CN103299193B - 分析物传感器、制备和使用所述传感器的方法、以及检测分析物活性的方法 - Google Patents

分析物传感器、制备和使用所述传感器的方法、以及检测分析物活性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103299193B
CN103299193B CN201180060987.0A CN201180060987A CN103299193B CN 103299193 B CN103299193 B CN 103299193B CN 201180060987 A CN201180060987 A CN 201180060987A CN 103299193 B CN103299193 B CN 103299193B
Authority
CN
China
Prior art keywords
analyte
analyte sensor
fluorescence
sensor
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201180060987.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103299193A (zh
Inventor
詹妮·杰·杨
唐申
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Georgia State University Research Foundation Inc
Original Assignee
Georgia State University Research Foundation Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Georgia State University Research Foundation Inc filed Critical Georgia State University Research Foundation Inc
Publication of CN103299193A publication Critical patent/CN103299193A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103299193B publication Critical patent/CN103299193B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
    • A61B5/1455—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue using optical sensors, e.g. spectral photometrical oximeters
    • A61B5/14551—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue using optical sensors, e.g. spectral photometrical oximeters for measuring blood gases
    • A61B5/14556—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue using optical sensors, e.g. spectral photometrical oximeters for measuring blood gases by fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/108331—Preservative, buffer, anticoagulant or diluent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了分析物传感器、分析物传感器的生产和使用方法、检测和/或测量分析物活性的方法、检测pH变化的方法和/或控制系统中的分析物浓度的方法。根据本发明公开内容的分析物传感器的实施方案可提供用于在体内和体外环境中、尤其是在活细胞成像中表征分析物活性、检测pH变化、控制系统中的分析物浓度等的准确而方便的方法。

Description

分析物传感器、制备和使用所述传感器的方法、以及检测分析 物活性的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年10月19日提交的名为“ANALYTE SENSORS,METHODS FORPREPARING AND USING SUCH SENSORS,AND METHODS OF DETECTING ANALYTE ACTIVITY”的美国临时专利申请序列号61/394,501的优先权，其通过引用在此全文并入。本申请还要求2011年8月23日提交的名为“ANALYTE SENSORS,METHODS FOR PREPARING AND USING SUCHSENSORS,AND METHODS OF DETECTING ANALYTE ACTIVITY”的美国临时专利申请序列号61/526,420的优先权，其通过引用在此全文并入。
技术领域
本公开内容涉及用于检测金属离子分析物的包含分析物结合区域和荧光多肽的融合蛋白分析物传感器，以及其在体内和体外的使用方法。
序列表
本公开内容包括通过引用全文并入本文的序列表。
背景技术
Ca2+是人体内最普遍的信号传导分子，其可以通过在亚细胞区室之间以不同幅度和持续时间流通来调节许多生物学功能，这些生物学功能包括心搏、肌肉收缩、神经功能、细胞的发育和增殖[1]。基于膜的细胞器内质网/肌质网（ER/SR）腔占据了小于10%的细胞体积，存储了多于90%的胞 内Ca2+，并在控制Ca2+信号传导中起关键作用。它能够产生固有的Ca2+的释放和传播Ca2+的振荡[2-4]。Ca2+动员激动剂，例如ATP、离子霉素、组胺和谷氨酰胺将激活Ca2+受体并泵送例如1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）来将来自ER的Ca2+释放到细胞质中[5-7]，这导致了ER Ca2+的快速下降（从处于静止状态的mM到激发状态的μM）。去除这些激动剂将有助于Ca2+通过膜通道诸如肌（内）质网Ca2+-ATP酶（SERCA）来重新填充ER。Ca2+浓度的交替通过结合Ca2+后发生的构象变化激活了多种细胞内的Ca2+传感（触发）蛋白，例如钙调蛋白（CaM）、肌钙蛋白C（TnC）和其它离子通道[8]。这些被激活的Ca2+传感器受体将会进一步调节许多细胞过程和活动。最近的研究表明，Ca2+信号传导对于心血管功能的内稳态处理非常重要[9-11]。在心肌细胞内，心脏的舒张和收缩是由胞内Ca2+浓度的周期性变化和与肌质网（SR）、ER的同系物相关的蛋白质来调节的[12、13]。在该激动剂诱导的过程中，心脏利阿诺定受体（RyR2）、(1,4,5)-三磷酸肌醇受体（IP3R）和肌质网Ca2+-ATP酶2a（SERCA2a）是Ca2+动员的三个关键的入口。由这两种蛋白质的功能障碍引起的心力衰竭与异常的Ca2+处理相关，并在从动物和人中收集的数据中变得日益明显[14-17]。监测具有快速释放动力学的ER/SR Ca2+浓度的Ca2+指示剂，以及定量检测在特定的亚细胞器中的Ca2+信号传导的能力，将在理解Ca2+信号传导的分子基础和心脏发育的内稳态以及疾病方面具有显著的影响。
在质膜透化活细胞内使用Ca2+染料Mag-fura-2实现了对ER Ca2+动力学的初始测量。与Ca2+染料相比，具有遗传编码的发色团的基于荧光蛋白（FP）的Ca2+指示剂可以在亚细胞器中以高时空分辨率检测Ca2+信号传导。它们由Ca2+调制蛋白（钙调蛋白或肌钙蛋白C）组成，Ca2+调制蛋白连接到单个荧光蛋白上以生成传感器，例如GCaMP（11）、或双荧光蛋白，例如Cameleon。对Cameleon在其Ca2+结合环或CaM的肽相互作用表面的修饰生成了几种ER/SR传感器，这些ER/SR传感器已经应用到可激发细胞上，带有一些限制。直接监测可激发细胞中的快速ER/SR Ca2+动力学仍然是一个新的领域。
作为第二信使，钙离子通过与蛋白质相互作用调节不同的胞内区室中 的许多生物学过程。钙参与肌肉收缩（包括心跳）、视觉和神经元信号传导。钙结合蛋白表现出不同的钙结合亲和力，Kd在从0.1μM到mM的范围内，这对于它们通过钙和钙内稳态的时空变化对各种刺激做出反应而言是必需的。例如，具有多个钙结合位点的细胞外钙调制蛋白，例如钙粘着蛋白和钙传感受体，具有在亚毫摩尔到毫摩尔范围内的解离常数。肌集钙蛋白是一种在内质网（ER）中的主要的钙结合蛋白，它具有相对弱的钙结合亲和力，使得它能够释放或结合在ER钙存储库中的钙。
具有静止Ca2+浓度的内质网（ER）作为主要的细胞内Ca2+存储库起作用，其能产生同步的Ca2+释放和传播Ca2+波。Ca2+动员激动剂，例如ATP、组胺和谷氨酰胺，以及第二信使例如IP3和cADPR产生了以限定的时空模式的胞质Ca2+浓度（[Ca2+]c）的增加。Ca2+从ER存储库中释放导致了[Ca2+]c的快速增加（从处于静止状态的大约10-7M到处于激发状态的大约10- 6M），这激活了多种胞内Ca2+传感（触发）蛋白，包括钙调蛋白（CaM）、肌钙蛋白C（TnC）和其它离子通道和酶（Protein Sci.7：270-282）。尽管钙遍及生物系统的普及是众所周知的，并且人们已经进行了大量的努力，但是主要由于天然蛋白质中的钙依赖性构象变化和协作钙结合，限制了钙对蛋白质的生物学功能、稳定性、折叠、动力学特性的调节作用的理解。
对钙结合的关键决定因素的研究一直努力持续了几十年。有几种因素，例如钙配体的类型、电荷、排列，已经证明这些在钙结合中是重要的。钙主要被来自Asp、Asn和Glu侧链的氧原子、主链羰基和蛋白质中的溶剂水分子螯合；五角双锥几何结构是最常见的结合几何结构。由于钙结合的静电特性，带电荷的Asp和Glu最常出现在钙结合位点。在配位层中的电荷数在钙结合的亲和力方面也起作用。另外，具有负电性更大的环境引起了对于给定的钙位点的更强的结合亲和力，且该静电环境影响了在多位点系统中的协同性。对于这些多位点蛋白质而言，表观钙亲和力含有来自金属间的相互作用和结合位点的协同性的贡献。然而，对于钙结合的关键因素的定量估算尚未建立。因此，对于钙结合的关键决定因素的系统研究需要一个新的策略和模型系统。
目前为止，监测钙对大量的细胞过程的影响仍然是一个难题，这是由 于许多因素，例如来自内源蛋白质的干扰和原始钙信号通路的扰乱。虽然具有从60nM到数百微摩尔范围的结合亲和力的市购染料通过简单的温育可以载入哺乳动物细胞中，但是它们不能以可预测的量被靶向于特定的细胞区室，使得难以精确地确定染料的浓度和监测钙的浓度。这些染料中有许多已被证明在细胞中具有缓冲效果，并且不提供厚组织、完整生物体或非哺乳动物细胞必需的灵敏度。可以直接由细胞表达并且可靠地靶向于特定的亚区室的基于蛋白质的钙传感器已经用于各种细胞类型，包括哺乳动物和细菌。发光蛋白质首先应用于监测在不同的细胞环境中的钙响应。然而，发光蛋白质需要不断地添加在每次反应后都被消耗掉的腔肠素。
后来使用两种不同颜色的荧光蛋白或它们的变体与钙调蛋白结合肽和钙调蛋白连接开发出了基于FRET的钙传感器（Cell Calcium22：209-216；Nature，388：882-887）。为了避免使用必需的触发蛋白钙调蛋白，使用了肌钙蛋白C（TnC）来感测在荧光蛋白的FRET对中的钙浓度的变化。为了解决有关内源蛋白质的竞争和使用必要的蛋白质如钙调蛋白和肌钙蛋白C的天然钙信号系统的扰乱以及潜在的天然钙信号网络扰乱的主要问题，对钙调蛋白结合位点和钙调蛋白进行了修饰以降低相互作用（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17404-17409；Chem.Biol.13：521-530）。因此，仍然需要开发不使用天然钙结合蛋白的钙传感器来监测钙在细胞中的时空变化，特别是在高浓度细胞器例如内质网中。
内质网/肌质网的钙信号传导对于肌肉收缩、脑活动和所有其它与钙的不正确处理相关的疾病的研究而言是至关重要的。不同于细胞质在细胞中的总体积，ER/SR具有充分界定的外形并且仅仅占细胞总体积的3%，这在没有高度特定靶向的钙指示剂的情况下对于研究而言很具有挑战性。不幸的是，只公布了少数遗传编码的ER钙传感器，并且所有的Kd都被缩小到大约几十微摩尔，然而众所周知在骨骼肌细胞的SR中的游离钙的浓度为大约1mM，并由肌集钙蛋白结合了额外的20mM钙。对设计一种具有较低结合亲和力的SR钙传感器存在强烈的需求，其适合于测量在肌肉细胞或组织中的SR钙。理想的是，钙结合亲和力应该在大约1mM或亚毫摩尔的范围内，类似于SR钙缓冲蛋白肌集钙蛋白的总的钙结合亲和力， 这是基于例如fura-2、camelone和GcamP2等胞质钙指示剂呈现出大约亚微摩尔的Kd的策略，这与钙调蛋白的Kd在相同的数量级内。
基于钙调蛋白的钙传感器的荧光变化高度依赖于钙结合形式的钙调蛋白和M13肽之间的相互作用，这是具有几个不同的结合过程的庞大复合物（bulk complex）。钙与钙调蛋白的C域和N域的结合亲和力在不同的数量级。此外，holo形式的钙调蛋白与M13肽的相互作用将为整个结合过程增加额外的Kd，因此，该传感器的表观Kd不是直接来自钙结合，而是以来自钙和钙调蛋白的相互作用的具有不同数量级的两个Kd和来自钙调蛋白和M13肽的相互作用的相继Kd的混合物。基于钙调蛋白的钙指示剂不能定量地测量钙的变化，因为D1ER结合过程的等式包括几个常数例如Kd1、Kd2和希尔系数，它们是很难原位测量的。而且，CaM和M13肽相互作用的动力学由于复杂的延迟而不能进一步加速。
发明内容
本发明方法的实施方案通过以定点诱变在GFP上创建Ca2+结合位点提供了设计的Ca2+生物传感器，其不仅克服了现有的Ca2+传感器的限制，而且还可以用于具有不同光学特性的各种其它荧光蛋白中，以用于在组织和动物成像中的进一步的应用，并精确测量在ER中的实时Ca2+浓度，这增强了我们对在ER中的与其生物学功能相关的Ca2+信号传导的理解。本公开内容的实施方案提供了具有不同的信号肽和多个量级的结合亲和力的增强的传感器，其可有助于检测对在不同细胞类型的各种亚细胞器中的不同激动剂的Ca2+信号响应。
因此，本公开内容的一个方面涵盖一种工程化荧光主体多肽（engineeredfluorescent host polypeptide）的实施方案，该工程化荧光主体多肽具有包括多个带负电荷的残基的金属离子结合位点，其中带负电荷的残基包括定位在五角双锥几何结构中的多个羧基氧，其中，所述几何结构提供了金属离子结合位点，金属离子结合位点与工程化荧光主体多肽的发色团区域可操作地相互作用，使得金属离子分析物与分子识别基序的结合对由荧光主体多肽发出的荧光信号的发射进行调制，并且任选地，对工程 化荧光主体多肽的吸收光谱进行调制。
本公开内容的另一个方面涵盖一种组合物的实施方案，该组合物包括分析物传感器的实施方案，其中该组合物可以配制成用于检测测试样品中的分析物。
本公开内容的又一方面涵盖一种试剂盒的实施方案，该试剂盒包括根据本公开内容的分析物和包装，该包装包括由分析物传感器检测分析物的分析物传感器的使用说明书。
本公开内容的再一个方面涵盖用于检测分析物的方法的实施方案，包括：（i）提供根据本公开内容的分析物传感器；（ii）提供怀疑包含分析物的测试样品，分析物对分析物传感器的分子识别基序具有亲和力；（iii）在怀疑包含分析物的测试样品不存在的情况下检测从分析物传感器发出的第一荧光信号，分析物对所述分析物传感器的分子识别基序具有亲和力；（iv）使该分析物传感器与测试样品接触；（v）检测由与测试样品接触的分析物传感器发出的第二荧光信号；以及（vi）比较第一荧光信号和第二荧光信号，其中信号的比率变化（ratiometric change）指示测试样品中的分析物与分析物传感器相互作用。
本公开内容的又一个方面涵盖编码根据本公开内容的分析物传感器的重组核酸的实施方案。
本公开内容的另一个方面涵盖用于表征分析物的细胞活性的方法的实施方案，包括：（i）提供包括表达根据权利要求1所述分析物传感器的重组核酸的遗传修饰的细胞；（ii）在该遗传修饰的细胞中表达分析物传感器，并测量从分析物传感器产生的信号；（iii）检测由分析物传感器发出的第一荧光信号；（iv）在诱导细胞中的生理事件之后，检测由分析物传感器发出的第二荧光信号；以及（v）比较第一荧光信号和第二荧光信号，其中信号的比率变化指示与细胞中的生理相关联的细胞中的分析物的水平的变化。
附图说明
参照下文的本发明各个实施方案的详述并结合附图将会更容易地理解本发明的其他方面。
图1A和图1B示出了基于1ema.pdb的基于EGFP的Ca2+传感器的模型结构。所有的Ca2 +传感器都由整合到增强的绿色荧光蛋白（EGFP）中的Ca2+结合基序构成。
图1A示出了多种GFP变体的域结构。CRsig：钙网蛋白信号肽MLLSVPLLLGLLGLAAAD（SEQ ID No.：112）；KDEL：ER保持信号；kz：在哺乳动物细胞中的最佳翻译起始的Kozak共有序列。构建体Ca-G1和Ca-G2包含侧翼序列。Ca-G1′、Ca-G2′和Ca-G3′不包含侧翼序列。
图1B示意性地示出了EGFP中的Glu172-Asp173（位置1）、Gln157-Lys158（位置2）和Asn144-Tyr145（位置3）的拓扑结构。
图2A示出了EGFP-wt及其变体的可见光吸光度。蛋白质浓度为20μM。
图2B示出了EGFP-wt及其变体的荧光光谱。蛋白质浓度为10μM；用于激发和发射的狭缝宽度均为1nm。λex＝398nm。
图3A-图3D示出了Ca2+传感器Ca-G1-37的光谱表征。
图3A示出了在各种Ca2+浓度下传感器Ca-G1-37在17μM处的可见吸收光谱。箭头指示了由Ca2+浓度的增加引起的信号变化的方向。
图3B示出了在各种Ca2+浓度下在1.7μM处以λex=398nm激发的荧光发射谱的Ca2+依赖性。激发和发射的狭缝宽度分别为1nm和2nm。箭头指示了由Ca2+浓度的增加引起的信号变化的方向。
图3C示出了在各种Ca2+浓度下在1.7μM处以λex=490nm激发的荧光发射谱的Ca2+依赖性。激发和发射的狭缝宽度分别为1nm和2nm。箭头指示了由Ca2+浓度的增加引起的信号变化的方向。
图3D是表示Ca2+滴定数据的标准化的F（398nm）/F（490nm）比率曲线拟合图。
图4A示出了在存在有Cu2+（0.1μM）、Zn2+（0.1mM）、Mg2+（10.0mM）、 Tb3+（5.0μM）和La3 +（5.0μM）的情况下的Ca-G1-37的Ca2+响应。在1.0mM Ca2+存在的情况下以398nm和490nm激发的Ca-G1-37的荧光发射的比率通过使用等式（5）来标准化这些值。
图4B示出了在存在有胞内分子：ATP（0.2mM）、ADP（0.2mM）、GTP（0.1mM）、GDP（0.1mM）和GSH（1.0mM）的情况下的Ca-G1-37的Ca2+响应。在1.0mM Ca2+存在的情况下以398nm和490nm激发的Ca-G1-37的荧光发射的比率通过使用等式（5）来标准化这些值。
图5A-图5D示出了Ca2+与Ca-G1相关联的动力学分析。图5A：示出了当快速混合Ca-G1（最终浓度为20μM）和所示浓度的Ca2+时的荧光增加（λex＝398nm）的停流痕迹。图5B：观察到的作为Ca2+浓度的函数的荧光增加的速率。图5C：在图5A中观察到的作为Ca2+浓度的函数的荧光强度幅度的最大变化。图5D：示出了当快速混合预装有0.8mM Ca2+的40μM Ca-G1时的荧光减少（λex＝398nm）的停流痕迹。使用455nm的长通滤光片来收集在510nm具有主峰的发射。分别将数据拟合到等式6（图5A和图5D）、等式8（图5B）和等式2（图5C）。
图6A-图6D是一系列的数字图像，示出了传感器Ca-G1-ER在HeLa和BHK-21细胞中的定位。图6A：示出了Ca-G1-ER的定位；图6B：示出了DsRed2-ER的定位；图6C：示出了在HeLa细胞中的Ca-G1-ER和DsRed2-ER的重叠；图6D：示出了在BHK-21细胞中的Ca-G1-ER的定位。Ca-G1-ER和DsRed2-ER定位的共焦图像在绿色通道是使用氩激光488nm线，而在红色通道是使用氦氖激光的543nm线。比例条指示10μM。
图6E和图6F示出了在BHK-21细胞中的传感器Ca-G1-ER的钙响应。图6E：响应于不同处理的Ca2+响应的时间进程。图6F：在ER中的Ca2+浓度的伪校准。时间进程表示为以385nm和480nm激发的在510nm处荧光发射比率。在图6E和图6F中，左侧的纵坐标均表示在510nm处的荧光发射比率（385nm和480nm激发）；在图6F中，右侧的纵坐标表示在ER中的经校准的Ca2+浓度。
图7示出了在10mM Tris和1mM DTT（pH7.4）中的EGFP-wt及其变体的CD光谱。用于CD实验的蛋白质浓度为10μM。
图8A示出了在各种pH值下的Ca-G1′的可见吸收光谱。在1mM DTT和10mM MES（pH5.0、5.5、6.0）、10mM PIPES（pH6.5、7.0）、以及10mM Tris（pH7.4、8.0、9.0）中进行了测量。
图8B示出了在各种pH值下的Ca-G1′的曲线拟合。
图9A示出了通过计算机设计添加有EGFP.D2（位点1）或通过将来自钙调蛋白的EF手型基序III插入到位置172-173中添加有EGFP-G1（172EF）的钙结合荧光蛋白的模型结构。参与形成发色团的残基是突出显示的。在发色团周围的EGFP的结构基于1EMA.pdb。
图9B示出了经修饰的接枝EGFP传感器的模型结构。将一个EF手插入到EGFP的荧光敏感位置，产生了EGFP-G1。在β片层表面上的位点定向诱变引入了带负电荷的残基以形成具有三个存在的带负电荷的残基的Ca2+结合位点。
图10是表示分别在30℃（空心柱）和37℃（实心柱）下在200mM IPTG诱导之后22小时的EGFP及其变体在大肠杆菌（E.coli）BL21-DE3中的表达的图。λex=488nm。
图11是一系列的数字图像，该数字图像示出了HeLa细胞的荧光显微镜成像。在HeLa细胞用EGFP-G1、EGFP-G1-C2和EGFP-G1-C3转染之后，成像进行了2天（48小时）。曝光时间为200ms。
图12A是表示分别在30℃和37℃下的HeLa细胞中的EGFP-D2系列表达的图。在蛋白质转染后两天获得了不同细胞团在510nm处的荧光强度。λex＝488nm。
图12B是表示分别在30℃和37℃下的HeLa细胞中的EGFP-G1系列表达的图。在蛋白质转染后两天获得了不同细胞团在510nm处的荧光强度。λex＝488nm。
图13A示出了EGFP、EF-172和位点1的可见吸收光谱。蛋白质的浓度为2mM。
图13B示出了EGFP、EF-172和位点1的荧光光谱。蛋白质的浓度为2mM。用于激发和发射的狭缝宽度均为1nm；λex＝488nm。
图14示意性地示出了基于GFP的钙结合蛋白（pdb1b9c）。GFP.D1的结合几何结构显示为″球和棒″。D2显示为圆形。还示出了具有野生型残基的GFP.D3的位置。
图15A是表示在大肠杆菌中表达的EGFP、GFP.D1、GFP.D2、GFP.D2′和GFP.D2′′的吸光光谱的图表，该图表表明GFP.D1的发色团没有形成。
图15B示出了EGFP、GFP.D1、GFP.D2、GFP.D2′和GFP.D2′′的远紫外CD光谱，表明了在216nm处具有最大负值的β片层二级结构的形成。
图16是一系列的数字图像，这些数字图像示出了表达：（a）野生型EGFP；（b）GFP.D1；和（c）GFP.D2的HeLa细胞的倒置的荧光显微图像。
图17A示出了在482nm处激发下的大肠杆菌中表达的GFP.D2的钙诱导发色团发射的变化。使用1∶1结合等式（等式2.3）的数据拟合给出了107μM的Kd。
图17B示出了在552nm处激发下的若丹明-5N与GFP.D2之间竞争钙结合荧光发射。插图示出了若丹明-5N的光谱与Ca2+浓度变化。
图17C示出了在20mM PIPES、10mM KCl、1mM DTT、1%甘油、pH6.8的假定1∶1结合的逐渐增加的铽浓度中的3μM GFP.D1的荧光变化。插图示出了在545nm处的光谱峰值的增加。
图17D示出了GFP.D1的金属竞争。
图18示出了加载有Pb2+和Ca2+的EGFP变体C2和C4的竞争滴定。
图19A示出了使用加载Ca2+的EGFP变体C2对过量的Pb2+的滴定。随着Pb取代了Ca，信号强度下降。
图19B示出了C2-Pb复合体的曲线拟合以定量Kd。C2-Pb2+的Kd为2μM，Ca2+的为440μM。
图19C示出了EGFP/Pb2+复合体的曲线拟合以定量Kd。Kd为3.5μM。
图19D示出了C2-Gd复合体的曲线拟合以定量Kd。Gd3+的Kd为2.0μM。
图20A-图20L示出了Ca2+生物传感器变体的结构和在体外的光学性 能。
图20A示意性地示出了具有显示为球体的发色团（CRO）的野生型EGFP（1EMA）的截短结构（左图）。从紧靠发色团的表面突出的残基147、202、204、223和225侧链突变形成Ca2+结合配体。参与与发色团质子相互作用的关键残基H147、T203和E222位于经设计的Ca2+结合位点附近。
图20B示出了负责Ca2+螯合的5个残基的空间分布。
图20C示出了在图20B中所示出的5个残基的空间组织和它们与EGFP分子中的发色团的关系，该EGFP分子显示了非酸性残基。
图20D-图20H分别示出了构建体D8、D9、D10、CatchER和D12，并示出了分别在残基S147、S202、Q204、F223和T225处的取代。
图20I示出了野生型EGFP和Ca2+传感器D8到D12的吸收光谱，并在280nm处具有标准化的吸收峰。Ca2+传感器D8到D12在398nm处呈现出了主要的吸收峰，在490nm处示出了较低的吸收峰。
图20J示出了Ca2+传感器D8到D12和野生型EGFP在395nm和488nm处的吸光度强度的比例。所述比例随着引入的带负电荷的残基的数目而增加。
图20K示出了EGFP变体响应于Ca2+的荧光强度变化，记录在510nm处发射和和488/395nm处激发，用10μM EGTA（黑色/灰色柱）或5mM Ca2+（红色/蓝色柱）。在存在有10μM EGTA的情况下，EGFP在510nm处具有最大发射，在488nm处被激发，并标准化为1.0。
图20L示出了D9、D10和CatchER的带负电荷的残基数目和表观Ca2+解离常数（Kd）之间的相关性，该相关性通过在存在（方块）和不存在（圆形）100mM KCl下用荧光滴定来测量。
图21A-图21E示出了在体外的CatchER的光学表征。
图21A示出了响应于增加的Ca2+浓度的发射光谱。
图21B示出了CatchER表观Kd，该CatchER表观Kd是通过在存在或不存在100mM KCl的情况下的荧光响应，或在存在10mM KCl（黑色） 的情况下通过异核单量子相干（HSQC）光谱中的残基Y143的主链化学移位变化来确定的。滴定结果拟合到1:1的结合模式中。
图21C示出了在存在1mM Ca2+的情况下的各种生理分子：20mM Na+、100mM K+、2μMCu2+、2μM Zn2+、1mM Mg2+、0.2mM ATP、0.1mM GTP和0.1mM GDP的荧光响应。在不存在其它金属的情况下将这些值标准化到1mM Ca2+。在510nm处发射最大；在488nm处激发。
图21D示出了在395nm处激发下记录的各种Ca2+浓度的10μM CatchER的停流荧光。测量CatchER在0mM Ca2+中的荧光响应来作为基线。
图21E示出了显示了在快速地混合加载Ca2+的CatchER与200μM EGTA时下降的荧光的停流痕迹。在510nm处发射。
图22A示出了在[Ca2+]＝0、0.5、1、2、4和6mM时的交叉峰Y143的代表性化学位移，与响应于Ca2+的0.3mM CatchER的2D[1H-15N]HSQC光谱重叠。
图22B示出了由Ca2+滴定诱导的Q69化学位移扰动。在加入2mM Ca2+之后，较小的峰从最初的单个峰中分离出来，并且随着Ca2+浓度从1mM增加到6mM，峰b与峰a的积分比例从0增加到2.27。
图22C示出了在Ca2+饱和形式与Ca2+游离形式之间在将主链酰胺质子和氮组合时的组合的化学位移变化。Ca2+影响与发色团相互作用或靠近经设计的Ca2+结合位点的残基。对溶剂高度可及的Y182和在柔性C端的G228也表现出大于0.2ppm的化学位移变化。根据EGFP，CatchER的二级结构被标记在顶部。在37℃下以10mM Tris、10mM KCl、pH7.4中的300μM15N标记的样品使用600MHz NMR光谱仪来记录所有数据。
图23A示出了用CatchER监测的C2C12成肌细胞内质网Ca2+动力学。由林格氏缓冲液冲洗间隔的两次100μM ATP（pH7.0）引起了对于没有胞外Ca2+或EGTA的完整成肌细胞的两种代表性的荧光响应。
图23B示出了与在图23A中所示出的同一批细胞，当在胞内缓冲液中用25μM毛地黄皂苷渗透3分钟，并依次用IP3、细胞内缓冲液冲洗、毒 胡萝卜素、IP3（箭头）、冲洗（三角形）、和离子霉素（箭头）进行处理。
图23C示出了共表达CatchER和mCherry-ER的C2C12的代表性的荧光成像。
图23D示出了对于4-氯-间甲酚（4-CmC）应用的CatchER（顶部）和mCherry-ER（底部）荧光响应。示出了在图23C中的对应的成像的时间点。
图23E示出了在存在或不存在毒胡萝卜素的情况下4-CmC诱发的Ca2+的释放。
图24示出了由Fura-2检测的4-CmC诱发的胞质Ca2+的变化。
图25A-图25N示出了纯化的细菌表达的基于EGFP的传感器响应于Ca2+的荧光和UV吸光度变化，证明传感器动态范围的调整。
图25A示出了在存在10μM EGTA（实线）或5mM Ca2+（虚线）的情况下EGFP从220nm到600nm的重叠吸收光谱。
图25B-图25F示出了在存在10μM EGTA（实线）或5mM Ca2+（虚线）的情况下基于EGFP的传感器D8、D9、D10、CatchER和D12从220nm到600nm的吸收光谱。响应于Ca2+，D9、D10和CatchER（C-E）的最大吸光度在488nm处增加，在395nm处降低。
图25G示出了在存在10μM EGTA（实线）或5mM Ca2+（虚线）的情况下由荧光计测量的EGFP从500nm到600nm的重叠荧光发射光谱。在顶部的这两个重叠发射光谱在488nm处激发，或在395nm处（底部）激发。
图25H-图25L分别示出了基于EGFP的传感器D8、D9、D10、CatchER和D12的荧光发射光谱。
图25M是表示响应于Ca2+的EGFP和经设计的变体在488nm（黑色柱）和395nm（灰色柱）处激发的在510nm处的荧光发射变化的幅度对比图表。幅度的变化是按照（FHolo/FApo-1），FHolo和FApo分别表示在存在5mM Ca2+和10μM EGTA的情况下的吸光度强度。D9、D10、CatchER和D12的在488nm和395nm处激发的在510nm处的非比率荧光变化呈现为柱 中的正值。
图25N是表示响应于Ca2+的EGFP及其变体在488nm（黑色柱）和395nm（灰色柱）处的吸光度变化的幅度对比图表。幅度的变化是按照（AHolo/AApo-1），AHolo和AApo分别表示在存在5mM Ca2+和10μM EGTA的情况下的吸光度强度。响应于Ca2+的D9、D10和CatchER的在488nm和395nm处的比率吸光度变化在柱中分别呈现为正值和负值。所有的变体在280nm处的吸光度都标准化为1。
图26A-图26G示出了通过测量基于荧光强度的pH依赖性的表观pKa值来确定的在结合Ca2+之前或之后的CatchER的pH稳定性，CatchER和Ca2+之间的化学计量相互作用是由Job曲线（Job’s Plot）来确定的。
图26A示出了在510nm处的荧光发射强度是在488nm处激发下在对应的pH值下在10μM EGTA（圆形）或4mM Ca2+（正方形）存在的情况下记录的。表观pKa为7.59±0.03（EGTA）和6.91±0.03（Ca2+）。
图26B示出了在395nm处激发的510nm处的荧光发射强度的pH依赖性。表观pKa为7.14±0.02（EGTA）和6.95±0.06（Ca2+）。
图26C示出了由作为CatchER浓度的函数的荧光（F488,F395）和吸光度（A488）来确定的结合Ca2+的CatchER的相对量的Job曲线。
图26D示出了图26C中的Job曲线的数值结果。
图26E示出了在488nm处激发的响应于[Ca2+]（以μM）=11.3、16.7、20.6、24.9、28.4（虚线）的以μM28.7、23.3、19.4、15.1和11.6（实线）的CatchER浓度的荧光光谱。
图26F示出了在395nm处激发的响应于[Ca2+]（以μM）=11.3、16.7、20.6、24.9、28.4（虚线）的以μM28.7、23.3、19.4、15.1和11.6（实线）的CatchER浓度的荧光光谱。
图26G示出了在不存在（实线）或存在（虚线）Ca2+的情况下的相应的吸光度变化。
图27A和图27B示出了通过平衡透析法和电感耦合等离子体发射光谱 仪（ICP-OES）测出的CatchER对Ca2+的结合。
图27A示出了ICP-OES（电感耦合等离子体发射光谱法）的代表性光谱，以确定肌红蛋白、EGFP、CatchER和α-乳白蛋白样品分别在透析管（缓冲液）外侧和在透析管内侧的总的Ca2+浓度（结合的和未结合的），在370.602nm处具有最大强度。每个光谱都是带有误差线的三次重复平均值，各样品的峰强度的幅度代表Ca2+的浓度。
图27B示出了由ICP-OES确定的每个样品的Ca2+浓度的对比。将在396.847、373.690、219.779、370.602、317.933、643.907和220.861nm处记录的峰强度转化成Ca2+浓度，分别由在每个波长处的预先确定的Ca2+标准的线性曲线较准。在透析管外侧的缓冲液的Ca2+浓度为60.4±0.7μM（未结合的），含有肌红蛋白、EGFP、CatchER和α-乳白蛋白的内侧（结合的和未结合的）分别为61.5±1.2、64.5±1.1、74.6±1.5和79.1±1.7μM（结合的和未结合的）。
图28A-图28C示出了使用高场核磁共振光谱法测量出的随着旋转相关时间τC的CatchER的单体化。
图28A示出了由SCT-CCR实验直接确定（灰色正方形）或由等式（16）和（17）来计算（黑色圆形）的τC，该SCT-CCR实验是在800MHz NMR光谱仪上执行的，等式（16）和（17）中弛豫时间T1、T2是在600MHz NMR光谱仪上确定的。相应残基的二级结构在上方标记出。
图28B示出了在0、30、60、100、240、480、720、1000和1500ms T1延迟处收集的峰积分的代表性拟合。
图28C示出了来自所选区域的T1延迟光谱的重叠：0ms和1500ms。
图29A-图29H示出了CatchER NMR的分配和Ca2+对残基的影响，该残基与经设计的Ca2+结合位点的相对侧上的发色团相互作用。
图29A示出了从I14到E17的所选的CatchER3D HNCA光谱，其中顺序和残基内的Cα–Cα连接是由红色线表示。
图29B示出了一种CatchER2D{1H-15N}HSQC光谱。
图29C示出了Cα化学位移。呈现超过1.5p.p.m.的化学位移差别的大多数标记的残基都依次接近于发色团或经设计的Ca2+结合位点。1-5号分别表示E147、D202、E204、E223和E225。所有数据都是在37℃下使用800MHz NMR光谱仪以低温探针和10mM Tris、pH7.4中300mM13C-15N双标记样品来记录。
图29D-图29G示出了在0mM Ca2+（黑色）和6mM Ca2+（红色）处所记录的CatchER2D{1H-15N}HSQC光谱。观测到了在6mM Ca2+处的Q94的化学位移变化，但没有观测到R96、F165或V61的化学位移变化。
图29H示出了朝向经设计的Ca2+结合位点的相对侧上的发色团突出的R96、Q94、F165和V61侧链。在37℃下使用10mM Tris和10mM KCl、pH7.4中300μM15N标记样品用600MHzNMR光谱仪来记录数据。
图30A-图30B示出了在HEK-293和C2C12细胞的ER中和FDB纤维的SR中表达的CatchER的定位。
图30A示出了在HEK-293细胞中的CatchER和DsRed2-ER的共定位。CatchER和DsRed2-ER是瞬时共转染的并在两种细胞系中表达用于共聚焦显微镜成像。重叠成像示出了对应于ER跟踪剂DsRed2-ER的CatchER的共定位。
图30B示出了在C2C12细胞中的CatchER和DsRed2-ER的共定位。CatchER和DsRed2-ER是瞬时共转染的并在两种细胞系中表达用于共聚焦显微术成像。重叠成像示出了对应于ER跟踪剂DsRed2-ER的CatchER的共定位。
图31A-图31I示出了HeLa和HEK293细胞的Kd原位确定和内质网Ca2+动力学。
图31A示出了在C2C12成肌细胞的ER中的Kd的原位确定，1-5分别对应于1、3、10和20mM Ca2+和3mM EGTA。
图31B示出了在BHK细胞中的Kd确定。1-7代表0.05、0.1、0.5、1、5和10mM Ca2+和200μM EGTA。在各种细胞外Ca2+浓度下平衡后，转染的透化细胞的CatchER荧光信号在488nm处激发。
图31C示出了以1∶1结合模式的Kd的计算。
图31D示出了由ATP触发的在HeLa细胞中的CatchER所检测出的代表性的ER Ca2+信号传导。
图31E示出了由组胺触发的在HeLa细胞中的CatchER所检测出的代表性的ER Ca2+信号传导。
图31F示出了由CPA触发的在HeLa细胞中的CatchER所检测出的代表性的ER Ca2+信号传导。
图31G示出了由ATP触发的在HeLa细胞中的CatchER所检测出的代表性的ER Ca2+信号传导。
图31H示出了HEK293细胞中由50μm组胺触发的可逆的Ca2+释放。
图31I示出了在存在1mM胞外Ca2+的情况下由2μM毒胡萝卜素诱导的在HEK293细胞中的不可逆的ER Ca2+释放的定量。Fmin和Fmax是在存在5μm的离子霉素的情况下，通过分别向完整的细胞中加入5mM EGTA和50mM Ca2+来确定的（n＝6）。
图32示出了CatchER的温度依赖的NMR HSQC光谱变化。
图33示出了由Ca2+触发的CatchER的化学位移变化的1D NMR光谱。
图34示出了Apo_CatchER和Ca2+加载的CatchER的发色团构象变化的X射线晶体结构和相关的吸收光谱（红色是浅灰色、蓝色是深灰色、绿色是中灰色、青色是浅灰色）。
图35示出了Apo_CatchER、Ca2+加载的CatchER和Gd3+加载的CatchER的发色团构象变化的X射线晶体结构（青色为淡灰色、紫色为深灰色、绿色是中灰色）。
这些附图在下面的说明和实施例中进行了更详细的描述。
本公开内容的方法和系统的一些示例性实施方案的细节将在下面的说明中阐述。在查阅了下面的说明书、附图、实施例和权利要求书之后，本公开内容的其它特征、目的和优点对于本领域的技术人员而言将是明显的。所有这些另外的系统、方法、特点以及优点都应当包括在本说明书的 范围内、在本公开内容的范围内、并且由所附权利要求书保护。
具体实施方式
在更详细地描述本公开内容之前，应当理解，本公开内容并不限于所描述的具体实施例，因为这些当然可以改变。还应该理解的是，本文所用术语只是为了描述特定的实施方案，而不是为了限定，因而本公开内容的范围仅受随附的权利要求书限制。
当提供一个数值范围时，应该理解的是，除非文中清楚地另有所指，否则介于该范围的上下限间的每一个中间值、到下限单位的十分之一、和任何其它所说明的或者在所说明范围中的中间值都被包括在本公开内容内。这些较小范围的上下限可独立地被包括在该较小的范围中，也被包括在本公开内容内，经受在所说明范围内任何具体的极限值的排除。当所示出的范围包含该两界限值的其中一者或两者时，除了该些包括的界限值的其中一者或两者以外的范围亦包括在本公开内容内。
除非有另外的限定，否则，本文所使用的所有技术术语以及科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在对本发明的实践中或试验中也可以使用与本文所描述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料，但是现在对优选的方法和材料进行描述。
在本说明书中提到的所有出版物和专利通过引用并入本文，如同各单独出版物或专利具体和单独地显示被通过引用并入并且通过引用并入本文来公开和描述与引用出版物有关的方法和/或物质。任何出版物的引用是为其内容于提交日期之前公开，且不应理解为承认由于先前的公开而使本发明不享受早于这些出版物的权利。此外，所提供的出版日期可能不同于真实的出版日期，真实的出版日期可能需要独立地进行确认。
