KR20190065879A - 민물장어의 황체형성 호르몬에 특이적인 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 민물장어의 황체 형성 호르몬(Luteinizing hormone, LH)을 특이적으로 인식하는 항체 및 이를 이용한 LH를 특이적으로 탐지하는 방법, 탐지용 키트에 관한 것이다. 또한, 상기 다클론 항체를 사용하여 민물장어 성 성숙도를 측정할 수 있다.

Description

민물장어의 황체형성 호르몬에 특이적인 항체 및 그의 용도{Antibody specific to luteinizing hormone of Japamese eel and uses thereof}

본 발명은 민물장어의 황체형성 호르몬을 특이적으로 인식하는 항체 및 이를 이용한 황체형성 호르몬을 특이적으로 검출하는 방법, 검출용 키트에 관한 것이다.

어류의 양식에 있어 어류 종묘(fish seeding)의 안정적인 생산, 공급과 순수혈종(bloodstock)의 성 성숙 조절과 평가는 중요하다. 뱀장어를 포함한 일부 어종은 부적절한 양식 환경에서는 성 성숙(gonadal maturation), 배란(ovulation), 정자 유리(spermiation) 등이 발생하지 않으므로 양식 어류의 생식활성을 인공적으로 조절하기 위해서는 광주기(photoperiod), 수온(water temperature), 호르몬 처리(hormone treatment)와 같은 환경 요소를 복합적이면서도 세심히 조절할 필요가 있다.

민물장어(Japanese eel)는 척삭동물문, 경골어류강, 뱀장어목, 뱀장어과에 속하며 바다와 민물 습성을 가진 복잡한 생활사를 갖는 강하 어류(catadromous fish)이다. 민물장어는 치어때 바다에서 강으로 이동하며, 이동하는 동안 노란색(yellow)에서 은색(silver) 뱀장어로 형태적, 생리적 변화를 겪고, 강에서 6~20년 동안 성장하며, 성장이 끝난 민물장어는 성 성숙 과정을 거친 후 바다로 다시 이주하고 이주하는 동안 배우자 형성(gametogenesis)을 완전히 이룬다. 민물장어는 극동산 민물장어, 일본 뱀장어(Japanese eel, Anguilla japonica)로도 불리우며, 일본과 중국에 널리 서식하고 있다. 민물장어는 북방한계선으로 홋카이도, 발해만 연안(the gulf of Pohai)과 인도네시아의 리하강(Liao river)까지 분포 서식하고 있으며, 남방 한계선으로 중국의 하이난 섬(Hainan island)과 중국과 베트남 사이에 있는 통킹만(the gulf of Tonkin)까지 서식하고 이외에도 대만, 필리핀, 유럽 등에 서식한다. 민물장어 성체는 주로 갑각류, 어류, 곤충류를 먹고 살며 회유 양상에 따라 담수 뱀장어(river eels), 기수 뱀장어(estuarine eels), 바다 뱀장어(sea eels)로 크게 3 부류로 나뉜다.

민물장어를 인공사육할 경우, 성적으로 미성숙하여 산란을 하는 경우가 많다. 아직까지 자연계의 미성숙한 뱀장어의 산란행동이 제대로 연구되지 않아, 번식 생리학 분야에서 뱀장어의 번식 산란행동에 관해서는 알려진 바가 많이 없다. 현재까지 연구 결과에 따르면, 자연 상태의 암컷 뱀장어는 10월~12월에 성 성숙을 시작하나 난모세포는 난황형성초기까지만 이루어지고, 수컷의 경우 정자형성이 시작되지도 않은 채 강 하류로 이동해서 산란장소로 이주하는 것으로 추측되며, 미성숙 상태의 양식 뱀장어를 해수 양식 시킬 경우, 천연 암컷 뱀장어와 같은 난황 형성 초기에 이르는 것으로 알려져 있다(Kagawa H., Iinuma N., Tanaka H., Ohta H., and Okuzawa K., 1998. Effects of rearing period in seawater on induced maturation in female Japanese eel Anguilla japonica. Fish Sci., 64 77-82.).

과거 민물장어 사육에 있어서 천연 또는 양식 암컷 뱀장어의 성 성숙을 진행시키는 것이 매우 어려웠다. 최근에 들어 연어뇌하수체 추출물(salmon pituitary extract, SPE)로 성 성숙 유도를 성공한 사례가 보고된 바 있으나 아직은 그 성공 빈도가 낮으며, 연어뇌하수체 추출물, 재조합 단백질 등을 반복 투여할 경우, 다른 성 성숙 유도 호르몬들과의 길항작용(antagonism), 상승작용(synergism) 또는 빠른 활성 상실 등에 의해 난모세포와 배란된 난자 내의 염색체 이상을 유발할 수 있으며, 난질에 영향을 주어 수정률(fertility)이 낮아지고, 기형어 발생률이 높아질 위험이 있다. 또한, 연어 뇌하수체 추출물과 재조합 단백질의 수급이 어렵기에 인공 양식장에서 뱀장어 종묘 생산이 여전히 어렵다는 문제점이 있다.

한편, 이제까지 인공 종묘 양식에 있어 호르몬의 반복투여 또는 환경 조절 등으로 진행되는 성 성숙도를 판정하는 기준은 대부분 육안에 의존되어왔는바, 사람마다 차이가 있어 정확도가 매우 떨어졌다. 따라서, 민물장어의 성 성숙 정도에 직접적인 영향을 미치는 각 호르몬의 마커(marker)또는 기준 인자(standard factor) 개발이 요구되고 있는 실정이다.

일반적인 척추동물의 성 성숙도를 판단할 수 있는 당단백질 호르몬 (Glycoprotein hormones; GPH)에는 갑상선 자극 호르몬 (Thyroid-stimulating hormone; thyrotropin; TSH), 여포 자극 호르몬 (Follicle-stimulating hormone; follitropin; FSH), 황체 형성 호르몬 (Luteinizing hormone; lutropin; LH), 융모막 성선 자극 호르몬 (chorionic gonadotropin, CG) 등이 있다. 상기 호르몬들은 공통적으로 두 개의 서로 다른 서브유니트(subunit) 알파 (-α)와 베타 (-β)로 구성되며, 동일한 종(species) 들은 동일한 알파 서브유니트 아미노산 서열을 가지고 있지만, 베타 서브유니트는 각 종별 및 호르몬 별로 특이적인 아미노산 서열을 가지고 있다. 따라서 베타 서브유니트는 각 호르몬의 특이적 활성 및 종 특이성(species specificity)을 나타낸다. 그러므로 모든 척추동물의 각 종(species)에서 서로 다른 성호르몬의 베타 서브유니트를 암호화하기 위해 적어도 3개의 유전자(FSHβ, LHβ, TSHβ)가 존재한다. 알파와 베타 서브유니트는 서로 다른 유전자에 의해 단백질로 형성되며, 생물학적 활성이 있는 호르몬 분자를 형성하기 위해 상기 알파 서브유니트와 베타 서브유니트는 비공유 결합(non-covalent bonding)에 의해 연결된다.

따라서 본 발명은 상기 문제점을 해결하고, 민물장어의 성 성숙 정도를 정확하게 측정하기 위해, 성 성숙도에 직접적인 영향을 미치는 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone; LH) 특이적인 펩타이드 마커(marker), 및 이에 결합하는 다클론 항체를 개발하였으며, 상기 항체는 민물장어의 JeLH-β와 결합함으로써 다른 성 호르몬들과 달리 JeLH에만 특이적으로 결합해, 민물장어 생물학적 시료 내의 JeLH를 특이적으로 탐지가능하고, 이를 이용해 민물장어의 성 성숙도를 측정할 수 있다.

한국등록특허 제10-15311286호 한국등록특허 제10-1493957호 한국등록특허 제10-0742115호

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 민물장어의 성 성숙의 변화를 탐지하기 위하여, 민물장어의 황체 형성 호르몬(Luteinizing hormone, LH)을 특이적으로 탐지할 수 있는 항체를 제공한다.

본 발명의 일 예는 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 LH 탐지용 펩타이드 마커를 항원으로 사용하여 제조되며, 민물장어의 LH와 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항체를 포함하는, 생물학적 시료 내 민물장어 LH 호르몬의 특이적 탐지용 조성물을 제공하며,

또한, 본 발명은 상기 항체를 생물학적 시료와 접촉시키고, 항원-항체 복합체 형성을 탐지하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 민물장어 LH 호르몬을 특이적으로 탐지하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 예는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 민물장어의 LH 탐지용 마커를 제공한다.

본 발명은 민물장어의 유사 호르몬은 제외하고 민물장어의 황체 형성 호르몬(Luteinizing hormone, LH)만을 특이적으로 인식, 판별할 수 있는 마커 항원 및 이와 결합하는 항체에 관한 것으로, 상기 항체를 이용하여 민물장어의 성 성숙도를 측정할 수 있으며, 민물장어 완전양식의 실현에 도움이 될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.

본 발명은 하기 표 1의 서열번호 1(EPINETNSVEKDGC), 서열번호 2(CITKDPSYKGPLS), 및 서열번호 3(SDCAIQSLRPD)의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 민물장어(Anguilla japonica)의 LH 탐지용 펩타이드 마커를 항원으로 사용하여 제조되며, 민물장어의 LH와 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

구분	서열	서열번호
JeLHβ N'31-44번째 아미노산 서열	EPINETNSVEKDGC	1
JeLHβ N'59-71번째 아미노산 서열	CITKDPSYKGPLS	2
JeLHβ N'119-129번째 아미노산 서열	SDCAIQSLRPD	3
JeLH-β/mGTH-α 키메라 항원 아미노산 서열	MSVYPECTWPLFVCLCHLLV SAGGSLLLPCEPINETISVE KDGCPKCLVFQTSICSGHCI TKDPSYKSPLSTVYQRVCTY RDVRYETVRLPDCRPGVDPH VTFPVALSCDCNLCTMDTSD CAIQSLRPDFCMSQRASLPA SSSSKDPGGGSLPDGDFIIQ GCPECKLKENKYFSKLGAPI YQCMGCCFSRAYPTPARSKK TMLVPKNITSEATCCVAKAF TKATVMGNARVENHTECHCS TCYYHKS	4
JeLH-β/mGTH-α 키메라 항원 염기서열	ATGTCAGTCTACCCAGAATGCACCTGGCCCCTCTTTGTATGCTTGTGTCACCTCCTTGTTTCTGCTGGAGGCTCTTTACTGCTGCCTTGTGAACCAATCAATGAAACTATTTCTGTGGAGAAAGATGGATGTCCAAAATGTCTGGTGTTCCAAACATCCATCTGCAGTGGTCACTGCATCACCAAGGACCCAAGCTACAAGAGCCCGCTGTCCACGGTGTACCAGCGCGTGTGCACGTACCGGGACGTCCGCTACGAGACGGTGCGGCTGCCAGACTGCCGCCCCGGCGTGGATCCCCATGTGACTTTCCCCGTGGCTCTGAGCTGCGACTGTAACCTGTGCACCATGGACACGTCTGACTGCGCCATCCAGAGTCTGAGGCCCGACTTCTGCATGAGCCAGCGGGCCAGCCTCCCCGCGTCCTCTTCCTCTAAGGATCCAggtggtggttcaCTTCCTGATGGAGACTTTATTATTCAGGGTTGCCCAGAATGTAAACTAAAGGAAAATAAATACTTCTCCAAGCTAGGAGCCCCCATCTACCAGTGTATGGGCTGTTGCTTCTCCAGGGCATATCCCACTCCCGCCAGGTCCAAGAAGACAATGCTGGTTCCAAAGAATATTACCTCGGAGGCCACATGCTGTGTGGCCAAAGCATTTACTAAGGCCACAGTAATGGGAAATGCCAGAGTGGAGAATCATACGGAGTGCCACTGTAGCACTTGCTACTACCACAAGTCG	5
JeLHβ Full 아미노산 서열	MSVYPECTWPLFVCLCHLLV SAGGSLLLPCEPINETISVE KDGCPKCLVFQTSICSGHCI TKDPSYKSPLSTVYQRVCTY RDVRYETVRLPDCRPGVDPH VTFPVALSCDCNLCTMDTSD CAIQSLRPDFCMSQRASLPA	6
JeLH-β 분비신호서열 N'1-24번째 아미노산 서열	MSVYPECTWPLFVCLCHLLVSAG	7
JeLH-β 친수성 부분 1	SAGGSLLLPC EPINETNSVE KDGCPKCLVF	8
JeLH-β 친수성 부분 2	QTSICSGHCI TKDPSYKGPL STVYQRVCTY	9
JeLH-β 친수성 부분 3	CNLCTMDTSD CAIQSLRPDF CMSQRASLPA	10

상기 "민물장어 LH 탐지용 펩타이드 마커"란 민물장어의 다른 성 성숙 호르몬(FSH, TSH, GTH, CG 등) 및 타 어종 유래의 성 성숙 호르몬으로부터 장어의 LH만을 특이적으로 탐지할 수 있는 마커를 의미한다.

상기 "펩타이드 마커를 항원으로 사용하여 제조되고, 민물장어의 LH를 특이적으로 인식하는 항체"란 갑상선 자극 호르몬 (Thyroid-stimulating hormone; thyrotropin; TSH), 여포 자극 호르몬 (Follicle-stimulating hormone FSH), 생식소 자극 호르몬 (gonadotropin, GTH)에는 결합하지 않으며 민물장어의 LH에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면, 상기 민물장어 LH 탐지용 펩타이드 마커 항원은 캐리어 단백질을 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 캐리어 단백질은 단백질은 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin), BSA(Bovine Serum Albumin), OVA(Ovalbumin), Tg(thyroglobulin), TT(tetanus toxoid), diphtheria toxioid(Td), 및 PPD(tuberculin purified protein) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어 마커의 N-말단에 시스테인(Cys)을 도입하고, 시스테인의 -SH 작용기와 N-(7-dimethylamino-4-methylcoumarinyl)maleimide을 결합시키고 캐리어 단백질을 결합시켜 제작한 가교 펩타이드를 면역 감작(immune sensitizing)에 이용하는 것도 가능하다.

본 발명의 상기"항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 서열번호 1(EPINETISVEKDGC), 서열번호 2(CITKDPSYKGPLS), 및 서열번호 3(SDCAIQSLRPD)의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 민물장어(Anguilla japonica)의 LH 탐지용 펩타이드 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 마커(이하, 제1마커), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 마커(이하, 제2마커), 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 마커(이하, 제3마커) 세 마커 모두에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린(Immunoglobulin, Ig) 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다. 상기 면역글로블린항체는 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE의 클래스 중 가장 보편적인 항체이고 대부분 혈액이나 체액의 전체 Ig의 75%를 차지하는 IgG인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 항체의 유래는 특별히 제한하지 않으나 마우스, 래트, 토끼, 닭, 곤충세포 등을 사용할 수 있으며, 제작의 편이성, 대량생산을 고려해 토끼 유래 다클론 항체인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 항체는 상기 LH-β아미노산 서열의 일부인 제1마커, 제2마커, 및 제3마커로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이상의 마커 모두에 특이적인 결합하는 항체, 항원결합단편 또는 앱타머일 수 있다. 바람직하게는 단클론 항체 또는 다클론항체, 더욱 바람직하게는 체액 속에서 복잡하고 미비한 호르몬의 변화를 감작할 수 있고 정확히 JeLH만을 검출할 수 있는 다클론 항체임이 바람직하다.

본 발명의 일 예는 상기 항체를 포함하는, 생물학적 시료 내 민물장어 JeLH 호르몬 특이적 탐지용 조성물을 제공한다.

상기 생물학적 시료는 민물장어 TSH, FSH 및 GTH 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 본 발명의 항체를 포함하는, 생물학적 시료 내 민물장어 LH 호르몬 탐지용 조성물은 생물학적 시료에 포함된 민물장어 TSH, FSH 또는 GTH와는 결합하지 않고, LH에 특이적으로 결합한다. 생물학적 시료에 LH가 포함되어 있지 않은 경우, 결합반응이 일어나지 않을 수 있다.

본 발명의 항체의 특징은 상술한 바와 같으며, 상기 항체를 포함하는 민물장어의 LH 호르몬 탐지용 조성물의 활용형태를 특별히 한정하지 않으나, 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다.

본 발명의 키트는 JeLH 호르몬을 검출하기 위한 것으로 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

본 발명의 일예는, 상기 항체를 생물학적 시료와 접촉시키고, 상기 시료 내에서 항원-항체 복합체의 형성여부를 탐지하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 민물장어 JeLH 호르몬을 특이적으로 탐지하는 방법을 제공한다.

상기 생물학적 시료의 특징은 상술한 바와 같으며, 상기 항원-항체 복합체의 형성은 효소면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 예를들어 Direct ELISA, indirect ELISA, competitive ELISA, sandwich ELISA, 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 면역형광법(Immuno-fluorescent Antibody test, IFA), 웨스턴 블롯팅 및 유세포 분석법 중에서 적어도 하나 이상의 방법으로 검출할 수 있으며, 검출 방법을 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 분석 방법을 통하여, LH 호르몬 단백질과 이에 대한 항체 사이의 "항원-항체 복합체" 형성 여부를 판단하여, 시료 내 LH의 존재여부와 함량을 측정할 수 있다.

본원에서 "항원-항체 복합체"란 JeLH 호르몬 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 여부는 검출 라벨(detection label)의 시그널을 통해서 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스(redox) 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

일 구체예로, JeLH 호르몬 단백질과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체 측정은 효소면역흡착법(ELISA법)을 이용할 수 있다. 또한, JeLH 호르몬 단백질에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수도 있다.

.

또한, 본 발명은 상기 민물장어 JeLH 특이적인 항체를 생물학적 시료와 접촉시키고, 상기 시료 내에서 항원-항체 복합체의 형성여부를 탐지하여 민물 장어의 성 성숙도를 측정하는 단계를 포함하는, 민물 장어의 성 성숙도 측정방법을 제공한다.

현재까지 민물장어의 성호르몬을 높은 정확도로 탐지하는 항체가 개발되지 않아 민물장어의 성 성숙 기작, 호르몬의 작용기작이 제대로 밝혀지지 않았으며, 뚜렷한 민물장어의 성성숙도 측정방법이 개발되지 않은 상태이다. 본원 발명은 민물장어의 복잡한 성 호르몬의 생리 변화를 성 호르몬 중 LH를 높은 정확도로 탐지함하여 예측 가능하고, 민물장어의 생리 변화를 밝힐 수 있는 단서를 제공하면서, 민물 장어의 성 성숙도를 간단하고 높은 효율로 측정할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

장어의 성체의 성성숙도를 판단하는 기존의 방법 중 하나로 성체 장어의 혈액을 채혈해 혈청을 분리한 후, 테스토스테론이 존재하면 수컷, 에스트로겐 2가 존재하면 암컷으로 판단하는 방법이 있으나, 이 방법으로는 장어의 암수 구분만 가능하며, 장어가 성 성숙도의 어느 위치에 있는지까지는 명확히 판단하기 어렵다.

또 다른 방법으로 장어 치어를 사육하고 4 ~ 6주 후 장어의 급격한 체중증가가 일어나는 지 여부로 장어의 성성숙도를 확인하는 방법이 있으나, 이는 정확도가 매우 떨어지는 방법이며, 암컷의 난모세포를 일부 적출해 1차 감수분열로 난핵포의 핵막소실을 확인하거나, 생식소 중량지수를 측정하는 방법이 있으나, 이는 측정 방법이 복잡하고 비용과 시간이 많이 든다는 단점이 있다.

본 발명의 상기 항체를 이용하여 생물학적 시료 내의 항원-항체 복합체의 형성여부를 탐지하여 민물 장어의 성 성숙도를 측정하는 방법은 장어의 기존의 방법들보다 훨씬 간단하며, 검체 내 JeLH의 존재를 특이적으로 탐지하고, 정량적으로 분석 가능해 보다 정확하게 장어의 성 호르몬 생리 변화, 그에 따른 성 성숙 정도를 판단 가능하다.

본 발명의 일 예는, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 민물장어의 JeLH 탐지용 마커를 제공한다.

상기 서열번호 1의 아미노산으로 구성된 펩타이드 마커(이하, 제1마커) 또는 서열번호 2의 아미노산으로 구성된 펩타이드 마커(이하, 제2마커) 또는 서열번호 3의 아미노산으로 구성된 펩타이드 마커(이하, 제3마커)는 JeLH-β서브유니트(서열번호 6)의 일부이며, 하기 실시예 1에서 확인한 바와 같이, 상기 두 마커는 LH의 유전자 서열과 민물장어의 다른 호르몬들(JeFSH, JeTSH 등)과의 유사성을 고려하여 LH 베타에서 막단백질(transmembrane) 사이트가 없음을 확인하고, 시그널 펩타이드 부위 제외, N-glycosylation 수식 위치를 제외, hydrophobic 부분을 제외하고 hydrophilic 한 부분을 선택함과 동시에, 민물장어의 성 성숙 호르몬 서열의 상동성(homology)을 비교하여 가장 유력한 후보 펩타이드를 선발한 것이다. 본 발명의 펩타이드 마커 항원은 제1마커, 제2마커 및 제3마커로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 제1마커, 제2마커, 및 제3마커를 모두 포함하는 것이 적절하다.

현재 장어의 성 성숙 호르몬을 면역학적으로 분석하기 위한 노력이 다처에서 일어나고 있으며, 장어 체내의 병원균에 의한 내분비계 변화, 일반적 생리상태의 민물장어 혈액 내에 포함된 성 성숙 호르몬 농도를 측정하기 위한 시스템을 구축하는 시도가 일어나고 있다. 이전에 알려진 JeLH-β/mGTH-α (mouse gonadotropic hormone α) 키메라 항원에 대한 다클론 항체는 JeLH 뿐만 아니라 기타 성 성숙 호르몬(JeFSH, JeTSH, GTH 등)과도 항원-항체 결합 반응을 일으켜 JeLH만을 특이적으로 검출하기 위한 항체로 사용하기에는 부적절하였다.

이와 달리, 본 발명의 제1마커, 제2마커 및 제3마커로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 펩타이드 마커는 장어의 JeLH만을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 펩타이드 마커를 항원으로 사용해 제조된 항체는 다른 민물장어 성 성숙 호르몬과는 결합하지 않고 오직 JeLH에만 특이적으로 항원-항체 반응이 일어나므로 JeLH 특이 검출 항체로 사용하기 적절하다.

또한, 본 발명은 상기 JeLH 탐지용 펩타이드 마커(제1마커, 제2마커, 제3마커) 및/또는 상기 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 JeLH 검출용 조성물 및 키트를 제공하며, 민물장어의 성 성숙도를 판단하기 위해, 장어의 생물학적 시료로부터 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종이상의 펩타이드, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 JeLH 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 민물장어의 JeLH 탐지용 마커를 제공할 수 있으며, 바람직하게는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 모두 포함하는 JeLH 탐지용 마커를 제공할 수 있다.

상기 "폴리뉴클레오타이드를 검출할 수 있는 제제"는 생물학적 시료 내에서 LH를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 구체적인 일 예로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 제1마커 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 제2마커 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 제3마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 핵산(antisense oligonucleotids) 등 일 수 있다.

이 때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링(annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건하에서 안티센스 핵산이 타겟에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도로 충분히 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명에서 "단백질을 검출할 수 있는 제제"는 시료 내에서 LH 단백질을 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 바람직하게, 상기 LH 단백질을 타겟(target)으로 하는 특정 화합물 또는 합성 물질일 수 있다. 구체적인 일 예로, 상기 LH-β아미노산 서열의 일부인 제1마커 또는 제2마커 또는 제3마커 또는 이 세 마커 모두에 특이적인 항체, 항원결합단편 또는 앱타머일 수 있다. 바람직하게는 단클론 항체 또는 다클론항체, 더욱 바람직하게는 체액 속에서 복잡하고 미비한 호르몬의 변화를 감작할 수 있고 정확히 LH만을 검출할 수 있는 다클론 항체일 수 있다.

본 발명은 민물장어의 황체 형성 호르몬(LH)에 특이적으로 결합하는 항체를 생물학적 시료와 접촉시키고, 항원-항체 복합체가 형성되는지를 탐지하여, 해당 시료 내에 민물장어 황체 형성 호르몬의 존재 여부를 용이하게 검출할 수 있으며, 복합체 형성 정도에 따라 민물장어 황체 형성 호르몬을 정량적으로 분석가능 하고, 민물장어의 성 성숙 정도를 측정할 수 있다.

도 1은 실시예 1-1에 따라, 민물장어 JeLH-β 서브유니트의 트랜스멤브레인 영역을 분석한 결과이다.
도 2는　실시예 1-1에 따라. 민물장어 JeLH-β 서브유니트의 신호서열(signal peptides, 성숙 단백질 후 떨어져 나가는 부분) 부분 분석결과를 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1-1에 따라, 민물장어 JeLH-β 서브유니트의 당쇄 수식(N-glycosylation) 부분 분석결과를 도시한 것이다.
도 4는 실시예 1-1에 따라, 민물장어 JeLH-β 서브유니트의 소수성 분석(hydropathy analysis) 후 첫 번째로 예측된 Hydrophilic한 서열 부분을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1-1에 따라, 민물장어 JeLH-β 서브유니트의 소수성 분석(hydropathy analysis) 후 두 번째 예측된 Hydrophilic한 서열 부분을 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1-1에 따라, 민물장어 JeLH-β 서브유니트의 소수성 분석(hydrophthy analysis) 후 세 번째 예측된 Hydrophilic한 서열 부분을 나타낸 것이다.
도 7은 (A) 실시예 2의 장어 JeLH-β 서브유니트에 대한 다클론 항체, (B) 비교예 1의 장어 JeLH-β 서브유니트와 쥐의 GTH-α 서브유니트이 키메라 다클론 항체의 항체 생산의 전 과정의 모식도를 나타낸다.
도 8은 실시예 1-2에 따라, 민물장어 JeFSH, JeLH, JeTSH의 β 서브유니트의 아미노산 서열의 상동성을 비교한 것으로, 검은 부분은 세 종류 호르몬 모두에 공통으로 존재하는 서열이며, 회색 부분은 세 종류 호르몬 중 두 종류의 호르몬에 공통적으로 존재하는 서열이고, 붉은 박스로 표시한 부분은 민물장어 JeLH-β 아미노산 서열 중 항체를 생산하기 위해 사용한 부분을 표시한 것이다.
도 9는 비교예 1에 따라, 민물장어 JeLH-β 서브유니트의 아미노산 서열과 쥐의 GTH-α 아미노산 서열이 연결된 키메라 LH 항원을 SDS 전기영동으로 확인한 것이다.
도 10은 실시예 2에 따라, JeLH-β의 N-말단으로부터 31-44번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 항원(서열번호 1), 장어의 JeLH-β의 N-말단으로부터 59-71번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 항원(서열번호 2), 및 장어의 JeLH-β의 N-말단으로부터 119-129번?의 아미노산으로 구성된 펩타이드 항원(서열번호 3)의 혼합물을 토끼에 면역한 후 혈액을 채취하여 항체가를 ELISA를 이용해 분석한 것으로, 두 번 반복한 결과를 나타낸다.
도 11은 비교예 1에 따라, 민물장어 JeLH-β 서브유니트와 쥐의 GTH-α 서브유니트를 재조합한 키메라 JeLH 항원을 토끼에 면역한 후 혈액을 채취하여 항체가를 ELISA를 이용하여 분석한 것으로, 두 번 반복 실험결과를 도시한 것이다.
도 12는 실시예 2에 따라, JeLH-β의 N-말단으로부터 31-44번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 항원(서열번호 1), 장어의 JeLH-β의 N-말단으로부터 59-71번째의 아미노산으로 구성된 펩타이드 항원(서열번호 2), 및 장어의 JeLH-β의 N-말단으로부터 119-129번?의 아미노산으로 구성된 펩타이드 항원(서열번호 3)의 혼합물을 토끼에 면역하여 얻은 다클론 항체 중 IgG를 정제한 후, SDS 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 13은 비교예 1에 따라, 민물장어 JeLH-β 서브유니트와 쥐의 GTH-α 서브유니트를 재조합한 키메라 LH 항원을 토끼에 면역하여 얻은 다클론 항체 중 IgG를 정제한 후, SDS 전기영동한 결과를 나타낸다.
도 14는 실험예 1-1에 따라, 누에 번데기에서 생산한 JeLH, JeLHβ, JeGTHα, JeFSH, JeFSHβ, JeGTHα, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα를 대상으로 SDS-PAGE하여 CBB 염색한 결과이다.
도 15는 실험예 1-2에 따라, 누에 번데기에서 생산한 JeLH, JeLHβ, JeGTHα, JeFSH, JeFSHβ, JeGTHα, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα를 대상으로 SDS-PAGE한 후, 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 옮기고 His 항체로 웨스턴 블롯팅한 결과이다.
도 16은 실험예 1-3에 따라, 누에 번데기에서 생산한 JeLH, JeLHβ, JeGTHα, JeFSH, JeFSHβ, JeGTHα, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα 를 대상으로 SDS-PAGE한 후, 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 옮긴 후 비교예 1에서 JeLH-β 서브유니트와 쥐의 GTH-α 서브유니트의 키메라 항원에 대한 다클론 항체로 웨스턴 블롯팅한 결과이다.
도 17은 실험예 1-4에 따라, 누에 번데기에서 생산한 JeLH, JeLHβ, JeGTHα, JeFSH, JeFSHβ, JeGTHα, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα 를 대상으로 SDS-PAGE한 후, 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 옮기고 실시예 2에서 제조한 장어 JeLH-β 펩타이드에 대한 다클론 항체로 웨스턴 블롯팅한 결과이다.
도 18은 실험예 2에 따라, 누에 번데기에서 생산한 JeLH, JeLHβ 를 대상으로 SDS-PAGE하고 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮긴 후 1:5,000, 1:10,000, 1:20,000 비율로 희석한 실시예 2에서 제조한 장어 LH-β 펩타이드에 대한 다클론 항체로 웨스턴 블롯팅한 결과이다.
도 19는 실험예 3에 따라, 누에 번데기에서 생산한 JeLH, JeLHβ를 1.6 ug 혼합 후, JeLH의 함량을 1.4, 1.2, 1.0, 0.8, 0.4, 0.2, 0 ug 순서로 감소시키고 다른 호르몬은 동량으로 혼합한 시료를 대상으로 SDS-PAGE한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮겨 민물장어 JeLH 베타 펩타이드에 대한 다클론 항체로 웨스턴 블롯팅 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 민물장어의 JeLH에 특이적인 마커 선정

1-1: JeLH-β 서뷰유니트의 분석

민물장어 JeLH-β 서브유니트의 구조 확인을 위하여, 트랜스멤브레인 및 신호서열을 검색하고, 단백질의 친수성과 소수성을 컴퓨터 프로그램을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 민물장어 LH-β 서브유니트(서열번호 6)에서 트랜스멤브레인(Transmembrane, TM, http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 영역, 분비신호서열(Signal peptides, SP, http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 당쇄 수식(N-glycosylation, http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)과 소수성(Hydrophobic, http://web.expasy.org/protscale/), 친수성(hydophilic http://web.expasy.org/protscale/) 부위를 분석하였으며, 분석결과를 도 1 내지 도 6에 나타냈다. 트랜스멤브레인 영역은 도 1에 나타냈고, 분비신호서열은 도 2에, 당쇄 수식 부분을 도 3에, 소수성 및 친수성 부분 분석결과는 도 4 내지 6에 나타냈다.

도 1 내지 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 민물장어 LH-β서브유니트의 구조에서 트랜스멤브레인(TM) 영역은 존재하지 않았으며(도 1), 분비 신호서열은 N-말단으로부터 1-24번째 아미노산 서열 부분 (서열번호 7)이 존재함을 확인하였고(도 2), N-말단으로부터 34번째 아미노산의 N(N-E-T, NET 서열에서 N의 위치) 부분이 N-당쇄 수식되어있으며(도 3), N-말단으로부터 21 내지 50번째까지 아미노산 서열(서열번호 8)이 친수성이 높은 부분으로써, 그 중 EPINETNSVEKDGC(서열번호 1)이 친수성 영역이고(도 4), 두 번째로 확인한 친수성이 높은 부분은 N-말단으로부터 51 내지 80번째까지 아미노산 서열(서열번호 9) 영역이었으며, 그 중 CITKDPSYKGPLS(서열번호 2)이 친수성 영역임을 확인하였고(도 5), 세 번째로 확인한 친수성이 높은 부분은 N-말단으로부터 111번째 내지 140번째까지 아미노산 서열(서열번호 10) 영역이었으며, 그 중 SDCAIQSLRPD(서열번호 3)이 친수성 영역(도 6)임을 확인하였다.

1-2: JeLH-β 서뷰유니트를 JeFSH 및 JeTSH의 β 서브유니트와 비교 분석

민물장어 뇌하수체 당단백질 호르몬인 JeFSH-β 서브유니트, JeLH-β 서브유니트, 및 JeTSH-β서브유니트의 아미노산 서열의 상동성을 http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw 에서 Multiple Sequence alignment(MSA) 방법을 사용해 비교 분석하였다.

JeLH와 JeFSH의 homology score는 39, JeLH와 JeTSH는 29로 나타났으며, 구체적인 세가지 당단백질 호르몬의 β 서브유니트 서열들의 상동성 분석결과를 도 8에 나타냈다. 도 8에서 검은색으로 표시한 부분은 세 종류 호르몬 모두에 공통으로 존재하는 서열을 나타내며, 회색 부분은 세 종류 호르몬 중 두 종류의 호르몬에 공통적으로 존재하는 서열이고, 붉은 박스로 표시한 부분은 민물장어 JeLH 베타 서브유니트의 서열 중에서 JeFSH와 JeTSH에는 존재하지 않고 LH에만 존재하는 아미노산 서열 영역으로, 본 발명의 다클론 항체를 생산하기 위해 사용한 폴리펩타이드 부분을 표시한 것이다.

1-3: JeLH 항체 제조용 항원 폴리펩타이드의 선정

상기 실시예 1-1에서 얻어진 분비 신호서열, N-당쇄 수식 서열 및 소수성 영역에 관한 정보와 상기 실시예 1-2에 따라 JeFSH 및 JeTSH의 β 서브유니트의 아미노산 서열 상동성 분석 결과로부터, 아미노산 서열 상동성이 낮은 서열을 종합하여, 최종적으로 JeLH-β 서브유니트의 N 말단으로부터 31-44번째의 아미노산 서열 부분(EPINETNSVEKDGC-서열번호 1), 59-71번째 아미노산 서열 부분(CITKDPSYKGPLS-서열번호 2), 및 119-129 아미노산 서열부분(SDCAIQSLRPD-서열번호 3)을 JeLH 다클론 항체 제조용 마커 펩타이드로 선정하였다.

실시예 2: 마커 펩타이드를 이용한 다클론 항체 제작

상기 실시예 1에서 선발한 서열번호 1의 아미노산으로 구성된 펩타이드 마커 (이하, 제1마커), 서열번호 2의 아미노산으로 구성된 펩타이드 마커(이하, 제2마커) 및 서열번호 3의 아미노산으로 구성된 펩타이드 마커(이하, 제3마커)를 혼합해 토끼에 면역화하여 토끼 다클론 항체를 제조하였다.

보다 구체적으로, 상기 제1마커, 제2마커 및 제3마커를 혼합하여 토끼 복강내에 총 3회 주사하여 다클론 항체를 제조하였다. 먼저 200 ug의 정제된 마커항원 혼합물에 2 ul의 10% SDS를 첨가한 후 2분간 가열하고, 200 ul의 컴플리트 어쥬번트(Freud's Complete aduvant, Sigma)를 첨가하여 초음파처리하였다. 이후 토끼 복강에 1차로 항원을 주입한 후 4-5주 경과 후 채혈하고, 2차 항원 주입을 실시하였다. 이로부터 2주 경과 후 채열하여 3차 항원을 주입하였으며, 항원을 토끼에 3차 부스팅(boosting)하고 9주 후에 혈액을 채취한 후, 혈액과 TBST 버퍼를 1:100, 1:1,000, 1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000 비율로 혼합한 장어 LH 탐지용 조성물을 처리해 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 다음으로 TBST로 세척하고 TMB 기질을 이용하여 450 nm 파장으로(Perkinelmer victor X3)으로 측정하여 direct ELISA 분석을 수행하였다(도 10).

ELISA 분석결과, 혈액과 TBST 버퍼를 1:50,000 내지 1:100,000 비율에서 혼합한 장어 JeLH 탐지용 조성물을 처리했을 때 OD값이 1.0 이하로 측정되었으며 이후 면역반응 활성이 높은 수준으로 나타남을 확인하였다. 두 마리의 토끼에 면역한 샘플은 모두 동일한 경향을 나타났다.

추가적으로, 상기에서 생산한 JeLH-β 서브유니트를 특이적으로 인식하는 다클론 항체 중 IgG를 정제한 후 SDS 전기영동하였으며, 그 결과를 도 12에 타나냈다. 도 12의 1-3번 레인은 상기 정제한 다클론 항체를 각각 0.5, 1, 2 ug 로딩한 것이며, 4, 5번 레인은 농도 확인을 위해 BGG(bovin gamma globulin) 1, 2 ug을 각각 로딩한 것이며, 6번은 단백질 사이즈 마커이다. 화살표로 제시한 부분이 본 발명 항체의 Heavy chain을 나타낸다.

비교예 1: JeLHβ / mGTHα 키메라 항원을 이용한 다클론 항체 생산

장어 LH의 β 서브유니트는 유지하고, α서브유니트를 쥐의 GTH(Gonadotropin hormone)-α서브유니트로 치환한 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 키메라 형태(JeLH-β/mGTH-α)의 LH 항원을 토끼에 주사하여 상기 키메라 항원을 특이적으로 인식하는 다클론 항체를 제조하였다(도 7의 (B)).

보다 구체적으로, JeLH-β/mGTH-α 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 5)과 한국등록특허 10-1493957에 개시된 누에유충 및 번데기 발현 시스템을 이용하여 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 키메라 형태의 LH 항원을 제조하고, SDS 전기영동을 통해 확인하였다(도 9 참조). 도 9에 나타난 바와 같이, SDS 전기영동 확인결과, 키메라 형태의 LH 항원은 약 35 kDa 분자량을 가지며 당쇄부가 효과로 인한 스메어(smear)한 상태임을 확인할 수 있었다.

상기에서 제조한 키메라 형태의 LH 항원을 실시예 2와 동일한 방법으로 토끼에 주사하여 키메라 항원을 특이적으로 인식하는 다클론 항체를 제조하였다.

다음으로, JeLHβ/mGTHα 키메라 항원을 토끼에 3차 부스팅(boosting)하고 9주 후에 혈액을 채취하였으며, 이를 1:100, 1:1,000, 1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000 비율로 TBST 버퍼와 혼합하여 항원과의 반응을 테스트하였다. 항체가를 ELISA를 이용하여 두 번 반복해 분석하였으며, 그 결과를 도 11에 나타냈다.

ELISA 분석 결과, 1:10,000에서 OD값이 약 1.0으로 측정되었으며, 이 비율이 이후 항원-항체반응 등의 실험에 있어 최소 반응 비율임을 알 수 있었다. 상기 결과는 두 마리의 토끼에 면역한 샘플에서 비슷한 경향을 나타냈다(도 11).

추가적으로, 상기에서 생산한 키메라 항원을 특이적으로 인식하는 다클론 항체 중 IgG를 정제한 후 SDS 전기영동하였으며, 그 결과를 도 13에 타나냈다. 도 1의 1-3번 레인은 상기 정제한 다클론 항체를 각각 0.5, 1, 2 ug 로딩한 것이며, 4, 5번 레인은 농도 확인을 위해 BGG(bovin gamma globulin) 1, 2 ug을 각각 로딩한 것이고, 6번은 단백질 사이즈 마커이다. 화살표로 제시한 부분이 본 발명 항체의 Heavy chain을 나타낸다.

실험예 1 : 항체의 JeLH 특이성 평가

1-1. CBB 염색 결과

한국등록특허 10-1493957에 개시된 누에유충 및 번데기 발현 시스템과 실질적으로 동일한 방법을 사용해 제조하고 분리한 JeLH, JeLHβ, JeFSH, JeFSHβ, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα를 12% SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 Coomassie Brillaiant Blue(CBB) 염색을 수행하였으며, 그 결과를 도 14에 나타냈다.

구체적으로, 각각의 폴리펩타이드 호르몬을 제조하기 위해, 호르몬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(JeLH: 서열번호 11, JeLHβ: 서열번호 6, JeFSH: 서열번호 12, JeFSHβ: 서열번호 13, JeTSH: 서열번호 14, JeTSHβ: 서열번호 15, JeGTHα: 서열번호 16)을 시판되는 배큘로바이러스 전이 벡터(baculovirus transfer vector)에 제조사에서 제공하는 프로토콜을 따라서 클로닝하여 재조합 전이벡터를 제조하고, 이렇게 제조한 재조합 전이벡터를 숙주세포(BmDH10Bac 컨피던트 세포)에 형질전환시켜 재조합 백미드를 제조한다. 형성된 백미드를 통상의 플라스미드 추출법을 이용하여 세포로부터 분리한다. 분리한 재조합 백미드를 누에(BmN) 세포 내로 형질감염시키고 형질감염된 곤충세포로부터 재조합 배큘로바이러스를 분리하고, 이를 누에 유충 또는 번데기 생체에 주입하여 형질전환하여 각각의 JeLH, JeLHβ, JeFSH, JeFSHβ, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα 단백질을 발현시킨다. 다음으로, 상기 누에 유충 또는 번데기의 세포 또는 체액으로부터 각각의 발현시킨 단백질을 통상적인 방법을 사용해 분리, 정제하였다.

도 14에서 알 수 있는 바와 같이. JeLH, JeLHβ. JeGTHα, JeFSH, JeFSHβ, JeGTHα, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα는 각각 33, 18, 18, 33, 19, 18, 33, 18, 18 kDa의 분자량을 가짐을 확인했으며, 이는 각각의 염기서열로부터 예상된 사이즈 보다 약 7-8 kDa 높은값으로 당쇄 부가에 의한 결과이다.

구분	염기서열	서열번호
JeLH	MSVYPECTWPLFVCLCHLLV SAGGSLLLPCEPINETISVE KDGCPKCLVFQTSICSGHCI TKDPSYKSPLSTVYQRVCTY RDVRYETVRLPDCRPGVDPH VTFPVALSCDCNLCTMDTSD CAIQSLRPDFCMSQRASLPA SYPNNEMARGGCDECRLQEN KIFSRPSAPIFQCVGCCFSR AYPTPLRSKKTMLVPKNITS EATCCVAREVTRLDNMKLEN HTDCHCSTCYYHKF	11
JeFSH	MHLAVTALCLTLAPVLARAS TSCGLANISISVENEECGGC ITFNTTACAGLCFTQDSVYK SSLKSYPQQACNFRDVVYET VHLPGCPSGMDLHFTYPVAL SCECSKCDTDSTDCGPLNTE VSGCLTHSYPNNEMARGGCD ECRLQENKIFSKPSAPIFQC VGCCFSRAYPTPLRSKKTML VPKNITSEATCCVAREVTRL DNMKLENHTDCHCSTCYYHK F	12
JeFSHβ	MHLAVTALCLTLAPVLARAS TSCGLANISISVENEECGGC ITFNTTACAGLCFTQDSVYK SSLKSYPQQACNFRDVVYET VHLPGCPSGMDLHFTYPVAL SCECSKCDTDSTDCGPLNTE VSGCLTH	13
JeTSH	MRVVLLASGVLCLLAGQVLS ICSPVDYTLYVEKPECDFCV AINTTICMGFCYSLDPNVVG PAVKRLAVQRGCTYQAVEYR TAELPGCPPHVDPRFSYPVA LHCTCRACDPARDECTHRAS ADGDRCSKPLLLHMHAYPGQ SNHIQTLSYPNNEMARGGCD ECRLQENKIFSKPSAPIFQC VGCCFSRAYPTPLRSKKTML VPKNITSEATCCVAREVTRL DNMKLENHTDCHCSTCYYHK F	14
JeTSHβ	MRVVLLASGVLCLLAGQVLS ICSPVDYTLYVEKPECDFCV AINTTICMGFCYSLDPNVVG PAVKRLAVQRGCTYQAVEYR TAELPGCPPHVDPRFSYPVA LHCTCRACDPARDECTHRAS ADGDRCSKPLLLHMHAYPGQ SNHIQTL	15
JeGTHα	MMVCPGKPGASLLMLSMLFH IIDSYPNNEMARGGCDECRL QENNIFSKPSAPIFQCVGCC FSRAYPTPLRSKKTMLVPKN ITSEATCCVAREVTRLDNMK LENHTDCHCSTCYYHK	16

1-2. His 항체 웨스턴 블랏 분석

실험예 1-1과 동일한 방법으로 합성하고 분리한　JeLH, JeLHβ, JeFSH, JeFSHβ, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα 를 SDS-PAGE한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮기고 His 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 그 결과를 도 15에 나타냈다.

도 15에서 알 수 있는 바와 같이, JeLH, JeLHβ, JeGTHα, JeFSH, JeFSHβ, JeGTHα, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα 각각의 분자량이 CBB 염색 결과와 동일하게 확인되었고, 이는 재조합단백질 제작시 태그로 사용된 His 항체는 모든 장어의 성 호르몬 단백질과 결합을 형성함을 확인하였다.

1-3. 비교예 1 항체 웨스턴 블랏 분석

실험예 1-1과 동일한 방법으로 합성하고 분리한　JeLH, JeLHβ, JeFSH, JeFSHβ, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα 를 SDS-PAGE한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮기고 상기 비교예 1에서 제조한 민물장어 LHβ와 쥐의 GTHα의 키메라 다클론 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 그 결과를 도 16에 나타냈다.

도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 비교예 1의 항체는 JeLH, JeLHβ와 결합하여 2번과 3번 레인에서 밴드가 뚜렷이 나타나기는 했으나, 그 외 GTHα 단백질과도 약하지만 결합하였으며, 항체가 종간 유사성을 인식하여 FSH(5 레인), FSHβ(6 레인), GTHα(7 레인)와 TSH(8 레인), TSHβ(9 레인), GTHα(10 레인)과도 약하게 나마 결합을 형성함을 확인하였다.

따라서, 비교예 1 항체는 JeLH 만을 특이적으로 검출해내기에 부적절함을 확인할 수 있었다.

1-4. 본 발명 다클론 항체 웨스턴 블랏 분석

실험예 1-1과 동일한 방법으로 합성하고 분리한　JeLH, JeLHβ, JeFSH, JeFSHβ, JeTSH, JeTSHβ, JeGTHα를 SDS-PAGE한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮기고 상기 실시예 2에서 제조한 본 발명의 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드, 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 및 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 혼합물을 토끼에 주사해 얻은 다클론 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 그 결과를 도 17에 나타냈다.

도 17에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 다클론 항체는 오직 JeLH, JeLHβ와 특이적으로 결합하였으며, 민물장어의 뇌하수체 호르몬의 공통서열인 GTHα는 물론(4, 7, 10 레인), JeFSH와 JeTSH의 특이서열인 베타(5, 6, 8, 9 레인) 에도 밴드가 나타나지 않았으며, 이로부터 본 발명의 다클론 항체는 GTH, JeGTHα, JeFSH, JeFSHβ. JeTSH, JeTSHβ와는 결합하지 않고 JeLH만을 특이적으로 인식하고 선별할 수 있는 항체임을 확인하였다.

본 발명의 다클론 항체는 비교예 1의 JeLHβ/mGTHα를 연결한 키메라항원으로부터 얻은 다클론항체의 LH 외의 다른 호르몬과도 비특이적으로 결합하는 문제점을 해결한 것으로, LH 검출 특이성에 있어서 본 발명의 다클론 항체가 우수한 효능을 가짐을 알 수 있었다.

실험예 2 : 항체의 민감도 측정

실험예 1-1과 동일한 방법으로 합성하고 분리한　JeLH, JeLHβ를 SDS-PAGE하고, 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 옮긴 후, 상기 실시예 2에서 제조한 본 발명의 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드, 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드 및 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드의 혼합물을 토끼에 주사해 얻은 다클론 항체를 1:5,000, 1:10,000 및 1:20,000 비율로 희석한 후 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 그 결과를 도 18에 나타냈다.

도 18에 나타난 바와 같이, 본 발명 다클론 항체 LH 결합 특이성을 확인할 수 있었으며, 다클론 항체를 1:20,000 비율로 희석하였을 때도 항원-항체반응이 일어났고, 이는 이전 ELISA 결과와도 일치하는 결과이다.

실험예 3 : 항체를 이용한 시료 JeLH 검출

장어의 혈액에는 다양한 호르몬들이 혼합되어 있으며, 이러한 혈액과 유사 환경을 만들어 본원발명 다클론항체의 JeLH 검출 특이성 확인하였다. 장어의 혈액과 유사 환경을 세팅하기 위해 실험예 1-1과 동일한 방법으로 합성하고 분리한　JeFSH, JeLH 및 JeTSH를 각각 1.6 ug씩 혼합한 시료, 다음으로 각각의 혼합 양을 0.2 ug씩 감소시켜 (1.6, 1.4, 1.2, 1.0, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0) 혼합한 시료를 대상으로, SDS-PAGE를 수행하였다. SDS-PAGE를 수행한 후 니트로 셀룰로오스 멤브레인에 옮기고 상기 실시예 2에서 제조한 본 발명의 다클론 항체를 처리해 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며 그 결과를 도 19에 나타냈다.

도 19에 나타난 바와 같이, JeFSH와 JeTSH 가 검출되어야 하는 부분에서 밴드가 나타나지 않아, 본 발명의 다클론 항체가 JeLH에 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었으며, 또한, 경쟁법(competition immunoblotting)을 통해 본원의 다클론 항체를 이용할 경우, 호르몬이 혼합된 상태의 검체에서도 JeLH만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

<110> Gyeongbuk Institute for Marine Bioindustry <120> Antibody specific to luteinizing hormone of Japamese eel and uses thereof <130> DPP20174111KR <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment of JeLH-beta subunit (N'31-44) <400> 1 Glu Pro Ile Asn Glu Thr Asn Ser Val Glu Lys Asp Gly Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment of JeLH-beta subunit (N'59-71) <400> 2 Cys Ile Thr Lys Asp Pro Ser Tyr Lys Gly Pro Leu Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment of JeLH-beta subunit (N'119-129) <400> 3 Ser Asp Cys Ala Ile Gln Ser Leu Arg Pro Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chimeric polypeptide linked to JeLH-beta subunit and mGTH-alpha subunit <400> 4 Met Ser Val Tyr Pro Glu Cys Thr Trp Pro Leu Phe Val Cys Leu Cys 1 5 10 15 His Leu Leu Val Ser Ala Gly Gly Ser Leu Leu Leu Pro Cys Glu Pro 20 25 30 Ile Asn Glu Thr Ile Ser Val Glu Lys Asp Gly Cys Pro Lys Cys Leu 35 40 45 Val Phe Gln Thr Ser Ile Cys Ser Gly His Cys Ile Thr Lys Asp Pro 50 55 60 Ser Tyr Lys Ser Pro Leu Ser Thr Val Tyr Gln Arg Val Cys Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Asp Val Arg Tyr Glu Thr Val Arg Leu Pro Asp Cys Arg Pro Gly 85 90 95 Val Asp Pro His Val Thr Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys Asp Cys Asn 100 105 110 Leu Cys Thr Met Asp Thr Ser Asp Cys Ala Ile Gln Ser Leu Arg Pro 115 120 125 Asp Phe Cys Met Ser Gln Arg Ala Ser Leu Pro Ala Ser Ser Ser Ser 130 135 140 Lys Asp Pro Gly Gly Gly Ser Leu Pro Asp Gly Asp Phe Ile Ile Gln 145 150 155 160 Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Leu 165 170 175 Gly Ala Pro Ile Tyr Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr 180 185 190 Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile 195 200 205 Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr 210 215 220 Val Met Gly Asn Ala Arg Val Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser 225 230 235 240 Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 245 <210> 5 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A nucleotide sequence of a chimeric polypeptide linked to JeLH-beta subunit and mGTH-alpha subunit <400> 5 atgtcagtct acccagaatg cacctggccc ctctttgtat gcttgtgtca cctccttgtt 60 tctgctggag gctctttact gctgccttgt gaaccaatca atgaaactat ttctgtggag 120 aaagatggat gtccaaaatg tctggtgttc caaacatcca tctgcagtgg tcactgcatc 180 accaaggacc caagctacaa gagcccgctg tccacggtgt accagcgcgt gtgcacgtac 240 cgggacgtcc gctacgagac ggtgcggctg ccagactgcc gccccggcgt ggatccccat 300 gtgactttcc ccgtggctct gagctgcgac tgtaacctgt gcaccatgga cacgtctgac 360 tgcgccatcc agagtctgag gcccgacttc tgcatgagcc agcgggccag cctccccgcg 420 tcctcttcct ctaaggatcc aggtggtggt tcacttcctg atggagactt tattattcag 480 ggttgcccag aatgtaaact aaaggaaaat aaatacttct ccaagctagg agcccccatc 540 taccagtgta tgggctgttg cttctccagg gcatatccca ctcccgccag gtccaagaag 600 acaatgctgg ttccaaagaa tattacctcg gaggccacat gctgtgtggc caaagcattt 660 actaaggcca cagtaatggg aaatgccaga gtggagaatc atacggagtg ccactgtagc 720 acttgctact accacaagtc g 741 <210> 6 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence of JeLH-beta subunit <400> 6 Met Ser Val Tyr Pro Glu Cys Thr Trp Pro Leu Phe Val Cys Leu Cys 1 5 10 15 His Leu Leu Val Ser Ala Gly Gly Ser Leu Leu Leu Pro Cys Glu Pro 20 25 30 Ile Asn Glu Thr Ile Ser Val Glu Lys Asp Gly Cys Pro Lys Cys Leu 35 40 45 Val Phe Gln Thr Ser Ile Cys Ser Gly His Cys Ile Thr Lys Asp Pro 50 55 60 Ser Tyr Lys Ser Pro Leu Ser Thr Val Tyr Gln Arg Val Cys Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Asp Val Arg Tyr Glu Thr Val Arg Leu Pro Asp Cys Arg Pro Gly 85 90 95 Val Asp Pro His Val Thr Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys Asp Cys Asn 100 105 110 Leu Cys Thr Met Asp Thr Ser Asp Cys Ala Ile Gln Ser Leu Arg Pro 115 120 125 Asp Phe Cys Met Ser Gln Arg Ala Ser Leu Pro Ala 130 135 140 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Secretion signal polypeptide fragment of JeLH-beta subunit (N' 1-24) <400> 7 Met Ser Val Tyr Pro Glu Cys Thr Trp Pro Leu Phe Val Cys Leu Cys 1 5 10 15 His Leu Leu Val Ser Ala Gly 20 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophilic polypeptide fragment 1 of JeLH-beta subunit <400> 8 Ser Ala Gly Gly Ser Leu Leu Leu Pro Cys Glu Pro Ile Asn Glu Thr 1 5 10 15 Asn Ser Val Glu Lys Asp Gly Cys Pro Lys Cys Leu Val Phe 20 25 30 <210> 9 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophilic polypeptide fragment 2 of JeLH-beta subunit <400> 9 Gln Thr Ser Ile Cys Ser Gly His Cys Ile Thr Lys Asp Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Gly Pro Leu Ser Thr Val Tyr Gln Arg Val Cys Thr Tyr 20 25 30 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hydrophilic polypeptide fragment 3 of JeLH-beta subunit <400> 10 Cys Asn Leu Cys Thr Met Asp Thr Ser Asp Cys Ala Ile Gln Ser Leu 1 5 10 15 Arg Pro Asp Phe Cys Met Ser Gln Arg Ala Ser Leu Pro Ala 20 25 30 <210> 11 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence of JeLH <400> 11 Met Ser Val Tyr Pro Glu Cys Thr Trp Pro Leu Phe Val Cys Leu Cys 1 5 10 15 His Leu Leu Val Ser Ala Gly Gly Ser Leu Leu Leu Pro Cys Glu Pro 20 25 30 Ile Asn Glu Thr Ile Ser Val Glu Lys Asp Gly Cys Pro Lys Cys Leu 35 40 45 Val Phe Gln Thr Ser Ile Cys Ser Gly His Cys Ile Thr Lys Asp Pro 50 55 60 Ser Tyr Lys Ser Pro Leu Ser Thr Val Tyr Gln Arg Val Cys Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Asp Val Arg Tyr Glu Thr Val Arg Leu Pro Asp Cys Arg Pro Gly 85 90 95 Val Asp Pro His Val Thr Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys Asp Cys Asn 100 105 110 Leu Cys Thr Met Asp Thr Ser Asp Cys Ala Ile Gln Ser Leu Arg Pro 115 120 125 Asp Phe Cys Met Ser Gln Arg Ala Ser Leu Pro Ala Ser Tyr Pro Asn 130 135 140 Asn Glu Met Ala Arg Gly Gly Cys Asp Glu Cys Arg Leu Gln Glu Asn 145 150 155 160 Lys Ile Phe Ser Arg Pro Ser Ala Pro Ile Phe Gln Cys Val Gly Cys 165 170 175 Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met 180 185 190 Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys Val Ala Arg 195 200 205 Glu Val Thr Arg Leu Asp Asn Met Lys Leu Glu Asn His Thr Asp Cys 210 215 220 His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Phe 225 230 <210> 12 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence of JeFSH <400> 12 Met His Leu Ala Val Thr Ala Leu Cys Leu Thr Leu Ala Pro Val Leu 1 5 10 15 Ala Arg Ala Ser Thr Ser Cys Gly Leu Ala Asn Ile Ser Ile Ser Val 20 25 30 Glu Asn Glu Glu Cys Gly Gly Cys Ile Thr Phe Asn Thr Thr Ala Cys 35 40 45 Ala Gly Leu Cys Phe Thr Gln Asp Ser Val Tyr Lys Ser Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Cys Asn Phe Arg Asp Val Val Tyr Glu Thr 65 70 75 80 Val His Leu Pro Gly Cys Pro Ser Gly Met Asp Leu His Phe Thr Tyr 85 90 95 Pro Val Ala Leu Ser Cys Glu Cys Ser Lys Cys Asp Thr Asp Ser Thr 100 105 110 Asp Cys Gly Pro Leu Asn Thr Glu Val Ser Gly Cys Leu Thr His Ser 115 120 125 Tyr Pro Asn Asn Glu Met Ala Arg Gly Gly Cys Asp Glu Cys Arg Leu 130 135 140 Gln Glu Asn Lys Ile Phe Ser Lys Pro Ser Ala Pro Ile Phe Gln Cys 145 150 155 160 Val Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys 165 170 175 Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys 180 185 190 Val Ala Arg Glu Val Thr Arg Leu Asp Asn Met Lys Leu Glu Asn His 195 200 205 Thr Asp Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Phe 210 215 220 <210> 13 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence of JeFSH-beta subunit <400> 13 Met His Leu Ala Val Thr Ala Leu Cys Leu Thr Leu Ala Pro Val Leu 1 5 10 15 Ala Arg Ala Ser Thr Ser Cys Gly Leu Ala Asn Ile Ser Ile Ser Val 20 25 30 Glu Asn Glu Glu Cys Gly Gly Cys Ile Thr Phe Asn Thr Thr Ala Cys 35 40 45 Ala Gly Leu Cys Phe Thr Gln Asp Ser Val Tyr Lys Ser Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Tyr Pro Gln Gln Ala Cys Asn Phe Arg Asp Val Val Tyr Glu Thr 65 70 75 80 Val His Leu Pro Gly Cys Pro Ser Gly Met Asp Leu His Phe Thr Tyr 85 90 95 Pro Val Ala Leu Ser Cys Glu Cys Ser Lys Cys Asp Thr Asp Ser Thr 100 105 110 Asp Cys Gly Pro Leu Asn Thr Glu Val Ser Gly Cys Leu Thr His 115 120 125 <210> 14 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence of JeTSH <400> 14 Met Arg Val Val Leu Leu Ala Ser Gly Val Leu Cys Leu Leu Ala Gly 1 5 10 15 Gln Val Leu Ser Ile Cys Ser Pro Val Asp Tyr Thr Leu Tyr Val Glu 20 25 30 Lys Pro Glu Cys Asp Phe Cys Val Ala Ile Asn Thr Thr Ile Cys Met 35 40 45 Gly Phe Cys Tyr Ser Leu Asp Pro Asn Val Val Gly Pro Ala Val Lys 50 55 60 Arg Leu Ala Val Gln Arg Gly Cys Thr Tyr Gln Ala Val Glu Tyr Arg 65 70 75 80 Thr Ala Glu Leu Pro Gly Cys Pro Pro His Val Asp Pro Arg Phe Ser 85 90 95 Tyr Pro Val Ala Leu His Cys Thr Cys Arg Ala Cys Asp Pro Ala Arg 100 105 110 Asp Glu Cys Thr His Arg Ala Ser Ala Asp Gly Asp Arg Cys Ser Lys 115 120 125 Pro Leu Leu Leu His Met His Ala Tyr Pro Gly Gln Ser Asn His Ile 130 135 140 Gln Thr Leu Ser Tyr Pro Asn Asn Glu Met Ala Arg Gly Gly Cys Asp 145 150 155 160 Glu Cys Arg Leu Gln Glu Asn Lys Ile Phe Ser Lys Pro Ser Ala Pro 165 170 175 Ile Phe Gln Cys Val Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 180 185 190 Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu 195 200 205 Ala Thr Cys Cys Val Ala Arg Glu Val Thr Arg Leu Asp Asn Met Lys 210 215 220 Leu Glu Asn His Thr Asp Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys 225 230 235 240 Phe <210> 15 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence of JeTSH-beta subunit <400> 15 Met Arg Val Val Leu Leu Ala Ser Gly Val Leu Cys Leu Leu Ala Gly 1 5 10 15 Gln Val Leu Ser Ile Cys Ser Pro Val Asp Tyr Thr Leu Tyr Val Glu 20 25 30 Lys Pro Glu Cys Asp Phe Cys Val Ala Ile Asn Thr Thr Ile Cys Met 35 40 45 Gly Phe Cys Tyr Ser Leu Asp Pro Asn Val Val Gly Pro Ala Val Lys 50 55 60 Arg Leu Ala Val Gln Arg Gly Cys Thr Tyr Gln Ala Val Glu Tyr Arg 65 70 75 80 Thr Ala Glu Leu Pro Gly Cys Pro Pro His Val Asp Pro Arg Phe Ser 85 90 95 Tyr Pro Val Ala Leu His Cys Thr Cys Arg Ala Cys Asp Pro Ala Arg 100 105 110 Asp Glu Cys Thr His Arg Ala Ser Ala Asp Gly Asp Arg Cys Ser Lys 115 120 125 Pro Leu Leu Leu His Met His Ala Tyr Pro Gly Gln Ser Asn His Ile 130 135 140 Gln Thr Leu 145 <210> 16 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide sequence of JeGTH-alpha <400> 16 Met Met Val Cys Pro Gly Lys Pro Gly Ala Ser Leu Leu Met Leu Ser 1 5 10 15 Met Leu Phe His Ile Ile Asp Ser Tyr Pro Asn Asn Glu Met Ala Arg 20 25 30 Gly Gly Cys Asp Glu Cys Arg Leu Gln Glu Asn Asn Ile Phe Ser Lys 35 40 45 Pro Ser Ala Pro Ile Phe Gln Cys Val Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala 50 55 60 Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn 65 70 75 80 Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys Val Ala Arg Glu Val Thr Arg Leu 85 90 95 Asp Asn Met Lys Leu Glu Asn His Thr Asp Cys His Cys Ser Thr Cys 100 105 110 Tyr Tyr His Lys 115

Claims (10)

1. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 민물장어(Anguilla japonica)의 황체 형성 호르몬(Luteinizing hormone, LH) 탐지용 펩타이드 마커를 항원으로 사용하여 제조되며, 민물장어의 LH와 특이적으로 결합하는 항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 민물장어의 여포 자극 호르몬(Follicle-stimulating hormone; FSH), 갑상선 자극 호르몬 (Thyroid Stimulating hormone; TSH), 및 생식소 자극 호르몬(gonadotropin, GTH)에는 결합하지 않으며 민물장어의 LH에 특이적으로 결합하는, 항체.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는, 항체.
4. 제1항에 있어서, 상기 항원은 캐리어 단백질을 추가적으로 포함함을 특징으로 하는, 항체.
5. 제4항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin), BSA(Bovine Serum Albumin), OVA(Ovalbumin), Tg(thyroglobulin), TT(tetanus toxoid), diphtheria toxioid(Td), 및 PPD(tuberculin purified protein) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 항체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 생물학적 시료 내 민물장어(Anguilla japonica)의 황체 형성 호르몬(Luteinizing hormone, LH)의 특이적 탐지용 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 민물장어의 TSH, FSH 및 GTH 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더욱 포함하는 것인 조성물.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계, 및 상기 시료 내에서 항원-항체 복합체의 형성여부를 탐지하는 단계를 포함하는,
   생물학적 시료 내 민물장어(Anguilla japonica)의 황체 형성 호르몬(Luteinizing hormone, LH)을 특이적으로 탐지하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체의 형성여부를 탐지하는 단계는, 효소면역흡착법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA), 면역형광법(IFA), 웨스턴 블롯팅(WB) 및 유세포 분석법(FCA) 중에서 적어도 하나의 방법에 의해 수행하는 것인, 방법.
10. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드, 또는
    서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는,
    민물장어(Anguilla japonica)의 황체 형성 호르몬(Luteinizing hormone, LH) 탐지용 마커.

Images