CN109721650A - 家蚕丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2在提高蚕丝抗菌性能中的应用及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了家蚕丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2在提高蚕丝抗菌性能中的应用及方法，其中抗菌肽BmGlv2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明通过转基因的方式在家蚕丝腺中过表达抗菌肽BmGlv2，并比较了转基因蚕丝和野生型蚕丝的抗菌性能，结果发现转基因蚕丝在抗菌性能方面得到提升。本发明首次从基因层面通过提高抗菌肽的表达量并掺入蚕丝中以提高蚕丝抗菌性能，为蚕丝在伤口辅料和手术缝合线等领域的使用奠定了基础。

Description

家蚕丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2在提高蚕丝抗菌性能中的应 用及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及家蚕丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2在提高蚕丝抗菌性能中的应用，还涉及提高蚕丝抗菌性能的方法。

背景技术

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物(昆虫)之一。它的蚕茧用作纺织材料已经有五千年的历史，蚕茧是由蚕丝构成的多层结构，具有超强的机械性能，能很好地保护蚕蛹。蚕丝主要由两根丝素(fibroin)和包裹在其外层的丝胶蛋白(sericin)构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H链、fib-L链和P25三种主要组分；丝胶由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1)、丝胶2(Sericin2)和丝胶3(Sericin3)三种主要组分(Gamo et al.,1977)。随着质谱等分子生物学技术的发展，发现蚕茧或蚕丝中除了丝素和丝胶，还有很多的蛋白组分，通过LC/MS/MS技术从多层蚕茧中鉴定到了286种蛋白 (Zhang et al.,2015)。接着，董照明等人通过分析家蚕七种不同发育时期的蚕丝，包括每龄幼虫的蚕丝、蚕茧丝和茧衣，共鉴定到500余种蛋白质(Dong etal.,2013)。除了丝素和丝胶蛋白之外，各种蛋白酶抑制剂和seroins蛋白的丰度占了80％。Seroins蛋白具有抑制细菌和核型多角体病毒生长的能力(Singh et al.,2014)，并且在细菌和病毒感染时Seroins在家蚕体内的表达明显上调(Gandhe et al.,2006)。蚕茧中很多蛋白酶抑制剂也被报到具有抑制真菌孢子萌发的作用，如TIL类蛋白酶抑制剂BmSPI38andBmSPI39和Kunitz类蛋白酶抑制剂BmSPI51 能通过抑制球孢白僵菌分泌的表皮降解酶，有效的抑制孢子的萌发(Guo et al.,2016；Li et al., 2015)。研究还发现，这些蛋白酶抑制剂通常参与了家蚕的免疫反应，它们的表达量会受到细菌、真菌和病毒的诱导上调(Zhaoet al.,2012)。蚕茧中除了上述的高丰度抑菌蛋白，还有其他的免疫相关蛋白，如goverin2，cecropin和defensin等抗菌肽蛋白(AMPs)。AMPs是昆虫先天免疫通路中的关键因子，它们通常在昆虫遇到病原体的威胁时增量表达，然后杀死病原体或抑制它们的生长(Chen and Lu,2018；Jiang et al.,2010)。Gloverin是一类富含甘氨酸的抗菌肽，也是在鳞翅目昆虫的先天免疫中很重要的效应蛋白之一。Gloverin主要以前体蛋白的形式在脂肪体和血细胞中产生，经过体内的酶解机制去除信号肽后变成成熟体(Lundstrom et al.,2002)。前人的研究显示，glverions蛋白的具有抑制细菌(Axen et al.,1997；Lundstromet al.,2002； Mackintosh et al.,1998；Xu et al.,2015)、真菌(Hwang and Kim,2011；Xu et al.,2012)和病毒 (Moreno-Habel et al.,2012)生长的活性。

