CN103476790A - 蚕幼虫的麻痹法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种用以固定鳞翅目幼虫的方法和使用，以及一种从固定的鳞翅目幼虫中强拉丝的方法、设备和使用。还披露了一种用于固定鳞翅目幼虫的方法，该方法包括通过在鳞翅目幼虫中转基因表达具有麻痹效果的多肽，或注入从鳞翅目幼虫中提取出来后经过氧化的血淋巴，或注入一种具有麻痹效果的天然或人造多肽三种中至少一种方法来麻痹鳞翅目幼虫。
Description
技术领域
本公开的领域涉及一种用以固定鳞翅目幼虫的方法和使用，以及一种从固定的鳞翅目幼虫中强拉丝的方法、设备和使用。
背景技术
鳞翅目属于昆虫。鳞翅目是世界上物种最丰富的目之一，包括蛾以及蝴蝶、弄蝶、蛾-蝶杂交三大家族。鳞翅目中的很多物种都有经济效益，因为它们在植物授粉的过程中的重要作用，或者可以产丝，比如家蚕。
鳞翅目物种经过了一种称为“全变态”的变化过程。鳞翅目的生命周期一般包括卵、幼虫、蛹以及成虫。鳞翅目一般为有性生殖、卵生，一些物种为卵胎生。幼虫是孵化出之后的第一个阶段，跟成虫相比具有非常不同的外形和尺寸。幼虫生长很快，一年可产好几代，然而一些物种的生长周期长达3年。不同龄的幼虫是由激素调控的，例如促前胸腺激素，这种激素可以刺激蜕皮激素（蜕皮素及其同系物）的产生，蜕皮激素释放于血淋巴，让鳞翅目昆虫开始蜕皮。
5龄或7龄之后幼虫开始化蛹，最后一龄表皮开始硬化，发展成为蛹。蛹包裹在茧里，粘附在瓦砾堆或者不粘附，这取决于是哪个物种。破茧而出的时间依物种而不同。成虫从茧里出来是依靠腹部的钩子或者头部的突起物，或者用酶把丝部分溶解。
本披露中蚕是指能产丝的蛾的幼虫。桑蚕指的是鳞翅目中家蚕的幼虫，其他的都叫野蚕。
野蚕品种柞蚕(Antheraeapernyi),天蚕(Antheraeayamamai),印度柞蚕(Antheraeamylitta),琥珀蚕(Antheraeaassama),蓖麻蚕(Philosamia Cynthia ricini)和樗蚕(Philosamia Cynthia pryeri)现在都用于生产商品用丝。其它蚕种例如Gonometa spp.也有生产商品化丝产品的巨大潜力。
商品化的丝是直接从蚕茧中抽取出来的，少数是通过梳理蚕茧得到。然而已被证实的是，在实验室稳定可控的条件下，直接从固定的5龄家蚕Bombyxmori体内人工抽丝（称为“强拉丝”）是非常有利的，所得蚕丝的力学性能优于天然纺出的蚕丝（图.1）这方面的工作有Pérez-Rigueiro J,Elices M,Llorca J和Viney C的文章“Tensile properties of silkworm silk obtained by forced silking”(Journal ofApplied Polymer Science82(8):1928-1935(2001)).类似的工作还有Shao Z和Vallrath F的“Surprising strength of silkworm silk”(Nature418:741(2002));KhanMd.M.R,Morikawa H,Gotoh Y,Miura M,Ming Z,Sato Y,Iwasa M的“Structuralcharacteristics and properties of Bombyxmorisilk fiber obtained by different artificialforcibly silking speeds”(International Journal of Biological Macromolecules42(3):264-270(2008))和Fu C,Porter D,Chen X,Vollrath F,Shao Z的工作“Understanding the Mechanical Properties of AntheraeaPernyi Silk–From PrimaryStructure to Comdensed Structure of the Protei”(Advanced Functional Materials,21:729-737(2001))。
上述作者都是采用物理限制的方法来固定幼虫，这种方法是有局限的。首先，物理限制的方法需要熟练的技巧，这需要花费时间和丝来达到，并且所得的丝长度较短。再者，这种固定是不完全的，幼虫或者体内跟丝压力有关的肌肉很小的动作都会导致抽取速率或力的不同，这会导致丝力学性能的均一性变差。最后，除非幼虫的颚也被固定住，否则在强拉丝过程中，幼虫会用颚把丝切断，导致产量的损失。这些局限导致了目前市场上并没有商品化的强拉丝纤维。
Ha SD,Nagata S,Suzuki A,Kataoka H的研究“Isolation and structuredetermination of paralytic peptide from the hemolymph of the silkworm,Bombyxmori”(Peptide20:561-8(1999))和Skinner WS,Dennis PA,Li JP,Summerfelt RM,Caeney RL,Quistad GB的工作“Isolation and identification ofparalytic peptide from hemolymph of the lepidopteran insects Manducasexta,Spodopteraexigua,and Heliothisvirescens”(J.Biol.Chem.266:12,873-877(1991))发现用从纺丝前停止喂食的5龄桑蚕幼虫体内抽取的血淋巴对5龄桑蚕幼虫皮下注射，可使其迅速麻痹。供体桑蚕中提取的血淋巴，必须在空气中放置10分钟才能皮下注射。有效成分家蚕麻痹蛋白（bmPP）已被分离和克隆、测序。前者由Ha SD,Nagata S,Suzuki A,Kataoka H的研究“Isolation and structuredetermination of paralytic peptide from the hemolymph of the silkworm,Bombyxmori”(Peptide20:561-8(1999))完成，后者可见于Kamimura M,NakaharaY,Kanamori Y,Tsuzuki S,Hayakawa Y,Kiuchi M的文章“Molecular cloning ofsilkworm paralytic peptide and its developmental regulation”(Biochem.Biophys.Res.Commun.286:67-73(2001)).Kamimuru等人也发现5龄蚕中bmPP的表达水平会受保幼激素和20-羟基蜕皮素的影响而上调，这解释了bmPP的分泌怎样定时于最后一龄。bmPP在造血器官中的盘状复合体中的表达，表明bmPP既参与免疫反应，又参与造血过程。
