CN101970469B - 外源蛋白或肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白的方法，包括培养保藏于NCIMB的保藏号为41533的嗜碱芽孢杆菌BhFD05(Δhag、ΔfliD、ΔwprA、Δalp、Δapr、Δvpr、Δasp)菌株。使该菌株表达并分泌高水平的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白于细胞外培养基中。所述基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白包括外源肽(i)框内插入到鞭毛蛋白可变区，外源肽的N-端一侧侧接于鞭毛多肽的N-端片段，或者外源肽的C-端一侧侧接于鞭毛多肽的C-端片段，或(ii)融合到鞭毛多肽的C-端。

Description

外源蛋白或肽的制备方法
技术领域
本发明涉及通过革兰氏阳性菌宿主细胞制备外源蛋白或肽。
背景技术
PCT国际申请PCT/IB2005/054022(国际申请号WO2006/072845)描述了重组革兰氏阳性菌株(嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)Alk36)，与其它革兰氏阳性菌株相比，其具有过量产生鞭毛蛋白(FliC)的能力。该重组菌株在重组菌株的表面产生高水平稳定和可溶的重组鞭毛蛋白。为了达到此目的，对重组菌株进行基因修饰以利于嵌合多肽的表达，该嵌合多肽包括鞭毛蛋白单体以及插入到其可变区的选择肽。基因修饰包括(i)使染色体上用于编码功能性鞭毛蛋白的hag基因失活；(ii)使细胞壁蛋白酶wprA失活；以及(iii)用含有编码框内鞭毛多肽融合蛋白基因的多拷贝载体转化重组菌株。
发明内容
本发明人利用改性鞭毛III型分泌系统开发出一种制备治疗肽的方法，通过所述系统，由修饰的嗜碱芽孢杆菌Alk36菌株(NCIMB41533)将治疗肽输出到培养基中。
修饰包括通过干扰使鞭毛基因(hag基因)失活，阻止功能性鞭毛蛋白的表达。干扰可以是通过将内源基因替换为不编码肽或编码非功能性鞭毛多肽的DNA序列来实施。在这种情况下，非功能性鞭毛多肽为缺少SEQ ID NO：1所示的氨基酸14-226的缺失突变体。干扰hag基因详述于PCT国际申请PCT/IB2005/054022(国际申请号WO2006/072845)，该申请以参阅的方式全文并入于此。
除了通过PCT国际申请PCT/IB2005/054022(国际申请号WO 2006/072845)公开的基因修饰之外，通过使编码鞭毛帽蛋白的fliD基因靶向失活，改变嗜碱芽孢杆菌(Δhag)菌株的基因组可以获得嵌合鞭毛蛋白单体的输出。帽蛋白有助于鞭毛蛋白单体聚合形成鞭毛丝。帽蛋白包括位于鞭毛丝尖端的5 FliD亚基并需要处在适当的位置以使鞭毛蛋白发生聚合。fliD基因的失活导致未聚合的嵌合鞭毛蛋白单体分泌至细胞外介质。在这种情况下，非功能性FliD多肽如SEQ ID NO：2所示。
选择与文献所述由枯草芽胞杆菌中鉴定的关键蛋白酶同源的蛋白酶基因用于基因靶向失活。该序列是通过进入日本DNA数据库(DDBJ；http://gib.genes.nig.ac.jp)检索嗜碱芽孢杆菌C-125基因组鉴定得到的。这些序列包括wprA(BH2080)、alp(BH0684)、vpr(BH0831)、apr(BH0696)、asp(BH0855)和aprX(BH 1930)基因。
为了改善嗜碱芽孢杆菌Alk36的分泌能力，可通过靶向灭活这些关键蛋白酶基因对其基因组进行进一步改造。所得菌株嗜碱芽孢杆菌Alk36(Δhag、ΔfIiD、ΔwprA、ΔaIp、Δapr、Δvpr、Δasp)，称为BhFD05，用含有与N-端鞭毛蛋白区或C-端鞭毛蛋白区相连的融合多肽，或位于鞭毛蛋白可变区，与N-端和C-端区均相连的融合多肽的表达载体转化。
因此，本发明一方面提供一种制备基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白的方法，该方法包括： 
培养保藏于NCIMB的保藏号为41533的嗜碱芽孢杆菌BhFD05，和
使该菌株表达并分泌基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白于细胞外培养基，
其中，所述基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白包括外源肽(i)框内插入到鞭毛蛋白可变区，外源肽的N-端一侧侧接于鞭毛多肽的N-端片段，或者外源肽的C-端一侧侧接于鞭毛多肽的C-端片段，或(ii)融合到鞭毛多肽的C-端。
嗜碱芽孢杆菌鞭毛蛋白的N-端、C-端和可变区描述于PCT国际申请PCT/IB2005/054022(国际申请号WO 2006/072845)。
嗜碱芽孢杆菌BhFD05于2007年12月17日以保藏号NCIMB41533保藏于NCIMB Ltd(Furguson Building，CraibstoreEstate，Buchsburn，Aberdeen AB210YA)。
含有嵌合蛋白的培养基可作为粗品使用。该粗品可为无细胞粗品。
所述方法包括将嵌合蛋白从培养基中部分或全部纯化出来。
本发明的另一方面提供了一种由第一方面的方法制备得到的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其包括外源肽(i)框内插入到鞭毛蛋白可变区，外源肽的N-端一侧侧接于鞭毛多肽的N-端片段，或者外源肽的C-端一侧侧接于鞭毛多肽的C-端片段，或(ii)融合到鞭毛多肽的C-端。
所述外源肽可只融合到鞭毛多肽的N-端片段。
或者，所述外源肽可只融合到全长鞭毛多肽的C-端。
基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白可替代性地，或者还包括融合到外源肽N-端的多肽标签。这种标签可用于分离嵌合蛋白。该标签还可在蛋白质印迹分析中用作特异性目标。这种标签可以是已知标签，例如FLAG-标签、HIS-标签等等。也可将不止一个标签副本融合到外源肽的N-端。
基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白可替代性地，或者还包括与外缘区，即外源肽的至少一侧相邻，或相连的切割位点。可提供与外源区的两侧均相邻的切割位点，即，切割位点可侧接于外源区。切割位点可为已知的切割位点，例如可被化学试剂例如溴化氰识别的甲硫氨酸切割位点。
外源肽(或多肽)可为治疗肽，其可选自由抗菌肽、抗病毒肽和免疫原性肽组成的组。
当外源肽为抗菌肽时，可以是一种阳离子肽。这种阳离子肽可以是抑菌素(Indolicidin)。