尽管在蚕茧中鉴定到了多种的免疫相关/抗菌蛋白，但目前蚕茧提取液的体外抑菌活性发现，其对细菌或真菌的抑制作用非常弱，几乎检测不到(Guo et al.,2016)。因此，大大阻碍了蚕丝在伤口辅料和手术缝合线等领域的使用(Akturk et al.,2011；Teramotoet al.,2008)。而通过基因层面通过提高抗菌肽的表达量并掺入蚕丝中，是否能大幅提高蚕丝的抗菌性能未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2在提高蚕丝抗菌性能中的应用；本发明的目的之二在于提供一种通过在家蚕丝腺增量表达抗菌肽 BmGlv2提高蚕丝抗菌性能的方法；本发明的目的之三在于提供所述方法制得的高抗菌性能蚕丝。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、家蚕丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2在提高蚕丝抗菌性能中的应用，所述抗菌肽BmGlv2 的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述抗菌为抗革兰氏阴性细菌、抗革兰氏阳性菌或抗真菌。

更优选的，所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌JM109，所述革兰氏阳性细菌为藤黄微球菌，所述真菌为球孢白僵菌或烟色曲霉菌。

2、一种提高蚕丝抗菌性能的方法，包括如下步骤：构建家蚕丝腺特异表达启动子调控抗菌肽BmGlv2表达的转基因重组表达载体，转化然后获得丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2的转基因家蚕品系，其获得的蚕丝即为高抗菌性能的蚕丝，所述抗菌肽BmGlv2的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述转基因重组载体构建方法如下：以家蚕cDNA为模板，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列为引物进行PCR扩增，克隆获得抗菌肽BmGlv2基因，连入pMD-19T载体上，获得pMD-19T-BmGlv2重组载体；然后以pSL1180[hr3Pser1spRedSer1PA](专利公开号CN105861515A)载体为模板，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物扩增获得家蚕丝腺特异表达的Ser1启动子，利用Spe I和Xho I将获得的家蚕丝腺特异表达的Ser1启动子插入至pMD-19T-BmGlv2载体上，获得pMD-19T-Ser1-BmGlv2重组载体，接着用Asc I限制向内切酶酶切pMD-19T-Ser1-BmGlv2重组载体获得目的片段-Ser1-BmGlv2，将得目的片段 -Ser1-BmGlv2重组到转基因载体pyggBac[3xP3DsRed,af]，获得转基因重组载体，命名为pBac [3xp3DsRed,SV40-BmGlv2-Ser1]。

优选的，获得转基因家蚕品系的方法如下：将所述转基因重组载体与辅助质粒phsp70PIG 按1:1的摩尔比例混合，利用转基因微注射仪注射到2小时内生产的非滞育蚕卵中，然后将此G0代蚕卵孵育后饲养为成虫并产下G1代的蚕卵，观察胚胎时期的蚕卵，筛选眼睛中带红色荧光标记的家蚕为阳性个体。

3、由所述方法制得的高抗菌性能蚕丝。

本发明的有益效果在于：本发明公开了家蚕丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2在提高蚕丝抗菌性能中的应用，首次在基因层面提高抗菌肽的表达量并掺入蚕丝中，获得抗菌性能大幅提高的蚕丝，为蚕丝在伤口辅料和手术缝合线等领域的使用奠定了基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为BmGlv2基因的序列与结构分析(A：BmGlv2基因序列的组成，以箭头为界第一段代表信号肽；第二段代表前体形式；第三段代表成熟体形式；B：使用I-TASSER软件构建的BmGlv2蛋白的三维结构的侧视图；C：使用I-TASSER软件构建的BmGlv2蛋白的三维结构的俯视图)。

图2为BmGlv2基因在丝腺组织中从5龄幼虫到吐丝结茧的时期表达谱分析(A：RT-PCR 检测结果；B：Western Blot检测结果；5龄1天(L5D1)、5龄3天(L5D3)、5龄5天(L5D5)、 5龄7天(L5D7)、吐丝第1天(SpD1)，吐丝第2天(SpD2))。

