CN106480199A - 单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法 - Google Patents

单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。该法操作技术要求低，缩短了获得基因型纯合的转基因家蚕所需的时间，所得纯合品系后代的转基因表达率均在98％以上。应用本发明进行转羊毛KAP5.4基因家蚕纯合品系的筛选和培育，在3代内就能筛选出所需的纯合系，大大缩短了育种周期。因此，本发明可高效筛选获得单拷贝转基因家蚕纯合品系，为转基因家蚕品种的培育提供重要的技术支撑，若广泛应用于转基因家蚕品种培育研究可为培育综合经济性状优良的转基因家蚕品种奠定坚实的基础。

Description

单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法
技术领域
本发明属于家蚕品种选育技术研究领域，尤其涉及一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法。
背景技术
家蚕丝作为纺织材料虽然吸湿性好、易于加工、光泽柔和、舒适性佳，但也存在易生折皱、易变黄、易褪色等缺陷，这些缺陷严重制约了丝织产品品质的提升和附加值的提高。如果能有效地克服蚕丝这些固有的缺点，将会大大改善蚕丝的品质，推动丝绸织物在更高端、更广泛方面的应用。羊毛角蛋白是毛囊中表达最丰富的蛋白，并且在很大程度上决定了羊毛纤维的特性。研究表明，羊毛中角蛋白相关蛋白(keratin-associated proteins，KAP)含量越丰富，羊毛的光泽就越好；该蛋白的数量与含量是决定羊毛品质的一个重要因素。2013年，西南大学赵爱春教授研究小组将羊毛KAP5.4基因成功转入家蚕基因组，该家蚕品种后部丝腺中表达了含有羊毛KAP蛋白的丝素蛋白，融合蛋白分泌到丝腺形成了含羊毛KAP蛋白的复合蚕丝，在蚕丝的改性方面做了重要的创新研究。申请人与西南大学合作进行该转羊毛KAP5.4基因家蚕的后期开发与利用。通过分析，外源转入的KAP5.4基因位于5号染色体。后续杂交等遗传分析也表明KAP5.4基因在该家蚕品系中是单基因遗传(即外源基因为单拷贝插入)，且只位于一条染色体上，KAP5.4基因的基因型为+-。另外，在转羊毛KAP5.4基因家蚕品种的后期培育中，为了提高综合经济性状，通常会结合杂交、回交等常规品种培育方式进行，这都会使外源转入的KAP5.4基因的基因型为+-，即杂合子，均需要获得纯合品系，以保证后代性状不发生分离。
获得转基因生物纯合体(或纯合系)的方法多种多样，这主要根据前期转基因方法的不同而确定，主要有通过筛选标记筛选获得、设计特异PCR引物进行扩增筛选获得等。目前，国内未见关于能够高效筛选出转基因家蚕纯合品系的相关研究报道。使用上述方法进行转基因家蚕纯合品系的筛选与培育存在以下一些问题：(1)其他物种的转基因纯合系筛选方法不能完全适用于转基因家蚕纯合子筛选；(2)技术要求高，费时、费力又需要消耗大量资金。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，该法可高效筛选获得单拷贝转基因家蚕纯合品系，为培育综合经济性状优良的转基因家蚕品种奠定坚实的基础。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。
上述单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，按以下步骤操作进行：
<1>使用非转基因蚕品种与单拷贝转基因家蚕阳性个体杂交，获得杂交F1代；
<2>浸酸、催青F1代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾区进行饲养；
<3>饲养步骤<2>挑选出的F1代蛾区至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得杂交F2代；
<4>浸酸、催青杂交F2代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾圈进行饲养，淘汰转入标记基因不表达的蛾圈；
<5>饲养步骤<3>挑选出的F2代蛾圈至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得自交F3代；自交结束后，对应的雄蛾再与常规非转基因品种雌蛾重交获得测交系，命名为F3代测交，测交系与自交系的各个蛾圈的蚕卵均一一对应编号；自交对应雌蛾产完卵以后也一一编号，每个雌蛾用剪刀一分为二，一半装入离心管放-20℃冻存，另一半送检毒室进行常规检疫；