当外源肽为抗逆转录病毒肽时，可为以商品名“Fuzeon”市售的“恩夫韦地(Enfuvirtide)”。它可以由“西夫韦肽(Sifuvirtide)”替代，西夫韦肽被当作Fuzeon的有潜力的改善剂。
当外源肽为免疫原性肽时，可以是HIV抗原肽。该HIV肽可为所有的HIV-1亚型CV3南非分离物的可变区的共有序列。
表达的外源肽的大小介于12-75个氨基酸之间。标签纯化后从不同构建体获得的产物介于2-20mg/L。
本发明进一步延伸到本发明第二方面的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白在用于制备治疗用途的药物中的应用。
本发明的第三方面提供了编码本发明第二方面的嵌合蛋白的核酸，该核酸包括编码(i)鞭毛多肽的N-端片段；鞭毛多肽的可变区；或者，鞭毛多肽的C-端片段的核苷酸序列，和编码框内插入到编码鞭毛多肽的可变区的核苷酸序列的外源肽的核苷酸序列，或编码(ii)融合到鞭毛多肽C-端的外源多肽或治疗肽的核苷酸序列。
核酸可包括编码鞭毛多肽的N-端片段的核苷酸序列，该鞭毛多肽的C-末端与编码外源肽的核苷酸序列框内相连。
编码外源肽的核苷酸序列可在位于SEQ ID NO：3所示核苷酸162至核苷酸606间的任何核苷酸之后邻接插入。 
编码外源肽的核苷酸序列可如框内融合一样，在SEQ ID NO：3所示核苷酸816之后邻接插入。
本发明的第四方面提供了包括编码本发明第二方面的嵌合蛋白的核酸序列的表达盒。
编码嵌合蛋白的核酸序列可被整合到宿主细胞的染色体内。
本发明的第五方面提供了一种包括编码本发明第二方面的嵌合蛋白的核酸序列的核酸载体，其可操作地与转录调控因子(TRE)连 接。
核酸载体可以是外染色体质粒。
本发明的第六方面提供了一种含有本发明第五方面的核酸载体的细菌细胞。
细菌细胞可为革兰氏阳性细菌细胞，如芽孢杆菌属的细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)菌种的细胞。这些细胞可为保藏于NCIMB的保藏号为41533的菌株嗜碱芽孢杆菌BhFD05(Δhag、ΔfIiD、ΔwprA、Δalp、Δapr、Δvpr、Δasp)的细胞。
术语“多肽”和“蛋白”可互换使用，表示任何肽键连接的氨基酸链，不论长度或翻译后修饰。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语与本领域技术人员常规理解的意思一致。如有冲突，以本发明文件包括的定义为准。尽管与本发明类似或等同的方法和材料可在实践或实验中应用，优选的方法和材料描述如下。本文提及的所有出版物、专利申请和其它参考文献以参阅的方式全文并入与此。本文公开的材料、方法和实例仅用于说明，并不用于限制本发明的范围。 
下面将结合非限制性实施例、序列表和附图对本发明特征作进一步的说明。
附图说明
图1：pSEC194(5.498kb)的质粒图。分别为用于在芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的温度敏感的ori(pE194)和ColE1 ori。限制性内切酶位点(粗体)，用于克隆。由DNAMAN，Version 4.1创建的质粒图；
图2A：来自于不同的缺陷蛋白酶的嗜碱芽孢杆菌菌株的细胞外样本的SDS-PAGE比较示意图，嗜碱芽孢杆菌菌株在pH8.5下，在对数生长期(泳道1-5，OD6oo 1.6)和静止期(泳道6-10，OD600 5)分泌HIV抗原融合蛋白。泳道1和6，菌株BhFD01；泳道2和7，菌 株BhFD02；泳道3和8，BhFD03；泳道4和9，BhFD04；泳道5和10，BhFD05和泳道11，分子量标记物(Fermentas)。箭头表示HIV抗原融合肽；
图2B：利用抗-FLAG抗体针对携带HIV抗原肽的嵌合鞭毛蛋白进行的蛋白质印迹分析。箭头表示FLAG HIV抗原融合肽；
图3A：层析之后，对嗜碱芽孢杆菌菌株BhFD05中的嵌合鞭毛蛋白的胞外蛋白片段的SDS PAGE凝胶分析。泳道1，分子量标记物(Fermentas)；泳道2，pSECNHIVC7 FLAG-亲和洗脱液。箭头表示鞭毛蛋白-HIV抗原融合蛋白；
图3B：利用MEIV3b 4抗体进行的3A的蛋白质印迹分析。泳道1，低分子量标记物(Biorad)；泳道2，pSECNC7(阴性对照)和泳道3，pSECNHIVC7。箭头表示鞭毛蛋白-HIV抗原融合蛋白；
图4A：FLAG-亲和层析后，对嗜碱芽孢杆菌菌株BhFD05中携带FLAG-标签的嵌合鞭毛蛋白的胞外蛋白片段的SDS PAGE凝胶分析。泳道1，低分子量梯度(Fermentas)；泳道2，pSECNFFuzC7和泳道3，pSECNF2SifC7。箭头表示FuzeonTM和西夫韦肽鞭毛融合蛋白；
图4B：使用抗-FLAG抗体针对由嗜碱芽孢杆菌BhFD05的嵌合鞭毛蛋白表达盒中得到的细胞外蛋白进行蛋白质印迹分析。泳道1，低分子量标记物；泳道2，pSECNF2SifC7；和泳道3，pSECNFFuzC7。箭头表示FuzeonTM和西夫韦肽鞭毛融合蛋白；
图5：确证Fuzeon表达及完整性的基于质谱(MS)的数据。(A)嵌合鞭毛基因产物pSECNFFuzC7的酶切报告及鉴别的肽。相关肽FuzeonTM的序列标示了下划线。(B)质量为2606.240的MS/MS谱，证实了FuzeonTM肽的N-端区域GGVDMYTSLIHSLIEESQNQQEK的存在。(C)质量为1109.51的MS/MS谱，证实了Fuzeon肽的C-端区域WASLWNWF的存在。(D)质量为1230.62的MS/MS谱，证实 了FuzeonTM肽的片段NEQELLELDK的存在；
图6A：FLAG-亲和层析后，对嗜碱芽孢杆菌菌株BhFD05中携带FLAG-标签的嵌合鞭毛蛋白的胞外蛋白片段的SDS PAGE凝胶分析。泳道1，低分子量梯度；泳道2，pSECNFINDC7。箭头表示抗菌素鞭毛融合蛋白；
图6B：携带pSECNFINDC7 FLAG-标签的嵌合鞭毛蛋白的蛋白质印迹分析。泳道1，分子量标记物(Fermentas)；泳道2，pSECNFINDC7 FLAG-亲和洗脱液。箭头表示抗菌素鞭毛融合蛋白；
图7：确证抗菌素表达及完整性的基于质谱(MS)的数据。(A)嵌合鞭毛基因产物pSECNFINDC7的酶切报告及鉴别的肽。相关肽抗菌素的序列标示了下划线。(B)质量为1115.59Da的MS/MS谱，证实了抗菌素肽的N-端区域(GGVDMILPWK，aa 195-204)的存在。(C)质量为1703.79Da的MS/MS谱，涉及抗菌素肽的N-端部分，通过K194后的缺失酶切产生的DDDDKGGVDMILPWK(aa 190-204)，包含图8A所示的酶切报告中未得到清楚证明的两个胰蛋白酶肽。(D)质量为1113.542的MS/MS谱，证实壳聚糖肽WPWWPWR的存在；