图3为转基因家蚕的构建(A：过表达BmGlv2载体的构建示意图。PBacL与PBacR：基本转基因载体piggyBac的左右末端反向重复序列；3×p3-Red：眼部红色标记基因；SV40：终止序列；Glv2：BmGlv2的全长DNA序列；Ser1：家蚕丝腺特异性启动子；B：卵和蛾阶段时转基因蚕眼部的荧光图像，比例尺代表1mm)。

图4为BmGlv2在转基因家蚕中的表达模式分析(A：转基因和非转基因蚕的丝腺组织中 BmGlv2基因的荧光定量PCR分析；B：蛋白Western印迹分析；C：转基因家蚕中茧丝里的BmGlv2蛋白Western印迹分析，WT：非转基因蚕；OverGlv2：过表达Glv2转基因蚕；(D-F') 通过扫描电子显微镜表征来自(D-F)转基因蚕和(D'-F')非转基因蚕的茧/丝。D和D'显示100x扩增的茧内层；E和E'显示100x扩增的茧外层；F和F'显示具有300X扩增的茧外层)。

图5为转基因(OverGlv2)茧/丝的抗菌能力测定(A：大肠杆菌JM109、B：恶臭假单胞菌、C：藤黄微球菌；D：铜绿假单胞菌的细菌生长曲线测定；E：真菌菌株白僵菌B.bassiana；F：烟曲霉菌A.fumigatus的生长曲线测量，通过记录600nm处的光密度来检测细菌和真菌在25℃下的生长。野生型茧/丝提取物用作阴性对照，溶菌酶和EDTA用作阳性对照)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、家蚕BmGlv2基因生物信息分析

从NCBI中获取了BmGlv2的基因序列(NM_001044218.2)及蛋白信息序列(NP_001037683.1)，基因编码区及氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。并利用ExPASy(http://www.expasy.org/)预测其相对分子质量大小及等电点基本信息，利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析其结构域，用ClustalX 1.8，SignalP4.1(Nielsen, 2017)分析其序列信息及预测其信号肽，利用I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)(Roy et al.,2010；Yang et al.,2015；Zhang, 2008)对其三维结构进行了预测。

分析结果显示，BmGlv2基因编码含173个氨基酸的前体蛋白，其预测分子量为18.8kDa，理论等电点为6.4，含有信号肽、前肽和成熟体蛋白三个功能域(图1中A)。BmGlv2前体蛋白的N-末端是由18个氨基酸残基构成典型的信号肽，该信号肽在分泌过程中会被切割，从而暴露出位于前肽上的RHPR基序。而由于-Arg-X-X-Arg-序列是内肽酶切割位点的典型位点 (Molloy et al.,1992)，该RHPR基序可以被内肽酶识别，从而产生成熟形式的BmG1v2蛋白。

使用蛋白三维结构预测在线软件I-TASSER(Roy et al.,2010；Yang et al.,2015；Zhang,2008) 对BmGlv2的三维结构进行预测，该预测是基于C分数的高低进行的选择建模(C分数是用于评估预测模型的置信度分数)。BmGlv2的模型C评分为3.63，TM评分为0.32，表明该模型是可接受的。基于预测所得结构，我们发现BmGlv2的三维结构主要由无规卷曲，α螺旋和少量β折叠组成(图1中B和1中C)，这与重组bmGlv2的二级结构检测结果一致(Wang et al., 2018)。BmGlv2的无规则卷曲结构能使其更容易在疏水环境中将无规则卷曲构象转变为α-螺旋，这是Glvs家族发挥其抗微生物活性的必要过程(Axen et al.,1997；Wang et al.,2018；Yi et al., 2013)。

