KR20140026781A - 인간 ＰＤＩｂ´ａ´태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 ＬＩＦ 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법 - Google Patents
인간 ＰＤＩｂ´ａ´태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 ＬＩＦ 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20140026781A KR20140026781A KR1020120092392A KR20120092392A KR20140026781A KR 20140026781 A KR20140026781 A KR 20140026781A KR 1020120092392 A KR1020120092392 A KR 1020120092392A KR 20120092392 A KR20120092392 A KR 20120092392A KR 20140026781 A KR20140026781 A KR 20140026781A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- hlif
- recombinant
- hpdib
- tag
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 3
- 101000942967 Homo sapiens Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000046645 human LIF Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 101001072202 Homo sapiens Protein disulfide-isomerase Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 29
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 14
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 10
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 101150088608 Kdr gene Proteins 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(CO)(CO)NCC(O)=O CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100021747 Leukemia inhibitory factor receptor Human genes 0.000 description 3
- 101710142062 Leukemia inhibitory factor receptor Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 1
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 101000801195 Homo sapiens TLE family member 5 Proteins 0.000 description 1
- 230000004163 JAK-STAT signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000018390 Ubiquitin-Specific Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010066496 Ubiquitin-Specific Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003173 antianemic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000056245 human TLE5 Human genes 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- -1 isopropyl - Chemical class 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000955 peptide mass fingerprinting Methods 0.000 description 1
- FEWLMSPFBRVAOJ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1.FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 FEWLMSPFBRVAOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5415—Leukaemia inhibitory factor [LIF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 인간 PDIb´a´ 태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 LIF 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법에 관한 것으로서, 인간 단백질 이황화물 이성질화효소(human protein disulfide isomerase; hPDI)를 코딩하는 유전자 또는 hPDIb´a´ 도메인 유전자 중 어느 하나의 유전자; 및 인간 백혈병 억제 인자(human Leukemia inhibitory factor; hLIF) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 또한 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하며, 상기 hLIF 재조합 단백질(rhLIF)의 생산방법 및 상기 생산방법에 의해 생산된 hLIF 재조합 단백질(rhLIF)을 제공한다.
Description
본 발명은 인간 PDIb´a´ 태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 LIF 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법에 관한 것이다.
백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor; LIF)는 다양한 세포에서 여러 효과를 나타내는 사이토카인들 중의 하나이다. LIF는 단핵세포(monocytes), 신경세포 및 배아줄기(embryonic stem; ES) 세포를 조절하고, 조혈작용을 한다(Trends Biochem Sci (1992) 17(2):72-6; Blood (1990) 76(1):50-6). LIF-결핍 마우스 모델에서, 이들 사이토카인은 배반포 이식(blastocyst implantation)에 필요하다는 사실이 밝혀졌다(Endocrinology (2000) 141(12):4365-72). 더구나, LIF는 쥐의 골수 백혈병 M1 세포의 성장을 억제하고, 분화를 유도한다(EMBO J (1987) 6(13): 3995-4002). LIF는 ES 세포의 발달 잠재력을 유지하기 때문에 다분화성(pluripotent) 줄기 세포 배양에 사용된다(Nature (1988) 336(6200): 684-7). 비변성 20 kDa LIF는 4개의 α-나선 다발(α-helical bundle) 단백질 중의 하나이고(Immunol Today (1990) 11(10): 350-4), 3개의 이황화 결합을 형성하는 6개의 시스테인 잔기를 포함한다. LIF는 낮은 친화도로 LIF 수용체(LIF receptor; LIFR)에 결합하고, 그 후 보다 높은 친화도로 gp130과 결합하여 기능성 복합체를 형성한다(Ciba Found Symp (1992) 167:245-55; discussion 255-9). LIFR 및 gp130의 헤테로다이머화(heterodimerization)는 줄기 세포 재생을 책임지는 Jak-STAT 경로를 활성화시킨다(Science (1994) 263(5143):92-5; Mech Dev (1994) 45(2):163-71; Cancer Invest (2004) 22(6):925-43; Oncogene (2005) 24(37): 5713-21; Cell Reprogram (2011) 13(3): 241-55). 다분화성(pluripotent) 줄기 세포 배양 배지에 있어서 첨가제로서의 중요성으로 인해 LIF의 과발현 및 정제에 대한 연구가 진행되어 왔다.
ES 세포는 태아의 모든 계열(lineages)로 분화하는 능력을 가진 시험관 내(in vitro) 세포주이다. 피더 세포(feeder cells)는 ES 세포가 분화하는 것을 방지하는데 필요한 LIF를 공급한다고 알려져 있다(Nature (1988) 336(6200): 684-7). 따라서 LIF는 ES 세포의 분화 효율에 있어서 매우 중요한 인자이다. 최근에는 다양한 인간 질병에 대한 임상 용도로서의 잠재성 때문에 ES 세포 연구의 중요성이 점점 더 커지고 있고, ES 세포를 조절하는 주요한 경로 중의 하나가 상기와 같이 LIF와 관련되어 있다. 그러나, LIF와 같은 상업적 단백질의 높은 비용으로 인해 이러한 연구 과정은 제한적이고 한계가 있다. 따라서 낮은 비용으로 다량의 단백질을 생산하기 위한 많은 시도가 있었다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주 GY1+ 또는 크렙스 아스시테스(Krebs ascites) 균주로부터 LIF를 발현하는 연구가 보고되었으나(Proc Natl Acad Sci U S A (1988) 85(8):2623-7; Anal Biochem (1988) 173(2):359-67), 발현 및 생산 수준이 낮았다. hLIF는 원핵세포 시스템에서 봉입체(inclusion bodies)로서 발현되었고, 그 후의 재접힘 방법을 통해 정제되었다(Biochim Biophys Acta (1995) 1260(1):27-34). 재접힘 과정은 높은 단백질 수율을 얻을 수 있는 장점이 있으나, 종종 생물학적으로 불활성화되는 표적 단백질과의 응집(aggregation) 및 잘못 접힘(misfolding)이 일어나는 단점이 있다. 이러한 결점을 보완하기 위해서, hLIF는 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST) 또는 티오레독신(thioredoxin; Trx)과 함께 수용성 융합 단백질로서 발현되었다(Nat Biotech (1989) 7(11):1157-1161; Protein Expr Purif (2010) 73(1):51-7; J Biotechnol (2011) 151(4):295-302; Protein Pept Lett (2011) 18(7): 690-8).
한편 한국특허출원 제 10-1997-703592호는 백혈병 억제 인자(LIF), 거의 순수한 형태로 LIF를 제조하는 방법 및 재조합 LIF를 클로닝하여 발현하는 방법, 그리고 LIF 제조를 위한 재조합 DNA 분자 및 숙주 세포에 관해 개시하고 있지만, LIF를 분리하기 위한 인간 PDI 또는 인간 PDIb´a´ 태깅 시스템에 대한 언급은 없다.
본 발명의 목적은 인간 단백질 이황화물 이성질화효소(human protein disulfide isomerase; hPDI)를 코딩하는 유전자 또는 hPDIb´a´ 도메인 유전자 중 어느 하나의 유전자; 및 인간 백혈병 억제 인자(human Leukemia inhibitory factor; hLIF) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 hLIF 재조합 단백질(rhLIF)의 생산방법 및 상기 생산방법에 의해 생산된 hLIF 재조합 단백질(rhLIF)을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 여러 태그들의 효과를 비교하기 위해서, hLIF를 His8, hPDI 또는 hPDIb´a´로 융합하였고, 각각의 융합단백질에 최적화된 조건에서 효율성을 증가시킬 수 있는 간소화된 공정을 통해 분리함으로써 본 발명을 완성하였다. hLIF의 His8 및 hPDIb´a´태깅 둘다 전체 길이의 수용성 단백질로 대장균(E. coli)에서 성공적으로 분리되었다. 그러나, hPDIb´a´가 hLIF 내에 있는 6 개의 시스테인 잔기에 3 개의 내부 이황화 결합을 형성하도록 도와서 His8보다 hLIF를 더 안정화시켰다. 분리된 hLIF의 생물학적 활성은 R1 세포에서 확인하였다.
본 발명은 인간 단백질 이황화물 이성질화효소(human protein disulfide isomerase; hPDI)를 코딩하는 유전자 또는 hPDIb´a´ 도메인 유전자 중 어느 하나의 유전자; 및 인간 백혈병 억제 인자(human Leukemia inhibitory factor; hLIF) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 상세하게는, 상기 hLIF 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하고, 상기 hPDI 유전자는 서열번호 2이고, 상기 hPDIb´a´ 도메인 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는, 상기 재조합 발현벡터는 도 1A(ii)의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명에서 사용한 Gateway Vector system은 엔트리벡터와 목적벡터로 구성되며, 상기 엔트리벡터는 목적유전자의 양말단에 attL1, attL2를 갖는 벡터이며, 목적벡터는 attR1, attR2를 포함하는 벡터이다. 상기 엔트리벡터와 상기 목적벡터는 목적벡터의 attR1 및 attR2가 엔트리벡터의 attL1 및 attL2와 재조합효소에 의해 LR반응을 일으키며, 이 과정에서 엔트리벡터에 포함되어 있던 목적유전자가 목적벡터로 전달되게 되고, attR1과 attR2 는 attB1과 attB2 서열로 치환되어진다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 상세하게는 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하고, 보다 상세하게는 대장균 BL21(DE3)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 hPDI 태그- 또는 hPDIb´a´ 도메인 태그-hLIF 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus; TEV) 단백질 분해효소(protease)를 처리하여 상기 hPDI 태그 또는 hPDIb´a´ 도메인 태그를 제거하는 단계; 및 상기 hPDI 태그 또는 hPDIb´a´ 도메인 태그가 제거된 hLIF 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 hLIF 재조합 단백질(rhLIF) 생산방법을 제공한다.
한편, 본 발명의 실시예에서는 담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus; TEV) 단백질 분해효소(protease)를 사용했지만, 상기 단백질 분해효소(protease)는 당업계에서 통상적으로 사용될 수 있는 트롬빈(Thrombin), 엔테로키나제(Enterokinase), Factor Xa, 유비퀴틴-특이적 단백질 분해효소(Ubiquitin-specific protease), 푸린(Furin), 유전자 분해효소 I(Genease I) 또는 단백질 분해효소 K(Proteinase K)등을 적용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된 hLIF 재조합 단백질(rhLIF)을 제공한다.
본 발명에서 사용한 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1,2,3, John Wiley & Sons, Inc.(1994)) 등을 참조할 수 있다.
본 발명은 인간 PDIb´a´태그를 이용한 인간 LIF 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법에 관한 것으로서, hPDIb´a´ 도메인과의 태깅을 통해 대장균 내에서 용해도 및 안정도가 증가된 LIF 단백질을 분리, 정제하는 방법에 대한 것이다. 이렇게 얻어진 LIF 단백질은 신경세포의 생존, 회복 및 형성 뿐만 아니라 배아줄기세포의 유지에 있어서 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
도 1은 His8- 및 hPDIb´a´-hLIF 발현벡터의 제작 과정 및 도메인 구조의 모식도를 나타낸다. (a)는 pET28(+)-His8-TEVrs-hLIF 및 p0GWA-hPDIb´a´-TEVrs-hLIF의 벡터 지도를 나타낸다. 대장균 내에서 융합 단백질의 발현은 IPTG 유도 T7 프로모터에 의해 조절되고, His8-hLIF를 위한 선택 마커는 카나마이신(Kan(R))이고, hPDIb´a´-hLIF를 위한 선택 마커는 앰피실린(Amp(R))이다. (b)는 His8-hLIF, hPDI-hLIF 및 hPDIb´a´-hLIF 융합 단백질의 모식도를 나타낸다. 화살표는 TEV 프로테아제(TEV protease)의 절단 위치를 나타낸다.
도 2는 SDS-PAGE를 이용하여 대장균 내에서 3개의 태그들로 융합된 rhLIF의 발현을 분석한 결과이다. 단백질 발현은 0.5 mM IPTG 에 의해 (A) 37℃ 및 (B) 18℃에서 유도되었다. His8, 옥타히스티딘(octahistidine); hPDI, 인간 PDI의 전체길이(full-length), hPDIb´a´, 인간 PDI의 b´a´ 도메인; M, 분자량 사이즈 마커; C, 대조구로서 IPTG 유도 전의 총 세포 단백질; I, IPTG 유도 후의 총 세포 단백질; P, 불용성 세포 펠렛; S, 세포 초음파 처리 후 수용성 상등액.
도 3은 대장균 내에서 rhLIF의 분리에 대한 것이다. 대장균으로부터 발현된 (A) His8-LIF 및 (C) hPDIb´a´-hLIF는 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. lane 5 및 lane 5'는 His8 및 hPDIb´a´가 거의 완전하게 절단되었다는 것을 나타낸다. M, 분자량 마커; lane 1 및 lane 1', 음성대조구로서 IPTG 유도 전 총 세포; lane 2 및 lane 2', IPTG로 처리한 총 세포; lane 3 및 lane 3', 세포 초음파 처리 후 수용성 분획; lane 4, His-trap HP 컬럼을 이용하여 분리한 His8-hLIF 융합 단백질(25 kDa); lane 4', 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리한 hPDIb´a´-hLIF 융합 단백질(55.4 kDa); lane 5, TEV 단백질 분해효소로 절단된 His8 태그: His8 (5 kDa) 및 rhLIF(20 kDa); lane 5', TEV 단백질 분해효소로 절단된 hPDIb´a´ 태그: hPDIb´a´ (35.6 kDa) 및 rhLIF(20 kDa); lane 6 및 lane 6', 최종 분리된 rhLIF. (B) 및 (D) 분리된 rhLIF의 최종 순도를 확인하기 위한 실버 염색된 10% SDS 젤 전기영동을 나타낸다. lane 7, His8 태그를 이용하여 정제된 rhLIF; lane 7', hPDIb´a´ 태그를 이용하여 정제된 rhLIF. (E) 절단 반응 후의 hLIF의 젤 여과 크로마토그램을 나타낸다. TEV 및 hPDIb´a´와 함께 절단된 hLIF는 다른 크기로 뚜렷하게 분리된다.
도 4는 대장균으로부터 분리된 rhLIF의 MALDI-TOF MS 분석결과를 나타낸다. (A) hLIF(181 aa)의 트립신 분해 펩타이드 지도. (B, C) 환원 및 비환원 조건에서 각각 분리된 hLIF의 MALDI-TOF MS 결과.
도 5는 생체 내(in vivo)의 생물학적 활성을 나타낸다. (A) 배아줄기세포에 대조구 LIF와 비교해서 재조합 LIF를 처리한 결과는 콜로니로 잘 자란 것을 확인하였다(왼쪽). 배아줄기세포는 LIF 존재하에 그 표면에서 SSEA-1 발현을 유지한다. 염색되지 않은 배아줄기세포는 background 발현을 하는데 사용되었다. (B) 배아줄기세포 유지와 분화과정을 보여주는 모식도(위쪽그림). 재조합 LIF 존재하에 유지되는 배아줄기세포는 대조구 LIF 존재 하에서와 같이 성공적으로 중배엽 전구체 Flk-1+를 대등하게 증가시켰다.
도 2는 SDS-PAGE를 이용하여 대장균 내에서 3개의 태그들로 융합된 rhLIF의 발현을 분석한 결과이다. 단백질 발현은 0.5 mM IPTG 에 의해 (A) 37℃ 및 (B) 18℃에서 유도되었다. His8, 옥타히스티딘(octahistidine); hPDI, 인간 PDI의 전체길이(full-length), hPDIb´a´, 인간 PDI의 b´a´ 도메인; M, 분자량 사이즈 마커; C, 대조구로서 IPTG 유도 전의 총 세포 단백질; I, IPTG 유도 후의 총 세포 단백질; P, 불용성 세포 펠렛; S, 세포 초음파 처리 후 수용성 상등액.
도 3은 대장균 내에서 rhLIF의 분리에 대한 것이다. 대장균으로부터 발현된 (A) His8-LIF 및 (C) hPDIb´a´-hLIF는 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. lane 5 및 lane 5'는 His8 및 hPDIb´a´가 거의 완전하게 절단되었다는 것을 나타낸다. M, 분자량 마커; lane 1 및 lane 1', 음성대조구로서 IPTG 유도 전 총 세포; lane 2 및 lane 2', IPTG로 처리한 총 세포; lane 3 및 lane 3', 세포 초음파 처리 후 수용성 분획; lane 4, His-trap HP 컬럼을 이용하여 분리한 His8-hLIF 융합 단백질(25 kDa); lane 4', 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리한 hPDIb´a´-hLIF 융합 단백질(55.4 kDa); lane 5, TEV 단백질 분해효소로 절단된 His8 태그: His8 (5 kDa) 및 rhLIF(20 kDa); lane 5', TEV 단백질 분해효소로 절단된 hPDIb´a´ 태그: hPDIb´a´ (35.6 kDa) 및 rhLIF(20 kDa); lane 6 및 lane 6', 최종 분리된 rhLIF. (B) 및 (D) 분리된 rhLIF의 최종 순도를 확인하기 위한 실버 염색된 10% SDS 젤 전기영동을 나타낸다. lane 7, His8 태그를 이용하여 정제된 rhLIF; lane 7', hPDIb´a´ 태그를 이용하여 정제된 rhLIF. (E) 절단 반응 후의 hLIF의 젤 여과 크로마토그램을 나타낸다. TEV 및 hPDIb´a´와 함께 절단된 hLIF는 다른 크기로 뚜렷하게 분리된다.
도 4는 대장균으로부터 분리된 rhLIF의 MALDI-TOF MS 분석결과를 나타낸다. (A) hLIF(181 aa)의 트립신 분해 펩타이드 지도. (B, C) 환원 및 비환원 조건에서 각각 분리된 hLIF의 MALDI-TOF MS 결과.
도 5는 생체 내(in vivo)의 생물학적 활성을 나타낸다. (A) 배아줄기세포에 대조구 LIF와 비교해서 재조합 LIF를 처리한 결과는 콜로니로 잘 자란 것을 확인하였다(왼쪽). 배아줄기세포는 LIF 존재하에 그 표면에서 SSEA-1 발현을 유지한다. 염색되지 않은 배아줄기세포는 background 발현을 하는데 사용되었다. (B) 배아줄기세포 유지와 분화과정을 보여주는 모식도(위쪽그림). 재조합 LIF 존재하에 유지되는 배아줄기세포는 대조구 LIF 존재 하에서와 같이 성공적으로 중배엽 전구체 Flk-1+를 대등하게 증가시켰다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
hLIF
발현벡터의 제작 및 발현
8개의 히스티딘 태그를 포함하는 최종 벡터를 만들기 위해서, 리딩프레임 카세트 A(reading frame cassette A; RfA)를 pET28a(+) 유래 벡터로 서브클로닝 하였다. RfA는 게이트웨이 벡터 전환 키트(Gateway vector conversion kit; Invitrogen, CA, USA)의 한 프레임이고, 이는 ccdB 유전자가 인접해 있는 attR 사이트 및 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하는 평활 말단 카세트(blunt-ended cassette)이다. pET28a(+) 유래 벡터는 Nco I 및 Xho I(Enzynomics, Daejon, Korea)으로 처리되었고, 멍 빈 뉴클레아제(Mung Bean Nuclease; New England Biolabs, Inc., MA, USA)에 의한 단일 가닥 연장(single-stranded extension)으로 제거된 후, RfA는 준비된 벡터에 연결되었다.
성숙(mature) hLIF (NCBI Reference Sequence: NP_002300.1)의 180개 아미노산을 코딩하는 DNA는 유전자 합성 서비스(Bioneer)에 의해 합성되었고, TEVrs 및 attB 사이트는 엔트리 벡터에 삽입되었다. 합성된 DNA는 BP 재조합 클로닝(Invitrogen, CA, USA)에 의해 pDONOR207로 서브클로닝 되었고, 최종 엔트리 벡터는 pENTR-TEVrs-hLIF로 명명하였다. 발현벡터를 얻기 위해서, pENTR-TEVrs-hLIF 내에 있는 hLIF는 LR 재조합(Invitrogen, CA, USA)에 의해 pDEST-His8로 옮겨졌다. His8-TEVrs-hLIF 융합 단백질을 코딩하는 최종 구조체(construct)는 pET28(+)-His8-TEVrs-hLIF로 명명하였고, DNA 염기서열 분석을 통해 확인하였다(Macrogen, Inc., Daejon, Korea). 또한, 추가적으로 LR 재조합 클로닝을 통해 발현 수준을 확인하기 위해서, pENTR-TEVrs-hLIF는 pDEST-hPDI 및 pDEST-hPDIb´a´로 각각 클로닝을 수행하였다(도 1). 다른 태그들을 포함하는 3 개의 발현벡터들이 게이트웨이 프로토콜(Gateway protocol)을 통해 얻어졌다(Genome Res (2000) 10(11): 1788-95). 한편, 하나의 추가적인 글리신 잔기를 가진 hLIF로부터 융합된 hPDIb´a´ 및 His8을 단백질 분해에 의해 절단하기 위해 TEVrs를 삽입하였다.
3 개의 융합된 태그들의 발현 수준을 비교하기 위해서, 3 개의 발현벡터를 컴피턴트(competent) E. coli BL21(DE3) 숙주세포로 각각 형질전환하였다. 형질전환체들을 25ug/ml 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 37℃로 배양하였고, 600nm에서의 광학밀도(OD600)가 0.6에 이르렀을 때, 0.5mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(isopropyl-β-D-thiogalactoside; IPTG)로 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후의 배양 조건은 용해도를 증가시키기 위해서, 37℃에서 4시간 동안 유지하거나 18℃에서 18시간 동안 배양으로 전환하였다. 배양 후, 발현 수준은 10% 트리스-글리신 젤(tris-glycine gel)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
<
실시예
2> 재조합
hLIF
의 분리
1. His8-hLIF의 분리
배양된 세포는 30분 동안 3,500 rpm에서 원심분리하여 수확한 후, 세포 펠렛은 용해 완충액(lysis buffer)(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 M NaCl, 5% 글리세롤 (v/v), 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(Phenylmethylsulfonylfluoride; PMSF))에 10ml/g 비율로 재현탁하였다. 용해물은 세포 파괴를 위해 20회 초음파 처리한 후, 12,000rpm에서 30분 동안 원심분리를 통해 얻어진 상등액에 포함된 수용성 단백질을 분리를 위해 사용하였다.
과발현된 His8-hLIF 융합 단백질은 미리 패킹된 Ni Sepharose 컬럼을 사용하여 우선 고정화 금속 이온 친화 크로마토그래피(immobilized metal ion affinity chromatography; IMAC)에 의해 분리되었다. 결합 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤 (v/v))으로 평형화된 여과된 용해물은 5ml His-trap HP 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하였다. 비특이적으로 결합한 단백질을 제거하기 위하여 컬럼은 8-10 컬럼 부피(column volume; CV)의 세척 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤 (v/v), 150 mM 이미다졸)으로 충분히 씻어낸 후, 단백질 샘플은 6 CV의 용출(elution) 완충액(EBA; 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤 (v/v), 1 M 이미다졸)으로 용출시켰다. 단백질 절단을 위해서, 용출된 His8-hLIF 융합 단백질에 1:1 (w/w)의 비율로 TEV 프로테아제(protease)를 처리하였다. 절단 조건은 30℃에서 1mM DTT 존재 하에서 3시간 동안 처리하였다. 단백질 절단 후에, hLIF는 2차 IMAC를 통해 다시 분리되었는데, 먼저 샘플을 분자량 3,500 Da 이상을 차단할 수 있는 투석막(Viskase Companies, Inc.)을 통과시켰고, 이를 His-trap HP 컬럼에 다시 적용하기 전에, DTT 및 이미다졸(imidazole)을 효과적으로 제거하기 위해서 결합 완충액으로 1:100 (v/v)의 비율로 4℃에서 2시간씩 2 번 투석하였다. 절단된 융합 단백질을 결합 완충액으로 평형화된 5ml His-trap HP 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 2 CV의 결합 완충액으로 씻어냈다. 절단된 hLIF를 2 CV의 용출 완충액 B(EBB; 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 100 mM 이미다졸)으로 용출시킨 후, 절단된 His8-태그 및 TEV 프로테아제는 EBA로 분리하였다. NaCl의 농도를 감소시키고 이미다졸을 제거하기 위해서, 분리된 hLIF 단백질을 포함하는 분획을 최종 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 5% 글리세롤 (v/v))에 투석하였다. 분리 과정 동안 모든 분획은 10% 트리스-트리신 SDS-PAGE 젤(tris-tricine SDS-PAGE gel)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단백질의 농도는 BSA를 사용하여 브래드포드 방법에 의해 측정하였다(Anal Biochem (1976) 72: 248-54).
2. hPDIb´a´-hLIF의 분리
배양된 세포는 상기에 언급한 바와 같이 수확하였고, 그 후 세포 펠렛은 용해 완충액(lysis buffer)(20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 5% 글리세롤 (v/v), 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(Phenylmethylsulfonylfluoride; PMSF), 0.5 mM EDTA)에 10ml/g 비율로 재현탁하였다. 용해물은 His8-LIF와 같이 초음파 처리하였다. 상등액은 Whatman™ 실린지 필터(0.45um, GE Healthcare)를 통하여 여과하였고, 완충액 A(20 mM Tris-HCl, pH 7.0, 5% 글리세롤 (v/v), 0.5 mM EDTA)로 전평형화된 5ml Hi-trap SP 컬럼(GE Healthcare)을 사용하였다. 비특이적으로 결합하는 단백질을 제거하기 위하여, 2 CV의 완충액 A로 씻어냈고, 25-45% 범위를 갖는 10 CV의 완충액 A에 0 - 1 M NaCl의 선형 구배(linear gradient)로 용출하였다. 용출된 분획들은 완충액 B(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5% 글리세롤 (v/v), 0.5 mM EDTA)로 투석한 후, 5ml Hi-trap Q HP 컬럼 (GE Healthcare)에 적용하였는데, 이는 완충액 B로 평형화된 것이다. 컬럼은 2 CV의 완충액 B로 씻어냈고, 45-60% 범위를 갖는 10 CV의 완충액 B에 0 - 1 M NaCl의 선형 구배(linear gradient)로 용출하였다. 10ug의 융합 단백질을 절단하기 위해서, 1ug의 TEV 단백질 분해효소(protease)로 처리하였다. 절단 조건은 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT) 하에 상온에서 밤새도록 처리하였다. 단백질 절단 후에, 센트리콘(centricon)으로 반응 혼합물을 500ul로 농축하였고, 수퍼덱스75(superdex75) 젤 여과 크로마토그래피를 통하여 분리하였다. 이를 완충액 C(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤 (v/v))로 평형화된 HiLoad 26/100 수퍼덱스-75 HR (GE Healthcarae)에 로딩하였다. hPDIb´a´ 태그로부터 분리된 hLIF를 약 75ml의 보존 체적(retention volume)으로 용출하였다. 잔여 TEV 단백질 분해효소(protease)를 제거하기 위해서, 수퍼덱스-75 HR로부터의 용출물을 결합 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤 (v/v))으로 평형화된 5 ml His-trap HP 컬럼 (GE Healthcare)에 로딩하였고, 2 CV의 결합 완충액으로 씻어냈다. 절단된 hLIF를 2 CV의 용출 완충액 C(EBC; 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤, 100 mM 이미다졸)로 용출하였다. 분리된 hLIF 단백질을 포함하는 분획을 최종 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 5% 글리세롤 (v/v))으로 투석하였다. 이는 NaCl의 농도를 감소시키고 이미다졸을 제거하기 위한 것으로, His8 태그된 hLIF의 분리와 같다. 분리 과정 동안의 모든 분획은 10% 트리스-트리신 SDS-PAGE 젤(tris-tricine SDS-PAGE gel)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
3. 전기영동 및 실버 염색
단백질들은 SDS-PAGE 젤에서 분리되었다(Nature (1970) 227(5259): 680-5). 단백질 샘플은 100 mM DTT가 포함된 샘플 완충액에서 100℃에서 10분 동안 변성되었다. 샘플들은 10% 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 젤에 로딩되었다. 단백질 밴드들은 쿠마시 브릴런트 블루 R-250(Coomassie brilliant blue R-250; AMRESCO LLC, OH, USA) 염색에 의해 확인되었고, ImageJ program (http://imagej.nih.gov/ij)에 의해 분석되었다. 최종적으로 분리된 hLIF는 염색하였고, 제조사의 지시에 따라 Silver Stain Plus® kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA)에 의해 확인하였다.
밴드들이 명확하게 보이면, 상기 반응을 5% (v/v) 아세트산으로 15분 동안 처리하여 정지시켰다. 젤들은 충분한 물로 씻어냈고, 보존을 위하여 5% (v/v) 글리세롤 및 0.02% (w/v) 소듐 아지드(sodium azide) 수용액으로 밤새도록 처리하였다.
4. 결과
여러 융합 태그들의 발현 수준을 비교하기 위해서, 상기에 언급한 바와 같이 3 개의 발현 벡터를 LR 조합에 의해 얻었다. 도 1B는 His8-, hPDI- 및 hPDIb´a´-hLIF의 모식도를 나타낸다. hPDI-hLIF는 37℃에서는 수용성이었으나, 발현 수준이 매우 낮았다(표 1). His8-hLIF 및 hPDIb´a´-hLIF 융합 단백질은 37℃에서는 거의 수용성 형태로 발현되지 않았다(도 2A). 하지만, IPTG가 존재하는 18℃에서는 각각 25 kDa, 79.7 kDa 및 55.5 kDa에서 수용성 형태로서 유도되었다(표 1 및 도 2B). 18℃에서 His8-, hPDI- 및 hPDIb´a´-hLIF의 용해도는 각각 80.1%, 95.4% 및 99.5%이었다(표 1).
| 태그 크기 (kDa) | 융합 단백질 크기(kDa) | 발현 수준 (%) | 용해도(%) | ||||
| 37 o C | 18 o C | 37 o C | 18 o C | ||||
|
hLIF
(19.8 kDa ) |
His8 - 1 | 5.2 | 25.0 | 30.9 | 51.9 | 22.0 | 80.1 |
| hPDI - | 59.8 | 79.6 | 12.0 | 78.3 | 97.0 | 95.4 | |
| hPDIb'a' - | 35.6 | 55.4 | 66.2 | 80.2 | 41.8 | 99.5 | |
1 TEVrs 포함.
His8-hLIF는 단지 금속 이온 친화 크로마토그래피를 사용해서만 분리되었다(도 3A). 과발현된 His8-TEVrs-hLIF 융합 단백질은 우선 His-trap HP 컬럼을 통해 분리되었고, TEV 단백질 분해효소로 절단되었다. TEV 단백질 분해효소에 의한 His8/LIF의 비특이적 절단은 검출되지 않았다. 절단 반응으로부터 20 kDa의 hLIF 및 5 kDa의 His8 태그를 얻었다. 클로닝을 위해 사용된 게이트웨이 방법으로 인해, 추가 아미노산이 His8과 함께 포함되었다. 그리고 그 후, hLIF, His8 및 TEV 단백질 분해효소의 혼합물은 2 번째 His-trap HP 컬럼에 의해 분리되었다. 1 L 배양으로부터 투석 후에 1.8 mg의 순수한 hLIF가 얻어졌다(도 3A, lane 6).
His8-hLIF는 초반에 hLIF의 발현 및 분리를 위해서 선택되었는데, 이는 His8 태그가 비록 발현 수준은 다른 구조체들보다 낮지만, 18℃에서 발현시킨 수용성 hLIF들 중 가장 작고, 분리하기 쉽기 때문이다. 하지만, 첫 번째 단계의 His-trap HP 컬럼을 사용한 후, 샘플 순도를 증가시키기 위한 두 번째 이온 교환 컬럼에 있어서, 본 발명자들은 완충액에 있는 염 농도를 감소시키려는 시도를 했는데, 대부분의 융합 단백질은 침전되었다. 단백질 침전을 최소화할 수 있는 이온 교환 컬럼을 위한 모든 종류의 완충액을 탐색하였으나, 적절한 완충액 조건을 찾는 것은 어려웠다.
hPDIb´a´ 태그는 hPDI 보다 작고, hPDIb´a´-hLIF의 발현 수준 및 용해도가 가장 높기 때문에, 분리 과정 동안 hPDIb´a´-hLIF가 hLIF의 용해도 비교를 위해 선택되었다. 따라서 His8 또는 hPDIb´a´ 태그된 hLIF의 용해도를 비교하였다. TEV 단백질 분해효소에 의한 hPDIb´a´의 절단과 함께 SP sepharose 및 Q sepharose를 조합하여 hLIF는 대장균 배양액으로부터 분리되었고, 젤 여과를 통하여 절단된 태그 및 TEV 단백질 분해효소로부터 분리되었다(도 3D). 약 1.3mg의 굉장히 순수한 재조합 hLIF를 1L 배양으로부터 얻었다(도 3B, lane 6). hLIF의 최종 순도를 확인하기 위해서, 최종적으로 분리된 hLIF를 실버 염색 방법으로 염색하였고 다른 불순물은 없었다(도 3C, lane 7).
다양한 시간 포인트, 온도 및 염 농도에 따라 각각의 수용성 hLIF를 정량한 실험에 기초하여, His8 및 hPDIb´a´로부터 최종적으로 분리된 hLIF 사이의 용해도는 비슷했다. 하지만, 융합 단백질의 경우, 최종 수용성 hPDIb´a´-hLIF는 91%인데 비해 염 농도를 줄인 His8-hLIF는 단지 6%에 불과했다.
<
실시예
3>
MALDI
-
TOF
MS
분석에 의한 재조합 융합 단백질의 확인
분리된 재조합 결합 단백질의 확인을 위하여, 샘플을 10% TCA로 침전시킨 후, 침전된 샘플을 50mM 이오도아세트아미드(iodoacetamide; IAA)가 포함된 IA 완충액(0.5 M Tris-HCl, pH 8.0, 5% 글리세롤 (v/v), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 % SDS)에 현탁하였고, 상온에서 30분 동안 유지하였다. 샘플을 14.4% SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 재조합 융합 단백질과 연관된 밴드를 자른 후에, 트립신으로 처리하였다. Voyager-DE™ STR을 이용하여 MALDI-TOF MS을 수행하였다. Data Explorer TM 소프트웨어(Applied Biosystems, Framingham, MA)를 사용하여 결과를 분석하였다. 그 후, 얻어진 펩타이드 질량을 Mascot peptide mass fingerprinting search program(Matrix Science, Boston; MA)으로 NCBI 데이타베이스에서 검색하였다(Nature 440(7082) (2006) 363-7).
분리된 rhLIF를 확인하기 위해서, MALDI-TOF MS 분석을 환원 및 비환원 조건에서 수행하였다. 분리된 rhLIF의 MALDI-TOF MS 분석 결과는 대부분의 트립신 분해 펩타이드 질량이 rhLIF와 관련된 것으로 관측되었다(도 4). 또한, rhLIF의 6개 시스테인 잔기가 비환원 조건에서 내부 이황화 결합의 형성에 관여한다는 것을 확인하였다(도 4C). 이는 rhLIF의 6개 시스테인 잔기 모두가 3개의 내부 이황화 결합을 형성한다는 것을 의미한다.
<
실시예
4>
rhLIF
의 활성 측정
1. rhLIF의 내독소 측정
잔여 내독소(endotoxin)의 양은 정량시험인 Endpoint Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Test (Lonza, Basel, Swizerland)를 통하여 측정하였다. 10ug/ml 샘플 또는 내독소 표준용액(1.0, 0.5, 0.25, 0.1 EU/ml) 중 50ul를 미리 따뜻하게 해 둔 37℃의 내독소(endotoxin)가 없는 마이크로플레이트 웰에 나누어 담았다. 각각의 웰에는 생물학적 내독소 시험(limulus amebocyte lysate; LAL) 시약 50ul를 첨가하였다. 웰들은 37℃에서 10분 동안 유지되었다. 그 후, 미리 따뜻하게 해 둔 100ul의 발색 기질(chromogenic substrate) 용액을 각각의 웰에 첨가하였고, 37℃에서 6분 동안 유지하였다. 그리고 나서 100ul의 정지 시약(25% (v/v) 아세트산)을 첨가하고, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 405nm에서 분석하였다. 흡광도 분석 후에, 표준용액을 통해 얻어진 표준곡선을 이용하여 내독소(endotoxin) 단위를 계산하였다.
2. 배아줄기세포 수확과 Flk1+ 세포 유도
E14tg2a 배아줄기세포 라인이 0.1% 젤라틴이 코팅된 판에서 상업적 대조구 LIF 혹은 재조합 LIF가 포함된 GMEM 유지 배양액에 1x103 cell/cm2의 밀도로 수확되었다. 배양액은 매일 바꿔주었다. Flk1+ 세포 유도를 위해, 배아줄기세포가 0.1% 젤라틴이 코팅된 판에서 LIF 추가 없이 2x103 cell/cm2의 밀도로 펼쳐졌다. 배양액은 이틀에 한번씩 바꿔주었다. 4.5일 후에 Flk1+ 세포 세대가 항-마우스 Flk1 항체(eBioscience)로 분석되었다.
3. 유동 세포 분석
세포들은 분리 완충액 (Invitrogen)과 함께 수확되었고 HBSS/2% FBS 100ul 당 2x106 세포가 재현탁 되었다. 세포들은 항-마우스 SSEA-1 (Abcam)이나 비오틴이 결합된 항-마우스 Flk1 (eBioscience)에서 10분간 배양되었다. HBSS/2% FBS로 두 번 세척된 후, 세포들은 PE 결합된 스트렙타비딘(streptavidin; eBioscience)이나 FITC 결합된 항-마우스 IgM 항체와 배양되었다. FACS Aria II (Beckton Dickinson)으로 분석되었고, 죽은 세포들은 7-AAD (Invitrogen)에 의해 배제되었다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star Inc.)로 분석되었다.
4. 결과
분리된 His8-hLIF의 생물학적 활성을 확인하기 위해서, FACS 배양물로 실험하였다(도 5). 그 결과, 분리된 재조합 hLIF는 상업적으로 판매하는 hLIF와 생물학적 활성이 유사한 것으로 나타났다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation
<120> Expression and purification method of biologically active human
LIF with human PDIb'a' tag in Escherichia coli
<130> DP-2012-0461
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 540
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
agtcctctgc cgatcacacc tgtgaatgcc acatgcgcaa tccgtcatcc ttgccacaat 60
aatctgatga atcagatccg ttcacagctc gcgcagctga atggatcagc taacgcactt 120
tttattctgt attataccgc acagggagag ccatttccga acaacctgga taaattgtgt 180
ggcccgaacg taactgattt tccgccattc catgctaatg ggacggaaaa ggccaagctg 240
gttgaactgt atcgtattgt tgtttacctg ggcacctctc tgggcaacat tactcgcgat 300
cagaaaattc tgaatccgag cgcactgagt ctccactcta aactgaacgc cacagctgac 360
atattacggg gtttactgag caatgtgttg tgtcgcctgt gttcgaaata tcatgtaggt 420
cacgtggatg tcacctacgg gcccgacacg tccggtaaag atgtctttca aaaaaaaaaa 480
ttgggctgcc aactgctggg caagtataaa cagataattg cggttctggc ccaggcgttc 540
540
<210> 2
<211> 1461
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gacgcaccgg aagaagagga tcatgtcctg gttctgcgca aaagcaactt cgcggaagca 60
ctggccgcac ataaatatct gctggtggaa ttttatgctc cttggtgcgg tcattgcaaa 120
gccctggccc cggagtacgc caaagccgca ggtaaactga aagctgaagg tagcgaaatc 180
cgcctggcaa aggttgatgc tacggaagag agtgacctgg cgcagcagta tggtgtccgc 240
ggctatccta caattaaatt cttccgtaac ggtgataccg catctccaaa agaatatacc 300
gctggtcgcg aggcggacga tattgttaac tggctgaaga aacgcactgg ccctgccgca 360
accaccctgc ctgatggcgc tgctgccgaa agcctggtcg aaagtagcga agttgccgtc 420
attggtttct ttaaggatgt agaatctgac agtgccaaac agtttctgca agcggcagag 480
gctatcgatg acatcccgtt cggcatcacc tctaacagtg acgtattcag taaataccaa 540
ctggataaag acggcgttgt gctgttcaag aaatttgatg aaggtcgcaa caactttgag 600
ggtgaggtga ccaaggagaa cctgctggat tttattaagc acaaccaact gccgctggtt 660
attgaattta cagaacaaac ggcgccgaaa attttcggcg gtgagattaa aacacatatc 720
ctgctgtttc tgccgaagag cgtttctgat tacgatggta aactgagtaa ttttaaaacc 780
gccgcagaat ctttcaaagg taagattctg ttcattttca ttgatagcga ccacacggac 840
aatcagcgta tcctggagtt ctttggtctg aagaaagagg aatgcccggc tgtgcgtctg 900
attacgctgg aagaggaaat gacaaagtac aagccggaga gcgaggaact gactgcagaa 960
cgtatcaccg aattttgtca tcgtttcctg gaggggaaga ttaagccgca tctgatgagc 1020
caggaactgc cggaggattg ggacaaacag ccagtgaaag ttctggtggg gaagaatttt 1080
gaagatgtgg ccttcgatga gaagaagaat gtgtttgtgg agttctacgc cccgtggtgt 1140
gggcactgta aacagctggc gccgatctgg gacaaactgg gcgaaacgta taaagatcac 1200
gaaaatattg tgatcgcgaa aatggattct accgcgaatg aagtagaagc ggtaaaagta 1260
cactcttttc cgacgctgaa attctttcca gcgagcgcgg atcgtactgt cattgattat 1320
aatggcgaac gtactctgga cggctttaag aaatttctgg aaagcggcgg ccaggatggc 1380
gcgggcgatg atgatgacct ggaagacctg gaagaagcgg aggaaccaga catggaggag 1440
gatgacgacc agaaagcggt c 1461
<210> 3
<211> 801
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
attgaattta cagaacaaac ggcgccgaaa attttcggcg gtgagattaa aacacatatc 60
ctgctgtttc tgccgaagag cgtttctgat tacgatggta aactgagtaa ttttaaaacc 120
gccgcagaat ctttcaaagg taagattctg ttcattttca ttgatagcga ccacacggac 180
aatcagcgta tcctggagtt ctttggtctg aagaaagagg aatgcccggc tgtgcgtctg 240
attacgctgg aagaggaaat gacaaagtac aagccggaga gcgaggaact gactgcagaa 300
cgtatcaccg aattttgtca tcgtttcctg gaggggaaga ttaagccgca tctgatgagc 360
caggaactgc cggaggattg ggacaaacag ccagtgaaag ttctggtggg gaagaatttt 420
gaagatgtgg ccttcgatga gaagaagaat gtgtttgtgg agttctacgc cccgtggtgt 480
gggcactgta aacagctggc gccgatctgg gacaaactgg gcgaaacgta taaagatcac 540
gaaaatattg tgatcgcgaa aatggattct accgcgaatg aagtagaagc ggtaaaagta 600
cactcttttc cgacgctgaa attctttcca gcgagcgcgg atcgtactgt cattgattat 660
aatggcgaac gtactctgga cggctttaag aaatttctgg aaagcggcgg ccaggatggc 720
gcgggcgatg atgatgacct ggaagacctg gaagaagcgg aggaaccaga catggaggag 780
gatgacgacc agaaagcggt c 801
Claims (9)
- 인간 단백질 이황화물 이성질화효소(human protein disulfide isomerase; hPDI)를 코딩하는 유전자 또는 hPDIb´a´ 도메인 유전자 중 어느 하나의 유전자; 및 인간 백혈병 억제 인자(human Leukemia inhibitory factor; hLIF) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제 1 항에 있어서, 상기 hLIF 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1 항에 있어서, 상기 hPDI 유전자는 서열번호 2이고, 상기 hPDIb´a´ 도메인 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 도 1A(ii)의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 1 항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제 6 항에 있어서, 상기 대장균은 BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제 5 항에 따른 재조합 미생물을 배지에서 배양하여 hPDI 태그- 또는 hPDIb´a´ 도메인 태그-hLIF 재조합 단백질을 발현시키는 단계;
담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus; TEV) 단백질 분해효소(protease)를 처리하여 상기 hPDI 태그 또는 hPDIb´a´ 도메인 태그를 제거하는 단계; 및
상기 hPDI 태그 또는 hPDIb´a´ 도메인 태그가 제거된 hLIF 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 hLIF 재조합 단백질(rhLIF) 생산방법. - 제 8 항에 따른 생산방법에 의해 생산된 hLIF 재조합 단백질(rhLIF).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120092392A KR101434739B1 (ko) | 2012-08-23 | 2012-08-23 | 인간 ＰＤＩｂ´ａ´태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 ＬＩＦ 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120092392A KR101434739B1 (ko) | 2012-08-23 | 2012-08-23 | 인간 ＰＤＩｂ´ａ´태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 ＬＩＦ 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140026781A true KR20140026781A (ko) | 2014-03-06 |
| KR101434739B1 KR101434739B1 (ko) | 2014-09-01 |
Family
ID=50641176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020120092392A Active KR101434739B1 (ko) | 2012-08-23 | 2012-08-23 | 인간 ＰＤＩｂ´ａ´태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 ＬＩＦ 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101434739B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020204601A1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-10-08 | 한국세라믹기술원 | Csq-태그를 이용한 단백질의 발현 및 정제 방법 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT87133B (pt) * | 1987-04-02 | 1992-07-31 | Amrad Corp Ltd | Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif |
| WO2007049829A1 (en) * | 2005-10-24 | 2007-05-03 | Vexxon, Inc. | Method for preparing soluble and active recombinant proteins using pdi as a fusion partner |
-
2012
- 2012-08-23 KR KR1020120092392A patent/KR101434739B1/ko active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020204601A1 (ko) | 2019-04-05 | 2020-10-08 | 한국세라믹기술원 | Csq-태그를 이용한 단백질의 발현 및 정제 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101434739B1 (ko) | 2014-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11492650B2 (en) | Production of seleno-biologics in genomically recoded organisms | |
| EP1220933B1 (en) | Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes | |
| JP2022544277A (ja) | カスパーゼ－２バリアント | |
| CN104974994A (zh) | 一种用于n-糖蛋白去糖基化的糖苷酶及其应用 | |
| US20080233614A1 (en) | Production of recombinant collagenases colg and colh in escherichia coli | |
| EP3330282A1 (en) | Cipa, cipb and pixa as scaffolds to organize proteins into crystalline inclusions | |
| KR101434739B1 (ko) | 인간 ＰＤＩｂ´ａ´태그를 이용한 생물학적 활성을 가진 인간 ＬＩＦ 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법 | |
| CN101970469B (zh) | 外源蛋白或肽的制备方法 | |
| JP2016518855A (ja) | 融合プロテアーゼ | |
| CN109136209B (zh) | 肠激酶轻链突变体及其应用 | |
| KR102060881B1 (ko) | 재조합 인간 혈청 알부민의 수용성 과발현 및 정제 방법 | |
| CN112029741B (zh) | 银杏中生长素n糖基转移酶蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN108486142A (zh) | 一种表达异戊烯基转移酶ComQ的基因工程菌的构建方法及应用 | |
| KR20210079235A (ko) | Whep 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법 | |
| KR101434734B1 (ko) | 인간 ＰＤＩｂ´ａ´도메인을 이용한 인간 ＦＧＦ２ 재조합 단백질의 대장균 내 발현 및 정제방법 | |
| CN102250938A (zh) | 一种海葵强心肽的制备方法 | |
| Schmidt et al. | Purification of the M flax‐rust resistance protein expressed in Pichia pastoris | |
| KR100677828B1 (ko) | ＯｍｐＦ와 목적단백질의 동시 발현을 통한 목적 단백질의세포외 분비·생산 방법 | |
| WO2016153150A1 (ko) | 다중 이황화 결합 펩티드의 재조합 발현 시스템 개발 | |
| KR101717238B1 (ko) | 크로타민 단백질을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 크로타민 단백질의 생산방법 | |
| KR101814048B1 (ko) | 대량 생산이 가능하도록 개선된 경구투여용 트롬보포이에틴 및 이의 대량 생산공정 | |
| CN102108344A (zh) | 那西肽耐药型核糖体rna甲基转移酶、其制备方法及应用 | |
| Ma et al. | High‐Level Expression and Purification of Tag‐free Peptides Containing Multiple Disulfide Bond in Pichia pastoris | |
| WO2025077918A1 (zh) | 一种重组多肽以及制备神经毒素的方法 | |
| WO2024231419A1 (en) | New high expression and high activity n-glycosidases, methods of production and applications thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20120823 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20140122 Patent event code: PE09021S01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20140717 |
|
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20140820 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20140820 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170928 Year of fee payment: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20170928 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180726 Year of fee payment: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20180726 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200304 Year of fee payment: 6 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20200304 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| R401 | Registration of restoration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20200803 Start annual number: 7 End annual number: 7 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20210819 Start annual number: 8 End annual number: 8 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20220801 Start annual number: 9 End annual number: 9 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20230807 Start annual number: 10 End annual number: 10 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240812 Start annual number: 11 End annual number: 11 |