许多合成和天然杀虫剂对蚕都有麻痹作用。例如，AM Heimpel和TA Angus在他们1960年的文章“Bacterial insecticides”中发现跟一些桑蚕传染病有关的细菌产物能使蚕幼虫快速麻痹。然而使用合成农药有人致病的危险。而细菌产物喂养或分散在幼蚕体内使其麻痹再杀死蚕幼虫对产丝过程来说太可怕了。
找到可行的方法来固定鳞翅目的幼虫并从这些固定的鳞翅目幼虫体内强拉丝还是有相当大的提升空间的。
上个十年已有很多对蚕进行转基因修饰的报道。Yamao M,Katayama N,Nakazawa H,Yamakawa M,Hayashi Y,Hara S,Kamei K,和Mori H的工作“Genetargeting in the silkworm by use of a baculovirus”(Genes and Development13,511-516(1999))以及Tamura T,Thibert C,Royer C,Kanda T,Abraham E,Kamba M,Komoto N,Thomas JL,Mauchamp B,Chavancy G,Shirk P,Fraser M,PrudhommeJC,Couble P的工作“Germline transformation of the silkworm Bombyxmori L.using a piggyback transposon derived vector”(Nature Biotechnology18(1):81-4(2000))都描述了现在很通用的早期的方法。也有很多利用转基因表达体系获得理想表达效果的专利，例如：美国专利申请书20070067855,20070056051,20090183269以及美国专利号6,551,825.近年来其他讨论转座子载体和利用转座子载体来生成转基因昆虫的文献包括，Handler A,McCoombs SD,Fraser MJ,SaulSH“The Lepidopteran transposon vector,piggyBac,mediates germlinetransformation in Mediterranean fruit fly”(ProcNatl Acid Sci95,7520-7525(1998));Fraser MJ“The TTAA-specific family of transposable elements”Insect transgenis:Methods and Applications(2001).A.A.James and A.H.Handler,eds.CRC Press,Orlando,Fla.;Lobo N,Li X,Fraser MJ,Jr.“Transposition of the piggyback elementin embryos of Drosophila melanogaster,Aedesaegypti and Trichoplusiani”(Mol.Gen.Genetics261,803-810(1999));Grossman GL,Rafferty CS,Fraser MJ,Benedict MQ.“The piggyback element is capable of precise excision and transition in cells andembryos of the mosquito,Anopheles gambiae”(Insect.Biochem.Mol.Biol.30:909-914(2000));Lobo NF,Li X,Hua-Van A,Fraser MJ,Jr.“Mobility of thepiggyback transposon in embryos of the vectors of Dengue fever(Aedesalbopictus)and La Crosse encephalitis(Ae.triseriatus)”(Mol Genet Genomics.265:66-71(2001));Lorenzen MD,Berghammer AJ,Brown SJ,Denell RE,Klinger M,BeemanRW“piggyback-mediated germ-line transformation in the beetle Triboliumcastaneum”(Insect Molec.Biol.12:433-440(2003));Hacker U,Nystedt S,Barmchi MP,Horn C,Wimmer E“A piggyback-based insertional mutagenesis in the presence of stablyintegrated P element in Drosophila”(ProcNatlAcadSci USA.1007720-5(2003));Sumitani M,Yamamoto DS,Oishi K,Lee JM,Hatakeyama M.“Germ-linetransformation of the sawfly,Athaliarosae(Humenoptera:Symphyta),mediated by apiggyback-derived vector”(Insect Biochem.Mol.Biol.33:449-458(2003));Horn C,Offen N,Nystedt S,Haecher U,Wimmer EA.“piggyback-based insertionalmutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genemics”(Genetics.163:647-61(2003));以及Tomita M,Munetsuna H,Sato T,Adachi T,Hino R,Hayashi M,Shimizu K,Nakamura N,Tamura T,Yoshizato K的“Transgenicsilkworms produce recombinant human typeⅢprocollagen in cocoons”(NatBiotechnol.21,52-6(2003))。
本披露中名词“昆虫”包含昆虫发育的各个阶段，这些阶段包括单细胞的生殖细胞，卵子和精子，早期胚胎，幼虫，也包括从一龄到五龄的任一幼虫，蛹，或者成虫。对于熟悉这个领域的人来讲，他们知道何种不同时期的昆虫适于何种特定的用途，比如储存或运输昆虫到一个不同的地点，保持原有物种，甚至基因交叉，或者其它。
本披露中提到的“表达控制序列”指的是多核苷酸序列，此序列可以调节功能地连接到其上面的多肽的表达。
本披露中提到的“启动子”指的是一段通常直接位于编码序列上游的DNA序列，它是基因基本和/或调控转录所必需的。特别地，它携带者允许转录开始的信息，一般来说其具有一个转录起始位点和一个聚合酶结合位点。
本披露中的“重组”核酸指的是一段用于编码异源于昆虫的麻痹诱导多肽的核酸，和/或在导入昆虫体内之前经基因工程修饰（比如，克隆到载体）的核酸。核酸编码一种特定鳞翅目昆虫的蛋白质（由该昆虫体内产生），但是设计后表达水平提高，然后导回到原始昆虫体内，这也叫做重组。