实施例2、丝腺发育过程中BmGlv2的表达模式研究

前人在转录水平上的研究表明，BmGlv2主要在脂肪体中表达，而在其他组织如表皮，血淋巴，马氏管，中肠和丝腺中表达量很低。为了进一步研究BmGlv2在丝腺中的生理功能，我们使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western bolt分析了其从5龄1天到上簇期表达模式。研究材料选用非滞育型大造p50品系家蚕(来源于家蚕基因组生物学国家重点实验室) 为研究对象，在25±1℃的温度及70±5％的湿度恒定条件下以桑叶喂养至成虫后产卵。其卵在25℃，95％湿度的条件下孵育成为幼虫，以桑叶喂养至5龄幼虫后，提取家蚕不同时期(分别是5龄1天，5龄3天，5龄5天，5龄7天，上蔟1天，上蔟2天)的丝腺组织，并储存于-80℃备用。当家蚕喂养至上蔟结茧后，收集蚕茧并储存于4℃备用。

RT-PCR利用TRIZOL(Invitrogen)法提取家蚕丝腺中的RNA，然后利用M-MLV反转录酶(Invitrogen)转录出cDNA并保存于-80℃。以家蚕sw22934为内参，设计目的RT-PCR引物(sw22934上游引物：5’-tacggaccttctgattacg-3’(SEQ ID NO.7)和sw22934下游引物： 5’-gccaaagaccttgcctc-3’(SEQ ID NO.8)。RT-qPCR验证时，每个样品设计3个独立重复对照，结果如图2中A所示。

提取丝腺和茧丝中的蛋白以进行Western Blot验证，所有的蛋白样品都以家蚕α-tubulin 为内参，验证时上样总量大约为30μg，丝腺蛋白提取具体步骤如下：首先，将丝腺材料从-80℃冰箱取出，置于预冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末状，并转移至1.5mL离心管中；然后，加入适量裂解液(8M尿素，25mM DTT，30mM Chaps)，混匀；最后，于12000g，4℃离心10min，吸取上清至新的1.5mL离心管中，放于-80℃冰箱保存备用。茧丝蛋白提取方法：先将转基因及非转基因蚕茧称重并剪碎。后取其0.25g茧丝分别与1mL PBS(PH6.0) 于25℃条件下孵育过夜，离心取上清即获得提取的茧丝蛋白，结果如图2中B所示。

结果显示，BmGlv2在mRNA水平和蛋白水平的总体表达量较低。其表达模式是从5龄第1天到第7天逐渐降低，然后在即将上簇的亮蚕和即将形成茧的上簇2天增加，这与对丝腺腔的蛋白质组内容物的分析时，在前部丝腺和中部丝腺的前部区域中观察到BmGlv2的表达变化相一致。以上结果表明BmGlv2能分泌到丝腺腔内，并掺入到丝纤维中以发挥其抗菌活性。此外，由于家蚕丝腺和茧中BmGlv2的表达水平非常低，因此在丝腺中过表达BmGlv2 以增加茧的抗菌活性比在茧中过表达蛋白酶抑制剂可行性更高。

实施例3、转基因品系家蚕丝腺的抑菌活性验证

为研究在中部丝腺过表达BmGlv2的可行性，使用含有丝胶1(SER1)启动子的转基因载体，构建家蚕转基因品系pBac[3xp3DsRed，SV40-BmGlv2-SER1]，具体方法如下：以家蚕5龄3天幼虫脂肪体组织cDNA为模板，利用PCR技术扩增出目的条带，PCR扩增引物如下：

BmGlv2上游引物：5’-ttggcgcgccaaccgctcgagcggggactagtatgaattcaaatctgtttta-3’(SEQ ID NO.3)和BmGlv2下游引物：5’-aaggcgcgcctcaccaatcatggcggatct-3’(SEQID NO.4)。在目的片段N端插入Asc I,Spe I,Xho I限制性酶切位点，在C端插入Asc I限制性酶切位点的目的基因。利用T克隆技术将目的片段连接至pMD-19T载体上，获得 pMD-19T-BmGlv2重组载体。同时，利用PCR技术在本实验室已构建好的中间载体 pSL1180[hr3Pser1spRedSer1PA](专利号CN105861515B)中克隆出家蚕丝腺特异表达的Ser1启动子，Ser1启动子上游引物：5’-cggactagtgtttccgaccactggcttag-3’(SEQ ID NO.5) 和Ser1启动子下游引物：5’-ccctcgaggttggcggtctttggatcg-3’(SEQ ID NO.6)并利用 Spe I和Xho I两个限制向内切酶位点插入至pMD-19T-BmGlv2载体上，获得 pMD-19T-Ser1-BmGlv2重组载体。利用Asc I限制向内切酶对pMD-19T-Ser1-BmGlv2重组载体进行消化后将目的片段-Ser1-BmGlv2-重组到转基因载体pyggBac[3xP3DsRed,af] (Tamura et al.,2000)上，获得转基因重组载体pBac[3xp3DsRed,SV40-BmGlv2-Ser1](图3中A)。