<6>浸酸、催青自交F3代和对应的测交系蚕卵至转青，通过筛选标记筛选，检测雄蛾的纯合性；自交和对应测交系标记基因表达率均为100％的蛾圈所对应的父本是纯合子，保留下该自交蛾圈卵，淘汰任何标记基因表达率不为100％的蛾圈；
<7>选取步骤<6>中保留蛾圈所对应的母蛾编号，取出步骤<5>中对应编号冻存的离心管，提取其中母蛾的基因组DNA，然后利用特异引物进行PCR扩增，根据扩增结果保留对应编号的卵；
<8>保留根据步骤<6>和<7>筛选出父本和母本均为纯合子所产下的蛾圈，饲养继代，筛选出的自交F3代即为该单拷贝转基因家蚕纯合品系。
步骤<7>中的特异性引物是根据外源转入基因在染色体上插入位点上下游的基因组序列以及转基因结构序列设计的PCR引物F、R和LR。
转基因家蚕为转羊毛KAP5.4基因家蚕。
步骤<7>中的特异引物包括KAP5.4基因鉴定引物和piggyBac转座子结合引物，它们分别具有以下碱基序列：
KAP5.4基因鉴定引物：
F：5’-CTGTAGGAGTATCAAGAACGGAGATG-3’，
R：5’-GACAGACAGATATAGGGACAGAGAAAGC-3’；
piggyBac转座子结合引物：
LR：5’-CAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGC-3’。
针对目前使用筛选标记筛选转基因家蚕纯合子周期长、不够准确等缺点，以及使用特异PCR引物进行检测筛选技术要求高、工作量大而集中、试剂耗材等费用高、假阳性检测结果导致筛选不正确等不足，发明人建立了一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。该法操作技术要求低，缩短了获得基因型纯合的转基因家蚕所需的时间(仅需3代即可筛选出纯合子、4代可准确无误的确定出转基因纯合品系)，所得纯合品系后代的转基因表达率均在98％以上(理论值为100％，但因为一些环境等因素会造成基因沉默等不表达的情况)。应用本发明进行转羊毛KAP5.4基因家蚕纯合品系的筛选和培育，在3代内就能筛选出所需的纯合系，快速、高效、技术难度系数低，大大缩短了育种周期。因此，本发明可高效筛选获得单拷贝转基因家蚕纯合品系，为转基因家蚕品种的培育提供重要的技术支撑；若广泛应用于转基因家蚕品种培育研究，可为培育综合经济性状优良的转基因家蚕品种奠定坚实的基础。
与现有技术相比，本发明的突出优点在于：
<1>若仅使用标记基因筛选，则只看得到表现型，难以排除杂合子，使自交后代常常分离出阴性个体，难以选育出稳定的转基因家蚕品种。而本发明采用标记基因筛选再结合测交测试结果筛选，将表现型与基因型有机结合，可大幅提高转基因纯合系筛选的效率。
<2>许多筛选转基因纯合系的方法主要利用特异引物对所有亲本进行PCR检测，技术要求高、工作量大。然而，家蚕所产的卵进行即时浸酸后，便开始发育，大约8天就孵化，如果仅利用分子检测方法进行转基因家蚕纯合系筛选，8天时间难以完成所有亲本检测；如果将所产的卵进行冷藏，待分子检测的结果出来后再进行下一代的筛选，会大大延长筛选周期。而本发明利用简单的测交测试雄性亲本的基因型，有效排除了♀(+/+)×♂(+/-)和♀(+/-)×♂(+/-)的交配方式，制20蛾共排除了16蛾，排除率为80％，而且雄性亲本不需要再进行PCR检测，使PCR检测的工作量减为原来的1/10(按传统方法，制20个蛾圈需要检测40只蛾，本发明通过排除只需要检测4只蛾)，大大减少了分子检测的工作量和费用。
<3>本发明能保证筛选出的纯合子基因型的纯合性。准确测试出转基因载体的插入位点是开展后续PCR检测筛选纯合子的前提，这些实验过程中的多个步骤容易出现假阳性结果，将导致筛选失败或错误。发明人也遇到此类问题，设计的PCR引物要么扩增不出来；要么不特异(多次PCR反应并电泳检测，发现同一样品可扩增出4-5种大小不同的DNA片段)，扩增出来的结果跟预期的差距很大、难以说明问题。经过反复研究锁定了本发明的引物，该引物可扩增出目的基因，虽然扩增的结果也不够理想，尤其是325bp的片段很弱，但是试验表明它具备特异性。同时，发明人通过后续步骤：同一蛾圈内除自交留种的14只雌蛾外，其余个体均与非转基因个体杂交(测交)，然后结合筛选标记筛选，依据调查的转基因表达比率，能有效证明前期PCR检测结果的正确与否，确保筛选出的纯合子准确无误。
附图说明
图1是本发明根据KAP5.4基因在五号染色体上的插入位点设计PCR引物F、R和LR的扩增原理图。
图2是不同个体应用图1扩增原理扩增结果示意图。
图3是应用本发明高效获得转羊毛KAP5.4基因家蚕纯合品系的流程图。
图4是转青期调查标记基因(红色荧光)表达结果图，图中：A所有个体为阳性，B阳性∶阴性＝1∶1，C阳性∶阴性＝3∶1，箭头指示荧光信号。