图8：显示菌株BhFD05(pSECNF2Sif)OD600 4.0的细胞外上清液的FLAG-标签纯化的SDS-PAGE凝胶图谱。泳道1，分子量标记物(Fermentas)；泳道2，FLAG-亲和洗脱液；箭头表示NF2Sif肽；
图9：确证嵌合鞭毛基因产物pSECNF2Sif，西夫韦肽的基于质谱(MS)的数据。MS/MS谱证实了组成西夫韦肽C-末端的重叠肽序列，质量为1772.8372Da的ILEESQEQQDRNER(A)，质量为2243.0657Da的ILEESQEQQDRNERDLLE(B)的存在；
图10：显示菌株BhFD05(pSECNF2Sif)OD600 4.0的细胞外上清液的FLAG-标签纯化的SDS-PAGE凝胶图谱。泳道1，分子量标记物(Fermentas)；泳道2，粗样品和泳道3FLAG-标签洗脱液；箭头表示NCF2Sif肽；和
图11：确证嵌合鞭毛基因产物pSECNCF2Sif，西夫韦肽的基于质谱(MS)的数据。MS/MS谱证实了质量为3938.6768Da的抗病毒肽的N-端区域，LEESGADYKDDDDKGGVDMSWETWEREIENYTR(A)，以及质量为2243.0669Da的C-端区域ILEESQEQQDRNERDLLE(B)的存在；
宿主遗传背景的发展
实施例1：
嗜碱芽孢杆菌BhFC04(Δhag ΔwprA)的染色体上的flid基因的灭活。
设计引物通过PCR扩增flid基因的两个片段。它们分别是1.5kb和0.989kb并含有flid基因的部分N-端(引物σDKpn/MC120805，表1)和部分C-端(引物FliDCF2/FliDCR2，表1)区。用KpnI/HindII消化载体pSEC194(Crampton等。2007)，以三向连接方式连接到两个片段上，并转化到大肠杆菌DH10B中创建含有缺陷flid基因的质粒pSECFliD。接着将质粒转化到嗜碱芽孢杆菌BhFC04(Δhag ΔwprA)并根据Crampton等(2007)的描述进行整合。用引物M13F和DChrRev(表1)筛选到20个推定的单交换菌落。获得了5个N-端单交换菌落和15个C-端单交换菌落。N-端单交换菌落中的一个用与创建一个双交换。引物ChrFliFor和DChrRev(表1)进行的PCR扩增证实双交换事件确曾发生。对20个氯霉素敏感的菌落进行了测试，其中12个被证明是正确的-含有flid基因，而其余的被发现是回复突变体。这个菌株被命名为嗜碱芽孢杆菌BhFD01(Δhag、ΔwprA、ΔfliD)。
实施例2：
染色体上关键蛋白酶基因的灭活
为通过减少蛋白酶的降解进一步改善分泌的嵌合肽单体的稳定性，决定对嗜碱芽孢杆菌BhFD01染色体上的除了wprA细胞壁蛋白 酶之外的蛋白酶进行灭活。靶向的蛋白酶基因为：alp、apr、asp和vpr。
2.1 嗜碱芽孢杆菌Alk36(BhFD01)的前体原碱性蛋白酶(alp)基因的灭活。
alp基因位于嗜碱芽孢杆菌C125基因组上的740001至741119位(http://www.jamstec.co.jp/genomebase/micrhome)。用于产生构建PCR缺陷性alp-片段必需的两个PCR产物alp 1(alp1F/alp1R)和alp 2(alp2F/alp2R)的引物列于表1。1183个碱基对的alp 1 PCR产物起始于ATG起始密码子上游的第999个碱基对并包括N-端区域的前184个碱基对。848个碱基对的alp 2 PCR产物包括alp C-端区域的后161个碱基对以及alp基因的TAA终止密码子下游的687个碱基对。
表1：PCR引物及其相应的核苷酸序列的列表。限制性内切酶位点加下划线。
  引物名称   核苷酸序列   限制性内  切酶位点
  alp1F   5’CTTGGTACCGCGTGGGAATGTTGCA 3’   KpnI
  alp1R   5’CTTGGATCCTGCACTTCTACCGCTGAG3’   BamHI
  alp2F   5’CTTGGATCCGGCTTCACCTCATGTGA 3’   BamHI
  alp2R   5’CTCCCGGGTGGTTGTCACAGCAGCGG 3’   SmaI
  apr1F   5’GCAGGTACCGTTGGTGTTCAAGATGTTTACG-3’   KpnI
  apr1R   5’GCAGGATCCAGGCGTTGCTTGAGACGTACCA3’   BamHI
  apr2F   5’GCAGGATCCGGACAGGAAGCGAACCTCAAG3’   BamHI
  apr2R   5’GCACCCGGGCAAGTCCTAGAGTACAATAAC 3’   SmaI
  vpr1F   5’CGTGTTACCGATGTGTAGTGCCTTATC3’   KpnI
  vpr1R   5’CTTGGATCCTTCATACGTCTCGCCATCGAG3’   BamHI
  vpr2F   5’CGTGGATCCCGAAGGTACGATCATCGTA3’   BamHI
  vpr2R   5’GTCCCGGGAAGCACGAGTGGATTCATGGTATA3’   SmaI
  asp1F   5’GTAGGTACCCTCGATGCGAAAGTTCTCGATG 3’   KpnI
  asp1R   5’GCAGGATCCGTACCAGCCACGTGAGTTCCG 3’   BamH1
  asp2F   5’GCAGGATCCGCTAGATACTCTGGTGTTATGG 3’   BamHI
  asp2R   5’GATCCCGGGCCTCCTATCATACCCAAATGAG 3’   SmaI
  MC120805   5’CGAGGATCCCGTATTTAAAGAGGAACGTAA3’   BamHI
  FliDCF2   5’CGAGGATCCCGAGCAGTGATTACAGATTG3’   BamHI
  FliDCR2   5’CGACCCGGGCAGAGAGCTCATTATGCTTCTC3’   SmaI
  DChrRev   5’CTTAGATCATGGTTAGAATCAAGAGG3’   -
  ChrFliFor   5’GCTTGTGCTGGGCAAAGGAGGCGAAG3’   -
  σDKpn   5’CTCGGTACCCTCGCGTTACGCTCTTTCTGT3’   KpnI
  FliNlerRev   5’CTCCTCGAGCGACCTTCTGAAACAGC3’   XhoI
