JP6158087B2 - 分析物センサー、そのようなセンサーを調製および使用するための方法、および分析物の活性を検出する方法 - Google Patents

分析物センサー、そのようなセンサーを調製および使用するための方法、および分析物の活性を検出する方法 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１０年１０月１９日出願の「ＡＮＡＬＹＴＥ ＳＥＮＳＯＲＳ、ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＳＵＣＨ ＳＥＮＳＯＲＳ、ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ ＡＮＡＬＹＴＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ」という表題の米国仮特許出願第６１／３９４，５０１号に基づく優先権を主張するものである。本出願はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１１年８月２３日出願の「ＡＮＡＬＹＴＥ ＳＥＮＳＯＲＳ、ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＳＵＣＨ ＳＥＮＳＯＲＳ、ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ ＡＮＡＬＹＴＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ」という表題の米国仮特許出願第６１／５２６，４２０号に基づく優先権も主張するものである。
本開示は、金属イオン分析物を検出するための、分析物結合領域と蛍光ポリペプチドとを含む融合タンパク質分析物センサー、ならびにそれらをｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで使用する方法に関する。
（配列表）
本開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。
Ｃａ２＋は、ヒトの体内に最も多く遍在するシグナル伝達分子であり、心拍動、筋肉収縮、神経機能、細胞の発達、および増殖を含めた多数の生物学的機能を、細胞内区画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）間を異なる振幅および持続時間で流動することにより調節する［１］。膜系細胞小器官である小胞体／筋小胞体（ＥＲ／ＳＲ）内腔は、細胞体積の１０％未満を占め、細胞内Ｃａ２＋の９０％超を貯蔵し、Ｃａ２＋シグナル伝達の制御の中枢である。これにより、内因性のＣａ２＋放出およびＣａ２＋振動の伝播［２−４］が生じ得る。ＡＴＰ、イオノマイシン、ヒスタミン、およびグルタミンなどのＣａ２＋動員のアゴニストによりイノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）などのＣａ２＋受容体およびＣａ２＋ポンプが活性化されて、Ｃａ２＋がＥＲから細胞質ゾル内に放出され［５−７］、その結果、ＥＲのＣａ２＋が（安静状態におけるｍＭから励起状態におけるμＭへと）急速に減少する。これらのアゴニストを除去することが、筋小胞体（小胞体）Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）などの膜チャネルを通じてＣａ２＋がＥＲを再び満たす助けとなる。Ｃａ２＋濃度が交互変化することにより、カルモジュリン（ＣａＭ）、トロポニンＣ（ＴｎＣ）などの種々の細胞内Ｃａ２＋感受性（トリガー）タンパク質および他のイオンチャネルが、Ｃａ２＋と結合すると起こるコンフォメーションの変化を通じて活性化される［８］。これらの活性化されたＣａ２＋センサー受容体により、多数の細胞プロセスおよび事象がさらに調節される。最近の研究により、Ｃａ２＋シグナル伝達は、心血管系機能の恒常性の操作のために重要であることが示されている［９〜１１］。心筋細胞では、心臓の弛緩および収縮が、細胞内Ｃａ２＋濃度およびＥＲの相同体である筋小胞体（ＳＲ）に関連するタンパク質の周期的変化によって調節される［１２、１３］。心臓のリアノジン受容体（ＲｙＲ２）、イノシトール（１，４，５）−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）および筋小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ）は、このアゴニストに誘導されるプロセスの間のＣａ２＋動員の３つの中心的な侵入門である。異常なＣａ２＋の操作に付随するこれらの２つのタンパク質の機能障害によって引き起こされる心不全が、動物およびヒトの両方から収集されたデータにおいてますます明らかになっている［１４〜１７］。ＥＲ／ＳＲのＣａ２＋濃度を速い放出カイネティクスでモニターするためのＣａ２＋指標、および特定の細胞内細胞小器官におけるＣａ２＋シグナル伝達を定量的に検出することができることが、心臓の発達および疾患における、Ｃａ２＋シグナル伝達および恒常性の分子基盤を理解することに、有意な影響を有する。
ＥＲのＣａ２＋ダイナミクスの最初の測定は、原形質膜を透過処理した生細胞においてＣａ２＋色素Ｍａｇ−ｆｕｒａ−２を使用することで実現された。Ｃａ２＋色素とは対照的に、遺伝子にコードされたクロモフォアを有する、蛍光タンパク質（ＦＰ）に基づくＣａ２＋指標により、細胞内細胞小器官におけるＣａ２＋シグナル伝達を高い空間分解能および時間分解能で検出することができる。これらは、センサーを生成するために単一の蛍光タンパク質とカップリングしたＣａ２＋により調節されるタンパク質であるカルモジュリンまたはトロポニンＣのいずれか、例えば、ＧＣａＭＰなど（１１）、あるいはカメレオン（Ｃａｍｅｌｅｏｎ）などの二重蛍光タンパク質からなる。Ｃａ２＋結合ループまたはＣａＭのペプチド相互作用表面においてカメレオンを改変することによって生成されたいくつかのＥＲ／ＳＲセンサーが、いくらかの制限を伴って興奮性細胞に適用されている。興奮性細胞における速いＥＲ／ＳＲのＣａ２＋ダイナミクスを直接モニターすることは未だ新しい分野である。
二次メッセンジャーとして、カルシウムイオンは、種々の細胞内区画（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）における多くの生物学的プロセスを、タンパク質との相互作用を通じて調節する。カルシウムは、筋肉収縮（心拍動を含む）、視覚、および神経細胞のシグナル伝達に関与する。カルシウム結合性タンパク質は、０．１μＭ〜ｍＭにわたるＫｄを有する種々のカルシウム結合親和性を示し、これは、カルシウム結合性タンパク質の、種々の刺激に対するカルシウムの時間的変化および空間的変化を通じた応答、ならびにカルシウムの恒常性に不可欠である。例えば、多数のカルシウム結合部位を有する細胞外カルシウム調節性タンパク質、例えばカドヘリンなど、およびカルシウム感知受容体は、ミリモル以下〜ミリモル範囲の解離定数を有する。カルセケストリンは、小胞体（ＥＲ）内の主要なカルシウム結合性タンパク質であり、カルシウム結合親和性が比較的弱く、これにより、ＥＲカルシウム貯蔵所内のカルシウムを放出すること、またはそれと結合することができる。
安静時Ｃａ２＋濃度を有する小胞体（ＥＲ）は、主要な細胞内Ｃａ２＋貯蔵所として機能し、同期的なＣａ２＋放出とＣａ２＋波の伝播の両方をもたらし得る。ＡＴＰ、ヒスタミン、およびグルタミンなどのＣａ２＋動員性アゴニスト、ならびにＩＰ３およびｃＡＤＰＲなどの二次メッセンジャーにより、規定された時空間パターンで細胞質ゾルＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）が上昇する。ＥＲ貯蔵所からＣａ２＋が放出されることにより、［Ｃａ２＋］ｃが（安静状態におけるおよそ１０−７Ｍから励起した状態におけるおよそ１０−６Ｍまで）急速に上昇し、これにより、カルモジュリン（ＣａＭ）、トロポニンＣ（ＴｎＣ）を含めたいくつもの細胞内Ｃａ２＋感受性（トリガー）タンパク質、および他のイオンチャネルおよび酵素が活性化される（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．７：２７０〜２８２）。生物系全体にわたるカルシウムの分布率はよく知られており、大規模な試みが行われてきたが、タンパク質の生物学的機能、安定性、折り畳み、および動的特性のカルシウムによる調節に関する理解は、天然のタンパク質におけるカルシウム依存性のコンフォメーションの変化および協同的なカルシウム結合が原因で大きく制限されている。
カルシウム結合の重要な決定因子の研究は、数十年にわたり継続的努力事項となってきた。カルシウムリガンドの種類、電荷、および配置などのいくつかの因子がカルシウム結合において重要であることが示されている。カルシウムは、主に、Ａｓｐ、Ａｓｎ、およびＧｌｕの側鎖由来の酸素原子、主鎖カルボニル、ならびにタンパク質の溶媒水分子によりキレート形成され、五角両錐形状が最も一般的な結合形状である。カルシウム結合の静電気的性質に起因して、カルシウム結合部位では荷電したＡｓｐおよびＧｌｕが最も頻繁に見いだされる。配位球体の電荷数もカルシウム結合親和性において役割を果たす。さらに、より電気陰性の環境により、所与のカルシウム部位に対するより強力な結合親和性が引き起こされ、静電気的環境は多部位系における協同性に影響を及ぼす。これらの多部位タンパク質について、明白なカルシウム親和性は、金属−金属相互作用および結合部位の協同性による寄与を含む。しかし、カルシウム結合に対する重要な因子の定量的推定は未だ確立されていない。したがって、カルシウム結合に対する重要な決定因子の系統的研究には新しい戦略およびモデル系が必要である。
多くの細胞プロセスに対するカルシウムの作用をモニターすることは、これまで、内在性タンパク質からの干渉および元のカルシウムシグナル経路の攪乱などの多数の因子に起因して困難な努力であった。６０ｎＭ〜数百マイクロモルにわたる結合親和性を有する市販の色素を単純なインキュベーションによって哺乳動物細胞内にローディングすることができるが、これらでは、特定の細胞区画を予測可能な量でターゲティングすることができず、色素濃度を正確に決定することおよびカルシウム濃度をモニターすることが困難になる。これらの色素の多くは、細胞における緩衝効果を有し、厚い組織、インタクトな生物体、または非哺乳動物細胞に対して必要な感度をもたらさないことが示された。細胞により直接発現され、特異的な亜区画に確実にターゲティングされ得るタンパク質に基づくカルシウムセンサーが、哺乳動物細胞型および細菌の細胞型を含めた多種多様な細胞型に使用されている。エクオリンが、異なる細胞環境におけるカルシウム応答をモニターするために最初に適用された。しかし、エクオリンは、各応答後に消費されるセレンテラジンを絶えず添加することを必要とする。
次いで、カルモジュリン結合性ペプチドと連結した、２つの異なるように着色された蛍光タンパク質またはそれらの変異体およびカルモジュリンを用いたＦＲＥＴに基づくカルシウムセンサーが開発された（Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ２２：２０９〜２１６；Ｎａｔｕｒｅ、３８８：８８２〜８８７）。必須のトリガータンパク質カルモジュリンの使用を回避するために、トロポニンＣ（ＴｎＣ）を用いて、蛍光タンパク質のＦＲＥＴ対におけるカルシウム濃度の変化を感知した。内在性タンパク質の競合およびカルモジュリンおよびトロポニンＣなどの必須のタンパク質を用いる天然カルシウムシグナル系の攪乱ならびに天然カルシウムシグナルネットワークの電位の攪乱に関する主要な懸念に取り組むために、相互作用を低下させるためのカルモジュリン結合部位およびカルモジュリンの改変を実施した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７４０４〜１７４０９；Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：５２１〜５３０）。したがって、細胞内、特に小胞体などの高濃度の細胞小器官におけるカルシウムの空間的変化および時間的変化をモニターするために、天然のカルシウム結合性タンパク質を使用しないカルシウムセンサーを開発する必要性が残っている。
小胞体／筋小胞体カルシウムシグナル伝達は、筋肉収縮、脳の活動およびすべての他のカルシウムの誤った取扱いに関連する疾患の研究のために極めて重要である。細胞の細胞質ゾルの大きな体積とは異なり、ＥＲ／ＳＲは明確に規定された輪郭を有し、細胞の総体積の３％のみを占め、高度に特異的な標的カルシウム指標なしで試験することが難しい。残念ながら、公開された、遺伝子にコードされたＥＲカルシウムセンサーは数種しかなく、Ｋｄのすべてがおよそ数十マイクロモルに制限されているが、骨格筋細胞のＳＲにおける遊離のカルシウム濃度はおよそ１ｍＭであり、さらに２０ｍＭのカルシウムがカルセケストリンと結合していることがよく知られている。筋肉細胞または組織におけるＳＲカルシウムを測定するために適合させた、結合親和性が低いＳＲカルシウムセンサーを設計する強い必要性がある。理想的には、カルシウム結合親和性は、ＳＲカルシウム緩衝タンパク質カルセケストリンの全体のカルシウム結合親和性と同様におよそ１ｍＭまたはミリモル以下の範囲であるべきであり、これは、カルモジュリンのＫｄと同じ大きさの範囲内で、ｆｕｒａ−２、カメレオンおよびＧｃａｍＰ２などの細胞質ゾルのカルシウム指標がおよそマイクロモル以下のＫｄを示すという戦略に基づく。
カルモジュリンに基づくカルシウムセンサーの蛍光変化は、いくつかの異なる結合プロセスを伴うかさ高い複合体である、カルシウムが結合した形態のカルモジュリンとＭ１３ペプチドの間の相互作用に高度に依拠する。カルモジュリンのＣ−ドメインおよびＮ−ドメインに対するカルシウム結合親和性は大きさが異なる。さらに、ホロ型カルモジュリンとＭ１３ペプチドの相互作用により、全体の結合プロセスに追加的なＫｄが付加され、したがって、センサーの見かけのＫｄはカルシウム結合に直接由来しないが、カルシウムとカルモジュリンの相互作用由来の大きさが異なる２つのＫｄとカルモジュリンとＭ１３ペプチドの相互作用由来の逐次的なＫｄとの組合せではカルシウム結合に由来する。Ｄ１ＥＲ結合プロセスの式はｉｎ ｓｉｔｕで測定することが難しいいくつかの定数、例えばＫｄ１、Ｋｄ２およびＨｉｌｌ係数などを必要とするので、カルモジュリンに基づくカルシウム指標ではカルシウムの変化を定量的に測定することができない。さらに、ＣａＭとＭ１３ペプチドの相互作用のカイネティクスは、複雑な遅延に起因して、さらに加速することができない。
本方法の実施形態は、部位特異的突然変異誘発を用いてＧＦＰ上にＣａ２＋結合部位を創出することによるＣａ２＋バイオセンサーの設計を提供し、これは、現行のＣａ２＋センサーの制限を克服するだけでなく、ＥＲにおけるリアルタイムＣａ２＋濃度を正確に測定するために、組織および動物画像化においてさらに適用するために光学特性が異なる種々の他の蛍光タンパク質に利用することもでき、それにより、その生物学的機能と相関してＥＲにおけるＣａ２＋シグナル伝達に関する本発明者らの理解が増強される。本開示の実施形態は、多様な細胞型の種々の細胞内細胞小器官における異なるアゴニストに対するＣａ２＋シグナル伝達応答の検出において役立ち得る、異なるシグナルペプチドおよび多数の大きさの結合親和性を有する増強されたセンサーを提供する。
したがって、本開示の一態様は、複数の負荷電残基を含む金属イオン結合部位を有する工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドであって、負電荷残基が五角両錐形状に配向された複数のカルボキシル酸素を含み、前記形状により、工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドのクロモフォア領域と作動的に相互作用する金属イオン結合部位がもたらされ、その結果、金属イオン分析物と分子認識モチーフが結合することにより、蛍光ホストポリペプチドにより放出される蛍光シグナルの放出、および任意選択で、工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドの吸収スペクトルが調節される蛍光ホストポリペプチドの実施形態を包含する。
本開示の別の態様は、試験試料において分析物を検出するために配合することができる、分析物センサーの実施形態を含む組成物の実施形態を包含する。
本開示のさらに別の態様は、本開示による分析物センサーおよび分析物センサーにより分析物を検出するために分析物センサーを使用するための説明書を含むパッケージを含むキットの実施形態を包含する。
本開示のさらに別の態様は、分析物を検出するための方法であって、
（ｉ）本開示による分析物センサーを用意するステップと、
（ｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料を用意するステップと、
（ｉｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料の不在下で分析物センサーにより放出される第１の蛍光シグナルを検出するステップと、
（ｉｖ）分析物センサーを試験試料と接触させるステップと、
（ｖ）試験試料と接触している分析物センサーにより放出される第２の蛍光シグナルを検出するステップと、
（ｖｉ）第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルを比較するステップであって、シグナルのレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示されるステップ
とを含む方法の実施形態を包含する。
本開示の別の態様は、本開示による分析物センサーをコードする組換え核酸の実施形態を包含する。
本開示の別の態様は、分析物の細胞活性を特徴付けるための方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の分析物センサーを発現する組換え核酸を含む遺伝子改変細胞を用意するステップと、
（ｉｉ）遺伝子改変細胞において分析物センサーを発現させ、分析物センサーから生じるシグナルを測定するステップと、
（ｉｉｉ）分析物センサーにより放出される第１の蛍光シグナルを検出するステップと、
（ｉｖ）細胞において生理的事象が誘導された後に分析物センサーにより放出される第２の蛍光シグナルを検出するステップと、
（ｖ）第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルを比較するステップであって、シグナルのレシオメトリック変化により、細胞における生理的事象に関連する細胞における分析物のレベルの変化が示されるステップ
とを含む方法の実施形態を包含する。
本開示のさらなる態様は、添付の図面と併せて考慮すると、以下に記載されたその種々の実施形態の詳細な説明を検討することにより、より容易に理解されるだろう。
図１Ａおよび１Ｂは、１ｅｍａ．ｐｄｂに基づく、ＥＧＦＰ系Ｃａ２＋センサーのモデル構造を例示する図である。すべてのＣａ２＋センサーは、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）内に組み込まれたＣａ２＋結合モチーフから構成された。
図１Ａは、種々のＧＦＰ変異体のドメイン構造を例示する図である。ＣＲｓｉｇ：カルレティキュリンシグナルペプチドＭＬＬＳＶＰＬＬＬＧＬＬＧＬＡＡＡＤ（配列番号１１２）、ＫＤＥＬ：ＥＲ保持シグナル、ｋｚ：哺乳動物細胞における最適な翻訳開始のためのコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列。構築物Ｃａ−Ｇ１およびＣａ−Ｃ２はフランキング配列を含有する。Ｃａ−Ｇ１’、Ｃａ−Ｇ２’およびＣａ−Ｇ３’はフランキング配列を含有しない。
図１Ｂは、ＥＧＦＰにおけるＧｌｕ１７２−Ａｓｐ１７３（１位）、Ｇｌｎ１５７−Ｌｙｓ１５８（２位）、およびＡｓｎ１４４−Ｔｙｒ１４５（３位）の形態を概略的に例示する図である。
図２Ａは、ＥＧＦＰ−ｗｔおよびその変異体の可視吸光度を例示する図である。タンパク質濃度は２０μＭであった。
図２Ｂは、ＥＧＦＰ−ｗｔおよびその変異体の蛍光スペクトルを例示する図である。タンパク質濃度は１０μＭであり、励起および発光の両方について１ｎｍのスリット幅であった。λｅｘ＝３９８ｎｍ。
図３Ａ〜３Ｄは、Ｃａ２＋センサーＣａ−Ｇ１−３７の分光学的特徴を例示する図である。
図３Ａは、種々のＣａ２＋濃度で１７μＭにおけるセンサーＣａ−Ｇ１−３７についての可視吸収スペクトルを例示する図である。矢印はＣａ２＋濃度の増加に起因するシグナル変化の方向を示す。
図３Ｂは、種々のＣａ２＋濃度で１．７μＭにおけるλｅｘ＝３９８ｎｍの励起での蛍光発光スペクトルのＣａ２＋依存性を例示する図である。励起および発光のスリット幅はそれぞれ１および２ｎｍであった。矢印はＣａ２＋濃度の増加に起因するシグナル変化の方向を示す。
図３Ｃは、種々のＣａ２＋濃度で１．７μＭにおけるλｅｘ＝４９０ｎｍの励起での蛍光発光スペクトルのＣａ２＋依存性を例示する図である。励起および発光のスリット幅はそれぞれ１および２ｎｍであった。矢印はＣａ２＋濃度の増加に起因するシグナル変化の方向を示す。
図３Ｄは、Ｃａ２＋滴定データの正規化したＦ（３９８ｎｍ）／Ｆ（４９０ｎｍ）比の曲線適合を示すグラフである。
図４Ａは、Ｃｕ２＋（０．１μＭ）、Ｚｎ２＋（０．１ｍＭ）、Ｍｇ２＋（１０．０ｍＭ）、Ｔｂ３＋（５．０μＭ）およびＬａ３＋（５．０μＭ）の存在下でのＣａ−Ｇ１−３７のＣａ２＋応答を例示する図である。１．０ｍＭのＣａ２＋の存在下で３９８ｎｍおよび４９０ｎｍ励起でのＣａ−Ｇ１−３７の蛍光発光の比を、式（５）を使用して値を正規化するために使用した。
図４Ｂは、細胞内分子：ＡＴＰ（０．２ｍＭ）、ＡＤＰ（０．２ｍＭ）、ＧＴＰ（０．１ｍＭ）、ＧＤＰ（０．１ｍＭ）、およびＧＳＨ（１．０ｍＭ）の存在下でのＣａ−Ｇ１−３７のＣａ２＋応答を例示する図である。１．０ｍＭのＣａ２＋の存在下で３９８ｎｍおよび４９０ｎｍ励起でのＣａ−Ｇ１−３７の蛍光発光の比を、式（５）を使用して値を正規化するために使用した。
図５Ａ〜５Ｄは、Ｃａ−Ｇ１に対するＣａ２＋会合の動力学的分析を例示する図である。図５Ａ：蛍光のストップフロートレース（Ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ ｔｒａｃｅ）は、Ｃａ−Ｇ１（２０μＭの最終濃度）および指示濃度におけるＣａ２＋の急速な混合時に増加する（λｅｘ＝３９８ｎｍ）。図５Ｂ：蛍光の観察比はＣａ２＋濃度に応じて増加する。図５Ｃ：Ｃａ２＋濃度に応じて図５Ａにおいて観察された蛍光強度の振幅の最大変化。図５Ｄ：蛍光のストップフロートレースは、０．８ｍＭのＣａ２＋を予め負荷した４０μＭのＣａ−Ｇ１の急速な混合時に減少する（λｅｘ＝３９８ｎｍ）。４５５ｎｍのロングパスフィルタを使用して、５１０ｎｍにおいて主要ピークを有する発光を収集する。データをそれぞれ式６（図５Ａおよび５Ｄ）、式８（図５Ｂ）および式２（図５Ｃ）に適合させた。 図６Ａ〜６Ｄは、ＨｅＬａ細胞およびＢＨＫ−２１細胞におけるセンサーＣａ−Ｇ１−ＥＲの局在化を例示する一連のデジタル画像である。図６Ａ：Ｃａ−Ｇ１−ＥＲの局在化、図６Ｂ：ＤｓＲｅｄ２−ＥＲの局在化、図６Ｃ：ＨｅＬａ細胞におけるＣａ−Ｇ１−ＥＲおよびＤｓＲｅｄ２−ＥＲの重なり。図６Ｄ：ＢＨＫ−２１細胞におけるＣａ−Ｇ１−ＥＲの局在化。Ｃａ−Ｇ１−ＥＲおよびＤｓＲｅｄ２−ＥＲ局在化の共焦点像は、緑色チャネルについてアルゴンレーザ４８８ｎｍライン、および赤色チャネルについてＨｅ−Ｎｅレーザ５４３ｎｍラインを用いた。スケールバーは１０μｍを示す。
図６Ｅおよび６Ｆは、ＢＨＫ−２１細胞におけるセンサーＣａ−Ｇ１−ＥＲのカルシウム応答を例示する図である。図６Ｅ：異なる処理に応答するＣａ２＋応答の経時変化。図６Ｆ：ＥＲにおけるＣａ２＋濃度の疑似校正。３８５ｎｍおよび４８０ｎｍでの励起について、経時変化を５１０ｎｍにおける蛍光発光比として表した。図６Ｅおよび６Ｆの両方において、左側の縦座標は５１０ｎｍ蛍光発光比（励起３８５ｎｍおよび４８０ｎｍ）を表し、図６Ｆにおいて、右側の縦座標はＥＲにおける校正したＣａ２＋濃度を表す。
図７は、１０ｍＭのＴｒｉｓおよび１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．４）中のＥＧＦＰ−ｗｔおよびその変異体のＣＤスペクトルを例示する図である。タンパク質濃度はＣＤ実験について１０μＭであった。 図８Ａは、種々のｐＨにおけるＣａ−Ｇ１’の可視吸光度スペクトルを例示する図である。測定は、１ｍＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．０、５．５、６．０）、１０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５、７．０）および１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４、８．０、９．０）において実施した。
図８Ｂは、種々のｐＨにおけるＣａ−Ｇ１’の曲線適合を例示する図である。
図９Ａは、カルモジュリン由来のＥＦ−ハンドモチーフＩＩＩを１７２〜１７３位に挿入することによって、ＥＧＦＰ−Ｇ１（１７２ＥＦ）のコンピュータ設計によりＥＧＦＰ．Ｄ２（部位１）を付加したカルシウム結合蛍光タンパク質のモデル構造を例示する図である。クロモフォアの形成に関与する残基は強調表示している。クロモフォア周囲のＥＧＦＰの構造は１ＥＭＡ．ｐｄｂに基づいた。
図９Ｂは、修飾した移植ＥＧＦＰセンサーのモデル構造を例示する図である。１つのＥＦ−ハンドは、ＥＧＦＰ−Ｇ１を生成する、ＥＧＦＰの蛍光感受性位置に挿入した。３つの存在する負荷電残基を有するＣａ２＋結合部位を形成するために負荷電残基を導入しているベータシート表面上の部位特異的突然変異誘発。
図１０は、２００ｍＭのＩＰＴＧ誘導の２２時間後、かつ３０℃（白抜きのバー）および３７℃（黒塗りのバー）のそれぞれでの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＤＥ３におけるＥＧＦＰおよびその変異体の発現を例示するグラフである。λｅｘ＝４８８ｎｍ。 図１１は、ＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像化を例示する一連のデジタル画像である。画像化は、ＨｅＬａ細胞にＥＧＦＰ−Ｇ１、ＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ２、およびＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ３をトランスフェクトしてから２日（４８時間）後に実施した。露光時間は２００ｍｓであった。 図１２Ａは、３０℃および３７℃のそれぞれでのＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＰ−Ｄ２シリーズの発現を例示するグラフである。異なる細胞ペレットの５１０ｎｍにおける蛍光強度をタンパク質のトランスフェクションの２日後に得た。λｅｘ＝４８８ｎｍ。
図１２Ｂは、３０℃および３７℃のそれぞれでのＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＰ−Ｇ１シリーズの発現を例示するグラフである。異なる細胞ペレットの５１０ｎｍにおける蛍光強度をタンパク質のトランスフェクションの２日後に得た。λｅｘ＝４８８ｎｍ。
図１３Ａは、ＥＧＦＰ、ＥＦ−１７２、および部位１の可視吸光度スペクトルを例示する図である。タンパク質濃度は２ｍＭであった。
図１３Ｂは、ＥＧＦＰ、ＥＦ−１７２、および部位１の蛍光スペクトルを例示する図である。タンパク質濃度は２ｍＭであった。励起および発光の両方について１ｎｍのスリット幅、λｅｘ＝４８８ｎｍ。
図１４は、ＧＦＰ（ｐｄｂ １ｂ９ｃ）に基づいたカルシウム結合タンパク質を概略的に例示する図である。ＧＦＰ．Ｄ１の結合形状は球-棒で示す。Ｄ２は円として示す。野生型残基を有するＧＦＰ．Ｄ３の位置もまた示す。 図１５Ａは、大腸菌において発現されるＥＧＦＰ、ＧＦＰ．Ｄ１、ＧＦＰ．Ｄ２、ＧＦＰ．Ｄ２’およびＧＦＰ．Ｄ２’’の吸光度スペクトルを例示するグラフであり、ＧＦＰ．Ｄ１のクロモフォアが形成されなかったことが示される。
図１５Ｂは、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ．Ｄ１、ＧＦＰ．Ｄ２、ＧＦＰ．Ｄ２’およびＧＦＰ．Ｄ２’’のＵＶ ＣＤスペクトルを例示する図であり、２１６ｎｍにて負の最大を有するβ−シート二次構造の形成が示される。
図１６は、（ａ）野生型ＥＧＦＰ、（ｂ）ＧＦＰ．Ｄ１、および（ｃ）ＧＦＰ．Ｄ２を発現するＨｅＬａ細胞の倒立落射蛍光画像を例示する一連のデジタル画像である。 図１７Ａは、４８２ｎｍでの励起による大腸菌において発現されるＧＦＰ．Ｄ２についてのカルシウム誘導性クロモフォア発光変化を例示する図である。１：１結合式（式２．３）を使用するデータの適合は１０７μＭのＫｄを与える。
図１７Ｂは、５５２ｎｍでの励起によるカルシウム結合蛍光発光についてのＧＦＰ．Ｄ２とのローダミン−５Ｎの競合を例示する図である。挿入図はＣａ２＋の濃度を変化させたローダミン−５Ｎのスペクトルを示す。
図１７Ｃは、１：１結合を仮定した増加するテルビウム濃度での２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１％のグリセロール、ｐＨ６．８における３μＭのＧＦＰ．Ｄ１の蛍光変化を例示する図である。挿入図は５４５ｎｍにおけるスペクトルピークの増加を示す。
図１７Ｄは、ＧＦＰ．Ｄ１の金属競合を例示する図である。
図１８は、Ｐｂ２＋およびＣａ２＋が負荷されたＥＧＦＰ変異体Ｃ２およびＣ４の競合滴定を例示する図である。 図１９Ａは、Ｃａ２＋が負荷されたＥＧＦＰ変異体Ｃ２を用いた、過剰なＰｂ２＋の滴定を例示する図である。ＰｂがＣａに置換するとシグナル強度は減少する。 図１９Ｂは、Ｋｄを定量するためのＣ２−Ｐｂ複合体の曲線適合を例示する図である。Ｃ２−Ｐｂ２＋についてのＫｄは２μＭであり、Ｃａ２＋は４４０μＭであった。 図１９Ｃは、Ｋｄを定量するためのＥＧＦＰ／Ｐｂ２＋複合体の曲線適合を例示する図である。Ｋｄは３．５μＭであった。 図１９Ｄは、Ｋｄを定量するためのＣ２−Ｇｄ複合体の曲線適合を例示する図である。Ｇｄ３＋についてのＫｄは２．０μＭであった。 図２０Ａ〜２０Ｈは、Ｃａ２＋バイオセンサー変異体の構造を例示する図である。