图5是挑选出的雌蛾基因组的PCR检测结果，图中：泳道M：DL-2000 Marker；泳道1：非转基因蚕品种932；泳道2：932×KAP5 F3 2号雌蛾；泳道3：932×KAP5 F3 5号雌蛾；泳道4：932×KAP5 F3 10号雌蛾；泳道5：932×KAP5 F3 13号雌蛾；箭头表示目的片段大小。
具体实施方式
单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法
一、基本操作步骤
<1>使用非转基因蚕品种与单拷贝转基因家蚕阳性个体杂交，获得杂交F1代；
<2>浸酸、催青F1代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾区进行饲养；
<3>饲养步骤<2>挑选出的F1代蛾区至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体(基因型为+-)饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得杂交F2代；
<4>浸酸、催青杂交F2代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾圈进行饲养，淘汰转入标记基因不表达的蛾圈；
<5>饲养步骤<3>挑选出的F2代蛾圈至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体(基因型为+-或++)饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得自交F3代；自交结束后，对应的雄蛾再与常规非转基因品种雌蛾重交获得测交系，命名为F3代测交，测交系与自交系的各个蛾圈的蚕卵均一一对应编号；自交对应雌蛾产完卵以后也一一编号，每个雌蛾用剪刀一分为二，一半装入离心管放-20℃冻存，另一半送检毒室进行常规检疫。例如，自交的1号雌蛾与1号雄蛾产生的卵编为F3代自交1号蛾圈卵；1号雄蛾对应的测交编号为F3代测交1号卵；1号雌蛾对应的离心管和蛾袋编号均为1号；共制自交和测交种各28个蛾圈；
<6>浸酸、催青自交F3代和对应的测交系蚕卵至转青，通过筛选标记筛选，检测雄蛾的纯合性；自交和对应测交系标记基因表达率均为100％的蛾圈所对应的父本是纯合子，保留下该自交蛾圈卵，淘汰任何标记基因表达率不为100％的蛾圈；
<7>选取步骤<6>中保留蛾圈所对应的母蛾编号，取出步骤<5>中对应编号冻存的离心管，提取其中母蛾的基因组DNA，然后利用特异引物进行PCR扩增，根据扩增结果保留对应编号的卵；其中特异性引物事先根据外源转入基因在染色体上插入位点上下游的基因组序列以及转基因结构序列(pBacL转座子臂)设计的PCR引物F、R和LR。
<8>保留根据步骤<6>和<7>筛选出父本和母本均为纯合子所产下的蛾圈，饲养继代，筛选出的自交F3代即为该单拷贝转基因家蚕纯合品系。
二、分析验证方法
分析后代是否分离，验证按本发明选出的纯合品系：催青上述选出的纯合系蚕卵至转青，调查标记基因表达情况，一个蛾圈内所有个体均有表达；继续饲养该蛾圈的所有个体至化蛾，自交14蛾留种，剩下的蛾与常规非转基因蚕品种进行杂交并制种，让这些种孵化至转青，调查标记基因表达情况，所有自交和杂交的蚕卵均为阳性。
三、转羊毛KAP5.4基因家蚕的应用
1.转基因个体筛选方式
羊毛KAP5.4基因是通过piggyBac转座子转入家蚕基因组，piggyBac转座载体基本表达元件如附图1所示。标记基因红色荧光蛋白(DsRed)基因与目的基因KAP5.4位于同一个转座载体内。通过检测红色荧光蛋白的表达与否来判断是否为转基因个体。红色荧光蛋白发出的信号可在装有相应波长滤光片的荧光显微镜下检测。如果为转基因蚕个体，其胚胎发育后期、小蚕期、大蚕期、蛹期和蛾期的眼睛内均能检测到红色荧光信号(张阳，转羊毛KAP基因家蚕茧丝改性研究[D].重庆，西南大学，2013：21-22)。
2.932×KAP5转基因纯合品系的获得
<1>根据KAP5.4基因在五号染色体上的插入位点设计PCR引物F、R和LR。
KAP5.4基因鉴定引物：
F：5’-CTGTAGGAGTATCAAGAACGGAGATG-3’(序列表SEQ.ID.No.1)
R：5’-GACAGACAGATATAGGGACAGAGAAAGC-3’(序列表SEQ.ID.No.2)
piggyBac转座子结合引物：
LR：5’-CAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGC-3’(序列表SEQ.ID.No.3)
注意：不同个体应用图1扩增原理扩增结果不同，如图2所示，非转基因个体可利用F、R扩增出染色体上630bp的片段；因转座载体特别大，纯合子利用F、R无法扩增出全长转座载体片段，所以只能利用R、LR扩增出325bp的片段；而杂合子可同时扩增出630bp和325bp的片段。