对于本领域普通技术人员而言，阅读了本公开内容后将明显的是，本文所描述和图示的各个实施方案具有分离的部件和特征，这些部件和特征能够容易地与其它多个实施方案中任意的实施方式的特征分离或合并，而不背离本发明的范围或精神。可以按照所述事件的顺序或按照任何其它合 理可能的顺序来实施任何所述的方法。
除非另外指明，本发明的实施方案将采用医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等的技术，这些是本领域技术人员所熟悉的。这些技术在文献中得到了详尽的解释。
必须指出的是，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文明确地另外指明。因此，例如，提及“一种载体”包括多个载体。在本说明书和所附权利要求书中，对于许多术语的提及应该被定义为具有下列意义，除非相反的意思是明显的。
如本文所用，除非特别指出，下述术语具有所赋予的含义。在本公开内容中，“包括”、“包含”、“含有”和“具有”等可以具有在美国专利法中所赋予的含义，并且可以指“包括”、“包含”等；当应用于本公开内容中涵盖的方法和组合物时，“主要由...组成”或“主要包括”等是指与本文中公开的组合物类似的组合物，但是其可以包含另外的结构基团、组合物组分或方法步骤（或如上所述的其类似物或衍生物）。然而，与本文所公开的相应组合物或方法相比，这种另外的结构基团、组合物组分或方法步骤等不会对组合物或方法的基本特征和新颖特征造成实质性的影响。当应用于本公开内容中涵盖的方法和组合物时，“主要由...组成”或“主要包括”等术语具有在美国专利法中所赋予的意义，并且该术语是开放式的但不包括现有技术的实施方案，允许存在多于所叙述的特征，只要所存在的多于所叙述的特征不改变所叙述的基本或新颖的特征。
定义
在描述和请求保护所公开的主题时，根据以下列出的定义使用下列术语。
在下文中提供了进一步的定义。除非有另外的限定，否则，本文所使用的所有技术术语以及科学术语均具有分子生物学领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在对本发明的实践中或试验中可以使用与本文所描述的方法和材料相似或等价的方法和材料，但是本文对合适的方法和材料进行了描述。
除非另外定义，否则本文所用的所有术语、符号和其他科学术语旨在具有本发明所属领域中技术人员通常理解的意思。在某些情况下，具有通常理解的意思的术语在本文被定义用以澄清和/或易于参考，并且本文这些定义的包括不必被理解为代表与本领域中一般理解本质上的不同。本文描述或提及的技术和程序是本领域技术人员一般充分理解和使用常规方法常用的，如，在Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版.（2001）Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor，N.Y.以及Current Protocols in Molecular Biology（Ausbel等人编著，John Wiley&Sons，Inc.2001）中描述的广泛使用的分子克隆方法。如适当，除非另外指出，否则通常按照生产商定义的方案和/或参数进行涉及可商购获得的试剂盒和试剂的使用的程序。
在本文中使用的术语“多肽”是指蛋白质及其片段。多肽在本文中作为氨基酸残基序列公开。那些序列以从氨基到羧基末端的方向从左到右书写。根据标准命名法，氨基酸残基序列用如下所示的三字母或单字母代码来命名：丙氨酸（Ala，A）、精氨酸（Arg，R）、天冬酰胺（Asn，N）、天冬氨酸（Asp，D）、半胱氨酸（Cys，C）、谷氨酰胺（Gln，Q）、谷氨酸（Glu，E）、甘氨酸（Gly，G）、组氨酸（His，H）、异亮氨酸（Ile，I）、亮氨酸（Leu，L）、赖氨酸（Lys，K）、甲硫氨酸（Met，M）、苯丙氨酸（Phe，F）、脯氨酸（Pro，P）、丝氨酸（Ser，S）、苏氨酸（Thr，T）、色氨酸（Trp，W）、酪氨酸（Tyr，Y）和缬氨酸（Val，V）。
本文中使用的术语“变体”是指不同于参考多肽或多核苷酸、但保留基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体和另一种参考多肽在氨基酸序列上不同。通常，差异是有限的，因而参考多肽和变体的序列整体上非常相似（同源的），并且有许多区域是相同的。变体和参考多肽可以由于一处或多处修饰（例如，取代、添加和/或缺失）而在氨基酸序列上不同。取代的或插入的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码子编码的。多肽的变体可以是天然存在的，例如等位变体，或者它可以是非天然的变体。
可以在本公开内容的多肽的结构中进行修饰和改变，但是仍然生成具有与多肽相似特性的分子（例如，保守性氨基酸取代）。例如，某些氨基 酸可以取代序列中的其它氨基酸，而不明显损失活性。因为多肽的相互作用能力和本质决定了该多肽的生物学功能活性，所以可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代，而仍然获得有相似性质的多肽。
在做出这些改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予多肽相互作用生物功能中的重要性是本领域中一般理解的。已知某些氨基酸可取代具有类似亲水指数或分数的其它氨基酸，并仍然获得有相似生物活性的多肽。各氨基酸基于其疏水性和电荷特性分配有亲水指数。这些指数为：异亮氨酸（+4.5）、缬氨酸（+4.2）、亮氨酸（+3.8）、苯丙氨酸（+2.8）、半胱氨酸/半胱氨酸（+2.5）、甲硫氨酸（+1.9）、丙氨酸（+1.8）、甘氨酸（-0.4）、苏氨酸（-0.7）、丝氨酸（-0.8）、色氨酸（-0.9）、酪氨酸（-1.3）、脯氨酸（-1.6）、组氨酸（-3.2）、谷氨酸（-3.5）、谷氨酰胺（-3.5）、天冬氨酸（-3.5）、天冬酰胺（-3.5）、赖氨酸（-3.9）和精氨酸（-4.5）。
人们相信氨基酸的相对亲水特性决定了所得多肽的二级结构，而多肽的二级结构又限定了多肽与其它分子例如酶、底物、受体、抗体、抗原等的相互作用。在本领域已知，氨基酸可被具有类似亲水指数的另一种氨基酸取代且仍获得功能相当的多肽。在这种改变中，优选的是亲水指数在±2以内的氨基酸取代，尤其优选的是在±1以内，甚至更为尤其优选的是在±0.5以内。
取代相似氨基酸也可在亲水性基础上进行，尤其是当由此产生的生物功能相当的多肽或肽打算用于免疫学的实施方案时。分配给氨基酸残基的亲水性值为以下：精氨酸（+3.0）、赖氨酸（+3.0）、天冬氨酸（+3.0±1）、谷氨酸（+3.0±1）、丝氨酸（+0.3）、天冬酰胺（+0.2）、谷氨酰胺（+0.2）、甘氨酸（0）、脯氨酸（-0.5±1）、苏氨酸（-0.4）、丙氨酸（-0.5）、组氨酸（-0.5）、半胱氨酸（-1.0）、甲硫氨酸（-1.3）、缬氨酸（-1.5）、亮氨酸（-1.8）、异亮氨酸（-1.8）、酪氨酸（-2.3）、苯丙氨酸（-2.5）、色氨酸（-3.4）。应当理解，氨基酸可由具有类似亲水性值的另外氨基酸所取代，且仍获得生物学相当的、尤其是免疫学相当的多肽。在这样的改变中，优选的是亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，尤其优选的是亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，甚至更尤其优选的是亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上文所述，氨基酸取代通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷和大小等。考虑到上述特征的一种或多种的示例性取代是本领域技术人员熟知的，包括但不限于（原始残基：示例性取代）：（Ala:Gly,Ser）、（Arg:Lys）、（Asn:Gln,His）、（Asp:Glu,Cys,Ser）、（Gln:Asn）、（Glu:Asp）、（Gly:Ala）、（His:Asn,Gln）、（Ile:Leu,Val）、（Leu:Ile,Val）、（Lys:Arg）、（Met:Leu,Tyr）、（Ser:Thr）、（Thr:Ser）、（Trp:Tyr）、（Tyr:Trp,Phe）和（Val:Ile,Leu）。因此，本公开内容的实施方案考虑如上所述的多肽的功能等同物或生物学等同物。特别地，多肽的实施方案可以包括与目的多肽具有约50%、60%、70%、80%、90%和95%的序列同一性的变体。
本文所用的术语“同一性”是指通过序列比较确定的两种或多种多肽序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还指多肽之间的序列相关性的程度，这是通过这些序列的链之间的匹配来确定的。“同一性”和“相似性”可以通过已知的方法容易地计算，这些已知的方法包括但不限于描述在下列文献中的那些方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编著，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing:Informaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，编著，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编著，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；以及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编著，M Stockton Press，New York，1991；以及Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J AppliedMath.，48:1073，（1988）。
确定同一性的优选方法被设计为给出在所测试的序列之间的最大匹配。用于确定同一性和相似性的方法编纂在公众可获得的计算机程序中。两个序列之间的同一性百分比可以通过使用结合了Needelman和Wunsch（J.Mol.Biol.，48：443-453，1970）算法（例如NBLAST和XBLAST）的分析软件（即，遗传学计算机组的序列分析软件包，Madison Wis）来确定。本发明的多肽的同一性使用默认参数来确定。
举例来说，多肽序列可以与参考序列相同，也就是说100%相同，或 者同参考序列相比它可包括多达某一整数个的氨基酸改变，因此%同一性小于100%。这样的改变选自：至少一个氨基酸缺失、取代（包括保守取代和非保守取代）或插入，并且其中所述的改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或在这些末端位置之间的任意位置处，单个地散布在参考序列中的氨基酸之间，或以参考序列中的一个或多个连续的组散布。给定的%同一性的氨基酸改变的数量是通过参考多肽中的氨基酸总数乘以各自的同一性百分比的数值百分比（除以100），然后从参考多肽中的所述氨基酸总数中减去该乘积来确定的。
保守氨基酸变体还可包括非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲醇基脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基-甘氨酸、异-苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氢吡啶羧酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3,3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域中已知有几种方法用于将非天然存在的氨基酸残基掺入到蛋白质中。例如，可以采用一种体外系统，其中通过使用化学氨酰化阻遏物tRNA而抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法在本领域中是已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译在无细胞系统中进行，该无细胞系统包括大肠杆菌S30提取物和商业上可得到的酶和其它试剂。蛋白质通过色谱法纯化（Robertson等人，（1991）J.Am.Chem.Soc.113：2722；Ellman等人，（1991）Methods Enzymol.202：301；Chung等人，Science（1993）259：806-809；以及Chung等人，（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：10145-10149）。在第二种方法中，翻译是通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化阻遏物tRNA在爪蟾卵母细胞中进行的（Turcatti等人，（1996）J.Biol.Chem.271：19991-19998）。在第三种方法中，在不存在待取代的天然氨基酸（例如，苯丙氨酸）和存在所需的非天然存在的氨基酸（例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸）的情况下培养大肠杆菌细胞。非天然存在的氨基酸被掺入到蛋白质中取代它的天然对应物（Koide等人，（1994）Biochem.33：7470-7476）。天然存在的氨基酸残基通过体外化学修饰可以 被转化为非天然存在的物质。化学修饰可以联合位点定向诱变以进一步扩大取代的范围（Wynn等人，（1993）Protein Sci.2：395-403）。
本文所使用的术语“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它们可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。因此，举例来说，本文所使用的多核苷酸是指，除了其他以外，单链和双链DNA、为单链和双链区域混合物的DNA、单链和双链的RNA、和为单链和双链区域混合物的RNA、包含可以是单链的或更典型地是双链的或是单链和双链区域混合物的DNA和RNA的杂合分子。术语“核酸”、“核酸序列”或“寡核苷酸”也包括如上所定义的多核苷酸。
本文所用术语多核苷酸包括含有一个或多个经修饰的碱基的上述的那些DNA或RNA。因此，带有由于稳定性或其它原因而经修饰的主链的DNA或RNA是作为本文所预期术语的“多核苷酸”。此外，仅举两个例子，包含不常见的碱基如肌苷或经修饰的碱基如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是作为本文所用术语的多核苷酸。
应意识到，为了本领域技术人员已知的多种使用目的，已经对DNA和RNA进行了多种修饰。本文所用的术语多核苷酸包括此类化学上、酶学上或代谢上经修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞，尤其包括单细胞和复杂细胞中，特征性的DNA和RNA化学类型。
举例来说，本公开内容的多核苷酸序列可以与参考序列相同，也就是说100%相同，或者同参考序列相比它可包括多达某一整数个的核苷酸改变。这样的改变选自包括至少一个核苷酸缺失、取代（包括转换和颠换）、或插入的组，并且其中所述的改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置处，或在这些末端位置之间的任意位置处，单个地散布在参考序列中的核苷酸之间，或以参考序列中的一个或多个连续的组散布。核苷酸改变的数量是通过将参考核苷酸中的核苷酸总数乘以各自的同一性百分比的数值百分比（除以100），然后从参考核苷酸中的核苷酸总数中减去该乘积来确定的。编码多肽的多核苷酸序列的改变可以在这样的改变后改变由多核苷酸编码的多肽。
本文所用的DNA可以通过任何方法获得。例如，DNA包括从mRNA 制备的互补DNA（cDNA）、从基因组DNA制备的DNA、通过化学合成制备的DNA、使用RNA或DNA作为模板通过PCR扩增来获得的DNA、以及通过适当地组合这些方法来构造的DNA。
例如，通过下述方法，cDNA可以从编码蛋白质的mRNA克隆：
首先，从以上提及的表达和生产蛋白质的组织或细胞制备编码蛋白质的mRNA。mRNA可以通过用已知的方法分离总RNA来制备，并使用低聚dT纤维素或聚-U琼脂糖对其进行亲和层析，所述已知的方法是例如胍基硫氰酸法（Chirgwin等人，Biochemistry，18:5294，1979）、热酚法、或AGPC方法。
然后，使用获得的mRNA作为模板，合成cDNA并转化成双链cDNA，cDNA的合成是例如通过利用逆转录酶的已知方法，例如Okayama等人所述的方法（Mol.Cell.Biol.2:161（1982）；Mol.Cell.Biol.3:280（1983））或Hoffman等人所述的方法等（Gene25:263（1983））。通过使用具有这种cDNA的质粒载体、噬菌体载体、或粘粒载体转化大肠杆菌或通过在体外包装后转染大肠杆菌来制备cDNA文库。
本文所用的“分离的核酸”是一种核酸，其结构与任何天然存在的核酸不同，或与跨越超过三个基因的天然存在的基因组核酸的任何片段不同。因此，该术语包括例如，（a）一种DNA，其具有天然存在的基因组DNA分子的部分序列，但侧翼没有其天然存在于其中的生物体基因组中的部分分子侧翼的两个编码序列；（b）一种核酸，该核酸以一种方式被掺入到载体或原核细胞或真核细胞的基因组DNA中，使所得的分子不同于任何天然存在的载体或基因组DNA；（c）一种单独的分子，例如cDNA、基因组片段、由聚合酶链式反应（PCR）产生的片段、或限制片段；以及（d）一种重组核苷酸序列，是杂合基因的一部分，杂合基因即编码融合蛋白的基因。要从此定义中特别排除的是以不同DNA分子、转染的细胞或细胞克隆的随机的、不典型的混合物存在的核酸分子，例如这些存在于DNA库诸如cDNA或基因组DNA库中。
本文使用的关于一种给定多肽的术语“基本上纯的”表示该多肽基本没有其它生物大分子。例如，基本上纯的多肽按干重计是至少75%、80%、 85%、95%或99%纯的。纯度可以利用本领域已知的任意适当标准方法测量，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或HPLC分析法。
本文所用的质粒载体不受限制，只要它们在宿主中复制和维持。也可以使用在宿主中可以复制的任何噬菌体载体。常用的克隆载体的实例是pUC19、λgt10、λgt11等。当载体应用于如下所述的免疫学筛选时，优选地使用具有能够在宿主中表达编码所需蛋白质的基因的启动子的载体。
cDNA可以通过例如，Maniatis等人所述的方法（Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，p.1.53，1989）插入到质粒中。cDNA可以通过，例如，Hyunh等人所述的方法（DNAcloning，a practical approach，1，p.49（1985））插入到噬菌体载体中。这些方法可以通过使用商业可获得的克隆试剂盒（例如，来自Takara Shuzo的产品）简单地进行。将如此获得的重组质粒或噬菌体载体引入到适当的宿主细胞中，如原核细胞（例如，大肠杆菌菌株HB101、DH5a、MC1061/P3等）。
用于将质粒引入到宿主中的方法的实例是在Molecular Cloning,A LaboratoryManual（第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，p.1.74（1989））中描述的氯化钙法、氯化钙/氯化铷法、脂质体（lipidsome）方法和电穿孔法。噬菌体载体通过例如一种方法可以引入到宿主细胞中，在该方法中，噬菌体DNA在体外包装之后被引入到生长的宿主细胞中。体外包装可以使用商业上可得到的体外包装试剂盒容易地进行（例如，来自Stratagene或Amersham的产品）。
对编码蛋白质的cDNA的鉴定可以使用两种cDNA文库，即从源于刺激细胞的mRNA构建的cDNA文库（检测cDNA文库）和从源于未刺激细胞的mRNA构建的cDNA文库（对照cDNA文库），利用抑制性PCR效应（（1995）Nucleic Acids Res.23:1087-1088）通过例如抑制减法杂交（SSH）（（1996）Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93:6025-6030；Anal.Biochem.（1996）240:90-97）来进行，所述蛋白质的表达依赖于本文公开的细胞因子如AID蛋白质的刺激而被增强。
本公开内容的实施方案涉及一种重组载体，该重组载体包含编码本文 使用的蛋白质的DNA。作为本文公开的重组载体，可以使用任何载体，只要其能够在原核和/或真核细胞的每个宿主细胞中保持复制或自身增殖，包括质粒载体和噬菌体载体。重组载体可以使用常用的方法通过连接编码蛋白质的DNA与在本领域中可获得的用于重组的载体（质粒DNA和噬菌体DNA）而容易地制备。
使用的用于重组的载体的具体实例是大肠杆菌衍生质粒，如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13和pUC19、酵母衍生质粒，如pSH19和pSH15、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）衍生质粒，如pUB110、pTP5和pC194。噬菌体的实例是细菌噬菌体，如λ噬菌体，和动物或昆虫病毒（pVL1393,Invitrogen），如逆转录病毒、痘苗病毒及核型多角体病毒。
“表达载体”可用于表达编码本文所用的蛋白质的DNA，并用于生产蛋白质。该表达载体是不受限制的，只要它在多种原核和/或真核宿主细胞中表达编码该蛋白质的基因并生产该蛋白质。其实例是pMAL C2、pEF-BOS（（1990）Nucleic Acids Res.18:5322等）、pME18S pCDNA（Experimental Medicine：SUPPLEMENT，“Handbook of GeneticEngineering”（1992））等。
当细菌尤其是大肠杆菌被用作宿主细胞时，表达载体通常至少包含：启动子/操纵子区域、起始密码子、编码蛋白质的DNA、终止密码子、终止子区域、以及复制子。
当酵母菌、动物细胞或昆虫细胞用作宿主时，表达载体优选地至少包含：启动子、起始密码子、编码蛋白质的DNA和终止密码子。它还可以包括编码信号肽的DNA、增强子序列、编码蛋白质的基因的5’和3’非翻译区域、剪接接点、聚腺苷酸化位点、选择标记区域、以及复制子。如果需要，表达载体还可以包含通常使用的用于基因扩增的基因（标志物）。DNA质粒也可以直接被引入到动物的哺乳动物细胞中来表达蛋白质。
在细菌中表达蛋白质的启动子/操纵子区域包括启动子、操纵子和Shine-Dalgarno（SD）序列（例如，AAGG）。例如，当宿主细胞是埃希氏杆菌（Escherichia）时，其优选地包括Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、tac启动子等。在酵母中表达蛋白质的启动子的实例是PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等等。当宿主是芽 孢杆菌（Bacillus）时，其实例是SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等等。当宿主细胞是真核细胞如哺乳动物细胞时，其实例是SV40衍生启动子、逆转录病毒启动子、热休克启动子等等，并且优选地是SV-40衍生启动子和逆转录病毒衍生启动子。当然，启动子不限于上述的实例。另外，使用增强子对表达有效。
优选的起始密码子是例如甲硫氨酸密码子（ATG）。
通常使用的终止密码子（例如，TAG、TAA、TGA）被例示为终止密码子。通常，天然或合成的终止子是作为终止子区域来使用。
“复制子”是指能够在宿主细胞中复制完整DNA序列的DNA，并包括天然质粒、人工修饰的质粒（从天然质粒制备的DNA片段）、合成质粒等。优选质粒的实例是用于大肠杆菌的pBR322或其人工衍生物（通过使用合适的限制性内切酶处理pBR322或pRSET获得的DNA片段）、用于酵母的酵母2μ质粒或酵母染色体DNA、用于哺乳动物细胞的pRSVneo ATCC37198、pSV2dhfr ATCC37145、pdBPV-MMTneo ATCC37224、pSV2neo ATCC37149等等。
还可使用本领域常用的增强子序列、聚腺苷酸化位点和剪接接点，例如源于SV40的那些。
可以根据常用方法使用通常采用的选择标记。其实例是对抗生素如四环素、氨苄青霉素或卡那霉素的抗性基因。
用于基因扩增的基因的实例是二氢叶酸还原酶（DHFR）基因、胸苷激酶基因、新霉素抗性基因、谷氨酸合酶基因、腺苷脱氨酶基因、鸟氨酸脱羧酶基因、潮霉素-B-磷酸转移酶基因、天冬氨酸转氨甲酰酶基因等。
本文使用的表达载体可以通过连续地和循环地连接至少上述启动子、起始密码子、编码蛋白质的DNA、终止密码子和终止子区到合适的复制子上来制备。如果需要，可以通过常用的方法例如用限制性酶进行消化或用T4DNA连接酶进行连接来使用适当的DNA片段（例如，接头、限制位点等）。
亲合性标签如His标签和GST可以添加到序列末端来帮助通过蛋白质 印迹和蛋白质沉淀技术对蛋白质的纯化和识别。其它标签的实例，如HA和FLAG也可以加入以允许进一步处理构建物。
本文所用的“转化株”可以通过将上述的表达载体引入到宿主细胞中来制备。
本文所用的“宿主”细胞是不受限制的，只要它们与上述的表达载体相容，并且可以被转化。其实例为各种细胞，如在技术领域中通常使用的野生型细胞或人工建立的重组细胞（例如，细菌（埃希氏杆菌和芽孢杆菌）、酵母（酿酒酵母（Saccharomyces）、毕赤酵母（Pichia）等）、动物细胞、或昆虫细胞）。
优选地使用大肠杆菌或动物细胞。具体的实例是大肠杆菌菌株DH5α、TB1、HB101等、小鼠衍生细胞（COP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH3T3等）、大鼠衍生细胞（PC12、PC12h）、仓鼠衍生细胞（BHK、CHO等）、猴子衍生细胞（COS1、COS3、COS7、CV1、Velo等）、人衍生细胞（Hela、二倍体成纤维细胞衍生细胞、骨髓瘤细胞和HepG2等）。
表达载体可以通过已知方法引入（转化（转染））到宿主细胞中。当宿主细胞是细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等）时，例如，可以根据Cohen等人（（1972）Proc.Natl.Acad.Sci.USA.69:2110）所述的方法、原生质体方法（（1979）Mol.Gen.Genet.168:111）或感受态法（（1971）J.Mol.Biol.56:209）来进行转化；当宿主是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）时，可以根据Hinnen等人（（1978）Proc.Natl.Acad.Sci.USA.75:1927）所述的方法、或锂方法（（1983）J.Bacteriol.153:163）来进行转化；当宿主细胞是动物细胞时，可以根据Graham等人（（1973）Virology52:456）所述的方法来进行转化；当宿主细胞是昆虫细胞时，可以根据Summers等人（（1983）Mol.Cell.Biol.3:2156-2165）所述的方法来进行转化。
本文公开的蛋白质可以通过培养转化体（在下文中，该术语包括转染体）来产生，所述转化体包含如上所述的在营养培养基中制备的表达载体。
优选地，营养培养基包括宿主细胞（转化体）生长所必需的碳源、无机或有机氮源。碳源的实例是葡萄糖、葡萄聚糖、可溶性淀粉和蔗糖，无 机或有机氮源的实例是铵盐、硝酸盐、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆饼和马铃薯提取物。如果需要，它们可以包括其它营养物（例如，无机盐（例如氯化钙、磷酸二氢钠和氯化镁）、维生素、抗生素（例如，四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等）。
细胞系的培养是通过本领域已知的方法进行的。适当地选择如温度、培养基pH值和培养时间的培养条件，以便大量生产蛋白质。
可以理解的是，本领域技术人员已知，为了多种使用目的，已经对DNA和RNA进行了多种修饰。本文所用的术语多核苷酸包括化学上、酶学上或代谢上修饰的多核苷酸形式，以及病毒和细胞，尤其包括单细胞和复杂细胞中特征性的DNA和RNA的化学形式。
举例来说，本公开内容的多核苷酸序列可以与参考序列相同，也就是说100%相同，或者同参考序列相比它可包括多达某一整数个的核苷酸改变。这样的改变选自包括至少一个核苷酸缺失、取代（包括转换和颠换）、或插入的组，并且其中所述的改变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置处，或在这些末端位置之间的任意位置处，单个地散布在参考序列中的核苷酸之间，或以参考序列中的一个或多个连续的组散布。核苷酸改变的数量是通过将参考核苷酸中的核苷酸总数乘以各自的同一性百分比的数值百分比（除以100），然后从参考核苷酸中的核苷酸总数中减去该乘积来确定的。编码多肽的多核苷酸序列的改变可以在这样的改变后改变由多核苷酸编码的多肽。
术语“密码子”是指在DNA链或mRNA中的特定的单核苷酸三联体，其组成了氨基酸或终止信号。
术语“简并核苷酸序列”表示包括一或多个简并密码子的核苷酸序列（与编码多肽的参考多核苷酸分子相比）。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基（例如，GAU和GAC三联体都编码Asp）。
如本文所用，术语“外源DNA”或“外源核酸序列”或“外源多核苷酸”是指一种从外源导入到细胞或细胞器中的核酸序列。通常地，导入的外源序 列是重组序列。
如本文所用，术语“转染”是指将核酸序列导入到活细胞的膜封闭空间的内部，包括将核酸序列导入到细胞溶质中以及线粒体、细胞核或叶绿体的内部空间。核酸可以是裸露的DNA或RNA形式、与各种蛋白质关联，或者核酸也可以并入到载体中。
本文所用的“DNA调控序列”是转录和翻译控制序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止信号等，其提供和/或调控宿主细胞中的编码序列的表达。
“启动子序列”是操纵子中能够在细胞中与RNA聚合酶结合并起始下游（3’方向）编码序列转录的DNA调控区域。启动子序列通过转录起始位点结合在其3’末端，并向上游（5’方向）延伸，以包括起始高于背景的可检测水平的转录所需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点、以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域。真核启动子通常但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。各种启动子，包括诱导型启动子，可以用来驱动本公开内容中的各种载体。
术语“嵌合”、“融合”和“复合”用来表示含有至少两种成分部分的蛋白质、肽结构域或核苷酸序列或分子，这至少两种成分部分是相互异源的，其意义是指在其他情况中在自然界发现它们不是直接（共价）连接的。更具体地，在自然界中在相同的连续多肽或基因中没有发现所述成分部分，至少没有发现它们以嵌合蛋白质或复合域中相同的顺序或方向或具有相同的间隔。这种材料含有来自至少两种不同的蛋白质或基因的成分，或含有来自相同的蛋白质或基因的至少两种非相邻部分的成分。编码它们的复合蛋白质和DNA序列是重组的，其意义是指它们包含至少两种组分部分，在其他情况中在自然界发现这两种组分部分不是直接连接（共价）在一起的。
在本文中的术语“结构域”并不有意受限于单个离散折叠结构域。
“报道多核苷酸”包括表达可检测的基因产物的任何基因，其可以是RNA或报告多肽。报道基因包括编码序列，对于该编码序列来说转录和/ 或翻译产物是容易检测或选择的。
与相应的天然存在的分子相比，本文所用的“插入”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列的改变分别导致了一个或多个氨基酸或核苷酸残基的添加或插入。
与相应的天然存在的分子相比，本文所用的“缺失”或“减去”是指氨基酸或核苷酸序列的改变分别导致了一个或多个氨基酸或核苷酸残基的缺失或减去。
本文使用的“取代”是指一个或多个氨基酸或核苷酸分别被不同的氨基酸或核苷酸替代。
“突变”是相对于参考“野生型”DNA序列的DNA序列的可遗传改变。可由于单个碱基的改变、多个碱基的改变、或多于一个核苷酸到DNA序列的添加或缺失，发生突变。
术语“突变体”被广泛的用于指与参考野生型蛋白质在某些方面不同的蛋白质，其中该蛋白质可以保留了参考野生型（例如，天然存在的）的蛋白质的生物学特性，或者可以具有不同于参考野生型蛋白质的生物学特性。术语主题蛋白质的“生物学特性”包括但不限于光谱特性，诸如发射最大值、量子产量和亮度等；在体内和/或体外的稳定性（例如，半衰期）等。突变体可以包括单个氨基酸改变（点突变）、一个或多个氨基酸的缺失（点缺失）、N-末端截短、C-末端截短、插入等。使用分子生物学标准技术可以产生突变体。
“基因突变”是指全部发生在一个基因或它的上游调节序列内的突变，并且包括全部发生在一个基因内的点突变或正常染色体结构的其它破坏。
“野生型”菌株能够进行全范围的代谢活动。例如，沙门氏菌的野生型菌株可以从单一碳源中合成所有的20种氨基酸。
“突变体”菌株不能进行从其衍生来的野生型菌株的所有活动。例如，缺少合成氨基酸组氨酸能力的突变细菌菌株（his菌株）需要外源组氨酸的存在以便生长。
“点突变”是指在DNA序列中的一个或少量碱基对的变化。点突变可 以是由碱基对的取代或小的插入或缺失而引起的。
“转换”是指一种嘌呤取代一种嘌呤或一种嘧啶取代一种嘧啶的点突变。
“颠换”是指一种嘧啶取代一种嘌呤或一种嘌呤取代一种嘧啶的点突变。一般来说，转换比颠换更常见，这是由于前者不被校读酶检测到。
另外，点突变也可以由于终止密码子（琥珀、赭石、乳白）的插入而导致无义突变。产生翻译终止密码子的碱基对突变引起编码的蛋白质的翻译的提前终止。
“移码突变”是由于基因内的一个或多个核苷酸的插入或缺失所致。基因的“阅读框”是指碱基相对于用于mRNA的翻译的起始点的顺序。单个碱基对的缺失导致在所有的密码子中向前移动一个碱基，并且通常被称为正移码。加入一个碱基对（或失去两个碱基对）使得阅读框移动到一个碱基的后面，并且通常被称为负移码。
如本文所用，术语“杂交”是指形成利用相对的核酸链的残基之间的氢键来稳定的反平行双链体的两个核酸链的缔合过程。
“杂交”和“结合”对于多核苷酸可互换地使用。这里使用的术语“特异性地杂交”和“特异性的杂交”和“选择性杂交”，是指在严格条件下，核酸分子优先与特定核苷酸序列的结合、成双链、或杂交。
本文所用的术语“严格试验条件”是指，在试验中，对有足够的互补性以提供所需要的特异性水平的核酸，例如，表面结合和溶液相核酸，相容以产生结合对，而对互补性不足以提供所需要的特异性的核酸的结合成员，较不相容以形成结合对的条件。严格的试验条件是杂交条件和洗涤条件两者的总和或组合（全部）。
根据本公开内容，本公开内容的传感器的“可检测的有效量”被定义为使用可用于临床使用的设备足以产生可接受的图像的量。本公开内容的传感器的可检测的有效量可以以多于一次注射而施用。本公开内容的传感器的可检测的有效量可以根据多种因素而变化，例如个体的敏感性程度、个体的年龄、性别和体重、个体的特异性应答、剂量测定等。本公开内容的 传感器的可检测的有效量也可以根据仪器和膜相关因素而变化。这些因素的优化完全在本领域技术人员知识范围之内。
“给药”是指向受试者引入本公开内容的传感器。传感器的优选的给药途径是静脉注射。然而，可以使用任何的给药途径，例如口服、局部、皮下、腹膜内、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻腔、引入到脑脊髓液中，或滴注到身体腔室。
本文所用的术语“分离的”是指用来描述多核苷酸、多肽、抗体、或宿主细胞，其在不同于所述多核苷酸、多肽、抗体或宿主细胞天然存在的环境中。
本文所用的短语“蛋白质的β罐结构(beta-can structure of proteins)”指一种蛋白质，其特征在于，以反平行的β链形成的紧密的圆筒。
“荧光蛋白”是指当用合适的电磁辐射来激发时，能够发光的任何蛋白质。荧光蛋白包括具有天然的或工程化的氨基酸序列的蛋白质，例如源于多管水母相关（Aequorea-related）荧光蛋白的荧光蛋白。本文所用的“荧光蛋白”是维多利亚多管水母（Aequoreavictoria）绿色荧光蛋白（GFP）、GFP的结构变体（即循环排列、单体形式）、GFP的折叠变体（即更可溶的形式、超折叠形式）、GFP的光谱变体（即，YFP、CFP）、和GFP样荧光蛋白（即，DsRed和mcherry）。荧光蛋白可以来自不同的资源。对于水螅纲（Hydrozoa），GFP可以来自维多利亚多管水母、Mitrocoma（同义词Halistaura）、薮枝螅（Obelia）、杯水母（Phialidium）等。对于珊瑚纲（Anthozoa），GFP可以来自针珊瑚（Acanthopilum）、海仙人掌（Cavernularia）、海肾（Renilla）、Ptilosarcus和海鳃（Pennatula）、Stylatula等。我们还具有来自Anemonia majna的GFP样蛋白质、来自Anemonia sulcata的FP595、来自花群海葵属（Zoanthus）的FP等。术语“GFP样荧光蛋白”用来指共有GFP的11-β链“桶状”结构的珊瑚纲荧光蛋白的成员，及其结构变体、折叠变体和光谱变体。术语“GFP样非荧光蛋白”和“GFP样发色蛋白”（或简称“发色蛋白”或“色蛋白”）用来指共有GFP的11-β链“桶状”结构的珊瑚纲和水螅纲发色蛋白，及其结构变体、折叠变体和光谱变体。GFP样蛋白质都共有共同的结构和功能特征，包括但不限于，除了分子氧， 不需要辅助的辅因子、外部酶催化或底物来形成内部发色团的能力。
在本公开内容中可以使用各种荧光蛋白，包括由于分子内重排或加入激发荧光的辅因子来发射荧光的蛋白质。例如，作为生物发光中的能量转移接受体的刺细胞动物的绿色荧光蛋白是用于荧光指示剂中的合适的荧光蛋白。绿色荧光蛋白（“GFP”）是发射绿光的蛋白质，以及蓝色荧光蛋白（“BFP”）是发射蓝光的蛋白质。已经从Pacific Northwest水母维多利亚多管水母、the sea pansy海肾（Renilla reniformis）、和Phialidium gregarium分离出GFP（参见Ward等人,（1982）Photochem.Photobiol.35:803-808和Levine等人,（1982）Comp.Biochem.Physiol.,72B:77-85）。红色荧光蛋白mCherry具有587nm的激发波长和610nm的发射最大值。（Shaner,N.C.等人,（2004）Nat.Biotech.）。
具有有用的激发和发射光谱的多种多管水母相关GFP已经通过修饰来自维多利亚多管水母的天然存在的GFP的氨基酸序列来设计。参见，Prasher等人（1992）Gene111:229-233；Heim等人（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.,USA91:12501-12504；1994年11月10日提交的美国序列号08/337,915；1995年11月10日提交的国际申请PCT/US95/14692；以及1996年8月30日提交的美国序列号08/706,408。GFP的cDNA可以与编码许多其它蛋白质的cDNA连接；所得的融合体通常是荧光的，并保留了配偶蛋白质的生化特征。参见，Cubitt等人，（1995）Trends Biochem.Sci.20:448-455。诱变研究已经生产出具有偏移的激发或发射波长的GFP突变体。参见，Heim&Tsien（1996）Current Biol.6:178-182。合适的对，例如蓝色偏移GFP突变体P4-3（Y66H/Y145F）和改进的绿色突变体S65T可以分别用作荧光共振能量转移（FRET）的供体和接受体。参见，Tsien等人，（1993）Trends Cell Biol.3:242-245。如果荧光蛋白的150个氨基酸的任何连续序列与来自于野生型多管水母绿色荧光蛋白的连续的或非连续的氨基酸序列具有至少85%的序列同一性，那么该荧光蛋白是多管水母相关的荧光蛋白。更优选地，如果荧光蛋白的200个氨基酸的任何连续序列与来自于野生型多管水母绿色荧光蛋白的连续的或非连续的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性，那么该荧光蛋白是多管水母相关的荧光蛋白。 类似地，使用相同标准，荧光蛋白可以与海肾或杯水母野生型荧光蛋白相关。