  M13F   5’TGACCGGCAGCAAAATG3’   -
  FliCR   5’CAACAAAGTAACGGTTGAGCG3’   -
  FliDNR3   5’CGAGGATCCCAAGACCGGCAGAGTTAATGTC3’   BamHI
[0066] 
  NC5F   5’CACGTCGACTCGAGCCCGGGATCCTTTAATACGC  AAAAATTACTC3’   XhoI
  VCF6 5’CACGTCGACTCGAGCCCGGGATGGATCCAGAAT GCACAATCAGCTATTGAC3’   SalI
  VNR6   5’GACGTCGACAGTGTGGTCAGTAATATCCTC3’   SalI
  FliDCR   5’CGACCCGGGGAAGAAGCTGAAGACGATGCAGC3’   SmaI
  FliC7F   5’CGAGGTACCAGGAGTTTGTCCTTCTG 3’   KpnI
  FuzendR   5’CGTCAGGATCCTTACATAAACCAATTCCA3’   BamHI
  FuzendR2   5’GTCTAGGATCC  
  TermF   5’GACGGATCCTTTGCTTCCATTTAAAGATCT3’   BamHI
  TermR   5’GTGCTGCAGGTATTTAAAGAGGAACGTAAACG3’   PstI
  SilRev   5’CTCGAGGATCCTTATTCTAATAAATCACGTTC3’   BamHI
消化的PCR产物(N-端KpnI\BamHI和C-端BamHI/SmaI)连在一起接到整合载体pSEC194(Kpn I和HindII)上，获得内部缺失771个碱基对的具有pSECAlp的缺陷性alp基因。
通过前面部分所述的双交换事件将缺陷性alp基因整合到嗜碱芽孢杆菌BhFD01(Δhag、ΔfIiD、ΔwprA)染色体中创建BhFD02(Δhag、ΔfliD、ΔwprA、Δalp)。通过PCR分析证实该事件。
2.2 嗜碱芽孢杆菌的前体原碱性蛋白酶(apr)基因的灭活。
前体原碱性蛋白酶(apr)基因位于嗜碱芽孢杆菌C125基因组上的751087至753465位(http://www.jamstec.co.jp/genomebase/micrhome)。用于产生构建PCR缺陷性apr-片段必需的两个PCR产物的引物为(apr1F/apr1R)和(apr2F/apr2R)(表1)。1625个碱基对的apr 1 PCR产物起始于apr基因TTG起始密码子上游的第644个碱基对并包括N-端序列的前981个碱基对。1235个碱基对的apr 2 PCR产物包括apr基因C-端序列的后167个碱基对以及apr基因的TAA终止密码子下游的1068个碱基对。
apr的PCR产物(N-端KpnI\BamHI和C-端BamHI/SmaI)连在一起接到整合载体pSEC194(KpnI\和HindII)上，获得内部缺失1231个碱基对的具有pSECapr-的缺陷性apr基因。
通过前述的双交换事件将缺陷性apr基因整合到嗜碱芽孢杆菌BhFD02(Δhag、ΔfliD、ΔwprA、Δalp)染色体中创建BhFD03(Δhag、ΔfliD、ΔwprA、Δalp、Δapr)。通过PCR分析证实该事件。
2.3 嗜碱芽孢杆菌的vpr蛋白酶基因的灭活。
vpr基因位于嗜碱芽孢杆菌C125基因组上的905382至902983位(http://www.jamstec.co.jp/genomebase/micrhome)。用于产生构建PCR缺陷性vpr-片段必需的两个PCR产物的引物概述于表1(vpr1F/vpr1R和vpr2F/vpr2R)。1724个碱基对的vpr 1 PCR产物起始于vpr基因TTG起始密码子上游的第578个碱基对并包括vprN-端序列的前1146个碱基对。1509个碱基对的vpr 2 PCR产物包括vpr基因C-端序列的后361个碱基对以及vpr基因的TAA终止密码子下游的1148个碱基对。将温度敏感性pSEC194用KpnI和HindII酶切并连接至vpr1和vpr2，得到pSEvpr。
通过前述的双交换事件将缺陷性vpr基因整合到嗜碱芽孢杆菌BhFD03(Δhag、ΔwprA、Δalp、Δapr)染色体中。通过PCR分析证实该事件并创建BhFD04(Δhag、ΔfliD、ΔwprA、Δalp、Δapr、Δvpr)。
2.4 嗜碱芽孢杆菌的asp蛋白酶基因的灭活。
asp基因位于嗜碱芽孢杆菌C125基因组上的927497至928582位上的(http://www.jamstec.co.jp/genomebase/micrhome)。用于产生构建PCR缺陷性asp-片段必需的两个PCR产物asp 1(asp1F/asp1R)和asp 2(asp2F/asp2R)的引物列于表1。852个碱基对的asp 1 PCR产物起始于ATG起始密码子上游的第371个碱基对并包括asp N-端区域的前481个碱基对。682个碱基对的asp 2 PCR产物包括asp C-端区域的后319个碱基对以及asp基因的TAA终止密码子下游的363个碱基对。消化的PCR产物(N-端KpnI\BamHI和C-端BamHI/SmaI)连在一起接到整合载体pSEC194(KpnI和HindII)上，获得内部缺 失281个碱基对的具有pSECasp的缺陷性asp基因。通过前面部分所述的双交换事件将缺陷性asp基因整合到嗜碱芽孢杆菌BhFD04(Δhag、ΔfliD、ΔwprA、Δalp、Δapr、Δvpr)染色体中创建BhFD05(Δhag、ΔfliD、ΔwprA、Δalp、Δapr、Δvpr、Δasp)。通过PCR分析证实该事件。
宿主菌的应用：根据框内夹心法融合分泌得到本发明的肽
实施例3：
使用下列不同肽评价flid突变对嵌合鞭毛蛋白融合的影响。
i)使用的HIV抗原肽（表2）的合成肽序列是基于所有HIV-1亚型C V3南非分离物的可变区的共有序列Hewer和Meyer(2003)。这种肽的尺寸为24个氨基酸，全插入尺寸为29个氨基酸。包括HIV-抗原肽的FliC的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示。编码SEQ ID NO:40的多肽序列的构建体命名为pSECNHIVC7，如SEQ ID NO:41所示。
ii)抑菌素,一种13个氨基酸（Hancock和Lehrer,1998）的阳离子抗菌肽（表2）与FLAG-标签一起插入形成框内嵌合鞭毛蛋白融合物，以便于分离。全插入尺寸为36个氨基酸，其包括将甲硫氨酸残基插入到抑菌素肽的任一侧以进行通常由溴化氰（CnBr）进行的氰化或选择性切割(Tang和Speicher2004)。FliC的氨基酸序列包括抑菌素插入体，以及FLAG-标签和切割位点，如SEQ ID NO:42所示。编码SEQ ID NO:42的多肽序列的构建体命名为pSECNFINDC7，如SEQ ID NO:43所示。