<2>使用常规非转基因蚕品种932与转羊毛KAP5.4基因家蚕(命名为KAP5)阳性个体杂交，获得932×KAP5 F1代，大蚕期调查其转基因表达情况。在本次调查中932×KAP5 F1代所有个体均检测到了红色荧光，说明其亲本的杂交方式为非转基因♀(-/-)×转基因♂(+/+)，所获得的F1代基因型为转基因+/-。
<3>调查转基因表达情况结束后淘汰阴性个体(本次调查中没有发现)，挑选出阳性个体(其基因型为+/-)，饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得932×KAP5 F2。
<4>浸酸、催青932×KAP5 F2蚕卵至转青，挑选检测到红色荧光信号的蛾圈进行饲养，淘汰检测不到红色荧光信号的蛾圈。
<5>饲养挑选出的932×KAP5 F2至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰阴性的个体(基因型为-/-)，挑选出转基因阳性个体(其基因型为+/-或+/+)。在本次试验中调查了多个蛾圈，932×KAP5 F2同一个蛾区内转基因阳性个体与阴性个体的比率均为或接近3∶1的比率，符合孟德尔单基因遗传分离比。
<6>饲养挑选出的932×KAP5 F2阳性个体至化蛾，然后雌雄个体自交获得932×KAP5 F3。自交结束后，对应的雄蛾再与常规非转基因品种雌蛾重交获得测交系，命名为932×KAP5测交，测交系与自交系的各个蛾圈均一一对应编号；自交对应雌蛾产完卵以后也一一编号，每个雌蛾用剪刀一分为二，一半装入离心管放-20℃冻存，另一半送检毒室进行常规的检疫。例如，自交的1号雌与1号雄产生的卵编为自交1号蛾圈；1号雄对应的测交编号为932×KAP5 F3测交1号；1号雌对应的离心管和蛾袋编号均为1号。共制得合格的自交和测交种各20个蛾圈。
<7>浸酸、催青932×KAP5 F3和对应的测交系蚕卵至转青，通过荧光显微镜筛选，可以调查出一个蛾圈内阳性与阴性的比率，由此推测出雄蛾的纯合性。自交和对应测交系荧光表达率均为100％的蛾圈所对应的父本是纯合子，保留下该蛾圈，淘汰任何荧光表达率不为100％的蛾圈。调查结果见图4和表1。
表1 932×KAP5 F3和对应的测交蚕卵转青期荧光筛查结果
<8>选取步骤<7>中保留蛾圈所对应的母蛾编号，取出对应编号冻存的离心管中的蛾(2、5、10、13号蛾)，提取并纯化其中母蛾的基因组DNA作为模板，然后利用步骤<1>的特异引物进行PCR扩增，通过检测可以判断该雌蛾是否为纯合子。另同时提取非转基因蚕品种932母蛾基因组，作为对照。扩增引物为F、R、LR三个引物组合进行，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，63℃40s，72℃50s(30个循环)；72℃10min；4℃保存至电泳检测。检测使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行。结果见图5。从图5可以看出对照932扩增出了一条630bp的片段；932×KAP5 F3 2号、5号和10号雌蛾扩增出了一条630bp和325bp的片段，说明为杂合子；932×KAP5 F3 13号雌蛾扩增出了一条325bp的片段，说明为纯合子。但扩增效果不是很好，特别是325bp的片段检测信号很弱，但通过该结果可进一步排除表现型为♀(+/-)×♂(+/+)的后代。
<9>保留13号蛾产下的卵，饲养继代。
3.分析验证
通过分析后代分离情况，验证13号蛾：催青13号蛾产下的蚕卵至转青，在荧光显微镜下观看荧光蛋白表达情况，一个蛾圈内所有个体均有表达。继续饲养该蛾圈的所有个体至化蛾，自交14蛾留种，为932×KAP5 F4。剩下的所有蛾分别与常规非转基因蚕品种进行杂交并制种(9KAP5 F4测交)，让这些种孵化至转青，在荧光显微镜下观看荧光表达信号，所有自交和杂交的蚕卵均能表达荧光蛋白标记基因。证明13号雌蛾和雄蛾均为纯合子的，所产的后代也是纯合子，由此可确立为转基因KAP5.4基因家蚕纯合品系，可与经济性状优良的非转基因蚕品种杂交制备一代杂交生产用种。
4.对照
对照品系仅使用筛选标记筛选，连续累代单蛾饲养筛选至第六代均未获得纯合品系。各代的转基因表达率(同一蛾区内转基因个体与整个蛾区所有个体的比值)见表2。从表2可以看出，仅使用筛选标记筛选进行该转基因家蚕的选育具有盲目性，不够准确，即使使用上一代转基因表达率为100％的蛾区进行传代，下一代依然会分离。
表2仅使用筛选标记进行筛选选育932×KAP5各个世代的转基因表达率