在本公开内容的实施方案中使用的在F64L和S65处具有两个突变的GFP变体，包括增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。它的发色团具有在488nm的激发最大值和在510nm的发射最大值。其荧光信号显著大于没有这两个突变的野生型GFP。
另一种GFP变体被称为Cycle3（参见，Patterson等人，（1997）Biophys.J.73:2782-2790，通过引入并入本文）。这种GFP变体在野生型GFP的F99S、M153T和V163A处具有突变，具有改进的折叠，且在37℃或高于37℃形成发色团。
可以在荧光指示剂中使用其它荧光蛋白，诸如，例如，来自费氏弧菌（Vibriofischeri）菌株Y-1的黄色荧光蛋白、来自甲藻共生甲藻属（Symbiodinium sp.）的多甲藻素-叶绿素a结合蛋白、来自海洋蓝细菌如聚球藻属（Synechococcus）的藻胆蛋白，如藻红蛋白和藻蓝蛋白、或来自用藻红素重建的燕麦的燕麦光敏色素。这些荧光蛋白在Baldwin等人，（1990）Biochemistry29:5509-5515，Morris等人，（1994）Plant Mol.Biol.,24:673-677和Wilbanks等人，（1993）J.Biol.Chem.268:1226-1235,和Li等人，（1995）Biochemistry34:7923-7930中已描述。
此处所用的术语“链接”是指物理连接以及由于生物粒子内的共存而产生的连接，该生物粒子是例如噬菌体、细菌、酵母或其它真核细胞。
用于以为目的多肽的表达编码的序列转染细胞的核酸一般是以表达载体的形式，该表达载体包括表达控制序列，该表达控制序列可操作地连接到为多肽表达编码的核苷酸序列。本文采用的术语为多肽的“表达编码的核苷酸序列”是指在mRNA的转录和翻译后产生多肽的序列。这可以包括包含例如内含子的序列。本文所用的术语“表达控制序列”是指核酸序列，该核酸序列调节其可操作地连接的核酸序列的表达。当表达控制序列适当地控制和调节核酸序列的转录和翻译时，该表达控制序列是可操作地连接于该核酸序列。因此，表达控制序列可以包括适当的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白质编码基因前面的起始密码子（即，ATG）、内含子的剪 接信号、为允许mRNA的正确翻译而维持该基因的正确的阅读框、以及终止密码子。
本领域技术人员所熟知的方法可以用于构建含有荧光指示剂编码序列以及合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内重组/遗传重组。（例如参见，在Maniatis等,Molecular Cloning A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，N.Y.，1989中所述的技术）。
可使用多种宿主表达载体系统来表达生物发光指示剂编码序列。这些包括但不限于微生物，例如用含有钙传感系统序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或者粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有钙传感系统序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有钙传感系统序列的重组病毒表达载体（例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV）感染或用重组质粒表达载体（例如，Ti质粒载体）转化的植物细胞系统；用含有钙传感系统序列的重组病毒表达载体（例如，杆状病毒）载体感染的昆虫细胞系统；或用含有钙传感系统序列的重组病毒表达载体（例如，逆转录病毒，腺病毒、痘苗病毒载体）感染的动物细胞系统，或经工程化用于稳定表达的转化的动物细胞系统。
依据所用的宿主/载体系统，多种适当转录和翻译元件的任一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等都可以用在表达载体中（例如参见，Bitter，等人，Methods in Enzymology153：516-544，1987）。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lac杂合启动子）等。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用来自哺乳动物细胞的基因组的启动子（例如，金属硫蛋白启动子）或来自哺乳动物病毒的启动子（例如，逆转录病毒长末端重复序列、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子）。由重组DNA或合成技术产生的启动子也可用于提供所插入的荧光指示剂编码序列的转录。
在细菌系统中，可以依据钙传感系统的预期用途有利地选择许多表达载体。
在酵母中，可以使用含有组成型或诱导型启动子的许多载体。综述参见，CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.2，Ausubel等编著，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience，Ch.13，1988；Grant等，Expression and Secretion Vectors forYeast，in Methods in Enzymology，Wu&Grossman编著，31987，Acad.Press，N.Y.，Vol.153，pp.516-544，1987；Glover，DNA Cloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3，1986；以及Bitter，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，Berger&Kimmel编著，Acad.Press，N.Y.，Vol.152，pp.673-684，1987；以及The Molecular Biologyof the Yeast Saccharomyces，Strathern等编著，Cold Spring Harbor Press，Vols.Iand II，1982。可以使用组成型酵母启动子如ADH或是LEU2或诱导型启动子例如GAL（Cloning in Yeast，Ch.3，R.Rothstein In：DNA Cloning Vol.11，A PracticalApproach，DM Glover编著，IRL Press，Wash.，D.C.，1986）。或者，可以使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体中的载体。
一种可用于表达突变检测系统的可选的表达系统是昆虫系统。在这样的一种系统中，苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）核型多角体病毒（AcNPV）用作表达外源基因的载体。该病毒在草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞中生长。钙传感系统序列可以被克隆到病毒的非必需的区域（例如，多角体蛋白基因）中，并且置于AcNPV启动子（例如多角体蛋白启动子）的控制下。钙传感系统序列的成功插入将导致多角体蛋白基因的失活和非闭合重组病毒（即，缺乏由多角体蛋白基因编码的蛋白质衣壳的病毒）的产生。然后，这些重组病毒用于感染草地夜蛾细胞，所插入的基因被表达在其中，参见Smith等人，J.Viol.46：584，1983；Smith，美国专利4,215,051。
编码本公开内容的突变检测系统的DNA序列可以在体外通过DNA转移到合适的宿主细胞中来表达。“宿主细胞”是载体可以在其中繁殖并且它的DNA得到表达的细胞。该术语也包括所述宿主细胞的任意子代。应当理解，有可能并非所有的子代都与亲代细胞相同，因为在复制过程中可能发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括了这样的后代。稳定的转移方法在本领域中是已知的，稳定的转移即，外源DNA连续地保留在 宿主中。
“物理连接”是指本领域已知的用于功能性地连接两个分子（这被称为“物理地链接”）的任何方法，包括但不限于有或没有中间域的重组融合、内含肽介导的融合、非共价结合、共价键合（例如，二硫键和其他共价键合）、氢键；静电键合；和构象键合，例如，抗体-抗原和生物素-亲和素结合。
“融合”是指通过共价键的连接。
如本文所用，术语“细胞器”是指细胞膜划界的结构，如叶绿体、线粒体、和细胞核。术语“细胞器”包括天然的和合成的细胞器。
本文所用的术语“非核细胞器”是指除了细胞核以外的细胞中存在的任何细胞膜划界结构。
本文所用的术语“宿主”或“生物体”包括人类、哺乳动物（如猫、狗、马等）、活细胞、和其它活的生物体。例如，活生物体可以如单个真核细胞一样简单，或者如哺乳动物一样复杂。本公开内容的实施方案可以施用的典型宿主是哺乳动物，特别是灵长类动物，尤其是人类。对于兽医学应用而言，多种受试者都会是合适的，例如，家畜，例如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家禽，如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及家养的动物，特别是宠物，例如狗和猫。对于诊断或研究应用而言，各种哺乳动物都会是适合的受试者，包括啮齿动物（例如，小鼠、大鼠、仓鼠）、兔、灵长类动物、以及猪，例如近交系猪等。另外，对于体外应用而言，例如在体外诊断和研究应用中，上述受试者的体液和细胞样品将适于使用，例如哺乳动物（特别是灵长类动物，例如人类）的血液、尿液或组织样本，或者是兽医应用中提到的动物的血液、尿液或组织样本。
“分析物”是能够结合蛋白质或肽的原子、分子或者离子。分析物可以可逆地或不可逆地进行结合，并且这种键合可以是共价的或非共价的。尽管Ca2+、Ln3+和Pb2+用作本公开内容的优选实施方案中的示例性分析物，但是应该理解的是，适合本公开内容的分析物包括但不限于：金属离子，包括第IIA族金属离子、过渡金属离子以及镧系离子。
“分析物”也可以是能够结合到蛋白质上来改变传感器的光学特性的H+或OH-。“结合位点”是指参与与分析物形成键的肽或蛋白质的任何部分。
“结合基序”是结合位点的一部分，经常存在于较大蛋白质中。术语结合位点可以与术语结合基序交换使用，反之亦然。
“化学反应”可以包括通过已知手段而进行的离子、共价或非共价结构的形成或分解。化学反应可以包括环境条件如pH、离子强度和温度的变化。
“构象”是分子的一级、二级、和三级结构的三维排列，且在某些情况下，还可以是分子的四级结构的三维排列，其包括分子中的侧基；当分子三维结构改变时，构象发生改变。构象变化可以是从α螺旋到β片层的偏移或者是从β片层到α螺旋的偏移。
“可检测到的变化”或“响应性”指蛋白质对其微环境的任何响应。这种可检测的变化或响应性可以是传感器多肽的氨基酸或肽片段的方向上的细小变化或偏移，以及例如，多肽的一级、二级或三级结构的变化，并且在某些情况下多肽的四级结构的变化，包括质子化、电和化学势和/或构象的变化。
任何荧光性质中活动状态和非活动状态之间“可测量的差异”对于活性试验中本公开内容的荧光蛋白质底物的效用而言是足够的。可测量的差异可以通过测量任何定量荧光性能的量来确定，任何定量荧光性能例如在特定波长上的荧光信号或跨发射光谱范围的荧光的积分。
“可操作地插入”或“链接”是指一种并置，其中如此描述的成分处于允许它们以预期方式起作用的关系中。连接可操作地连接于编码序列的控制序列，使得该编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。
“响应”旨在包括多肽或蛋白质的任何响应以与分析物相互作用。
“荧光寿命”是指荧光团信号的寿命，而不是它的强度。荧光寿命可以使用荧光寿命成像显微术（FLIM）来测量，荧光寿命成像显微术（FLIM）是一种成像技术，用于基于来自荧光样品的荧光指数衰减速率中的差别产生图像。它可以用作共焦显微术、双光子激发显微术和多光子断层扫描中的成像技术。测量荧光寿命具有的优势是最小化了在样本的厚层中的光子 散射的影响。
描述
公开了分析物传感器、分析物传感器的制造和使用方法以及检测和/或测定分析物活性、检测pH变化、和/或控制系统中分析物浓度的方法。根据本公开内容的分析物传感器的实施方案可提供用于在体内和体外环境中、尤其是在活细胞成像中表征分析物活性、检测pH变化、控制系统中的分析物浓度等的准确而方便的方法。
Ca2+通过胞质Ca2+浓度的时空变化以及随后与Ca2+结合蛋白的相互作用来调节多种生物学过程。内质网（ER）用作细胞内的Ca2+存储库并且在胞质Ca2+内稳态中起主要作用。强烈需要开发一种Ca2+传感器，该Ca2+传感器能够实时定量测量在特定的亚细胞环境中的Ca2+，而不使用天然Ca2+结合蛋白，例如钙调蛋白，它们本身就参与用作细胞中的信号传导分子。公开的策略是通过将Ca2+结合基序整合到绿色荧光蛋白中的发色团敏感位置中来创建这种传感器。当Ca2+以与ER中发现的Ca2+浓度相对应的亲和力结合（Kd值的范围是0.4-2mM）时，工程化的Ca2+传感器表现出大的比率荧光以及吸光度变化。除采用各种光谱方法表征新开发的Ca2+传感器的光学和金属结合性能之外，还使用停流荧光分光光度法研究动力学特性，以确保精确监测动态的Ca2+变化。开发的Ca2+传感器是针对哺乳动物细胞系的ER的，以便于监测发生在该区室内的响应于激动剂刺激的Ca2+变化。可以设想，这类Ca2+传感器可以进行进一步修改，以便于测量在其它细胞区室中的Ca2+，这为研究这些区室对于细胞Ca2+信号传导的贡献提供了工具。
通过将带有连续Ca2+结合位点的EF手型基序接枝到作为支架蛋白的野生型EGFP中，成功地创建了基于EGFP的Ca2+传感器[35]。当在398和490nm处激发时，对所产生的Ca2+传感器（G1）相应地呈现出的双510nm荧光强度比率变化进行监测，以确定Ca2+的浓度。虽然在哺乳动物细胞成像中动态范围相对较小（只有10-15%的变化），但是该项工作强烈支持这样的假设，即GFP发色团可以通过引入Ca2+诱导的构象变化来被改变。通过位点定向诱变的Ca2+传感器的优点列举如下：1）如果它到发色 团的距离比接枝途径短，那么在EGFP表面上的Ca2+结合位点的直接设计应该产生较大的信号变化动态范围。这是因为GFP表面与发色团之间的最短距离仅为约而结合到接枝的EF手型上的Ca2+应在远于处串扰发色团。这种新的策略可对发色团具有更直接的影响。2）我们选择EGFP（wt.GFP的S65T突变体）作为支架蛋白，因为它是稳定的、无毒的，并在生理条件下表现出稳定的光学荧光[36]。该cycle2突变（M153G、V163A）[37]在支架蛋白中产生，以便于提高在高温下的蛋白质折叠效率，因为折叠不好不仅会导致由于低荧光强度而使细胞成像不合格，而且还会使Ca2+结合位点功能不良。由于wtGFP是由居住在深冷海洋中的多管水母（Aequor Jellyfish）所编码的，因此哺乳动物细胞的生理温度不利地高。3）根据基于CD2的Ca2+结合蛋白设计的成功，通过改变来自于局部带负电荷配位配体的结合位点的静电势，可以容易地开发出具有不同Ca2+结合亲和力的蛋白质[38]。4）通过融合不同的信号肽，所设计的基于GFP的Ca2+传感器可以特异性地针对各种细胞器或组织。5）它能够克服由于Ca2+信号传导的扰动而产生的目前报导的基于天然Ca2+结合蛋白的Ca2+传感器的局限性[39]。此外，我们建议进行核磁共振分析，以探索影响发色团环境和发色团的构象变化的特定分子的机制。这将为检测不同分子的基于GFP的生物传感器的开发提供坚实的理论证据。
通过位点定向诱变，在GFP表面上设计Ca2+结合位点的基本原理如下：图1示出了在EGFP（7E15.EGFP）中设计的Ca2+传感器，这是基于以下考虑：首先，这种Ca2+结合位点设计成模拟CD2中7E15的结合位点，这是通过五个带负电荷的残基而形成，这五个带负电荷的残基的侧链羧基氧定位于五角双锥几何结构中，以便实现相似的Ca2+结合亲和力。第二，耐受用于蛋白质折叠的突变可视为是为了避免荧光强度的扰动。我们根据已公开文献选择该位点，其中，三个大块的芳香残基突变成为围绕该区域的带有正电荷的芳香残基，以便于防止二聚体的形成。[40]第三，荧光灵敏度点由在特定位置中的发色团溶剂可及性而确定，因为通过将发色团暴露于溶剂，荧光趋向于猝灭。Richmond已经报道了通过残基204以及147的位点定向诱变，响应于10-100μM的Cu2+，具有多于40%的荧光熄灭的Cu2+指示剂[41]，这证明了该区域周围具有高度的水可及性。我们将所有 五个带负电荷的残基应用在该区域周围，以便通过侧链电荷排斥力削弱在反平行β片层之间的氢键。第四，将发色团和钙结合位点之间几何距离最小化，以便使得在Ca2+与发色团之间进行最大的相互作用。据报道，参与与发色团的氢网络的几个残基，例如222和203，具有在该区域中紧密的最短距离。
根据本公开内容的分析物传感器的实施方案包括荧光主体多肽和分子识别基序，分子识别基序与分析物相互作用（例如钙（或如本文所述的其它金属）或钙在其微环境中的流量）。在分析物与分子识别基序相互作用后，分析物传感器产生光学可检测信号（或光学可检测信号改变或信号的寿命改变），该光学可检测信号是在暴露于分析物的过程中产生的。将该分子识别基序整合到或可操作地连接到（在氨基酸序列内）荧光主体多肽中。基于分析物的量，分析物与分子识别基序的相互作用在分析物传感器的荧光特性中产生可检测的变化（例如，强度、或吸收的最大波长或成像、透射光、荧光激发或发射变化、光散射、信号的寿命、和/或发色团和蛋白质的能量转移的改变）。
通过使用相关分子识别基序，分析物传感器可用于研究疾病的机制，跟踪疾病的过程，以及诊断与体外、活细胞中以及体内的分析物活性相关的一些疾病。另外，特定的信号肽也可用于实时并原位研究机制，例如与各种细胞区室中的钙（或如本文所述其它金属）活性相关的疾病的激活或抑制，这在生物技术、细胞生物学和药物化学、疾病的诊断和预后、钙抑制剂筛选以及药物开发中有用。
分析物传感器的实施方案包括一种工程化荧光主体多肽，该工程化荧光主体多肽具有包括多个带负电荷残基的金属离子结合位点，其中带负电荷的残基包括多个定位在五角双锥几何结构中的羧基氧，其中所述几何结构提供了与工程化荧光主体多肽的发色团区域可操作地相互作用的金属离子结合位点，以使金属离子分析物与分子识别基序的结合对由荧光主体多肽发射的荧光信号的发射进行调制，并且任选地，对工程化荧光主体多肽的吸收光谱进行调制。
在该分析物（例如、钙、铅、镧系元素等）与分析物结合位点相互作 用后，该分析物传感器产生相对于相互作用之前的分析物传感器改变的信号。在这点上，在该分析物与分析物结合位点相互作用后，荧光主体多肽内发色团的相对三维位置发生改变，其中，这样的改变会产生改变的信号。
换句话说，该分析物传感器在三维空间中具有折叠的布置，这产生特定的信号。在以分析物结合位点诱导分析物（例如，钙、铅、或镧系元素）下，分析物传感器可经历局部构象变化成为带有发色团微环境变化的另一种折叠布置。可以检测和测量该构象变化，并将该构象变化与在与分析物相互作用之前的钙传感器产生的信号进行比较。
本公开内容的实施方案的优点可以包括以下的一种或多种：（i）本公开内容的实施方案能够通过活细胞成像监测在活细胞或组织中的许多细胞事件。本公开内容的实施方案能提供细胞事件的连续和动态影片以及它们对刺激或药物的响应。本公开内容的实施方案在很大程度上克服了目前商业可获得的小分子染料、肽/模拟物探针以对分析物行为的一张快照的局限性；（ii）本公开内容的实施方案包括单个荧光蛋白，比起使用两种荧光蛋白的FRET对，更容易且更好地在细胞环境下移位以原位探测分析物的反应。在添加信号肽的情况下，这些分析物传感器可以被特异性地表达/放置于诸如ER、线粒体、高尔基体或细胞核的细胞环境中，以便不仅有时间分辨率还具有空间分辨率地监测细胞事件。当前可用的染料检测方法简单地依赖于探针通过膜进行被动扩散，并且在靶向细胞位置处，只允许对钙的行为进行短时间快照而没有检测反应的能力。由于有限的细胞寿命和特异性，这些探针不能提供钙行为的连续动态成像；（iii）本公开内容的实施方案不使用现有的/天然钙结合蛋白质以感测金属离子（例如，钙、铅、或镧系元素），因此，它们具有最小的细胞网络扰动；（iv）本公开内容的实施方案包括单个荧光蛋白单元，克服使用基于FRET的传感器观察到的局限性，由于基于FRET的传感器的大尺寸，它们易于发生荧光光褪色、在细胞区室中的取向和移位差；（v）通过将传感器的浓度变化以及荧光信号的细胞和仪器的干扰标准化，在398和490nm处的吸收或激发下，本公开内容的实施方案的比率信号变化允许对钙（或如本文所述的其它金属）的行为进行定量以及精确的测量；（vi）创建具有不同分析物亲和力的不同传感器允许以高精确度和灵敏度监测细胞响应；（vii）本公开内容的实施方案中使用的结构基序允许化学反应所需的最大光学响应以及最佳分子识别；和（viii）所开发的分析物传感器可以在细菌、哺乳动物细胞以及例如小鼠的动物中表达，并具有本文所述的良好的光学特性。可由金属离子结合诱导的本公开内容的工程化多肽的荧光和吸收性能的变化也可用于检测导致逆向变化的金属离子的去除。
因此，本公开内容的系统、传感器、以及方法可用于在体外和体内对于分析物与分析物结合位点之间的相互作用进行检测、测量、定量、和成像。具体而言，本公开内容的实施方案可以在体外、在细胞中、组织中、以及在体内用于检测（且可视化）和/或定量钙的相互作用或事件。另外，本公开内容的系统、传感器、以及方法可以用于在体外和体内检测、测量、定量分析物结合位点的pH变化。此外，本公开内容的系统、传感器、以及方法可用于控制系统中分析物的浓度。
根据本公开内容的分析物传感器可包括具有金属离子结合位点的工程化荧光主体多肽，该金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，其中，带负电荷的残基包括定位在五角双锥几何结构中的多个羧基氧，其中，所述几何结构提供了金属离子结合位点，金属离子结合位点与工程化荧光主体多肽的发色团区域可操作地相互作用，使得金属离子分析物与分子识别基序的结合对由荧光主体多肽发出的荧光信号的发射进行调制，并且任选地，对工程化荧光主体多肽的吸收光谱进行调制。在一个实施方案中，带负电荷的残基在三个反平行β片层的表面上。在一个实施方案中，带负电荷的残基分布在具有β罐结构的蛋白质的三条链上。
通过将分析物结合位点掺入到荧光主体多肽以及结构基序的氨基酸序列中，改变了荧光蛋白的天然信号。具体而言，本公开内容的实施方案提供了分析物结合位点的插入位置，使得该分析物传感器在两种或多种波长处产生发射。在这一点上，发色团在荧光主体多肽内的相对三维位置通过分析物结合位点以及结构基序的掺入而改变，其中这种改变产生了改变的信号。
在分析物（例如，钙、铅和/或镧系元素）与分析物结合位点相互作用 后，分析物传感器产生相对于相互作用之前的分析物传感器改变的信号。在这点上，在分析物与分析物结合位点相互作用后，发色团在荧光主体多肽内的相对三维位置改变，其中这种改变产生改变的信号。相互作用后的信号（发色团信号）的比率变化允许进行分析物活性的精确测量（例如，在体外和体内使用标准化传感器浓度）。结构基序的掺入允许通过并入特定类型分析物所必需的重要结构和化学特性来进行最佳分子识别。例如，结构基序的掺入允许：易于接近钙的溶剂可及性、识别所需的柔性、用于相互作用的特殊的几何袋、为便于结合过程的亲水性表面或带电环境、和用于快速动力学速率如实时测量所需的良好的解离速率所需的环境。
钙-结合GFP的设计：绿色荧光蛋白中钙结合蛋白的设计使用已确立的设计程序以及基于五边形双锥体几何结构的给定参数来进行（Biochemistry44：8267-8273；J.Am.Chem.Soc.127：2085-2093；J.Am.Chem.Soc.125：6165-6171）。超过3000个潜在的钙结合位点通过计算进行构建。
施加多个标准用于排序以及选择位点：（i）去除在中心螺旋（即氨基酸56至71）中包含突变的任何位点；（ii）去除使用带电荷的残基取代隐蔽的疏水性残基的位点，以避免折叠破坏；（iii）消除包括溶剂不可及残基例如Phe8的位点，因为对于许多钙结合位点而言都观察到了溶剂可及性。溶剂可及性由程序GetArea进行评价；（iv）将具有更高的柔性的环形区域中的突变视为是“安全”的而不破坏蛋白质折叠，而包括在β链上的突变的位点则视为更具破坏性；（v）由于较少的突变不太可能扰动蛋白质天然构象，因此优选的是具有多个现有残基的预测位点作为配体；（vi）为了钙传感器的可能的开发，还评价了从发色团的距离。检查了蛋白质的过度包装（over packing），并避免了与闭合残基的冲突。此外，基于钙结合蛋白的统计结果，优选的是带有三至四个带负电荷配体残基的位点；以及（vii）具有潜在钙诱导荧光变化，基于荧光蛋白的动态和构象特性，对发色团敏感位置进行了分析。
图14显示了位于根据标准选择的GFP中的三个不同位置的五个钙结合位点（称为GFP.D1、GFP.D2、GFP.D2′、GFP.D2′′、以及GFP.D3）（表1）。 GFP.D1位于环形区域中的桶的端部处。由于环形区域的柔性，预计在EGFP的折叠和结构上具有较小影响。GFP.D2、GFP.D2′和GFP.D2′′位于桶的从GFP.D1相对端部上的环区域中。它们含有四个相同的配体残基，并且相差一个残基。GFP.D2具有配体L194E、S86D、S2D、D82和E5。在GFP.D2′和GFP.D2′′中L194都突变为N。GFP.D2′含有K85D突变，GFP.D2和GFP.D2′′包含S86D。这改变了在局部环境中的侧链包装和静电相互作用，这是由于Lys、Glu、Asn和Ser的不同的尺寸和电荷性质。GFP.D3位于桶的中间，距离发色团包括两个天然的配体残基以及三个突变在内的所有配体残基都位于β链上。
设计的蛋白质的发色团和构象特性：4个钙结合位点经工程化到EGFP中，并且它们显示出不同的光学特性。在大肠杆菌中的所有细菌表达蛋白质中，GFP.D2是保留了绿色荧光颜色的唯一一个。如图15A和图15B所示，该细菌表达和纯化的GFP.D2以及它的系列和野生型EGFP在490nm处呈现出最大吸收。在490nm处的激发导致在510nm处具有最大发射。相反，其余的细菌表达蛋白质GFP.D1和GFP.D3是无色的，表明在细菌表达系统中没有发色团形成。图15B显示了这些设计的蛋白质的远紫外CD光谱类似于EGFP在216nm处具有负的最大值，表明尽管发色团的形成受到干扰，但是在引入钙结合配体残基之后，主要的β片层结构并没有改变。
GFP最初是来自于水母，以及据报道真核表达系统可促进发色团形成，因为真核细胞包含有助于蛋白质折叠的机构（J.Mol.Biol.353:397-409）。图16示出了当在Hela细胞中表达时，GFP.D1和GFP.D2都表现出荧光。相反，当在哺乳动物细胞中表达时，GFP.D3保持无色，这与它在细菌系统中的表达类似。这些结果表明，引入几个用于钙结合的带电荷残基不影响蛋白质的折叠和结构，但的确影响发色团的合成以及形成，发色团对于环境的变化具有较小的耐受性。
设计的GFP变体的金属结合亲和力及选择性：设计的GFP变体对钙及其类似物镧系离子的金属结合能力使用四种不同方法检查，这四种方法使用的是细菌表达和纯化的蛋白质。对于带有正确形成的发色团的GFP.D2而言，金属结合亲和力是通过监测作为金属浓度函数的荧光信号的变化来 直接确定的。如图17A所示，加入0-10mM的钙，导致了在398nm处激发时在510nm处的荧光信号逐渐减少。510nm处的分数变化可以使用形成1：1的钙：蛋白复合物的等式很好地拟合。钙的解离常数为107±13。另一方面，当加入金属离子后，野生型EGFP并没有任何显著的荧光信号变化。
使用若丹明-5N（Molecular Probes）这种商业可获得的钙结合染料，以便于通过染料竞争实验获得钙以及镧系元素的亲和力。如图17B所示，当钙结合在GFP.D1中时，若丹明-5N显示出了荧光信号有大的增加。在该染料竞争实验中，用钙对具有恒定染料和蛋白质浓度的溶液进行滴定，直到观察到饱和（图17B的插图）。设计的蛋白质的结合亲合力是通过将光谱与金属双配体模型总体上拟合而获得的。如表1所示，通过直接测量荧光信号变化而获得的GFP.D2的钙结合亲和力与通过染料竞争方法所得到的一致。
表1：工程化到绿色荧光蛋白中的设计位点
对于120、177和194而言，铽亲和力是在pH6.8的20mM PIPES、10mM KCl、1mM DTT、1%甘油中测量的。对于194来说，铽亲和力是在pH7.4的10mM Tris、1mM DTT、1%甘油中测量的。对四个位点的钙亲和力是在pH7.4的10mM Tris、1mM DTT、1%甘油中测量的。
然后，使用钙结合染料竞争以获得这些细菌表达蛋白GFP.D1、GFP. D2、GFP.D2’、GFP.D2”和GFP.D3的钙结合亲和力。它们的钙结合亲和力分别是60±5μM、57±2μM、96±7μM和38±5μM。
为了进一步表征所设计的蛋白质的金属结合，使用了铽敏化荧光共振能量转移。铽是一种具有类似离子大小以及结合几何结构的钙类似物，其自身在545nm处发荧光并且能够接收从芳香族残基转移的能量。EGFP包含1Trp和10Tyr，并且Trp处于GFP.D1和GFP.D2的内以及在GFP.D3和GFP.D4的内（表1）。如图17C所示，向蛋白质中加入铽导致在280nm处激发的在545nm处的铽-FRET信号有大的增加。假定金属：蛋白质复合物的比是1:1，作为铽浓度函数的增强作用提供了结合亲和力（表1）。在pH7.4下测试的这三种蛋白质中，GFP.D1具有最强的铽亲和力（1.9±0.4μM）。GFP.D2具有4.9±0.2μM的稍弱的亲和力，GFP.Ca2’表现出32±13μM的15倍更弱的亲和力。在pH6.8下，GFP.D2”表现出对于铽的2.9±0.3μM的结合亲和力。由于竞争，将钙和镧加入到铽蛋白质复合物中显著降低了铽的荧光增强作用。
如图17D所示，加入1mM的钙导致GFP.D1的铽荧光大幅降低，表明钙与蛋白结合并且与铽竞争结合。加入100μM的镧导致了荧光减少到一半，显示出估计的5倍更低的金属结合亲和力（约10μM）。另一方面，加入较高浓度的镁（10mM）导致了相对较小的减少，这显示出相对较弱的结合亲和力。类似地，GFP.D2’表现出使用1mM钙或者100μM镧的荧光最大降低一半，这也比镁更有效。总之，钙和镧系元素结合到蛋白质中的相同袋，并且它们具有大于镁20倍的选择性。本公开内容的钙结合位点具有Kd在38-96μM的范围中的钙结合亲和力。在钙浓度远高于细胞质中浓度的细胞外环境中或ER中，在没有镁的干扰下，金属选择性也足够将蛋白质结合到钙上。
本公开内容的实施方案提供包括分子识别基序的分析物传感器以及荧光主体多肽，该分子识别基序结合分析物（例如、钙、铅、和/或镧系元素），其中，该分子识别基序是可操作地连接到或整合在荧光主体多肽中的。分析物与分子识别基序的相互作用产生了可检测的变化。表2列出了分析物传感器的一些实施方案、相应的SEQ ID NO、以及特定的分析物传 感器的特性，其它分析物传感器在SEQ ID.No.115-159中描述。尽管SEQ ID NO.1-99以及SEQ ID NO.104-105和SEQ ID NO.115-159包括氨基酸的特定顺序，但是只要分析物传感器产生的结果与本文公开的实施方案一致，每组（例如，分子识别基序、荧光主体多肽等）可以不同地放置。
表2
SEQ ID.No.105对应于CaratER传感器。来自钙网蛋白信号肽的ER靶向序列的残基附接至N-末端，ER保留序列附接至C-末端。SEQ ID.No.:105包括新结合位点的突变和分别在N和C末端上的ER靶向和保留序列。传感器的另外的序列描述在SEQ ID.No.115到SEQID.No.159中。
荧光主体多肽可以具有分子识别基序，该分子识别基序在多个位置之一处插入或整合到荧光主体多肽中，其中每个不同的插入点为分析物传感器提供了不同的特性。例如，当荧光主体多肽是增强的荧光蛋白（EGFP）时，分子识别基序可以插入到位置152、172、或170中。
还应当注意的是，荧光主体多肽可以经修饰以通过包括对荧光主体多肽的两个或三个突变来提高分析物传感器的热稳定性和/或荧光特性。特别 地是，EGFP可以包括两个突变（M153T、V163A）和/或三个突变（F99S、M153T、V163A），如本文所述，这提高了热稳定性和/或荧光特性。这些突变分别记录在SEQ ID No.:16到SEQ ID No.:45、SEQ ID No.:48到SEQ ID No.:51、SEQ ID No.:54至SEQ ID No.:57、和SEQ ID No.:72至SEQ ID No.:99中。描述本公开内容具体实施方案的其它细节和实例在以下提供。
基于分析物传感器的荧光特性，分析物传感器的DNA构建体可以插入到重组载体或者可方便地进行重组DNA过程的任何合适的载体中。特定的载体可以依赖于宿主细胞的类型。例如，可以作为染色体外实体而存在的重组DNA质粒载体可以是合适的载体。可选地，所述载体可以是这样的载体，当被引入到宿主细胞中时，整合到宿主细胞的基因组中，并且与所整合入的染色体一起进行复制。已经构建了分析物传感器后，包含荧光核酸分子的载体就可以制成各种组合物，例如用于转染宿主细胞的溶液（例如，缓冲溶液）。
使用在蛋白质-分子复合物将被暴露的条件下稳定的任何连接，荧光主体多肽或其变体可以直接或间接地链接到分子上。因此，通过在蛋白质和分子上存在的反应性基团之间的化学反应，荧光主体多肽和分子可以进行链接，或者该连接可由接头部分介导，该接头部分含有对于荧光主体多肽以及分子具有特异性的反应性基团。应该认识到，用于连接荧光主体多肽变体和分子的合适条件的选择是取决于例如，分子的化学性质和所需键的类型。当目的分子是多肽时，用于连接荧光主体多肽变体和分子的便利的方式是通过从重组核酸分子将它们表达为融合蛋白，重组核酸分子包括编码例如荧光主体多肽的多核苷酸可操作地连接于编码多肽分子的多核苷酸。
分析物传感器的实施方案可以通过重组DNA技术生产为嵌合蛋白。包括荧光主体多肽的蛋白的重组生产包括表达具有编码蛋白质的序列的核酸。编码荧光主体多肽的核酸可以通过本领域已知的方法获得。例如，可以使用基于维多利亚多管水母GFP的DNA序列的引物，通过DNA的聚合酶链式反应分离编码蛋白质的核酸。荧光主体多肽的突变形式可以通过编码荧光蛋白的其他核酸的位点特异性诱变来制备，或者通过使用0.1 mM MnCl2和不平衡的核苷酸浓度而增加原始多核苷酸的PCR的错误率所引起的随机诱变来制备。
分子识别基序可包括分析物结合位点、一个或多个结构基序以及靶向基序。分析物结合位点和结构可以包括上述的那些。靶向基序能够靶向细胞器和亚细胞器，诸如但不限于ER、线粒体、高尔基体、核、通道、间隙连接、和细胞外空间。靶向基序包括但不限于编码位于靶细胞器的蛋白质中的信号肽。靶向基序包括SEQ ID No.:5-6、20-21、35-36、65-66、79-80、93-94中列出的那些，其中，特定的氨基酸序列如前所述。如上所述，这些基序可以进行不同于本文所述的定位，只要它们具有的特性与所公开的实施方案一致。描述本公开内容具体实施方案的其它细节和实例在以下提供。
本公开内容提供包括分子识别基序的分析物传感器和荧光主体多肽，该分子识别基序结合金属离子分析物（例如、钙、铅、和/或镧系金属），其中，该分子识别基序可操作地连接到或整合在荧光主体多肽中。分析物与分子识别基序的相互作用产生了可检测的变化。分析物传感器具有包含分子识别基序和荧光主体多肽的蛋白质序列，选自：SEQ IDNo.:5、6、20、21、35、36、80、81、94和95。
分析物传感器的一个实施方案具有选自如下的至少一个特征：在大于约30℃的温度下稳定；具有增强的荧光特性和光学特性（例如从荧光蛋白的突变得到（例如，F99S、M153T和V163A））及其组合。特别地，分析物传感器的实施方案（表示为C2或C3变体）（SEQ IDNO.:16-45、48-51、54-57、和72-99）能够在哺乳动物和细菌细胞两者中都维持荧光。本文描述的每个实施方案都能够结合钙和其他金属离子（包括但不限于，Pb2+、Tb3+、La3+、以及Gd3 +）。
本公开内容的分析物传感器的实施方案可通过首先构建包括能够响应金属离子分析物的分析物结合位点的分子识别基序，随后将分子识别基序可操作地插入到荧光主体多肽中来产生。在大多数情况下，分子识别基序典型地具有一级结构、二级结构和三级结构，并且在某些情况下具有四级结构，这些结构中的至少一个可以对分析物传感器定制以获得分析物灵 敏度所需的水平。也就是说，一级结构、二级结构、三级结构以及（如果存在的话）四级结构中的每一个都可以独立地或者与一个或多个其他结构组合地对分析物传感器定制，以获得传感器相对于分析物的灵敏度的所需水平。例如，分析物与分子识别基序的结合优选地在可检测的信号（例如荧光）中产生变化，并且分子识别基序的操作操控传感器的响应性。
由于在激发时，分子识别基序能够产生可检测的变化，表达蛋白，并向分析物传感器提供激发，以及随后对可检测的变化进行定量，所以分析物传感器的实施方案还可以允许分析物的定量。优选地，该蛋白可以包括荧光主体多肽，荧光主体多肽的发射强度是相对于微环境中分析物的量。
产生分子识别基序的一种方法是通过使用整合方法。该整合方法集中于对分子识别基序进行工程化以及构建，这是通过对所鉴定的结合位点的一级、二级、三级和/或四级结构进行修饰。
使用整合方法用于构建分子识别基序的示例性方法包括首先鉴定以特异性结合分析物的分析物结合肽，然后确定编码该分析物结合肽的核酸序列的至少一部分。这完成后，将编码该分析物结合肽的核酸序列定制为包括分析物结合位点的分子识别基序。在完成该定制之后，选择荧光主体多肽，并且鉴定荧光主体多肽的核酸序列的相关的部分，将编码分析物结合肽的定制的核酸序列与荧光主体多肽核酸序列可操作地链接为分子识别基序序列。最后，表达该分子识别基序序列。在该方法中，对编码分析物结合肽的核酸序列进行定制，以便获得带有对分析物的所需特异性的分子识别基序。优选的是，定制编码分析物结合肽的核酸序列以具有对该分析物超过对其他分析物的特异性。由分子识别基序序列编码的所得的蛋白是本公开内容有用的产物。
分析物结合位点的一级结构可以通过将至少一个密码子插入编码分析物结合肽的核酸序列而选择性地修饰。类似地，带电荷的氨基酸的密码子可以插入到编码分析物结合肽的核酸序列中。除了其它方法以外，通过有选择地处理和添加螺旋、环、桥或接头，也可以对该分析物结合位点进行修饰。带电荷的氨基酸可以插入到编码分析物结合肽的氨基酸序列中，以及或者芳香族氨基酸可以引入到编码分析物结合肽的氨基酸序列中。
用于产生所需的分子识别基序的另一种方法是通过使用计算方法，其中，用于从头工程化和构建分子识别基序的计算方法是基于分析物与其他部分的最佳结合特性。在一个示例性实施方案中，使用评估Ca2+结合数据的已确立的标准，可以通过分子建模来构建具有所需的灵敏度的Ca2+结合位点。例如，可基于一些参数使用这样的计算算法来开发所需的离子结合基序，这些参数是例如金属的结合几何形状、主体蛋白的折叠、电荷在荧光蛋白上的位置、特定发色团、以及针对Ca2+结合数据的其它标准。
通过以下，该计算方法可用于构建分子识别基序：访问包含有关分析物结合位点的结构数据的公共和/或私人数据库，基于某些先前选择的标准从结构数据生成至少一个初步的分析物结合位点，从初步的分析物结合位点选择一个或多个适合的分析物结合位点，并通过定制所选的分析物结合位点以及通过将其与宿主蛋白进行可操作地链接来构建分析物结合基序，要记住，该分子识别基序优选地对于选定的分析物具有特异性。结构数据通常可包括氨基酸序列、二级结构、核酸序列、几何参数、静电特性、以及该分析物结合位点的配位特性，例如在蛋白质和基因库中。
该计算方法可以在一种系统上或通过一种系统来执行，该系统包括至少一个包含有关分析物结合位点的结构数据的数据库、使用与分子识别基序相关的所选标准用于从结构数据的部分中生成初步分析物结合位点并基于对所选的分析物的特异性对初步分析物结合位点分级的算法、以及用于执行该算法以便查询数据库来生成初步分析物结合位点的计算机。总的来说，该算法是一种相对简单的搜索的算法，该算法将基于输入的标准来查询数据库。
在分子识别基序已经被定制并且可操作地链接到荧光主体多肽中后，该分析物传感器可以表现出对分析物依赖性荧光变化的响应性。该分析物传感器的响应性是通过荧光主体多肽与分子识别基序的相互作用而引起的，它随后可显示与分析物浓度或流量成比例的荧光特性。特别地，该响应性被认为是由荧光蛋白发色团的定向和质子化中的改变引起的。分析物与荧光主体多肽之间的相互作用可以导致在发射光谱、量子产量、和/或消光系数中的偏移，可以对该偏移进行实时的定量分析来探测微环境。