本披露中的“同系物”指的是具有相同或类似生物功能的基因或蛋白质。这种相同或类似的生物功能可以反映在大约50%，70%，或90%的序列相同性或类似性上（在氨基酸或核苷酸水平上）。位于定义的分子区域或者跨越整个分子序列长度上的序列相似或相同（氨基酸或核苷酸水平上）可以用序列比对法来测定，不同算法的计算机软件比如BLST,ALIGN,DNAstar以及INHERIT可以用来测定同系物。熟悉这个领域的人都熟悉这些算法程序。同系物的序列区域称为保守序列、一致序列或规范序列，其代表每个位置上碱基或氨基酸最常见的选择。
发明内容
本专利申请教导了一种安全、方便、高效、经济的固定鳞翅目幼虫（家养或野生）进而可以连续强拉丝的方法。这种固定方法不需要会熟练操作鳞翅目幼虫且可大规模实行。采用这种方法，具有一致且优异力学性能的丝可以以恒定、可控的拉伸速率、拉力从固定的鳞翅目幼虫体内抽出。
根据本专利申请的这种固定鳞翅目幼虫的方法包含是以下三种麻痹鳞翅目幼虫的方法中的一种或几种：在鳞翅目幼虫体内转基因表达一种具有麻痹效果的多肽，注射从鳞翅目幼虫体内提取并氧化的血淋巴，或者注射具有麻痹效果的天然或人工多肽。这种多肽可以是一种蛋白质。
转基因表达则包括以下三种方法中的一种或几种：引入一种病毒性载体，引入一种转座子载体，或者利用表达控制序列来调控表达。病毒性载体或转座子载体可能还包含一个标记基因。表达控制序列至少包含一个诱导型的启动子或增强子元件来进一步控制转基因表达。
此外，对转基因表达的调控至少包括改变温度诱导转基因表达，采用化学方法来诱导或抑制转基因表达其中的一种。
本披露的另一方面是这种具有麻痹效果的多肽是bmPP,bmPP的同系物或碎片。这些多肽可能会发生突变，但是仍然具有麻痹效果。
麻痹多肽的麻痹性或活性还可以通过转录控制信号或转译控制信号来单独修饰。
本披露更深层次的目的是使用上述方法来固定鳞翅目的幼虫。
此外，还提供了一种从鳞翅目幼虫体内强拉丝的方法，包括固定鳞翅目的幼虫以及直接抽丝。
也提供了一种从固定的鳞翅目幼虫体内拉丝的装置，其包括一个机械绕丝设备和挑起所绕丝的装置，其中鳞翅目幼虫可连接并通过上述方法固定到绕丝设备上。该装置可进一步用于收集丝，因为它可以改变绕丝速度和卷轴的数量（一个或平行的多个）。这种装置可包括环境控制器来控制环境条件比如温度和湿度。
可以对丝进行后拉伸的装置，包括一个或多个传感器，一个或多个后拉伸辊，一个致动器和一个致动器传感器，以及一个收集辊，依靠这些装置，麻痹的鳞翅目幼虫可被连接到后拉伸装置上并可采用上述方法中至少一种方法来固定鳞翅目幼虫。该装置还可以添加一个洗浴池，丝可以经过它后再被卷取。这种装置还可以包括一个温度控制器来控制幼虫的加热和冷却以影响丝的性能或者达到诱导麻痹肽表达的环境条件，比如Notch。
附图说明
图1是清洗和脱胶后的桑蚕单丝（25℃下自动卷取）、络新妇蜘蛛(Nephila)的牵引丝（25℃,20mm s-1）以及通过动物天然“8字”吐丝在20℃下以4到15mms-1的速率得到的标准脱胶商业蚕茧丝的应力-应变曲线。曲线下的面积代表纤维断裂前吸收的能量，其表征动物丝的韧性。标尺为10μm.对固定的蚕（n=4）进行强拉丝，每只蚕提供3-6根纤维，最后在拉伸仪器上测试。（力分辨率，30μN;时间分辨率，对于1mN的力小于5ms;应变速率，50%/min）[Shao Z,VollrathF.“Surprising strength of silkworm silk”Nature418:741(2002)]。
图2是我们这种方法的流程图。这些步骤包括通过麻痹固定鳞翅目幼虫（步骤200），通过以下方法中的一种或几种来麻痹幼虫：在鳞翅目幼虫体内转基因表达具有麻痹作用的多肽（步骤210），注射从鳞翅目幼虫体内提取并在注射前氧化的血淋巴（步骤220），或者注射具有麻痹效果的天然或人工多肽（步骤230）。也包括直接从鳞翅目幼虫体内人工抽丝（步骤240）。
图3是一套用来强拉丝的绕丝装置，机械绕丝设备300。A是用于绕丝的辊，B是马达，C是鳞翅目幼虫，D是一个可以放置多个幼虫的装置，E是可以使丝通过其后再被卷取的洗浴池。
图4是一个可用来绕丝的后拉伸的装置N。F是麻痹的蚕，G可以是一个或一套传感器，该传感器可用来测定丝的尺寸和性质，例如纤维的运动和张力，飞、该传感器也可以包含一个热电阻来加热和冷却，H是绕取的丝，I是用于绕丝的后拉伸辊，J是拉丝的致动器，K是观察丝拉伸的制动器传感器，L是洗浴池，M是一个收集辊。
图5表示的是小范围的后拉伸（10%和16%）对强拉丝的影响，并将其与蚕茧丝作对照。曲线显示应力是伸长应变的函数，此图说明了通过可控麻痹来调节纤维性能并达到所预测的性质。
具体实施方式
使用麻痹的方法来固定鳞翅目幼虫可以通过图2所示的三种方法来实现。麻痹鳞翅目幼虫的方法(200)包括：
方法1(步骤210)：在鳞翅目幼虫体内转基因表达一段有麻痹效果的多肽；
方法2(步骤220)：注射从鳞翅目幼虫中提取并预先氧化的血淋巴；或
方法3（步骤230）：注射一种具有麻痹效果的天然或人工多肽。
方法1（步骤210）是通过生成转基因鳞翅目幼虫来实现的，这些鳞翅目幼虫体内的一些或全部细胞中含有重组基因从而可以在5龄鳞翅目幼虫体内表达一种具有麻痹效果的天然蛋白质或多肽。这些具有麻痹效果的天然蛋白质或多肽不仅仅局限于家蚕麻痹肽bmPP，其还包括其他野蚕中的天然同系物或者一段碎片。这种方法一经诱导，就会合成出可以产生麻痹效果的活性蛋白质或多肽。已存在于鳞翅目幼虫体内无活性的麻痹蛋白质或多肽也可以被活化（例如，家蚕幼虫血淋巴中的bmPP,或者其他品种野蚕体内的同系物），从而产生麻痹的效果。
第二种麻痹鳞翅目幼虫的方法（步骤220）是通过注射血淋巴来实现的。血淋巴提取自鳞翅目幼虫并经氧化后再进行注射。可以提取血淋巴的鳞翅目幼虫包括家蚕和其他种类的野蚕。被麻痹的鳞翅目幼虫是刚刚停止进食的5龄鳞翅目幼虫（家蚕或其他野蚕）。因此，我们也提供一种新型的但并不明显的可在5龄鳞翅目幼虫中活化bmPP表达的目的。
第三种方法（步骤230）是通过从鳞翅目幼虫的血淋巴中分离具有麻痹效果的天然蛋白质或多肽（例如家蚕的麻痹肽bmPP,其他野蚕中同系物，碎片），或者人工合成这些蛋白质或多肽，然后将其注射进刚刚停止进食的鳞翅目幼虫体内实现的。人工合成减小了分离血淋巴这一步的工作量而且很经济实惠。
这三种方法都可以用来固定鳞翅目幼虫以达到从鳞翅目幼虫中直接人工绕丝的目的（步骤240）。这三种方法都会导致鳞翅目幼虫迅速僵硬麻痹，从而可以很容易地进行纺丝并将其连接到可以以不同速度连续抽丝的机械绕丝装置300上进行连续纺丝直到鳞翅目幼虫体内的丝全被抽完（大于300米）。
图3是机械绕丝装置300的一个示意图。其包括用来绕丝的辊A，马达B，鳞翅目幼虫C，一个固定多个鳞翅目幼虫C的装置D，洗浴池E。这个机械绕丝装置300可以通过控制纺丝时间来优化可以改变丝的力学性能的变量。这些变量包括湿度（纺丝前和纺丝时）和环境温度（纺丝前和纺丝时）以及鳞翅目幼虫C的体温和体重。需要指出的是我们可以让丝通过一个或一组洗浴池E来除去我们不希望有的丝胶，也可以在其表面覆盖一层我们所希望的保护层或药物层等。