发明人同时应用上述方法进行转羊毛角蛋白4.3基因家蚕品种纯合品系的筛选研究，同样获得了成功。另外，因KAP3.2的在家蚕基因组中的插入位点尚未确定，无法设计特异引物测试该品系雌蛾的纯合性，但采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交和后期与常规品种杂交检测相结合来进行转羊毛角蛋白3.2基因家蚕纯合品系的筛选，也取得了一定的结果。说明该发明可广泛应用于单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区蚕业技术推广总站
西南大学
<120> 单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<400> 1
ctgtaggagt atcaagaacg gagatg 26
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<400> 2
gacagacaga tatagggaca gagaaagc 28
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<400> 3
cagtgacact taccgcattg acaagcacgc 30

Claims (5)

1.一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，其特征在于采用累代单蛾区饲养、标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾进行PCR扩增和后期与常规品种杂交检测相结合来进行单拷贝转基因家蚕纯合品系的筛选。
2.根据权利要求1所述的单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，其特征在于按以下步骤操作进行：
<1>使用非转基因蚕品种与单拷贝转基因家蚕阳性个体杂交，获得杂交F1代；
<2>浸酸、催青F1代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾区进行饲养；
<3>饲养步骤<2>挑选出的F1代蛾区至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得杂交F2代；
<4>浸酸、催青杂交F2代蚕卵至转青，挑选转入标记基因有表达的蛾圈进行饲养，淘汰转入标记基因不表达的蛾圈；
<5>饲养步骤<3>挑选出的F2代蛾圈至大蚕期，调查同一蛾圈内所有个体标记基因表达分离比，调查结束后淘汰不表达所转入基因的个体，挑选出目的基因有表达的个体饲养至化蛾，然后雌雄个体自交获得自交F3代；自交结束后，对应的雄蛾再与常规非转基因品种雌蛾重交获得测交系，命名为F3代测交，测交系与自交系的各个蛾圈的蚕卵均一一对应编号；自交对应雌蛾产完卵以后也一一编号，每个雌蛾用剪刀一分为二，一半装入离心管放-20℃冻存，另一半送检毒室进行常规检疫；
<6>浸酸、催青自交F3代和对应的测交系蚕卵至转青，通过筛选标记筛选，检测雄蛾的纯合性；自交和对应测交系标记基因表达率均为100％的蛾圈所对应的父本是纯合子，保留下该自交蛾圈卵，淘汰任何标记基因表达率不为100％的蛾圈；
<7>选取步骤<6>中保留蛾圈所对应的母蛾编号，取出步骤<5>中对应编号冻存的离心管，提取其中母蛾的基因组DNA，然后利用特异引物进行PCR扩增，根据扩增结果保留对应编号的卵；
<8>保留根据步骤<6>和<7>筛选出父本和母本均为纯合子所产下的蛾圈，饲养继代，筛选出的自交F3代即为该单拷贝转基因家蚕纯合品系。
3.根据权利要求1所述的单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，其特征在于步骤<7>中的特异性引物是根据外源转入基因在染色体上插入位点上下游的基因组序列以及转基因结构序列设计的PCR引物F、R和LR。
4.根据权利要求3所述的单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，其特征在于：所述转基因家蚕为转羊毛KAP5.4基因家蚕。
5.根据权利要求4所述的单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法，其特征在于步骤<7>中的特异引物包括KAP5.4基因鉴定引物和piggyBac转座子结合引物，它们分别具有以下碱基序列：
KAP5.4基因鉴定引物：
F：5’-CTGTAGGAGTATCAAGAACGGAGATG-3’，
R：5’-GACAGACAGATATAGGGACAGAGAAAGC-3’；
piggyBac转座子结合引物：
LR：5’-CAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGC-3’。
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