在使用和应用中，分析物传感器的实施方案可以用于在例如非比率染料的样品中来检测和定量分析物的浓度和流量。更具体地说，将分析物传感器插入到样品中，然后，样品被辐射所激发，随后使用光学装置测量来自样品的荧光，之后对荧光或其流量进行分析以便于定量或检测样品中的分析物浓度。为了分析样品，可能需要基于已知分析物浓度产生的荧光来生成标准曲线。具体地说，将分析物传感器的荧光信号与标准曲线的荧光进行比较，从而确定样品中分析物的浓度。
荧光主体多肽：根据本公开内容的分析物传感器可以包括荧光主体多肽或多肽（也称为“光学活性荧光主体多肽”或“光学活性荧光蛋白”）。通过将分析物结合位点掺入在荧光主体多肽的氨基酸序列中，荧光蛋白的天然信号被改变了。本公开内容的实施方案提供荧光主体多肽中分析物结合位点的特定插入位置，使得分析物传感器产生在分析物与分析物结合位点相互作用时被改变的发射。在这点上，荧光主体多肽内的发色团的相对三维位置由分析物结合位点的掺入来被改变，其中这种改变产生了改变的信号。在一个实施方案中，分析物传感器能在两种或多种可区分的波长发射。
适用于本公开内容的分析物传感器中的荧光主体多肽包括但不限于从维多利亚多管水母分离的绿色荧光蛋白（GFP）、以及大量的GFP变体，例如增强的荧光蛋白（EGFP）。特别地，水母绿色荧光蛋白（GFP）及其增强的荧光蛋白具有在单个多肽链上的大约238个氨基酸残基。已表明，天然分子从完全变性的状态再生它的自身荧光。GFP显示了强的可见吸光度和荧光，这被认为是通过发色团的自动环化和氧化产生的，该发色团在238个氨基酸序列的65至67的位置上具有三肽Ser-Tyr-Gly序列。GFP的突变已经导致了在吸光度和荧光中的各种偏移。GFP的可用性来源于来自GFP的荧光，不需要额外的辅因子；荧光团是通过肽主链的环化反应自组装的。
GFP的发色团是由三肽Ser65-Tyr66-Gly67的环化形成的。该发色团位于β桶内部，该β桶包括11个反向平行链和单个中央α螺旋。存在封盖β桶端部的短螺旋。发色团具有大量与蛋白质框架键合的氢键，并且发色团可在不同折叠状态下受到水分子的影响。发色团是在紧密构建的β桶中， 当在470nm激发时，该β桶显示了在400至480nm处的吸收峰以及510nm处的发射峰，并且量子产量为约0.72。增强的绿色荧光蛋白（EGFP）中发色团具有提高的荧光强度和热灵敏度，其中，增强的绿色荧光蛋白（EGFP）是带有突变S65T的GFP。
在37℃或37℃以上，将两个（M153T、V163A）或三个额外的突变（F99S、M153T、V163A）加入到EGFP中以增加蛋白质的表达、稳定性以及发色团形成。
例如，如表2中所示，如SEQ ID No.:1-58中所示，包含特定分析物结合位点的接头可以被接枝在位置170、172、和157之间。
分析物结合位点的一个实施方案可以通过荧光蛋白中的突变形成适当的结合袋而产生，而不使用来自连续序列段的氨基酸。例如，如表2中所示，所有的序列都示于SEQ IDNo.:59-99中。
分析物结合位点：根据本公开内容的分析物传感器可以具有包括分析物结合位点的分子识别基序。通过将分析物结合位点整合到荧光主体多肽的氨基酸序列中，荧光蛋白的天然信号可以被改变。发色团在荧光主体多肽内的相对三维位置可通过分析物结合位点的掺入来改变，其中这种改变产生了改变的信号。传感器中的这一信号变化可以导致在吸收和/或荧光激发两方面的比率的变化，即，在一个波长处的增加、降低、或增加，和在另一个波长处的相对变化。
分析物结合位点的一个实施方案通过与金属离子分析物相互作用来起作用，相对于相互作用之前的分析物传感器，这种相互作用致使分析物传感器产生改变的信号。发色团在荧光主体多肽内的相对三维位置可在分析物与分析物结合位点相互作用时被改变，其中这种改变产生改变的信号。
分析物结合位点可以包括但不限于，其中分析物结合到分析物传感器上的一种结合位点。该结合位点可以是其中分析物结合到分析物传感器的位置。通常，以特定的顺序或特定的空间排列的特定类型的氨基酸可用于特定类型的分析物。根据反应和结合性质和发色团的相对改变，分析物的 结合可导致分析物传感器信号的改变。然而，该裂解反应将导致传感器信号产生很大变化。这可能是由于发色团在荧光主体多肽内的三维位置的局部环境的改变，该改变引起信号发生改变。这种改变可以是由于氢网络的扰动、动态特性、溶剂可及性或者例如疏水性以及静电相互作用的化学特性而引起的。
优选地，可以对荧光主体多肽内的用于插入分析物结合位点以及裂解位点的位点的实施方案进行选择，使得该位置对于金属离子分析物具有可及性。另外，可以对荧光主体多肽内的位置进行选择，使得该位置基本不会降低来自荧光主体多肽的荧光，并且使得该位置基本上不会变性或改变荧光主体多肽或发色团的蛋白质折叠。此外，可以根据以下一个或多个标准，对荧光主体多肽内的用于插入分析物结合位点以及裂解位点的位点进行选择，所述标准为：溶剂可及性最大化以允许有效的酶作用，分析物结合位点可操作地掺入到荧光主体多肽中后，荧光/光信号的最大化；分析物结合位点与分析物相互作用后，发色团环境破坏的最小化；最小化对荧光主体多肽的蛋白折叠和包装的影响；和由于分析物与分析物结合位点的相互作用，发色团信号的比率变化的最大化，以允许在体外或体内对分析物的活性进行精确的测量。应当注意，分析物结合位点可以被包括在荧光主体多肽的基序内或基序之间，如二级结构基序、三级结构基序、或四级结构基序内或基序之间。具体地，分析物结合位点可以插入β桶的环中，及环之间。
结构基序：在分子识别基序中掺入结构基序允许通过并入特定类型的分析物所需的重要结构特性和化学特性来进行最佳分子识别。例如，分析物较容易接近的良好的溶剂可及性、识别所需的良好柔性、用于相互作用的特殊的几何袋、便于结合过程的亲水性表面或带电荷环境以及快速动力学速率要求的环境，如实时测量所需的良好的解离速率。
例如但不限于，对于溶剂的可及性和柔性，例如螺旋-环-螺旋或局部基序可以是有用的。这些螺旋-环-螺旋基序可以是来自EF手型基序、来自钙结合蛋白如钙调蛋白或trponic c、S100或来自核结合基序等。另外，其它结构基序如β-环-β或β-环-螺旋、或线圈结构或结构域以及包含裂解序 列的片段可以用于本公开内容的实施方案中，例如表2中所列的，相对于能够改变发色团环境的发色团，所述的结构基序位于敏感的位置。
靶向基序：靶向基序可具有对目标的亲和力，该目标例如可以是与样品或宿主的正常或病理状态、生物或生理事件相关的细胞、组织、小分子、蛋白质、细胞器、亚细胞器等。靶向基序可以对一个或多个目标具有亲和性。该靶向基序可以是特异性的或者非特异性的。
可以选择非特异性靶向部分进行如下操作中的一个或多个：进入细胞或细胞类型、进入血管系统、进入胞外空间、进入细胞内空间、对细胞表面具有亲和性、通过细胞膜扩散、与细胞膜上的非特异性部分反应、由于血管系统渗漏进入肿瘤等。非特异性靶向部分可包括促进探针进入细胞的摄取的化学、生化或生物实体。非特异性靶向部分可包括但不限于细胞穿透肽、聚氨基酸链、小分子和肽模拟物。
本公开内容的纯化的蛋白质也可以直接注射到细胞或细胞空间以测量分析物浓度。选自SEQ ID No.1-99、104-105和115-159的传感器蛋白质也能够用于在体外测量分析物的变化，例如，在溶液中。纯化的蛋白质也可用作缓冲剂或螯合剂来起作用以在体内和体外控制分析物的浓度。
使用方法：可以考虑到的是本公开内容的分析物传感器可用于体内和/或用于体外。本公开内容的分析物传感器或系统可以导入到细胞或宿主中，该分析物传感器或系统可以表达在系统中，和/或该分析物传感器或系统可以包括于转基因动物或植物中。分析物传感器可以包括特定的信号肽，该信号肽用于将分析物传感器输送到不同的亚细胞区室中，例如细胞质、细胞核、线粒体基质、内质网、高尔基体和过氧化物酶体等。
本公开内容的实施方案提供用于检测和测量金属离子分析物的方法。该方法可以包括：将分析物传感器引入到系统中；允许分析物传感器与目的分析物相互作用，该目的分析物能够与分析物传感器的分析物结合位点相互作用；和检测或测量衍生自荧光团的荧光特性或变化。当分析物传感器的荧光活性的变化代表目的分析物的活性时，该方法提供了研究和评估分析物活性的方法。
本公开内容的方法的实施方案可以包括：通过标准基因转移方法将编码分析物传感器的质粒引入到宿主细胞中；在宿主细胞中表达分析物传感器；允许分析物传感器与目的分析物相互作用，该目的分析物能够与分析物传感器的分析物结合位点相互作用，从而检测或测量荧光信号或变化。当分析物传感器的荧光活性的变化代表目的分析物的活性时，该方法提供了一种研究和评估分析物活性的方法。
该方法可以包括：将分析物传感器引入到系统中；允许分析物传感器与金属离子分析物相互作用，该金属离子分析物能够与分析物传感器的分析物结合位点相互作用；以及检测或测量荧光特性或变化，这些荧光特性或变化可以与pH变化相关。
本公开内容的实施方案还可以提供控制一种或多种金属离子分析物的浓度的方法。在一个实施方案中，该方法可以包括：将分析物传感器引入到系统中；允许分析物传感器与分析物相互作用，该分析物能够与分析物传感器的分析物结合位点相互作用。分析物传感器与分析物的结合控制着细胞或宿主中分析物的量。
根据本公开内容有用的样品包括生物样品、环境样品、或需要确定其中是否存在一种特定的分子的任何其他样品。样品可以是但不限于可以从动物或植物获得的活的细胞或细胞提取物。可选地，这些细胞可来自或衍生自细菌细胞。进一步来说，这些细胞可以从这些细胞的培养物例如细胞系获得，或者可以从生物体中分离。当该方法使用完整的活细胞或新鲜分离的组织或器官样品来实施时，可以鉴定活细胞中目的分子的存在，由此提供了实时地确定例如分子的胞内区室化的方法。
使用分析物传感器进行检测：使用分析物传感器或者是表达含有分析物传感器的细胞进行检测的方法可包括但不限于，用照射源照射该分析物传感器或表达传感器的细胞，使得分析物传感器或表达分析物传感器的细胞发出辐射。这种检测方法可以使用的照射源是例如白炽光源、荧光源、卤素光源、阳光、激光、和其它的等效源。当使用这样的照射源进行照射时，分析物传感器可以发出荧光，该荧光可以通过独立的目测或通过其它定性或定量方法来检测。用于测量样品的荧光的合适的方法是已知的，并 且是本领域的普通技术人员所理解的。
为了克服缓慢动力学的局限性（Zou等，Brioche，2007），通过重新设计基于GFP的Ca2+传感器中钙调蛋白和其靶向肽之间的结合界面，获得了提高到256s-1的解离速率常数koff。对基于GFP的Ca2+传感器中的发色团的质子化比率进行优化将提供进一步提高精确度的方法，使用该方法，Ca2+信号可以高时间分辨率来测量。
CatchER的光学特性中Ca2+诱导的变化：我们设计的Ca2+传感器的模型结构即CatchER是基于支架蛋白EGFP的。该结合位点邻近于发色团（正好在Y66酚氧上方）并挨着H148、T203和E222（图20A）；它的荧光灵敏度可以是出于氢键相互作用。X射线晶体结构显示出突变的残基侧链从蛋白质表面伸出，这提供了对溶剂的接近。该推定的Ca2+结合位点是由残基147、202、204、223和225形成的，这赋予了Ca2+-优选的几何特性（图20B）。通过在这些位置中引入带电荷残基而产生了5种变体（图20D-20H）。
使用已经建立的方法对CatchER（D11）及其变体（D8-D10和D12）进行细菌表达和纯化（Heim&Tsien（1996）Curr.Biol.6:178-182；Zou等，（2007）Biochemistry46：12275-12288）。引入酸性配体残基增加在398nm处的吸收最大值，以490nm峰为代价（图20I）。这种EGFP特征是与阴离子发色团的优势相关联的。吸收最大比率395/488从无带电荷残基的EGFP的0.2增加到带有四个酸性残基的D10的2.3（图20J）。在488nm处激发的510nm的荧光最大值平行于吸收最大值（图25A-25L）。
Ca2+向CatchER和其变体D9和D10的结合增加了在490nm处的吸光度并且在398nm处降低了吸光度（图25C-25E、图25M），这表明Ca2+结合增加了阴离子发色团。相反，当在395nm和488nm下进行激发时，510nm的发射最大值增加（图25I-25K、图25M）。在所有变体中，在Ca2+结合时（图25K和图25M），CatchER具有最大的荧光增强作用（约80%）并且获得大约50%的EGFP荧光强度。D8的荧光响应是可忽略的，这可能因为它具有极少的配体残基以及低的Ca2+结合亲和力。
金属结合辅助发色团形成，如所示的，在Ca2+存在时CatchER的pKa降低了0.7单位（图26B），值为6.9，这更接近EGFP的值。Ca2+结合逆转 了与添加带电荷的配体残基相关的在荧光特性中的变化，这可能是因为它中和了过量的负电荷，同时增强当在488nm和395nm处激发时的荧光。总之，这些结果提示了CatchER的独特机构，这涉及到伴随的荧光的恢复和发色团的离子形式的转换。
金属结合特性：几个方面的证据都证实简单的CatchER-Ca2+化学计量反应。Job曲线表明，Ca2+与CatchER形成1∶1复合物（图26C），响应于Ca2+滴定的荧光变化可以拟合成1∶1的结合等式（图21B）。使用肌红蛋白（非钙结合蛋白）、EGFP（非钙结合蛋白）、CatchER和α-乳清蛋白（Ca2+结合蛋白，且kd＝10-9M）与Ca2+的平衡透析实验证明，CatchER以弱亲和力结合Ca2+（图27A和27B）。
靠近所设计的CatchER的Ca2+结合位点的几个残基的Ca2+诱导的化学位移变化（图22A至22C）也可以拟合成1∶1的结合方法，kd值与那些通过荧光变化确定的值一致。在10mMTris pH7.4下，CatchER表现出最强的Ca2+结合亲和力，表观Kd为0.18±0.02mM，D9具有最弱的Ca2+结合亲和力，表观Kd为0.95±0.08mM（图20L）。在100mM KCl的存在下，CatchER的解离常数升高至0.48±0.07mM，这与Ca2+静电相互作用一致。Na+、K+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、ATP、GTP和GDP不能与Ca2+竞争来结合CatchER（图21C），这表明其具有良好的选择性。
CatchER的体外动力学性质：停流分光光度计用于记录当混合10μMCatchER与各种Ca2+浓度时的荧光变化。基线对应于与无Ca2+缓冲液混合的CatchER。初始荧光的40%至60%的增加发生在停流分光光度计的滞后时间内（即2.2ms）。作为Ca2+浓度的函数的△F的绘图得到了双曲线模式，其中，kd值为0.19±0.02mM与在同样的条件下由荧光平衡滴定确定的值为0.18±0.02mM的kd合理地一致（图20L）。观察到的速率常数独立于50μM和1000μM之间的钙浓度，其平均值为73±16s-1。
CatchER：在用10μM Ca2+加上EGTA平衡10μM CatchER之后，Ca2+解离速率通过直接监测荧光信号中的变化来测量。约70%的荧光变化在仪器滞后时间内完成（2.2ms），这与非常快速的Ca2+释放一致。如果需要两个半衰期来完成Ca2+从CatchER中释放所需类型的一阶过程的75%，则 为～700s-1的koff值可以从图26E中的数据估算得到。据我们所知，在所有报道的Ca2+传感器中，CatchER都表现出最快的解离速率。
通过高分辨率NMR的Ca2+-CatchER相互作用的结构分析：在引入所设计的Ca2+结合位点、残基，诸如Y143、T153之后，附近的结合位点或发色团周围的V68表现出超过1.5-ppm的变化，大多数残基在CatchER和EGFP之间具有小于0.4-ppm的Cα化学位移变化（图29C）。该发现表明，加入带电荷的配体残基改变了局部的发色团构象，减少了荧光，并且朝着中性状态迁移了发色团的离子状态。
通过动态NMR，Ca2+传感器在溶液中保持是单体。Ca2+结合引起位于所设计的Ca2+结合位点附近的T153、Y143、L42和T43残基的HSQC光谱中显著的化学位移变化（图29C）。应注意到，靠近所设计的位点处的Y143的主链显示了最大位移。这些化学位移拟合为1∶1结合等式，Kd值与通过荧光测量（图21B）而确定的值一致，这显示出这些残基之间的高度相关性。另一方面，残基R96、Q94、F165以及V61朝向发色团突出，但远离所设计的Ca2+结合位点，没有表现出显著的化学位移变化，表明Ca2+与所设计的位点特异性结合。
尽管在HSQC光谱中缺乏发色团信号，但NMR可以进一步揭示Ca2+诱导的发色团变化。将Q69掩埋于蛋白质中并且与发色团形成氢键。加入Ca2+后，它的单个共振逐渐变成两个（图22B），这显示出Ca2+结合将Q69从快速交换状态转变成两种不同的慢交换构象。E222羧基和发色团的酚基氧之间形成的氢键对于它的荧光强度来说是至关重要的；这一残基在报道的野生类型EFGP X-射线结构（pdb ID＝1EMA）中与L42形成主链氢键。L42还呈现出显著的Ca2+诱导的化学位移变化。从吸光度和荧光研究和高分辨率NMR来看，我们可以把具备快速动力学的Ca2+诱导的荧光的增强作用归因于靠近所设计的Ca2+结合位点的局部构象变化，这会减慢两个发色团离子状态之间的化学交换（通过金属结合照亮荧光）。另外，通过直接的金属相互作用的荧光变化可能快于经由构象变化的间接相互作用。Ca2+结合诱导的荧光变化还绕开了离子状态之间的慢速率，如我们对G1观察到的，这将本公开内容的传感器与GCaMP区分开，尽管两者都在488 nm处表现出响应于Ca2+的类似的荧光增强作用。
在各种细胞类型中的内质网Ca2+浓度与释放：CatchER分别与钙网蛋白信号肽和KDEL在支架EGFP N-或C-末端融合，来将其靶向ER（图23B）。共定位于HEK-293和C2C12细胞中的CatchER与ER-跟踪器DsRed2-ER的共聚焦显微术进一步确认了CatchER对ER的靶向特异性（图30A和图30B）。
为确定CatchER的Ca2+结合亲和力，将透化的C2C12成肌细胞暴露于所述的递增的Ca2+浓度。在BHK细胞中CatchER的Kd为1.07±0.26mM而在C2C12细胞中为1.09±0.20mM。在实验结束时，荧光强度完全恢复到校准之前的值，这表明透化的BHK和C2C12细胞中的CatchER没有被洗出，进一步支持它靶向于并滞留在ER中。在HeLa、HEK293以及C2C12细胞中静止的ER Ca2+浓度分别是：396±13.2（n＝7）、742±134（n＝5）和813±88.6μm（n＝11），这与报道的使用几种基于Cameleon的ER传感器的为100-900μM的ER Ca2+浓度一致。
由ATP引起的ER Ca2+释放在完整的C2C12成肌细胞中测量（图23A），并且相同批次细胞由毛地黄皂苷透化以检测IP3诱导的Ca2+信号传导（图23B）。当洗去IP3时，荧光恢复，并且加入毒胡萝卜素减慢了ER Ca2+浓度的降低。再次加入IP3引起荧光快速减少到之前的坪值，洗涤之后没有观察到恢复，这表明毒胡萝卜素完全抑制了SERCA泵。
通过由4-氯-间甲酚（4-CmC）在完整细胞中引起的利阿诺定受体，CatchER可检测Ca2+释放。相反，在ER的mCherry共表达中没有观察到药物相关的响应（图23C和23D）。在C2C12成肌细胞中使用Fura-2监测胞质Ca2+（图24）。4-CmC引发浓度依赖性的SR Ca2+耗尽，添加500μM4-CmC和2μM毒胡萝卜素一起诱导了整个SR Ca2+的耗尽（图23E）。CatchER报告了在诸如HeLa和HEK293的这些可激发和非可激发细胞中，响应于ATP、组胺、毒胡萝卜素以及环匹阿尼酸的ER Ca2+的释放（图31E-31G、31J）。
试剂盒：本公开内容还包括试剂盒，它可包括但不限于根据本公开内容的分析物传感器、便于将蛋白质递送至所需的目的地的相关试剂和指导 （书面的使用说明书）。上面列出的组分可以对本文所述的待监测的特定生物事件定制。用于转染宿主细胞的试剂盒可以使用编码分析物传感器的核酸分子来组装，或者该试剂盒用于以分析物传感器标记靶多肽。宿主细胞转染试剂盒可以包括含有一种或多种编码分析物传感器的核酸分子的至少一个容器（或包含上述的核酸分子或质粒的一种或多种的组合物），其中，核酸分子优选地包含质粒。试剂盒可还包括本领域已知用于将上面所列的组分的各种组合施用到宿主细胞或宿主生物体的适当的缓冲液和试剂。本公开内容的组分和载体可以以溶液或冻干的形式提供。当试剂盒的组分是冻干的形式时，该试剂盒可以任选地含有无菌及生理上可接受的重构介质，如水、盐水、缓冲盐水等。
因此，本公开内容的一方面包括分析物传感器的实施方案，该分析物传感器包括具有金属离子结合位点的工程化荧光主体多肽，该金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，其中，该带负电荷的残基包括多个定位在五角双锥几何结构中的羧基氧，其中，该几何形状提供金属离子结合位点，该金属离子结合位点与工程化荧光主体多肽的发色团区域可操作地相互作用，以使金属离子分析物与分子识别基序的结合调制由荧光主体多肽发出的荧光信号的发射，任选地，调制工程化荧光主体多肽的吸收光谱。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，该带负电荷的残基在三个反平行β片层的表面上。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，带负电荷的残基分布在具有β罐结构的蛋白质的三条链上。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，分析物传感器的氨基酸序列与选自由SEQ ID No.:104-105和113-159组成的组的序列可具有至少90%的相似性。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，分析物传感器的氨基酸序列与选自由SEQ ID No.:105组成的组的序列可具有至少95%的相似性。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，分析物传感器的氨基酸序列是根据选自由SEQ ID No.:104-105和113-159组成的组的序列。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，分析物传感器的氨基酸序列与SEQ IDNo.:105可具有至少90%的相似性。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，分析物传感器的氨基酸序列与选自由SEQ ID No.:105组成的组的序列可具有至少95%的相似性。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，分析物传感器的氨基酸序列是根据SEQID No.:105。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，分析物传感器可以与选自以下组成的组的金属离子结合：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、汞和镉。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，分析物传感器可以与选自以下组成的组的金属离子结合：钙。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，分析物传感器还可包括用于选择性地靶向细胞的内质网或肌质网的靶向基序。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，在结合于其上的分析物存在的情况下，分析物传感器可以发射荧光信号，该荧光信号指示分析物与分析物传感器的结合。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，在分析物不存在的情况下，分析物传感器可以发射第一荧光信号，并且在结合到分析物传感器上的分析物存在的情况下，其能够发射第二荧光信号，其中，第一荧光信号和第二荧光信号是可区分地检测的。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，传感器是可溶性的。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，传感器是附接到固体表面。
本公开内容的另一个方面包括组合物的实施方案，该组合物包含分析物传感器的实施方案，其中，该组合物可以配制成用于检测测试样品中的分析物。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，组合物可以配制成用于检测动物或人类宿主的组织或细胞中的分析物。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，组合物可以配制成用于检测分离的细胞或组织中或培养的细胞或组织中的分析物。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，组合物可以配制成用于检测液体中的分析物。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，组合物还可含有药学上可接受的运载体。
本公开内容的又一方面包括试剂盒的实施方案，该试剂盒包括根据本公开内容的分析物传感器和包装，该包装包括通过分析物传感器检测分析物的分析物传感器的使用说明书。
本公开内容的另一个方面包括用于检测分析物的方法的实施方案，包括：（i）提供根据本公开内容的分析物传感器；（ii）提供怀疑包含分析物的测试样品，该分析物对分析物传感器的分子识别基序具有亲和力；（iii）在怀疑包含分析物的测试样品不存在的情况下检测由分析物传感器发出的第一荧光信号，该分析物对分析物传感器的分子识别基序具有亲和力；（iv）使分析物传感器与测试样品接触；（v）检测由与测试样品接触的分析物传感器发出的第二荧光信号；以及（vi）比较第一荧光信号和第二荧光信号，其中，信号中的比率变化指示测试样品中的分析物与分析物传感器相互作用。
本公开内容的另一个方面包括用于检测分析物的方法的实施方案，包括：（i）提供根据本公开内容的分析物传感器；（ii）提供怀疑包含分析物的测试样品，该分析物对分析物传感器的分子识别基序具有亲和力；（iii）在怀疑包含分析物的测试样品不存在的情况下检测源自分析物传感器的第一吸收信号，该分析物对分析物传感器的分子识别基序具有亲和力；（iv）使该分析物传感器与测试样品接触；（v）检测源自与测试样品接触的分析物传感器的第二吸收信号；以及（vi）比较第一吸收信号和第二吸收信号，其中，吸收信号中的比率变化指示测试样品中的分析物与分析物传感器相互作用。
本公开内容的另一个方面包括用于检测分析物的方法的实施方案，包 括：（i）提供根据本公开内容的分析物传感器；（ii）提供怀疑包含分析物的测试样品，该分析物对分析物传感器的分子识别基序具有亲和力；（iii）在怀疑包含分析物的测试样品不存在的情况下检测由分析物传感器发出的第一荧光信号，该分析物对分析物传感器的分子识别基序具有亲和力；（iv）使该分析物传感器与测试样品接触；（v）检测由与测试样品接触的分析物传感器发出的第二荧光信号；以及（vi）比较第一荧光信号和第二荧光信号，其中，在信号的寿命期内的比率变化指示测试样品中的分析物与分析物传感器相互作用。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，在分析物不存在的情况下第一荧光信号是零发射。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，第一荧光信号和第二荧光信号在波长上是不同的，其中，在波长上的不同以及任选地在其强度上的不同指示在测试样品中的分析物与分析物传感器相互作用。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，第一荧光信号和第二荧光信号在强度上不同，其中，强度上的不同指示在测试样品中的分析物与分析物传感器相互作用。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，信号强度中的比率变化提供了测试样品中的分析物的定量测量。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，吸收中的信号强度中的比率变化提供了测试样品中的分析物的定量测量。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，寿命期信号中的变化提供了测试样品中的分析物的定量测量。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，分析物是选自以下组成的组的金属离子：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、汞和镉。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，测试样品是动物或人类受试者的细胞或组织，或是从动物或人类受试者分离的细胞或组织。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，该方法是在体外进行的。
本公开内容的另一个方面包括重组核酸的实施方案，该重组核酸编码根据本公开内容的分析物传感器。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，重组核酸还可包含载体核酸序列。
本公开内容的另一个方面包括遗传修饰的细胞的实施方案，该遗传修饰的细胞包括根据本公开内容的重组核酸。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，细胞表达由重组核酸编码的分析物传感器。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，在细胞中表达的分析物传感器可以提供可检测的荧光信号、吸收信号、和/或寿命期变化，所述信号提供细胞中的分析物的定性或定量的指示。
本公开内容的另一方面包括用于表征分析物的细胞活性的方法的实施方案，该方法包括：（i）提供遗传修饰的细胞，其包括表达根据权利要求1所述的分析物传感器的重组核酸；（ii）在遗传修饰的细胞中表达分析物传感器，并测量从分析物传感器产生的信号；（iii）检测由分析物传感器发出的第一荧光信号；（iv）在诱导了细胞中的生理事件之后，检测由分析物传感器发出的第二荧光信号；以及（v）比较第一荧光信号和第二荧光信号，其中，信号中的比率变化指示细胞中的分析物水平的变化与细胞中的生理事件相关。
本公开内容的另一方面包括用于表征分析物的细胞活性的方法的实施方案，该方法包括：（i）提供遗传修饰的细胞，其包括表达根据本公开内容的分析物传感器的重组核酸；（ii）在遗传修饰的细胞中表达分析物传感器，并测量从分析物传感器产生的信号；（iii）检测由分析物传感器发出的第一吸收信号；（iv）在诱导了细胞中的生理事件之后，检测由分析物传感器发出的第二吸收信号；以及（v）比较第一吸收信号和第二吸收信号，其中，吸收信号中的比率变化指示细胞中的分析物水平的变化与细胞中的生理事件相关。
本公开内容的另一方面包括用于表征分析物的细胞活性的方法的实 施方案，该方法包括：（i）提供遗传修饰的细胞，其包括表达根据本公开内容的分析物传感器的重组核酸；（ii）在遗传修饰的细胞中表达分析物传感器，并测量从分析物传感器产生的信号；（iii）检测由分析物传感器发出的第一荧光信号；（iv）在诱导了细胞中的生理事件之后，检测由分析物传感器发出的第二荧光信号或吸收信号；以及（v）比较第一荧光信号和第二荧光信号，其中，信号的寿命期的比率变化指示细胞中的分析物的水平的变化与细胞中的生理事件相关。在本公开内容的这个方面的实施方案中，遗传修饰的细胞是分离的遗传修饰的细胞。
在本公开内容的这个方面的实施方案中，分析物是选自以下组成的组的金属离子：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、汞和镉。
在本公开内容的这个方面的一些实施方案中，分析物是钙。
提出了下列实施例以便向本领域的普通技术人员提供关于如何进行本文公开和请求保护的方法以及使用本文公开和请求保护的组合物和化合物的完整的公开内容和描述。为确保数据（例如量、温度等）的准确性已经做出努力，但是应该考虑到一些误差和偏差。除非另有说明，份是重量份，温度是℃，以及压力是大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。
应当注意的是在本文中，比率、浓度、量和其它数值数据可以用范围格式表示。应当理解的是，此类范围格式是为了方便和简洁而使用，因此，应以灵活的方式解释成不仅包括明确列出作为界限范围的数值，而且还包括包含在该范围内的所有单个数值或子范围，如同明确列举每个数值和子范围一样。为便于说明，“约0.1%至约5%”的浓度范围应解释为不仅包括明确列出的约0.1重量%至约5重量%的浓度，还包括单个浓度（例如1%、2%、3%和4%）和在所述范围内的子范围（例如0.5%、1.1%、2.2%、3.3%和4.4%）。在一个实施方案中，根据数值的有效数字，术语“约”可包括传统的舍入。另外，短语“约‘x’到‘y’”包括“约‘x’到约‘y’”。
实施例
实施例1
基于EGFP的Ca2+传感器的构建：将CaM的Ca2+结合基序，即环-III（DKDGNGYISAAE（SEQ ID NO.:113）和EF手型基序EEEIREAFRVFDKDGNGYISAAELRHVMTNL（SEQ ID NO.:114）），插入到如先前所报道（J.Biotechnol.119：368-378中，其通过引用并入本文）的增强GFP（EGFP）中，并且通过自动化DNA测序验证插入。
将接枝有Ca2+结合基序的编码EGFP变体的cDNA克隆到细菌和哺乳动物表达载体的BamH1和EcoR1限制酶位点之间。对于细菌表达，使用带有六组氨酸标签的载体pET28(a)。对于哺乳动物表达，将编码蛋白质的DNA亚克隆到pcDNA3.1+载体中。通过PCR，将ER保留序列KDEL附接到基于EGFP的Ca2+传感器的C末端，并且钙网蛋白的ER靶向序列（CRsig）MLLSVPLLLGLLGLAAAD（SEQ ID NO.:112）附接到N末端。将Kozak共有序列放置在钙网蛋白序列的N末端，为了在哺乳动物细胞中的蛋白质表达的最佳起始。DsRed2-ER（BD BiosciencesClontech），其分别在N和C末端包含CRsig和KDEL信号肽，在共定位实验中用作ER的标志物。为了改善在37℃时的折叠，将两个另外的突变，M153T和V163A，也添加到Ca2+传感器（NatureBiotechnol.14:315-319，Biochemistry39:12025-12032，它们的每一个通过引用并入本文）。
实施例2
EGFP及其变体的表达和纯化：将EGFP及其变体在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。将细胞在含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在37℃下生长至大于0.6的O.D.600，随后用0.2mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行蛋白质诱导。因为EGFP在37℃时体内呈现减少的荧光，所以EGFP可溶性成熟形式的高水平表达通过在30℃下在LB肉汤中使培养物过夜生长而实现。通过对细胞团超声处理并在22,500×g离心20分钟来纯化EGFP及其变体。将上清液注射到快速性能液相色谱（FPLC）系统AKTAprime中，所述AKTAprime连接到Hitrap Ni2+螯合柱（Amersham Biosciences）。用在50mM NaH2PO4/Na2HPO4和250mM NaCl（pH7.4）中的咪唑梯度，从柱上洗脱蛋白质，然后通过质谱法鉴定。通过对10mM Tris和1mM DTT（pH7.4）进行透析除去咪唑。
紫外线和可见吸收光谱：通过Shimadzu UV-1601分光光度计，确定EGFP及其变体的紫外线和可见吸收光谱。通过在280nm处的吸光度确定蛋白质的浓度，对EGFP-wt使用21,890M-1cm-1的摩尔消光系数，其从芳族残基（1Trp和11Tyr）（对Trp和Tyr分别为5500和1490M-1cm-1）的贡献来计算。EGFP变体的消光系数（在398nm或490nm）用等式（1）获得：
ϵ p = ϵ p , 280 nm ( A p A p , 280 nm ) - - - ( 1 )
其中，εp是EGFP变体在398nm或490nm的消光系数，εp,280nm是EGFP变体在280nm的消光系数，Ap是在398nm或490nm处EGFP变体的吸光度，以及Ap,280nm是在280nm处EGFP变体的吸光度。EGFP用作EGFP变体的消光系数测量中的参考。
荧光光谱：在20℃时，使用带有10mm路径长度的石英室的荧光分光光度计（PhotonTechnology International,Inc.）监测EGFP及其变体的性质。在分别具有398和490nm激发波长的410至600nm和500至600nm的发射区域中，测量蛋白质中的发色团的荧光光谱。当在398和490nm处激发时，利用作为Ca2+浓度的函数的500至600nm处的发射比率，来计算各种基于EGFP的Ca2+传感器的Ca2+结合的表观解离常数Kd，通过将等式2与1∶1金属结合方程拟合：
( [ P ] T + [ Ca ] T + K d ) - ( [ P ] T + [ Ca ] T + K d ) 2 - 4 [ P ] T [ Ca ] T 2 [ P ] T ( 2 )
其中，f是Ca2+结合蛋白质的比例，[P]T为总蛋白质浓度（mM），[Ca]T是总Ca2+浓度（mM），以及Kd是蛋白质的Ca2+解离常数。与Ca2+结合的蛋白质的比例依据等式3计算：
f = R - R min R max - R min - - - ( 3 )
其中，Rmin、R、Rmax是用停流荧光分光光度计分别对Ca2+-游离、Ca2+-结 合和Ca2+-饱和蛋白质测量的荧光发射比率（在398nm和490nm处激发）或者是振幅。荧光发射比率（在398nm和490nm处激发）通过将数据拟合到等式4而获得：
R = F ( 398 nm ) F ( 490 nm ) - - - ( 4 )
其中，F（398nm）和F（490nm）是分别是在398nm和490nm处激发的范围为500至600nm的积分荧光强度。通过将Ca2+饱和状态在398nm和490nm处激发的荧光发射比率（Rmax）除以Ca2+游离状态的（Rmin），计算Ca2+传感器的动态范围值。
基于EGFP的Ca2+传感器的Ca2+结合表观解离常数（Kd）也通过使用若丹明-5N的竞争滴定法来测量。在100mM Tris，pH7.4中，若丹明-5N是具有对Ca2+为319±13μM的Kd的荧光染料（Molecular Probes）。染料浓度使用在552nm处63,000M-1cm-1的消光系数来计算。通过保持染料（10μM）和蛋白质的浓度恒定，用不同Ca2+浓度执行测量。利用1cm路径长度的室测量在552nm处激发的560nm至650nm的荧光发射信号。激发和发射的狭缝宽度分别设定在2和4nm。使用具有金属和两个配体模型的Specfit/32（Spectrum Software Associates），通过对560到650nm的光谱进行全局拟合，获得表观解离常数。
在包括0.1μM Cu2+、0.1mM Zn2+、10.0mM Mg2+、5.0μM Tb3+或5.0μM La3+的金属离子存在下，通过以1.0mM Ca2+监测荧光比例F（398nm）/F （490nm）的变化，来检测基于EGFP的Ca2+传感器的Ca2+选择性。使用等式5计算比率的标准化改变（△R）：
ΔR = R metal - R 0 R Ca - R 0 × 100 - - - ( 5 )
其中，R0是在Ca2+和金属离子不存在的情况下，基于EGFP的Ca2+传感器的比率，Rca是在金属离子不存在的情况下，以1.0mM Ca2+的基于EGFP的Ca2+传感器的比率，以及Rmetal是在金属离子存在的情况下，以1.0mM Ca2+的基于EGFP的Ca2+传感器的比率。等式（5）也用于检验小分子对基于GFP的Ca2+传感器的Ca2+响应的影响，这些小分子包括腺苷三磷酸（ATP）、腺苷二磷酸（ADP）、鸟苷三磷酸（GTP）、鸟苷二磷酸（GDP）和谷胱甘肽（GSH）。数据表示成百分数。