需要注意的是，我们可以加入多个辊A使其在不同速率下同时工作。我们还可以将从鳞翅目幼虫C中拉出的单丝以单位长度上可控的捻度捻在一起，从而可以将其直接连在卷轴上或在较后的步骤中再将其连在卷轴上。
转基因鳞翅目昆虫产生的方法很常见。例如，一种方法是可以将要引入的基因克隆进载体，比如病毒性载体（如减毒杆状病毒载体，或者对特定鳞翅目昆虫无传染性的病毒载体）。需要被引入到鳞翅目昆虫中的序列两侧是这种鳞翅目昆虫的基因组序列。然后这段结构被引入到鳞翅目的卵中（比如通过显微注射的方法），转基因通过旁侧序列的同源重组整合到鳞翅目基因组中的类似序列中。我们所用的方法是可以在Yamao M,Katayama N,Nakazawa H,Yamakawa M,Hayashi Y,Hara S,Kamei K,Mori H的文章“Gene targeting in the silkworm by useof a baculovirus”(Genes and Development13,511-516(1999))中找到。在这篇文章中，作者利用携带目标基因且两端连接宿主基因组序列的重组基因AcMNPV来对家蚕进行转染。病毒可以连续转运它的DNA，但是不能完成侵染循环。病毒DNA通过其中的宿主基因序列和家蚕基因中相同序列之间的同源重组来整合到宿主基因组中。
在另一种方法中，载体是一种转座子载体。转座子载体的一种形式是病毒载体（如上所述），其进一步包含了一段适合的转座子的末端反向重复序列。一个或多个目标转基因可以克隆到转座子载体中。在一些体系中，转座子载体携带着自身的转座酶。然而，一般来讲，转座子载体不会编码一段合适的转座酶。在这种情况下，载体是在可以提供转座酶的病毒或质粒的辅助下转移进鳞翅目昆虫体内的。重组载体和辅助着是通过常规的方法（例如显微注射）导入卵或早期胚胎中；且鳞翅目基因组中的转基因会在转座子位点上开始整合（例如与转座子的末端反向重复序列一致的序列）。熟练的工作者了解适合的转座子载体类型，例如，Minos,mariner,Hermes,piggyback。
在另外一种方案中，转座子载体是一种”piggyBac”载体。一类具有相似结构和移动性质的转座子含有TTAA这种特定的短的重复单元。典型的piggyBac载体(以前是IFP-2)是这类插入单元中被研究最多的。piggyBac有2400个碱基，端基是13个反向重复的碱基对，中间还有位于与两端不对称的位置上的19个反向重复序列[Cary LC,Goebel M,Corsaro BG,Wang HG,Rosed E,Fraser MJ.“Transposon mutagenesis of baculoviruses:Analysis of TrichoplusianitransposonIFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses”Virology172,156-69(1989)].piggyBac载体可以编码转座酶来让自己移动；另外，编码转座酶的序列可被移除而由辅助的质粒或病毒来提供。piggyBac载体会被当作非必须基因而被删除，而大量的插入基因可在其内部克隆。约15kB大小的插入基因可被克隆到某一piggyBac载体种。这允许一起插入例如六到七个基因以及它们的表达控制序列。因此，麻痹多肽，标记蛋白质，或者类似其他物质可以通过同一个转座子载体一起导入鳞翅目基因组的一个单一位点上。
一些piggyBac载体已被用作昆虫转基因。通过对转座子边界里面和外面的缺失突变的分析，Li et al.发展了两种可用来移动piggyBac所携带的序列的“最小结构”[Li X,Lobo N,Bauser CA,Fraser MJ Jr.“The minimum internal and externalsequence requirements for transposition of the eukaryotic transformation vectorpiggyback”Mol.Genet.Genomics.266,190-8(2001)].由转座子酶移动的基因数量可以通过使用这些最小结构或者最小化载体的尺寸来得到增加。这种移动所需的最小结构包括5个和3个碱基对的端基重复序列以及伴随的TTAA目标序列。尽管将移动序列有效迁移到昆虫的基因组中需要一些内部片段，但大部分的内部片段还是要被移除。另外，有效地转移最少需要50个碱基对来分隔TTAA目标序列[Li X,Lobo N,Bauser CA,Fraser MJ Jr.“The minimum internal andexternal sequence requirements for transposition of the eukaryotic transformationvector piggyback”Mol.Genet.Genomics.266,190-8(2001)]。
尽管带有一个标记基因，piggyBac载体可以在昆虫细胞内发生转化，此外，piggyBac元素的移动可在相隔较远的鳞翅目品种的细胞内发生。例如，已经证实piggyBac载体可转换多种果蝇物种，果蝇(D.melanogaster),实蝇(Anastrephasuspena),桔小实蝇(Bactroceradorsalis),以及一些蚊子种类和五种鳞翅目，红铃虫Pectinophoragossypiella,粉纹夜蛾(Trichoplusiani),苹果蠹蛾(ydiapomonella),小菜蛾(Plutellaxylostella),家蚕(B.mori)。
一般来讲，表达转座子酶的辅助病毒或质粒会和转座子载体一起转染。转座子酶的表达可由用于被测试的昆虫顺反子或系统（这两个词可以当作相同的意思来使用）的启动子的选择来决定。合适的启动子应具有的性质和一些例子将在本文的其他地方来阐述。
本文中，我们采用了一种Yamamoto M,Yamao M,Nishiyama H,Sugihara S,Nagaoka S,Tomita M,Yoshizato K,Tamura T,Mori H在他们“New and highlyefficient method for silkworm transgenesis usingAutographacalifornicanucleopolyhedrovirus and piggyback transposable elements”(BiotechnolBioeng88:849-853(2004))一文中提到的方法。在这篇文章中，非许可性宿主B.mori被两种重组基因AcMNPVs感染。其中一种含有Drosophila hsp70启动子控制的piggyBac转座子酶，另一种编码了一种要插入B.mori基因组的绿色荧光蛋白，该基因组的两端连上了piggyBac末端反向重复序列且受B.mori肌动蛋白A3启动子的控制。结果是，一种病毒表达的转座子酶使另一种病毒两段末端反向重复序列之间的DNA移动然后整合到受体蚕的基因组中。
