사선 특이적으로 발현하는 프로모터가 피브로인 H쇄 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 유전자를 트랜스포존 유래의 DNA를 이용하여 누에 염색체에 조립하는 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
6. 제5항에 있어서, 사이토카인 유전자가 트랜스포존 유래의 2쌍의 말단 역위 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 트랜스포존 유래의 DNA가 곤충 유래인 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
8. 제7항에 있어서, 트랜스포존이 인시목 곤충 유래의 트랜스포존 piggyBac 유래인 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 유전자가 인터페론 유전자 또는 콜로니 자극 인자 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
10. 제9항에 있어서, 인터페론 유전자 또는 콜로니 자극 인자 유전자가 고양이 인터페론-ω 유전자, 인간 인터페론-β 유전자 또는 고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 고치실로부터 수용성 용매를 이용하여 사이토카인을 추출하는 것을 특징으로 하는 재조합형 사이토카인의 제조 방법.
12. 염색체 중에 사이토카인 유전자가 도입되고, 또한 견사선 또는 고치실에 사이토카인을 생산하는 성질을 갖는 유전자 재조합 누에.
13. 제12항에 있어서, 염색체에 도입된 사이토카인 유전자가 인터페론 유전자 또는 콜로니 자극 인자 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 누에.
14. 제13항에 있어서, 염색체에 도입된 인터페론 유전자 또는 콜로니 자극 인자 유전자가 고양이 인터페론-ω 유전자, 인간 인터페론-β 유전자 또는 고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 누에.
15. 사이토카인 유전자를 견사선 특이적으로 발현하는 프로모터의 하류에 연결하는 것을 특징으로 하는 누에 염색체에의 외래 유전자 도입용 벡터.
16. 제15항에 있어서, 프로모터가 세리신 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 누에 염색체에의 외래 유전자 도입용 벡터.
17. 제15항에 있어서, 프로모터가 피브로인 H쇄 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 누에 염색체에의 외래 유전자 도입용 벡터.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 유전자가 트랜스포존 유래의 2쌍의 말단 역위 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 누에 염색체에의 외래 유전자 도입용 벡터.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 유전자가 인터페론 유전자 또는 콜로니 자극 인자 유전자인 것을 특징으로 하는 누에 염색체에의 외래 유전자 도입용 벡터.
20. 제19항에 있어서, 인터페론 유전자 또는 콜로니 자극 인자 유전자가 고양이 인터페론-ω 유전자, 인간 인터페론-β 유전자 또는 고양이 과립구 콜로니 자극 인자 유전자인 것을 특징으로 하는 누에 염색체에의 외래 유전자 도입용 벡터.
21. (1) 견사선에서 발현하는 프로모터와, (2) 상기 (1)의 하류에 연결된 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분을 외래 단백질 구조 유전자의 5'측에 융합시킨 유전자를 포함하는 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트.
22. (1) 견사선에서 발현하는 프로모터와, (2) 상기 (1)의 하류에 연결된 종지 코돈을 포함하지 않는 외래 단백질 구조 유전자의 3'측에 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분을 융합시킨 유전자를 포함하는 외래 단백질의 발현 카세트, 또는(1) 견사선에서 발현하는 프로모터와, (2) 상기 (1)의 하류에 연결된 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분의 3'측에 외래 단백질 구조 유전자를 융합시킨 유전자를 포함하는 외래 단백질의 발현용 유전자 카세트.
23. (1) 견사선에서 발현하는 프로모터와, (2) 상기 (1)의 하류에 연결된 종지 코돈을 포함하지 않는 외래 단백질 구조 유전자의 5'측에 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분을 융합시키면서, 구조 유전자의 3'측에 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분을 융합시킨 유전자를 포함하는 외래 단백질의 발현 카세트.
24. 제21항 또는 제23항에 있어서, 상기 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분이 피브로인 H쇄 유전자의 제1 엑손, 제1 인트론, 제2 엑손의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 카세트.
25. 제24항에 있어서, 상기 피브로인 H쇄 유전자의 제1 엑손과 제2 엑손을 합친 부분이 피브로인 H쇄 유전자의 분비 시그널 유전자 영역인 것을 특징으로 하는 유전자 카세트.
26. 제25항에 있어서, 상기 (1) 견사선에서 발현하는 프로모터와, (2) 상기 (1)의 하류에 연결된 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분이 서열번호 22 또는 서열번호 23에 나타내는 DNA인 것을 특징으로 하는 유전자 카세트.
27. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분이 시스테인을 코딩하는 코돈을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 카세트.
28. 제27항에 있어서, 상기 피브로인 H쇄 유전자의 3' 말단 부분이 서열번호 24에 나타내는 DNA인 것을 특징으로 하는 유전자 카세트.
29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 견사선에서 발현하는 프로모터가 피브로인 H쇄 유전자의 프로모터, 피브로인 L쇄 유전자의 프로모터 및 세리신 유전자의 프로모터 중에서 선택되는 하나 이상의 프로모터인 것을 특징으로 하는 유전자 카세트.
30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 외래 단백질 발현 카세트의 하류에, 피브로인 H쇄 유전자의 폴리 A 부가 영역, 피브로인 L쇄 유전자의 폴리 A 부가 영역 및 세리신 유전자의 폴리 A 부가 영역 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리 A 부가 영역이 존재하는 것을 특징으로 하는 유전자 카세트.
31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 기재된 외래 단백질 발현 카세트의 양측에, 1쌍의 피기백(piggyBac) 트랜스포존의 역위 반복 서열이 존재하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포의 염색체에의 유전자 도입용 유전자 카세트.
32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 외래 단백질 발현 유전자 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포용 발현 벡터.
33. 제31항에 기재된 곤충 염색체에의 유전자 도입 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충 세포용 유전자 도입 벡터.
34. 제32항 또는 제33항에 기재된 곤충 세포용 벡터를 곤충 세포에 도입하는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 제조 방법.
35. 제34항에 있어서, 곤충 세포가 인시목 곤충 유래인 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 제조 방법.
36. 제35항에 있어서, 곤충 세포가 누에(Bombyx mori) 유래인 것을 특징으로 하는 외래 단백질 제조 방법.
37. 제36항에 있어서, 곤충 세포가 누에(Bombyx mori)의 견사선 세포인 것을 특징으로 하는 외래 단백질 제조 방법.
38. 제33항에 기재된 곤충 세포용 유전자 도입 벡터와 피기백(piggyBac) 트랜스포사제의 DNA 전이 활성을 이용하여, 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 외래 단백질 발현용 유전자 카세트를 염색체에 조립한 재조합 누에를 제조하고, 얻어진 재조합 누에의 견사선 또는 견사에 외래 단백질을 생산시킨 후, 그 견사선 또는 견사로부터 외래 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 제조 방법.
39. 제38항에 있어서, 곤충 세포용 유전자 도입 벡터와 피기백(piggyBac) 트랜스포사제를 생산하는 DNA 또는 RNA를 동시에 누에란에 마이크로 주입함으로써 외래 단백질 발현용 유전자 카세트를 염색체에 조립한 재조합 누에를 제조하는 것을 특징으로 하는 외래 단백질 제조 방법.
40. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 외래 단백질의 발현 유전자 카세트가 염색체에 도입되어 있고, 또한 견사선 또는 견사에 외래 단백질을 생산하는 능력을 갖는 재조합 누에.
41. 제40항에 기재된 재조합 누에가 생산하는 외래 단백질을 포함하는 견사.