停流光谱荧光测量：在20℃下，以蛋白质传感器和钙为1∶1（v/v）的比率，在Hi-Tech SF-61停流荧光分光光度计（10mm的路径长度，截止时间＜2ms）上执行停流动态测量，如前所述（J.Am.Chem.Soc.127：2067-2074）。通过在10mM Tris和1mM DTT（pH7.4）中混合Ca2+和Ca-G1，利用398nm激发波长和长通455nm滤波器来确定与Ca2+结合Ca-G1相关的荧光发射变化。Ca2+的浓度范围为0至10mM。通过混合在10mM Tris和1mM DTT（pH7.4）中的预加载有Ca2+的Ca-G1与相同的缓冲液，测量与从Ca-G1解离出Ca2+相关的荧光发射变化。通常，对每个点进行六次重复测量，并且拟合最后三次测量以获得所观察的速率，kobs。通过根据等式6所述的单指数函数拟合停流迹线，获得每种Ca2+浓度的kobs：
F t = F 0 + Amp [ 1 - exp ( - k obs t ) ] - - - ( 6 )
其中，Ft是在任意停流时间的荧光强度，F0是初始荧光强度，Amp是在给定Ca2+浓度下在过程结束时的荧光信号的最终值，Kobs是观察到的荧光变化速率（s-1），以及t是反应时间（s）。通常在重复实验之间的测量差异小于1%。
实施例3
细胞培养和转染：在35mm培养皿中，在杜尔贝克改良伊格尔氏培养基（DMEM，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO）中，其带有44mM NaHCO3、pH7.2，并补充有10%（v/v）胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素（Pen/Strep），于37℃下在含有5%CO2的湿润培养室中，将BHK-21和HeLa细胞生长在100mm培养皿或玻璃盖玻片（0.5-1.0×106细胞/皿）上。将细胞接种和并使之生长过夜，随后用Ca2+传感器质粒构建体瞬时转染。
使用QIAGEN Miniprep实验方案（Qiagen），从转化的大肠杆菌（DH5α）收获用于转染的质粒DNA。按照厂商的说明，使用Lipofectamine-2000（(Invitrogen LifeTechnologies）和无血清Opti-MEMI（Gibco Invitrogen Corporation），将每一个GFP变体单独并瞬时地转染到BHK-21和HeLa细胞内。DNA与Lipofectamine的比率为1∶1至1∶3（μg/μl）的质粒DNA（2μg）通常在典型转染中使用。在37℃培养4小时后，除去含有DNA-Lipofectamine复合物的培养基，用富含FBS和Pen/Strep的DMEM代替。然后，使细胞在含有5%CO2的潮湿的腔室内于30或37℃下生长1至3天，随后荧光或共焦显微镜成像。
实施例4
共焦显微镜成像：将BHK-21和HeLa细胞从DMEM转移到没有二价阳离子的Hank平衡盐溶液（HBSS（--），Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）介质中，该介质含有10mM HEPES、5mM NaHCO3、1mM EGTA、pH7.2，使用100×油浸物镜（Zeiss，Fluar、1.30n.a.）在LSM510激光共焦显微镜（Carl Zeiss inc.，Thornwood，NY）上进行活体成像实验。在成像之前，将细胞和缓冲液置于环境温度下并使其与室内空气平衡。通过用488nm线的氩气激光来激发EGFP，观测到基于EGFP的Ca2+传感器的定位，并且最窄带通滤波器（505nm-530nm）用于发射。使用543nm线的氦氖激光来激发DsRed2-ER，并且通过长通滤波器（发射在560nm以上）检测发射。Zeiss LSM510软件（Carl Zeiss，Inc.）用于控制图像采集参数。所有图像都以高分辨率（1024×1024）获得。
实施例5
荧光显微镜成像及其定量：在用GFP变体转染后的1-3天，将BHK-21细胞成像。运行具有双激发功能的Metafluor软件（Universal Imaging）的Nikon TE200显微镜用于细胞成像实验。测量基于EGFP的Ca2+传感器响应于385nm和480nm的激发波长的荧光发射比率（在510nm处测量）以监测在时间序列实验中的[Ca2+]ER的变化。根据等式7定量BHK-21细胞中的[Ca2+]ER：
[ Ca 2 + ] = K d × ( R - R min R max - R ) 1 n - - - ( 7 )
其中，R是在初始状态中385nm/480nm激发的荧光发射比率（在510nm处测量），Rmin是在Ca2+-游离状态下确定的发射比率的最小值，Rmax是在 Ca2+-饱和状态下的发射比率的最大值，Kd是表观解离常数（mM），以及n是希尔系数（n＝1）。Ca2+-游离状态和Ca2+-饱和状态在用5μM离子霉素处理，并分别暴露于1.0mM EGTA和1.0mM Ca2+的细胞上获得。
实施例6
带有单个插入的Ca2+-结合基序的基于EGFP的Ca2+传感器设计：图1示出了Ca2+传感器的设计，该Ca2+传感器通过基于以下标准将Ca2+结合基序、CaM环-III及其侧翼螺旋的组合集成到EGFP中而制成。首先，Ca2+-结合基序，如来自CaM的环-III或完整的EF-手型基序III，用于在EGFP中产生Ca2+-结合位点。Ca2+被EF-手型基序中的12-残基螯合。因此，CaM的EF-基序的肽片段与任何一种CaM目标酶相互作用，从而产生不可能干扰细胞信号传导事件的传感器。通过修饰在环和侧翼螺旋中的带电荷残基（J.Am.Chem.Soc.127：3743-3750；J.Inorg.Biochem.99：1376-1383，它们中的每一个通过引用并入本文），可改变接枝环的Ca2+-结合亲和力，改变任何所设计的传感器的Ca2+结合亲和力。
选择三个整合位点：在EGFP的环-9中的Glu172-Asp173（位置1）、在环-8中的Gln157-Lys158（位置2）和在环-7中的Asn144-Tyr145（位置3）。带有或不带有侧翼螺旋的CaM的环-III用作Ca2+结合基序，并接枝在这些位置以构建基于EGFP的Ca2+传感器（图1A）。接下来，将突变M153T和V163A插入到构建体Ca-G1，以产生在37℃具有改善表达的传感器（Ca-G1-37）（Nature Biotechnol.14：315-319；Biochemistry39：12025-12032，它们中的每一个通过引用并入本文）。最后，设计带有ER靶向序列和保留序列的构建体，并称为Ca-G1-ER，所述ER靶向序列和保留序列将Ca-G1特异地靶向哺乳动物细胞的ER。
实施例7
基于EGFP的Ca2+传感器的光谱特性和EGFP的敏感位置：首先使用纯化的蛋白质（pH7.4）研究Ca2+传感器的光谱特性。图2A和2B示出了EGFP-wt和不同Ca2+传感器构建体的可见吸光度和荧光发射光谱。包括Ca2+传感器的消光系数和量子产量的光谱特性总结在表3中。
表3：EGFP和Ca2+传感器构建体的光谱特性
aε是以103M-1cm-1为单位的消光系数。吸光度峰的波长在括号中示出。
b在EGFP变体的吸收消光系数（ε）和荧光量子产量的计算中，EGFP-wt用作参考。
c在Ca-G3’中没有形成发色团。
d N/A，不可用。
在EGFP的Gln157-Lys158（Ca-G2’和Ca-G2（仅Ca-G2’在图2A和2B中示出），图1A）插入CaM的环-III，产生具有类似于EGFP-wt的光谱特性和吸光度强度有轻微降低的蛋白质。注意，在490nm处的主要吸光度峰和在398nm处的次要吸光度峰反映了发色团的阴离子和中性状态的相对群体。图2B示出了在398nm处激发（中性状态）极大地有助于在510nm处的发射峰。
如表3所示，带有接枝在Gln157-Lys158（位置2）的Ca2+-结合基序的构建体（Ca-G2’和Ca-G2）具有类似于EGFP-wt的光谱特征（在398nm和490nm处的消光系数和量子产量常数）。在EGFP的Glu172-Asp173处集成CaM的环III（Ca-G1’）导致一种蛋白质的形成，与EGFP-wt相比，该蛋白质显示在398nm处的吸光度轻微的增加，在490nm处的吸光度降低。此外，在相同的位置处插入含有侧翼EF-螺旋的环III（Ca-G1）产生一种蛋白质，该蛋白质在398nm处的吸光度进一步增加，在490nm处的降低。与EGFP-wt相比，Ca-G1的消光系数在398nm处增加了2.6倍，在490nm处降低了约60%。同时，观察到了Ca-G1’和Ca-G1的荧光发射的相应增加（图2B）。
相反，在EGFP的Asn144-Tyr145处插入环III之后（Ca-G3’）没有形成发色团，由在细菌表达以及纯化蛋白质中缺乏绿色荧光来表示。因此， 在EGFP的Glu172-Asp173处集成Ca2+结合基序显著地将发色团群体从如490nm峰所指示的阴离子状态转变到如398nm峰所指示的中性状态。EGFP的Glu172-Asp173可能是发色团敏感位置。
进行CD分析以测试Ca2+传感器构建体的发色团性质的改变是否是由于结构变化所致。所有Ca2+传感器构建体显示类似于EGFP-wt的CD光谱（图7），表明Ca2+结合基序插入到EGFP中不会显著地改变GFP的β片层结构的折叠。
Ca-G1’的光学特性的pH敏感性，因为几个基于GFP的生物传感器已经报道为对pH敏感。图8A和8B示出了Ca-G1′的吸收光谱为pH的函数。pH从9.0到5.0的变化导致398nm处的吸光度增加以及488nm处的吸光度降低。Ca-G1’的pKa为7.45±0.05，EGFP的pKa为6.0。这些数据表明，所设计的Ca2+传感器的光学特性对在生理pH的pH比EGFP-wt更敏感。
实施例8
Ca2+结合对基于EGFP的Ca2+传感器的光谱特性的影响：如图3A中所示，观察到响应于向Ca-G1-37添加Ca2+，在398nm处的吸光度的增加，伴随着490nm处的吸光度的降低。类似地，Ca2+结合导致在398nm处激发时荧光的增加（图3B），在490nm处激发时荧光的降低（图3C）。
通过将Ca2+饱和状态的在398nm和490nm处激发的荧光发射比率（Rmax）除以Ca2+游离状态（Rmin），来计算出动态范围值是1.8（参见实验程序）。图3D示出了Ca-G1-37的荧光发射比率F（398nm）/F（490nm），其为Ca2+浓度的函数。标准化的荧光发射比例变化可以拟合为1∶1的Ca-G1-37-Ca2+复合物（等式2），得到用于它的Ca2+结合亲和力的表观解离常数（Kd＝0.44±0.04mM）。使用若丹明-5N竞争滴定法，也确定了基于EGFP的Ca2+传感器的Ca2+结合亲和力。这些Ca2+传感器的Ca2+结合亲和力从0.4mM变化到2mM（表4），这通过不同的技术确定。
表4.不同的基于EGFP的Ca2+传感器的Ca2+结合亲和力的比较
a根据荧光分光光度计的结果估计。
b根据使用来自停流荧光分光光度计的结果的拟合方案1估计。
c根据拟合停流荧光分光光度计的标准化变化（Amp）估计。
这些值与见于例如ER的细胞区室中的近似钙浓度一致，使得这些Ca2+传感器成为活细胞生理实验中的有前途的候选物。
实施例9
基于EGFP的Ca2+传感器的Ca2+选择性：在添加各种金属离子之前和之后，在1.0mMCa2+存在的情况下，通过测量比率F（398nm）/F（490nm）的变化，检测开发的Ca2+传感器对Ca2+的结合选择性。在细胞中，Cu2+、Zn2+和Mg2+的总金属浓度分别估计是大约10μM、大约0.1mM和大于10mM。然而，这些金属离子的游离水平显著低于总浓度，这保护细胞免受潜在的毒性反应。例如，未检测到细胞内游离铜，以及在体内使用铜伴侣，以便直接将铜分配给其目标蛋白质。
图4A示出了在Cu2+、Zn2+、Mg2+、Tb3+和La2+存在的情况下传感器Ca-G1-37的Ca2+响应。注意，观察到Cu2+（0.1μM）对传感器对Ca2+的荧光响应没有影响（与对1.0mM Ca2+100%的参考值相比，101.95±3.02%）。Zn2+（0.1mM）和Mg2+（10.0mM）仅在荧光响应中产生微小的变化（分别减少至85.71±3.34%和74.29±1.22%）。非生理金属离子，如Tb3+（5.0μM）和La3+（5.0μM），具有类似于Ca2+的金属配位特性，并且能够更强烈地与传感器的Ca2+响应竞争（分别为0.15±5.4%和16.0±9.0%）。这些结果表明，开发的Ca2+传感器Ca-G1-37对于Ca2+、La3+和Tb3+具有良好的金属选 择性，对于其它生理金属离子只有较小程度的金属选择性。
在1.0mM Ca2+存在的情况下，通过测量添加小分子之前和之后比率F （398nm）/F（490nm）的变化，还分析了小分子对基于GFP的Ca2+传感器的Ca2+响应的影响，这些小分子包括腺苷三磷酸（ATP）、腺苷二磷酸（ADP）、鸟苷三磷酸（GTP）、鸟苷二磷酸（GDP）和谷胱甘肽（GSH）。
图4B表明，ATP（0.2mM）、ADP（0.2mM）、GTP（0.1mM）、GDP（0.1mM）和GSH（1.0mM）的添加仅导致荧光响应的小幅降低（分别减少至85.75±13.98%、96.17±1.36%、88.30±8.09%、93.29±1.01%和89.18±2.90%）。这些结果表明，开发的Ca2+传感器Ca-G1-37具有高的Ca2+结合亲和力，以便与细胞内环境中包括ATP、ADP、GTP、GDP和GSH的小分子竞争。
实施例10
Ca2+与基于EGFP的Ca2+传感器结合的动力学：如图5A所示，将Ca-G1与不同浓度的Ca2+混合，导致在398nm激发的在510nm处的荧光发射快速增加。荧光信号的变化符合单指数函数（等式6），产生荧光发射变化（kobs）和幅度（Amp）的所观察的速率。
如图5B所示，Ca-G1的Kobs值随Ca2+的浓度的增加而降低，符合方案1的动力学模型，其中Ca2+迅速地与Ca-G1的一种物质关联，Ca-G1的这种物质与生物传感器的第二形式平衡。如图5A所示，在Ca2+结合时观察到Ca-G1在398nm处激发的荧光发射增加，进一步表明，Ca-G1的中性形式是与Ca2+结合的物质（方案1中的E**），生物传感器（E*）的阴离子形式不与Ca2+结合。
根据此动力学模型，k1是将Ca-G1的阴离子物质转化为中性物质的一级速率常数（s-1），k2是将Ca-G1的中性物质转化为阴离子形式的一级速率常数（s-1），以及Kd2表示将Ca2+结合到Ca-G1的中性形式的表观解离常数（mM）。
方案1
通过将确定为Ca2+浓度的函数的kobs值拟合到等式8，k1和k2值分别估计为9.5±0.3s-1和14.0±0.6s-1，并且kd2值确定为0.8±0.1mM。通过使用等式2将荧光发射中的标准化幅度拟合为Ca2+浓度的函数，kd2值独立地估计为0.6±0.1mM（图5C）。在测量带来的误差内，使用停流荧光光谱术确定的Kd值与使用荧光分光光度计在静态滴定中独立确定的Kd值是一致的，所产生的Kd值为0.8±0.1mM（表1）。这反过来强烈地支持了方案1对Ca2+与Ca-G1结合所提出的最小动力学机制的有效性，其中，与Ca2+向生物传感器的快速结合和解离相比，与Ca2+结合Ca-G1的中性物质相关的荧光变化速率，反映了Ca-G1的中性和阴离子形式的互换速率。
k obs = k 1 + k 2 ( K d 2 K d 2 + [ Ca 2 + ] ) - - - ( 8 )
根据方案1的最小动力学机制和图5A所示出的数据，预计Ca2+从预先加载的Ca-G1的释放伴随着荧光的降低，其中，荧光变化速率代表Ca-G1从中性到阴离子形式转变的慢速率，即k2。因此，通过将Ca2+-饱和传感器与10mM Tris和1mM DTT（pH7.4）等体积混合，停流光谱用来独立地确定k2。正如所预计的，在Ca2+释放之后在510nm处的荧光强度降低，且荧光变化的时间过程与单指数过程一致（等式6）。
如图5D所示，在该实验中通过将数据拟合到等式6，kobs值估计为16.9±1.0s-1，这与从图5B的数据中确定的值为14s-1的k2良好符合。总之，动力学数据支持这样的结论：Ca2+迅速地与Ca-G1的中性形式结合和解离，产生中性和阴离子物质的相对量变化，这种变化与来自Ca-G1的荧光信号的强度变化相关。
Ca2+结合至Ca-G1，导致发色团的化学平衡在其阴离子和中性状态之间发生快速转换（方案1）。这一结论由可见吸光度、荧光发射和停流荧光数据支持。使用停流荧光测量确定动力学和热力学参数，这些参数包括发色团的阴离子和中性状态互换的正向和反向速率常数，以及Ca2+结合至Ca-G1的表观解离常数。这种方法确定，Ca2+结合到传感器和从传感器解离的速率必须明显大于正向和反向一级速率常数，为～10至～20s-1，所述一级速率常数定义了发色团的化学平衡（k1和k2在方案1中）。Ca2+与蛋白质结合的速率通常是具有结合速率（kon）等于或大于1×106M-1s-1的扩 散-限制过程。由于在对Ca-G1的这一研究中对Ca-G1确定的Ca2+结合过程的表观解离常数是～0.8mM，所以可以从koff＝kon×Kd估计出解离速率（koff）为～800s-1。尽管基于GFP的Ca2+传感器的结合速率通常不是Ca2+测量中的限制因素，Ca2+传感器所表现出的慢解离速率限制了它们监测体内Ca2+浓度变化的用处，特别是限制了用于快速Ca2+振荡。为了克服这种限制，通过在基于GFP的Ca2+传感器中重新设计钙调蛋白和其靶向肽之间的结合界面，来获得改进的解离速率常数koff，为256s-1。在基于GFP的Ca2 +传感器中，优化发色团的质子化速率将提供一种可以进一步提高精确度的方法，通过该方法可以以高时间分辨率测量Ca2+信号。
实施例11
监测细胞中的ER Ca2+响应：通过使用ER标志物DsRed2-ER共转染细胞，在HeLa细胞中证实了Ca2+传感器Ca-G1-ER的定位，该ER标志物DsRed2-ER已经显示为专门定位到哺乳动物细胞中的这个区域。图6表示通过分别在488nm和543nm处激发的绿色（A，Ca-G1-ER）和红色（B，DsRed2-ER）通道所拍摄的图像。合并的图像（图6C）指示通过使用在HeLa细胞的ER中的ER标志物DsRed2-ER对Ca-G1-ER的完整共定位。图6D示出了在一种哺乳动物成纤维细胞系BHK-21细胞中的Ca-G1-ER的ER分布。注意在图6A和6D中的Ca-G1-ER的相同的颗粒分布，表明Ca2+传感器也特异向地定位于BHK细胞的ER。相反，缺乏ER信号肽的Ca-G1遍及细胞的胞质广泛表达，从而用作阴性对照（数据未示出）。
通过使用小的、低亲和力的Ca2+指示剂，BHK-21细胞之前已经用于研究完整细胞中的[Ca2+]ER的生理作用。ATP（100μM）是这种细胞类型的Ca2+动员激动剂，并引起通过Ins(1,4,5)P3-介导的途径从ER释放Ca2+。如图6E所示，ATP的添加（100μM）导致在510nm处测量的荧光比率（在385nm和480nm处激发）显著降低（7.3±0.6%的相对变化）。实验显示了在相同的实验中成像的五个代表性细胞，且结果是在5个独立的实验中获得的典型结果。在无Ca2+缓冲液中，应用ATP之后，也观察到[Ca2+]ER降低，这表明ATP从ER中释放Ca2+，而与细胞外的Ca2+无关。在培养基中存在正常细胞外Ca2+的情况下，Ca2+存储库的再填充需要几分钟。类似地，在无Ca2+的条件下，加入Ca2+离子载体离子霉素，显著地清空ER存储库，如降低的385nm/480nm荧光比率所示。为了获得[Ca2+]ER的估值，使用等式7和表1所示的0.8mM Ca-G1的Kd，在BHK-21细胞中执行伪校准（图6F）。用不含Ca2+的培养基（EGTA）洗涤之后385nm/480nm荧光比率降低到最小值（Rmin），随后将离子霉素（大约5μM）添加到不含Ca2+的培养基中（使用免费软件程序“Bound and Determined”估计含有小于10nM的Ca2+）。加入毫摩尔细胞外的Ca2+（大约1mM），导致Ca2+信号大量增加，该Ca2+信号具有接近385nm：480nm的荧光比率最大值（Rmax）的饱和状态的稳定水平。使用等式7，估计BHK-21细胞的ER中最初的Ca2+浓度为小于1mM，以及ATP（100μM）的添加将[Ca2+]ER减少至大约0.15mM（图6F）。正如所预期的，在用野生型对照构建体EGFP-wt-ER转染的细胞中，没有观察到响应于上述实验方案的显著的荧光信号变化（数据未显示）。这些成像实验证实了这种新型的Ca2+传感器在活细胞中的用处，并且预期其未来应用将促进ER在Ca2+信号传导和Ca2+内稳态中的作用的研究。
实施例12
变体构建体：通过以PCR和turbo pfu（Strategene）的位点定向诱变，按照厂商的建议用EGFP（S65T、F64L、V22L、M218I、H231L）作为初始模板，制成带有不连续的钙结合位点（S2D、S86D、L194E）、cycle3（F99S、M153T、V163A）突变的GFP变体EGFP-D2（SEQ ID No.：64）。
EGFP-G1包含连续的EF-手型Ca2+结合基序III，其利用turbo pfu通过几轮PCR插入。按照厂商的说明，用T4DNA连接酶（Promega）连接线性DNA，且将环状DNA转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中以进行DNA扩增。通过自动测序证实了变体DNA。将编码在N末端和C末端之间带有BamH I和EcoR I限制酶位点的EGFP变体的cDNA，亚克隆到使用CMV启动子的哺乳动物表达载体pcDNA3.1+中。
实施例13
细菌表达和纯化：在LB卡那霉素（30μg/mL）中，使用大肠杆菌BL21（DE3）从带有六组氨酸标签的载体pet28a（EMD Biosciences）表达蛋白 质。在0.6的O.D600，使用0.2mMIPTG诱导表达，并且允许表达持续21小时，随后通过离心收获细胞。对于这些研究，诱导之后，温度控制在30℃和37℃。通过利用Fluo-star仪器和488nm的激发波长在510nm处的荧光强度监测EGFP及其变体的表达。
使用充有镍的Amersham-Pharmacia5mL HiTrap螯合HP柱纯化蛋白质。将细胞团重悬于20mM Tris、10mM NaCl、0.1%Triton X-100，pH8.8中并进行超声处理。细胞碎片通过离心除去且将蛋白质加载至制备的HiTrap柱上，该HiTrap柱连接到Amersham-PharmaciaAktaPrime FPLC。通过洗涤以除去污染蛋白质后，目的蛋白质用咪唑梯度洗脱。通过透析除去污染咪唑，并且用带有pH8.0的NaCl梯度的HiTrap Q离子交换柱（Amersham）进一步纯化蛋白质。蛋白质纯度由SDS-PAGE证实。
实施例14
哺乳动物细胞培养：HeLa细胞生长在60mm的培养皿上且在在杜尔贝克改良伊格尔氏培养基（DMEM，Sigma Chemical Co.，St.Louis,MO）中，用5%CO2的湿润培养室于37℃下，所述培养基具有44mM NaHCO3、pH7.2，并补充有10%（v/v）胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素（Pen/Strep）。在瞬时转染之前，HeLa细胞生长至汇合。
使用QIAGEN微量制备实验方案（Qiagen），从转化的大肠杆菌（DH5α）收获用于转染的质粒DNA。按照厂商的说明，使用Lipofectamine-2000（Invitrogen Life Technologies）和无血清Opti-MEMI（Gibco Invitrogen Corporation），将九种GFP变体的每一种都单独且瞬时地转染进入HeLa细胞。典型的转染由1或2μg质粒DNA组成，且DNA与Liptofectamine的比例介于1∶1和1∶3（μg/μl）之间，该比例取决于蛋白质构建体。在倒置落射荧光成像前，允许进行48小时和72小时的蛋白质表达。在与每种构建体相同的条件下用EGFP进行对照转染。
实施例15
荧光强度的测量：在表达过程中的时间点上收集三个1ml的试样，并且按14k rpm离心3分钟。将细胞团重悬于pH7.4的1ml Tris缓冲液中， 并采用带有390nm和/或460nm的激发滤光器和510nm的发射滤光器的FLUOstar OPTIMA（BMG Labtech）读板器对200μl加以分析。
实施例16
荧光显微镜/成像及其定量：倒置落射荧光显微镜（Zeiss Axiovert200）用于体内的荧光强度筛选。显微镜配备有氙弧灯、具有398nm激发和510nm发射的用于蓝宝石GFP的滤波器、标准DAPI、FITC和Texas Red滤波器和透射光。Axiocam5CCD照相机以与载物台成直角地连接到显微镜，并且Zeiss Axiovision Rel4.3软件用于数据采集和分析。对于荧光强度测量，使用40倍干式物镜，和蓝宝石GFP和FITC滤波器，曝光时间50-2000ms。允许动态范围内的荧光强度的曝光图像用于数据分析。在该时间范围内测量的荧光强度是曝光时间的线性函数。
对转染细胞的面积和平均荧光强度（每个图像n＞20个细胞）进行测量，并且通过等式（9）的计算，获得在每个成像视野内的细胞的总平均荧光强度：
F = Σ i = 1 n S i F i Σ i = 1 n S i - - - ( 9 )
其中，F是每个图像中在398nm或480nm处激发的细胞总平均荧光强度，且n是荧光细胞的数目。Si是第i个荧光细胞的面积，以及Fi是在398nm或480nm处激发的第i个荧光细胞的平均荧光强度。
用EGFP-G1-C3转染后3天，在398nm或480nm处激发的HeLa细胞的总平均荧光强度用作参考，并且以不同波长激发的带有其它GFP变体的生长时间不同的HeLa细胞的荧光强度，按照等式（10）表示为EGFP-G1-C3荧光的百分比：
F ′ = F F 0 x 100 - - - ( 10 )
其中，F’是在398nm或480nm处激发的HeLa细胞的相对荧光强度，F是在398nm或480nm处激发的HeLa细胞的总平均荧光强度，且F0是在398nm或480nm处激发的在EGFP-G1-C3转染后培养三天的HeLa细胞 的总平均荧光强度。
实施例17
紫外线（UV）和可见吸收光谱的测量：利用Shimadzu紫外线和可见光分光光度计，通过从600nm到220nm的紫外线和可见吸收光谱测量EGFP及其变体的光谱特性。使用21,890M-1cm-1的摩尔消光系数，通过在280nm处的紫外-可见吸光度确定蛋白质浓度，所述摩尔消光系数是由芳族残基（1Trp和11Tyr）（Trp和Tyr分别为5500M-1cm-1和1490M-1cm-1）的贡献计算出来的。在398nm或490nm处的EGFP变体的消光系数通过等式（11）获得：
ϵ p = ϵ p , 280 nm ( A p A p , 280 nm ) - - - ( 11 )
其中，εp是EGFP变体在398nm或490nm处的消光系数，εp，280nm是EGFP变体在280nm处的消光系数，Ap是EGFP变体在398nm或490nm处的吸光度，Ap，280nm是EGFP变体在280nm处的吸光度。EGFP用作测量变体消光系数时的参考。
实施例18
荧光激发和发射光谱：EGFP及其变体的光谱特性也通过其荧光光谱监测，在室温下且以10mM Tris和1mM DTT（pH7.4）中1μM浓度，在带有1cm路径长度的石英室的荧光分光光度计（Hitachi Co.Ltd.）中测量。3nm和5nm的狭缝宽度分别用于激发和发射。通过等式（12）的计算，得到具有不同激发波长的EGFP变体的量子产量：
其中，是在398nm或490nm激发的EGFP变体的相对量子产量；是在398nm或490nm激发的参考样品的相对量子产量；Ap是EGFP变体在398nm或490nm处的吸光度；Ar是参考样品在398nm或490nm处的吸光度；FP是在398nm或490nm处激发的EGFP变体的500nm到600nm范围中的集成荧光强度；Fr是在398nm或490nm处激发的参考样品的500 nm到600nm范围中的集成荧光强度；np为EGFP变体的折射率；以及nr为参考样品的折射率。
EGFP在EGFP变体的量子产量的测量中用作参考样品。
实施例19
统计分析：使用软件包Super ANOVA（Abacus Concepts、Berkeley，CA）进行统计分析。数值表示为平均值±SEM。通过执行方差分析（ANOVA），比较对照组和处理组。Fisher保护最小显著性差异检验（Fisher’s Protected Least Significance Difference Test,Fisher's PLSD）用于统计显著性的事后检验。与第1天相比的显著性水平如下所示：*p≤0.05； **p≤0.01；***p≤0.001。
实施例20
基于EGFP的钙结合蛋白的设计：在增强型绿色荧光蛋白（EGFP）中产生两种不同类型的钙结合位点。图9A显示了基于共有的五角双锥几何结构和化学性质的EGFP-D2（SEQ IDNo.:64）的设计，该EGFP-D2包含不连续的钙结合位点（J.Am.Chem.Soc.127：2085-2093；J.Am.Chem.Soc.125：6165-6171）。通过突变的氨基酸位置S2D、L194E、S86D和天然配体的D82和E5，它由来自侧链羧基的5个带负电荷的配体残基的氧形成。图9A还示出了通过整合钙调蛋白的EF手型钙结合基序III，连续的钙结合位点EGFP-G1（SEQ ID No.：4）的工程化，所述钙调蛋白的EF手型钙结合基序III插入在EGFP的残基E172和D173之间的环9上。除了满足钙结合所要求的标准，以具有合适的局部钙结合几何特性和电荷分布，还基于标准选择这些钙结合位点，以辅助发色团的形成：（i）位点位置和残基突变不应消除发色团的合成或蛋白质的折叠。保留在荧光蛋白中的且蛋白质结构和折叠所必需的任何残基都不发生突变；（ii）该位置应该在溶剂-暴露区内以具有良好的可及性，使得能够钙结合；（iii）避免引入的带电荷的钙配体残基剧烈改变蛋白质折叠和发色团形成，优选地，钙结合口袋带有极少必要的突变。
还产生另外的突变体以测试在两种温度下折叠突变对荧光的影响。 cycle3突变施加在每个钙结合位点的两个或三个的组，以根据所施加的突变检查荧光差异。两个突变M153T和V163A施加到EGFP-D2和EGFP-G1，以分别产生EGFP-D2-C2和EGFP-G1-C2（SEQ IDNo.：19）构建体。进一步引入最后一个突变F99S以创建C3构建体：EGFP-D2-C3和EGFP-G1-C3（SEQ ID No.：34）。相同的突变（C2和C3）也施加到EGFP-wt。
图9B示出了修饰的接枝EGFP传感器的模型结构。一个EF-手型插入到EGFP的荧光敏感位置中，产生EGFP-G1。在β片层表面上的位点-定向诱变引入带负电荷的残基以形成带有三个存在的负电荷残基的Ca2+结合位点。
EGFP钙结合蛋白的细菌表达：九种蛋白：EGFP、EGFP-C2、EGFP-C3、EGFP-D2（SEQ IDNo64）、EGFP-D2-C2、EGFP-D2-C3、EGFP-G1（SEQ ID No.：4）、EGFP-G1-C2（SEQ ID No.：19）和EGFP-G1-C3（SEQ ID No.:34），在30℃和37℃时，首先在细菌中表达，以通过监测在510nm处的荧光强度（在490nm处激发）来检测发色团成熟的差异。在整个表达中的五个时间点取九种蛋白的平均强度。
图10列出了IPTG诱导之后22小时的平均荧光强度。还计算出30℃和37℃表达荧光强度之间的差异。如图10所示，在30℃时，将两种类型的钙结合位点添加到EGFP中不改变发色团的形成。然而，在细菌中表达的特性的荧光强度显著下降。
在30℃和37℃时，EGFP-D2（SEQ ID No.:64）和EGFP-G1（SEQ ID No.:4）的荧光强度显著低于EGFP的荧光强度。在EGFP-D2（SEQ ID No.：64）中的C2和C3突变在30℃时分别使其荧光强度增加37和18倍。在30℃时，EGFP-G1（SEQ ID No.：4）中的C2和C3突变也观察到荧光强度增加（6和4倍）。然而，在30℃时，EGFP中的C2和C3突变没有观察到类似的荧光强度增加。在30℃时，添加了钙结合位点D2和G1的蛋白质在510nm处的荧光强度分别大于在37℃时的荧光强度。虽然EGFP的C2和C3变体没有任何显著的荧光强度差异，但D2和G1的C2构建体令人惊奇地显示出比C3变体增加的荧光。尽管荧光不如没有添加cycle3突变的蛋白质变体低，但这表明当应用到M153T/V163A构建体上时，F99S 实际干扰了蛋白质变体的折叠。
实施例21
基于EGFP的钙结合蛋白的哺乳动物细胞表达：还使用荧光显微镜监测C2和C3突变对在哺乳动物细胞中的EGFP钙蛋白表达的影响。图11显示了在EGFP-G1、EGFP-G1-C2和EGFP-G1-C3转染后，在30℃和37℃表达两天时，HeLa细胞的荧光显微镜成像。如图11A至11C所示，在30℃转染和表达两天后，EGFP-G1（SEQ ID No.:4）变体及其C2和C3突变体在HeLa细胞的大部分中表达和折叠，如它们的强荧光信号所示。然而，如图11D所示，EGFP-G1（SEQ IDNo.：4）在37℃失去其荧光信号，这表明此温度不适合于HeLa细胞中的EGFP-G1（SEQ IDNo.：4）的成熟。相反，在EGFP-G1（SEQ ID No.：4）中添加C2和C3突变导致在37℃时HeLa细胞中的蛋白质的成熟，如图11E和11F所示。
图12A和12B示出HeLa细胞（每个图像多于20个细胞）在30℃和37℃的荧光强度的定量分析，其中HeLa细胞经EGFP-D2和EGFP-G1系列转染。与EGFP-G1（SEQ ID No.：4）相比，在30℃和37℃时观察到用EGFP-D2（SEQ ID No.：64）转染的HeLa细胞的低荧光强度（图12A）。EGFP-D2中的C2突变导致荧光强度的增加，在C3突变体中没有观察到另外的增加。哺乳动物细胞中的结果与在大肠杆菌中观察到的一致。尽管在30℃时没有观察到EGFP-G1的C2和C3突变的影响，但是类似的结果也使用在37℃时EGFP-G1的C2突变来表示，如图12B所示。
实施例22
钙结合GFP的光谱特性：为了进一步研究这种现象，将蛋白质进行纯化。在蛋白质浓度增加时，EGFP-D2-C2和EGFP-G1-C2（SEQ ID No.：19）比亲本蛋白更难于纯化，表明该蛋白质折叠更有效，且存在可以容易地在超声波处理过程中释放的更多的可溶性级分。这是预料之中的，因为EGFP-D2-C2和EGFP-G1-C2（SEQ ID No.:19）具有比没有“折叠突变”的其对应物高37倍和19倍的荧光。
使用纯化的蛋白质研究基于EGFP的Ca2+结合蛋白的光谱特性。图13A 和13B显示了在pH7.4时EGFP、EGFP-D2（SEQ ID No.：64）和EGFP-G1（SEQ ID No.：4）的可见吸光度和荧光发射光谱。
表5EGFP、EGFP-D2和EGFP-G1及它们的C2和C3突变体的光谱特性
表5概括了EGFP、EGFP-D2和EGFP-G1及它们的C2和C3突变体的光谱特性。如图13A所示，在488nm处的主要吸光度峰和在398nm处的次要吸光度峰出现在EGFP的可见光谱中，表明发色团的阴离子状态是EGFP中的主要形式。在EGFP荧光光谱中，观察到510nm处的荧光发射峰（图13B）。包括在398nm和488nm处的消光系数和量子产量常数（表1）的类似光谱特性表明，C2和C3突变对EGFP-C2和EGFP-C3的可见吸收光谱没有影响。通过使用EGFP的3种突变配体S2D、L194E和S86D以及两种天然配体D82和E5形成Ca2+结合位点（EGFP-D2（SEQ ID No.:64））导致了在398nm和488nm处的可见光吸收的降低，如图13A观察到的。与EGFP比较，例如，EGFP-D2（SEQ ID No.:64）在488nm处的消光系数从55900M-1cm-1减少至9324M-1cm-1。同时，尽管在其荧光光谱（图13B）中，510nm处的荧光发射峰值降低了，但是EGFP-D2（SEQ ID No.：64）的量子产量与EGFP的几乎相同。引人注目的是，EGFP-D2（SEQ ID No.:64）中的C2和C3突变再现了类似于EGFP的在488nm处的主要吸光度峰和在398nm处的次要吸光度峰（表5）。总而言之，尽管带有两种类型的钙结合位点的EGFP变体的量子产量显著增加，但是发色团的离子-中性状态的相对分布没有被折叠突变的加入改变。
实施例23
计算设计：由于GFPc3结构1b9c的荧光比在37℃表达的野生型GFP大30,000倍，所以使用其进行钙-结合位点的设计。潜在的钙结合位点在 计算上构造为具有所需的氧-钙-氧角度、氧-钙距离、配体类型和配体数目。使用一个锚Asp和来自Asp、Asn、Glu或主链的四个附加的潜在配体。钙-氧长度范围为2.0至从理想五角双锥几何结构的理论角度，氧-钙-氧的角度范围是±45°（Biochemistry44:8267-73;J.Am.Chem.Soc.127:2085-2093;J.Am.Chem.Soc.125:6165-6171）。
实施例24
GFP变体的克隆和纯化：通过以pfu或turbo pfu（Invitrogen）的经典的聚合酶链式反应，进行位点定向诱变，使用EGFP DNA作为初始模板以及正向引物序列5′-ACGGCGACGCGAACCTCGCCGACC-3′（SEQ ID No.：106），且反向序列是5′-CCTCGTCGTTGTGGCGGATCTTG-3′（SEQ ID No.：107）。线性DNA用T4DNA连接酶（Promega）连接，且环状DNA在大肠杆菌（DH5α或Top10）感受态细胞中扩增。构造177c3的突变包括上述突变，并添加F99S、M153T和V163A，称为cycle3（C3）。F99S正向和反向引物分别为5′-CGCACCATCTCCTTCAAGGACG-3’（SEQ ID No.：108）和5′-CTCCTGGACGTAGCCTTCCC-3′（SEQ IDNo.:109）。产生M153T和V163A，连同正向引物5′-GAACGGCATCAAGGCGAACTTCAA-3′（SEQ IDNo.:110）和反向引物5′-TTCTGCTTGTCGGCCGTGATATAGA-3′（SEQ ID No.：111）。按照厂商的实验方案，F99S退火温度为61℃，153/163退火温度为63℃，利用turbo pfu（Stratagene）实施突变。DNA用Qiagen微量制备试剂盒进行纯化，且环状变体DNA是在GSU中心设备中通过自动化测序进行验证的。
在诱变过程中使用载体pcDNA3.1＋（Invitrogen），并且用于哺乳动物细胞中的细胞质中的蛋白质表达。对于蛋白质在ER中的表达，pcDNA3.1+载体通过PCR修饰以在蛋白质的N末端包含钙网蛋白信号肽和在C末端包含KDEL保留序列。来自钙网蛋白的N末端标签MLLSVPLLLGLLGLAAAD（SEQ ID No.:112）将基因的表达导向在ER中开始。C末端标签KDEL是保留序列，将表达的蛋白质保留在ER中，并且不允许其被拖到高尔基体。由于其长度，N末端标签以四种引物经两轮PCR插入。在含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，利用pet28a载体（EMD Biosciences）将蛋白质融合表达于6组氨酸标签。在0.6的OD600 以0.2mM IPTG诱导蛋白质表达，并且继续生长3至4小时，然后在9500g离心20分钟来收获。在用超声破坏细胞后，将蛋白质用8Ｍ尿素溶解。通过10倍稀释到缓冲液（10mM Tris、1mM DTT、1%甘油，pH7.4）中将变性蛋白质再次折叠，并离心以除去细胞碎片。使用Sephadex G-75大小排阻FPLC（10mMTris，pH7.3）将再折叠的蛋白质纯化至大于95%的纯度。通过SDS-PAGE分析蛋白质的表达和纯度。使用在280nm时计算的21,890M-1cm-1的消光系数估算蛋白质浓度。用于纯化的组氨酸标签对钙和铽的结合不产生任何影响。
实施例25
铽荧光：在该研究中，所有用于金属结合和构象分析研究的缓冲液用Chelex-100树脂（Bio-Rad）预处理。在545nm处发射、在280nm处激发之后，用PTI荧光计测量蛋白质的铽结合。对于铽滴定，对于蛋白质GFP.Ca1-3，初始蛋白质浓度为20mM PIPES、10mM KCl、1mMDTT、1%甘油、pH6.8中3μM，对于GFP.Ca2”为10mM Tris、1mM DTT、1%甘油、pH7.4中3μM。含相同浓度蛋白质的1.0mM或5.0mM铽母液被直接加入蛋白样品中。空白样品由带有递增的铽、不含有蛋白质的缓冲液组成。对数据进行基线校正，并且通过假定铽：蛋白为1∶1结合（J.Am.Chem.Soc.125：6165-6171），拟合在545nm的峰的积分面积。还使用Specfit/32（Talanta，33，943）分析数据。每个结合亲和力是4至6次滴定的平均值。为了研究金属选择性，用10mM Tris、1mM DTT、1%甘油、pH7.4中的0.1mM和1mM钙、10mM镁、或100mM镧培育含有20μM铽的GFP.Ca1和GFP.Ca2’（3μM）；并测量每个样品的铽荧光。
实施例26