将转基因载体与编码辅助细胞的转座酶混合并显微注射到家蚕胚胎中，具体如下：利用质粒提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取转基因重组质粒pBac[3xp3DsRed,SV40-BmGlv2-Ser1]，按照1:1的摩尔比例与辅助质粒phsp70PIG混合，使其终浓度为500ng/μL，并利用转基因微注射仪(Eppendorf,Germany)注射到2小时内的生产的非滞育蚕卵中。筛选获得了在288个G0代的蚕卵，其中有23个成功孵化并成长为蚕蛾。经过相互交配后，我们获得了G1代胚胎，然后用奥林巴斯SZX12荧光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)观察胚胎时期的蚕卵，筛选眼睛中带红色荧光标记的家蚕为阳性个体，结果有1个G1代胚胎复眼在转青期之前出现阳性DsRed表达(图3中B)，将G1代的阳性个体与野生型的家蚕(大造品系)进行杂交，以保留转基因稳定遗传系，每一代家蚕阳性个体均需要以荧光显微镜进行筛选。将此阳性G1代蚕蛾与野生型家蚕回交以获得品系名为OverGlv2的稳定转基因家蚕品系。

实施例4、BmGlv2在转基因品系OverGlv2中的表达分析

为了证实BmGlv2在转基因品系OverGlv2中确实过表达，通过qPCR和Western blot分析了OverGlv2和野生型家蚕丝腺中的BmGlv的表达情况。结果如图4中A所示，在转录水平上BmGlv2在转基因品系OverGlv2中的5龄3天幼虫丝腺中的表达量明显高于非转基因野生型家蚕(图4中A)，且蛋白水平也表现出了相同的结果，证明OverGlv2转基因家蚕品系确实过表达了BmGlv2(图4中B)。Western blot分析还发现了可被Glv2抗体识别/染色的特异性条带有两条，其表观分子量分别为18kDa和14kDa。较小条带的大小与成熟BmG1v2的理论分子量一致，表明较小条带是Glv2的活化形式，而较高条带可能是Glv2前体(pro-Glv或 pre-pro-Glv形式)。该发现暗示过表达的BmGlv2可被丝腺中的内肽酶有效激活。

此外，还使用SDS-PAGE和Western blot分析了从野生型和OverGlv2家蚕中提取的茧蛋白。结果显示，观察到了成熟BmGlv2条带和BmGlv2前体条带，证明过表达的BmGlv2在上簇期间被分泌到丝腺中并结合在了丝纤维上(图4中C)。通过扫描电子显微镜检查茧和丝的形态特征，发现在转基因品系OverGlv2和野生型家蚕的丝/茧之间没有出现明显差异(图4中D-F')，表明茧/丝的形成过程在转基因蚕中没有受到影响。