存在于某些B.mori中的piggyBac转座子残基不会干扰转座子的转座。另外，在无piggyBac转座子复制时（如：Nistari），B.mori的菌株会被识别。piggyBac载体已被注入到B.mori胚胎中，且为了证实piggyBac进入了基因组转化株已经被成功恢复和表征。
有关使用杆状病毒载体的进一步说明，请见WO01/29204以及美国专利6551825.近期讨论piggyBac载体以及用它来生产转基因昆虫的文献还包括，Handler A,McCoombs SD,Fraser MJ,Saul SH.“The lepidopteran transposon vector,piggyback,mediates germline transformation in Mediterranean fruit fly”(ProcNatlAcadSci95,7520-7525(1998));Fraser MJ(2001)“The TTAA-specificfamily of transposable elements”In:Insect transgenesis:Methods and Applications.A.A.James and A.H.Handler,eds.CRC Press,Orlando,Fla.;Lobo N,Li X,FraserMJ Jr.“Transposition of the piggyback element in embryos of Drosophilamelanogaster,Aedesaegypti and Trichoplusiani”(Mol.Gen.Genetics261,803-810(1999));Grossman GL,Rafferty CS,Fraser MJ,Benedict MQ.“The piggybackelement is capable of precise excision and transposition in cells and embryos of themosquito,Anopheles gambiae”(Insect.Biochem.Mol.Bio.30:909-914(2000));Lobo NF,Li X,Hua-Van A,Fraser MJ Jr.“Mobility of the piggyback transposon inembryos of the vectors of Dengue fever(Aedesalbopictus)and La Crosse encephalitis(Ae.triseriatus)”(Mol Genet Genomics.265:66-71(2001));Lorenzen MD,Berghammer AJ,Brown SJ,Denell RE,Klinger M,Beeman RW“piggyback-mediated germ-line transformation in the beetle Triboliumcastaneum”(Insect Molec.Biol.12:433-440(2003));Hacker U,Nystedt S,Barmchi MP,Horn C,Wimmer EA“piggyback-based insertional mutagenesis in the presence of stablyintegrated P elements in Drosophila”(ProcNatlAcadSci USA.1007720-5(2003));Sumitani M,Yamamoto DS,Oishi K,Lee JM,Hatakeyama M.“Germ-linetransformation of the sawfly,Athaliarosae(Hymenoptera:Symphyta),mediated by apiggyback-derived vector”(Insect Biochem.Mol.Biol.33:449-458(2003));Horn C,Offen N,Nystedt S,Haecker U,Wimmer EA.“piggyback-based insertionalmutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics”(Genetics.163:647-61(2003));Tomita M,Munestsuna H,Sato T,Adachi T,Hino R,Hayashi M,Shimizu K,Nakamura N,Tamura T,Yoshizato K.“Transgenenicsilkworms produce recombinant human typeⅢprocollagen in cocoon”(NatBiotechnol.21,52-6(2003))。
进一步指出转基因表达可以由表达控制序列来控制。因此，将要引入的一个或多个基因需要在一个合适的表达控制序列的调控下定位。表达的调控可以在mRNA的层面上，也可以在多肽的层面上。因而表达控制序列包括mRNA相关的元素和蛋白质相关的元素。这些元素包括启动子、启动子内部的片段、上游元素、增强子、赋予组织或细胞特异性的元素、响应元素、核糖体结合序列、转译终止子等。当表达控制序列以这样一种方式定位时表达控制序列功能性地连接到核苷酸编码序列上来实现编码序列的表达。例如，当一个启动子功能性地连接到一个编码序列的5’位置时，编码序列的表达会受这个启动子的驱动。
熟练的工作者会知道怎样选择可以在鳞翅目细胞中起作用的表达控制序列。在一些方案中，表达控制序列适合带有一个组成性启动子。可以使用的合适启动子的例子包括用于p10,多角体蛋白（polh）,p6.9,衣壳，以及类组织蛋白酶的基因的杆状病毒启动子。其他合适的强组成性启动子包括B.mori肌动蛋白基因启动子；Drosophila hsp70,肌动蛋白，α-1-微管蛋白或遍素基因的启动子；RSV或MMTV启动子；转座因子启动子；吉普赛启动子；以及巨细胞（CMV）IE基因启动子。一些“弱”的杆状病毒启动子同样有效，比如ie1,ie2,ie0,etl,39K(akapp31),gp64基因的启动子。如果需要增加由弱启动子表达的基因数量，可以把增强子（例如杆状病毒增强子元素hr5）和启动子一起使用。当然可用的的启动子并不限于上面这几种。对于这个领域的专业人员来讲，可以根据特定的需要来选择启动子。
有的启动子比较大或者比较复杂，但是这种启动子的缺点是当他们被导入非寄主鳞翅目中时作用得不充分。相应地可以使用小启动子，比如hsp70启动子。虽然它们自身的活性较低，但是却可以通过一种正反馈机制来使活性增强。
一般来讲最小的启动子要具有足够的额外序列来允许基本和/或调控基因的转译有效。其通常不含有其他序列信息，如决定组织特异性的序列信息。作为这种缺失的直接结果，在没有活性增强子的情况下最小的启动子不具有活性。所以，一般来讲采用最小启动子时，本文中的体系会需要一个合适的增强子或者其他的调控元素（典型的基因产物）来活化体系。
因此，最小启动子最好是直接从已知的启动子来源中获得，或者是从已知的天然或非天然产生的较大启动子中获得。专业人员懂得什么样的最小启动子是合适的以及怎样获取它们。例如，可用的启动子包括hsp70,CMV,以及以Act5C为基础的最小启动子，BmA3的启动子碎片，还有Adh核启动子[Bieschke E,Wheeler J,Tower J.“Doxycycline-induced transgene expression during Drosophiladevelopment and aging”Mol Gen Genet258,571-579(1998)]。
不是所有的最小启动子都一定会对所有的昆虫种类起作用，但是显而易见专业人员会知道怎样确定启动子是有活性的。例如，某个质粒或其它载体，如果其包含一个带有即将被测试的最小启动子的顺反子，那么其构成了一种标记物，比如标记荧光蛋白的基因，这个基因是受已知可以在这个物种中作用的启动子控制的。这种方法要进一步分析假定的用来表达标记物的转基因个体，在最小启动子的控制下表达了基因会通过分析在什么地方表达了标记物来确定，例如分析转录RNA.如果RNA的含量高于在诱导或去抑制条件下的背景水平，说明最小启动子在我们研究的这种鳞翅目中是有活性的。类似地，如果在非诱导或抑制条件下的这种RNA含量低或不存在，说明最小启动子自身基础活性低。
当重组核酸编码麻痹多肽是有效链接时，这个表达控制序列可以是相同的，也可以是不同的。这里讨论的表达控制序列调控多个核酸序列是可以相同或不同的。复制的序列可以串联整合，整合进同一个染色体的不同区域，或者整合进不同的染色体。效应基因可以与反馈基因串联在一起，包括把这两种基因当成一个合并产物，或者将两种基因连同各自的启动子反方向放置，但要与增强子并排。
为了达到目标，我们可以调节表达控制序列（比如引入一个诱导型启动子和/或增强子单元）。包括但又不局限于那些可以被调控的合适的启动子：例如Drosophila或其它的hap70启动子，蜕皮激素调控的启动子，SaccharomycescerevisciaeGal4/UAS体系（在本文其他地方描述），以及其他已知的可被诱导的体系。杆状病毒染后启动子，即只在杆状病毒感染后才有活性的启动子构成了另一种可诱导的启动子。
对转基因表达的诱导或抑制叫做“表达开关”。对于该领域的专业人员来说控制表达开关是很简单的，并且麻痹可以在引入诱导因子后很短时间内开始作用，并且这个过程是可预测的，在某一时刻可以麻痹某一确定数目的鳞翅目昆虫。
例如，表达开关可以通过鳞翅目幼虫和无毒的化学物质（例如四环素）之间的作用以形成一种化学控制开关来控制表达。四环素可用水稀释，然后通过水汽作用于鳞翅目幼虫，或者通过在纺丝前的最后一次喂食来实施。化学控制开关与保幼激素/蜕皮激素开关的共同作用可以防止因化学品的污染而导致的bmPP在任何龄期的过早表达，这会导致鳞翅目绝食死亡。
可被四环素调控的分子开关可以和组成性启动子协同使用，比如前面所说的启动子（例如与CMV-IE启动子，杆状病毒启动子协同）。从而，目标基因的表达可以被专业工作者轻易地控制。
一般来说，能够控制正转录的物质要结合到启动子附近的增强子上，例如可以有助于增强聚合酶连接到启动子上。正转录控制还可以通过其它机制来实现，比如对抗抑制子效果的机制，例如阻碍抑制剂的转录或转译。比如，使用发卡RNA或核酶来阻碍编码转录抑制剂的mRNA的转录，可以抑制转录抑制剂。或者，使用可以直接结合转录抑制剂的物质，从而防止对转录或转译的抑制。
例如，由本文可知，麻痹肽的表达与保幼激素（JH）有关。保幼激素是在昆虫的咽侧体中产生的。保幼激素通过血淋巴分散，作用于响应组织。JH可被保幼激素酯酶（JHE）或保幼激素环氧化物水解酶（JHEH）分解。JHE和JHEH都会抑制JH的信号和反应。可响应JH的组织会产生这些酶中的一种或两种。例如，如果转基因中含有可以抑制这两种分解酶的表达控制元素，然后因此延长了诱导基因的效果，这在我们的工作中则为麻痹多肽。
可以采用一种正反馈的机理。在这种机理中，RNA或转译产物（即将要表达的功能性麻痹多肽或蛋白质，以及至少一个启动子）在转录增强子位点上作用，一般会结合到这个位点，从而会增强启动子的活性。一个例子是增强子和启动子连接在一起，基因产物通过增强子来增强启动子的活性，然后会增加该产物基因的转录水平，依次地进一步再消除抑制剂或增强启动子活性，从而形成一个正反馈循环。
例如，控制因子可以是tTA基因产物或类似物，一个活多个tetO操纵基因单元作为增强子功能性地链接到启动子上，tTA或者类似物通过tetO增强启动子的活性。tTA的基因产物（四环素抑制的转录活化剂）作用在tetO操纵基因的序列上[Baron U,Bujard H“Tet repressor-based system for regulated geneexpression in eukaryotic cells:principles and advances”(Methods Enzymol327:401-421(2000));Gossen M,Freundlieb S,Bender G,Muller G,Hillen W,Bujard H“Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells”(Science268:1766-1769(1995));Gossen M,Bujard H“Tight control of gene expression inmammalian cells by tetracycline-responsive promoters”(ProcNatlAcadSci USA89:5547-5551(1992))].在启动子的上游，任意一端，当连接上tTA基因的产物时，受近距离的启动子影响，tetO可以增强转录水平。如果tTA基因是包含tetO操纵基因和启动子的机构盒的一部分，那么当tTA基因产物表达时就会发生正反馈。
这个体系容易受四环素的控制，四环素会通过结合基因产物来阻止tetO的转录。对于使用tTA或类似物的体系，当使用tTA基因产物时，可通过是否使用四环素，或者改变四环素的浓度，来调控反馈机理。
因此，tTA作为一种四环素控制的转录因子起作用。还有一个例子是链阳性菌素调控的表达体系。我们需要意识到的是有关的转录因子将会决定相应的转录因子的结合位点。
在另外一种方案中，表达开关可以由温度控制（如：刻痕），进而形成一种温度可控开关。对温度可控开关适用的启动子中的一个例子是hsp70热机激启动子，这种启动子允许用户通过改变环境温度（如：鳞翅目在实验室中或在大规模饲养的设备中表达的温度的改变）来控制表达。另外一个关于温度可控的例子是Fryxell,K.J.和Miller,T.A.发表的文章“Autocidal Biological-Control：aGeneral Strategy for Insect Control-Based on Genetic-Transformation with a HighlyConserved Gene”(Journal of Economic Entomology88,1221-1232(1995))。表达开启的温度可以被选择进而使所选基因的表达在温度显著低于培养鳞翅目幼虫所需温度（24-30℃）时能够快速上调。从如bmPP或其类似物中的延迟恢复应该使紧接的鳞翅目幼虫的麻痹可以回到一个能进行稳定地人工纺丝且可以纺出所有丝的优化温度范围。温度可控开关连续地与青春激素/蜕化素结合在一起来阻止偶尔的充分冷却且操纵鳞翅目幼虫的温度开关，这将导致bmPP在任何龄期过早地表达。例如使用GAL4,且使用GAL80或其突变体来进一步实现可控，或许可以通过温度控制来抑制有效的基因（如麻痹多肽），直到传递适当的刺激。在此系统中，酵母GAL4蛋白会通过使用选择的增强子或启动子而在特定的细胞中表达。GAL4转录因子会键合到GAL4上游激活序列（UAS）上来激活所选报告基因的转录[Brand AH,Perrimon N“Targeted gene-expression as a means ofaltering cell fates and generating dominant phenotypes”(Development118,401-415(1993))]。
在果蝇中普遍存在的含有微管蛋白启动子的GAL80的表达完全抑制了GAL4驱动的锅神经GFP的表达[Lee T,Luo L“Mosaic analysis with arepressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.”(Neuron22,451-461(1999))].GAL80蛋白通过二聚体-二聚体相互作用键合到GAL4的活性区域来抑制其活性，进而阻止了GAL4与转录机器之间的相互作用。因此，可以想象的是结合使用GAL80和GAL4/UAS标记将会对感兴趣的标记基因实现阻遏表达。
在另外一种方案中，bmPP及其类似物的表达可由一种化学抑制开关来控制。而在食物中加入无毒的可化学抑制如bmPP表达的物质（如四环素/tTAV）且通过一种负反馈循环来培养转基因鳞翅目幼虫会导致麻痹伴随最后龄期鳞翅目幼虫的绝食。我们必须将化学抑制开关连续地与青春激素/蜕化素开关结合在一起来抑制临时进食（如在蜕落时），因为蜕落会导致bmPP或其类似物的过早表达。
因此，我们需要意识到的是诱导的或未能抑制的表达水平可以在一个有用且可预测的方式下通过调节正反馈系统的序列来进行改善。
麻痹和/或活化麻痹多肽可以通过独立于转录和转译控制信号的一些方法来修改，如：使用一种核定位信号，修改活化区域等等。[Fussenegger,M.“The impactof mammalian gene regulation concepts on functional genomic research,metabolicengineering,and advanced gene therapies”BiotechnolProg17,1-51(2001)]。
此外，标记物可以被包含于信息披露的转基因系统中。在鳞翅目中，转化成功率非常低，因此如果能通过一些方法很容易地识别转基因鳞翅目将会非常有用。标记物可以独自引入，也可以与其它一个或多个外源多肽结合后引入。一种标记物如果具有以下所举功能的话就有可能别使用，如：能够确认构建功能，能识别那些外源构建正在别表达的鳞翅目幼虫等等。适宜的标记物对于技术工人来说显得很明显，且其包括但不仅仅局限于无毒荧光蛋白，如：DsRed2,绿色荧光蛋白(GFP),ECFP,和EGFP的衍生物。
将构造引入到胚胎进而产生一种转基因的鳞翅目的方法（如通过显微注射的方法）较方便。虽然存活率会随鳞翅目物种的不同而存在差异，但对于一些显微注射胚胎方面的专业人员来说这种存活率通常会很高（高达75%）。通常，预胚盘卵被装有质粒DNA和/或重组病毒溶液的细小玻璃毛细管穿破。从注入病毒卵的回交幸存者孵化出的G1鳞翅目幼虫被进一步筛选来表达感兴趣的基因。将转基因G1与正常鳞翅目昆虫交叉繁殖会导致孟德尔氏遗传。先驱者通过使用一种piggyBac转座子已经在三种鳞翅目物种（苹果蠹蛾，红铃虫和桑蚕）中成功产生了转化株。
一旦转基因以一种稳定的方式整合到鳞翅目卵或其早期的胚胎基因组中，技术人员便可利用传统的方法来产生转基因鳞翅目，这样，转基因存在于所有的体细胞和胚细胞中。在另一种实施例中，当麻痹表达的不同水平从两个或多个转基因鳞翅目中获得时，这些转基因鳞翅目可以被基因杂交进而产生一种可以进行更高水平或完全水平麻痹表达的转基因鳞翅目。
在一些方案中，转基因鳞翅目的麻痹多肽基因是杂合的。例如，当潜在致命的麻痹多肽被既定产生时，它可能有利于鳞翅目是杂合的，进而限制产生肽的数目。在另外一些实施方案中，鳞翅目的转基因是纯合的。产生纯合转基因鳞翅目的方法（如使用合适的回交）很常见。
大家普遍认为，对于不同物种而言，存在不同水平的表达是合适的。因为用于驱动正反馈系统的特定序列的转录因子也可被用于表达其它的基因，所以这一双向表达系统可以通过制造两个分离的建构来实现。第一种建构可以用起子来制造（通常是一种启动子转录因子建构，这里是正反馈构造）。第二种建构是用受一种复合启动子（结合位点+最小启动子）控制的感兴趣基因或分子来制造，这种复合启动子会对第一种构造的转录因子产生响应[Bello,B.,Resendez-Perez,D.and Gehring,W.J.″Spatial and temporal targeting of geneexpression in Drosophila by means of a tetracycline-dependent transactivator system″Development,125,2193-2202(1998)].这对于这些正反馈起子也是适合的。另外，拥有两种功能元素（感兴趣的起子和结合位点-最小起子-基因）的这两种构造可以被结合于相同的构造上。在相同构造上的这种结合对于一个大规模饲养设备具有潜在的好处，因为这种结合会大幅降低两种功能元素可能被重新结构而分离的风险。除此之外，完全表达系统可以通过一个单一转化事件而引入，这也意味着鳞翅目系统纯合子在仅仅一个基因座而非两个基因座上是纯合的，这样可以通过繁殖提高系统构建的速率且减小由于随机插入突变而引起的潜在适应缺陷。
鳞翅目昆虫的多肽克隆及表达方法很常见。从特定来源“获得”的一个序列并不一定编译成和来自同一来源的野生型鳞翅目昆虫的麻痹诱导多肽相同的多肽序列。所有保留了野生型鳞翅目的酶的麻痹作用的多肽都可以被利用，包括天然存在的等位基因变异体或人为引入到蛋白质中的突变体。诱导麻痹的多肽片段也可以被利用。
用来设计和准备适合产生转基因的鳞翅目昆虫（或作为载体感染的鳞翅目）的构造的方法是很常见的。关于这些方法，以及其他的与分子生物过程有关的专利，参见，比如：Sambrook J and Russell D,″Molecular Cloning:A LaboratoryManual″,Third Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2001);Wu W,Welsh MJ,Kaufman PB,Zhang HH″Methods in Gene Biotechnology″,Second edition,CRCPress,New York,N.Y.,(2003),″Recombinant Gene Expression Protocols″,inMethods in Molecular Biology,Vol.62,Tuan,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.,(1997);and″Current Protocols in Molecular Biology″,Ausabel et al,eds.,JohnWiley&Sons,N.Y.(1994-2010)。
诱导麻痹5龄蚕的非转基因方法以及随后绕丝的影响和蚕丝的性能都可以被实施和研究，如同下面例子所描述的一样但不仅限于此例：
例1
在桑蚕右边第一个伪足的根部注射已提取的并暴露于空气中10分钟的血淋巴0.l ml，或者注射100ng/μl的麻痹肽的水溶液0.l ml。
注射了血淋巴的蚕将在5分钟内被麻痹，蚕的下颌骨和胸腿的一些持续运动除外。注射了血淋巴的蚕将保持几个小时静止不动，且可以立即被抽丝。注射人工合成的桑蚕麻痹肽也会很快的使蚕不动，但是较注入血淋巴的蚕而言动物在吐丝之前常常需要较长的时间，而且肽注射液的影响会比注射血淋巴持续的时间短。
对于这两种方法，都有可能从l0mm/s到25mm/s以多种速度获得绕丝样品。注射了血淋巴的蚕只是用少量的胶带在尾部固定住，然后蚕丝就被直接卷绕在特殊分析线轴上。为了考虑到不同的后拉伸处理对蚕丝性能的影响而进行进一步的实验，注射了合成肽的蚕通过更为先进的限制方式进行了研究。
与未被麻痹的蚕的蚕丝相比，从被合成肽麻痹的蚕中取得的蚕丝其应力-应变曲线都表现出了较少的分散性，以及更一致的横截面积。这种蚕丝质量的提高是显著的，尽管不同的绕速表明麻痹肽处理的蚕丝可以一致的减少纤维的变化。有趣的是，尽管血淋巴注射诱导引起的麻痹导致了更容易的操纵和从麻痹的蚕中抽丝，但与从通过合成肽麻痹的幼虫中得到的样品相比，在血淋巴注射后得到的蚕丝样品在应力-应变的重复性上并没有表现出明显的改善。
麻痹蚕幼虫使通过其他方式无法实现的实验成为了可能，如将直接从蚕嘴里拉出的数百米丝绕在一个卷轴上或者将直接从蚕嘴里抽出的丝绕在一个后拉伸装置N和具有如胶剥离，水浴和化学涂层特性的洗浴池L上。图4描述了这样一种后拉伸装置N。
图4进一步展示了一条麻痹的蚕F，一个用于检测丝尺寸及性质的传感器或传感器组G，例如丝的移动和张力，可能含有用于加热和冷却的热阻器，所绕的丝H，用于卷绕所绕丝H的后拉伸辊I，一个用于拉伸已绕丝H的驱动器J，一个用于对已绕丝H进行拉伸感应的驱动器传感器K，一个可以通过其对所绕丝H进行卷绕的洗浴池L，以及一个收集辊M。这种依赖于处理水平的后拉伸改性会显著影响丝的力学性能以及其他一些可调的性质。仅仅举例说明，图5说明了一种特殊处理（小尺度后拉伸到10%和16%）对于此处所示强拉丝纤维相对于直接从一个蚕茧中抽出的丝的影响。这些曲线说明了应力应变之间的关系。
后拉伸在目前披露中的意思是在对静止不动的鳞翅目幼虫进行绕丝时中或绕丝后对丝的拉伸或延伸。
附图标记列表
200 通过麻痹固定鳞翅目幼虫
210 在鳞翅目幼虫中转基因表达具有麻痹效果的多肽
220 注入血淋巴，此血淋巴从鳞翅目幼虫中提取出来并经过氧化处理后再进行注射
230 注入一种具有麻痹效果的天然或人造多肽
240 直接从鳞翅目幼虫中人工绕丝
300 机械绕丝装置
A 卷轴
B 马达
C 鳞翅目幼虫
D 固定许多纺丝幼虫的设备
E 机械绕丝装置洗浴池300
F 麻痹的蚕/不动的鳞翅目幼虫
G 丝参数传感器以及用于加热制冷的热阻器
H 所绕的丝
I 后拉伸辊
J 拉伸丝的驱动器
K 驱动器传感器
L 后拉伸设备的洗浴池
M 收集辊
N 后拉伸装置
Claims (18)
1.一种固定鳞翅目幼虫从而可以允许连续强拉丝的方法，包括：
至少通过下列一个办法来麻痹鳞翅目幼虫
a.在鳞翅目幼虫中转基因表达具有麻痹效果的多肽；
b.注入血淋巴，此血淋巴从鳞翅目幼虫中提取出来并经过氧化处理后再进行注射；或者
c.注入一种具有麻痹效果的天然或人工多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽是一种蛋白质。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转基因的表达至少包括如下所述的其中一个：
a.引入一种病毒载体；
b.引入一种基于转座子的载体；或
c.通过表达控制序列进行调控。
4.根据权利要求3所述的方法，表达控制序列至少由可以进一步控制转基因表达的诱导型启动子或增强子元素中的一个组成。
5.根据权利要求4所述的方法，转基因表达的控制至少包括如下所述的其中一个
a.应用化学品来诱导转基因表达；
b.应用温度来诱导转基因表达；或
c.应用化学品来抑制基因表达。
6.根据权利要求3所述的方法，病毒载体或转座子基于的载体进一步包括一个标记基因。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，具有麻痹效果的多肽是bmPP，一种天然的同系物或其片段。
8.根据权利要求7所述的方法，所述的bmPP、天然的同系物或其片段被突变，但保留了麻痹效果。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括：
改进具有麻痹效果多肽的麻痹或活性中的至少一项且这种改进独立于转录控制信号或转译控制信号。
10.使用权利要求1到9的其中一项所述的方法来固定鳞翅目幼虫。
11.一种从鳞翅目幼虫中强拉丝的方法，包括：
根据权利要求1到9中至少一项所述的方法来固定的鳞翅目昆虫并从鳞翅目幼虫中直接人工纺丝。
12.从一个不动的鳞翅目幼虫中强拉丝的设备，包括：
鳞翅目幼虫（C）被连接到一个机械绕丝装置（300）上，这样鳞翅目幼虫（C）就可以根据权利要求1至9中的至少一项所述的方法来固定，以及一种拾起丝的装置。
13.根据权利要求12的设备，其适合于在多种速度以及多种卷轴（A）下工作，这种卷轴可以是单一的，也可以是平行的多个。
14.根据权利要求12和13中的任一项所述的设备，其中从不动的鳞翅目幼虫（C）抽出的双股单丝在抽丝过程中以单位长度上可控的捻度捻在一起。
15.根据权利要求12和13中的任一项所述的设备，由可控制环境条件的环境控制器组成，由此环境条件包括温度和湿度。
16.用于后拉伸丝（H）的设备（N），其包括一个或多个传感器（G），一个或多个后牵引辊（Ⅰ），一个驱动器（J），一个驱动器传感器（K），一个收集辊（M），由此，固定的鳞翅目幼虫（F）可被连接到后拉伸装置（N）上且不动的鳞翅目幼虫（F）可根据要求1至9中至少一个要求的方法来固定。
17.根据权利要求16所述的装置，包括一个洗浴池（L），通过此洗浴池可以进行抽丝。
18.根据权利要求16或17所述的装置，进一步包括可调节不动鳞翅目幼虫（F）的温度的温度控制器。
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