钙结合染料竞争：将蛋白质（30μM或40μM）和若丹明-5N（大约20μM，MolecularProbes）（J.Biol.Chem.264:19449-19457）培育在10mMTris、1mM DTT、1%甘油、pH7.4中。100mM CaCl2母液含有相同浓度的染料。将蛋白质逐渐加入到混合物中，并用1cm路径长度的室和552nm的激发测量荧光。滴定之后，通过在552nm处消光系数为63000M-1cm-1的吸光度验证染料浓度。使用带有金属-配体-配体模型（Talanta，33，943）的Specfit/32，通过全局拟合560nm至650nm的光谱对数据进行分析。
实施例27
哺乳动物细胞转染：将未转染的HeLa细胞维持在100mm组织培养皿中的过滤灭菌的杜尔贝克改良的伊格尔氏培养基（DMEM,Sigma Chemical Co.）中，在带有5%CO2的湿润培养室中于37℃下，该培养基具有44mM NaHCO3、pH7.2，并补充有10%v/v胎牛血清（FCS，Hyclone）、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素（Pen/Strep,Sigma）。将所设计的蛋白质DNA亚克隆到pcDNA3.1+载体（Invitrogen），用于通过EcoRI和BamHI消化表达在哺乳动物细胞中，然后用T4DNA连接酶连接。在60mm细胞-培养物-处理的培养皿中，用Lipofectamine2000（Invitrogen），将通过自动化测序证实的DNA转染到之前制备的90%汇合的HeLa（HEK293、Vero或CHO）细胞中。在Opti-MEMI无血清的培养基（Invitrogen）中，将DNA（3μg）与Lipofectamine2000按1∶3的比例混合，并允许其在室温下黑暗中平衡20分钟，然后加入到Opti-MEMI培养基中的细胞中。使转染在37℃和5%CO2下进行4小时。移除转染培养基，并替换为DMEM、10%FCS、1%青霉素-链霉素溶液；细胞于30℃、5%CO2中生长72小时。在未添加DNA用于背景对照的情况下，以相同的方式处理模拟-转染的HeLa细胞。
实施例28
显微镜成像：用GFP.Ca1转染的HeLa细胞在转染后72小时进行成像。将带有细胞的盖玻片转移到微型培养室（模型MSC-TD，Harvard Apparatus，Holliston，MA）。简单地说，GFP.Ca1荧光的成像在装配有以下的Nikon TE300（Nikon Inc.，Melville，NY）倒置显微镜上进行，并被支撑在隔振台上：对GFP光学优化的Nikon滤波器模块（λex480、λem510；ChromaTechnology Corp，Rockingham，VT）、调节激发光曝露时间的Metaltek滤光轮（MetaltekInstruments，Raleigh，NC）、75瓦氙短弧灯、Hamamatsu CCD数字照相机（HamamatsuCorporation，Bridgewater,NJ）。MetaFluor软件（Universal Imaging Corp.,v3.5,Downington,PA）用于图像采集。采集时间是增益为1-3的50ms，这取决于转染效率。
对瞬时转染的GFP.Ca1或GFP.Ca1c3的荧光强度监测几分钟以获得基线值，然后向浸泡缓冲液中加入离子霉素至最终浓度为2μM。对所设计的 蛋白质的荧光进行成像直到荧光强度稳定（通常为2分钟），并通过随后加入浓缩CaCl2，操纵细胞内钙浓度，以获得目标细胞外钙浓度。多次CaCl2的添加通常间隔1分钟。通过HBSS++缓冲液的浸泡灌注，细胞外钙浓度返回至基础水平。无钙结合位点的EGFP用作对照。
为了测试在ER中表达的传感器的钙响应，将50-100μM ATP和100μM组胺加入到浸泡培养基中以诱导钙从ER中释放。采用较高浓度的离子霉素（2.5-5μM），以使ER膜透化并通过将钙加入浸泡培养基（10-100mM）中来允许对钙的吸收。将毒胡萝卜素（1μM）和卡米达佐（Calmidozolium）（2μM）加入到浸泡培养基中以缓慢地排空ER的钙。
实施例29
EGFP工程化变体作为对Pb2+和Gd3+离子具有高亲和力和选择性的分析物传感器的应用：有毒金属（例如Gd3+、La3+、Tb3+、Pb2+、Sm3+、Sr2+、Hg2+和Cd2+）可以与生物系统不利地相互作用。尽管已经广泛研究了金属的毒性作用，但并不完全理解与蛋白质的相互作用相关的毒性机制。铅（Pb2+）是持久的、人为的有毒金属，造成与神经疾病、贫血、肾损伤、高血压和男性生育力降低相关的多种健康问题（Reprod.Toxicol.（2005）.20:221-228；（2000）Am.J.Ind.Med.38:310-315；（2005）Neurotoxicol.Teratol.27:245-257；（1997）Annu.Rev.Nutr.17:37-50；（2001）Int.J.Toxicol.20:113-120；（2000）Int.J.Dev.Neurosci.18:791-795；（1987）Ann.N.Y.Acad.Sci.514:191-203）。已知镧系元素能在人和动物细胞中阻断钙通道，并且Pb2+、Cd2+、以及Hg2+将特异性地靶向电压门控钙通道（（2003）J.Bioenerg.Biomembr.2003.35:507-532）。因此，对用于检测和中和天然系统中的有毒金属、并用于生物修复的廉价、良性材料存在强烈需求。因此，本公开内容包括本公开内容的EGFP工程化变体作为对例如Pb2+和Gd3+离子具有高亲和力和选择性的分析物传感器的应用。GFP及其变体的荧光使其成为金属结合研究的通用标签，其中，金属阳离子与蛋白质中的发色团紧密靠近导致了荧光峰的可检测的淬灭（（2000）Biochem.Biophys.Res.Commun.268:462-465.）。
实施例30
基于EGFP的Pb2+和Ln3+传感器的开发：通过使用PCR的亚克隆，开 发了设计用于金属结合和蛋白酶研究的EGFP蛋白质变体。通过加入六组氨酸标签，制备用于在Ni2+螯合的琼脂糖柱上纯化的蛋白质。这些变体提供了诱变研究所用支架，以便提供具有高金属选择性的蛋白质变体，并用作蛋白酶传感器。EMD Omnipur tris(羟甲基)氨基乙烷（EMDChemicals,Inc.,Gibbstown,NJ），或TRIS，是用于表达的蛋白质的缓冲剂。
转化：包含编码EGFP变体的区域的重组的pET28a载体在42℃下热激90秒转化到大肠杆菌细胞株DE3中。将样品置于冰上2分钟。添加LB培养基（50μL），并且将样品在37℃下培养30分钟，随后铺板到选择性培养基上。
表达：卡那霉素以0.03mg/mL使用。将1.0L LB培养基培养物温育至0.6±0.1的A600，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）到浓度为0.2mM，并使温度降至20-25℃。每间隔1小时取出1.0mL样品，持续3小时，随后第二天最后取样，使用SDS-PAGE凝胶评价蛋白质表达。收获并在4℃储存细胞。
纯化：将细胞团块悬浮在约20mL萃取缓冲液中（20mM TRIS、100mM NaCl、0.1%Triton×-100）并置于冰上。将样品进行超声处理6×30s周期，超声处理之间有约5分钟间隔，在大约5×104g离心20分钟。上清液用0.45μm孔径的过滤器（Whatman，Florham Park，NJ）过滤，用合适的结合缓冲液稀释，随后注入到FPLC系统。
使用配备有紫外检测器和280nm滤光器的Aktaprime FPLC（AmershamBiosciences，Piscataway,NJ）完成对EGFP变体的纯化。对于大多数纯化，使用Hitrap5mLHP螯合的琼脂糖柱。结合缓冲液A为1M K2HPO4、1M KH2PO4、250mM NaCl、pH7.4，以及洗脱缓冲液B为缓冲液A和0.5M咪唑。
首先用100mM EDTA、1M NaCl、pH8.0漂洗该柱以除去金属，并用蒸馏水漂洗。然后，用0.1M NiSO4清洗该柱以将Ni2+结合到该柱上，再次用蒸馏水漂洗以去除未结合的NiSO4。
对于另外的蛋白纯化，使用Hitrap Q离子交换柱（GE Healthcare，Piscataway，NJ）。结合缓冲液A为20mM TRIS、pH8.0，而且洗脱缓冲液B为20mM TRIS、1M NaCl、pH8.0。
注入该柱的蛋白限制在5-8mL，并且收集8mL级分的洗脱结合蛋白质，然后通过在2.0L的10mM TRIS、1mM二硫苏糖醇、pH7.4中透析来进一步纯化。蛋白质级分在分子量截断值为3,500Da的透析袋中进行透析，持续72小时，以除去咪唑和其它杂质。使用SDS-PAGE凝胶评估纯度。
实施例31
光谱分析：采用设定为1nm的激发狭缝宽度进行EGFP变体的荧光光谱分析，以减少蛋白的光褪色，发射狭缝宽度设定在2nm。使用398nm和490nm的激发波长。以1nm间隔收集来自荧光计的数据。
在测试金属离子存在的情况下，通过监测用1.0mM Ca2+获得的荧光比率F（398nm）/F（490nm）的变化来检查基于EGFP的传感器对Pb2+和Gd3+的选择性。
通过积分从500-600nm每次发射扫描（398nm和488nm）的峰面积作为在每1nm间隔处记录的强度之和，计算从不含金属的蛋白质到金属蛋白质复合物的比率变化，并然后评估（F398/F488）的比例，如等式13所见。
（等式13）
该比例消除了由于设备变化引起的与绝对强度值相关联的可能误差。
对1.0μM的EGFP变体估计荧光比率变化（F398/F490），以评估在10mM TRIS-Cl、pH7.4中的Ca2+和Pb2+或Gd3+之间的选择性。首先，将1mM Ca2+加入到蛋白质中，然后加入竞争性金属的小份。
假定竞争性离子的亲合力与比例（F398/F490）的变化成正比，如利用等式11计算的。为了计算竞争滴定的Keq，将竞争性离子的级分值（F）跨评估的浓度范围标准化。用等式14计算该F标准化值（FNorm）。
F Norm = ( F Cainitial - F M + ) / ( F Cainitial - F M + final ) （等式14）
在等式14中，FCa initial是加入Ca2+之后的初始比（F398/F490），FM+是 加入竞争性金属离子的每个点处的比率，以及FM+final是在金属的最终浓度处的比率。使用曲线-拟合等式计算竞争滴定的K：
F Norm = ( ( ( [ P ] t + [ M ] t + K ) - ( ( [ P ] t + [ M ] t + K ) 2 - 4 [ P ] t [ M ] t ) 1 / 2 ) / 2 [ P ] t ) + ( C * [ M ] t ) （等式15）
其中，最终项（C*[M]t）考虑了非特异性结合。对Pb2+或Gd3+的Kd通过等式4计算，其中K由等式15计算出来，以及先前确定的EGFP-C2变体对Ca2+的Kd是440μM。
K dM + = K / ( 1 + ( [ Ca 2 + ] / K dCa ) ) （等式16）
吸光度扫描涵盖的范围为600-220nm。
实施例32
从竞争性滴定确定，在本公开内容的工程化EGFP变体的结合位点中，Gd3+和Pb2+置换Ca2+。图18示出了与Pb2+置换Ca2+相关的标准化比率变化。图19A到D示出了由Pb2+置换Ca2+引起的荧光强度的变化，以及接近10μM Pb2+的光谱中的2-3nm的红移。这种红移认为是相对于发色团的构象变化的结果，与已发生的Ca2+的置换无关。然后用这些数据计算对Gd3+和Pb2 +的结合亲合力。
对于在此研究中分析的EGFP-C2变体，发现对Pb2+和Gd3+的结合亲和力都比对Ca2+高约200倍（图19B和19D）。对于其它EGFP变体（SEQ ID No.：18和19），发现对Pb2+的结合亲合力比对Ca2+高100倍以上（图19C）。这些较高的亲和力，连同与这些金属结合相关的构象变化，表明与毒性的重要关系。还提供了一种能够高亲和力结合Pb2+和Gd3+的传感器。
实施例33
CatchER生物传感器家族设计策略：基于如下关键决定因素：精细调节Ca2+结合亲和力、Ca2+诱导的构象变化，以及荧光蛋白的确定的发色团特性，设计具有快速荧光响应的Ca2+传感器，直接将Ca2+结合位点耦合到发色团，而不依赖于拉伸蛋白-蛋白相互作用以调节发色团构象。
计算机辅助设计是基于下面的标准和考虑：（i）需要四个或五个来自蛋白质残基的氧配体原子（典型地，D、E、N、Q的羧基），该蛋白质残 基位于天然Ca2+结合蛋白质特有的球形几何形状中；（ii）残基电荷和类型的合适选择可以选择为精细调节Ca2+结合亲和力和金属选择性；（iii）Ca2+向位点的扩散-限制可及需要良好的溶剂可及性；（iv）通过带电荷的配体残基相对于发色团的正确定位，可以实现对发色团的传播中的Ca2+诱导变化、局部构象变化和静电变化；（v）归因于这些发色团，这些变化必须比从中性到阴离子状态的转变速率更快地发生；和（v），产生的结合位点必须不干扰发色团的合成和形成。选择带有M153T/V163A突变的EGFP变体（EGFP Cycle2）作为支架蛋白，因为其具有高的荧光强度、折叠效率和热稳定性。
实施例34
质粒构建、蛋白质表达和纯化：通过在cycle2EGFP（F64L/S65T/M153T/T163A）上进行位点-定向诱变，并插入在pET28a载体（EMD Biosciences，San Diego，CA）的BamHI和EcoRI限制酶切割位点之间，构建EGFP变体D8至D12的细菌表达质粒。在这两个限制位点之间的所设计的EGFP变体的DNA序列被切割并插入到pcDNA3.1+载体（Invitrogen,Carlsbad,CA）中。将钙网蛋白ER靶向序列（CRsig）MLLSVPLLLGLLGLAAAD（SEQ ID No.:112）和ER保留序列KDEL分别加入至N-和C-末端，以构建哺乳动物细胞表达质粒。CatchER（D11）及其变体（D8至D10和D12）在大肠杆菌BL21（DE3）中细菌表达，并用已建立的方法进行纯化（Heim&Tsien（1996）Curr.Biol.6:178-182；Zou等人,（2007）Biochemistry46:12275-12288）。
实施例35
CatchER的Ca2+解离常数的原位测量：测量BHK和C2C12细胞中的CatchER的Ca2+解离常数（Kd）。通过将100μM组胺和5μM毒胡萝卜素施加在Ringer0Ca2+缓冲液中，耗尽BHK细胞中的ER Ca2+。在含有140mM KCl、10mM NaCl、1mM MgCl2、20mM Hepes，pH7.25的细胞内样溶液中，在100μM洋地黄皂苷中对细胞进行透化。通过将Ca2+添加到细胞内样溶液中来制备校准缓冲液，达到最终浓度为0.05、0.1、0.5、1、5和10mM和200μM EGTA缓冲液。Fmin和Fmax分别在200μM EGTA和没有Ca2+离子载体的10mM Ca2+中确定。
相似原位Kd校准在C2C12成肌细胞中进行。透化细胞的ER Ca2+在含有10μM IP3和2μM毒胡萝卜素的细胞内缓冲液中耗尽。对于校准，1、3、10和20mM的Ca2+缓冲液在5μM离子霉素存在下施加。Fmin和Fmax分别在3mM EGTA和20mM Ca2+中确定。
按照等式，将荧光标准化：
f = F - F min F max - F min
以及Kd由希尔-等式测定：
f = [ Ca 2 + ] n K d + [ Ca 2 + ] n
Kd在BHK细胞中为1.07±0.26mM（0.90±0.19希尔系数），在C2C12细胞中为1.09±0.20mM（0.94±0.17希尔系数）。
实施例36
通过停流将Ca2+结合到CatchER的动力学分析：在22℃时，使用SF-61停流荧光分光光度计（Hi-Tech Scientific，Salisbury,UK；10-mm路径长度、室温、2.2-ms的停歇时间），研究了细菌表达的CatchER的荧光动力学。使用具有在395nm激发的455nm长通滤波器记录荧光强度变化。等体积的在10mM Tris-Cl、pH7.4中的无Ca2+蛋白质和在相同缓冲液中的Ca2 +在停流荧光分光光度计中混合，得到最终浓度为10μM CatchER和50、100、200、300、500和1000μM的Ca2+。将停流迹线拟合到等式（17），该等式（17）描述了在任何给定时间的荧光强度F、在无限时间处的荧光F∞，以及荧光变化的幅度△F。
17） F = F ∞ - ΔFexp ( - k obs · t )
18） F = F ∞ + ΔFexp ( - k obs · t )
19） k obs · τ = ln 2
实施例37
通过pH图确定表观pKa：通过拟合在510nm处的荧光强度变化（λex＝488/395nm），用细菌表达的蛋白质确定无Ca2+或Ca2+-加载的CatchER的表观pKa。在10μM EGTA（apo）或4mMCa2+（holo）的存在下，将5μM蛋白质在pH4.5至9.5的不同缓冲液中溶解，并且实际的pH在测量荧光之后确定。所提出的相互作用方案是
20） pH = pKa + log [ P ] [ HP + ]
21） f = F - F min F max - F min
22） F min = [ P ] T c 1
23） F max = [ P ] T c 2
24） F = ( [ P ] T - [ P ] ) c 1 + [ P ] c 2
25） f = [ P ] T c 1 - [ P ] c 1 + [ P ] c 2 - [ P ] T c 1 [ P ] T c 2 - [ P ] T c 1 = [ P ] [ P ] T
26） [ P ] [ HP + ] = 1 1 / f - 1
27） f = 1 1 + exp ( pKa - pH c )
H+是质子；P是CatchER蛋白质；f是标准化的△F变化；[P]T是总蛋白质浓度；c1或c2分别是HP+或P荧光的消光系数；F是实时荧光；Fmin是最低pH处的荧光；Fmax是最高pH处的荧光；c为调整常数。值在理论上等于lge。由单指数（等式11）拟合的表观pKa，针对apo和holo形式分别地在488nm处激发为7.59±0.03和6.91±0.03，以及在395nm处激发为 7.14±0.02和6.95±0.06。
实施例38
通过Job曲线研究CatchER：Ca2+化学计量：在Job曲线（15）中Ca2+-结合CatchER的最大相对量处，确定CatchER和Ca2+相互作用的化学计量。依据等式F=Sf·Cf+Sb·Cb，将无Ca2+和结合的[CatchER]转化为荧光强度，其中F是表观荧光强度；Sf和Sb分别是无Ca2+和结合的CatchER的系数；以及Cf和Cb分别是无Ca2+和结合的CatchER的浓度。使用等式（12）计算Ca2+结合的CatchER（Cb·V，V＝1）的相对量。荧光发射（λex＝488/395nm）和吸收光谱是用分别响应于[Ca2+]：11.3、16.7、20.6、24.9、28.4μM的[CatchER]28.7、23.3、19.4、15.1、11.6μM记录。
F C a 2 + - bound F C a 2 + - free = S f · C f + S b · C b S f · C T = S f ( C T - C b ) + S b · C b S f · C T = 1 + C b · ( S b - S f ) S f · C T
28）
S b - S f S f
29）
C b C T · a = F C a 2 + - bound F C a 2 + - free - 1
30）
C b · V = ( F C a 2 + - bound F C a 2 + - free - 1 ) · C T a
31）
实施例39
NMR光谱法：使用Varian800或600MHz的分光光度计，在37℃下进行所有NMR实验。通常，NMR样品含有在10mM Tris、10mM KCl、10%D2O、pH7.4中0.3mM的15N-或13C、15N-标记蛋白。对于1H、13C和15N共振的主链分配，在Varian Inova800MHz分光光度计上收集HNCA，并且在Varian Inova600MHz分光光度计上收集CBCA(CO)NH，两个分光光度计均配备有低温探头。对于Ca2+滴定，收集{1H,15N}HSQC光谱，且使用等式△δav={0.5[△δ(1HN)2+(0.2△δ(15N))2]}1/2计算化学位移扰动，其中△δ是apo和Ca2+加载形式之间的化学位移的变化。使用共享的、 恒定时间的、交叉相关弛豫（SCT-CCR）脉冲顺序测量旋转相关时间（τc）。在这次测量中，在0至约100ms的弛豫获取时间中，收集一系列高敏感的HSQC光谱。然后从指数式衰减率中减去残基特异性的τc值。在Varian Inova600MHz分光光度计上收集T1和T2。用I=I0exp（-t/T1/2）拟合在0、30、60、100、240、480、720、1000和150ms（T1）以及10、30、50、70、90、110、130和150ms（T2）处收集的峰的积分，其中，I0是在零衰减处的强度，且t是弛豫衰减。根据下面的等式计算出τc值：
32） τ c = ( 2 ω N ) - 1 · ( 6 T 1 / T 2 - 7 )
33） ω N = 2 π · f N
实施例40
通过NMR的Catcher及其变体的结构分析和X射线验证
在建立荧光强度和钙浓度之间的关系后，钙结合至传感器的事实可以进一步由NMR通过钙滴定证明。样品制备条件对于影响NMR光谱的质量是非常重要的，因为蛋白是β片层蛋白，其具有聚合倾向。一个因素是将影响峰绝望（desperation）的温度，因此我们在不同温度，在500MHz NMR中测试D11光谱质量。图32示出了温度依赖性的CatchER的NMR HSQC光谱变化。
随着温度从20℃升高至37℃，峰数目从128增加到194。由于EGFP的总氨基酸数目为238，所以试验操作的最佳温度高于37℃。
在gNhsqc钙滴定之前，操作1D NMR钙滴定以大致检测化学位移，除了侧链分散大约0至6ppm外，NH基团主要的化学位移是近似6.6-7.8ppm，其后来证明是来自侧链NH。由于大量的峰重叠在一起，区分时不敏感，所以8至11ppm的区域没有显示出明显的位移。
因为1D实验不够有效探索这种巨大蛋白质，所以进行gNhsqc来验证每一个残基的化学位移。将0.3mM浓度的蛋白质溶于10mM、pH7.4的Tris缓冲液并且D2O的最终浓度为10%。600MHz NMR的操作温度为40℃。图33显示了由Ca2+触发的CatchER的化学位移变化的1D NMR光 谱。
应该首先检验盐效应以验证D11是否可以非特异性地结合到一价阳离子。在样品中加入0.1mM EGTA，作为起始点，接着用10mM KCl滴定以监测化学位移。在这两个光谱重叠之后，它们完美地匹配。暗示了高浓度盐不能导致蛋白质的构象变化，从而不存在非特异性结合。
无Ca2+CatchER、Ca2+_加载CatchER的X射线晶体结构
无Ca2+的CatchER显示了在395nm处的主要吸收峰和在490nm处的次要峰，其类似于wtGFP，具有在体外测量的395nm比490nm的比率3.0（Tang,等人）。从无Ca2+和加载形式的CatchER的晶体结构（图34），222的侧链旋转以改变侧链Glu222和Ser205的羧基基团与发色团的羟基基团之间的氢键距离。发色团周围的提出的氢网络是基于先前报道的wtGFP（pdbcode:1EMB）和EGFP（pdb code:1EMA）的晶体结构。先前报道的来自水母的wtGFP在390nm（主要）和490nm（次要）处具有两个吸收峰，表明两种形式的发色团的混合物共存于一种荧光蛋白中（Heim，1996）。尽管从DNA序列比对，位点定向诱变S65T是造成主要差异的原因，然而，wtGFP和EGFP的发色团可以从晶体结构很好地重叠，但发色团周围的侧链显示出不同的构象，尤其对于Thr203和Glu222（Baird,1997）。在wtGFP中，Thr203的主链通过水分子与发色团远距离地相互作用（Reminton,1996和Tsien,1998），对于EGFP，极性侧链羟基氧与发色团的氧原子直接相互作用，形成短的氢键2.5A，以及以阴离子形式稳定发色团，造成在490nm处的主要吸收峰。通过E222的侧链羧基基团的特殊定向进一步增强这种稳定，唯一带负电荷的残基朝向发色团突出，在发色团中共轭的E222、V61和T65之间形成受限氢网络。然而，wtGFP的Tyr66的氧仅与H2O直接相互作用，而不与极性残基形成氢键，维持中性形式，有助于在395nm处的主要吸收峰。E222的羧基基团的两个氧原子相等地部分带电荷，与Ser205和发色团形成氢键。T65和Y66的羟基基团之间的氢桥经由E222、S205和水分子形成，确保发色团内的极性残基之间的有效电子转移。有趣地从晶体结构观察到E222的羧基基团在无Ca2+和加载形式CatchER之间旋转，改变了E222的羧基基团到S205和发色团之间的氢键的距离。到目 前为止，没有报道分析物结合触发的Glu222的旋转，特别是与光学特性变化相关的旋转。有可能的是，响应于Ca2+的E222侧链旋转可能有助于CatchER的快速动力学，因为在基于FRET对的传感器中，单个残基的旋转比长范围蛋白质-蛋白质的相互作用要快。然而，在无Gd3+和Gd3+_浸泡CatchER结构的比较中，没有观察到Glu222的这种侧链旋转（图35），结晶后，隐埋在GFP的β桶结构内部的残基很可能没有显示出进一步的构象变化，甚至在金属浸泡期间，尽管在体外滴定期间加入Gd3+之后，CatchER的荧光强度显著地增强。在所有不含金属的、Ca2+_加载和Gd3+加载形式CatchER中，CatchER的另一关键残基Thr203保持在主链氧和接近于发色团的水之间的一个氢键，类似于wtGFP，表明Ca2+_加载CatchER的荧光强度仅恢复EGFP的50%，可能是由于固定的氢键网络接近发色团的Tyr66的苯酚基团，该发色团保持类似于wtGFP。
序列表：
<SEQ ID No.：1；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：2；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAshSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：3；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：4；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：5；PRT3；人工序列>
MetLeuLeuSerValProLeuLeuLeuGlyLeuLeuGlyLeuAlaAlaAlaAspGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLysLysAspGluLeu
<SEQ ID No.：6；PRT3；人工序列>
MetSerValLeuThrProLeuLeuLeuArgGlyLeuThrGlySerAlaArgArgLeuProValProArgAlaLysIleHisSerLeuGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyr8GlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeu160ValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsn1IleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisVal240MetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGln2AsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys310
<SEQ ID No.：7；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerGluGluGluLysArgGluAlaGluArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisAlaAlaThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：8；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAsnLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：9；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAsnLysAsnGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：10；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAshSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValAsnLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：11；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspLysAspGlyAspGlyThrIleThrThrLysGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAla24GlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：12；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerCysAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetCysAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：13；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrILeMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerAlaAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetCysAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：14；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerCysAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetAlaAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：15；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGln HisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerAlaAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetAlaAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：16；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAla24GlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：17；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyeIleSerAlaAlaGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAsp24HisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：18；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleVal24LeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：19；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：20；PRT3；人工序列>
MetLeuLeuSerValProLeuLeuLeuGlyLeuLeuGlyLeuAlaAlaAlaAspGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsn16IleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGln24AsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLysLysAspGluLeu
<SEQ ID No.：21；PRT3；人工序列>
MetSerValLeuThrProLeuLeuLeuArgGlyLeuThrGlySerAlaArgArgLeuProValProArgAlaLysIleHisSerLeuGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeu16ValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisVal24MetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys31
<SEQ ID No.：22；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerGluGluGluLysArgGluAlaGluArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisAlaAlaThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：23；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAsnLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：24；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGly AsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAsnLysAsnGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：25；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValAsnLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：26；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspLysAspGlyAspGlyThrIleThrThrLysGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAla24GlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：27；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerCysAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetCysAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：28；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerAlaAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetCysAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：29；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeu ProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerCysAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetAlaAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：30；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerAlaAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetAlaAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：31；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAshSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAla24GlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.；32；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAsp24HisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：33；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleVal24LeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：34；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：35；PRT3；人工序列>
MetLeuLeuSerValProLeuLeuLeuGlyLeuLeuGlyLeuAlaAlaAlaAspGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsn16IleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGln24AsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLysLysAspGluLeu
<SEQ ID No.：36；PRT3；人工序列>
MetSerValLeuThrProLeuLeuLeuArgGlyLeuThrGlySerAlaArgArgLeuProValProArgAlaLysIleHisSerLeuGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeu16ValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisVal24MetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys31