实施例4、转基因品系家蚕蚕茧的抑菌活性验证

在过去的研究显示，由于野生家蚕茧提取物的抗菌性非常微弱或有限(Guo etal。，2016)，往往不能够用生长曲线的方法评估提取物的抗菌活性。因此，以野生型家蚕茧为对照，比较了OverGlv2茧和野生型茧对细菌和真菌的抗菌活性。选取两种革兰氏阴性菌((E.coli JM109 和P.putida)，两种革兰氏阳性菌(M.luteus和P.aeruginosa)和两种真菌菌株(B.bassiana 和A.fumigatus)与茧提取物分别孵育，用分光光度法监测生长曲线。具体方法如下：即是说，先将细菌与真菌培养至LB或者马铃薯葡萄糖肉汤培养基至OD₆₀₀＝0.2-0.3，取其150μL与50 μL茧丝提取蛋白混匀后加入96孔板中，在25℃，80rpm的条件下进行孵育，利用紫外分光光度计(GloMax Multi+,Promega,American)每隔1小时测定其OD₆₀₀的吸光值，并绘制细菌生长动力学曲线进行分析。结果显示，与对照组相比，OverGlv2在长时间孵育后(细菌超过10小时，真菌超过30小时)能够显著抑制革兰氏阴性细菌E.coliJM109(图5中A)、革兰氏阳性细菌M.luteus(图5中C)和真菌B.bassiana与A.fumigatus的生长(图5中E和F)。然而，OverGlv2的提取物对革兰氏阴性菌P.putida(图5中B)和革兰氏阳性菌P.aeruginosa (图5中D)显示出相对弱的抑制活性，并且仅在较短的孵育时间内能观察到抑菌活性(小于 5小时)。

而在王等的研究中，使用相同的生长曲线分析方法，发现重组BmGlv2只能抑制E.coli JM109的生长，而不抑制P.putida和P.aeruginosa的生长(Wang et al.,2018)。Lu等人也发现 BmGlv2蛋白对B.bassiana没有明显的抗真菌活性(Lu et al.,2016b)。这些发现表明，OverGlv2 蚕茧的抗菌活性增强不仅仅是过表达了BmGlv2蛋白所形成的单方面结果。可能BmGlv2能够与其他AMP协同抗菌，提高了蚕茧的抗菌活性。

综上所述，BmGlv2属于一类富含甘氨酸的抗菌肽，它除了本身有很好的抗菌效果之外，还具有增强其他抗菌肽类抵抗真菌侵染的协同效应。在此次研究中，利用丝胶1(Ser1)表达系统在丝腺中过表达了BmGlv2基因，并发现其明显增强了蚕丝的抗菌性能。Western blot的结果表明成功的在丝腺中过表达的BmGlv2部分呈现了成熟体形式，且在蚕吐丝融合于丝中，并不会对茧丝的正常形成造成任何影响。更为重要的是，相比于非转基因茧丝，过表达BmGlv2 的转基因茧丝表现除了更优越的抑制细菌和真菌的抗菌活性。该实验表明，通过转基因过表达BmGlv2的手段，来增强蚕丝的抗菌能力是可行的；这种转基因抗菌蚕丝不仅能保证蚕丝的更长效的存储，而且扩宽了蚕丝在生物医学领域的运用。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 家蚕丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2在提高蚕丝抗菌性能中的应用及方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 522