iii)恩夫韦地是一种HIV-融合抑制剂，其以FuzeonTM市售，选择的合成寡核苷酸基于恩夫韦地（表2）的氨基酸序列（Bolognesi等，1995）。这种肽的尺寸为36个氨基酸，包括FLAG-标签以便于分离，同时将甲硫氨酸残基插入到该肽的任一侧以便于切割。插入到构建体的氨基酸总数为59。FliC的氨基酸序列包括恩夫韦地插 入体，以及FLAG-标签和切割位点，如SEQ ID NO:44所示。编码SEQ ID NO:44的多肽序列的构建体命名为pSECNFFuzC7，如SEQ ID NO:45所示。
iv)西夫韦肽,一种36个氨基酸的肽（表2）是恩夫韦地的一种很有前途的替代剂，其显示出改善的活性和稳定性（Franquelim等，2008）。甲硫氨酸切割位点以及两个FLAG-标签包含在内生成的全插入尺寸为75个氨基酸。FliC的氨基酸序列包括西夫韦肽插入体，以及FLAG-标签和切割位点，如SEQ ID NO:46所示。编码SEQ ID NO:46的多肽序列的构建体命名为pSECNF2SifC7，如SEQ ID NO:47所示。
表2插入到鞭毛蛋白NC7位点的HIV分支C，FLAG-抑菌素，FLAG-Fuzeon和FLAGx2-西夫韦肽多肽，FLAGx2-西夫韦肽多肽连接到鞭毛蛋白的N-端区域，和FLAG-西夫韦肽多肽连接到鞭毛蛋白的C-端区域。
加粗的氨基酸表示多肽和FLAG序列，非加粗氨基酸编码连接子以及阴影氨基酸表示插入的氨基酸残基。
表3 用于构建抑菌素、FuzeonTM和西夫韦肽表达盒的互补寡核苷酸序列列表。
加粗的核苷酸表示多肽和FLAG序列，非加粗氨基酸编码多连接位点的序列以及阴影核苷酸表示插入的氨基酸残基。下划线的核苷酸对应于限制性酶切位点。
这些肽均插入到鞭毛肽单体的中央可变区，多连接子被插入到鞭毛基因的核苷酸540位(Crampton等.2007)。
3.1 pSECNC7盒的构建
该构建体是构建体pSECNC6(描述于PCT国际申请PCT/IB2005/054022；国际公开号：WO 2006/072845)的增强型。pSECNC7盒通过分别使用引物FliC7F/VNR6和FliDNR3/VCF6扩增鞭毛基因的N-(1447bp)和C-端(1401bp)区获得(表1)。分别用Kpn\I/SalI和SalI消化N-端和C-端产物。在三元连接中将这两个片段均连接到pSEC194(KpnI/HincII)，获得pSECNC7，其中在核苷酸540位含有27个碱基对多连接子(图1)。
3.2 免疫原性肽表达的评价。
3.2.1 嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)BhFD05分泌的免疫原性嵌合鞭毛蛋白融合pSECNHIVC7的构建与评价。
使用按照Crampton等.(2007)描述的方法构建的含有HIV抗原肽的质粒pSECNHIVC7(表2和表3)，将所述质粒转化到全部5个蛋白酶缺失株：嗜碱芽孢杆菌BhFD01、BhFD02、BhFD03、BhFD04和BhFD05，并评价融合肽到胞外介质的分泌。
用不同宿主背景中pSECNHIVC7的嵌合鞭毛基因产物评价到胞外介质的分泌。收集前，细胞生长的OD600在3.5-5.5之间。收集约1.5ml的细胞培养物以8000×g离心1分钟(上清液中含有胞外组分(fraction))。将1ml上清液转移至Eppendorf管中。将300μl 20％ TCA(三氯乙酸)溶液加入到上清液中，在冰中振摇培养30分钟。胞外蛋白以12000×g沉淀10分钟。用乙醇和乙醚溶液(1∶1 v/v)洗涤沉淀物一次。干燥沉淀物，悬浮于30μl 25mM Tris-HCl溶液(pH 9.5)中。
采用10％ SDS-PAGE凝胶分析胞外蛋白组分(10μl)，以胶体考马斯亮蓝染色显像(图2A)。约1-2μg用于蛋白质印迹分析(Westernblot analysis)。
3.2.2 嗜碱芽孢杆菌BhFD05分泌的免疫原性嵌合鞭毛蛋白融合物的分析。
细胞在1升大小的容器内生长至OD600为3.5-5.5之间后，以8000×g离心10分钟收集上清液。向上清液中加入10％(w/v)TCA(三氯乙酸)，在冰中培养30分钟，沉淀得到总胞外蛋白。胞外蛋白以12000×g沉淀10分钟。用乙醇和乙醚溶液(1∶1 v/v)洗涤沉淀物一次。风干沉淀物，将蛋白重悬于10ml 50mM Tris-HCl溶液(pH 7.4)中。采用阴离子交换色谱，从粗总胞外蛋白组分中将免疫原性嵌合鞭毛融合蛋白纯化至接近均匀状态。将全部10ml粗蛋白制备物加载到Toyopearl650M强阴离子交换树脂(Tosoh Bioscience)1.6×13cm的预制柱上，采用 FPLCTM蛋白纯化系统。用10-15个柱体积的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4)洗脱至基线吸收(A280nm)稳定到约零，将污染的非蛋白组分从树脂中洗去。用溶于50mM Tris-HCl的0-500mM NaCl溶液，pH 7.4，共15个柱体积，以逐渐增加的梯度，将蛋白从树脂上洗脱下来。采用10％ SDS-PAGE凝胶分析含有蛋白的洗脱馏分，评价免疫原性嵌合鞭毛蛋白融合蛋白的最终纯度。
纯化的免疫原性嵌合鞭毛蛋白融合蛋白采用QubitTM荧光计(Invitrogen)定量，该荧光计带有Quant-iTTM蛋白分析试剂，其中含有高灵敏度蛋白-特异性荧光染色和认证的蛋白标准品，按照生产商的说明使用。获得的总蛋白量为每升培养上清液含有9.87mg免疫原性嵌合鞭毛融合蛋白，约9.38mg/L，估计纯度为95％。纯化后，采用上述方法用10％ SDS-PAGE凝胶分析嵌合鞭毛融合蛋白(图3A)。采用MEIV3b 4抗体，对约1-2μg进行蛋白质印迹分析(图3B)。
3.3 抗病毒多肽FuzeonTM和西夫韦肽(Sifuvirtide)的表达的评价。
3.3.1 携带FLAG::Fuzeon肽的pSECNFFuzC7的构建。
基于恩夫韦地(FuzeonTM)氨基酸序列(表2)设计合成寡核苷酸(表3)(Bolognesi等.1995)。在N-和C-末端包括甲硫氨酸残基以采用溴化氰进行化学切割(Tang和Speicher.2004)。为便于纯化，引入FLAG-标签。