<SEQ ID No.：37；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerGluGluGluLysArgGluAlaGluArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisAlaAlaThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：38；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyA snIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAsnLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：39；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAsnLysAsnGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：40；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValAsnLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：41；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspLysAspGlyAspGlyThrIleThrThrLysGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAla24GlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：42；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerCysAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetCysAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：43；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeu ProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerAlaAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetCysAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：44；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerCysAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetAlaAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：45；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluSerArgAsnIleCysAspIleSerAlaAspLysPheLeuAspAspAspIleThrAspAspIleMetAlaAlaLysLysIleLeuAspIleLysGlyAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeu24SerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：46；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnAspLys16AspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAla24GlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：47；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnGluGlu16GluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：48；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnAspLys16AspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAla24GlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：49；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnGluGlu16GluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：50；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnAspLys16AspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAla24GlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：51；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnGluGlu16GluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：52；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAshSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：53；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnThrGluGluGlnIleAlaGluPheLysGluAlaPheSerLeuPheAspLysAspGlyAspGlyThrIleThrThrLysGluLeuGlyThrValMetArgSerIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSer24AlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：54；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：55；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeLThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnThrGluGluGlnIleAlaGluPheLysGluAlaPheSerLeuPheAspLysAspGlyAspGlyThrIleThrThrLysGluLeuGlyThrValMetArgSerIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSer24AlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：56；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSer24LysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys27
<SEQ ID No.：57；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnThrGluGluGlnIleAlaGluPheLysGluAlaPheSerLeuPheAspLysAspGlyAspGlyThrIleThrThrLysGluLeuGlyThrValMetArgSerIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSer24AlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：58；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValAspPheGluGlyAspThrLeuAsnAsnAspIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：59；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleAsnValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuAsnAsnAspIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：60；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnAspGluAspGlyAspValAsnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：61；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetAspGlnHisAspPhePheAspSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValAsnLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：62；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetAspGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAshSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValAsnLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：63；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisAsnLysGlnAspAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnAspTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyAspThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：64；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：65；PRT3；人工序列>
MetLeuLeuSerValProLeuLeuLeuGlyLeuLeuGlyLeuAlaAlaAlaAspGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsn16IleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArg24AspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLysLysAspGluLeu
<SEQ ID No.：66；PRT3；人工序列>
MetSerValLeuThrProLeuLeuLeuArgGlyLeuThrGlySerAlaArgArgLeuProValProArgAlaLysIleHisSerLeuGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGlu16LeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGln24SerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：67；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleAspValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuSerAsnGluIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：68；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspAspPheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAsPGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrGluMetAspAspLysGlnLysAsn16GlyAspLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：69；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProAspLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePheGluLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnSerLeuGlyHisLysAsnGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGluLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：70；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluAspPheThrGlyValAsnProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaSerProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysAspGluGlyAspThrAspValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：71；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluAspPheThrGlyValAsnProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaThrProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysAspGluGlyAspThrGluValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleMetAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysValAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：72；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValAspPheGluGlyAspThrLeuAsnAsnAspIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：73；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleAsnValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuAsnAsnAspIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：74；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnAspGluAspGlyAspValAsnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：75；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetAspGlnHisAspPhePheAspSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValAsnLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：76；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetAspGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValAsnLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：77；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisAsnLysGlnAspAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnAspTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyAspThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：78；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：79；PRT3；人工序列>
MetLeuLeuSerValProLeuLeuLeuGlyLeuLeuGlyLeuAlaAlaAlaAspGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsn16IleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArg24AspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLysLysAspGluLeu
<SEQ ID No.：80；PRT3；人工序列>
MetSerValLeuThrProLeuLeuLeuArgGlyLeuThrGlySerAlaArgArgLeuProValProArgAlaLysIleHisSerLeuGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGlu16LeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGln24SerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：81；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleAspValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuSerAsnGluIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：82；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspAspPheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrGluThrAspAspLysGlnLysAsn16GlyAspLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：83；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProAspLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePheGluLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnSerLeuGlyHisLysAsnGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGluLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：84；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluAspPheThrGlyValAsnProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaSerProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysAspGluGlyAspThrAspValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：85；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluAspPheThrGlyValAsnProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaThrProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysAspGluGlyAspThrGluValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：86；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValAspPheGluGlyAspThrLeuAsnAsnAspIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：87；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleAsnValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuAsnAsnAspIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：88；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnAspGluAspGlyAspValAsnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：89；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetAspGlnHisAspPhePheAspSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValAsnLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：90；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetAspGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsrIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValAsnLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：91；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisAsnLysGlnAspAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnAspTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyAspThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：92；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAshSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：93；PRT3；人工序列>
MetLeuLeuSerValProLeuLeuLeuGlyLeuLeuGlyLeuAlaAlaAlaAspGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsn16IleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAshTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArg24AspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLysLysAspGluLeu
<SEQ ID No.：94；PRT3；人工序列>
MetSerValLeuThrProLeuLeuLeuArgGlyLeuThrGlySerAlaArgArgLeuProValProArgAlaLysIleHisSerLeuGlySerGlyProSerArgMetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysAspAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGlu16LeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGln24SerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：95；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleAspValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuSerAsnGluIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：96；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspAspPheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrGluThrAspAspLysGlnLysAsn16GlyAspLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValGluLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：97；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProAspLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerGluLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnSerLeuGlyHisLysAsnGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGluLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：98；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluAspPheThrGlyValAsnProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaSerProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysAspGluGlyAspThrAspValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：99；PRT3；人工序列>
MetValSerLysGlyGluGluAspPheThrGlyValAsnProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaThrProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIleSerPheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysAspGluGlyAspThrGluValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsn16GlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：100；PRT3；人工序列>
MetLeuLeuSerValProLeuLeuLeuGlyLeuLeuGlyLeuAlaAlaAlaAspGlySerGlyProSerArg
<SEQ ID No.：101；PRT3；人工序列>
LysAspGluLeu
<SEQ ID No.：102；PRT3；人工序列>
MetSerValLeuThrProLeuLeuLeuArgGlyLeuThrGlySerAlaArgArgLeuProValProArgAlaLysIleHisSerLeuGlySerGlyProSerArg
<SEQ ID No.：103；PRT3；人工序列>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：104；PRT3；人工序列>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：105；PRT3；人工序列>
MetLeuLeuSerValProLeuLeuLeuGlyLeuLeuGlyLeuAlaAlaAlaAspValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLysLysAspGluLeu
<SEQ ID No.：106；DNA；人工序列>
ACGGCGACGCGAACCTCGCCGACC
<SEQ ID No.：107；DNA；人工序列>
CCTCGTCGTTGTGGCGGATCTTG
<SEQ ID No.：108；DNA；人工序列>
CGCACCATCTCCTTCAAGGACG
<SEQ ID No.：109；DNA；人工序列>
CTCCTGGACGTAGCCTTCCC
<SEQ ID No.：110；DNA；人工序列>
GAACGGCATCAAGGCGAACTTCAA
<SEQ ID No.：111；DNA；人工序列>
TTCTGCTTGTCGGCCGTGATATAGA
<SEQ ID No.：112；PRT；人工序列>
MLLSVPLLLGLLGLAAAD
<SEQ ID No.：113；PRT；人工序列>
DKDGNGYISAAE
<SEQ ID No.：114；PRT；人工序列>
EEEIREAFRVFDKDGNGYISAAELRHVMTNL
<SEQ ID No.：115；DNA；人工序列>
TATTACGTGTTCGCTGGCTaGCGTTTaACTTaAGCTTATGGGGGCCAGAGCAGTGTCCGAGCTGCGGCTGGCACTGCTGTTTGTACTGGTGCTAGGGACGCCCAGGTTAGGGGTCCAGGGGGAAGATGGGTTGGACTTCCCTGAGTACGACGGTGTGGACCGTGTGATCAATGTGAATGCCAAGAACTACAAGAACGTGTTTAAGAAGTATGAGGTGCTGGCCCTCCTCTACCATGAGCCCCCTGAGGACGACAAGGCCTCGCAGAGACAATTTGAGATGGAGGAGCTAATCCTGGAGTTAGCAGCCCAAGTCTTAGAAGACAAGGGTGTTGGCTTTGGCCTGGTGGACTCAGAGAAGGATGCAGCTGTGGCCAAGAAACTAGGACTAACTGAAGAAGACAGCGTTTATGTGTTCAAAGGAGATGAAGTCATTGAATATGACGGCGAGTTTTCTGCAGACACTCTGGTGGAGTTTCTGCTTGATGTCCTAGAAGACCCTGTAGAGTTGATTGAAGGTGAACGAGAGCTGCAGGCATTTGAGAATATTGAAGATGAAATCAAACTCATTGGCTACTTCAAGAGCAAAGACTCAGAGCATTACAAAGCCTACGAGGACGCAGCTGAAGAGTTCCATCCCTACATCCCTTTCTTCGCTACCTTCGACAGCAAGGTGGCAAAGAAGCTGACTCTGAAGTTGAATGAGATTGATTTCTACGAGGCCTTCATGGAAGAGCCTATGACCATCCCAGACAAGCCCAACAGTGAAGAGGAGATTGTGAGCTTCGTGGAGGAGCACAGGAGATCAACCCTGAGGAAACTGAAGCCTGAGAGTATGTACGAGACTTGGGAGGATGACCTGGATGGAATCCACACTGTCGCCTTTGCAGAGGAAGCAGATCCTGATGGCTATGAGTTCTTAGAGACTCTCAAGGCTGTGGCCCAAGACAACACTGAGAACCCCGACCTCAGTATCATCTGGATTGATCCTGATGACTTCCCGCTGCTGGTCCCGTACTGGGAGAAGACCTTTGACATTGACCTGTCAGCTCCACAAATAGGAGTTGTCAATGTTACAGACGCGGACAGCATATGGATGGAGATGGATAACGAGGAGGACCTGCCTTCTGCTGATGAGCTGGAGGACTGGCTGGAGGACGTGCTGGAGGGCGAGATCAACACAGAGGATGACGACGACGATGACGACGATGACGATGATGACGATGATGACGACGACGGATCCGGGCCCTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACGAGCACAACGTCTATATCACGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGGACACCGAATCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGGAGGTGGAGGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGT
<SEQ ID No.：116；PRT；人工序列>
ITCSLASVLKLMGARAVSELRLALLFVLVLGTPRLGVQGEDGLDFPEYDGVDRVINVNAKNYKNVFKKYEVLALLYHEPPEDDKASQRQFEMEELILELAAQVLEDKGVGFGLVDSEKDAAVAKKLGLTEEDSVYVFKGDEVIEYDGEFSADTLVEFLLDVLEDPVELIEGERELQAFENIEDEIKLIGYFKSKDSEHYKAYEDAAEEFHPYIPFFATFDSKVAKKLTLKLNEIDFYEAFMEEPMTIPDKPNSEEEIVSFVEEHRRSTLRKLKPESMYETWEDDLDGIHTVAFAEEADPDGYEFLETLKAVAQDNTENPDLSIIWIDPDDFPLLVPYWEKTFDIDLSAPQIGVVNVTDADSIWMEMDNEEDLPSADELEDWLEDVLEGEINTEDDDDDDDDDDDDDDDDDGSGPSRMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNEHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLDTESALSKDPNEKRDHMVLLEEVEAAGITLGMDELYK-EFXXQISSTVAAARV-RARLNPLISLDCAF-LPAICC
<SEQ ID No.：117；DNA；人工序列>
TATTACGTGTTCGCTGGCTaGCGTTTaACTTaAGCTTATGGGGGCCAGAGCAGTGTCCGAGCTGCGGCTGGCACTGCTGTTTGTACTGGTGCTAGGGACGCCCAGGTTAGGGGTCCAGGGGGAAGATGGGTTGGACTTCCCTGAGTACGACGGTGTGGACCGTGTGATCAATGTGAATGCCAAGAACTACAAGAACGTGTTTAAGAAGTATGAGGTGCTGGCCCTCCTCTACCATGAGCCCCCTGAGGACGACAAGGCCTCGCAGAGACAATTTGAGATGGAGGAGCTAATCCTGGAGTTAGCAGCCCAAGTCTTAGAAGACAAGGGTGTTGGCTTTGGCCTGGTGGACTCAGAGAAGGATGCAGCTGTGGCCAAGAAACTAGGACTAACTGAAGAAGACAGCGTTTATGTGTTCAAAGGAGATGAAGTCATTGAATATGACGGCGAGTTTTCTGCAGACACTCTGGTGGAGTTTCTGCTTGATGTCCTAGAAGACCCTGTAGAGTTGATTGAAGGTGAACGAGAGCTGCAGGCATTTGAGAATATTGAAGATGAAATCAAACTCATTGGCTACTTCAAGAGCAAAGACTCAGAGCATTACAAAGCCTACGAGGACGCAGCTGAAGAGTTCCATCCCTACATCCCTTTCTTCGCTACCTTCGACAGCAAGGTGGCAAAGAAGCTGACTCTGAAGTTGAATGAGATTGATTTCTACGAGGCCTTCATGGAAGAGCCTATGACCATCCCAGACAAGCCCAACAGTGAAGAGGAGATTGTGAGCTTCGT GGAGGAGCACAGGAGATCAACCCTGAGGAAACTGAAGCCTGAGAGTATGTACGAGACTTGGGAGGATGACCTGGATGGAATCCACACTGTCGCCTTTGCAGAGGAAGCAGATCCTGATGGCTATGAGTTCTTAGAGACTCTCAAGGCTGTGGCCCAAGACAACACTGAGAACCCCGACCTCAGTATCATCTGGATTGATCCTGATGACTTCCCGCTGCTGGTCCCGTACTGGGAGAAGACCTTTGACATTGACCTGTCAGCTCCACAAATAGGAGTTGTCAATGTTACAGACGCGGACAGCATATGGATGGAGATGGATAACGAGGAGGACCTGCCTTCTGCTGATGAGCTGGAGGACTGGCTGGAGGACGTGCTGGAGGGCGAGATCAACACAGAGTGATGACGATGATGACGACGACGGATCCGGGCCCTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACGAGCACAACGTCTATATCACGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGGACACCGAATCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGGAGGTGGAGGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGT
<SEQ ID No.：118；PRT；人工序列>