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 1

atgaattcaa atctgtttta tatcttcgct acaactctgg tgtgtgttaa cgcagaagtt 60

tacggacctt ctgattacgc agaagattac tcgatcagcg ggcaatcctc aaggcgacac 120

ccccgtgacg tcacttggga caaacaaatg gggggaggca aggtctttgg cactttggga 180

caaaacgatg atggcctctt tggaaaagct ggttacaaca aagagatctt taatgacgac 240

cgcggcaaac taaccggtca ggcttacggt accagggttt taggacctgg aggcgacagc 300

accaactacg gcggacgcct agactgggcg aacaagaatg cacaagccac tattgaccta 360

aatagacaaa tcggtggcag atctgggatg acagcatcag gctccggtgt gtgggatctg 420

gataagaaca cccacttttc tgccggtggt atggtctcga aggagttcgg tcacaaaaga 480

ccagacgtcg gtcttcaagc agagatccgc catgattggt ga 522

<210> 2

<211> 173

<212> PRT

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 2

Met Asn Ser Asn Leu Phe Tyr Ile Phe Ala Thr Thr Leu Val Cys Val

1 5 10 15

Asn Ala Glu Val Tyr Gly Pro Ser Asp Tyr Ala Glu Asp Tyr Ser Ile

20 25 30

Ser Gly Gln Ser Ser Arg Arg His Pro Arg Asp Val Thr Trp Asp Lys

35 40 45

Gln Met Gly Gly Gly Lys Val Phe Gly Thr Leu Gly Gln Asn Asp Asp

50 55 60

Gly Leu Phe Gly Lys Ala Gly Tyr Asn Lys Glu Ile Phe Asn Asp Asp

65 70 75 80

Arg Gly Lys Leu Thr Gly Gln Ala Tyr Gly Thr Arg Val Leu Gly Pro

85 90 95

Gly Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Gly Gly Arg Leu Asp Trp Ala Asn Lys

100 105 110

Asn Ala Gln Ala Thr Ile Asp Leu Asn Arg Gln Ile Gly Gly Arg Ser

115 120 125

Gly Met Thr Ala Ser Gly Ser Gly Val Trp Asp Leu Asp Lys Asn Thr

130 135 140

His Phe Ser Ala Gly Gly Met Val Ser Lys Glu Phe Gly His Lys Arg

145 150 155 160

Pro Asp Val Gly Leu Gln Ala Glu Ile Arg His Asp Trp

165 170

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttggcgcgcc aaccgctcga gcggggacta gtatgaattc aaatctgttt ta 52

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaggcgcgcc tcaccaatca tggcggatct 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggactagtg tttccgacca ctggcttag 29

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctcgaggt tggcggtctt tggatcg 27

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tacggacctt ctgattacg 19

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccaaagacc ttgcctc 17

Claims (8)

1.家蚕丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2在提高蚕丝抗菌性能中的应用，其特征在于：所述抗菌肽BmGlv2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗菌为抗革兰氏阴性细菌、抗革兰氏阳性菌或抗真菌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌JM109，所述革兰氏阳性细菌为藤黄微球菌，所述真菌为球孢白僵菌或烟色曲霉菌。

4.一种提高蚕丝抗菌性能的方法，其特征在于，包括如下步骤：构建家蚕丝腺特异表达启动子调控抗菌肽BmGlv2表达的转基因重组表达载体，转化然后获得丝腺增量表达抗菌肽BmGlv2的转基因家蚕品系，其获得的蚕丝即为高抗菌性能的蚕丝，所述抗菌肽BmGlv2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转基因重组载体构建方法如下：以家蚕cDNA为模板，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列为引物进行PCR扩增，克隆获得抗菌肽BmGlv2基因，连入pMD-19T载体上，获得pMD-19T-BmGlv2重组载体；然后以pSL1180[hr3Pser1spRedSer1PA]载体为模板，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物扩增获得家蚕丝腺特异表达的Ser1启动子，利用Spe I和Xho I将获得的家蚕丝腺特异表达的Ser1启动子插入至pMD-19T-BmGlv2载体上，获得pMD-19T-Ser1-BmGlv2重组载体，接着用Asc I限制向内切酶酶切pMD-19T-Ser1-BmGlv2重组载体获得目的片段-Ser1-BmGlv2，将目的片段-Ser1-BmGlv2重组到转基因载体pyggBac[3xP3DsRed,af]，获得转基因重组载体，命名为pBac[3xp3DsRed,SV40-BmGlv2-Ser1]。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，获得转基因家蚕品系的方法如下：将所述转基因重组载体与辅助质粒phsp70PIG按1:1的摩尔比例混合，利用转基因微注射仪注射到2小时内生产的非滞育蚕卵中，然后将此G0代蚕卵孵育后饲养为成虫并产下G1代的蚕卵，观察胚胎时期的蚕卵，筛选眼睛中带红色荧光标记的家蚕为阳性个体。

7.根据权利要求4～6任一项所述的方法，其特征在于：所述抗菌为抗革兰氏阴性细菌、抗革兰氏阳性菌或抗真菌。

8.由权利要求4～7任一项所述方法制得的高抗菌性能蚕丝。