根据IDT(整合DNA技术，www.idtdna.com)描述的方法对寡核苷酸(表1)FuzF和FuzR退火。用STE缓冲液(10mM Tris pH 8，50mMNaCl，1mM EDTA)稀释寡核苷酸至终浓度为20μM。制备工作储备液(5μM)，与等量的互补寡核苷酸混合在一起(通常各为25μl)。将样品煮沸5分钟，在水浴中缓慢冷却。所得产物用适当的限制性内切酶进行酶切，连接到用SalI和BamHI消化的pSECNC7。将所得构建体命名为pSECNFuzC7。该构建体用SalI消化。FLAG-标签的寡核苷酸来自于多肽序列DYKDDDDK(表2)(Sigma cat no F3290))，在N-和C-末端添加了4和2个氨基酸连接子，以更好地暴露FLAG-标签。按上述方法对FLAG-标签的寡核苷酸(表3)退火。退火的寡核苷酸被 连接到pSECNFuzC7，用SalI消化得到pSECNFFuzC7。
采用引物FliNterRev和NC5F(表1)通过PCR分析证实所有构建体均正确。证实构建体的完整性后，采用改良的原生质体转化法(Crampton等.2007)将它们转化到嗜碱芽孢杆菌BhFD05中。采用引物FIiCR和FuzF(表1和表3)通过限制性消化和定向PCR证实插入物的定位。
3.3.2 携带FLAG×2::西夫韦肽多肽的pSECNF2SifC7的构建。
合成的寡核苷酸衍生自西夫韦肽多肽序列(表2)(Franquelim等.2008)，并在N-和C-末端包括甲硫氨酸残基用于溴化氰化学切割。按照3.3.1章节所述的方法对寡核苷酸SifF和SifR(表3)退火。所得产物用适当的限制性内切酶(表1)进行酶切，连接到用SalI和BamHI消化的pSECNC7。将所得构建体命名为pSECNSifC7。
用SalI消化pSECNSifC7。按照3.3.1章节所述的方法对FLAG-标签的寡核苷酸退火。退火的寡核苷酸被连接到pSECNSifC7，在Sif多肽前端引入两个FLAG-标签。该构建体命名为pSECN2SifC7。
通过如用于pSECNFFuzC7的所述的PCR和序列分析证实所有构建体均正确。采用引物FIiCR和FuzF(表1和表3)通过定向PCR证实插入物的定位。然后将构建体转化到嗜碱芽孢杆菌BhFD05中。
3.3.3 嗜碱芽孢杆菌BhFD05分泌的抗病毒嵌合鞭毛蛋白融合物的分析。
对pSECNFFuzC7和pSECNF2SifC7的嵌合鞭毛基因产物至胞外介质的分泌进行评价。收集前，细胞生长的OD600在3.5-5.5之间。收集约1.5ml的细胞培养物以8000×g离心1分钟(上清液中含有胞外组分)。将1ml上清液转移至Eppendorf管中。将330μl 20％ TCA(三氯乙酸)溶液加入到上清液中，在冰中培养30分钟。胞外蛋白以12000×g沉淀10分钟。用乙醇和乙醚溶液(1∶1 v/v)洗涤沉淀物一次。干燥沉淀物，将蛋白重悬浮于30μl 25mM Tris-HCl溶液(pH 9.5)中。
采用10％ SDS-PAGE凝胶分析胞外蛋白组分(10μl)，以胶体考马斯亮蓝染色显像。可检出鞭毛蛋白融合物的大小为45kDa的嵌合鞭毛蛋白带(结果未示出)。
3.3.4 嗜碱芽孢杆菌BhFD05分泌的抗病毒嵌合鞭毛蛋白融合的分析。
用亲和色谱纯化所需的鞭毛融合蛋白。术语“亲和色谱”是指通过分子与粘附到不溶基质上的配体的亲和力来分离分子的技术，因此，随后结合的分子可以相对纯的状态被洗脱下来。该技术包括将FLAG-标签粘附到融合多肽上，进行色谱分离，然后通过从(10％)SDS-PAGE凝胶上切除来分离融合蛋白。
对pSECNFFuzC7和pSECNF2SifC7的嵌合鞭毛基因产物至胞外介质的分泌进行评价。细胞在1升大小的容器内生长至OD600为3.5-5.5之间后，以8000×g离心10分钟收集上清液。向上清液中加入10％(w/v)TCA(三氯乙酸)，在冰中培养30分钟，沉淀得到总胞外蛋白。胞外蛋白以12000×g沉淀10分钟。用乙醇和乙醚溶液(1∶1 v/v)洗涤沉淀物一次。风干沉淀物，将蛋白重悬浮于含有500mM NaCl和2.5％(v/v)曲拉通X-100的10ml 50mM Tris-HCl溶液(pH 7.4)中。粗蛋白溶液用1ml M2抗-FLAG亲和树脂(Sigma)在室温下培养2小时，以结合相关的FLAG-标记的融合蛋白。用含有500mM NaCl和2.5％(v/v)曲拉通X-100的15ml 50mM Tris-HCl溶液(pH 7.4)洗涤树脂，除去非特异性结合蛋白。用8ml 0.1M甘氨酸，pH 3.5，洗脱FLAG-标记的融合蛋白，采用3.2.3章节所述的10％ SDS-PAGE凝胶分析(图4A)。采用多克隆兔抗-鞭毛蛋白抗体，对约1-2μg进行蛋白质印迹分析(图4B)。纯化的免疫原性嵌合鞭毛蛋白融合蛋白采用QubitTM荧光计(Invitrogen)定量，该荧光计带有Quant-iTTM蛋白分析试剂，其中含有高灵敏度蛋白-特异性荧光染色和认证的蛋白标准品，按照生产商的说明使用。获得的总蛋白量为每升培养上清液含有10-20mg免疫原性 嵌合鞭毛融合蛋白，估计纯度为95％。
从SDS-PAGE凝胶上切取从pSECNFFuzC7中获得的抗病毒嵌合鞭毛蛋白::Fuzeon蛋白带，通过本领域技术人员熟知的方法(Shevchenco和Shevchenco.2001)，采用改良的测序级胰蛋白酶进行酶切。切割步骤为在赖氨酸(K)和精氨酸(R)残基的C-末端切割多肽。通过质谱分析验证FuzeonTM肽的存在和完整性，使用AppliedBiosystems/MDS SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF分析仪，CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)作为基质，1 fmol缓激肽作为内校(质子化的，单一同位素质量为1060.5692)。采用反射正离子模式进行质谱的初步检查，质量范围为600-4000Da，表明每个质谱中的许多最高峰与构建体所期待的胰蛋白酶肽相对应。切割报告的审查结果证实除了肽17和20外，在该模式使用的范围内(600-4000Da)所有预期的质量都出现了(图5A)。采用GPMAW 7.1进行肽质量匹配，用50ppm的精密度更详细地检验序列的覆盖范围。25个质量与26个未改性的肽相匹配，8个质量与8个改性的肽相匹配，残基覆盖度为85％(331个氨基酸中的284个)。这三个前体蛋白(precursors)每个都提供了非常完整的y-和b-离子系列。为了进一步证实该序列，需进行多次MS/MS质谱。带注释的MS/MS质谱表明相关肽带有质量标记、鉴定的y-离子和b-离子(图5B、C、D)。相关肽包括预期在2606.24、1230.62和3164.53Da的胰蛋白酶肽(图5A)。2606.240处的峰被鉴定为多肽GGVDMYTSLIHSLIEESQNQQEK(aa 195-217，图5B)，与FuzeonTM的N-末端区相对应。3164.53Da处没有明显的峰，但在1109.52处有与插入序列的C-末端位置相对应的峰。MS质谱中有一个质量为2074.03的显著峰。该质量的MS/MS谱很容易将其指定为肽MWIQNAQSAIDAIDEQLK。该肽确实出现在融合序列中，就在插入的关注肽后，并占未被质谱匹配覆盖的肽的大部分。另一半预期的肽应出现在3164.53Da-2074.03Da+18Da+1Da＝1109.5Da，此处确实 存在一个强度很高的峰。该峰被MS/MS证实为与WASLWNWF相对应(图5C)，在关注的FuzeonTM肽的C-末端。此外，1230.62处的质量被证实为关注肽的NEQELLELDK(图5D)。总之，得到了关注肽Fuzeon的积极证据，(下划线的，图5A中)确实以完整的嵌合鞭毛蛋白融合物的形式被表达。
3.4 抗菌肽抑菌素的表达的评价。
3.4.1 携带FLAG::抑菌素多肽的pSECNFINDC7的构建。
按Selsted等(1992)的描述得到合成的抑菌素寡核苷酸，在N-和C-末端含有用于化学切割的甲硫氨酸残基(表2)。按照3.3.1章节描述的方法对寡核苷酸(表3)进行退火。所得产物用适当的限制性内切酶(表1)进行酶切，连接到用SalI和BamHI消化的pSECNC7得到pSECNINDC7。用SalI消化该构建体。按照3.3.1章节所述的方法对FLAG-标签的寡核苷酸退火。退火的寡核苷酸被连接到pSECNINDC7，在IND多肽前端并入一个FLAG-标签。将该构建体命名为pSECNFINDC7。通过PCR和序列分析证实所有构建体均正确，并将其转化到嗜碱芽孢杆菌BhFD05。
3.4.2 嗜碱芽孢杆菌BhFD05分泌的抗菌嵌合鞭毛蛋白融合物的分析。
按照3.3.4章节所述的方法从嗜碱芽孢杆菌培养上清液中提取和纯化抗菌肽，抑菌素。用亲和色谱分离相关的FLAG-标签的融合蛋白。纯化的免疫原性嵌合鞭毛蛋白融合蛋白采用QubitTM荧光计(Invitrogen)定量，该荧光计带有Quant-iTTM蛋白分析试剂，其中含有高灵敏度蛋白-特异性荧光染色和认证的蛋白标准品，按照生产商的说明使用。获得的总蛋白量为每升培养上清液含有1-5mg免疫原性嵌合鞭毛融合蛋白，估计纯度为95％。在SDS-PAGE(10％)凝胶上运行样品(图6A)，采用多克隆兔抗-鞭毛蛋白抗体进行蛋白质印迹分析以证实结果(图6B)。从SDS-PAGE(10％)凝胶上切取凝胶抗菌嵌合鞭毛 蛋白::抑菌素蛋白带，采用改良的测序级胰蛋白酶进行酶切，按上面3.3.4章节所述的方法进行MALDI TOF/TOF质谱分析。切割报告的审查结果证实除了多肽17和20外，在反射正离子模式使用的范围内(600-4000Da)所有预期的质量都出现了(图7A)。采用GPMAW 7.1进行肽质量匹配，用50ppm的精密度更详细地检验序列的覆盖范围。42个质量与39个未改变的多肽相匹配，17个质量与16个改变的多肽相匹配，残基覆盖度为99％(308个氨基酸中的306个)。为了证实相关肽在融合构建体中的表达，在相关区域获得了多个质量。带注释的MS/MS质谱表明相关肽带有质量标记、鉴定的y-离子和b-离子(图7B、C、D)。鉴定了预期在1115.59Da(GGVDM ILPWK，氨基酸195-204)的多肽，包括相关的N-末端部分(图7B)。为了进一步证明相关肽存在N-末端部分，获得了前体蛋白质量(precursor mass)为1703.79Da的MS/MS谱(图7C)。经鉴定的峰提供了肽DDDDKGGVDMILPWK(氨基酸190-204)由K194后缺失的切割产生的证据，且在切割切割报告中不清楚的该肽包含两个胰蛋白酶的证据，如图7A所示。证实多肽WPWWPWR(氨基酸205-211)存在的前体蛋白质量(precursormass)1113.542的MS/MS谱如图7D所示。该多肽组成了抑菌素的C-末端区。总之，得到了相关多肽抑菌素的积极证据，确实作为嵌合鞭毛蛋白融合被完整表达。
宿主菌的应用：根据本发明分泌的作为N-末端鞭毛蛋白融合的多肽。
实施例4：
4.1 抗病毒多肽西夫韦肽的Flic N-末端融合的表达
4.1.1 携带FLAG::西夫韦肽多肽的pSECNF2Sif的构建
将质粒pSECNF2SifC7作为模板，采用引物σDKpn和SifRev2获得含有FIiC N-末端片段(770bp)的947bp PCR产物，融合到2×FLAG::西夫韦肽多肽(225bp)，在西夫韦肽多肽的C-末端不含有甲硫氨酸残基和终止密码子的内含物。含有西夫韦肽插入物的所述FIiC N-末端片段的编码的多肽序列如SEQ ID NO:64所示。将相同的质粒作为模板，采用引物TermF和TermR获得含有FIiC3'非翻译区(700bp)的PCR产物。用适当的酶消化这两个片段，并连接到用KpnI和HindII消化的pSEC194。所得编码多肽序列SEQ ID NO:64的构建体被命名为pSECNF2Sif，如SEQ ID NO:65所示。通过如用于pSECNFFuzC7的所述的PCR和序列分析证实所有构建体均正确，并将其转化到嗜碱芽孢杆菌BhFD05。
4.1.2 N-末端多肽融合表达的评价
按照3.3.3章节所述，评价pSECNF2Sif的嵌合鞭毛基因产物到嗜碱芽孢杆菌BhFD05的胞外介质的分泌。
在10％ SDS-PAGE凝胶上分析胞外蛋白组分。在～38kDa的范围内检出鞭毛蛋白::西夫韦肽融合的嵌合鞭毛蛋白带。按照3.3.4章节描述的方法从嗜碱芽孢杆菌BhFD05培养上清液中提取和纯化抗病毒多肽FLAG×2-西夫韦肽。在10％ SDS-PAGE凝胶上运行样品(图8)。
4.1.3 N-末端肽融合的分析。
纯化的免疫原性嵌合鞭毛融合蛋白采用QubitTM荧光计(Invitrogen)定量，该荧光计带有Quant-iTTM蛋白分析试剂，其中含有高灵敏度蛋白-特异性荧光染色和认证的蛋白标准品，按照生产商的说明使用。获得的总蛋白量为每升培养上清液含有1-5mg免疫原性嵌合鞭毛融合蛋白，估计纯度为95％。将抗病毒嵌合鞭毛融合蛋白在10％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，从凝胶上切取条带，通过本领域技术人员熟知的方法，采用改良的测序级胰蛋白酶进行酶切。采用带有独立的纳米电喷雾离子源的QSTARElite质谱仪(AppliedBiosystems/MDS SCIEX)通过质谱分析验证西夫韦肽多肽的存在和完整性。将样品加载到Proxeon NanoES毛细管柱，采用900-1200V的离子喷雾电压进行电离。采用碎片离子为246.15和1285.54m/z的Glu- 血纤维蛋白肽B(Sigma-Aldrich)校准仪器。在正离子模式下获得范围为450-1500m/z的肽质量指纹(Peptide Mass Fingerprint，PMF)图谱。通过信息依赖性获取法(Information Dependent Acquisition，IDA)得到MS/MS数据，其中通过碰撞诱导切割(CID)选择两个或三个电荷的母离子作为碎片，氮气作为碰撞气体。在msdb数据库(在msdb.fasta文件中合并有鞭毛蛋白序列、N-末端FLAG和西夫韦肽)搜索MS/MS数据。带注释的MS/MS谱表明鉴定了带有质量标记、鉴定的y-离子和b-离子的相关肽(图9A、B)。具有极高可信度的MS/MS谱证实了两个重叠多肽(1772.8372Da，ILEESQEQQDRNER；图9A和2243.0567Da，ILEESQEQQDRNERDLLE；图9B)的存在，与西夫韦肽的C-末端区相对应，提供了西夫韦肽作为N-末端肽融合的成功表达的证据。