ITCSLASVLKLMGARAVSELRLALLFVLVLGTPRLGVQGEDGLDFPEYDGVDRVINVNAKNYKNVFKKYEVLALLYHEPPEDDKASQRQFEMEELILELAAQVLEDKGVGFGLVDSEKDAAVAKKLGLTEEDSVYVFKGDEVIEYDGEFSADTLVEFLLDVLEDPVELIEGERELQAFENIEDEIKLIGYFKSKDSEHYKAYEDAAEEFHPYIPFFATFDSKVAKKLTLKLNEIDFYEAFMEEPMTIPDKPNSEEEIVSFVEEHRRSTLRKLKPESMYETWEDDLDGIHTVAFAEEADPDGYEFLETLKAVAQDNTENPDLSIIWIDPDDFPLLVPYWEKTFDIDLSAPQIGVVNVTDADSIWMEMDNEEDLPSADELEDWLEDVLEGEINTEGSGPSRMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNEHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLDTESALSKDPNEKRDHMVLLEEVEAAGITLGMDELYKEFXXQISSTVAAARVRARLNPLISLDCAFLPAICC
<SEQ ID No.：119；PRT；人工序列>
FCLTLRRRYTMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSGPSRMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNEHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLDIESALSKDPNEKRDHMVLLEEVEAAGITLGMDELYKEFELRRQACGRTRVPPPPPLRSGCQSPKGSXGCCPTPLPXXRIRPXQRPXXSAXXXXCX
<SEQ ID No.：120；PRT；人工序列>
XITCSLASVLKLGTELGSGPSRMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNEHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLDTESALSKDPNEKRDHMVLLEEVEAAGITLGMDELYKFYTLRFLALFLAFAINFILLFYKVSEFCRYPAQWRPLESRGPVTRSASTVPSSCQPSV
<SEQ ID No.：121；PRT3；>(D8-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：122；PRT3；>(D9-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：123；PRT3；>(D10-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：124；PRT3；>(D11-EGFP，无ER标签的CatchER)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：125；PRT3；>(D11-EGFP，带ER标签的CatchER)
MetLeuLeuSerValProLeuLeuLeuGlyLeuLeuGlyLeuAlaAlaAlaAspValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLysLysAspGluLeu
<SEQ ID No.：126；PRT3；>(D12-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrAr gAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluAspValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：127；PRT3；>(D13-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrAsnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluAspValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：128；PRT3；>(D14-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisGluValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：129；PRT3；>(D15-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisGluValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：130；PRT3；>(D16-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisGluValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：131；PRT3；>(D11-EGFP-203I，CatchER-203I)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAsrIleGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：132；PRT3；>(D11-EGFP-203V，CatchER-203V)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspValGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：1 33；PRT3；>(D1 1-EGFP-203D，CatchER-203D)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspAspGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：1 34；PRT3；>(D1 1-EGFP-203F，CatchER-203F)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspPheGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaG lyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：1 35；PRT3；>(D11-EGFP-203E，CatchER-203E)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspGluGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：136；PRT3；>(D11-EGFP-175G，CatchER-175G)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlyGlyValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：137；PRT3；>(D11-EGFP-148D，CatchER-148D)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluAspAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：138；PRT3；>(G1 M1-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnAspIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAshSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：139；PRT3；>(G1 M2-EGFP)
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuGluGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.：140；PRT；>(肌集钙蛋白连系的CatchER)
ITCSLASVLKLMGARAVSELRLALLFVLVLGTPRLGVQGEDGLDFPEYDGVDRVINVNAKNYKNVFKKYEVLALLYHEPPEDDKASQRQFEMEELILELAAQVLEDKGVGFGLVDSEKDAAVAKKLGLTEEDSVYVFKGDEVIEYDGEFSADTLVEFLLDVLEDPVELIEGERELQAFENIEDEIKLIGYFKSKDSEHYKAYEDAAEEFHPYIPFFATFDSKVAKKLTLKLNEIDFYEAFMEEPMTIPDKPNSEEEIVSFVEEHRRSTLRKLKPESMYETWEDDLDGIHTVAFAEEADPDGYEFLETLKAVAQDNTENPDLSIIWIDPDDFPLLVPYWEKTFDIDLSAPQIGVVNVTDADSIWMEMDNEEDLPSADELEDWLEDVLEGEINTEDDDDDDDDDDDDDDDDDGSGPSRMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNEHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLDTESALSKDPNEKRDHMVLLEEVEAAGITLGMDELYK-EFXXQISSTVAAARV-RARLNPLISLDCAF-LPAICC
<SEQ ID No.：141；PRT；>(肌集钙蛋白17 Asp缺失的连系的CatchER)
ITCSLASVLKLMGARAVSELRLALLFVLVLGTPRLGVQGEDGLDFPEYDGVDRVINVNAKNYKNVFKKYEVLALLYHEPPEDDKASQRQFEMEELILELAAQVLEDKGVGFGLVDSEKDAAVAKKLGLTEEDSVYVFKGDEVIEYDGEFSADTLVEFLLDVLEDPVELIEGERELQAFENIEDEIKLIGYFKSKDSEHYKAYEDAAEEFHPYIPFFATFDSKVAKKLTLKLNEIDFYEAFMEEPMTIPDKPNSEEEIVSFVEEHRRSTLRKLKPESMYETWEDDLDGIHTVAFAEEADPDGYEFLETLKAVAQDNTENPDLSII WIDPDDFPLLVPYWEKTFDIDLSAPQIGVVNVTDADSIWMEMDNEEDLPSADELEDWLEDVLEGEINTEGSGPSRMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNEHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLDTESALSKDPNEKRDHMVLLEEVEAAGITLGMDELYKEFXXQISSTVAAARVRARLNPLISLDCAFLPAICC
<SEQ ID No.142：D8-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.143：D9-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.144：D10-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAshGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAshIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.145：D11-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.146：D12-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluAspValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.147：D13-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrAsnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluAspValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.148：D14-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisGluValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.149：D15-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisGluValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.150：D16-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisGluValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.151：D11-EGFP-203I>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyP roValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspIleGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.152：D11-EGFP-203V>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspValGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.153：D11-EGFP-203D>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspAspGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.154：D11-EGFP-203F>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAshTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspPheGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.155：D11-EGFP-203E>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspphePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnpheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspGluGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.156：D11-EGFP-175G>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlyGlyValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.157：D11-EGFP-148D>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnGluAspAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuAspThrGluSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluGluValGluAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.158：G1 M1-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnAspIleGluLeuLysGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAshLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys
<SEQ ID No.159：G1 M2-EGFP>
ValSerLysGlyGluGluLeuPheThrGlyValValProIleLeuValGluLeuAspGlyAspLeuAsnGlyHisLysPheSerValSerGlyGluGlyGluGlyAspAlaThrTyrGlyLysLeuThrLeuLysPheIleCysThrThrGlyLysLeuProValProTrpProThrLeuValThrThrLeuThrTyrGlyValGlnCysPheSerArgTyrProAspHisMetLysGlnHisAspPhePheLysSerAlaMetProGluGlyTyrValGlnGluArgThrIlePhePheLysAspAspGlyAsnTyrLysThrArgAlaGluValLysPheGluGlyAspThrLeuValAsnArgIleGluLeuGluGlyIleAspPheLysGluAspGlyAsnIleLeuGlyHisLysLeuGluTyrAsnTyrAsnSerHisAsnValTyrIleThrAlaAspLysGlnLysAsnGlyIleLysAlaAsnPheLysIleArgHisAsnIleGluGluGluGluIleArgGluAlaPheArgValPheAspLysAspGlyAsnGlyTyrIleSerAlaAlaGluLeuArgHisValMetThrAsnLeuAspGlySerValGlnLeuAlaAspHisTyrGlnGlnAsnThrProIleGlyAspGlyProValLeuLeuProAspAsnHisTyrLeuSerThrGlnSerAlaLeuSerLysAspProAsnGluLysArgAspHisIleValLeuLeuGluPheValThrAlaAlaGlyIleThrLeuGlyMetAspGluLeuTyrLys

Claims (14)

1.一种分析物传感器，所述分析物传感器包括具有金属离子结合位点的工程化荧光主体多肽，所述金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，其中，所述带负电荷的残基包括定位在五角双锥几何结构中的多个羧基氧，其中，所述几何结构提供了金属离子结合位点，并与所述工程化荧光主体多肽的发色团区域可操作地相互作用，使得金属离子分析物与分子识别基序的结合对由所述荧光主体多肽发出的荧光信号的发射进行调制，或对所述工程化荧光主体多肽的吸收光谱进行调制，其中所述分析物传感器任选地包括用于选择性地靶向细胞内质网的靶向基序，并且其中，所述分析物传感器的氨基酸序列选自以下组成的组：SEQ ID No.：104、121-123、125和126。
2.根据权利要求1所述的分析物传感器，其中，所述分析物传感器与选自以下组成的组的金属离子结合：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、汞和镉。
3.根据权利要求1所述的分析物传感器，其中，在分析物不存在的情况下，所述分析物传感器发出第一荧光信号，在结合到所述分析物传感器的分析物存在的情况下，所述分析物传感器发出第二荧光信号，其中，所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地检测的。
4.根据权利要求1所述的分析物传感器，其中，所述带负电荷的残基在三个反平行的β片层的表面上。
5.根据权利要求1所述的分析物传感器，其中，所述带负电荷的残基在具有β罐结构的蛋白质的三条链上。
6.一种检测金属离子分析物的方法，包括：
(i)提供根据权利要求1-5中任一项所述的分析物传感器；
(ii)提供怀疑包含对所述分析物传感器的所述分子识别基序具有亲和力的金属离子分析物的测试样品；
(iii)在怀疑包含对所述分析物传感器的所述分子识别基序具有亲和力的金属离子分析物的所述测试样品不存在的情况下检测由所述分析物传感器发出的第一荧光信号；
(iv)使所述分析物传感器与所述测试样品接触；
(v)检测由与所述测试样品接触的所述分析物传感器发出的第二荧光信号；以及
(vi)比较所述第一荧光信号和所述第二荧光信号，其中，所述信号的比率变化指示所述测试样品中的金属离子分析物与所述分析物传感器相互作用。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一荧光信号和所述第二荧光信号的波长和/或强度不同，其中，波长的差异或强度的差异指示所述测试样品中的金属离子分析物与所述分析物传感器相互作用。
8.根据权利要求7所述的方法，还包括从所述强度的比率变化确定所述测试样品中的所述金属离子分析物的定量测量的步骤。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述金属离子分析物是选自以下组成的组的金属离子：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、汞和镉。
10.一种重组核酸，所述重组核酸编码根据权利要求1-5中任一项所述的分析物传感器。
11.根据权利要求10所述的重组核酸，还包括载体核酸序列。
12.根据权利要求10所述的重组核酸，其中所述重组核酸在遗传修饰的细胞中。
13.一种用于表征金属离子分析物的细胞活性的方法，包括：
(i)提供包括表达根据权利要求1-5中任一项所述的分析物传感器的重组核酸的遗传修饰的细胞；
(ii)检测由所述分析物传感器发出的第一荧光信号；
(iii)在诱导细胞中的生理事件之后，检测由所述分析物传感器发出的第二荧光信号；以及
(iv)比较所述第一荧光信号和所述第二荧光信号，其中，所述信号的比率变化指示细胞中的金属离子分析物水平的变化，其中所述变化与细胞中的所述生理事件相关联，
且其中，所述金属离子分析物选自以下组成的组：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、汞和镉。
14.一种检测金属离子分析物的方法，包括：
(i)提供根据权利要求1-5中任一项所述的分析物传感器；
(ii)提供怀疑包含对所述分析物传感器的所述分子识别基序具有亲和力的金属离子分析物的测试样品；
(iii)检测(a)在所述测试样品不存在的情况下源自所述分析物传感器的第一吸收信号或(b)在所述测试样品不存在的情况下由所述分析物传感器发出的第一荧光信号；
(iv)使所述分析物传感器与所述测试样品接触；
(v)检测(a’)源自与所述测试样品接触的所述分析物传感器的第二吸收信号或(b’)由与所述测试样品接触的所述分析物传感器发出的第二荧光信号；以及
(vi)比较所述第一吸收信号和所述第二吸收信号，其中所述吸收信号的比率变化指示所述测试样品中的金属离子分析物与所述分析物传感器相互作用；或比较所述第一荧光信号和所述第二荧光信号，其中所述信号的寿命的比率变化指示所述测试样品中的金属离子分析物与所述分析物传感器相互作用。
CN201180060987.0A 2010-10-19 2011-10-19 分析物传感器、制备和使用所述传感器的方法、以及检测分析物活性的方法 Active CN103299193B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39450110P 2010-10-19 2010-10-19
US61/394,501 2010-10-19
US201161526420P 2011-08-23 2011-08-23
US61/526,420 2011-08-23
PCT/US2011/056952 WO2012054648A2 (en) 2010-10-19 2011-10-19 Analyte sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting analyte activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103299193A CN103299193A (zh) 2013-09-11
CN103299193B true CN103299193B (zh) 2016-08-10

Family

ID=45975872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180060987.0A Active CN103299193B (zh) 2010-10-19 2011-10-19 分析物传感器、制备和使用所述传感器的方法、以及检测分析物活性的方法

Country Status (7)

Country Link
US (3) US8865416B2 (zh)
EP (1) EP2630502B1 (zh)
JP (1) JP6158087B2 (zh)
CN (1) CN103299193B (zh)
AU (1) AU2011317082B2 (zh)
CA (1) CA2815087C (zh)
WO (1) WO2012054648A2 (zh)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10852296B2 (en) 2011-12-27 2020-12-01 BiOMICom Incorporated Micro-sampling for cell, tissue, and micro-organism monitoring
JP6179918B2 (ja) * 2013-02-08 2017-08-16 三菱ケミカル株式会社 水質監視方法
CN105612426B (zh) * 2013-08-06 2018-01-12 佐治亚州立大学研究基金会公司 金属离子传感器和检测金属离子的方法
WO2015196080A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Connecticut Children's Medical Center Automated cell culture system and corresponding methods
CN104359888B (zh) * 2014-11-26 2019-04-05 环境保护部华南环境科学研究所 一种基于镧系金属铕离子配合物探针的pH值检测方法
US10845305B1 (en) 2015-11-20 2020-11-24 Verily Life Sciences Llc Method for increasing sensor resolution by spectrally stacking responsive dyes
KR102002589B1 (ko) * 2016-07-21 2019-07-22 주식회사 올리브헬스케어 주파수 도메인 기반의 다파장 생체신호 분석 장치 및 그 방법
WO2018187303A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Brozik James Alan Ultrasensitive detection platform using luminescent metals and uses thereof
EP3813651B1 (en) * 2018-06-28 2023-09-06 Becton, Dickinson and Company Systems and methods for normalizing signals in blood culture measurement systems
WO2020027237A1 (ja) 2018-08-01 2020-02-06 国立大学法人鹿児島大学 ペプチド融合タンパク質
US20220235106A1 (en) * 2019-04-05 2022-07-28 Korea Institute Of Ceramic Engineering And Technology Method for expressing and purifying protein by using csq-tag
AU2020318633A1 (en) * 2019-07-24 2022-02-24 Luca Science Inc. Method of obtaining mitochondria from cells and obtained mitochondria
BR102019017792A2 (pt) * 2019-08-27 2021-11-16 Fundação Oswaldo Cruz Receptáculo proteico, método para produção do receptáculo, método de identificação de patógenos ou de diagnóstico de doenças, e, uso do receptáculo
CN114423781B (zh) * 2019-09-24 2024-03-26 北京大学 用肌集钙蛋白传导离子的电导体和方法
CN112540178B (zh) * 2020-08-06 2023-12-19 武汉天德生物科技有限公司 一种检测早期老年痴呆症的免疫组化试剂盒及其使用方法
CN117795312A (zh) * 2021-07-01 2024-03-29 微量热技术有限公司 用于通过比率表征荧光粒子的方法和设备
EP4392438A2 (en) * 2021-08-25 2024-07-03 Yang, Jenny Fluorescent sensor for monitoring calcium dynamics
CN113999320B (zh) * 2021-11-02 2022-09-27 深圳先进技术研究院 以cd28和4-1bb为共刺激结构域的靶向cd276的嵌合抗原受体及其应用
CN114199846B (zh) * 2021-12-15 2023-05-23 上海理工大学 一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（ii）荧光生物传感器及其应用
CN116429950B (zh) * 2023-06-07 2023-08-11 成都佩德生物医药有限公司 多肽pd-dp-005的有关物质分析方法
CN117169129B (zh) * 2023-11-02 2024-01-23 苏州市药品检验检测研究中心（苏州市药品不良反应监测中心） 一种基于液晶的组胺检测用可视化检测器

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5952236A (en) * 1995-10-26 1999-09-14 Thompson; Richard B. Enzyme-based fluorescence biosensor for chemical analysis
CN101520416A (zh) * 2009-04-10 2009-09-02 北京化工大学 牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
JP2002253261A (ja) * 2001-03-05 2002-09-10 Inst Of Physical & Chemical Res 蛍光タンパク質
ATE509120T1 (de) 2001-09-18 2011-05-15 Carnegie Inst Of Washington Fusionsproteine zur detektion von analyten
CA2576849C (en) * 2004-08-09 2017-09-26 Georgia State University Research Foundation, Inc. Analyte sensors and method for constructing analyte binding motifs
US9151767B2 (en) * 2004-08-09 2015-10-06 Georgia State University Research Foundation, Inc. Analyte sensors
JP2007049943A (ja) * 2005-08-18 2007-03-01 Kyoto Univ 細胞内カルシウムイオン指示機能を有するポリペプチド
WO2008019123A2 (en) * 2006-08-04 2008-02-14 Georgia State University Research Foundation, Inc. Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity
WO2008076365A2 (en) * 2006-12-14 2008-06-26 Georgia State University Research Foundation, Inc. Analyte sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting analyte activity
EP2020418A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fluorescent GFP variant displaying highly increased fluorescence intensity without a spectral shift
JP2011097930A (ja) * 2009-10-07 2011-05-19 Hokkaido Univ 光活性化生理機能センサータンパク質
CN103293689B (zh) 2013-05-31 2015-05-13 京东方科技集团股份有限公司 一种可在不同显示模式之间切换的方法和显示装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5952236A (en) * 1995-10-26 1999-09-14 Thompson; Richard B. Enzyme-based fluorescence biosensor for chemical analysis
CN101520416A (zh) * 2009-04-10 2009-09-02 北京化工大学 牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Facilitating chromophore formation of engineered Ca2+ binding green fluorescent proteins;Angela N. Holder 等;《Archives of Biochemistry and Biophysics》;20090407;第486卷(第1期);29页右栏第3段，图1 *
基于GFP标记的镉生物传感器构建及其对镉毒性的检测;王珂征;《万方数据库 华中农业大学硕士学位论文》;20080331;1－56 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2815087A1 (en) 2012-04-26
US9599617B2 (en) 2017-03-21
JP2014503790A (ja) 2014-02-13
EP2630502A4 (en) 2014-04-30
JP6158087B2 (ja) 2017-07-05
EP2630502B1 (en) 2017-08-02
AU2011317082A1 (en) 2013-05-30
CA2815087C (en) 2019-02-26
AU2011317082B2 (en) 2016-11-03
US20130244250A1 (en) 2013-09-19
US20150072353A1 (en) 2015-03-12
US8865416B2 (en) 2014-10-21
US20150369805A1 (en) 2015-12-24
CN103299193A (zh) 2013-09-11
WO2012054648A2 (en) 2012-04-26
US9081023B2 (en) 2015-07-14
WO2012054648A3 (en) 2012-12-27
EP2630502A2 (en) 2013-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103299193B (zh) 分析物传感器、制备和使用所述传感器的方法、以及检测分析物活性的方法
US8420327B2 (en) Analyte sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting analyte activity
CN105612426B (zh) 金属离子传感器和检测金属离子的方法
Newman et al. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells
Stepanenko et al. Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes
EP1505073B1 (en) Genetically encoded bioindicators of calcium-ions
US20090203035A1 (en) Fluorescent proteins with increased photostability
JP2004532001A (ja) 単細胞レベルでの生物発光性Ｃａ＋＋リポーターとしてのキメラ性ＧＦＰ−エクオリン
US9815870B2 (en) Monomeric and bright infrared fluorescent proteins
CA2606402A1 (en) Nanoscale neuromodulating platform for retina neuron activation apparatus and method
Zhao et al. A Large Stokes Shift Fluorescent Protein Constructed from the Fusion of Red Fluorescent mCherry and Far‐Red Fluorescent BDFP1. 6
Krishna et al. Evolving trends in biosciences: multi-purpose proteins-GFP and GFP-like proteins
Kauk Investigating the Molecular Mechanism of Receptor Activation at Muscarinic Receptors by Means of Pathway-Specific Dualsteric Ligands and Partial Agonists
Heim Genetically encoded calcium indicators based on troponin C and fluorescent proteins
Murray Shedding light on nicotinic acetylcholine receptors: Creation and use of fluorescently tagged receptors
bastien Granier et al. Structure and Conformational Changes in the C-terminal Domain of the 2-Adrenoceptor

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant