KR101922433B1

KR101922433B1 - 재조합 거미독 단백질 발현용 베큘로바이러스 또는 이를 이용하여 누에로부터 생산된 재조합 단백질

Info

Publication number: KR101922433B1
Application number: KR1020180085156A
Authority: KR
Inventors: 최광호; 김성렬; 김성완; 유정희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2018-11-28

Abstract

본 발명은 거미독 유전자(PnTx2-6)를 포함하는 베큘로바이러스에 관한 것으로서, 상기 벡터를 통해 재조합 거미독 단백질을 생산할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 베큘로바이러스 발현 시스템을 통해 기존보다 다량의 목적 단백질을 생산할 수 있는 재조합 거미독 단백질 발현용 유전자와 이에 적합한 누에 품종을 선발할 수 있다. 또한 이렇게 얻은 거미독 단백질을 각종 질환의 의약품으로 용이하게 이용할 수 있다.

Description

재조합 거미독 단백질 발현용 베큘로바이러스 또는 이를 이용하여 누에로부터 생산된 재조합 단백질 {Baculovirus expressing recombinant spider toxin protein or trasngenic silk worm manufactured therefrom}

본 발명은 재조합 거미독 단백질(PnTx2-6) 발현용 베큘로바이러스 또는 이를 사용하여 누에로부터 생산된 재조합 거미독 단백질에 관한 것이다.

2003년 인간 유전자 지도 해독 후 새로운 바이오의약품 개발을 위한 기술개발의 필요성이 국가산업 측면에서 크게 부각되고 있다. 특히, 세계 제약 시장의 주력이 기존의 화학합성 의약품에서 바이오 의약품으로 빠르게 전환되고 있으며, 이 중 대부분을 의약용 단백질이 차지할 전망이다. 또한 의약용 재조합 단백질 치료제에 대한 수요도 기하급수적으로 증가되고 있어 저렴한 비용으로 대량생산이 가능한 발현시스템을 이용한 재조합 의약품 생산기술 개발은 미래 의약산업 성장에 크게 기여할 것으로 예측된다.

한편, 의약품으로 개발될 잠재성 높은 인체 유래의 단백질들은 기존 미생물 기반 발현 기술로는 발현 효율이 매우 저조하므로 이들 난발현 단백질 관련 문제를 해결할 수 있는 혁신적이 재조합발현 시스템 개발의 필요성이 대두되고 있다. 재조합 인간 단백질 생산을 위해서 우선 미생물 발현 시스템(대장균 및 효모)을 고려할 수 있는데, 이들 미생물 발현시스템은 고등 진핵세포 발현시스템에 비해 생산단가가 저렴하며 생산 공정이 간단하다는 장점은 있으나, 고비용 기술인 동물세포에서 생산하는 경우에는 바이러스와 광우병의 원인인 프라이온 등의 오염 가능성 문제가 있다.

현존 생물 중 가장 많은 종을 차지하는 곤충은 21세기 녹색 신성장동력산업으로서 중요한 위치를 차지하고 있어, 다양한 국내외 곤충의 가치를 재평가하고 잠재된 식품 또는 약용으로의 가치를 발굴할 경우 고부가가치를 창출할 수 있다. 이 중에서도 누에는 바이오신약 생산을 위한 살아있는 생체공장으로 매우 적합하다. 누에는 현재 한 마리당 20원 정도의 가격으로 생산단가가 매우 낮고, 각 세대가 45일로 짧으면서도 연중 사육이 가능하고 사육조건이 까다롭지 않다. 더구나 누에는 인간과 공통병원균이 없어서 누에에서 생산된 단백질은 전염병 등에서 안전성이 보장된다. 누에는 곤충 가운데 완전하게 인간에게 가축화 되어 인간의 사육에 의해서만 생존이 가능한 곤충이며, 자연계에 노출되어도 살아남을 수 있는 것을 기대할 수 없기 때문에 생태계 교란을 걱정할 필요가 없다.

현재 재조합 단백질 생산을 위해서 우선 미생물 발현 시스템(대장균 및 효모)을 고려할 수 있는데, 이들 미생물 발현 시스템은 고등 진핵세포 발현시스템에 비해 생산단가가 저렴하며 생산 공정이 간단하다는 장점은 있으나, 양질의 단백질을 생산하는 동물세포의 경우에는 바이러스와 광우병의 원인인 프라이온 등의 오염 가능성이 문제가 있다. 그러나 누에는 진핵생물에 속하며 인간 또는 가축 간에 공통 병원균이 존재하지 않아 누에로부터 생산한 바이오의약품은 미생물에서의 생산보다 양질의 단백질을 저비용으로 많이 생산할 수 있다. 따라서 다수의 유용 단백질이 누에에서 베큘로바이러스 발현 연구가 진행되고 있다.

한편, 거미의 독성분은 혈관확장, 혈행 개선의 효과가 확인되는 등, 다양한 연구가 진행되고 있으나 아직 효과적인 대량 생산방법을 확립하지 못해 활용에 어려움을 겪고 있는 실정이다. 거미독을 누에를 이용하여 대량생산하는 방법을 구축하므로 인하여 다른 유용단백질을 누에에서 발현하여 현재 합성의약품에 의존하는 것을 경제성이 높은 고효율의 재조합단백질 발현 시스템으로 전환할 수 있다(Tatsuya Kato, 2010; Hye-Seong Kim, 2000).

따라서 본 발명자들은 거미독의 유효 성분을 대량 생산할 수 있는 재조합 베큘로바이러스를 개발하고 이를 통해 누에로부터 재조합 거미독을 생산할 수 있는 시스템을 구축하고자 한다.

대한민국 등록특허 제10-1634272호 (발명의 명칭 : 청색 형광 실크를 생산하는 형질전환 누에, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2016년06월22일) 대한민국 등록특허 제10-1570784호 (발명의 명칭 : 황색 형광 실크를 생산하는 형질전환 누에, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2015년11월16일) 대한민국 등록특허 제10-1510437호 (발명의 명칭 : 적색 형광 실크를 생산하는 형질전환 누에, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2015년04월02일) 대한민국 등록특허 제10-1570783호 (발명의 명칭 : 항균 펩타이드를 함유하는 형질전환 누에, 출원인 : 대한민국, 등록일 : 2015년11월16일)

Jung AR et al., The effect of PnTx2-6 protein from Phoneutria nigriventer spider toxin on improvement of erectile dysfunction in a rat model of cavernous nerve injury. Urology. 2014. 84(3), 730(e9-17). Torres FS et al., Functional expression of a recombinant toxin - rPnTx2-6 - active in erectile function in rat. Toxicon. 2010. 56(7), 1172-1180. Marcelo R. V. Diniz et al., functional expression and purification of recombinant Tx1, a sodium channel blocker neurotoxin form the venom of the Brazilian "armed" spider, phoneutria nigriventer., Protein Expression and purification. 2006. 50, 18-24. Tatsuya Kato, Silkworm expression system as a platform technology in life science., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(3), 459-470. Hye-Seong Kim, High-level expression of a foreign gene by a recombinant baculovirus with an expanded host range., Cytotechnology, 2000, 32, 87-92.

본 발명의 목적은 재조합 거미독 단백질(PnTx2-6) 발현용 베큘로바이러스 또는 이를 사용하여 곤충세포와 누에로부터 생산된 재조합 거미독 단백질을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 서열번호 5, 6 또는 7의 염기서열을 포함하는 베큘로바이러스에 관한 것이다.

상기 서열번호 5, 6 또는 7의 염기서열은 서열번호 1의 거미독 단백질(PnTx2-6) 발현 유전자(Phoneutria nigriventer neurotoxin Tx2-6 mRNA, complete cds, Gen bank Sequence ID: AY054746.1)로부터 유래된 것을 특징으로 한다.

상기 베큘로바이러스는 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)일 수 있다.

따라서 본 발명에서는 서열번호 5, 6 또는 7의 염기서열을 포함하는 베큘로바이러스를 제조하는 단계; 상기 베큘로바이러스를 곤충세포에 트랜스펙션하여 바이러스를 감염시키는 단계; 및, 바이러스에 감염된 곤충세포의 세포 또는 이의 배양액으로부터 재조합 거미독 단백질을 추출 및 정제하는 단계;를 포함하는 재조합 거미독 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 5, 6 또는 7의 염기서열을 포함하는 베큘로바이러스를 제조하는 단계; 베큘로바이러스를 곤충세포에 트랜스펙션하여 바이러스를 감염시키는 단계; 바이러스에 감염된 세포의 배양액을 누에에 주사하여 바이러스를 감염시키는 단계; 및, 바이러스에 감염된 누에로부터 재조합 거미독 단백질을 추출 및 정제하는 단계;를 포함하는 재조합 거미독 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 누에에 주사되는 배양액 내의 바이러스 농도는 1x10⁷~ 2x10⁷/개체인 좋다.

상기 곤충 세포주는 담배거세미나방(Spodoptera frugiperda) 유래 세포 또는 누에(Bombyx mori) 유래 세포일 수 있다.

상기 누에의 품종은 가잠(Bombyx mori L.)의 잠123인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 서열번호 5, 6 또는 7의 염기서열을 포함하는 베큘로바이러스에 관한 것으로서, 상기 서열번호 5, 6 또는 7의 염기서열은 재조합 거미독 단백질(PnTx2-6) 발현용 유전자이다. 보다 자세하게는 상기 서열번호 5, 6 또는 7의 염기서열은 서열번호 1의 거미독 단백질(PnTx2-6) 발현 유전자(Phoneutria nigriventer neurotoxin Tx2-6 mRNA, complete cds, Gen bank Sequence ID: AY054746.1)로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 거미독 단백질 발현 유전자 서열은 아래 그림처럼, signal peptide와 거미독 단백질을 발현하는 core 영역(Mature toxin, mature form)으로 나뉜다.

본 발명에서는, 재조합 거미독 단백질을 얻기 위해 core 영역을 1회 또는 다회 반복 삽입하며 반복 삽입시에는 그 사이에 단백질을 자르기 위해 P2A peptide 서열을 삽입하였다. 또한 이 P2A peptide 서열은 core 영역(mature form)에 재조합 단백질의 정제를 위해 붙여둔 6x His 서열 뒤에 존재하도록 하였다.

서열번호 2는 signal peptide와 단백질을 발현하는 core 영역 및 P2A와 6x His를 가지며, 서열번호 4는 signal peptide가 제외된 거미독 단백질을 발현하는 core 부분과 P2A peptide, 6xHis 서열로 구성된다. 서열번호 5의 서열은 core 영역이 한번 삽입된 것이기 때문에 서열번호 2를 기준으로 P2A peptide가 존재하지 않고 6x His 뒤에 stop codon을 가지는 구조를 가진다.

서열번호 5~7의 염기서열은 본 발명의 재조합 거미독 단백질을 발현하는 core 유전자가 1회 삽입되거나 2회 또는 6회 삽입(반복)된 구조를 갖고 있으며, 특히, 서열번호 6과 7의 서열은 서열번호 2의 염기서열과 서열번호 4의 염기서열을 갖는 유전자의 조합을 통해 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 베큘로바이러스는 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)이며, 바람직하게는 AcNPV의 게놈 DNA일 수 있다. AcNPV는 나비목 곤충에 병원성(감염성)이 있는 바이러스이지만, 누에에 있어서는 바이러스 감염성이 낮다. 따라서 본 발명을 통해 누에 품종에서 바이러스 감염성이 높아 단백질 발현률을 높일 수 있는 품종을 선발할 필요가 있다.

본 발명에서의 베큘로바이러스는 목적 유전자를 숙주세포 또는 숙주동물에 전달하는 기능을 하며, 항생 물질 내성 유전자, 형광 단백질 유전자 등 마커 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 서열번호 5, 6 또는 7의 염기서열을 포함하는 재조합 베큘로바이러스를 제공할 수 있는데, 이 때, 곤충 세포에서 바이러스를 만들어 이를 누에에 감염시킴으로써 목적 단백질을 생산할 수 있다. 이 때, 상기 곤충세포는 담배거세미나방(Spodoptera frugiperda) 유래 세포 또는 누에(Bombyx mori) 유래 세포일 수 있다.

본 발명의 베큘로바이러스 감염은 누에의 1~5령 어떤 시기라도 좋으나 바람직하게는 몸집이 커서 많은 바이러스를 생산할 수 있는 5령 누에를 사용하는 것이 더 적절하다. 또한 베큘로바이러스 감염용 누에는 작잠(Antheraea pernyi), 천잠(Antheraea yamamai), 가잠(Bombyx mori L.) 또는 율충(Caliqula japonica)일 수 있으며, 바람직하게는 가잠(Bombyx mori L.)을 사용하는 것이 좋으며, 그 품종은 잠123인 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 곤충세포, 누에로부터 거미독 단백질을 추출 및 정제하는 방법은 당업계의 통상의 실시자들에게 알려진 단백질 분리/정제 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는 세포 배양액이나 누에 혈액 자체, 세포 또는 누에의 용해액으로부터 친화성 크로마토그래피 등의 방법으로 정제가능하다.

Jung AR 등(2014)의 선행기술문헌에 거미독 단백질을 대장균에서 발현하는 기술이 개시되어 있지만 이를 베큘로바이러스 발현 시스템에 도입할 수 있음은 전혀 암시되어 있지 않다. Torres FS 등(2010)의 선행기술문헌에서도 거미독 단백질(PnTx2-6) 유전자가 대장균에서 발현할 수 있다는 것만이 개시되어 있다.

원핵 생물인 대장균에서의 단백질을 발현하게 되면, 단백질의 post-translation이 제대로 일어나지 않기 때문에 목적 단백질의 mature form만이 발현되는데 이러한 조건에서 mature form 단백질은 세포질 내에 insoluble form으로만 발현된다. 따라서 대장균과 같은 단백질 발현 시스템에서는 목적 단백질에 soluble form 발현을 도와주는 단백질이 융합된 시스템이 구축되어야 한다는 단점이 있다. 게다가 이렇게 발현된 단백질은 정제 후에는 오히려 목적 단백질의 활성을 저해할 수 있어 별도의 효소작용을 통해 제거해야만 한다는 단점도 발생한다.

그러나 본 발명에서는 베큘로바이러스를 이용하여 진핵생물에서 거미독의 발현을 유도하고, signal peptide와 glutamine rich 부분과 PnTx2-6의 mature toxin이 존재하는 전체 유전자 서열을 사용한다. 이 진핵생물 발현 시스템 중 하나인 곤충에서의 발현은 단백질의 post-translation이 일어나 목적 단백질이 soluble form으로 발현가능하며, 원핵생물인 대장균 발현 시스템보다 진핵생물유래 단백질 생산에 있어서 제조공정이 현저하게 개선된 방법으로 목적 단백질을 얻을 수 있다.

도 1은 재조합 거미독 단백질 발현용 유전자를 제조하기 위한 서열번호 2~4의 DNA 염기서열을 나타낸다.
도 2의 A~C는 거미독 단백질(PnTx2-6) 발현용 유전자인 SEANx1, SEANx2, SEANx6가 베큘로바이러스 제작용 전이벡터(pFastBac-HTC)에 삽입된 pFastBac-SEANx1, pFastBac-SEANx2, pFastBac-SEANx6의 구조를 나타낸다. 도 2의 D~2F는 제한효소인 BamHI과 XhoI을 사용하여 pFastBac-HTC에 SEANx1, SEANx2, SEANx6가 삽입되었는지를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 pFastBac에 삽입된 SEANx1(도 3A), SEANx2(도 3B), SEANx6(도 3C) 유전자의 실제 DNA 염기서열이 이론적으로 설계된 목적 DNA 염기서열과 일치하는지 확인한 결과를 나타낸다(SEANx1: 도 3A, SEANx2:도 3B, SEANx6:도 3C).
도 4는 본 발명의 재조합 바이러스 제작 및 목적 단백질 생산 단계를 나타내는 모식도이다. 도 4A는 본 발명의 거미독 유전자 서열(SEANx1, SEANx2, SEANx6)이 삽입된 pFastBac-SEANx1, pFastBac-SEANx2, pFastBac-SEANx6를 이용하여 베큘로바이러스의 genomic DNA에 도입함으로써 SEANs Bacmid를 제조한 후, 이를 이용하여 곤충세포에서 재조합 바이러스를 제작하는 단계를 나타내는 모식도이다. 도 4B는 상기 재조합 바이러스를 곤충세포인 Sf9과 누에에 감염시켜 단백질을 생산하는 단계를 나타내는 모식도이다.
도 5는 전이벡터가 도입된 균주를 colony PCR로 확인한 결과를 나타낸다. 도 5A는 pFastBac-SEANx1, pFastBac-SEANx2, pFastBac-SEANx6를 AcNPV Bacmid에 transformation한 균주에 대한 colony PCR 결과이다. 도 5B는 SEANx1 Bacmid, SEANx2 Bacmid, SEANx6 Bacmid가 확인된 각 콜로니에서 Bacmid DNA를 추출하여 전기 영동한 결과를 나타낸다(130 kb 이상으로 화살표로 표시한 부분).
도 6은 재조합바이러스 vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6에 감염된 세포에서의 목적 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸다. 도 6A는 RT-PCR로 vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6에 감염된 세포에서의 거미독 PnTx2-6 유전자 발현을 확인한 결과를 나타내며(바이러스 비감염 세포인 대조군은 control로 표기함), 도 6B는 6x His 항체 및 Western blot으로 vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6에 감염된 세포에서 거미독 단백질 생성을 확인한 결과이다(MD는 cell culture media에서 확인된 단백질, CL은 cell lysate에서 확인된 단백질, control은 바이러스 비감염 세포).
도 7은 vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6에 감염된 곤충세포에서의 목적 단백질의 발현양을 6x His에 대한 ELISA를 이용하여 정량적으로 비교 분석한 실험이다(MSx1 : vSEANx1 감염 세포의 배양액, MSx2 : vSEANx2 감염 세포의 배양액, MSx6 : vSEANx6 감염 세포의 배양액, CSx1 : vSEANx1 감염 세포의 cell lysate, CSx21 : vSEANx2 감염 세포의 cell lysate, CSx61 : vSEANx6 감염 세포의 cell lysate).
도 8은 vSEANx2에 감염된 누에의 품종별/감염일별로 거미독 PnTx2-6 유전자(SEAN으로 표기함)에 대한 RNA 발현 정도를 RT-PCR과 real-time PCR로 확인한 결과를 나타낸다(도 8A: RT-PCR, 도 8B: Real-time PCR, 1d~5d는 각각 재조합바이러스 주입 이후의 날짜 1~5일째를 의미함).
도 9는 vSEANx2에 감염된 누에의 품종별/감염일별로 거미독 유전자의 단백질 발현 정도를 혈액(Hemolymph)과 몸체(Whole body)에서 6x His 항체를 이용하여 western blot을 수행한 결과를 나타낸다.
도 10는 잠종 선발 1차에서 거미독 단백질의 발현이 높은 것으로 확인된 잠123, 잠125, 백옥잠에, vSEANx2 바이러스 농도를 높여(1x10⁷/개체, 2x10⁷/개체) 감염시킨 후, 6x His 항체를 이용하여 혈액(Heamolymph)과 몸체(whole body)에서의 거미독의 단백질 발현 정도를 western blot으로 확인한 것이다.
도 11은 2차 선발된 잠123과 잠125에 거미독 반복 구조 재조합 바이러스인 vSEANx2, vSEANx6을 감염시켜 혈액과 지방체에서의 발현된 단백질을 6x His에 대한 ELISA를 통하여 확인한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 거미독 유전자(PnTx2-6)가 도입된 베큘로바이러스의 제조>

거미독 발현을 위한 베큘로바이러스를 제조하기에 앞서, 서열번호 1의 DNA 염기서열을 이용하여 타겟 유전자를 제조하기 위한 3종의 유전자 서열(서열번호 2~4)을 합성하였다. 이 때, 서열번호 2~4의 각 염기서열의 base 단위들이 갖는 기능은 도 1에 나타내었다.

도 1을 참고하여 서열번호 2~4에 대해 설명하면, 거미독의 유전자인 PnTx2-6의 signal peptide와 mature form 서열이 존재하는 full gene의 C-term에 종결코돈을 제거하고 self cleavage peptide인 P2A와 6x His(histidine) tag을 삽입한 것을 서열번호 2의 염기서열을 갖는 Clone #1이라 명명하였다. 또한 PnTx2-6 full gene에서 signal peptide 서열을 제거하고 C-term에 P2A와 6x His tag을 삽입한 서열번호 3의 염기서열을 갖는 Clone #2라 하였다. 그리고 PnTx2-6 full gene에서 signal peptide 서열을 제거하고 C-term에 6x His tag과 종결코돈을 삽입한 서열번호 4의 염기서열을 갖는 Clone #3라 명명하였다.

이렇게 구성된 Clone #1(서열번호 2)과 Clone #3(서열번호 4)의 조합을 서열번호 6의 염기서열을 갖는 SEANx2(목적 유전자의 2반복 구조), Clone #1(서열번호 2)과 Clone #3(서열번호 4) 사이에 Clone #2(서열번호 3)를 4번 반복한 구조를 삽입한 것을 서열번호 7의 염기서열을 갖는 SEANx6(목적 유전자의 6반복 구조)이라 명명하였다(도 2A~C 상단에 구조를 표현함). SEANx1 서열은 SEANx2과 SEANx6와 달리 반복 삽입 구조를 갖지 않으며, 단지 목적 유전자의 서열을 한번 삽입하는 구조로, Clone #1에 self cleavage site인 P2A peptide를 제거하고 His-tag과 종결 코돈을 삽입한 것이다.

이에 서열번호 1~7의 DNA 서열을 하기에 나타낸다. 또한 각 서열 DNA가 발현하는 거미독 관련 펩타이드 서열도 같이 나타내었다.

서열번호 1 : Phoneutria nigriventer neurotoxin Tx2-6 mRNA, complete cds, Gen bank Sequence ID: AY054746.1

서열번호 8 : (서열번호 1의 DNA 서열을 통해 발현되는 펩타이드 - Accession No. AAL 14349.1)

서열번호 2 : (Clone #1 DNA 서열)

서열번호 3 : (Clone #2 DNA 서열)

서열번호 4 : (Clone #3 DNA 서열)

서열번호 5 : (SEANx1 DNA 서열)

서열번호 9 : (SEANx1 서열을 통해 발현되는 거미독 펩타이드 서열)

서열번호 6 : (SEANx2 DNA 서열)

서열번호 10 : (SEANx2 서열을 통해 발현되는 거미독 펩타이드 서열)

서열번호 7 : (SEANx6 DNA 서열)

서열번호 11 : (SEANx6 서열을 통해 발현되는 거미독 펩타이드 서열)

상기 SEANx1, SEANx2, SEANx6의 DNA 서열에서 빨간색은 signal peptide 서열을 나타내고, 검은 밑줄은 Tx2-6 서열이다. 상기 DNA 서열에서 파랑색은 단백질 확인과 정제를 위한 6x-his 서열이고 나머지 검은색은 제한 효소 서열을 나타내고, 초록색은 각각 반복되는 유전자 사이에 존재하여 서열번호 10, 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 하나의 단편(목적 단백질)으로 잘라주는 cleavage site인 P2A 자리이다.

또한, 상기 SEANx1, SEANx2, SEANx6의 펩타이드 서열에서 파랑색 밑줄은 최종 생성되는 거미독 단백질의 matured form을 나타낸다. 따라서, 본 발명에서 최종 생성되는 거미독 단백질은 하기 서열번호 12의 펩타이드 서열을 갖는다.

서열번호 12 : TCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK

또한, SEANx1와 SEANx2, SEANx6를 제한효소 BamHI과 XhoI으로 잘라내어 동일한 제한효소로 처리한 베큘로바이러스 제작용 전이벡터(pFastBac-HTC, invitrogen)에 삽입함으로서 pFastBac-SEANx1와 pFastBac-SEANx2, pFastBac-SEANx6를 각각 완성하였다(도 2A~C). 유전자의 벡터의 삽입을 확인을 위해 pFastBac-SEANx1와 pFastBac-SEANx2, pFastBac-SEANx6에 BamHI과 XhoI 효소 처리하여, 삽입된 SEANx1과 SEANx2, SEANx6의 사이즈가 각 0.3 kb와 0.5 kb, 1.4 kb를 확인하였다(도 2D, 도 2E, 도 2F).

또한, pFastBac-SEANx1와 pFastBac-SEANx2, pFastBac-SEANx6에 벡터용 primer인 pFast-Forward 와 pFast-Reverse를 사용하여 염기서열 분석을 한 후 Clustal 2.1 multiple sequence aligments(- 통해 원본 서열과의 비교에서 서열의 변화 없이 목적 서열과 일치하는 것을 확인하였다(도 3A, 도 3B, 도 3C).

다음으로는, 재조합 베큘로바이러스를 제작하기 위해 invitrogen사의 Bac-to-Bac Baculovirus Expression system kit(No. 10359-016)를 사용하였다. 거미독 유전자(PnTx2-6)를 활용한 전체적인 벡터 제조방법, 이를 곤충세포에 감염시켜 재조합 바이러스를 생산하고, 재조합 바이러스가 생산된 곤충 배지를 누에에 주사하여 세포에서의 단백질을 생산하는 시스템의 모식도는 도 4에 나타내었다.

먼저 바이러스 전이 벡터인 pFastBac-SEANx1와 pFastBac-SEANx2, pFastBac-SEANx6을 AcNPV Bacmid가 들어있는 DH10Bac competent cell에 transformation을 실시하였고, 재조합 베큘로바이러스의 1차 선발은 LB plate에서 항생제 저항성을 이용하여 선발하였고, 2차 선발은 화이트/블루 선발법에 의해 화이트 콜로니들을 PCR을 사용하여 선별하였다. 이렇게 2회의 선별 작업을 거치기 때문에 최종 제조되는 재조합 바이러스는 80% 이상 DH10Bac competent cell의 게놈 DNA(AcNPV Bacmid)에 목적 유전자(SEANx1, SEANx2 또는 SEANx6)가 삽입되는 것이 확인된다. * AcNPV - Autographa californica nuclear polyhedrosis virus.

이 후 SEANx1, SEANx2 또는 SEANx6가 삽입된 베큘로바이러스를 곤충세포인 SF9 세포에 transfection하여 4일에서 5일 동안 배양하게 되면, 배양배지 내로 목적 단백질 유전자가 삽입된 바이러스가 배출된다.

이러한 과정을 보다 상세하게 설명하면, 바이러스 제작을 위해 전이벡터인 pFastBac-SEANx1와 pFastBac-SEANx2, pFastBac-SEANx6를 invitrogen사의 MAX Efficiency DH10Bac kit(No.10361-012)에서 제공하는 DH10Bac competent cell에 transformation을 하였다.

이 실험에 사용된 DH10Bac에는 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 게놈 DNA가 존재한다. 본 발명에서는 AcNPV 게놈 DNA에, 단백질 발현률을 높이기 위해 가장 강력한 promoter로 알려진 polyhedrin promoter를 사용한다. 그리고 본 발명의 실험조건에서는 바이러스 생육에 polyhedrin 유전자 부위가 존재하지 않아도 되기 때문에 이 부위에 목적 유전자(SEANx1, SEANx2 또는 SEANx6)를 삽입한다.

목적 유전자가 삽입된 AcNPV 게놈 DNA를 가진 DH10Bac을 선발하기 쉽게 이 DH10Bac의 AcNPV 게놈 DNA는 항생제 저항성을 가지며 이를 확인하기 위한 LacZ가 존재한다. AcNPV 게놈 DNA는 거대한 크기를 갖는 plasmid로서 Bacmid 라고도 한다.

따라서, DH10Bac에 transformation(42℃에서 1분 열 충격)을 실시하여 화이트/블루 콜로니 선발법을 사용하여 목적 유전자(SEANx2 또는 SEANx6)가 삽입된 화이트 콜로니를 1차 선발하고, 콜로니 선별 프라이머인 M13 Forward-40(5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3')와 M13 Reverse(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')를 이용하여 콜로니 PCR(95℃-5min, 95℃-30sec, 54℃-30sec, 72℃-3min: 25cycle, 72℃-5min)을 실시함으로써 Bacmid(AcNPV genomic DNA)에 SEANx1, SEANx2, SEANx6가 삽입된 콜로니를 선발하였다.

콜로니 PCR 수행 시, Bacmid 벡터 유전자를 인식하는 M13-forward(-40)와 M13-Reverse primer를 이용하여 염기 서열을 증폭하기 때문에 삽입 유전자보다 약 2.4kb 증가된 크기가 된다.

그 결과 SEANx1이 삽입된 콜로니의 증폭된 밴드는 약 2.7 kb이며 SEANx2가 삽입된 콜로니에 대한 band 크기는 약 2.9 kb, SEANx6가 삽입된 콜로니에 대한 band 크기는 약 3.8 kb로 확인된다(도 5A의 DNA band에서 화살표 표시).

이를 바탕으로, SEANx1 Bacmid, SEANx2 Bacmid 또는 SEANx6 Bacmid가 삽입된 각 콜로니를 Endo Free plasmid Maxi kit(No. 12362)을 사용하여 추출하였다. 이렇게 얻은 Bacmid 사이즈는 130kb 이상인 것으로 확인된다(도 5B의 DNA band에서 화살표 표시). 이렇게 각 콜로니로부터 수집된, SEANx1, SEANx2 또는 SEANx6가 삽입된 바이러스는 vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6라 명명하였다.

이렇게 추출한 vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6를 각각 Sf9 세포(9x10⁵)에 cellfection reagent(invitrogen, No. 10362-010)를 사용하여 transfection을 하였다. Transfection 5일 후 세포가 커지면서 부유하는 것을 확인할 수 있다. 이는 세포가 바이러스에 감염되어 세포 내에 많은 바이러스가 존재하여 세포가 커지며 부착세포인 Sf9 세포가 죽어 배지에 부유하기 때문이다.

이렇게 바이러스에 감염된 세포를 원심 분리하여 세포와 배지로 나누어 회수하였고, 바이러스가 존재하는 배지는 새 Sf9 세포에 재감염하는 과정을 반복하였다. 이렇게 세포의 배양을 3번째까지 더 계대배양을 하였다(Passage 3을 얻음).

<실시예 2. 거미독 유전자(PnTx2-6)가 도입된 베큘로바이러스로 형질전환된 곤충세포에서의 유전자 발현 확인>

실시예 1에서 얻은 바이러스 감염 세포는 바이러스 농도가 높아져 감염 후 3일째부터 세포가 커지며 부유하게 된다. Passage 3인 감염 세포를 배지와 세포로 회수하여 감염된 세포에서 RNA와 protein을 추출하여 RT-PCR과 Western Blot을 하여 vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6의 감염 여부를 확인하였다.

보다 자세하게는, vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6에 감염된 세포의 RNA를 추출하여 Transcription 단계에서 확인하였다. 추출한 RNA를 Quantitect Reverse Transcription kit(Qiagen, 205310)를 사용하여 cDNA 합성하였고 이를 RT-PCR법을 이용하여 확인하였다. 재조합 바이러스에서 도입된 거미독 유전자 검출을 위해 제작한 거미독 유전자의 signal peptide 서열에 대한 특이 프라이머 SEANsigRT-F (5'-ATGAAAGTTGCAATCCTCTTCCTC-3')와 SEANsigRT-R(5'-GGCTCTCCCCAATTCTTCTACAG-3')를 사용하여 PCR(94℃-2min, 94℃-30sec, 54℃-30sec, 72℃-2min: 25cycle, 72℃-5min) 법으로 확인하였다.

vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6에 감염된 세포에서의 거미독 PnTx2-6 유전자 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 이 때 각 세포에서 발현되는 거미독 유전자의 signal peptide 서열을 증폭하여 100 bp가 되도록 하였는데, 이러한 100 bp 크기의 band를 각 vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6에 감염된 세포에서 확인할 수 있으나, 대조군(control)에서는 이러한 band를 확인할 수 없다(도 6A).

다음으로는 vSEANx1, vSEANx2, vSEANx6에 감염된 세포에서 거미독 단백질 생성을 확인하기 위하여 6x His 항체를 이용하여 Western blot 분석을 수행하였다. 이를 위해 바이러스 비감염 곤충세포(Sf9)를 T75 플라스크에 1.2x10⁷농도로 분주하여 1시간 동안 세포를 안정화한 후 vSEANx1, vSEANx2, vSEANx6에 감염된 세포 배양액을 처리하였다. 이 때, 각 배양액 내의 초기 바이러스 농도는 2.5x10⁷IFU/ml로 동일하게 조절하였다(Bac PAK baculovirus Rapid titer kit(Clontech, No. 631406) 사용).

72시간 후 거미독 발현검정을 위해 각각의 감염 세포와 배지를 회수하였다. 회수한 배지는 protein sample buffer를 넣고 90℃에서 10분 동안 반응 시킨 후 사용하였으며 세포는 단백질 추출 용액인 I-PER Insect cell protein Extraction Reagent(Thermo, 89802)를 이용하여 단백질을 추출하였고 배지와 동일하게 protein sample buffer에 반응하여 denature시켜 SDS-PAGE 전기영동 후 단백질을 PVDF 멤브레인에 transfer하여 6x His 항체(Abcam, ab18184)를 이용하여 확인하였다. 그 결과 거미독 단백질이 배지와 세포에서 발현하는 것을 확인되며 배지에서의 발현은 이 두 구조의 단백질이 세포 밖으로 분비되는 것으로 나타나는데, 그 사이즈는 vSEANx1 감염세포는 16kDa, vSEANx2 감염세포와 vSEANx6 감염세포에서는 각각 18kDa에서 확인된다(도 6B - 여기에서 MD는 cell culture media에서 확인된 단백질을 의미하며, CL은 cell lysate에서 확인된 단백질을 의미한다). 한편, vSEANx2에서 발현한 단백질과 vSEANx6에서 발현한 단백질은 반복 구조 유전자 사이마다 P2A(protein cleavage site)가 존재하므로 반복 사이가 잘려 사이즈가 하나인 단편으로 잘리는 것을 확인 할 수 있다.

<실시예 3. 거미독 유전자(PnTx2-6)가 도입된 베큘로바이러스로 바이러스 감염된 곤충세포에서의 단백질 발현 확인>

vSEANx1, vSEANx2 또는 vSEANx6에 감염된 곤충세포에서의 목적 단백질의 발현양을 His ELISA를 이용하여 EIISA로 정량분석하였고 이를 도 7에 나타내었다.

다음으로는 vSEANx1, vSEANx2, vSEANx6에 감염된 세포에서 거미독 단백질의 발현 양을 확인하기 위하여 6x His 항체를 이용하여 His-ELISA 분석을 수행하였다. 이를 위해 바이러스 비감염 곤충세포(Sf9)를 T75 플라스크에 1.2 x 10⁷농도로 분주하여 1시간 동안 세포를 안정화한 후 바이러스 농도 2.5 x 10⁷IFU/ml인 vSEANx1, vSEANx2, vSEANx6을 세포 배양액을 처리하였다.

바이러스 감염 72시간 후 거미독 발현검정을 위해 각각의 감염 세포와 배지를 회수 하였다.세포는 단백질 추출 용액인 I-PER Insect cell protein Extraction Reagent(Thermo, No.89802)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 단백질의 발현 양을 확인하기 위하여 배지와 세포 용해한 총 단백질 농도를 quick start bradford dye reagent (Bio-Rad, No. 500-0205)를 이용하여 그 양이 2.4mg으로 하여 His-tag Detection ELISA kit (Cayman, N0.10012445)를 사용하여 그 발현 양을 비교 분석하였다.

도 7을 참고하면, 각 세포 배양액과 세포 내 존재하는 cell lysate 내에서 거미독 단백질의 발현이 확인되며, 단백질 발현량은 vSEANx1에서 vSEANx2, vSEANx6의 순으로 더 증가되는 것을 알 수 있다(MSx1 : vSEANx1 감염 세포의 배양액, MSx2 : vSEANx2 감염 세포의 배양액, MSx6 : vSEANx6 감염 세포의 배양액, CSx1 : vSEANx1 감염 세포의 cell lysate, CSx21 : vSEANx2 감염 세포의 cell lysate, CSx61 : vSEANx6 감염 세포의 cell lysate).

<실시예 4. 거미독 유전자(PnTx2-6)가 도입된 베큘로바이러스로 바이러스 감염된 누에의 제조 및 유전자/단백질 발현 확인>

재조합 바이러스에 사용되는 AcNPV는 숙주 특이적이다. 따라서 AcNPV에서 높은 감염력을 보이는 누에 품종을 선발하고자 백옥잠과 잠123, 잠124, 잠125, 잠140 총 5 품종에서 재조합 바이러스인 SEANx2의 발현을 확인하였다.

곤충세포에서의 거미독 단백질 발현율이 vSEANx2와 vSEANx6를 감염시켰을 때가 좋았기 때문에 누에 실험에서는 이 중에서 vSEANx2를 감염시켰다.

vSEANx2에 감염된 세포로부터 얻은 배양액에서 Bac PAK baculovirus Rapid titer kit(Clontech, No. 631406)를 사용하여 titer를 측정한 값이 vSEANx2에 감염된 세포로부터 얻은 배양액에서 2x10⁸이기에, 누에에 바이러스를 주사할 때 2x10⁶/개체바이러스 농도로 세포배양액으로 보정한 후 누에 생체에서 최적 발현 조건을 구명하기 위한 시료로 사용하였다.

재조합 거미독 단백질 생산에 적합한 누에 계통을 선발하기 위해, 잠123, 잠124, 잠125, 잠140, 백옥잠, 총 5개 품종의 5령 3일째 누에를 준비하여 vSEANx2에 감염된 세포로부터 얻은 배양액을 2x10⁶/100 ㎕씩 누에의 10번째 마디의 복강에 주사하였다. 주사 후 1일부터 5일까지 날마다 5마리씩 누에의 혈액과 몸체를 채취하였다. 대조군으로 바이러스가 전혀 없는 일반 곤충세포 배지를 100 ㎕씩 주사하여 실험군과 동일한 시각에 날마다 누에의 혈액과 몸체를 채취하였다.

또한 잠종에 대한 목적 유전자 발현율 검증을 위해 vSEANx2가 감염된 각 누에 품종의 날짜별로 채취된 몸체를 액체 질소에 갈아 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 동량 취해 cDNA를 합성하고(Qiagen, 205310), 거미독 PnTx2-6 유전자의 RNA의 발현양을 확인하기 위해 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 RT-PCR법과 real-time PCR을 수행하였다.

Primer Name	Sequence (5'-> 3')
SEANsigRT-F	ATGAAAGTTGCAATCCTCTTCCTC
SEANsigRT-R	GGCTCTCCCCAATTCTTCTACAG
BmA3-F	GAACTGTGCTACGTCGCTC
BmA3-R	CCGATGGTGATGACCTGACC

그 결과, 도 8을 참고하면, 누에 품종마다 vSEANx2 감염 3일 후부터 거미독 PnTx2-6 유전자(SEAN으로 표기함)의 RNA의 발현량이 증가되는 것이 확인되며, 특히 잠123(jam123)이 다른 4종의 누에 종보다 500배 가량 많은 RNA 발현을 보이는 것을 알 수 있다(도 8A: RT-PCR, 도 8B: Real-time PCR).

또한 단백질 발현을 위해서는 vSEANx2에 감염된 각 누에 품종의 날짜별로 채취된 몸체를 액체 질소에 갈아 그 시료를 I-PER Insect cell protein Extraction Reagent(Thermo, 89802)을 사용하여 단백질을 추출하였다. 혈액과 몸체 단백질을Quick start bradford protein assay를 사용하여 bradford 법을 (Bio-Rad,500-0202) 이용하여 단백질 정량한 후 SDS-PAGE 전기영동하고 PVDF 멤브레인에 trnasfer하여 6x His 항체(Abcam, ab18184)를 이용하여 단백질 발현량을 확인하였다.

그 결과, 혈액에서는 총 5종의 잠종에서 오직 잠123(jam123)만이 감염 5일에 매우 약하게 발현하는 것이 확인되며, 몸체에서는 감염 4~5일에서 잠123(jam123)이 가장 발현이 좋고 그 다음으로 잠125(jam125), 백옥잠(Bacok) 순으로 발현양이 좋은 것으로 확인된다(도 9).

또한 추가적으로 잠123(jam123), 잠125(jam125), 백옥잠(Bacok)에 대해 바이러스 감염 농도를 올려(1x10⁷/개체, 2x10⁷/개체) 동일한 실험을 수행한 바, 이와 유사한 경향을 나타내면서 보다 뚜렷한 단백질 발현을 나타내는 결과를 확인할 수 있다(도 10 참조)

이 외에도 잠123과 잠125 누에에 vSEANx2, vSEANx6 바이러스를 개체 당 2x10⁷/100㎕ 주사하고 바이러스 주사 5일 후에 혈액과 누에의 지방체를 이용하여 실험하였다.

거미독 단백질 발현 정도를 실시예 3에 개시된 ELISA 방법으로 확인하였다. 도 11을 참고하면, 잠123에서 혈액과 지방체 모두 vSEANx6 바이러스 감염된 개체에서의 거미독 단백질 발현이 가장 좋은 것을 알 수 있다(H-123 : 잠123 품종의 혈액, H-125 : 잠125 품종의 혈액, Fb-123 : 잠123 품종의 지방체, Fb-125 : 잠125 품종의 지방체).

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Baculovirus expressing recombinant spider toxin protein or trasngenic silk worm manufactured therefrom <130> 249 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 323 <212> DNA <213> Phoneutria nigriventer <400> 1 tcggcacgag atcagaatga aagttgcaat cctcttcctc tctattttgg tgcttgctgt 60 tgcaagtgaa tccattgaag aatcccgtga tgattttgct gtagaagaat tggggagagc 120 cacatgcgct ggccaagacc agccctgcaa agaaacttgc gactgctgtg gagagagagg 180 agaatgtgtt tgcggaggac cttgcatttg caggcaaggc tacttttgga tagcatggta 240 taaacttgct aactgtaaaa aatgatatgg atttatgtat accacgatat aataaatata 300 ttgcatttga aaaaaaaaaa aaa 323 <210> 2 <211> 380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phoneutria nigriventer <400> 2 ggatcccata tgcccgggtc ggcacgagat cagacaccat gaaagttgca atcctcttcc 60 tctctatttt ggtgcttgct gttgcaagtg aatccattga agaatcccgt gatgattttg 120 ctgtagaaga attggggaga gccacatgcg ctggccaaga ccagccctgc aaagaaactt 180 gcgactgctg tggagagaga 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<210> 8 <211> 82 <212> PRT <213> Phoneutria nigriventer <400> 8 Met Lys Val Ala Ile Leu Phe Leu Ser Ile Leu Val Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ile Glu Glu Ser Arg Asp Asp Phe Ala Val Glu Glu Leu 20 25 30 Gly Arg Ala Thr Cys Ala Gly Gln Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys 35 40 45 Asp Cys Cys Gly Glu Arg Gly Glu Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Gly Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys 65 70 75 80 Lys Lys <210> 9 <211> 88 <212> PRT <213> Phoneutria nigriventer <400> 9 Met Lys Val Ala Ile Leu Phe Leu Ser Ile Leu Val Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ile Glu Glu Ser Arg Asp Asp Phe Ala Val Glu Glu Leu 20 25 30 Gly Arg Ala Thr Cys Ala Gly Gln Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys 35 40 45 Asp Cys Cys Gly Glu Arg Gly Glu Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Gly Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys 65 70 75 80 Lys Lys His His His His His His 85 <210> 10 <211> 166 <212> PRT <213> Phoneutria nigriventer <400> 10 Met Lys Val Ala Ile Leu Phe Leu Ser Ile Leu Val Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ile Glu Glu Ser Arg Asp Asp Phe Ala Val Glu Glu Leu 20 25 30 Gly Arg Ala Thr Cys Ala Gly Gln Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys 35 40 45 Asp Cys Cys Gly Glu Arg Gly Glu Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Gly Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys 65 70 75 80 Lys Lys His His His His His His Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser 85 90 95 Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ser Gly 100 105 110 Ala Thr Cys Ala Gly Gln Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys Asp Cys 115 120 125 Cys Gly Glu Arg Gly Glu Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile Cys Arg 130 135 140 Gln Gly Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys Lys Lys 145 150 155 160 His His His His His His 165 <210> 11 <211> 478 <212> PRT <213> Phoneutria nigriventer <400> 11 Met Lys Val Ala Ile Leu Phe Leu Ser Ile Leu Val Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Ser Glu Ser Ile Glu Glu Ser Arg Asp Asp Phe Ala Val Glu Glu Leu 20 25 30 Gly Arg Ala Thr Cys Ala Gly Gln Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys 35 40 45 Asp Cys Cys Gly Glu Arg Gly Glu Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Gly Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys 65 70 75 80 Lys Lys His His His His His His Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser 85 90 95 Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ser Gly 100 105 110 Ala Thr Cys Ala Gly Gln Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys Asp Cys 115 120 125 Cys Gly Glu Arg Gly Glu Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile Cys Arg 130 135 140 Gln Gly Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys Lys Lys 145 150 155 160 His His His His His His Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu 165 170 175 Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ala Thr 180 185 190 Cys Ala Gly Gln Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys Asp Cys Cys Gly 195 200 205 Glu Arg Gly Glu Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile Cys Arg Gln Gly 210 215 220 Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys Lys Lys His His 225 230 235 240 His His His His Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln 245 250 255 Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ala Thr Cys Ala 260 265 270 Gly Gln Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys Asp Cys Cys Gly Glu Arg 275 280 285 Gly Glu Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile Cys Arg Gln Gly Tyr Phe 290 295 300 Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys Lys Lys His His His His 305 310 315 320 His His Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly 325 330 335 Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gln 340 345 350 Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys Asp Cys Cys Gly Glu Arg Gly Glu 355 360 365 Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile Cys Arg Gln Gly Tyr Phe Trp Ile 370 375 380 Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys Lys Lys His His His His His His 385 390 395 400 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 405 410 415 Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gln Asp Gln 420 425 430 Pro Cys Lys Glu Thr Cys Asp Cys Cys Gly Glu Arg Gly Glu Cys Val 435 440 445 Cys Gly Gly Pro Cys Ile Cys Arg Gln Gly Tyr Phe Trp Ile Ala Trp 450 455 460 Tyr Lys Leu Ala Asn Cys Lys Lys His His His His His His 465 470 475 <210> 12 <211> 47 <212> PRT <213> Phoneutria nigriventer <400> 12 Thr Cys Ala Gly Gln Asp Gln Pro Cys Lys Glu Thr Cys Asp Cys Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Glu Cys Val Cys Gly Gly Pro Cys Ile Cys Arg Gln 20 25 30 Gly Tyr Phe Trp Ile Ala Trp Tyr Lys Leu Ala Asn Cys Lys Lys 35 40 45

Claims

서열번호 6의 염기서열을 포함하는 베큘로바이러스.
제1항에 있어서,
서열번호 6의 염기서열은 서열번호 1의 거미독 단백질 발현 유전자(Phoneutria nigriventer neurotoxin Tx2-6 mRNA, complete cds, Gen bank Sequence ID: AY054746.1)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 베큘로바이러스.
제1항에 있어서,
상기 베큘로바이러스는 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)인 것을 특징으로 하는 베큘로바이러스.
제1항의 베큘로바이러스를 제조하는 단계;
상기 베큘로바이러스를 곤충세포에 트랜스펙션하여 바이러스를 감염시키는 단계; 및,
바이러스에 감염된 곤충세포의 세포 또는 이의 배양액으로부터 재조합 거미독 단백질을 추출 및 정제하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 거미독 단백질을 생산하는 방법.
제1항의 베큘로바이러스를 제조하는 단계;
베큘로바이러스를 곤충세포에 트랜스펙션하여 바이러스를 감염시키는 단계;
바이러스에 감염된 세포의 배양액을 누에에 주사하여 바이러스를 감염시키는 단계; 및,
바이러스에 감염된 누에로부터 재조합 거미독 단백질을 추출 및 정제하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 거미독 단백질을 생산하는 방법.
제5항에 있어서,
누에에 주사되는 배양액 내의 바이러스 농도는 1x10⁷~ 2x10⁷/개체인 것을 특징으로 하는 재조합 거미독 단백질을 생산하는 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 곤충 세포주는 담배거세미나방(Spodoptera frugiperda) 유래 세포 또는 누에(Bombyx mori) 유래 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 거미독 단백질을 생산하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 누에의 품종은 가잠(Bombyx mori L.)의 잠123인 것을 특징으로 하는 재조합 거미독 단백질을 생산하는 방법.