宿主菌的应用：根据本发明分泌的作为C-末端鞭毛蛋白融合物的肽。
实施例5：
5.1 抗病毒多肽西夫韦肽的Flic C-末端融合的表达
5.1.1 携带FLAG::西夫韦肽多肽的pSECNCFSif的构建
采用Crampton等(2007)所述的含有全FliC蛋白的质粒pSECFliC及其5'和3'区作为模板，采用引物σDKpn和FliCendR获得1065bp PCR产物，该产物含有在C-末端引入XhoI和BamHI位点的全FliC蛋白。该片段（用XhoI和KpnI消化）与FLAG-西夫韦肽片段（用XhoI和BamHI消化）一起连接到用KpnI和BamHI消化的pSECNF2Sif。含有融合了C-末端的抗病毒蛋白西夫韦肽的FliC的编码的多肽序列，如SEQ ID NO:66所示。编码该多肽的构建体被命名为pSECNCFSif，如SEQ ID NO:67所示。通过如用于pSECNFFuzC7的所述的PCR和序列分析证实所有构建体均正确，并将其转化到嗜碱芽孢杆菌BhFD05。
5.1.2 C-末端肽融合表达的评价
按照3.3.3章节所述，评价pSECNCFSif的嵌合鞭毛基因产物到嗜碱芽孢杆菌BhFD05的胞外介质的分泌。
在10％ SDS-PAGE凝胶上分析胞外蛋白组分。在～37kDa的范围内检出鞭毛蛋白::西夫韦肽融合的嵌合鞭毛蛋白带。按照3.3.4章节描述的方法从嗜碱芽孢杆菌BhFD05培养上清液中提取和纯化抗病毒肽FLAG-西夫韦肽。在10％ SDS-PAGE凝胶上运行样品(图10)。
5.1.3 C-末端多肽融合的分析。
纯化的免疫原性嵌合鞭毛融合蛋白采用QubitTM荧光计(Invitrogen)定量，该荧光计带有如前所述的Quant-iTTM蛋白分析试剂。获得的总蛋白量为每升培养上清液含有5-12mg免疫原性嵌合鞭毛融合蛋白，估计纯度为95％。将抗病毒嵌合鞭毛融合蛋白在10％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，从凝胶上切取条带，通过本领域技术人员熟知的方法，采用改良的测序级胰蛋白酶进行酶切。采用如4.1.3章节所述的QSTARElite质谱仪(Applied Biosystems/MDS SCIEX)通过质谱分析验证西夫韦肽多肽的存在和完整性。带注释的MS/MS谱表明鉴定了带有质量标记、鉴定的y-离子和b-离子的相关多肽(图11A、B)。具有极高可信度的MS/MS谱证实了与抗病毒多肽LEESGADYKDDDDKGGVDMSWETWEREIENYTR(3938.6768Da)(图11A)的N-末端区相对应的多肽的存在，以及证实了C-末端区ILEESQEQQDRNERDLLE(2243.0669Da)(图11B)的存在。这些结果提供了西夫韦肽作为C-末端多肽融合的成功表达的证据。
参考文献
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Claims (13)

1.一种制备基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白的方法，该方法包括：
培养保藏于NCIMB的保藏号为41533的嗜碱芽孢杆菌BhFD05(△hag、△fliD、△wprA、△alp、△apr、△vpr、△asp)菌株，和
使该菌株表达并分泌高水平的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白于细胞外培养基中；
其中，所述基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白包括选自抑菌素、恩夫韦地和西夫韦肽的外源肽，该外源肽仅融合到SEQ ID NO.1的全长嗜碱芽孢杆菌鞭毛多肽的C-端。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有嵌合蛋白的培养基作为粗品使用，且从培养基中能够纯化得到部分或全部的嵌合蛋白。
3.根据权利要求1所述方法制备的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其包括选自抑菌素、恩夫韦地和西夫韦肽的外源肽，该外源肽仅融合到SEQ ID NO.1的全长嗜碱芽孢杆菌鞭毛多肽的C-端。
4.根据权利要求3所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其包括融合到外源肽N-端一侧的多肽标签。
5.根据权利要求3所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白，其包括与外源肽相连的至少一个切割位点。
6.权利要求3所述的基于鞭毛蛋白的嵌合蛋白在用于制备治疗用药物中的应用。
7.编码权利要求3所述的嵌合蛋白的核酸，所述核酸包括编码选自抑菌素、恩夫韦地和西夫韦肽的外源肽的核苷酸序列，所述外源肽仅融合到SEQ ID NO.1的全长嗜碱芽孢杆菌鞭毛多肽C-端。
8.包括编码权利要求3所述的嵌合蛋白的核酸序列的表达盒。
9.根据权利要求8所述的表达盒，其中所述编码嵌合蛋白的核酸序列被整合至宿主细胞的染色体中。
10.包括编码权利要求3所述的嵌合蛋白的核酸序列的核酸载体，其可操作地与转录调控因子连接。
11.根据权利要求10所述的核酸载体，其为外染色体质粒。
12.含有权利要求10所述的核酸载体的细菌细胞。
13.根据权利要求12所述的细菌细胞，其为NCIMB保藏号为41533的菌株嗜碱芽孢杆菌BhFD05(△hag、△fliD、△wprA、△alp、△apr、△vpr、△asp)的细胞。
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