図２０Ａは、球として示したクロモフォア（ＣＲＯ）を有する野生型ＥＧＦＰ（１ＥＭＡ）の切断構造（左の画像）を概略的に例示する図である。クロモフォアに近接して表面から突出している残基１４７、２０２、２０４、２２３、および２２５側鎖を突然変異させて、Ｃａ２＋結合リガンドを形成させた。クロモフォアとのプロトン相互作用に関与する、重要な残基Ｈ１４７、Ｔ２０３、およびＥ２２２は、設計したＣａ２＋結合部位付近に位置する。
図２０Ｂは、Ｃａ２＋キレート化に関与する５つの残基の空間分布を例示する図である。
図２０Ｃは、図２０Ｂに示した５つの残基の空間構成および非酸性残基を示す、ＥＧＦＰ分子におけるクロモフォアとのそれらの関係を例示する図である。
図２０Ｄ〜２０Ｈは、それぞれ、構築物Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０、ＣａｔｃｈＥＲ、およびＤ１２を例示し、それぞれ残基Ｓ１４７、Ｓ２０２、Ｑ２０４、Ｆ２２３、およびＴ２２５における置換を示す図である。
図２０Ｉ〜２０Ｌは、Ｃａ２＋バイオセンサー変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの光学特性を例示する図である。
図２０Ｉは、２８０ｎｍにおける正規化した吸光度ピークを有する、野生型ＥＧＦＰおよびＣａ２＋センサーＤ８〜Ｄ１２の吸光度スペクトルを例示する図である。Ｃａ２＋センサーＤ８〜Ｄ１２は、３９８ｎｍにおける主要な吸光度ピークおよび４９０ｎｍにおけるより低いピークを呈示した。
図２０Ｊは、Ｃａ２＋センサーＤ８〜Ｄ１２および野生型ＥＧＦＰについての３９５ｎｍおよび４８８ｎｍにおける吸光度強度比を例示する図である。導入された負荷電残基の数と共に比は増加した。
図２０Ｋは、１０μＭのＥＧＴＡ（黒／灰色のバー）または５ｍＭのＣａ２＋（赤／青色のバー）のいずれかでの５１０ｎｍ発光および４８８／３９５ｎｍ励起において記録したＣａ２＋に応答するＥＧＦＰ変異体の蛍光強度の変化を例示する図である。１０μＭのＥＧＴＡの存在下で、４８８ｎｍで励起した、５１０ｎｍにおけるＥＧＦＰ発光最大を１．０に正規化した。
図２０Ｌは、１００ｍＭのＫＣｌの存在下（四角）および不在下（円）で蛍光滴定により測定した、Ｄ９、Ｄ１０、およびＣａｔｃｈＥＲについての負荷電残基の数と、見かけのＣａ２＋解離定数（Ｋｄ）との間の相関関係を例示する図である。
図２１Ａ〜２１Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｔｃｈＥＲの光学的特徴を例示する図である。
図２１Ａは、増加させたＣａ２＋濃度に応答する発光スペクトルを示す図である。
図２１Ｂは、１００ｍＭのＫＣｌの存在または不在下での蛍光応答により、または１０ｍＭのＫＣｌの存在下（黒色）での異核単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）スペクトルにおける残基Ｙ１４３の主鎖化学シフト変化により決定したＣａｔｃｈＥＲの見かけのＫｄを示す図である。滴定の結果は１：１の結合様式に適合させた。
図２１Ｃは、１ｍＭのＣａ２＋の存在下での種々の生理学的分子：２０ｍＭのＮａ＋、１００ｍＭのＫ＋、２μＭのＣｕ２＋、２μＭのＺｎ２＋、１ｍＭのＭｇ２＋、０．２ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭのＧＴＰ、および０．１ｍＭのＧＤＰの蛍光応答を示す図である。値は他の金属の不在下で１ｍＭのＣａ２＋に正規化した。５１０ｎｍで発光最大、４８８ｎｍで励起。
図２１Ｄ〜２１Ｅは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｔｃｈＥＲの光学的特徴を例示する図である。
図２１Ｄは、３９５ｎｍの励起で記録した種々のＣａ２＋濃度における１０μＭのＣａｔｃｈＥＲを使用するストップフロー蛍光を示す図である。０ｍＭのＣａ２＋におけるＣａｔｃｈＥＲの蛍光応答をベースラインとして測定した。
図２１Ｅは、Ｃａ２＋が負荷されたＣａｔｃｈＥＲと２００μＭのＥＧＴＡとの急速な混合時に減少した蛍光を示すストップフロートレースを示す図である。５１０ｎｍで発光。
図２２Ａは、Ｃａ２＋に応答する０．３ｍＭのＣａｔｃｈＥＲの２Ｄ［１Ｈ−１５Ｎ］ＨＳＱＣスペクトルと重ねた、［Ｃａ２＋］＝０、０．５、１、２、４、および６ｍＭにおける交差ピークＹ１４３の代表的な化学シフトを示す図である。 図２２Ｂは、Ｃａ２＋滴定により誘導されたＱ６９化学シフト摂動を示す図である。微小ピークを２ｍＭのＣａ２＋を加えた後に元の単一ピークから分離し、ピークｂ対ピークａの積分の比は、Ｃａ２＋濃度が１ｍＭ〜６ｍＭに増加すると、０〜２．２７に増加した。 図２２Ｃは、骨格アミドプロトンと、Ｃａ２＋が飽和した形態とＣａ２＋を含まない形態との間の窒素とを混合する際に組み合わせた化学シフト変化を示す図である。Ｃａ２＋は、クロモフォアと相互作用するか、または設計したＣａ２＋結合部位に近接する残基に影響を与える。溶媒に非常に接近しやすいＹ１８２、およびフレキシブルなＣ末端におけるＧ２２８もまた、０．２ｐｐｍより多い化学シフトの変化を呈示した。ＥＧＦＰに係るＣａｔｃｈＥＲの二次構造を上部に標識した。すべてのデータは、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４中の３００μＭの１５Ｎ−標識試料を用いる６００ＭＨｚのＮＭＲ分光計を使用して３７℃で記録した。 図２３Ａは、ＣａｔｃｈＥＲを用いてモニターしたＣ２Ｃ１２筋芽細胞小胞体Ｃａ２＋ダイナミクスを例示する図である。細胞外Ｃａ２＋またはＥＧＴＡを有さないインタクトな筋芽細胞に対する２つの代表的な蛍光応答を、リンゲル緩衝液洗い出しにより２回分離して１００μＭのＡＴＰ（ｐＨ７．０）により引き起こした。
図２３Ｂは、３分間、細胞内緩衝液中の２５μＭのジギトニンで透過処理し、続いてＩＰ３、細胞内緩衝液洗い出し、タプシガルギン、ＩＰ３（矢印）、洗い出し（三角）、およびイオノマイシン（矢印）で処理した場合の図２３Ａと同じ細胞のバッチを例示する図である。
図２３Ｃは、ＣａｔｃｈＥＲおよびｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲを共発現するＣ２Ｃ１２の代表的な蛍光画像を例示する図である。 図２３Ｄは、４−クロロ−ｍ−クレゾール（４−ＣｍＣ）適用に対するＣａｔｃｈＥＲ（上部）およびｍＣｈｅｒｒｙ−ＥＲ（下部）の蛍光応答を例示する図である。図２３Ｃにおける対応する画像の時点を示す。
図２３Ｅは、タプシガルギンの不在下および存在下で４−ＣｍＣにより引き起こされたＣａ２＋放出を例示する図である。
図２４は、Ｆｕｒａ−２により検出した４−ＣｍＣにより引き起こされた細胞質Ｃａ２＋変化を例示する図である。 図２５Ａ〜２５Ｆは、Ｃａ２＋に応答する精製した細菌で発現されたＥＧＦＰに基づいたセンサーのＵＶ吸光度変化を例示する図であり、センサーダイナミックレンジの調節を実証する。
図２５Ａは、１０μＭのＥＧＴＡ（実線）または５ｍＭのＣａ２＋（破線）の存在下で２２０ｎｍ〜６００ｎｍのＥＧＦＰの重ねた吸光度スペクトルを例示する図である。
図２５Ｂ〜２５Ｆは、１０μＭのＥＧＴＡ（実線）または５ｍＭのＣａ２＋（破線）の存在下でＥＧＦＰに基づいたセンサーＤ８、Ｄ９、Ｄ１０、ＣａｔｃｈＥＲ、およびＤ１２の２２０ｎｍ〜６００ｎｍの吸光度スペクトルを例示する図である。Ｃａ２＋に応答するＤ９、Ｄ１０、およびＣａｔｃｈＥＲ（Ｃ〜Ｅ）について、４８８ｎｍにおける吸光度最大は増加し、３９５ｎｍは減少した。
図２５Ｇ〜２５Ｌは、Ｃａ２＋に応答する精製した細菌で発現されたＥＧＦＰに基づいたセンサーの蛍光度変化を例示する図であり、センサーダイナミックレンジの調節を実証する。
図２５Ｇは、１０μＭのＥＧＴＡ（実線）または５ｍＭのＣａ２＋（破線）の存在下で蛍光光度計により測定したＥＧＦＰの５００ｎｍ〜６００ｎｍの重ねた蛍光発光スペクトルを例示する図である。上部における２つの重ねた発光スペクトルは４８８ｎｍおよび２つで励起するか、または３９５ｎｍ（下部）で励起した。
図２５Ｈ〜２５Ｌは、ＥＧＦＰに基づいたセンサーＤ８、Ｄ９、Ｄ１０、ＣａｔｃｈＥＲおよびＤ１２のそれぞれの蛍光発光スペクトルを例示する図である。
図２５Ｍ〜２５Ｎは、Ｃａ２＋に応答する精製した細菌で発現されたＥＧＦＰに基づいたセンサーの蛍光およびＵＶ吸光度変化を例示する図であり、センサーダイナミックレンジの調節を実証する。
図２５Ｍは、ＥＧＦＰおよびＣａ２＋に応答する設計した変異体の４８８ｎｍ（黒色のバー）および３９５ｎｍ（灰色のバー）で励起した５１０ｎｍにおける蛍光発光変化の振幅の比較を示すグラフである。振幅変化は、（ＦＨｏｌｏ／ＦＡｐｏ−１）で表され、ＦＨｏｌｏおよびＦＡｐｏはそれぞれ５ｍＭのＣａ２＋および１０μＭのＥＧＴＡの存在下での吸光度強度を表す。Ｄ９、Ｄ１０、ＣａｔｃｈＥＲおよびＤ１２の４８８ｎｍおよび３９５ｎｍのいずれかで励起した５１０ｎｍにおける非レシオメトリック蛍光変化をバーの正の値で提示する。
図２５Ｎは、Ｃａ２＋に応答するＥＧＦＰおよびその変異体の４８８ｎｍ（黒色のバー）および３９５ｎｍ（灰色のバー）における吸光度変化の振幅の比較を示すグラフである。振幅変化は（ＡＨｏｌｏ／ＡＡｐｏ−１）で表され、ＡＨｏｌｏおよびＡＡｐｏはそれぞれ５ｍＭのＣａ２＋および１０μＭのＥＧＴＡの存在下での吸光度強度を表す。Ｃａ２＋に応答するＤ９、Ｄ１０およびＣａｔｃｈＥＲの４８８ｎｍおよび３９５ｎｍにおけるレシオメトリック吸光度変化をそれぞれ、バーの正および負の値で提示する。すべての変異体の２８０ｎｍにおける吸光度は１に正規化した。
図２６は、蛍光強度のｐＨ依存性に基づいた見かけのｐＫａ値を測定することにより決定した場合のＣａ２＋に結合する前後のＣａｔｃｈＥＲのｐＨ安定性を例示する図であり、ＣａｔｃｈＥＲとＣａ２＋との間の化学量論的相互作用はＪｏｂのプロットにより決定される。
図２６Ａは、５１０ｎｍにおける蛍光発光強度が、対応するｐＨ値にて４８８ｎｍにおける励起で１０μＭのＥＧＴＡ（円）または４ｍＭのＣａ２＋（四角）の存在下で記録されたことを示す図である。見かけのｐＫａは７．５９±０．０３（ＥＧＴＡ）および６．９１±０．０３（Ｃａ２＋）であった。
図２６Ｂは、３９５ｎｍで励起された５１０ｎｍにおける蛍光発光強度のｐＨ依存性を示す図である。見かけのｐＫａは７．１４±０．０２（ＥＧＴＡ）および６．９５±０．０６（Ｃａ２＋）であった。
図２６Ｃは、ＣａｔｃｈＥＲの濃度に応じて蛍光（Ｆ４８８、Ｆ３９５）および吸光度（Ａ４８８）により決定した場合のＣａ２＋が結合したＣａｔｃｈＥＲの相対量のＪｏｂのプロットである。 図２６Ｄは、図２６ＣのＪｏｂプロットの数値結果を示す図である。 図２６Ｅは、４８８ｎｍで励起した、［Ｃａ２＋］（μＭ）＝１１．３、１６．７、２０．６、２４．９、２８．４（破線）に応答して、μＭで２８．７、２３．３、１９．４、１５．１および１１．６（実線）のＣａｔｃｈＥＲの濃度での蛍光スペクトルを示す図である。
図２６Ｆは、３９５ｎｍで励起した、［Ｃａ２＋］（μｍ）＝１１．３、１６．７、２０．６、２４．９、２８．４（破線）に応答して、μＭで２８．７、２３．３、１９．４、１５．１および１１．６（実線）のＣａｔｃｈＥＲの濃度での蛍光スペクトルを示す図である。
図２６Ｇは、Ｃａ２＋の不在下（実線）または存在下（破線）での対応する吸光度変化を示す図である。
図２７Ａおよび２７Ｂは、平衡透析および誘導結合プラズマ発光分析（ＩＣＰ−ＯＥＳ）によるＣａｔｃｈＥＲによるＣａ２＋結合を例示する図である。
図２７Ａは、３７０．６０２ｎｍにおける最大強度で、ミオグロビン、ＥＧＦＰ、ＣａｔｃｈＥＲおよびα−ラクトアルブミンの試料をそれぞれ有する透析管（緩衝液）の外側および透析管の内側の全Ｃａ２＋濃度（結合および未結合）を決定するための、ＩＣＰ−ＯＥＳ（誘導結合プラズマ発光分析）の代表的なスペクトルを示す図である。各スペクトルはエラーバーを有する３回の反復の平均であり、各試料のピーク強度の振幅はＣａ２＋の濃度を表す。
図２７Ｂは、ＩＣＰ−ＯＥＳにより決定した各試料のＣａ２＋濃度の比較を示す図である。３９６．８４７、３７３．６９０、２１９．７７９、３７０．６０２、３１７．９３３、６４３．９０７および２２０．８６１ｎｍにおいて記録したピーク強度をそれぞれ、各波長における予め決定したＣａ２＋標準線形曲線により校正したＣａ２＋濃度に変換した。透析管の外側の緩衝液のＣａ２＋濃度は、６０．４±０．７μＭ（未結合）であり、ミオグロビン、ＥＧＦＰ、ＣａｔｃｈＥＲおよびα−ラクトアルブミンを含有する内側（結合および未結合の両方）はそれぞれ、６１．５±１．２、６４．５±１．１、７４．６±１．５および７９．１±１．７μＭ（結合および未結合の両方）であった。
図２８Ａ〜２８Ｃは、高磁場核磁気共鳴分光計を用いて測定した回転相関時間τｃによるＣａｔｃｈＥＲの単量体化を例示する図である。
図２８Ａは、８００ＭＨｚのＮＭＲ分光計で実施したＳＣＴ−ＣＣＲ実験により直接決定した（灰色の四角）、または６００ＭＨｚのＮＭＲ分光計で決定した緩和時間Ｔ１、Ｔ２で式（１６）および（１７）を使用して算出した（黒色の円）τｃを示す図である。対応する残基の二次構造は上部に特徴付けられている。
図２８Ｂは、０、３０、６０、１００、２４０、４８０、７２０、１０００および１５００ｍｓのＴ１遅延で収集したピーク積分の代表的な適合を示す図である。
図２８Ｃは、選択領域：０ｍｓおよび１５００ｍｓからのＴ１遅延スペクトルの重なりを示す図である。
図２９Ａ〜２９Ｂは、ＣａｔｃｈＥＲ ＮＭＲ割り当ておよび設計したＣａ２＋結合部位の反対側のクロモフォアと相互作用する残基に対するＣａ２＋の影響を例示する図である。
図２９Ａは、赤色の線により示した連続したおよび残基内（ｉｎｔｒａｒｅｓｉｄｕａｌ）Ｃα−Ｃα結合を有するＩ１４からＥ１７の選択したＣａｔｃｈＥＲ ３Ｄ ＨＮＣＡスペクトルを示す図である。
図２９Ｂは、ＣａｔｃｈＥＲ ２Ｄ｛１Ｈ−１５Ｎ｝ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。
図２９Ｃは、ＣａｔｃｈＥＲ ＮＭＲ割り当ておよび設計したＣａ２＋結合部位の反対側のクロモフォアと相互作用する残基に対するＣａ２＋の影響を例示する図であって、Ｃα化学シフトを示す図である。１．５ｐ．ｐ．ｍ．より高い化学シフト相違を呈示する大部分の標識した残基は、クロモフォアまたは設計したＣａ２＋結合部位に連続して近接していた。番号１〜５はそれぞれＥ１４７、Ｄ２０２、Ｅ２０４、Ｅ２２３およびＥ２２５を表す。すべてのデータは、低温プローブおよび１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４中の３００ｍＭの１３Ｃ−１５Ｎ二重標識試料を用いる８００ＭＨｚのＮＭＲ分光計を使用して３７℃で記録した。 図２９Ｄ〜２９Ｈは、ＣａｔｃｈＥＲ ＮＭＲ割り当ておよび設計したＣａ２＋結合部位の反対側のクロモフォアと相互作用する残基に対するＣａ２＋の影響を例示する図である。
図２９Ｄ〜２９Ｇは、０ｍＭのＣａ２＋（黒色）および６ｍＭのＣａ２＋（赤色）で記録したＣａｔｃｈＥＲ ２Ｄ｛１Ｈ−１５Ｎ｝ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。化学シフト変化が６ｍＭのＣａ２＋でＱ９４について観察されたが、Ｒ９６、Ｆ１６５またはＶ６１については、変化はなかった。
図２９Ｈは、設計したＣａ２＋結合部位の反対側のクロモフォアに対して突出するＲ９６、Ｑ９４、Ｆ１６５およびＶ６１の側鎖を示す図である。データは、１０ｍＭのＴｒｉｓおよび１０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４中の３００μＭの１５Ｎ標識試料を用いる６００ＭＨｚのＮＭＲ分光計を使用して３７℃で記録した。
図３０Ａ〜３０Ｂは、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣ２Ｃ１２細胞のＥＲならびにＦＤＢ繊維のＳＲにおいて発現されたＣａｔｃｈＥＲの局在化を例示する図である。
図３０Ａは、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＣａｔｃｈＥＲおよびＤｓＲｅｄ２−ＥＲの共局在化を示す図である。ＣａｔｃｈＥＲおよびＤｓＲｅｄ２−ＥＲを共焦点顕微鏡画像化のために２つの細胞系統において一過性に共トランスフェクトし、発現させた。重なっている画像は、ＥＲ−トラッカーＤｓＲｅｄ２−ＥＲに対応するＣａｔｃｈＥＲの共局在化を示す。
図３０Ｂは、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＣａｔｃｈＥＲおよびＤｓＲｅｄ２−ＥＲの共局在化を示す図である。ＣａｔｃｈＥＲおよびＤｓＲｅｄ２−ＥＲを共焦点顕微鏡画像化のために２つの細胞系統において一過性に共トランスフェクトし、発現させた。重なっている画像は、ＥＲ−トラッカーＤｓＲｅｄ２−ＥＲに対応するＣａｔｃｈＥＲの共局在化を示す。
図３１は、ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３細胞のＫｄおよび小胞体Ｃａ２＋ダイナミクスのｉｎ ｓｉｔｕ決定を例示する図である。
図３１Ａは、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞のＥＲにおけるＫｄのｉｎ ｓｉｔｕ決定を示す図である。１〜５はそれぞれ、１、３、１０および２０ｍＭのＣａ２＋ならびに３ｍＭのＥＧＴＡに対応する。
図３１Ｂは、ＢＨＫ細胞におけるＫｄの決定を示す図である。１〜７は、０．０５、０．１、０．５、１、５および１０ｍＭのＣａ２＋ならびに２００μＭのＥＧＴＡを表す。４８８ｎｍで励起した種々の細胞外Ｃａ２＋濃度による平衡後のトランスフェクトした透過性細胞のＣａｔｃｈＥＲ蛍光シグナル。
図３１Ｃは、１：１結合様式を用いたＫｄの算出を示す図である。
図３１Ｄは、ＡＴＰにより誘発されたＨｅＬａ細胞におけるＣａｔｃｈＥＲにより検出した代表的なＥＲ Ｃａ２＋シグナル伝達を示す図である。
図３１Ｅは、ヒスタミンにより誘発されたＨｅＬａ細胞におけるＣａｔｃｈＥＲにより検出した代表的なＥＲ Ｃａ２＋シグナル伝達を示す図である。
図３１Ｆは、ＣＰＡにより誘発されたＨｅＬａ細胞におけるＣａｔｃｈＥＲにより検出した代表的なＥＲ Ｃａ２＋シグナル伝達を示す図である。
図３１Ｇは、ＡＴＰにより誘発されたＨｅＬａ細胞におけるＣａｔｃｈＥＲにより検出した代表的なＥＲ Ｃａ２＋シグナル伝達を示す図である。
図３１Ｈは、ＨＥＫ２９３細胞において５０μＭのヒスタミンにより誘発された可逆的Ｃａ２＋放出を示す図である。
図３１Ｉは、１ｍＭの細胞外Ｃａ２＋の存在下で２μＭのタプシガルギンにより誘導されたＨＥＫ２９３細胞における不可逆的ＥＲ Ｃａ２＋放出の定量を示す図である。ＦｍｉｎおよびＦｍａｘはそれぞれ、５μＭのイオノマイシン（ｎ＝６）の存在下で、インタクトな細胞に５ｍＭのＥＧＴＡおよび５０ｍＭのＣａ２＋を加えることにより決定した。
図３２は、ＣａｔｃｈＥＲの温度依存性ＮＭＲ ＨＳＱＣスペクトル変化を示す図である。 図３３は、Ｃａ２＋により誘発されたＣａｔｃｈＥＲの化学シフト変化の１Ｄ ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図３４は、Ａｐｏ＿ＣａｔｃｈＥＲおよびＣａ２＋が負荷されたＣａｔｃｈＥＲのクロモフォアコンフォメーション変化のＸ線結晶構造、および相関した吸収スペクトルを例示する図である（赤色は薄い灰色であり、青色は暗い灰色であり、緑色は中間の灰色であり、シアンは薄い灰色である）。 図３５は、Ａｐｏ＿ＣａｔｃｈＥＲ、Ｃａ２＋が負荷されたＣａｔｃｈＥＲ、およびＧｄ３＋が負荷されたＣａｔｃｈＥＲのクロモフォアのコンフォメーション変化のＸ線結晶構造を例示する図である（シアンは薄い灰色であり、紫色は暗い灰色であり、緑色は中間の灰色である）。
図面は以下の説明および実施例にさらに詳細に記載されている。
本開示の方法およびシステムの一部の例示的な実施形態の詳細は以下の説明に明記されている。その開示の他の特徴、目的、および利点は、以下の説明、図面、実施例および特許請求の範囲を検討することにより当業者に明らかになるであろう。すべてのこのような追加の系、方法、特徴、および利点は、本明細書の範囲内に含まれ、本開示の範囲内であり、添付の特許請求の範囲により保護されることが意図される。
（詳細な説明）
本開示のより詳細な説明の前に、本開示は記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって、当然、変更され得ることが理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的なものではないことも理解される。
値の範囲が提供される場合、文脈により明確に別段の規定がなされない限り下限の単位の１０分の１までの間に入る値のそれぞれ、その範囲の上限と下限の間およびその明示された範囲内の任意の他の明示されたまたは間に入る値が本開示に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限と下限は、それぞれ独立に、より小さな範囲内に含まれ、本開示にも包含され、明示された範囲の任意の具体的に排除される限界にさらされる。明示された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれか、またはその両方を除く範囲も本開示に包含される。
別段の定義のない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料も本開示の実施または試験において使用することができ、好ましい方法および材料がここに記載されている。
本明細書において引用されている刊行物および特許はすべて、個々の刊行物または特許が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたかのように参照により本明細書に組み込まれ、引用された刊行物に関連して方法および／または材料を開示し、説明するために参照により本明細書に組み込まれる。いずれの刊行物の引用も出願日より前のその開示に対するものであり、本開示が、先行する開示に基づいてそのような刊行物に先行する権限がないと容認するものであると解釈されるべきではない。さらに、提供されている刊行物の日付は実際の刊行物の日付とは異なる可能性があり、それぞれ独立に確認する必要があり得る。
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本明細書に記載され、例示されている個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲または主旨から逸脱することなく、任意の他のいくつかの実施形態の特徴と容易に切り離すこと、またはそれと組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。列挙された方法はいずれも、列挙された事象の順序で、または論理的に可能性のある任意の他の順序で行うことができる。
本開示の実施形態は、別段の指定のない限り、医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学などの技法を用い、これらは当技術分野の技術の範囲内である。そのような技法は、文献において十分に説明されている。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって、例えば、「支持体（ａ ｓｕｐｐｏｒｔ）」への言及は、複数の支持体を包含する。本明細書およびそれに続く特許請求の範囲において、反対の意図が明らかでない限り、以下の意味を有すると定義されるいくつもの用語を参照する。
本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定のない限り、それらに帰する意味を有する。本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法におけるそれらに帰する意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」などは、本開示に包含される方法および組成物に適用する場合、本明細書に開示されているような組成物を指すが、追加的な構造群、組成物成分または方法のステップ（または上記の、その類似体もしくは誘導体）を含有してよい。しかし、そのような追加的な構造群、組成物成分または方法のステップなどは、対応する本明細書に開示されている組成物または方法と比較して、組成物または方法の基本的な新規の特性（複数可）には実質的に影響を及ぼさない。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」などは、本開示に包含される方法および組成物に適用される場合、米国特許法におけるそれらに帰する意味を有し、この用語はオープンエンド形式であり、列挙されているもの以上のものが存在することにより列挙されているものの基本的または新規の特性が変化しない限りは、列挙されている以上のものが存在することが許容されるが、先行技術の実施形態は排除される。
（定義）
本発明の説明および特許請求の範囲では、以下の用語法が下記の定義に従って使用される。
さらなる定義は以下の文脈で提供される。特に定義されていなければ、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、分子生物学の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料が本明細書に記載されている。
特に定義されていなければ、本明細書において使用される技術分野の用語、表示法および他の科学的な用語法はすべて、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味を有するものとする。いくつかの場合には、一般に理解される意味を有する用語は、明瞭さおよび／または即時参照のために本明細書で定義されており、そのような定義を本明細書に包含することは、当技術分野において一般に理解されているものとの必ずしも実質的な差異を示すと解釈されるべきではない。本明細書において説明または参照されている技法および手順は、一般に、十分に理解されており、一般に、当業者により慣習的な方法体系、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．２００１）に記載の広範に利用されている分子クローニング方法体系などを使用して用いられる。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順は、一般に、特に断りのない限り、製造者により規定されたプロトコールおよび／またはパラメータに従って行う。
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、タンパク質およびその断片を指す。ポリペプチドはアミノ酸残基配列として本明細書に開示されている。これらの配列は、左から右にアミノ末端からカルボキシ末端の方向で記載されている。標準の命名法に従って、アミノ酸残基配列は以下に示されている通り３文字または１文字のコードのいずれかにより命名されている：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｌｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは異なるが、基本的な性質を保持するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の、参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般に、差異は限定されており、その結果、参照ポリペプチドおよび変異体の配列が全体的に極めて類似し（相同である）、多くの領域において同一である。変異体および参照ポリペプチドは、アミノ酸配列が１つまたは複数の修飾（例えば、置換、付加、および／または欠失）により異なってよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされているものであってもなくてもよい。ポリペプチドの変異体は、対立遺伝子の変異体などの天然に存在するものであってよく、または、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。
本開示のポリペプチドの構造に修飾および変化をもたらすことができ、依然としてポリペプチドと同様の特性を有する分子がもたらされる（例えば、保存されたアミノ酸置換）。例えば、特定のアミノ酸を、活性の認識できるほどの損失を伴わずに配列内の他のアミノ酸と置換することができる。これは、ポリペプチドの生物学的機能活性を規定するポリペプチドの相互作用的な能力および本質であるので、ポリペプチド配列内で特定のアミノ酸配列の置換をもたらすことができ、それにもかかわらず、同様の性質を有するポリペプチドが得られる。
そのような変化をもたらすことにおいて、アミノ酸の疎水性親水性指標を考えることができる。ポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を付与することにおけるアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当技術分野において一般に理解されている。特定のアミノ酸を、同様の疎水性親水性指標またはスコアを有し、依然として同様の生物活性を有するポリペプチドをもたらす他のアミノ酸と置換することができることが知られている。各アミノ酸にはその疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。これらの指標は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２.８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）、アルギニン（−４．５）である。
アミノ酸の相対的な疎水性親水性特性により、得られるポリペプチドの二次構造が決定され、今度はそれにより、ポリペプチドと他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、抗体、抗原などとの相互作用が規定されると考えられている。アミノ酸を、同様の疎水性親水性指標を有する別のアミノ酸で置換することができ、依然として機能的に等価のポリペプチドが得られることが、当技術分野で知られている。そのような変化では、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の疎水性親水性指標が特に好ましく、さらには±０．５以内の疎水性親水性指標が特に好ましい。
同様のアミノ酸の置換は、特に、それにより創出される生物学的に機能的等価であるポリペプチドまたはペプチドを免疫学的実施形態において使用することが意図されている場合、親水性に基づいて行うこともできる。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０ ±１）；グルタミン酸（＋３．０ ±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５ ±１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を同様の親水性値を有する別のアミノ酸と置換することができ、依然として生物学的に等価、詳細には、免疫学的に等価のポリペプチドが得られることが理解される。そのような変化では、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１である親水性値が特に好ましく、さらには±０．５である親水性値が特に好ましい。
上に概説されている通り、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対的な類似性に基づく。前述の特性のうちの１つまたは複数を考察に入れた例示的な置換は当業者にはよく知られており、それらとしては、（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、および（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）（元の残基：例示的な置換）が挙げられるが、それだけに限られない。したがって、本開示の実施形態は、上記のポリペプチドの機能的または生物学的等価物を意図している。詳細には、ポリペプチドの実施形態は、対象のポリペプチドに対して約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および９５％の配列同一性を有する変異体を含んでよい。
本明細書で使用される「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される２つ以上のポリペプチド配列間の関係を指す。当技術分野では、「同一性」とは、そのような配列の一続き間の一致によって決定されるポリペプチド間の配列関連性の程度も指す。「同一性」および「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．、およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３、（１９８８）に記載のもの（それだけに限られない）を含めた既知の方法によって容易に算出することができる。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最も大きな一致がもたらされるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の％同一性は、ＮｅｅｄｅｌｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３〜４５３、１９７０）アルゴリズム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ、およびＸＢＬＡＳＴ）を組み入れた解析ソフトウェア（すなわち、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することによって決定することができる。初期状態のパラメータを使用して本発明のポリペプチドの同一性を決定する。
例として、ポリペプチド配列は参照配列と同一であってよく、それは１００％同一であってよく、または、参照配列と比較して、１００％未満の％同一性になるようなある特定の整数までのアミノ酸の変更を含んでよい。そのような変更は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換（保存された置換および保存されていない置換を含む）、または挿入から選択され、前記変更は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端位またはカルボキシ末端位において、またはこれらの末端位の間のどこにおいても、参照配列内のアミノ酸の間に個別に分散して、または参照配列内の１つまたは複数の連続した群に分散して起こり得る。所与の％同一性に対するアミノ酸の変更の数は、参照ポリペプチド内のアミノ酸の総数にそれぞれの％同一性の数値パーセントを掛け（１００で割り）、次いでその積を前記参照ポリペプチド内のアミノ酸の総数から引くことによって決定する。
保存されたアミノ酸変異体は、天然に存在しないアミノ酸残基も含んでよい。天然に存在しないアミノ酸としては、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチル−グリシン、アロトレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシ−エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトロ−グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−メチルプロリンおよび４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニル−アラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、ならびに４−フルオロフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み入れるためのいくつかの方法が当技術分野で知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用してナンセンス突然変異を抑制する場合にｉｎ ｖｉｔｒｏ系を使用することができる。アミノ酸を合成するための方法およびｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当技術分野で知られている。ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は、大腸菌Ｓ３０抽出物ならびに市販の酵素および他の試薬を含む無細胞系において行う。タンパク質はクロマトグラフィーによって精製する。（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２７２２；Ｅｌｌｍａｎら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１；Ｃｈｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２５９：８０６〜８０９、Ｃｈｕｎｇら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０１４５〜１０１４９）。第２の方法では、アフリカツメガエルの卵母細胞において、突然変異したｍＲＮＡおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションにより翻訳を行う（Ｔｕｒｃａｔｔｉら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９９９１〜１９９９８）。第３の方法の中では、大腸菌細胞を、交換される天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下、かつ所望の天然に存在しないアミノ酸（複数可）（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、または４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。天然に存在しないアミノ酸がその天然の対応物の代わりにタンパク質に組み込まれる。（Ｋｏｉｄｅら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：７４７０〜７４７６）。天然に存在するアミノ酸残基は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学的な修飾によって天然に生じない種に変換することができる。化学的な修飾を部位特異的突然変異誘発と組み合わせて、置換の範囲をさらに拡大することができる（Ｗｙｎｎら、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２：３９５〜４０３）。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい。したがって、例えば、ポリヌクレオチドとは、本明細書で使用される場合、とりわけ、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより一般には二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子を指す。「核酸」、「核酸配列」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、上記で定義されたポリヌクレオチドも包含する。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドという用語は、１つまたは複数の修飾塩基を含有する上記のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。したがって、安定性のためまたは他の理由で骨格が修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書において意図される「ポリヌクレオチド」である。さらに、例を２つだけ挙げると、イノシンなどの普通ではない塩基、またはトリチル化された塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドである。
当業者に既知の、多くの有用な目的に役立つ多種多様の修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われていることが理解されよう。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、そのような化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに、とりわけ単純な細胞および複雑な細胞を含めたウイルスおよび細胞に特徴的な化学的な形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
例として、本開示のポリヌクレオチド配列は、参照配列と同一であってよく、それは１００％同一であってよく、または、参照配列と比較してある特定の整数までのヌクレオチドの変更を含んでよい。そのような変更は、塩基転位および塩基転換、または挿入を含めた少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換を含む群から選択され、前記変更は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位または３’末端位において、またはそれらの末端位の間のどこにおいてでも、参照配列内のヌクレオチドの中で個別に分散して、または参照配列内の１つまたは複数の連続した群に分散して起こり得る。ヌクレオチドの変更の数は、参照ヌクレオチド内のヌクレオチドの総数にそれぞれのパーセント同一性の数値パーセントを掛け（１００で割り）、その積を前記参照ヌクレオチド内のヌクレオチドの総数から引くことによって決定する。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変更により、そのような変更に従ってポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが変更され得る。
本明細書で使用される場合、ＤＮＡは任意の方法によって得ることができる。例えば、ＤＮＡとは、ｍＲＮＡから調製された相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製されたＤＮＡ、化学合成によって調製されたＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ増幅によって得られたＤＮＡ、およびこれらの方法を適切に組み合わせることによって構築されたＤＮＡを包含する。
ｃＤＮＡは、タンパク質をコードするｍＲＮＡから、例えば、下記の方法によってクローニングすることができる。
まず、タンパク質を発現および産生している上記の組織または細胞から、タンパク質をコードするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡは、グアニジン−チオシアン酸法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８：５２９４、１９７９）、ホットフェノール法、またはＡＧＰＣ法などの既知の方法によって全ＲＮＡを単離し、それをオリゴ−ｄＴセルロースまたはポリＵセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーに供することにより調製することができる。
次いで、鋳型として得られるｍＲＮＡを用いて、例えば、逆転写酵素を用いるよく知られた方法、例えば、Ｏｋａｙａｍａら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１（１９８２）；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３））の方法またはＨｏｆｆｍａｎら（Ｇｅｎｅ ２５：２６３（１９８３））の方法などによってｃＤＮＡを合成し、二本鎖ｃＤＮＡに変換する。ｃＤＮＡライブラリーを、このｃＤＮＡを有するプラスミドベクター、ファージベクター、またはコスミドベクターを用いて大腸菌を形質転換することによって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏパッキング後に大腸菌をトランスフェクトすることによって調製する。
本明細書で使用される場合、「単離された核酸」は、構造が、天然に存在する核酸のいずれとも、または４つ以上の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の断片のいずれとも同一ではない核酸である。したがって、この用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、それが天然に存在する生物体のゲノム内の分子の一部と隣接するコード配列のどちらとも隣接しないＤＮＡ；（ｂ）生じる分子が天然に存在するベクターまたはゲノムＤＮＡのいずれとも同一ではないようにベクターまたは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み入れられた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノムの断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製される断片、または制限断片などの別々の分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列を包含する。ランダムな、特徴付けられていない異なるＤＮＡ分子の混合物、トランスフェクトされた細胞、または細胞クローン、例えば、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーなどのＤＮＡライブラリーにおいて見いだされるものに存在する核酸は、この定義から具体的に排除される。
「実質的に純粋な」という用語は、本明細書で所与のポリペプチドに関して使用される場合、ポリペプチドが他の生物学的な巨大分子を実質的に含まないことを意味する。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％純粋である。純度は、当技術分野で既知の任意の適切な標準方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
本明細書において使用されるプラスミドベクターは、宿主において複製され、維持される限りは限定されない。宿主において複製され得る任意のファージベクターも使用することができる。一般に使用されるクローニングベクターの例は、ｐＵＣ１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１などである。ベクターを下記の免疫学的スクリーニングに適用する場合、宿主において所望のタンパク質をコードする遺伝子を発現させることができるプロモーターを有するベクターを使用することが好ましい。
ｃＤＮＡは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１．５３頁、１９８９）の方法によってプラスミドに挿入することができる。ｃＤＮＡは、例えば、Ｈｙｕｎｈら（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、１、４９頁（１９８５））の方法によってファージベクターに挿入することができる。これらの方法は、市販のクローニングキット（例えば、Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏの製品）を使用することによって簡単に実施することができる。これにより得られる組換えプラスミドまたはファージベクターを原核生物（例えば、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＭＣ１０６１／Ｐ３など）などの適切な宿主細胞に導入する。
プラスミドを宿主に導入するための方法の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１．７４頁（１９８９））に記載の塩化カルシウム法、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リポソーム（ｌｉｐｉｄｓｏｍｅ）法、および電気穿孔法である。ファージベクターは、例えば、ファージＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング後に成長した宿主に導入する方法によって宿主細胞に導入することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングは、市販のｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングキット（例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅまたはＡｍｅｒｓｈａｍの製品）を用いて容易に実施することができる。
本明細書に開示されているサイトカイン様ＡＩＤタンパク質の刺激に応じてその発現が増大したタンパク質をコードするｃＤＮＡの同定は、例えば、２つのｃＤＮＡライブラリー、すなわち、刺激された細胞に由来するｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリー（テスターｃＤＮＡライブラリー）および刺激されていない細胞に由来するｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリー（ドライバーｃＤＮＡライブラリー）を用いた、抑制ＰＣＲ作用（（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：１０８７〜１０８８）を利用するサプレッションサブトラクトハイブリダイゼーション（ｓｕｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＳＨ）（（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：６０２５〜６０３０；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）２４０：９０〜９７）によって行うことができる。
本開示の実施形態は、本発明で使用されるタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターに関する。本明細書に開示されている組換えベクターとして、原核宿主細胞および／または真核宿主細胞のそれぞれにおいて複製または自己増殖を保持することができる限りは、プラスミドベクターおよびファージベクターを含めた任意のベクターを使用することができる。組換えベクターは、タンパク質をコードするＤＮＡを、当技術分野において利用可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡおよびバクテリオファージＤＮＡ）と、通常の方法によってライゲーションすることによって、容易に調製することができる。
使用される組換え用ベクターの具体例は、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、およびｐＵＣ１９などの大腸菌由来のプラスミド、ｐＳＨ１９およびｐＳＨ１５などの酵母由来のプラスミド、ならびにｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、およびｐＣ１９４などのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のプラスミドである。ファージの例は、ラムダファージなどのバクテリオファージ、ならびにレトロウイルス、ワクシニアウイルス、および核多角体病ウイルスなどの動物ウイルスまたは昆虫ウイルス（ｐＶＬ１３９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
「発現ベクター」は、本発明で使用されるタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるために、およびタンパク質を産生させるために、有用である。発現ベクターは、タンパク質をコードする遺伝子を種々の原核宿主細胞および／または真核宿主細胞において発現させ、このタンパク質を産生させる限りは限定されない。その例はｐＭＡＬ Ｃ２、ｐＥＦ−ＢＯＳ（（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５３２２など）、ｐＭＥ１８Ｓ ｐＣＤＮＡ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（１９９２））などである。
細菌、特に大腸菌を宿主細胞として使用する場合、発現ベクターは、一般には、少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、タンパク質をコードするＤＮＡ、終結コドン、ターミネーター領域、およびレプリコンを含む。
酵母、動物細胞、または昆虫細胞を宿主として使用する場合、発現ベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、タンパク質をコードするＤＮＡおよび終結コドンで構成されることが好ましい。発現ベクターは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、タンパク質をコードする遺伝子の５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、スプライシングジャンクション、ポリアデニル化部位、選択マーカー領域、およびレプリコンも含んでよい。発現ベクターは、必要であれば、通常使用される遺伝子増幅のための遺伝子（マーカー）も含有してよい。ＤＮＡプラスミドを哺乳動物細胞に直接導入してタンパク質を発現させることもできる。
細菌においてタンパク質を発現させるためのプロモーター／オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター、およびシャインダルガーノ（ＳＤ）配列（例えば、ＡＡＧＧ）を含む。例えば、宿主が大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）である場合、プロモーター／オペレーター領域は、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどを含むことが好ましい。酵母においてタンパク質を発現させるためのプロモーターの例は、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどである。宿主がバチルス属（Ｂｃｉｌｌｕｓ）の場合、プロモーターの例はＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどである。宿主が哺乳動物細胞などの真核細胞である場合、プロモーターの例は、ＳＶ４０由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター、熱ショックプロモーターなどであり、ＳＶ−４０由来プロモーターおよびレトロウイルス由来プロモーターであることが好ましい。当然のことながら、プロモーターは上記の例に限定されない。さらに、エンハンサーを使用することが発現させるために有効である。
好ましい開始コドンは、例えば、メチオニンコドン（ＡＴＧ）である。
一般に使用される終結コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡ）が終結コドンとして例示されている。通常使用される天然または合成のターミネーターがターミネーター領域として使用される。
「レプリコン」とは、宿主細胞において全ＤＮＡ配列を複製することができるＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に改変されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡ断片）、合成のプラスミドなどを包含する。好ましいプラスミドの例は、大腸菌に対してはｐＢＲ３２２またはその人工的な誘導体（ｐＢＲ３２２またはｐＲＳＥＴを適切な制限酵素で処理することによって得られるＤＮＡ断片）であり、酵母に対しては、酵母２μプラスミドまたは酵母染色体ＤＮＡであり、哺乳動物細胞に対しては、ｐＲＳＶｎｅｏ ＡＴＣＣ３７１９８、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ ＡＴＣＣ３７１４５、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ ＡＴＣＣ３７２２４、ｐＳＶ２ｎｅｏ ＡＴＣＣ３７１４９などである。
当技術分野において通常使用されるエンハンサー配列、ポリアデニル化部位、およびスプライシングジャンクション、例えば、ＳＶ４０に由来するものなども使用することができる。
通常使用される選択マーカーを通常の方法に従って使用することができる。その例は、テトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンなどの抗生物質に対する耐性遺伝子である。
遺伝子増幅のための遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸シンターゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子などである。
本発明で使用される発現ベクターは、少なくとも上記のプロモーター、開始コドン、タンパク質をコードするＤＮＡ、終結コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に連結して適切なレプリコンにすることによって調製することができる。所望であれば、適切なＤＮＡ断片（例えば、リンカー、制限部位など）を、通常の方法、例えば、制限酵素を用いた消化またはＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用したライゲーションなどによって使用することができる。
ＨｉｓタグおよびＧＳＴなどのアフィニティータグを配列の末端に付加して、ウエスタンブロットおよびプルダウンアッセイによるタンパク質の精製および認識を容易にすることができる。ＨＡおよびＦＬＡＧなどの他のタグの例を付加して構築物のさらなる操作を可能にすることもできる。
本明細書で使用される場合、「形質転換体」は、上記の発現ベクターを宿主細胞に導入することによって調製することができる。
本明細書で使用される場合、「宿主」細胞は、上記の発現ベクターと適合し、形質転換することができる限りは限定されない。その例は、技術分野において通常使用される野生型細胞または人工的に確立された組換え細胞（例えば、細菌（大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびバチルス属（Ｂｃｉｌｌｕｓ））、酵母（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）など）、動物細胞、または昆虫細胞）などの種々の細胞である。
大腸菌または動物細胞を使用することが好ましい。具体例は、大腸菌株ＤＨ５アルファ、ＴＢ１、ＨＢ１０１など、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ３Ｔ３など）、ラット由来細胞（ＰＣ１２、ＰＣ１２ｈ）、ハムスター由来細胞（ＢＨＫ、ＣＨＯなど）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｌｏなど）、ならびにヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、二倍体の線維芽細胞由来細胞、骨髄腫細胞、およびＨｅｐＧ２など）である。
発現ベクターは、既知の方法によって宿主細胞に導入（形質転換（トランスフェクト））することができる。形質転換は、例えば、宿主が細菌（大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）である場合はＣｏｈｅｎら（（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．６９：２１１０）の方法、プロトプラスト法（（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１）、またはコンピテント法（（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９）、宿主がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである場合はＨｉｎｎｅｎら（（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７５：１９２７）の方法、またはリチウム法（（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、宿主が動物細胞である場合にはＧｒａｈａｍ（（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６）の方法、宿主が昆虫細胞の場合にはＳｕｍｍｅｒｓら（（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）の方法に従って実施することができる。
本明細書に開示されているタンパク質は、上記の通り調製した発現ベクターを含む形質転換体（以下、この用語はトランスフェクタントを包含する）を栄養培地で培養することによって作製することができる。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の成長に必要な炭素供給源、無機または有機の窒素供給源を含むことが好ましい。炭素供給源の例はグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、およびスクロースであり、無機または有機の窒素供給源の例はアンモニウム塩、硝酸、アミノ酸、コーンスチープリカー、ペプトン、カゼイン、肉抽出物、ダイズ粕、およびジャガイモ抽出物である。所望であれば、栄養培地は、他の栄養分（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、および塩化マグネシウム）、ビタミン、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシンなど）を含んでよい。
細胞系統の培養は当技術分野で既知の方法によって実施する。温度、培地のｐＨ、および培養時間などの培養条件は、タンパク質が多量に産生されるように適切に選択する。
当業者に既知の、多くの有用な目的に役立つ多種多様の修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われていることが理解されよう。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、そのような化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに、とりわけ、単純な細胞および複雑な細胞を含めたウイルスおよび細胞に特徴的な、化学的な形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
例として、本開示のポリヌクレオチド配列は参照配列と同一であってよく、それは１００％同一である、または、参照配列と比較してある特定の整数までのヌクレオチドの変更を含んでよい。そのような変更は、塩基転位および塩基転換、または挿入を含めた少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換を含む群から選択され、前記変更は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位または３’末端位において、またはそれらの末端位の間のどこにおいてでも、参照配列内のヌクレオチドの中で個別に分散して、または参照配列内の１つまたは複数の連続した群に分散して起こり得る。ヌクレオチドの変更の数は、参照ヌクレオチド内のヌクレオチドの総数にそれぞれのパーセント同一性の数値パーセントを掛け（１００で割り）、その積を前記参照ヌクレオチド内のヌクレオチドの総数から引くことによって決定する。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変更により、そのような変更に従ってポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが変更され得る。
「コドン」という用語は、アミノ酸または終結シグナルを構成するＤＮＡ鎖またはｍＲＮＡ内のモノヌクレオチドの特定のトリプレットを意味する。
「変性ヌクレオチド配列」という用語は、１つまたは複数の変性コドンを含む（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子と比較して）ヌクレオチドの配列を意味する。変性コドンは、異なるヌクレオチドのトリプレットを含有するが、同じアミノ酸残基をコードする（例えば、ＧＡＵトリプレットおよびＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
本明細書で使用される場合、「外因性ＤＮＡ」または「外因性核酸配列」または「外因性ポリヌクレオチド」という用語は、外部の供給源から細胞または細胞小器官に導入された核酸配列を指す。一般には、導入された外因性配列は組換え配列である。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、核酸配列を生細胞の膜に囲まれた空間の内部に導入することを指し、核酸配列を細胞の細胞質ゾル、ならびにミトコンドリア、核または葉緑体の内部空間に導入することを含む。核酸は、種々のタンパク質を伴う裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよく、または核酸は、ベクターに組み入れられていてよい。
「ＤＮＡ調節配列」とは、本明細書で使用される場合、宿主細胞におけるコード配列の発現をもたらし、かつ／または調節するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどの、転写制御配列および翻訳制御配列である。
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるオペロン内のＤＮＡ調節領域である。プロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位が結合し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで、転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列内に転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見い出される。真核生物のプロモーターは、多くの場合、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含めた種々のプロモーターを使用して、本開示の種々のベクターを駆動することができる。
「キメラ」、「融合」および「複合体」という用語は、そうでなけれは天然では直接（共有結合的に）連結しては見い出されないという意味で互いに異種性である、少なくとも２つの構成部分を含有するタンパク質、ペプチドドメインまたはヌクレオチド配列または分子を示すために使用される。より詳細には、構成部分は、天然では同じ連続的なポリペプチドまたは遺伝子において、少なくとも、同じ順序または配向では、またはキメラタンパク質または複合体ドメインに存在するのと同じ間隔では見い出されない。そのような材料は、少なくとも２つの異なるタンパク質または遺伝子に由来する、または同じタンパク質または遺伝子の少なくとも２つの隣接しない部分に由来する成分を含有する。複合体タンパク質、およびそれをコードするＤＮＡ配列は、そうでなければ天然では直接連結して（共有結合的に）は見いだされない少なくとも２つの構成成分を含有するという意味で組換え型である。
「ドメイン」という用語は、この場合は、単一の別個の折り畳みドメインに限定されるものではない。
「レポーターポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡまたはレポーターポリペプチドであってよい検出可能な遺伝子産物を発現する任意の遺伝子を包含する。レポーター遺伝子は、転写産物および／または翻訳産物が容易に検出可能または選択可能なコード配列を含む。
「挿入」または「付加」とは、本明細書で使用される場合、対応する天然に存在する分子と比較して、それぞれ、１つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の付加または挿入をもたらすアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変化を指す。
「欠失」または「サブトラクション」とは、本明細書で使用される場合、対応する天然に存在する分子と比較して、それぞれ、１つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失またはサブトラクションをもたらすアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変化を指す。
「置換」とは、本明細書で使用される場合、１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチドの、それぞれ、異なるアミノ酸またはヌクレオチドとの交換を指す。
「突然変異」とは、参照「野生型」ＤＮＡ配列と比較した、ＤＮＡ配列における遺伝性の変化である。突然変異は、一塩基の変化、多塩基の変化、またはＤＮＡ配列への２つ以上のヌクレオチドの付加または欠失の結果として起こり得る。
「突然変異体」という用語は、参照野生型タンパク質と何らかの違いがあるタンパク質を指すために広範に使用され、タンパク質は参照野生型（例えば、天然に存在する）タンパク質の生物学的特性を保持してよく、または参照野生型タンパク質とは異なる生物学的特性を有してもよい。対象タンパク質の「生物学的特性」という用語は、最大発光、量子収率、および輝度などのスペクトル特性；ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける安定性（例えば、半減期）などを包含する（それだけに限られない）。突然変異体は、単一のアミノ酸の変化（点突然変異）、１つまたは複数のアミノ酸の欠失（点欠失）、Ｎ末端の切断、Ｃ末端の切断、挿入などを含んでよい。突然変異体は分子生物学の標準の技法を使用して生成することができる。
「遺伝子突然変異」とは、完全に１つの遺伝子内で、またはその上流の調節配列で起こる突然変異を指し、完全に１つの遺伝子内で起こる点突然変異または他の通常の染色体の構造の破壊のいずれかを包含し得る。
「野生型」株には、あらゆる範囲の代謝活性の能力がある。例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の野生型株は、２０種のアミノ酸すべてを単一の炭素供給源から合成することができる。
「突然変異体」株には、それが由来する野生型株の活性のすべての能力はない。例えば、アミノ酸ヒスチジンを合成する能力が不完全である突然変異細菌株（ｈｉｓ株）が増殖するためには外因性ヒスチジンが存在する必要がある。
「点突然変異」は、ＤＮＡ配列内の１つまたは少数の塩基対の変化である。点突然変異は、塩基対の置換、または、わずかな挿入もしくは欠失に起因し得る。
「塩基転位」は、プリンがプリンと交換されるか、またはピリミジンがピリミジンと交換される点突然変異である。
「塩基転換」は、プリンがピリミジンと交換されるか、ピリミジンがプリンと交換される点突然変異である。一般的に言えば、塩基転位は校正酵素により検出されないので、塩基転換よりも一般的である。
あるいは、点突然変異により、終止コドン（アンバー、オーカー、オパール）の挿入によって生じるナンセンス突然変異もまた、引き起こされ得る。翻訳終止コドンを生成する塩基対突然変異により、コードされるタンパク質の翻訳の中途終結が引き起こされる。
「フレームシフト突然変異」は、遺伝子内の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失により生じる。遺伝子の「読み枠」とは、ｍＲＮＡの翻訳の出発点に基づく塩基の順序を指す。単一の塩基対が欠失することにより、すべてのコドンの１つの塩基が前に進み、これは多くの場合、正のフレームシフトと称される。１つの塩基対が付加されること（または、２つの塩基対が損失すること）により、読み枠が１つの塩基分後ろにシフトし、これは多くの場合、負のフレームシフトと称される。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つの核酸鎖が会合して、向かい合った核酸鎖の残基間の水素結合によって安定化された逆平行の２重鎖を形成するプロセスを指す。
「ハイブリダイズすること」と「結合」は、ポリヌクレオチドに関しては互換的に使用される。「特異的にハイブリダイズすること」および「特異的なハイブリダイゼーション」および「選択的にハイブリダイズする」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸分子がストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列と優先的に結合すること、二重鎖形成すること、またはハイブリダイズすることを指す。
「ストリンジェントなアッセイ条件」という用語は、本明細書で使用される場合、アッセイにおいて所望のレベルの特異度をもたらすために十分な相補性の核酸の結合対、例えば、表面結合および液相核酸の産生には適合するが、所望の特異度をもたらすためには相補性が不十分である結合メンバー間の結合対の形成に対しては適合性が低い条件を指す。ストリンジェントなアッセイ条件は、ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件の総和または組み合わせ（全体）である。
本開示によると、本開示のセンサーの「検出可能量」は、臨床使用のために利用可能な装置を用いて許容できる画像をもたらすために十分な量と定義される。検出可能量の本開示のセンサーは、２回以上の注射により投与することができる。本開示のセンサーの検出可能量は、個体の感受性の程度、個体の年齢、性別、および体重、個体の特異体質的応答、用量測定値などの因子に応じて変動し得る。本開示のセンサーの検出可能量は、計器およびフィルムに関連する因子によっても変動し得る。そのような因子の最適化は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
「投与」とは、本開示のセンサーを対象に導入することを意味する。センサーの好ましい投与経路は静脈内である。しかし、経口、局部、皮下、腹膜内、動脈内、吸入、膣内、直腸内、鼻内、脳脊髄液への導入、または体の区画への滴下注入などの任意の投与経路を使用することができる。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、天然に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞とは異なる環境にあるポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞について説明するものである。
本明細書で使用される場合、「タンパク質のベータカン（ｂｅｔａ−ｃａｎ）構造」という句は、逆平行のベータ鎖で形成された小型の円柱として特徴付けられるタンパク質を指す。
「蛍光タンパク質」とは、適切な電磁気照射で励起されると光を放出することができる任意のタンパク質を指す。蛍光タンパク質は、天然または工学的に作製されたアミノ酸配列を有するタンパク質、例えばＡｅｑｕｏｒｅａ関連蛍光タンパク質に由来する蛍光タンパク質などを包含する。「蛍光タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの構造変異体（すなわち、環状の円順列変異体（ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）、単量体型）、ＧＦＰの折り畳み変異体（すなわち、より可溶型、スーパーフォルダー（ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ）型）、ＧＦＰのスペクトル変異体（すなわち、ＹＦＰ、ＣＦＰ）、およびＧＦＰ様蛍光タンパク質（すなわち、ＤｓＲｅｄおよびｍｃｈｅｒｒｙ）である。蛍光タンパク質は、異なる資源由来であってよい。ヒドロ虫綱（Ｈｙｄｒｏｚｏａ）クラスについては、ＧＦＰはＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ｍｉｔｒｏｃｏｍａ（Ｈａｌｉｓｔａｕｒａとシノニム）、Ｏｂｅｌｉａ、Ｐｈｉａｌｉｄｉｕｍなど由来であってよい。花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）クラスについては、ＧＦＰは、Ａｃａｎｔｈｏｐｉｌｕｍ、Ｃａｖｅｒｎｕｌａｒｉａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、ＰｔｉｌｏｓａｒｃｕｓおよびＰｅｎｎａｔｕｌａ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａなど由来であってよい。本発明者らは、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｍａｊｎａ由来のＧＦＰ様タンパク質、Ａｎｅｍｏｎｉａ ｓｕｌｃａｔａ由来のＦＰ５９５、Ｚｏａｎｔｈｕｓ由来のＦＰなども有する。「ＧＦＰ様蛍光タンパク質」という用語は、ＧＦＰの１１−ベータ鎖「バレル」構造を共有する花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）蛍光タンパク質のメンバー、ならびにその構造変異体、折り畳み変異体およびスペクトル変異体を指すために使用される。「ＧＦＰ様非蛍光タンパク質」および「ＧＦＰ様クロモフォアタンパク質」（または、単に「クロモフォアタンパク質」または「色素タンパク質」）という用語は、ＧＦＰの１１−ベータ鎖「バレル」構造を共有する花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）クロモフォアタンパク質およびヒドロ虫綱（Ｈｙｄｒｏｚｏａ）クロモフォアタンパク質、ならびにその構造変異体、折り畳み変異体およびスペクトル変異体を指すために使用される。ＧＦＰ様タンパク質はすべて、分子状酸素以外に、付帯的な補因子、外部の酵素の触媒作用または基質を必要とすることなく内部のクロモフォアを形成する能力を（制限なく）含めた、共通の構造特性および機能特性を共有する。
分子内の再配置または蛍光を促進する補因子の付加に起因して蛍光を放出するタンパク質を含めた種々の蛍光タンパク質を本開示において使用することができる。例えば、刺胞動物の生物発光におけるエネルギー転移アクセプターとしての機能を果たす刺胞動物の緑色蛍光タンパク質が、蛍光指標において使用するために適した蛍光タンパク質である。緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）は、緑色の光を放出するタンパク質であり、青色蛍光タンパク質（「ＢＦＰ」）は、青色の光を放出するタンパク質である。ＧＦＰは太平洋岸北西部のクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ；ウミシイタケＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｈｉａｌｉｄｉｕｍ ｇｒｅｇａｒｉｕｍから単離されている（Ｗａｒｄら、（１９８２）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３５：８０３〜８０８およびＬｅｖｉｎｅら、（１９８２）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、７２Ｂ：７７〜８５を参照されたい）。赤色蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙは５８７ｎｍにおける励起波長および６１０ｎｍにおける最大発光を有する（Ｓｈａｎｅｒ、Ｎ．Ｃ．ら、（２００４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。
有用な励起および発光スペクトルを有する種々のＡｅｑｕｏｒｅａ関連ＧＦＰが、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の天然に存在するＧＦＰのアミノ酸配列を改変することによって工学的に作製されている。Ｐｒａｓｈｅｒら、（１９９２）Ｇｅｎｅ１１１：２２９〜２３３；Ｈｅｉｍら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ９１：１２５０１〜１２５０４；米国特許出願第０８／３３７，９１５号、１９９４年１１月１０日出願；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４６９２号、１９９５年１１月１０日出願；および米国特許出願第０８／７０６，４０８号、１９９６年８月３０日出願を参照されたい。ＧＦＰのｃＤＮＡは多くの他のタンパク質をコードするｃＤＮＡと鎖状につながっている可能性があり、生じる融合物は多くの場合、蛍光性であり、パートナータンパク質の生化学的特徴を保持する。Ｃｕｂｉｔｔら、（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：４４８〜４５５を参照されたい。突然変異誘発研究により、励起または発光の波長がシフトしたＧＦＰ突然変異体が作製された。Ｈｅｉｍ＆Ｔｓｉｅｎ（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．６：１７８〜１８２を参照されたい。適切な対、例えば青色−シフトＧＦＰ突然変異体Ｐ４−３（Ｙ６６Ｈ／Ｙ１４５Ｆ）および改善された緑色突然変異体Ｓ６５Ｔは、それぞれ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）のドナーおよびアクセプターとして機能し得る。Ｔｓｉｅｎら、（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２４２〜２４５を参照されたい。蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質の１５０アミノ酸の連続した配列のいずれかが、野生型Ａｅｑｕｏｒｅａ緑色蛍光タンパク質由来の連続した、または連続していないアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＡｅｑｕｏｒｅａ関連蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質の２００アミノ酸の連続した配列のいずれかが、野生型Ａｅｑｕｏｒｅａ緑色蛍光タンパク質由来の連続した、または連続していないアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＡｅｑｕｏｒｅａ関連蛍光タンパク質であることがより好ましい。同様に、蛍光タンパク質は、同じ基準を用いて、Ｒｅｎｉｌｌａ野生型蛍光タンパク質またはＰｈｉａｌｉｄｉｕｍ野生型蛍光タンパク質に関連するものであってよい。
本開示の実施形態において使用される、Ｆ６４ＬおよびＳ６５において２つの突然変異を有するＧＦＰの変異体は高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を含む。そのクロモフォアは、４８８ｎｍにおいて最大励起を有し、５１０ｎｍにおいて最大発光を有する。その蛍光シグナルはこれらの２つの突然変異を有さない野生型ＧＦＰの蛍光シグナルを有意に超える。
別のＧＦＰの変異体はＣｙｃｌｅ３と称されている（参照により本明細書に包含されるＰａｔｔｅｒｓｏｎら、（１９９７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７３：２７８２〜２７９０を参照されたい）。野生型ＧＦＰにおけるＦ９９Ｓ、Ｍ１５３ＴおよびＶ１６３Ａの突然変異を有するこのＧＦＰ変異体は、折り畳みが改善されており、３７℃以上でクロモフォアが形成される。
他の蛍光タンパク質、例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ株Ｙ−１由来の黄色蛍光タンパク質、渦鞭毛藻類Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ種由来のペリジニン−クロロフィルａ結合タンパク質、シネコッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）などの海洋のシアノバクテリア由来のフィコビリタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびフィコシアニン、またはフィコエリスロビリンを用いて再構築されたエンバク由来のエンバクフィトクロムなどを蛍光指標に使用することができる。これらの蛍光タンパク質は、Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９：５５０９〜５５１５、Ｍｏｒｒｉｓら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４：６７３〜６７７、およびＷｉｌｂａｎｋｓら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２２６〜１２３５、およびＬｉら、（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：７９２３〜７９３０に記載されている。
本明細書で使用される「連結する」という用語は、物理的な連結ならびに生物学的粒子、例えば、ファージ、細菌、酵母または他の真核細胞内に共存することによって起こる連結を指す。
対象のポリペプチドの発現をコードする配列を有する細胞にトランスフェクトするために使用される核酸は、一般に、ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む発現ベクターの形態である。ポリペプチドの「発現をコードするヌクレオチド配列」という用語が使用される場合、ｍＲＮＡが転写され、翻訳されるとポリペプチドを産生する配列を指す。これは、例えば、イントロンを含有する配列を包含し得る。本明細書で使用される場合、「発現制御配列」という用語は、それが作動可能に連結している核酸配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列は、発現制御配列により、核酸配列の転写、および必要に応じてその翻訳が制御および調節される場合に、核酸配列に作動可能に連結している。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、適切なｍＲＮＡの翻訳を可能にするためのその遺伝子の正確な読み枠の維持、および終止コドンを含んでよい。
当業者によく知られた方法を用いて、蛍光指標のコード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成法およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．、１９８９に記載の技法を参照されたい）。
種々の宿主−発現ベクター系を利用して、生物発光の指標のコード配列を発現させることができる。これらとしては、カルシウム感受性系配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；カルシウム感受性系配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、カルシウム感受性系配列を含有するＴｉプラスミドベクター）で形質転換した植物細胞系；カルシウム感受性系配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）ベクターを感染させた昆虫細胞系；または、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カルシウム感受性系配列を含有するレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターを感染させた形質転換した動物細胞系、または安定発現のために工学的に作製された形質転換動物細胞系が挙げられる（それだけに限られない）。
利用する宿主／ベクター系に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めたいくつもの適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントの任意のものを発現ベクターにおいて使用することができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６〜５４４、１９８７）を参照されたい。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、誘導性プロモーター、例えば、バクテリオファージｌａｍｄａ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃのｐＬ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などを用いることができる。哺乳動物細胞系におけるクローニングの場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルスの長い末端反復；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を用いることができる。組換えＤＮＡまたは合成法によって作製されるプロモーターは、挿入された蛍光指標のコード配列の転写をもたらすためにも用いることができる。
細菌系では、いくつもの発現ベクターを、カルシウム感受性系を対象とする使用に応じて有利に選択することができる。
酵母では、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するいくつものベクターを用いることができる。概説については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈ．１３、１９８８；Ｇｒａｎｔら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ、ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｗｕ＆Ｇｒｏｓｓｍａｎ編、３１９８７、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１５３巻、５１６〜５４４頁、１９８７；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＩＩ巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．、Ｄ．Ｃ．、Ｃｈ．３、１９８６、Ｂｉｔｔｅｒ、Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ編、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１５２巻、６７３〜６８４頁、１９８７、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｉ巻およびＩＩ巻、１９８２を参照されたい。酵母の構成的プロモーター、例えば、ＡＤＨまたはＬＥＵ２など、または誘導性プロモーター、例えば、ＧＡＬなどを用いることができる（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ、Ｃｈ．３、Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ Ｉｎ：ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、１１巻、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＤＭ Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．、Ｄ．Ｃ．、１９８６）。あるいは、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを用いることができる。
突然変異アッセイ系を発現させるために用いることができる代替の発現系は、昆虫系である。１つのそのような系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病 ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用する。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において成長する。カルシウム感受性系配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。カルシウム感受性系配列の上首尾の挿入により、ポリヘドリン遺伝子が不活化され、非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質被膜を欠くウイルス）が産生される。次いで、これらの組換えウイルスを使用して、挿入された遺伝子を発現させるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させる。Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．４６：５８４、１９８３；Ｓｍｉｔｈ、米国特許第４，２１５，０５１号を参照されたい。
本開示の突然変異アッセイ系をコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡを適切な宿主細胞に移行させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることができる。「宿主細胞」はベクターが繁殖し、そのＤＮＡを発現させることができる細胞である。この用語は、対象宿主細胞の任意の後代も包含する。複製の間に突然変異が起こり得るので、すべての後代が親細胞と同一であるわけではないことが理解される。しかし、そのような後代は、「宿主細胞」という用語が使用される場合、それに含まれる。安定な移行、言い換えれば、外来ＤＮＡを宿主において連続的に維持する方法は、当技術分野で知られている。
「物理的な連結」とは、介在性ドメインを伴うかまたは伴わない組換え融合、インテイン媒介性融合、非共有結合性の会合、共有結合（例えば、ジスルフィド結合および他の共有結合）、水素結合；静電気的な結合、配座結合、例えば、抗体−抗原会合、およびビオチン−アビジン会合を（制限なく）含めた、２つの分子を機能的に接続する（２つの分子は「物理的に連結した」と称される）ための、当技術分野で既知の任意の方法を指す。
「融合した」とは、共有結合により連結していることを指す。
本明細書で使用される場合、「細胞小器官」という用語は、葉緑体、ミトコンドリア、および核などの細胞膜に結合した構造を指す。「細胞小器官」という用語は、天然の細胞小器官および合成の細胞小器官を包含する。
本明細書で使用される場合、「非核細胞小器官」という用語は、細胞に存在する、核以外の任意の細胞膜に結合した構造を指す。
本明細書で使用される場合、「宿主」または「生物体」という用語は、ヒト、哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマなど）、生細胞、および他の生きている生物体を包含する。生きている生物体は、例えば単一の真核細胞のように単純であってよく、または哺乳動物のように複雑であってよい。本開示の実施形態を投与することができる典型的な宿主は哺乳動物、特に霊長類、特にヒトである。獣医学への適用については、多種多様な対象、例えば、家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタなど；家禽、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなど、家畜動物、特に愛玩動物、例えば、イヌおよびネコなどが適切である。診断または研究への適用については、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、およびブタ、例えば、純系のブタなどを含めた多種多様な哺乳動物が適切な対象である。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける適用、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける診断および研究への適用については、上記の対象の体液および細胞試料、例えば、哺乳動物（特に、ヒトなどの霊長類）の血液試料、尿試料、もしくは組織試料、または獣医の適用に関して言及した動物の血液試料、尿試料、もしくは組織試料などが使用に適している。
「分析物」は、タンパク質またはペプチドに結合させることができる原子、分子またはイオンである。分析物は、可逆的または不可逆的に結合してよく、そのような結合は共有結合性または非共有結合性であってよい。本開示の好ましい実施形態では例示的な分析物としてＣａ２＋、Ｌｎ３＋およびＰｂ２＋が使用されているが、本開示に適する分析物は、ＩＩＡ族金属イオン、遷移金属イオン、およびランタニド系列イオンを含めた金属イオンを包含する（それだけに限られない）ことが理解される。
「分析物」は、タンパク質に結合させてセンサーの光学特性を変化させることができるＨ＋またはＯＨ−であってもよい。「結合部位」とは、分析物との結合の形成に関与するペプチドまたはタンパク質の任意の区域を指す。
「結合モチーフ」は、多くの場合、より大きなタンパク質の中の結合部位の一部である。結合部位という用語は、結合モチーフという用語と互換的に使用することができ、逆もまた同じである。
「化学反応」は、既知の手段によるイオン性、共有結合性、または非共有結合性の構造の形成または解離を含んでよい。化学反応は、ｐＨ、イオン強度、および温度などの環境条件の変化を含んでよい。
「コンフォメーション」は、分子の側基を含めた、分子の一次構造、二次構造、および三次構造、およびいくつかの場合には分子の四次構造の三次元の配置であり、分子の三次元構造が変化するとコンフォメーションの変化が起こる。コンフォメーションの変化は、アルファヘリックスからベータ−シートへのシフトまたはベータ−シートからアルファヘリックスへのシフトであってよい。
「検出可能な変化」または「反応性」とは、タンパク質の、その微小環境に対する任意の反応を意味する。そのような検出可能な変化または反応性は、センサーポリペプチドのアミノ酸またはペプチド断片の配向の小さな変化またはシフト、ならびに、例えば、プロトン化、電気ポテンシャルおよび化学ポテンシャルならびに／またはコンフォメーションの変化を含めた、ポリペプチドの一次構造、二次構造、または三次構造、およびいくつかの場合にはポリペプチドの四次構造の変化であってよい。
活性な状態と不活性な状態の間の任意の蛍光特性の「測定可能な差異」が、活性についてのアッセイにおける本開示の蛍光タンパク質基質の有用性のために十分である。測定可能な差異は、任意の定量的蛍光特性の量、例えば、特定の波長における蛍光シグナルまたは放出スペクトルに対する蛍光の積分を測定することによって決定することができる。
「作動的に挿入された」または「連結した」とは、そのように記載された成分が、それらの意図された様式で機能することが可能になる関係にある近位を指す。コード配列に作動可能に連結した制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で実現されるようにライゲーションされている。
「反応する」とは、ポリペプチドまたはタンパク質の、分析物との相互作用に対する任意の反応を包含するものとする。
「蛍光の寿命」とは、フルオロフォアシグナルの強さではなく、その寿命を指す。蛍光の寿命は、蛍光試料からの蛍光の指数関数的な減衰速度の差異に基づいて画像を作製するための画像化技法である蛍光寿命画像化顕微鏡法（ＦＬＩＭ）を使用して測定することができる。これは、共焦点顕微鏡法、二光子励起顕微鏡法、および多光子断層撮影法における画像化技法として用いることができる。蛍光の寿命を測定することには、試料の厚い層における光子の散乱の影響が最小化されるという利点がある。
（説明）
分析物センサー、分析物センサーを作製および使用するための方法、分析物の活性を検出および／もしくは測定し、ｐＨの変化を検出し、かつ／または系における分析物の濃度を制御する方法が開示されている。本開示による分析物センサーの実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏ環境およびｉｎ ｖｉｔｒｏ環境の両方において、特に生細胞画像化において、分析物の活性を特徴付けるため、ｐＨの変化を検出するため、系における分析物の濃度を制御するためなどの、正確かつ便利な方法を提供することができる。
Ｃａ２＋は、多数の生物学的プロセスを、細胞質ゾルＣａ２＋濃度の時空間的変化およびその後のＣａ２＋ 結合タンパク質との相互作用を通じて調節する。小胞体（ＥＲ）は、細胞内Ｃａ２＋貯蔵所としての機能を果たし、細胞質ゾルＣａ２＋ の恒常性において重要な役割を果たす。特定の細胞内環境において、それ自体が細胞におけるシグナル伝達分子として関与する天然のＣａ２＋結合タンパク質、例えばカルモジュリンなどを用いることなく、リアルタイムの定量的なＣａ２＋測定をすることができるＣａ２＋センサーを開発する強い必要性がある。そのようなセンサーを、Ｃａ２＋結合モチーフを緑色蛍光タンパク質内のクロモフォア感受性位置に組み込むことによって創出するための戦略が開示されている。工学的に作製されたＣａ２＋センサーは、Ｃａ２＋がＥＲにおいて見い出されるＣａ２＋濃度に対応する親和性（０．４〜２ｍＭにわたるＫｄ値）で結合すると、大きなレシオメトリックな蛍光および吸収の変化を示す。新しく開発されたＣａ２＋センサーの光学的な結合特性および金属結合特性を種々の分光法を用いて特徴付けることに加えて、ストップフロー分光蛍光分析を用いて動力学的特性も検査して、動的なＣａ２＋の変化の正確なモニタリングを確実にした。開発されたＣａ２＋センサーを哺乳動物細胞系のＥＲにターゲティングして、アゴニストを用いた刺激に反応してこの区画で起こるＣａ２＋の変化をモニターした。このクラスのＣａ２＋センサーは、他の細胞区画内のＣａ２＋を測定するためにさらに改変し、それにより、細胞のＣａ２＋シグナル伝達に対するこれらの区画の寄与を試験するためのツールをもたらすことができると考えられる。
ＥＧＦＰに基づくＣａ２＋センサーを、連続的なＣａ２＋結合部位を有するＥＦ−ハンドモチーフを野生型ＥＧＦＰに足場タンパク質として移植することによって首尾よく創出した［３５］。生成したＣａ２＋センサー（Ｇ１）は３９８ｎｍおよび４９０ｎｍにおいて励起させると二重の５１０ｎｍの蛍光強度レシオメトリック変化を示し、それをモニターしてＣａ２＋の濃度を決定した。哺乳動物細胞画像化における動的範囲は相対的に小さい（僅か１０〜１５％の変化）が、この研究は、Ｃａ２＋に誘導されるコンフォメーションの変化を導入することによりＧＦＰクロモフォアを変更することができるという仮説を強力に支持する。部位特異的突然変異誘発によるＣａ２＋センサーの利点は以下の通り列挙される。１）ＥＧＦＰの表面上にＣａ２＋結合部位を直接設計することにより、それのクロモフォアとの距離が移植アプローチよりも短ければ、より大きな動的範囲のシグナルの変化が創出されると推測される。これは、ＧＦＰの表面とクロモフォアとの間の最短距離はおよそ１０Åだけであるが、移植されたＥＦ−ハンドに結合したＣａ２＋はクロモフォアに対して３０Å超離れてクロストークすることによる。この新しい戦略は、クロモフォアに対してより直接的な影響を有し得る。２）ＥＧＦＰ（野生型ＧＦＰのＳ６５Ｔ突然変異体）は生理的条件下で安定であり、無毒性であり、かつ頑強な光学的な蛍光を示すので、本発明者らはそれを足場タンパク質として選択した［３６］。折り畳みが不十分であると蛍光強度が低いことに起因して細胞画像化が不適格になるだけでなく、Ｃａ２＋結合部位の機能障害もが引き起こされるので、足場タンパク質においてｃｙｃｌｅ２突然変異（Ｍ１５３Ｇ、Ｖ１６３Ａ）［３７］を創出して、高い温度におけるタンパク質の折り畳み効率を改善した。野生型ＧＦＰは深く冷たい海中に住むＡｅｑｕｏｒ Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈによりコードされるので、哺乳動物細胞の生理的温度は不都合に高い。３）ＣＤ２に基づくＣａ２＋ 結合タンパク質設計の成功［３８］に従って、異なるＣａ２＋結合親和性を有するタンパク質を、局所的な負荷電配位リガンドに由来する結合部位の静電ポテンシャルを交番させることによって容易に開発することができる。４）設計されたＧＦＰに基づくＣａ２＋センサーは、異なるシグナルペプチドと融合することによって種々の細胞の細胞小器官または組織に特異的にターゲティングすることができる。５）設計されたＧＦＰに基づくＣａ２＋センサーは、現在報告されている天然のＣａ２＋結合タンパク質に基づくＣａ２＋センサーの、Ｃａ２＋シグナル伝達の攪乱に起因する制限［３９］を克服することができる。さらに、本発明者らは、クロモフォアの環境およびクロモフォアのコンフォメーションの変化に影響を及ぼす特定の分子の機構を探究するために、核磁気共鳴分析を行うことを提案する。これにより、多様な分子を検出するＧＦＰに基づくバイオセンサーを開発することについての確かな理論的な証拠がもたらされる。
ＧＦＰの表面上に部位特異的突然変異誘発によってＣａ２＋結合部位を設計することの理論的根拠：図１は、以下の考察に基づいてＥＧＦＰ中に設計したＣａ２＋センサーを示す（７Ｅ１５．ＥＧＦＰ）。第１に、このＣａ２＋結合部位を設計して、側鎖カルボキシル酸素が五角両錐形状に配向された５つの負荷電残基によって形成される、ＣＤ２における７Ｅ１５のＣａ２＋結合部位を模倣して、同様のＣａ２＋結合親和性を可能にした。第２に、タンパク質の折り畳みに対する突然変異の耐容能を考慮して蛍光強度の攪乱を回避した。本発明者らは、この部位を公開された論文に従って選択し、この領域の周囲の３つのかさのある芳香族残基を正に荷電した残基に突然変異させて、二量体の形成を妨げた［４０］。第３に、蛍光は、クロモフォアを溶媒に曝露させることによって消光される傾向があるので、クロモフォアの溶媒接近可能性、特に位置によって蛍光感度スポットを決定した。Ｒｉｃｈｍｏｎｄにより、残基２０４および１４７の部位特異的突然変異誘発による、１０〜１００μＭのＣｕ２＋に反応して４０％超の蛍光が消光されるＣｕ２＋指標が報告され［４１］、これにより、この領域の周辺への高い水の接近可能性が実証されている。本発明者らは、側鎖電荷の反発により逆平行ベータシート間の水素結合を弱めるために、この領域周辺の５つの負荷電残基すべてを適用した。第４に、クロモフォアとカルシウム結合部位の間の幾何学的距離(ｇｅｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｔａｎｃｅ)は、Ｃａ２＋とクロモフォアの相互作用が最大であると最小になる。クロモフォアを有し水素ネットワークに関与するいくつかの残基、例えば２２２および２０３などが、この領域内に圧縮された最短距離を有することが報告された。
本開示による分析物センサーの実施形態は、蛍光ホストポリペプチドと、分析物（例えば、カルシウム（もしくは本明細書において示されている他の金属）またはその微小環境におけるカルシウムのフラックス）と相互作用する分子認識モチーフとを含む。分析物が分子認識モチーフと相互作用すると、分析物センサーにより、分析物に曝露されている間に生じる光学的に検出可能なシグナルが生成される（または、光学的に検出可能なシグナルが変更されるか、もしくはシグナルの寿命が変化する）。分子認識モチーフは、蛍光ホストポリペプチド（アミノ酸配列の内部）に組み込まれるか、または作動的に連結される。分析物と分子認識モチーフの相互作用により、分析物の量に基づいて、分析物センサーの蛍光特性の検出可能な変化（例えば、強度、または吸収の最大波長もしくは画像化、伝達される光、蛍光の励起もしくは発光の変化、光散乱、シグナルの寿命、ならびに／またはクロモフォアおよびタンパク質のエネルギー転移）が生じる。
関連する分子認識モチーフを使用して、分析物センサーを、疾患の機構を調査するため、疾患のプロセスを追跡するために、および分析物の活性に関連するいくつかの疾患を診断するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、生細胞およびｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用することができる。さらに、特異的なシグナルペプチドも、それらによる種々の細胞区画におけるカルシウム（または、本明細書において示されている他の金属）の活性に関連する疾患の活性化または阻害などの機構をリアルタイムかつｉｎ ｓｉｔｕで調査するために有用であり得、このことは、バイオテクノロジー、細胞生物学および医薬品化学、疾患の診断および予後判定、カルシウム阻害薬のスクリーニングおよび薬物の開発において有用である。
分析物センサーの実施形態は、複数の負荷電残基を含む金属イオン結合部位を有する工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドであって、負荷電残基が、五角両錐形状に配向された複数のカルボキシル酸素を含み、前記形状により、工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドのクロモフォア領域と作動的に相互作用する金属イオン結合部位がもたらされ、その結果、金属イオン分析物と分子認識モチーフが結合することにより、蛍光ホストポリペプチドにより放出される蛍光シグナルの放出、および任意選択で、工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドの吸収スペクトルが調節される、蛍光ホストポリペプチドを含む。
分析物（例えば、カルシウム、鉛、ランタニドなど）が分析物結合部位と相互作用すると、分析物センサーにより、相互作用する前の分析物センサーと比較してシグナルの変更が生じる。これに関して、分析物が分析物結合部位と相互作用すると蛍光ホストポリペプチド内のクロモフォアの相対的な三次元の位置が変更され、そのような変更により、シグナルの変更が生成される。
言い換えれば、分析物センサーは、三次元空間において、特異的なシグナルを生じる折り畳み配置を有する。分析物センサーは、分析物結合部位を有する分析物（例えば、カルシウム、鉛、またはランタニド）の誘導下で、クロモフォアの微小環境の変更を伴う別の折り畳み配置への局所的なコンフォメーションの変化を受ける可能性がある。コンフォメーションの変化を検出し、測定し、分析物と相互作用する前にカルシウムセンサーによって生成されるシグナルと比較することができる。
本開示の実施形態の利点としては、以下の１つまたは複数を挙げることができる。（ｉ）本開示の実施形態は、生細胞または生物体における多数の細胞の事象を生細胞画像化によってモニターすることができる。本開示の実施形態により、細胞の事象および刺激または薬物によるそれらの反応に関する連続的な動画をもたらすことができる。本開示の実施形態により、分析物の作用に関する１枚のスナップショットを伴う現在商業的に利用可能な小分子色素、ペプチド／模倣体プローブの制限が大きく克服される。（ｉｉ）本開示の実施形態は、細胞環境下で２つの蛍光タンパク質を使用したＦＲＥＴ対よりもより容易かつ、より良く移行して、ｉｎ ｓｉｔｕで分析物の反応をプローブする単一の蛍光タンパク質を含む。シグナルペプチドを付加すると、これらの分析物センサーをＥＲ、ミトコンドリア、ゴルジ体または核などの細胞環境において特異的に発現／位置させて、細胞の事象を、時間分解能に加えて空間分解能を伴ってモニターすることができる。現在利用可能な色素検出方法は、単にプローブが膜を通じて受動的に拡散することに依拠し、カルシウムの作用の短いスナップショットのみが可能になり、ターゲティングされた細胞の場所における反応を検出することができない。これらのプローブでは、細胞の寿命および特異性が限られているので、カルシウムの作用の連続的な動的画像化はもたらされない。（ｉｉｉ）本開示の実施形態では、金属イオン（例えば、カルシウム、鉛、またはランタニド）を感知するために既存の／天然のカルシウム結合性タンパク質を使用せず、したがって、細胞のネットワークの攪乱が最小限になる。（ｉｖ）本開示の実施形態は、蛍光退色を起こしやすく、それらのサイズが大きいことに起因して細胞区画における配向性および移行が不十分であるＦＲＥＴに基づくセンサーにおいて認められる制限を克服する単一の蛍光タンパク質ユニットを含む。（ｖ）３９８ｎｍおよび４９０ｎｍにおける吸収または励起に伴う本開示の実施形態のシグナルのレシオメトリック変化により、カルシウム（または、本明細書において示されている他の金属）の作用を、センサーの濃度変化ならびに蛍光シグナルの細胞および機器による干渉を正規化することによって定量的かつ正確に測定することが可能になる。（ｖｉ）異なる分析物親和性を有する異なるセンサーを創出することにより、細胞の反応を高い正確度および感度でモニターすることが可能になる。（ｖｉｉ）本開示の実施形態において使用される構造モチーフにより、化学反応のために必要な最適な分子認識に加え最大の光学反応が可能になる。（ｖｉｉｉ）開発された分析物センサーは、細菌、哺乳動物細胞、および動物、例えば、マウスなどにおいて、本明細書に記載のものなどの良好な光学特性を伴って発現させることができる。金属イオン結合により誘導される、本開示の工学的に作製されたポリペプチドの蛍光特性および吸収特性の変化は、逆の変化をもたらす金属イオンの除去を検出するためにも使用することができる。
したがって、本開示の系、センサー、および方法を用いて、分析物と分析物結合部位の間の相互作用を、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて検出し、測定し、定量化し、画像化することができる。具体的には、本開示の実施形態を用いて、カルシウムの相互作用または事象をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ならびに細胞、組織、およびｉｎ ｖｉｖｏにおいて検出し（かつ可視化し）かつ／または定量化することができる。さらに、本開示の系、センサー、および方法を使用して、分析物結合部位のｐＨの変化をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて検出し、測定し、定量化することができる。さらに、本開示の系、センサー、および方法は、系における分析物の濃度を制御するために用いることができる。
本開示による分析物センサーは、複数の負荷電残基を含む金属イオン結合部位を有する工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドであって、負荷電残基が五角両錐形状に配向された複数のカルボキシル酸素を含み、前記形状により、工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドのクロモフォア領域と作動的に相互作用する金属イオン結合部位がもたらされ、その結果、金属イオン分析物と分子認識モチーフが結合することにより、蛍光ホストポリペプチドにより放出される蛍光シグナルの放出、および任意選択で、工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドの吸収スペクトルが調節される蛍光ホストポリペプチドを含んでよい。ある実施形態では、負荷電残基が３つの逆平行ベータシートの表面上にある。ある実施形態では、負荷電残基はベータカン構造を有するタンパク質の３つの鎖に広がっている。
蛍光タンパク質のネイティブなシグナルは、蛍光ホストポリペプチドのアミノ酸配列内の分析物結合部位および構造モチーフを含めることによって変更される。具体的には、本開示の実施形態により、分析物結合部位の挿入位置がもたらされ、その結果、分析物センサーにより、２つ以上の波長で放出が生じる。これに関して、蛍光ホストポリペプチド内のクロモフォアの相対的な三次元の位置は、分析物結合部位および構造モチーフを含めることによって変更され、そのような変更により、シグナルの変更が生成される。
分析物（例えば、カルシウム、鉛、および／またはランタニド）が分析物結合部位と相互作用すると、分析物センサーにより、相互作用する前の分析物センサーと比較してシグナルの変更が生じる。これに関して、分析物が分析物結合部位と相互作用すると蛍光ホストポリペプチド内のクロモフォアの相対的な三次元の位置が変更され、そのような変更により、シグナルの変更が生成される。相互作用した後のシグナル（クロモフォアシグナル）のレシオメトリック変化により、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、正規化されたセンサー濃度を用いて）分析物の活性を正確に測定することが可能になる。構造モチーフを含めることにより、特定の種類の分析物に必要な必須の構造的特性および化学的特性が組み入れられることによって最適な分子認識が可能になる。例えば、構造モチーフを含めることにより、カルシウムに容易に接近するための溶媒接近可能性、認識のために必要な柔軟性、相互作用するための特別な幾何的ポケット、結合プロセスを容易にする親水性表面または荷電した環境およびリアルタイム測定するために必要な、良好なオフ速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）などの高速のカイネティクス速度に必要な環境が可能になる。
カルシウム結合性ＧＦＰの設計：緑色蛍光タンパク質におけるカルシウム結合性タンパク質の設計を、確立された設計計画および五角両錐形状に基づく所与のパラメータを用いて行った（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：８２６７〜８２７３；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：２０８５〜２０９３；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：６１６５〜６１７１）。３０００を超える潜在的なカルシウム結合部位を計算的に構築した。
いくつかの基準を適用して、部位を順位づけ、選択した。（ｉ）中心のヘリックス（すなわち、アミノ酸５６〜７１）に突然変異を含有する部分をいずれも除去した。（ｉｉ）折り畳みの破壊を回避するために、覆い隠された疎水性残基が荷電残基で交換された部位を除去した。（ｉｉｉ）多くのカルシウム結合部位で溶媒接近可能性が観察されるので、Ｐｈｅ８などの溶媒が到達しにくい残基を伴う部位を排除した。溶媒接近可能性はＧｅｔＡｒｅａプログラムを使用して評価した。（ｉｖ）柔軟性が高いループ領域における突然変異は、タンパク質の折り畳みを攪乱することなく「安全」であるとみなしたが、β鎖上に突然変異を伴う部位はより侵攻性であるとみなした。（ｖ）突然変異が少ないとネイティブなタンパク質のコンフォメーションをかき乱す可能性が低いので、リガンドとして存在している残基がより多いと予測される部位が好ましい。（ｖｉ）カルシウムセンサーの電位の発生についてクロモフォアからの距離も評価した。タンパク質の過剰パッキングを検査し、近くの残基との衝突を回避した。さらに、カルシウム結合性タンパク質についての統計学的な結果に基づいて、３〜４つの負荷電リガンド残基を有する部位を選んだ。（ｖｉｉ）潜在的なカルシウムに誘導される蛍光変化をさせるために、クロモフォア感受性位置を蛍光タンパク質の動的特性およびコンフォメーション特性に基づいて解析した。
図１４は、基準（表１）に基づいて選択されたＧＦＰの３つの異なる位置に位置する５つのカルシウム結合部位（ＧＦＰ．Ｄ１、ＧＦＰ．Ｄ２、ＧＦＰ．Ｄ２’、ＧＦＰ．Ｄ２’’、およびＧＦＰ．Ｄ３と称される）を示す。ＧＦＰ．Ｄ１はループ領域内のバレルの末端に位置する。ＧＦＰ．Ｄ１は、ループ領域の柔軟性に起因して、ＥＧＦＰの折り畳みおよび構造に対する影響が少ないことが予想される。ＧＦＰ．Ｄ２、ＧＦＰ．Ｄ２’、およびＧＦＰ．Ｄ２’’は、ＧＦＰ．Ｄ１とは反対側のバレルの末端のループ領域内に位置する。これらは、４つの同一のリガンド残基を含有し、１つの残基が異なる。ＧＦＰ．Ｄ２はリガンドＬ１９４Ｅ、Ｓ８６Ｄ、Ｓ２Ｄ、Ｄ８２、およびＥ５を有する。Ｌ１９４はＧＦＰ．Ｄ２’およびＧＦＰ．Ｄ２’’のどちらにおいてもＮに突然変異している。ＧＦＰ．Ｄ２’は、Ｋ８５Ｄ突然変異を含有するが、ＧＦＰ．Ｄ２およびＧＦＰ．Ｄ２’’はＳ８６Ｄを含有する。これにより、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、およびＳｅｒのサイズおよび電荷の性質が異なることに起因して、局所的な環境における側鎖のパッキングおよび静電気的相互作用が変化する。ＧＦＰ．Ｄ３はバレルの中央に位置し、クロモフォアまで１４Åである。２つの天然のリガンド残基および３つの突然変異を含めたすべてのリガンド残基がβ鎖上に位置する。
設計されたタンパク質のクロモフォアおよびコンフォメーション特性：異なる光学特性を示す４つのカルシウム結合部位をＥＧＦＰ内に工学的に作製した。大腸菌における細菌により発現されたタンパク質のすべての中で、ＧＦＰ．Ｄ２のみが緑色の蛍光色を保持する。図１５Ａおよび１５Ｂに示されているように、細菌により発現され、精製されたＧＦＰ．Ｄ２およびその系列および野生型ＥＧＦＰは４９０ｎｍにおいて吸収極大を示す。４９０ｎｍにおける励起により、５１０ｎｍにおける最大発光がもたらされる。対照的に、残りの細菌により発現されたタンパク質であるＧＦＰ．Ｄ１およびＧＦＰ．Ｄ３は無色であり、これは、細菌の発現系においてクロモフォアが形成されていないことを示している。図１５Ｂは、これらの設計されたタンパク質の遠紫外ＣＤスペクトルがＥＧＦＰと同様に２１６ｎｍにおいて陰性極大を有することを示し、これは、カルシウム結合性リガンド残基が導入された後に優性のβシート構造が変更されなかったにもかかわらずクロモフォアの形成が攪乱されたことを示している。
ＧＦＰはクラゲ由来であり、真核細胞はタンパク質の折り畳みを補助する機構を含有するので、真核生物の発現系によりクロモフォアの形成を容易にすることができることが報告された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５３：３９７〜４０９）。図１６は、ＧＦＰ．Ｄ１およびＧＦＰ．Ｄ２がどちらも、Ｈｅｌａ細胞において発現されると蛍光を呈することを示す。対照的に、ＧＦＰ．Ｄ３は、哺乳動物細胞において発現された場合も、細菌系におけるその発現と同様に無色のままである。これらの結果は、カルシウム結合性のためのいくつかの荷電残基を導入することは、タンパク質の折り畳みおよび構造には影響を及ぼさないが、環境の変化に対する耐容能が低いクロモフォアの合成および形成には影響を及ぼすことを示唆している。
金属結合親和性および設計されたＧＦＰ変異体の選択性：設計されたＧＦＰ変異体のカルシウムおよびその類似体ランタニドイオンに対する金属結合能を、細菌により発現され、精製されたタンパク質を使用した４つの異なる方法を用いて検査した。正しく形成されたクロモフォアを有するＧＦＰ．Ｄ２については、金属結合親和性は、金属濃度に応じた蛍光シグナルの変化をモニターすることによって直接決定した。図１７Ａに示されているように、０〜１０ｍＭのカルシウムを添加することにより、３９８ｎｍにおいて励起させた際の５１０ｎｍにおける蛍光シグナルが徐々に減少する。５１０ｎｍにおけるわずかな変化は１：１のカルシウム：タンパク質複合体を形成する式にうまくあてはめることができる。カルシウムの解離定数は１０７±１３である。他方では、野生型ＥＧＦＰは、金属イオンの添加に際していかなる有意な蛍光シグナルの変化も有さない。
市販のカルシウム結合性色素であるローダミン−５Ｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、色素競合アッセイによりカルシウム親和性およびランタニド親和性を得た。図１７Ｂに示されているように、ローダミン−５Ｎは、カルシウムがＧＦＰ．Ｄ１に結合すると大きな蛍光シグナルの増加を示す。色素競合アッセイにおいて、色素およびタンパク質の濃度が一定である溶液を、飽和が観察されるまでカルシウムで滴定した（図１７Ｂ、挿入図）。設計されたタンパク質の結合親和性を、スペクトルを金属および２つのリガンドモデルに全体的にあてはめることによって得た。表１に示されているように、蛍光シグナルの変化を直接測定することによって得られたＧＦＰ．Ｄ２のカルシウム結合性親和性は、色素競合法によって得られた親和性と一致する。
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１２０、１７７、および１９４について、テルビウム親和性を２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１％グリセロール、ｐＨ６．８中で測定した。１９４について、テルビウム親和性を１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＤＴＴ、１％グリセロール、ｐＨ７．４中で測定した。４つの部位すべてについてカルシウム親和性を１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＤＴＴ、１％グリセロール、ｐＨ７．４中で測定した。
次いで、カルシウム結合性色素の競合を用いて、これらの細菌により発現されたタンパク質ＧＦＰ．Ｄ１、ＧＦＰ．Ｄ２、ＧＦＰ．Ｄ２’およびＧＦＰ．Ｄ２’’ならびにＧＦＰ．Ｄ３についてのカルシウム結合性親和性を得た。これらのカルシウム結合性親和性は、それぞれ６０±５μＭ、５７±２μＭ、９６±７μＭおよび３８±５μＭである。
設計されたタンパク質の金属結合性をさらに特徴付けるために、テルビウム感作蛍光共鳴エネルギー転移を用いた。テルビウムは、同様のイオンのサイズおよび結合形状を有するカルシウムの類似体であり、本来、５４５ｎｍにおいて蛍光性であり、芳香族残基から転移したエネルギーを受容することができる。ＥＧＦＰは、１Ｔｒｐおよび１０Ｔｙｒを含有し、ＴｒｐはＧＦＰ．Ｄ１およびＧＦＰ．Ｄ２の３０Åの範囲内にあり、ＧＦＰ．Ｄ３およびＧＦＰ．Ｄ４の１７Åの範囲内にある（表１）。図１７Ｃに示されているように、タンパク質にテルビウムを添加することにより、２８０ｎｍにおける励起で５４５ｎｍにおけるテルビウム−ＦＲＥＴシグナルが大きく増加する。１：１の金属：タンパク質複合体を仮定したテルビウム濃度に応じた増強により、結合親和性がもたらされる（表１）。ｐＨ７．４で試験した３つのタンパク質のうち、ＧＦＰ．Ｄ１が最も強力なテルビウム親和性（１．９±０．４μＭ）を有している。ＧＦＰ．Ｄ２はそれよりもわずかに弱い親和性４．９±０．２μＭを有し、一方ＧＦＰ．Ｃａ２’は１５分の１の弱い親和性３２±１３μＭを示す。ｐＨ６．８では、ＧＦＰ．Ｄ２’’は、２．９±０．３μＭのテルビウムに対する結合親和性を示す。カルシウムおよびランタンをテルビウム−タンパク質複合体に付加すると、競合によりテルビウムによる蛍光の増強が有意に低下した。
図１７Ｄに示されているように、１ｍＭのカルシウムを添加することにより、ＧＦＰ．Ｄ１についてテルビウムの蛍光が大きく減少し、これは、カルシウムがタンパク質に結合し、テルビウムの結合と競合することを示す。１００μＭのランタンを添加することにより、蛍光が半分に減少し、これは、金属結合親和性が推定で５分の１低い（約１０μＭ）ことを示唆している。他方では、より高濃度のマグネシウム（１０ｍＭ）を添加することにより比較的小さな減少がもたらされ、これは、結合親和性が比較的弱いことを示す。同様に、ＧＦＰ．Ｄ２’は、１ｍＭのカルシウムまたは１００μＭのランタンで蛍光の最大半量の減少を示し、これもマグネシウムより有効である。総合すると、カルシウムおよびランタニドはタンパク質の同じポケットに結合し、マグネシウムの２０倍超の選択性を有する。本開示のカルシウム結合部位は３８〜９６μＭの範囲内のＫｄを有するカルシウム結合性親和性を有する。金属選択性は、細胞外の環境において、または細胞質ゾルよりもカルシウム濃度がはるかに高いＥＲにおいて、タンパク質がマグネシウムに干渉されずにカルシウムと結合するためにも十分である。
本開示の実施形態は、分析物（例えば、カルシウム、鉛、および／またはランタニド）に結合する分子認識モチーフおよび分子認識モチーフが作動的に連結されたまたは組み込まれた蛍光ホストポリペプチドを含む分析物センサーを提供する。分析物と分子認識モチーフの相互作用により、検出可能な変化が生じる。表２には、分析物センサーのいくつかの実施形態、対応する配列番号、および特定の分析物センサーの特性が列挙されており、他の分析物センサーは、配列番号１１５〜１５９に記載されている。配列番号１〜９９、および１０４〜１０５および１１５〜１５９は特定の順序のアミノ酸を含むが、各群（例えば、分子認識モチーフ、蛍光ホストポリペプチドなど）は、分析物センサーにより、本明細書に開示されている実施形態と一致する結果が生じる限りは違うように位置づけることができる。
Figure 0006158087
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配列番号１０５はＣａｒａｔＥＲセンサーに対応する。カルレティキュリンシグナルペプチド由来のＥＲターゲティング配列の残基がＮ末端に付着しており、ＥＲ保持配列がＣ末端に付着している。配列番号１０５は、新しい結合部位ならびにＥＲターゲティング配列および保持配列の突然変異をそれぞれＮ末端およびＣ末端に含む。センサーの追加的な配列は、配列番号１１５〜１５９に記載されている。
蛍光ホストポリペプチドは、蛍光ホストポリペプチドに、いくつもの場所のうちの１つにおいて挿入された、または組み込まれた分子認識モチーフを有してよく、異なる挿入ポイントのそれぞれにより、異なる特性の分析物センサーがもたらされる。例えば、蛍光ホストポリペプチドが、高感度蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）である場合、１５２位、１７２位、または１７０位に分子認識モチーフを挿入することができる。
蛍光ホストポリペプチドに２つまたは３つの突然変異を含めることにより、蛍光ホストポリペプチドを改変して、分析物センサーの熱安定性および／または蛍光特性を増強することができることにも留意すべきである。具体的には、ＥＧＦＰは、２つの突然変異（Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ）および／または３つの突然変異（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ）を含んでよく、これにより、本明細書に記載の熱安定性および／または蛍光特性が増大する。これらの突然変異は、それぞれ配列番号１６〜４５、配列番号４８〜５１、配列番号５４〜５７、および配列番号７２〜９９に示されている。本開示の特定の実施形態を説明する追加的な詳細および例が以下に提供される。
分析物センサーの蛍光特性に基づいて、分析物センサーのＤＮＡ構築物を、組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができる組換えベクターまたは任意の適切なベクターに挿入することができる。具体的なベクターは宿主細胞の種類に左右され得る。例えば、染色体外の実体として存在し得る組換えＤＮＡプラスミドベクターが適切なベクターであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるベクターであってよい。分析物センサーが構築されたら、蛍光核酸分子を含むベクターを、宿主細胞のトランスフェクトに用いる溶液（例えば、緩衝溶液）などの種々の組成物に配合することができる。
蛍光ホストポリペプチドまたはその変異体は、分子に直接的に、または間接的に、タンパク質−分子複合体が曝露される条件下で安定である任意の連結を用いて連結することができる。したがって、蛍光ホストポリペプチドおよび分子は、タンパク質上に存在する反応性基と分子の間の化学反応により連結することができる、または連結は、蛍光ホストポリペプチドおよび分子に特異的な反応性基を含有するリンカー部分によって媒介されてよい。蛍光ホストポリペプチド変異体と分子を連結するために適した条件は、例えば、分子の化学的性質および所望の連結の種類に応じて選択されることが理解されよう。対象の分子がポリペプチドである場合、蛍光ホストポリペプチド変異体と分子を連結するための都合のよい手段は、それらを、例えば、ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドに作動的に連結された蛍光ホストポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子から融合タンパク質として発現させることによる。
分析物センサーの一実施形態は、組換えＤＮＡ技術により、キメラタンパク質として作製することができる。蛍光ホストポリペプチドを含むタンパク質の組換え作製は、タンパク質をコードする配列を有する核酸を発現させることを含む。蛍光ホストポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野で既知の方法によって得ることができる。例えば、タンパク質をコードする核酸は、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａから、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰのＤＮＡ配列に基づくプライマーを使用してＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。蛍光ホストポリペプチドの突然変異型は、蛍光タンパク質をコードする他の核酸の部位特異的突然変異誘発によって、または０．１ｍＭのＭｎＣｌ２および不均衡なヌクレオチド濃度を用いた元のポリヌクレオチドのＰＣＲのエラー率の上昇によって引き起こされるランダム突然変異誘発によって作出することができる。
分子認識モチーフは、分析物結合部位、１つまたは複数の構造モチーフ、およびターゲティングモチーフを含んでよい。分析物結合部位および構造モチーフは、上記のものを含んでよい。ターゲティングモチーフは、細胞小器官および亜細胞小器官（ｓｕｂ−ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ）、例えば、ＥＲ、ミトコンドリア、ゴルジ体、核、チャネル、ギャップ結合、および細胞外空間など（それだけに限らない）にターゲティングすることができる。ターゲティングモチーフとしては、標的細胞小器官に位置するタンパク質においてコードされるシグナルペプチドが挙げられる（それだけに限られない）。ターゲティングモチーフは、配列番号５〜６、２０〜２１、３５〜３６、６５〜６６、７９〜８０、９３〜９４に列挙されているものを含み、特異的なアミノ酸配列は上述されている。上記の通り、モチーフは、開示された実施形態と一致する特性を有する限りは、本明細書の記載とは違うように位置づけることができる。本開示の特定の実施形態を説明する追加的な詳細および例が以下に提供される。
本開示は、金属イオン分析物（例えば、カルシウム、鉛、および／またはランタニド）に結合する分子認識モチーフおよび分子認識モチーフが作動的に連結されたか、または組み込まれた蛍光ホストポリペプチドを含む分析物センサーを提供する。分析物と分子認識モチーフの相互作用により、検出可能な変化が生じる。分析物センサーは、配列番号５、６、２０、２１、３５、３６、８０、８１、９４、および９５から選択される分子認識モチーフおよび蛍光ホストポリペプチドを含むタンパク質配列を有する。
分析物センサーの一実施形態は、以下から選択される少なくとも１つの特性を有する。約３０℃を超える温度において安定であること、蛍光および光学特性が増強されていること（例えば、蛍光タンパク質の突然変異（例えば、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３ＴおよびＶ１６３Ａ）に由来する）、およびそれらの組み合わせ。具体的には、分析物センサーの実施形態（Ｃ２変異体またはＣ３変異体と称される）（配列番号１６〜４５、４８〜５１、５４〜５７、および７２〜９９）は、哺乳動物細胞および細菌細胞のどちらにおいても蛍光を維持することができる。本明細書に記載の実施形態のそれぞれは、カルシウムおよび他の金属イオン（Ｐｂ２＋、Ｔｂ３＋、Ｌａ３＋、およびＧｄ３＋を含めた（それだけに限られない））と結合することができる。
本開示の分析物センサーの一実施形態は、まず、金属イオン分析物と反応することができる分析物結合部位を含む分子認識モチーフを構築し、次いで、分子認識モチーフを蛍光ホストポリペプチドに作動的に挿入することによって生成することができる。分子認識モチーフは、一般には、ほとんどの場合一次構造、二次構造、および三次構造を含み、いくつかの場合には四次構造を含み、その少なくとも１つを、分析物センサーに合わせて調整し、所望のレベルの分析物の感度を実現することができる。すなわち、一次構造、二次構造、三次構造、および存在する場合は四次構造のそれぞれを、それぞれ独立に、または１つまたは複数の他の構造と組み合わせて分析物センサーに合わせて調整して、分析物に対するセンサーの所望のレベルの感度を実現することができる。例えば、分析物が分子認識モチーフに結合することにより、検出可能なシグナル（例えば蛍光）の変化が生じ、分子認識モチーフを操作することにより、センサーの反応性が操作されることが好ましい。
分析物センサーの一実施形態は、励起されると検出可能な変化を生じることができる分子認識モチーフ、タンパク質の発現、分析物センサーに興奮がもたらされること、次いで、検出可能な変化を数量化することに起因して、分析物の数量化も可能にすることができる。好ましくは、タンパク質は、発光強度が微小環境における分析物の量と相対的である蛍光ホストポリペプチドを含んでよい。
分子認識モチーフを創出するための１つの方法は、組み込み法を用いることによるものである。組み込み法は、同定された結合部位の一次構造、二次構造、三次構造、および／または四次構造を修飾することにより分子認識モチーフを工学的に作製し、構築することに焦点を合わせている。
組み込み法を用いて分子認識モチーフを構築するための例示的な方法は、まず、分析物に特異的に結合する分析物結合性ペプチドを同定し、次いで、分析物結合性ペプチドをコードする核酸配列の少なくとも一部分を突き止めることを含む。これが実現されたら、分析物結合性ペプチドをコードする核酸配列を、分析物結合部位を含む分子認識モチーフ内に合わせて調整する。合わせて調整することが完了した後、蛍光ホストポリペプチドを選択し、蛍光ホストポリペプチドの核酸配列の関連する部分を同定し、合わせて調整された分析物結合性ペプチドをコードする核酸配列を分子認識モチーフ配列内の蛍光ホストポリペプチド核酸配列に作動的に連結する。最後に、分子認識モチーフ配列を発現させる。この方法では、分析物に対して所望の特異性を有する分子認識モチーフを実現するために、分析物結合性ペプチドをコードする核酸配列を合わせて調整する。分析物結合性ペプチドをコードする核酸配列は、他の分析物を超える分析物に対する特異性を有するように合わせて調整することが好ましい。その結果生じる分子認識モチーフ配列によりコードされるタンパク質は本開示の有用な産物である。
分析物結合部位の一次構造は、分析物結合性ペプチドをコードする核酸配列に少なくとも１つのコドンを挿入することによって選択的に修飾することができる。同様に、分析物結合性ペプチドをコードする核酸配列に荷電アミノ酸のコドンを挿入することができる。他の方法としては、分析物結合部位を、ヘリックス、ループ、橋またはリンカーを選択的に操作し、付加することによって修飾することもできる。分析物結合性ペプチドをコードするアミノ酸配列に荷電アミノ酸を挿入することができ、かつ／または分析物結合性ペプチドをコードするアミノ酸配列に芳香族アミノ酸を導入することができる。
所望の分子認識モチーフを生成するための別の方法は、新規の分子認識モチーフを工学的に作製し構築するための計算的方法が、分析物の、他の部分との最適な結合特性に基づく計算的手法の使用によるものである。例示的な一実施形態では、Ｃａ２＋結合データを評価するための確立された基準を使用して、所望の感度のＣａ２＋結合部位を分子モデリングによって構築することができる。例えば、そのような計算アルゴリズムを使用して、金属の結合形状、宿主タンパク質の折り畳み、蛍光タンパク質における電荷の場所、特定のクロモフォア、およびＣａ２＋結合データに特異的な他の基準などのパラメータに基づいて所望のイオン結合モチーフを開発することができる。
分子認識モチーフは選択された分析物に対する特異性を有することが好ましいことに留意して、分析物結合部位に関する構造データを含む公共のデータベースおよび／または民間のデータベースにアクセスし、構造データから、特定の予め選択された基準に基づいて少なくとも１つの予備的な分析物結合部位を生成し、予備的な分析物結合部位から１つまたは複数の適切な分析物結合部位を選択し、選択された分析物結合部位を合わせて調整することによって分析物結合モチーフを構築し、宿主タンパク質に作動的に連結することにより分子認識モチーフを構築するために、計算的手法を用いることができる。構造データは、一般には、タンパク質バンクおよび遺伝子バンクにおけるものなどのアミノ酸配列、二次構造、核酸配列、幾何的パラメータ、静電気的特性ならびに分析物結合部位の配位特性を含んでよい。
計算的手法は、分析物結合部位に関する構造データ、分子認識モチーフに関連する構造データの一部から予備的な分析物結合部位を生成し、予備的な分析物結合部位を選択された基準および選択された分析物に対する特異性に基づいて評価するためのアルゴリズム、およびデータベースを照会して予備的な分析物結合部位を生成するためにアルゴリズムを実行するためのコンピュータを含む少なくとも１つのデータベースを含むシステムにおいて、またはそれにより実施することができる。アルゴリズムは、一般に、入力された基準に基づいてデータベースを照会する比較的単純な検索アルゴリズムである。
分子認識モチーフを合わせて調整し、蛍光ホストポリペプチドに作動的に連結したら、分析物センサーにより、分析物依存的な蛍光の変動に対する反応性が示され得る。分析物センサーの反応性は、蛍光ホストポリペプチドと分子認識モチーフの相互作用によって引き起こされ、次いで、それにより、分析物の濃度またはフラックスに比例した蛍光特性が示され得る。具体的には、反応性は、蛍光タンパク質のクロモフォアの配向およびプロトン化の変化によって引き起こされると考えられている。分析物と蛍光ホストポリペプチドの間の相互作用により、発光スペクトル、量子収率、および／または吸光係数がシフトする可能性があり、これは、リアルタイムで定量的に分析して、微小環境を探索することができる。
使用および適用において、分析物センサーの一実施形態を用いて、試料中の分析物の濃度およびそのフラックスを非レシオメトリック色素として検出し、数量化することができる。より詳細には、分析物センサーを試料に挿入し、次いで、試料を照射により励起させ、次いで光学デバイスを使用して試料からの蛍光を測定し、次いで、蛍光またはそのフラックスを分析して、試料中の分析物の濃度を数量化または検出する。試料を分析するために、既知の分析物の濃度から生成される蛍光に基づいて検量線を作成することが必要であり得る。具体的には、試料中の分析物の濃度を決定するために、分析物センサーの蛍光シグナルを検量線の蛍光と比較する。
蛍光ホストポリペプチド：本開示による分析物センサーは、蛍光ホストポリペプチドまたはポリペプチド（「光学的に活性な蛍光ホストポリペプチド」または「光学的に活性な蛍光タンパク質」とも称される）を含んでよい。蛍光タンパク質のネイティブなシグナルは、蛍光ホストポリペプチドのアミノ酸配列内の分析物結合部位を含めることによって変更される。本開示の実施形態は、蛍光ホストポリペプチド内の特異的な分析物結合部位の挿入位置を提供し、その結果、分析物センサーにより、分析物が分析物結合部位と相互作用すると変更される発光が生じる。これに関して、蛍光ホストポリペプチド内のクロモフォアの相対的な三次元の位置は、分析物結合部位を含めることによって変更され、そのような変更により、シグナルの変更が生成される。一実施形態では、分析物センサーは、２つ以上の区別可能な波長において発光し得る。
本開示の分析物センサーにおいて使用するために適した蛍光ホストポリペプチドとしては、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａから単離された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ならびに高感度蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）などのいくつものＧＦＰ変異体が挙げられる（それだけに限られない）。特に、Ａｅｑｕｏｒｅａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその高感度蛍光タンパク質は、単一のポリペプチド鎖に約２３８アミノ酸残基を有する。ネイティブな分子は、その内因性の蛍光を、完全に変性した状態から再生することが示されている。ＧＦＰは、２３８アミノ酸配列の６５〜６７位にトリペプチドＳｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ配列を有するクロモフォアの自己環化（ａｕｔｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）および酸化により生成されると考えられている強力な可視の吸収および蛍光を示す。ＧＦＰに対する突然変異により、吸収および蛍光の種々のシフトがもたらされた。ＧＦＰの有用性は、追加的な補因子を必要としないＧＦＰからの蛍光に由来し、フルオロフォアは、ペプチド骨格の環化反応を介して自己組織化する。
ＧＦＰのクロモフォアは、トリペプチドＳｅｒ６５−Ｔｙｒ６６−Ｇｌｙ６７が環化することにより形成される。このクロモフォアは、１１本の逆平行の鎖および単一の中心αヘリックスで構成されるβバレルの内側に位置する。βバレルの末端にキャップ形成する短いヘリックスが存在する。クロモフォアはタンパク質フレームとの大規模な水素結合を有し、異なる折り畳みの状態で水分子の影響を受ける可能性がある。しっかりと構築されたβバレル内のクロモフォアは、４００ｎｍおよび４８０ｎｍにおいて吸収ピークを示し、５１０ｎｍにおいて発光ピークを示し、４７０ｎｍにおいて励起させると量子収率が約０．７２である。突然変異Ｓ６５Ｔを有するＧＦＰである高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）内のクロモフォアは、蛍光強度および感温性が改善されている。
２つの追加的な突然変異（Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ）、または３つの追加的な突然変異（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ）をＥＧＦＰに付加して３７℃以上におけるタンパク質の発現、安定性、クロモフォアの形成を増加させた。
例えば、表２に示されている配列番号１〜５８に示されているように、１７０位、１７２位、および１５７位の間に特異的な分析物結合部位を含むリンカーを移植することができる。
分析物結合部位の一実施形態は、配列の連続した一続きからのアミノ酸を用いずに適切な結合ポケットを形成するための蛍光タンパク質における突然変異によって創出することができる。例えば、表２に示されている配列番号５９〜９９に示されている配列のすべてである。
分析物結合部位：本開示による分析物センサーは、分析物結合部位を含む分子認識モチーフを有してよい。蛍光タンパク質のネイティブなシグナルは、蛍光ホストポリペプチドのアミノ酸配列内に分析物結合部位を組み込むことにより変更することができる。蛍光ホストポリペプチド内のクロモフォアの相対的な三次元の位置は、分析物結合部位を含めることによって変更することができ、そのような変更により、シグナルの変更が生成される。このセンサーのシグナルの変化により、レシオメトリック変化、すなわち、吸収および／または蛍光の励起の両方の、ある波長における１つの増加、１つの減少、または複数の増加と、別の波長における逆の変化とがもたらされる。
分析物結合部位の一実施形態は、金属イオン分析物と相互作用することによって機能し、そのような相互作用により、相互作用する前の分析物センサーと比較して、分析物センサーが変更されたシグナルを生じるようになる。蛍光ホストポリペプチド内のクロモフォアの相対的な三次元の位置は、分析物が分析物結合部位と相互作用すると変更され得、そのような変更により、シグナルの変更が生成される。
分析物結合部位は、分析物が分析物センサーに結合する結合部位を含んでよい（それだけに限られない）。結合部位は、分析物が分析物センサーに結合する場所であってよい。通常、特定の連続的配置または特定の空間的配置にある特定の種類のアミノ酸を、特定の種類の分析物に対して使用することができる。結合の反応および性質ならびにクロモフォアの相対的な変更に応じて、分析物の結合により分析物センサーシグナルの変更が引き起こされ得る。しかし、切断反応により、センサーシグナルの大きな変化が引き起こされる。これは、シグナルの変更をもたらす蛍光ホストポリペプチド内のクロモフォアの三次元の位置の局所的な環境が変更されることに起因し得る。そのような変更は、水素ネットワーク、動的特性、溶媒接近可能性または化学的特性、例えば疎水性相互作用および静電気的相互作用などが攪乱されることに起因し得る。
分析物結合部位切断部位を挿入するための蛍光ホストポリペプチド内の部位の一実施形態は、金属イオン分析物がその場所に接近可能なように選択することができることが好ましい。さらに、蛍光ホストポリペプチド内の場所は、その場所により蛍光ホストポリペプチドからの蛍光が実質的に低下しないように、かつ、その場所により蛍光ホストポリペプチドまたはクロモフォアのタンパク質の折り畳みが実質的に変性または変化しないように選択することができる。さらに、分析物結合部位切断部位を挿入するための蛍光ホストポリペプチド内の部位は、以下の基準の１つまたは複数に基づいて選択することができる：効率的な酵素作用を可能にするための溶媒接近可能性の最大化、分析物結合部位が蛍光ホストポリペプチドに作動的に組み入れられた際の、蛍光シグナル／光学シグナルの最大化；分析物結合部位と分析物が相互作用した後のクロモフォアの環境の破壊の最小化；蛍光ホストポリペプチドのタンパク質の折り畳みおよびパッキングに対する影響の最小化；ならびに、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける分析物の活性の正確な測定を可能にするための分析物結合部位と分析物の相互作用に起因するクロモフォアシグナルのレシオメトリック変化の最大化。分析物結合部位は、蛍光ホストポリペプチドのモチーフの内部またはそれらの間、例えば、二次構造モチーフ、三次構造モチーフ、または四次構造モチーフの内部またはそれらの間に含めることができることに留意するべきである。具体的には、分析物結合部位は、βバレルのループ内、およびループ間に挿入することができる。
構造モチーフ：分子認識モチーフに構造モチーフを含めることにより、特定の種類の分析物に必要な必須の構造的特性および化学的特性が組み入れられることによって最適な分子認識が可能になる。例えば、分析物が容易に接近するための良好な溶媒接近可能性、認識ために必要な良好な柔軟性、相互作用のための特別な幾何ポケット、結合プロセスを容易にするための親水性の表面または荷電した環境、およびリアルタイム測定するために必要な、良好なオフ速度などの高速のカイネティクス速度に必要な環境。
例として（しかし限定することを意図するものではなく）、溶媒接近可能性および柔軟性のためには、ヘリックス−ループ−ヘリックスまたは部分的なモチーフなどが有用であり得る。これらのヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフは、カルモジュリンまたはトロポニンＣ（trponic c）、Ｓ１００などのカルシウム結合性タンパク質のＥＦ−ハンドモチーフ由来、または核結合モチーフ由来などであってよい。さらに、例えば表２に列挙されている通り、ベータ−ループ−ベータもしくはベータ−ループ−ヘリックスなどの他の構造モチーフ、またはコイル状構造、または切断配列を含有し、クロモフォアの環境を変化させる能力を有するクロモフォアと比較して感受性の場所に位置するドメインおよび断片などを、本開示の実施形態において使用することができる。
ターゲティングモチーフ：ターゲットモチーフは、試料または宿主の正常な状態または病的状態、生物学的事象または生理的事象に関連する細胞、組織、小分子、タンパク質、細胞小器官、亜細胞小器官などの標的に対する親和性を有してよい。ターゲティングモチーフは、１つまたは複数の標的に対する親和性を有してよい。ターゲティングモチーフは特異的または非特異的であってよい。
非特異的なターゲティング部分は、以下の１つまたは複数を行うように選択してよい：細胞または細胞型に進入すること、脈管構造に進入すること、細胞外の空間に進入すること、細胞内の空間に進入すること、細胞表面に対する親和性を有すること、細胞膜を通じて拡散すること、細胞膜上の非特異的部分と反応すること、漏出性の脈管構造が原因で腫瘍に進入することなど。非特異的なターゲティング部分は、プローブの細胞への取り込みを容易にする化学的実体、生化学的実体、または生物学的実体を含んでよい。非特異的なターゲティング部分としては、細胞浸透性ペプチド、ポリアミノ酸鎖、小分子、およびペプチド模倣体を挙げることができる（それだけに限られない）。
本開示の精製されたタンパク質を細胞または細胞の空間に直接注射して、分析物の濃度を測定することもできる。配列番号１〜９９、１０４〜１０５および１１５〜１５９から選択されるセンサータンパク質を使用して、溶液中などのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分析物の変化を測定することもできる。精製されたタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて分析物の濃度を制御するための緩衝液またはキレート化剤としても機能し得る。
使用方法：本開示の分析物センサーはｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて使用することができると考えられる。本開示の分析物センサーまたは系は、細胞または宿主に導入することができ、分析物センサーまたは系は、系において発現させることができ、かつ／または、分析物センサーまたは系は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物に含めることができる。分析物センサーは、分析物センサーを異なる細胞内区画（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）、例えば、細胞質ゾル、核、ミトコンドリアのマトリックス、小胞体、ゴルジ体およびペルオキシソームなどに送達するための特異的なシグナルペプチドを含んでよい。
本開示の実施形態は、金属イオン分析物を検出し、測定する方法を提供する。この方法は、分析物センサーを系に導入するステップと、分析物センサーを、分析物センサーの分析物結合部位と相互作用することができる対象の分析物と相互作用させるステップと、フルオロフォアに由来する蛍光特性または変化を検出または測定するステップとを含んでよい。分析物センサーの蛍光活性の変化は、対象の分析物の活性の代理であるので、この方法により、分析物の活性を試験し、評価するための手段がもたらされる。
本開示の方法の実施形態は、分析物センサーをコードするプラスミドを、標準の遺伝子移入方法によって宿主細胞に導入するステップと、宿主細胞において分析物センサーを発現させるステップと、分析物センサーを、分析物センサーの分析物結合部位と相互作用することができる対象の分析物と相互作用させるステップと、それにより、蛍光シグナルまたは変化を検出または測定するステップとを含んでよい。分析物センサーの蛍光活性の変化は、対象の分析物の活性の代理であるので、この方法により、分析物の活性を試験し、評価するための手段がもたらされる。
本発明の方法は、分析物センサーを系に導入するステップと、分析物センサーを、分析物センサーの分析物結合部位と相互作用することができる金属イオン分析物と相互作用させるステップと、ｐＨの変化と相関し得る蛍光特性または変化を検出または測定するステップとを含んでよい。
本開示の実施形態は、１つまたは複数の金属イオン分析物の濃度を制御する方法をさらに提供する。一実施形態では、この方法は、分析物センサーを系に導入するステップと、分析物センサーを、分析物センサーの分析物結合部位と相互作用することができる分析物と相互作用させるステップとを含んでよい。分析物と分析物センサーとの結合により、細胞または宿主における分析物の量が制御される。
本開示で有用な試料としては、生体試料、環境試料、または、その中に特定の分子が存在するかどうかを決定することが望まれる任意の他の試料が挙げられる。試料は、動物または植物から得ることができる生細胞または細胞抽出物であってよい（それだけに限られない）。あるいは、細胞は、細菌細胞が起源であってよく、またはそれに由来してよい。さらに、細胞は、そのような細胞の培養物、例えば、細胞系統から得ることができるか、または、生物体から単離することができる。方法を、インタクトな生細胞または新鮮に単離された組織もしくは臓器試料を使用して実施する場合、生細胞における対象の分子の存在を同定し、したがって、例えば、分子の細胞内の区画化をリアルタイムで決定するための手段をもたらすことができる。
分析物センサーの検出：分析物センサーまたは分析物センサーを含有し発現している細胞を検出するための方法は、分析物センサーまたは分析物センサーを発現している細胞が放射を放出するように、分析物センサーまたはセンサーを発現している細胞を照明源で照明するステップを含んでよい（それだけに限られない）。そのような検出方法では、白熱光源、蛍光光源、ハロゲン光源、太陽光、レーザ光、および他の等価の供給源などの照明源を使用することができる。そのような照明源により照明すると、分析物センサーにより、肉眼による光学的観察または他の定性的方法もしくは定量的方法によって検出することができる蛍光が放出され得る。試料の蛍光を測定するための適切な方法は当業者に既知であり、理解されている。
遅いカイネティクスの制限を克服するために（Ｚｏｕら、Ｂｒｉｏｃｈｅ、２００７）、ＧＦＰに基づくＣａ２＋センサーにおいてカルモジュリンとそのターゲティングペプチドの間の結合界面を再設計することにより、オフ速度定数ｋｏｆｆを２５６ｓ−１に改善した。ＧＦＰに基づくＣａ２＋センサーのクロモフォアのプロトン化速度を最適化することにより、正確度をさらに増強する手段がもたらされ、それを用いてＣａ２＋シグナルを高い時間分解能で測定することができる。
ＣａｔｃｈＥＲの光学特性のＣａ２＋に誘導される変化：本発明者らが設計したＣａ２＋センサーであるＣａｔｃｈＥＲのモデル構造は、足場タンパク質ＥＧＦＰに基づく。結合部位は、クロモフォア（Ｙ６６フェノールの酸素の上の右側）に近接し、Ｈ１４８、Ｔ２０３、およびＥ２２２に隣接する（図２０Ａ）。その蛍光感度は水素結合による相互作用に起因し得る。Ｘ線結晶構造により、溶媒への接近をもたらす、タンパク質表面から突出している突然変異した残基側鎖が示される。この推定上のＣａ２＋結合部位は、残基１４７、２０２、２０４、２２３、および２２５により形成され、これにより、Ｃａ２＋を好む幾何的特性が付与される（図２０Ｂ）。これらの位置に荷電残基を導入することにより、５つの変異体を創出した（図２０Ｄ〜２０Ｈ）。
ＣａｔｃｈＥＲ（Ｄ１１）およびその変異体（Ｄ８〜Ｄ１０およびＤ１２）を細菌によって発現させ、確立された方法を用いて精製した（Ｈｅｉｍ＆Ｔｓｉｅｎ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８〜１８２；Ｚｏｕら、（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６：１２２７５〜１２２８８）。酸性のリガンド残基を導入することにより、４９０ｎｍのピークが失われ、３９８ｎｍにおける吸収極大が付加された（図２０Ｉ）。このＥＧＦＰの特徴は、陰イオン性のクロモフォアが優性であることに関連づけられる。吸収極大比３９５／４８８は、荷電した残基がないＥＧＦＰについての０．２から、４つの酸性残基を有するＤ１０についての２．３に上昇した（図２０Ｊ）。４８８ｎｍにおいて励起させた５１０ｎｍの蛍光極大は吸収極大に匹敵する（図２５Ａ〜２５Ｌ）。
ＣａｔｃｈＥＲおよびその変異体Ｄ９およびＤ１０にＣａ２＋が結合することにより、４９０ｎｍにおける吸収が増加し、３９８ｎｍにおける吸収が減少し（図２５Ｃ〜２５Ｅ、２５Ｍ）、これは、Ｃａ２＋が結合することにより、陰イオン性のクロモフォアが増加することを示している。対照的に、５１０ｎｍの最大発光は、３９５ｎｍおよび４８８ｎｍのどちらで励起させた場合も増加した（図２５Ｉ〜２５Ｋ、２５Ｍ）。すべての変異体の中で、ＣａｔｃｈＥＲが、Ｃａ２＋が結合した際の最も大きな蛍光の増強（約８０％）を有し（図２５Ｋおよび図２５Ｍ）、およそ５０％のＥＧＦＰ蛍光強度が達成された。Ｄ８の蛍光反応は、おそらくＤ８が有するリガンド残基が少なく、Ｃａ２＋結合親和性が低いことが原因で、無視できるものであった。
Ｃａ２＋の存在下でＣａｔｃｈＥＲのｐＫａが６．９の値に対して０．７ユニット減少し、ＥＧＦＰのｐＫａに近いことによって示されている通り、金属の結合によりクロモフォアの形成が補助された（図２６Ｂ）。Ｃａ２＋が結合することにより、荷電したリガンド残基を付加することに伴う蛍光特性の変化が逆転し、これは、おそらく、４８８ｎｍおよび３９５ｎｍで励起させた時に蛍光が増強される一方で過剰な負電荷が中和されることによる。総合すると、これらの結果により、蛍光の回復およびクロモフォアのイオン形態の切り換えを同時に伴うＣａｔｃｈＥＲに独特の機構が示唆される。
金属結合特性：一連の証拠により、単純なＣａｔｃｈＥＲ−Ｃａ２＋ストイキオメトリー反応が裏付けられる。ジョブプロット（Ｊｏｂ Ｐｌｏｔ）により、Ｃａ２＋がＣａｔｃｈＥＲと１：１複合体を形成し（図２６Ｃ）、Ｃａ２＋滴定に反応した蛍光変化は１：１結合式にあてはめることができる（図２１Ｂ）ことが示唆される。ミオグロビン（非カルシウム結合性タンパク質）、ＥＧＦＰ（非カルシウム結合性タンパク質）、ＣａｔｃｈＥＲ、およびα−ラクトアルブミン（Ｋｄ＝１０−９ＭのＣａ２＋結合タンパク質）をＣａ２＋と一緒に使用した平衡透析実験により、ＣａｔｃｈＥＲがＣａ２＋と弱い親和性で結合することが実証される（図２７Ａおよび２７Ｂ）。
設計されたＣａｔｃｈＥＲのＣａ２＋結合部位の近くのいくつかの残基のＣａ２＋に誘導される化学シフトの変化（図２２Ａ〜２２Ｃ）も１：１結合プロセスにあてはめることができ、Ｋｄ値は蛍光変化によって決定されるＫｄ値と一致する。ＣａｔｃｈＥＲは最も強力なＣａ２＋結合親和性を示し、見かけのＫｄは０．１８±０．０２ｍＭであり、一方Ｄ９は最も弱いＣａ２＋結合親和性を有し、見かけのＫｄは１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４中で０．９５±０．０８ｍＭである（図２０Ｌ）。ＣａｔｃｈＥＲの解離定数は、１００ｍＭのＫＣｌの存在下で０．４８±０．０７ｍＭまで増加し、これは、Ｃａ２＋の静電気的相互作用と一致する。Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＧＤＰは、Ｃａ２＋とＣａｔｃｈＥＲとの結合について競合することができず（図２１Ｃ）これは、その良好な選択性を実証している。
ＣａｔｃｈＥＲのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける動力学的特性：ストップフロー分光光度計を用いて、１０μＭのＣａｔｃｈＥＲを種々の濃度のＣａ２＋と混合した際の蛍光変化を記録した。ベースラインは、Ｃａ２＋を含まない緩衝液と混合したＣａｔｃｈＥＲに対応した。ストップフロー分光光度計の遅延時間（すなわち、２．２ｍｓ）内に４０％から６０％の間の最初の蛍光の増加が起こった。Ｃａ２＋濃度に応じたΔＦのプロットにより、双曲的なパターンがもたらされ、Ｋｄ値は０．１９±０．０２ｍＭであり、同じ条件における蛍光平衡滴定によって決定されたＫｄ０．１８±０．０２ｍＭと合理的に一致した（図２０Ｌ）。観察された速度定数は、５０μＭから１０００μＭの間のカルシウム濃度には依存せず、平均値は７３±１６ｓ−１であった。
ＣａｔｃｈＥＲ：Ｃａ２＋オフ速度を、１０μＭのＣａｔｃｈＥＲを１０μＭのＣａ２＋と、それに加えてＥＧＴＡを用いて平衡化した後の蛍光シグナルの変化を直接モニターすることによって測定した。計器の遅延時間（２．２ｍｓ）内に約７０％の蛍光変化が完了し、これは非常に速いＣａ２＋放出と一致した。ＣａｔｃｈＥＲからのＣａ２＋放出のために必要な種類の一次プロセスの７５％を完了するために２つの半減期が必要である場合、図２６Ｅのデータから約７００ｓ−１のｋｏｆｆ値を推定することができる。本発明者らが知る限り、ＣａｔｃｈＥＲが報告されたＣａ２＋センサーすべての中で最も速いオフ速度を示す。
高分解能ＮＭＲによるＣａ２＋−ＣａｔｃｈＥＲ相互作用の構造解析：設計されたＣａ２＋結合部位を導入した後、ＣａｔｃｈＥＲとＥＧＦＰの間のＣα化学シフトについて、結合部位の近くのＹ１４３、Ｔ１５３などの残基またはクロモフォアの周囲のＶ６８は１．５ｐｐｍを超える変化を示したが、大多数の残基の変化は０．４ｐｐｍ未満であった（図２９Ｃ）。この所見は、荷電したリガンド残基を付加することにより、局所的なクロモフォアのコンフォメーションが変化し、蛍光が低下し、クロモフォアがイオンの状態からその中性の状態にシフトすることを示唆している。
動的ＮＭＲによると、Ｃａ２＋センサーは溶液中で単量体のままである。Ｃａ２＋が結合することにより、設計されたＣａ２＋結合部位の近くに位置するＴ１５３残基、Ｙ１４３残基、Ｌ４２残基、およびＴ４３残基のＨＳＱＣスペクトルの有意な化学シフトの変化がもたらされる（図２９Ｃ）。設計された部位の近くのＹ１４３の主鎖が最も大きなシフトを示したことに留意されたい。これらの化学シフトは１：１結合式にあてはまり、Ｋｄ値は蛍光測定によって決定されたＫｄ値と一致し（図２１Ｂ）、これは、これらの残基間の高い相関を示唆している。他方では、クロモフォアに向かって突き出ているが、設計されたＣａ２＋結合部位からは離れている残基Ｒ９６、Ｑ９４、Ｆ１６５、およびＶ６１は、有意な化学シフトの変化を示さず、これは、Ｃａ２＋が設計された部位に特異的に結合することを示している。
ＮＭＲにより、ＨＳＱＣスペクトルのクロモフォアシグナルの欠如にもかかわらず、Ｃａ２＋に誘導されるクロモフォアの変化がさらに明らかになり得る。Ｑ６９はタンパク質の内側に覆い隠されており、クロモフォアと水素結合を形成する。その単一の共鳴はＣａ２＋の付加に伴って徐々に２つになり（図２２Ｂ）、これは、Ｃａ２＋が結合することにより、Ｑ６９が速い交換状態から２つの異なる遅い交換コンフォメーションに変換されることを示唆している。Ｅ２２２のカルボキシル基とクロモフォアのフェノールの酸素の間に形成される水素結合が、その蛍光強度にとって極めて重要であり、この残基により、報告されている野生型ＥＧＦＰのＸ線構造におけるＬ４２との主鎖水素結合が形成される（ｐｄｂ ＩＤ＝１ＥＭＡ）。Ｌ４２は、有意なＣａ２＋に誘導される化学シフトの変化も示す。吸収および蛍光試験ならびに高分解能ＮＭＲから、速いカイネティクスを伴うＣａ２＋に誘導される蛍光の増強を、２つのクロモフォアのイオンの状態の化学的な交換を減速させる、設計されたＣａ２＋結合部位の近くの局所的なコンフォメーションの変化に帰することができる（金属結合により起こる蛍光）。さらに、直接的な金属相互作用による蛍光変化は、コンフォメーションの変化による間接的な相互作用よりも速い可能性がある。Ｇ１について観察された通り、Ｃａ２＋の結合に誘導される蛍光変化は遅い速度でイオンの状態の間を迂回もし、これにより本開示のセンサーとＧＣａＭＰが区別されるが、どちらもＣａ２＋に反応して４８８ｎｍにおいて同様の蛍光の増強を示す。
種々の細胞型における小胞体Ｃａ２＋の濃度および放出：ＣａｔｃｈＥＲを、足場ＥＧＦＰのＮ末端またはＣ末端において、それぞれカルレティキュリンシグナルペプチドおよびＫＤＥＬと融合して、それをＥＲにターゲティングした（図２３Ｂ）。ＨＥＫ−２９３細胞およびＣ２Ｃ１２細胞に共局在するＣａｔｃｈＥＲおよびＥＲトラッカーＤｓＲｅｄ２−ＥＲの共焦点顕微鏡により、ＥＲに対するＣａｔｃｈＥＲのターゲティング特異性がさらに確認される（図３０Ａおよび３０Ｂ）。
ＣａｔｃｈＥＲのＣａ２＋結合親和性を決定するために、透過処理したＣ２Ｃ１２筋芽細胞を記載の通り濃度を漸増させたＣａ２＋に曝露させた。ＣａｔｃｈＥＲのＫｄは、ＢＨＫ細胞では１．０７±０．２６ｍＭであり、Ｃ２Ｃ１２細胞では１．０９±０．２０ｍＭであった。実験の最後に、蛍光強度は較正前の値に完全に回復し、これは、透過処理したＢＨＫ細胞およびＣ２Ｃ１２細胞においてＣａｔｃｈＥＲが洗い流されなかったことを実証し、さらに、そのＥＲへのターゲティングおよびＥＲにおける保持を裏付ける。ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＣ２Ｃ１２細胞における安静時のＥＲのＣａ２＋濃度は、それぞれ３９６±１３．２（ｎ＝７）、７４２±１３４（ｎ＝５）、および８１３±８８．６μＭ（ｎ＝１１）であり、いくつかのカメレオンに基づくＥＲセンサーを使用して報告されたＥＲのＣａ２＋濃度１００〜９００μＭと一致した。
ＡＴＰによるＥＲのＣａ２＋放出の惹起を、インタクトなＣ２Ｃ１２筋芽細胞において測定し（図２３Ａ）、同じバッチの細胞をジギトニンによって透過処理してＩＰ３に誘導されるＣａ２＋シグナル伝達を検出した（図２３Ｂ）。ＩＰ３を洗い落とすと蛍光が回復し、タプシガルジンを添加することによりＥＲのＣａ２＋濃度の減少が遅くなった。再度ＩＰ３を添加することにより、蛍光が急速に減少して以前のようにプラトーになり、洗浄した後に回復は観察されず、これはタプシガルジンによりＳＥＲＣＡポンプが完全に阻害されたことを示唆している。
インタクトな細胞において、ＣａｔｃｈＥＲにより、４−クロロ−ｍ−クレゾール（４−ＣｍＣ）によって引き出されるリアノジン受容体を通じたＣａ２＋放出を検出することができる。対照的に、ＥＲにおいて同時発現させたｍＣｈｅｒｒｙについては薬物に関連する反応は観察されなかった（図２３Ｃおよび２３Ｄ）。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞において、Ｆｕｒａ−２を用いて細胞質ゾルＣａ２＋をモニターした（図２４）。４−ＣｍＣにより濃度依存性のＳＲのＣａ２＋枯渇が引き出され、一方、５００μＭの４−ＣｍＣおよび２μＭのタプシガルジンを一緒に添加することにより、完全なＳＲのＣａ２＋枯渇が誘導された（図２３Ｅ）。ＣａｔｃｈＥＲにより、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３などの興奮性細胞および非興奮性細胞における、ＡＴＰ、ヒスタミン、タプシガルジン、およびシクロピアゾン酸に反応したＥＲのＣａ２＋放出が報告される（図３１Ｅ〜３１Ｇ、３１Ｊ）。
キット：本開示は、本開示による分析物センサー、タンパク質を所望の行先および方向へと送達することを容易にすることができる関連する作用剤（それらの使用のための使用説明書）を含み得る（それだけに限られない）キットをさらに包含する。上に列挙されている成分は、本明細書に記載の通りモニターされる特定の生物学的な事象に合わせて調整することができる。宿主細胞をトランスフェクトすることにおいて使用するため、または分析物センサーを用いて標的ポリペプチドを標識するためのキットは、分析物センサーをコードする核酸分子を使用して組み立てることができる。宿主細胞トランスフェクションキットは、分析物センサーをコードする核酸分子（または、上記の核酸分子またはプラスミドのうちの１つまたは複数を含む組成物）のうちの１つまたは複数を含有する少なくとも１つの容器を含んでよく、核酸分子はプラスミドを含むことが好ましい。キットは、上に列挙されている成分の種々の組み合わせを宿主細胞または宿主生物体に投与するための当技術分野で既知の適切な緩衝液および試薬をさらに含んでよい。本開示の成分および担体は、溶液中で、または凍結乾燥した形態で提供することができる。キットの成分が凍結乾燥した形態である場合、キットは、任意選択で、滅菌した生理的に許容される再構成用媒体、例えば、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水などを含有してよい。
したがって、本開示の一態様は、複数の負荷電残基を含む金属イオン結合部位を有する工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドを含む分析物センサーであって、負荷電残基が五角両錐形状に配向された複数のカルボキシル酸素を含み、前記形状により、工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドのクロモフォア領域と作動的に相互作用する金属イオン結合部位がもたらされ、その結果、金属イオン分析物と分子認識モチーフが結合することにより、蛍光ホストポリペプチドにより放出される蛍光シグナルの放出、および任意選択で、工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドの吸収スペクトルが調節される、分析物センサーの実施形態を包含する。
本開示のこの態様の実施形態では、負荷電残基が３つの逆平行ベータシートの表面上にある。
本開示のこの態様の実施形態では、負荷電残基はベータカン構造を有するタンパク質の３つの鎖に広がっている。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーのアミノ酸配列は、配列番号１０４〜１０５および１１３〜１５９からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の類似性を有し得る。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーのアミノ酸配列は、配列番号１０５からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の類似性を有し得る。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーのアミノ酸配列は、配列番号１０４〜１０５および１１３〜１５９からなる群から選択される配列に従う。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーのアミノ酸配列は、配列番号１０５に対して少なくとも９０％の類似性を有し得る。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーのアミノ酸配列は、配列番号１０５からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の類似性を有し得る。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーのアミノ酸配列は配列番号１０５に従う。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーを、カルシウムイオン、鉛イオン、ガドリニウムイオン、ランタンイオン、テルビウムイオン、アンチモンイオン、ストロンチウムイオン、水銀イオン、およびカドミウムイオンからなる群から選択される金属イオンに結合させることができる。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、分析物センサーを、カルシウムイオンからなる群から選択される金属イオンに結合させることができる。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーは、細胞の小胞体または筋小胞体を選択的にターゲティングするためのターゲティングモチーフさらに含んでよい。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーは、それに結合した分析物の存在下で蛍光シグナルを放出し、その蛍光シグナルにより分析物と分析物センサーとの結合が示される。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物センサーは、分析物の不在下で第１の蛍光シグナルを放出することができ、分析物センサーに結合した分析物の存在下で第２の蛍光シグナルを放出することができ、第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルとが区別できる状態で検出可能である。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、センサーは可溶化されている。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、センサーは固体表面に付着している。
本開示の別の態様は、試験試料において分析物を検出するために配合することができる分析物センサーの一実施形態を含む組成物の実施形態を包含する。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、組成物は、動物またはヒト宿主の組織または細胞において分析物を検出するために配合することができる。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、組成物は、単離された細胞もしくは組織において、または培養細胞もしくは培養組織において分析物を検出するために配合することができる。
本開示のこの態様の実施形態では、組成物は、液体において分析物を検出するために配合することができる。
本開示のこの態様の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。
本開示のさらに別の態様は、本開示による分析物センサーおよび分析物センサーにより分析物を検出するために分析物センサーを使用するための説明書を含むパッケージを含むキットの実施形態を包含する。
本開示のさらに別の態様は、分析物を検出するための方法であって、（ｉ）本開示による分析物センサーを用意するステップと、（ｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料を用意するステップと、（ｉｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料の不在下で分析物センサーにより放出される第１の蛍光シグナルを検出するステップと、（ｉｖ）分析物センサーを試験試料と接触させるステップと、（ｖ）試験試料と接触している分析物センサーにより放出される第２の蛍光シグナルを検出するステップと、（ｖｉ）第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルを比較するステップであって、シグナルのレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示されるステップとを含む方法の実施形態を包含する。
本開示のさらに別の態様は、分析物を検出するための方法であって、（ｉ）本開示による分析物センサーを用意するステップと、（ｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料を用意するステップと、（ｉｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料の不在下で分析物センサーに由来する第１の吸収シグナルを検出するステップと、（ｉｖ）分析物センサーを試験試料と接触させるステップと、（ｖ）試験試料と接触している分析物センサーに由来する第２の吸収シグナルを検出するステップと、（ｖｉ）第１の吸収シグナルと第２の吸収シグナルを比較するステップであって、吸収シグナルのレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示されるステップとを含む方法の実施形態を包含する。
本開示のさらに別の態様は、分析物を検出するための方法であって、（ｉ）本開示による分析物センサーを用意するステップと、（ｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料を用意するステップと、（ｉｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料の不在下で分析物センサーにより放出される第１の蛍光シグナルを検出するステップと、（ｉｖ）分析物センサーを試験試料と接触させるステップと、（ｖ）試験試料と接触している分析物センサーにより放出される第２の蛍光シグナルを検出するステップと、（ｖｉ）第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルを比較するステップであって、シグナルの寿命のレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示されるステップとを含む方法の実施形態を包含する。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、分析物の不在下での第１の蛍光シグナルはゼロ放出である。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルは波長が異なり、波長の違い、および任意選択でその強度の違いにより、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示される。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルの強度が異なり、強度の違いにより、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示される。
本開示のこの態様の実施形態では、シグナルの強度のレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物の定量的測定がもたらされる。
本開示のこの態様の実施形態では、吸収におけるシグナルの強度のレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物の定量的測定がもたらされる。
本開示のこの態様の実施形態では、寿命シグナルの変化により、試験試料中の分析物の定量的測定がもたらされる。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、分析物は、カルシウムイオン、鉛イオン、ガドリニウムイオン、ランタンイオン、テルビウムイオン、アンチモンイオン、ストロンチウムイオン、水銀イオン、およびカドミウムイオンからなる群から選択される金属イオンである。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、試験試料は、動物もしくはヒト対象の細胞もしくは組織、または動物もしくはヒト対象から単離された細胞もしくは組織である。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、該方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する。
本開示の別の態様は、本開示による分析物センサーをコードする組換え核酸の実施形態を包含する。
本開示のこの態様の実施形態では、組換え核酸は、ベクター核酸配列をさらに含んでよい。
本開示の別の態様は、本開示による組換え核酸を含む遺伝子改変細胞の実施形態を包含する。
本開示のこの態様の実施形態では、細胞は、組換え核酸によりコードされる分析物センサーを発現する。
本開示のこの態様の実施形態では、細胞において発現される分析物センサーにより検出可能な蛍光シグナル、吸収シグナル、および／または寿命の変化がもたらされ得、前記シグナルにより、細胞中の分析物の定性的または定量的指標がもたらされる。
本開示の別の態様は、分析物の細胞活性を特徴付けるための方法であって、（ｉ）請求項１に記載の分析物センサーを発現する組換え核酸を含む遺伝子改変細胞を用意するステップと、（ｉｉ）遺伝子改変細胞において分析物センサーを発現させ、分析物センサーから生じるシグナルを測定するステップと、（ｉｉｉ）分析物センサーにより放出される第１の蛍光シグナルを検出するステップと、（ｉｖ）細胞において生理的事象が誘導された後に分析物センサーにより放出される第２の蛍光シグナルを検出するステップと、（ｖ）第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルを比較するステップであって、シグナルのレシオメトリック変化により、細胞における生理的事象に関連する細胞における分析物のレベルの変化が示されるステップとを含む方法の実施形態を包含する。
本開示の別の態様は、分析物の細胞活性を特徴付けるための方法であって、（ｉ）本開示による分析物センサーを発現する組換え核酸を含む遺伝子改変細胞を用意するステップと、（ｉｉ）遺伝子改変細胞において分析物センサーを発現させ、分析物センサーから生じるシグナルを測定するステップと、（ｉｉｉ）分析物センサーにより放出される第１の吸収シグナルを検出するステップと、（ｉｖ）細胞において生理的事象が誘導された後に、分析物センサーにより放出される第２の吸収シグナルを検出するステップと、（ｖ）第１の吸収シグナルと第２の吸収シグナルを比較するステップであって、吸収シグナルのレシオメトリック変化により、細胞における生理的事象に関連する細胞における分析物のレベルの変化が示されるステップとを含む方法の実施形態を包含する。
本開示の別の態様は、分析物の細胞活性を特徴付けるための方法であって、（ｉ）本開示による分析物センサーを発現する組換え核酸を含む遺伝子改変細胞を用意するステップと、（ｉｉ）遺伝子改変細胞において分析物センサーを発現させ、分析物センサーから生じるシグナルを測定するステップと、（ｉｉｉ）分析物センサーにより放出される第１の蛍光シグナルを検出するステップと、（ｉｖ）細胞において生理的事象が誘導された後に分析物センサーにより放出される第２の蛍光シグナルまたは吸収シグナルを検出するステップと、（ｖ）第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルを比較するステップであって、シグナルの寿命のレシオメトリック変化により、細胞における生理的事象に関連する細胞における分析物のレベルの変化が示されるステップとを含む方法の実施形態を包含する。本開示のこの態様の実施形態では、遺伝子改変細胞は、単離された遺伝子改変細胞である。
本開示のこの態様の実施形態では、分析物は、カルシウムイオン、鉛イオン、ガドリニウムイオン、ランタンイオン、テルビウムイオン、アンチモンイオン、ストロンチウムイオン、水銀イオン、およびカドミウムイオンからなる群から選択される金属イオンである。
本開示のこの態様のいくつかの実施形態では、分析物はカルシウムイオンである。
以下の実施例は、どのように方法を実施し、本明細書において開示され、特許請求されている組成物および化合物を使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示される。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための試みが行われているが、いくらかの誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別段の指定のない限り、部は重量部であり、温度は℃単位であり、圧力は、大気または大気付近の圧力である。標準の温度および圧力は、２０℃および１気圧と定義される。
比率、濃度、量、および他の数値的なデータは、本明細書では範囲形式で表され得ることに留意するべきである。そのような範囲形式は便宜上、簡潔にするために使用され、したがって、範囲の制限として明確に記載されている数値が含まれるだけでなく、その範囲内に包含される個々の数値または部分範囲もすべて、各数値および部分範囲が明確に記載されているかのように含まれるように柔軟に解釈されるべきであることが理解されるべきである。例示として、「約０．１％〜約５％」の濃度範囲は、明確に記載された濃度である約０．１ｗｔ％〜約５ｗｔ％を含むだけでなく、示されている範囲内の個々の濃度（例えば、１％、２％、３％、および４％）および部分範囲（例えば、０．５％、１．１％、２．２％、３．３％、および４．４％）も包含すると解釈されるべきである。ある実施形態では、「約」という用語は、従来の数値の有効数字による丸めを包含し得る。さらに、「約「ｘ」〜「ｙ」」という句は、「約「ｘ」〜約「ｙ」」を包含する。
（実施例１）
ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーの構築：ＣａＭ、ループ−ＩＩＩのＣａ２＋結合モチーフ（ＤＫＤＧＮＧＹＩＳＡＡＥ（配列番号１１３）およびＥＦハンドモチーフＥＥＥＩＲＥＡＦＲＶＦＤＫＤＧＮＧＹＩＳＡＡＥＬＲＨＶＭＴＮＬ（配列番号１１４））を、以前に報告されている高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）内に挿入し（本明細書に参照により組み込まれている、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１９：３６８〜３７８）、その挿入物を自動化ＤＮＡシークエンシングにより検証した。
Ｃａ２＋結合モチーフを移植したＥＧＦＰ変異体をコードするｃＤＮＡを、ＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１制限酵素部位との間に、細菌および哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。細菌発現のために、６×Ｈｉｓ−タグを有するベクターｐＥＴ２８（ａ）を利用した。哺乳動物発現のために、タンパク質をコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター内にサブクローニングした。ＥＲ保持配列、ＫＤＥＬをＣ末端に付着させ、カルレティキュリン（ＣＲｓｉｇ）のＥＲターゲティング配列、ＭＬＬＳＶＰＬＬＬＧＬＬＧＬＡＡＡＤ（配列番号１１２）を、ＰＣＲによりＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーのＮ末端に付着させた。コザックコンセンサス配列を、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現の最適な開始のためにカルレティキュリン配列のＮ末端に配置した。Ｎ末端およびＣ末端においてそれぞれ、ＣＲｓｉｇおよびＫＤＥＬシグナルペプチドを含有する、ＤｓＲｅｄ２−ＥＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、共局在化実験においてＥＲのためのマーカーとして使用した。３７℃における折り畳みを改良するために、２つのさらなる突然変異体、Ｍ１５３ＴおよびＶ１６３Ａもまた、Ｃａ２＋センサー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３１５〜３１９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２０２５〜１２０３２、それらの各々は本明細書に参照により組み込まれる）に加えた。
（実施例２）
ＥＧＦＰおよびその変異体の発現および精製：ＥＧＦＰおよびその変異体を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させた。０．２ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）とのタンパク質インキュベーションの前に、０．６より大きいＯ．Ｄ．６００まで、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で３７℃にて細胞を増殖させた。ＥＧＦＰはｉｎ ｖｉｖｏで３７℃にて減少した蛍光を呈示したので、ＥＧＦＰの可溶性の成熟形態の高レベルの発現が、３０℃にてＬＢ培養液中で培養物を一晩増殖させることにより達成された。ＥＧＦＰおよびその変異体を、細胞ペレットの超音波処理および２０分間、２２，５００×ｇでの遠心分離により精製した。Ｈｉｔｒａｐ Ｎｉ２＋キレートカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続した高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ内に上清を注入した。タンパク質は、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４および２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中のイミダゾールの勾配でカラムから溶出し、質量分析により確認した。１０ｍＭのＴｒｉｓおよび１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．４）に対する透析によりイミダゾールを除去した。
紫外・可視吸収分光法：ＥＧＦＰおよびその変異体の紫外・可視吸収スペクトルを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１６０１分光光度計を用いて決定した。タンパク質濃度を、芳香族残基（１Ｔｒｐおよび１１Ｔｙｒ）（ＴｒｐおよびＴｙｒについてそれぞれ５５００および１４９０Ｍ−１ｃｍ−１）の寄与から算出したＥＧＦＰ−ｗｔについての２１，８９０Ｍ−１ｃｍ−１のモル減衰係数を使用して２８０ｎｍでの吸光度により決定した。ＥＧＦＰ変異体の減衰係数（３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにて）を式（１）を用いて得た。
Figure 0006158087
式中、εｐはＥＧＦＰ変異体の３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおける減衰係数であり、εｐ，２８０ｎｍはＥＧＦＰ変異体の２８０ｎｍにおける減衰係数であり、Ａｐは３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおけるＥＧＦＰ変異体の吸収であり、Ａｐ，２８０ｎｍは２８０ｎｍにおけるＥＧＦＰ変異体の吸収である。ＥＧＦＰはＥＧＦＰ変異体の減衰係数の測定における基準として使用した。
蛍光分光法：ＥＧＦＰおよびその変異体の特性を、２０℃で１０ｍｍの経路長石英セルを用いる蛍光分光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を使用してモニターした。タンパク質におけるクロモフォアの蛍光スペクトルを、３９８および４９０ｎｍの励起波長をそれぞれ用いて４１０〜６００ｎｍおよび５００〜６００ｎｍの発光領域において測定した。Ｃａ２＋濃度に応じて３９８および４９０ｎｍにて励起した場合、５００〜６００ｎｍにおける発光比を利用して、式２に１：１金属結合式を適合させることにより、種々のＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーのＣａ２＋結合についての見かけの解離定数Ｋｄを算出した。
Figure 0006158087
式中、ｆはＣａ２＋結合タンパク質の画分であり、［Ｐ］Ｔは全タンパク質濃度（ｍＭ）であり、［Ｃａ］Ｔは全Ｃａ２＋濃度（ｍＭ）であり、Ｋｄはタンパク質のＣａ２＋解離定数である。Ｃａ２＋と結合したタンパク質の画分は式３に従って算出した。
Figure 0006158087
式中、Ｒｍｉｎ、Ｒ、Ｒｍａｘはそれぞれ、Ｃａ２＋を含まない、Ｃａ２＋が結合した、およびＣａ２＋が飽和したタンパク質についての蛍光発光比（３９８および４９０ｎｍで励起される）またはストップフロー分光蛍光光度計を用いて測定した振幅である。蛍光発光比（３９８および４９０ｎｍで励起される）は式４にデータを適合させることによって得た。
Figure 0006158087
式中、Ｆ（３９８ｎｍ）およびＦ（４９０ｎｍ）はそれぞれ、３９８および４９０ｎｍで励起される５００〜６００ｎｍの範囲における積分した蛍光強度である。Ｃａ２＋センサーのダイナミックレンジの値は、Ｃａ２＋が飽和した状態（Ｒｍａｘ）の３９８および４９０ｎｍで励起される蛍光発光比をＣａ２＋を含まない状態（Ｒｍｉｎ）のもので割ることにより算出した。
ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーのＣａ２＋結合についての見かけの解離定数（Ｋｄ）もまた、ローダミン−５Ｎとの競合滴定により測定した。ローダミン−５Ｎは、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４中のＣａ２＋について３１９±１３μＭのＫｄを有する蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）である。５５２ｎｍにおいて６３，０００Ｍ−１ｃｍ−１の減衰係数を使用して色素濃度を算出した。色素（１０μＭ）およびタンパク質の濃度を一定に維持することによって異なるＣａ２＋濃度による測定を実施した。５５２ｎｍで励起される１ｃｍの経路長のセルを用いて５６０〜６５０ｎｍの蛍光発光シグナルを測定した。励起および発光のスリット幅はそれぞれ２および４ｎｍに設定した。金属および２つのリガンドモデルを用いるＳｐｅｃｆｉｔ／３２（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して５６０〜６５０ｎｍのスペクトルを全体的に適合させることによって見かけの解離定数を得た。
０．１μＭのＣｕ２＋、０．１ｍＭのＺｎ２＋、１０．０ｍＭのＭｇ２＋、５．０μＭのＴｂ３＋、または５．０μＭのＬａ３＋を含む金属イオンの存在下で１．０ｍＭのＣａ２＋を用いて蛍光比Ｆ（３９８ｎｍ）／Ｆ（４９０ｎｍ）の変化をモニターすることによってＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーのＣａ２＋選択性を検査した。式５を使用して比の正規化した変化（ΔＲ）を算出した。
Figure 0006158087
式中、Ｒ０は、Ｃａ２＋の不在下でのＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーと、金属イオンとの比であり、ＲＣａは、ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーと、金属イオンの不在下での１．０ｍＭのＣａ２＋との比であり、Ｒｍｅｔａｌは、ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーと、金属イオンの存在下での１．０ｍＭのＣａ２＋との比である。式（５）をまた使用して、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、およびグルタチオン（ＧＳＨ）を含む低分子の、ＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーのＣａ２＋応答に対する効果を検査した。データを百分率として表す。
ストップフロー分光蛍光分析：ストップフロー動力学測定を、以前に記載されているように（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：２０６７〜２０７４）、２０℃にて１：１（ｖ／ｖ）比のタンパク質センサーとカルシウムを用いてＨｉ−Ｔｅｃｈ ＳＦ−６１ストップフロー分光蛍光光度計（１０ｍｍの経路長、２ｍｓ未満の不感時間）で実施した。３９８ｎｍおよびロングパス４５５ｎｍフィルタにおける励起を用いて１０ｍＭのＴｒｉｓおよび１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．４）中でＣａ２＋とＣａ−Ｇ１とを混合することによりＣａ−Ｇ１に対するＣａ２＋の結合に関連する蛍光発光変化を決定した。Ｃａ２＋の濃度は０〜１０ｍＭの範囲であった。１０ｍＭのＴｒｉｓおよび１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．４）中のＣａ２＋を予め負荷したＣａ−Ｇ１と同じ緩衝液との混合時に、Ｃａ−Ｇ１からのＣａ２＋の解離に関連する蛍光発光変化を測定した。全体として、各点について６回の繰り返し測定を実施し、最後の３回を適合させて、観察比、ｋｏｂｓを得た。式６に示した単一指数関数に従ってストップフロートレースを適合することによって、各Ｃａ２＋濃度についてのｋｏｂｓを得た。
Figure 0006158087
式中、Ｆｔは任意のストップフロー時間における蛍光強度であり、Ｆ０は開始蛍光強度であり、Ａｍｐは所与のＣａ２＋濃度におけるプロセスの終わりの蛍光シグナルの最終値であり、ｋｏｂｓは、蛍光変化（ｓ−１）の観察比であり、ｔは反応時間（ｓ）である。測定は典型的に繰り返し実験の間で１％未満だけ異なった。
（実施例３）
細胞培養およびトランスフェクション：ＢＨＫ−２１細胞およびＨｅＬａ細胞の両方を、加湿インキュベーションチャンバー中で５％のＣＯ２を用いて３７℃にて、４４ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．２を有し、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）入りの１００ｍｍ培養ディッシュまたは３５ｍｍ培養ディッシュ中のガラスのカバースリップ（０．５〜１．０×１０６細胞／ディッシュ）で増殖させた。Ｃａ２＋センサープラスミド構築物を用いた一過性トランスフェクションの前に、細胞を播種し、一晩増殖させた。
トランスフェクションのために使用したプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮミニプレッププロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して形質転換した大腸菌（ＤＨ５α）から回収した。ＧＦＰ変異体の各々を、製造業者の指示書により、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＢＨＫ−２１およびＨｅＬａ細胞内に個々にかつ一過性にトランスフェクトした。１：１から１：３（μｇ／μｌ）の間のＤＮＡ対Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの比を用いてプラスミドＤＮＡ（２μｇ）を典型的なトランスフェクションにおいて全体的に使用した。３７℃にて４時間のインキュベーション後、ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を含有する培地を除去し、ＦＢＳおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを豊富に有するＤＭＥＭと交換した。次いで蛍光または共焦点顕微鏡画像化前に、３０または３７℃にて５％のＣＯ２を用いて加湿チャンバー内で細胞を１〜３日間増殖させた。
（実施例４）
共焦点顕微鏡画像化：１００×油浸対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ、Ｆｌｕａｒ、１．３０ｎ．ａ．）を使用するＬＳＭ５１０レーザ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）での生の画像化実験のために、ＢＨＫ−２１細胞およびＨｅＬａ細胞を、ＤＭＥＭから、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１ｍＭのＥＧＴＡ、およびｐＨ７．２を有する、二価カチオンを有さないハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ（−−）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）培地に移した。画像化前に、細胞および緩衝液を周囲温度にもたらし、室内の空気と平衡化した。ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーの局在化を、４８８ｎｍラインのアルゴンレーザを用いたＥＧＦＰの励起により可視化し、最も狭いバンドパスフィルタ（５０５〜５３０ｎｍ）を発光のために利用した。５４３ｎｍラインのＨｅ−Ｎｅレーザを用いてＤｓＲｅｄ２−ＥＲを励起し、ロングパスフィルタ（５６０ｎｍ超の発光）により発光を検出した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、画像収集パラメータを制御した。高解像度（１０２４×１０２４）ですべての画像を獲得した。
（実施例５）
蛍光顕微鏡画像化およびその定量化：ＢＨＫ−２１細胞を、ＧＦＰ変異体でのトランスフェクションの１〜３日後に画像化した。二重励起能力を用いてＭｅｔａｆｌｕｏｒソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ）を作動しているＮｉｋｏｎ ＴＥ２００顕微鏡を細胞画像化実験のために使用した。３８５ｎｍおよび４８０ｎｍの励起波長に応答するＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサー（５１０ｎｍにて測定した）の蛍光発光の比を測定して、時系列実験において［Ｃａ２＋］ＥＲの変化をモニターした。式７に従ってＢＨＫ−２１細胞における［Ｃａ２＋］ＥＲを定量した。
Figure 0006158087
式中、Ｒは開始状態における３８５ｎｍ／４８０ｎｍ励起についての蛍光発光比（５１０ｎｍにおいて測定した）であり、ＲｍｉｎはＣａ２＋を含まない状態において決定した発光比の最小であり、ＲｍａｘはＣａ２＋が飽和した状態における発光比の最大であり、Ｋｄは見かけの解離定数（ｍＭ）であり、ｎはヒル係数（ｎ＝１）である。Ｃａ２＋を含まない、およびＣａ２＋が飽和した状態をそれぞれ、５μＭのイオノマイシンで処理した細胞で得て、１．０ｍＭのＥＧＴＡおよび１．０ｍＭのＣａ２＋に曝露した。
（実施例６）
単一の挿入したＣａ２＋結合モチーフを用いたＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーの設計：図１は、Ｃａ２＋結合モチーフ、ＣａＭループ−ＩＩＩおよびその隣接ヘリックスの組み合わせを、以下の基準に基づいてＥＧＦＰに組み込むことにより作製したＣａ２＋センサーの設計を例示する。最初に、ＣａＭ由来のループ−ＩＩＩまたはインタクトなＥＦ−ハンドモチーフＩＩＩなどのＣａ２＋結合モチーフを使用して、ＥＧＦＰにおいてＣａ２＋結合部位を作製した。ＥＦ−ハンドモチーフにおける１２残基によりＣａ２＋をキレート化する。したがって、ＣａＭのＥＦ−モチーフのペプチド断片がいずれかのＣａＭ標的酵素と相互作用し、それにより、細胞シグナル伝達事象を妨げる可能性が低いセンサーを生成する。移植したループのＣａ２＋結合親和性を、ループおよび隣接ヘリックスにおける変化した残基を修飾することにより変化させることができ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：３７４３〜３７５０、Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：１３７６〜１３８３、それらの各々は本明細書に参照により組み込まれる）、任意の設計されたセンサーのＣａ２＋結合親和性を改変する。
３つの組み込み部位を選択した：ＥＧＦＰのループ−９内のＧｌｕ１７２−Ａｓｐ１７３（１位）、ループ−８内のＧｌｎ１５７−Ｌｙｓ１５８（２位）、およびループ−７内のＡｓｎ１４４−Ｔｙｒ１４５（３位）。隣接ヘリックスを有するかまたは有さないＣａＭのループ−ＩＩＩを、Ｃａ２＋結合モチーフとして使用し、ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーを構築するために３つの位置に移植した（図１Ａ）。次に、突然変異体Ｍ１５３ＴおよびＶ１６３Ａを構築物Ｃａ−Ｇ１内に挿入して、３７℃にて改良した発現によりセンサーを作製した（Ｃａ−Ｇ１−３７）（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３１５〜３１９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２０２５〜１２０３２、それらの各々は本明細書に参照により組み込まれる）。最後に、Ｃａ−Ｇ１を哺乳動物細胞のＥＲに対して特異的に標的とする、ＥＲターゲティング配列および保持配列の両方を有する構築物を設計し、Ｃａ−Ｇ１−ＥＲと称する。
（実施例７）
ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーおよびＥＧＦＰの感受性位置の分光学的特性：Ｃａ２＋センサーの分光学的特性を、精製したタンパク質（ｐＨ７．４）を使用して最初に調べた。図２Ａおよび２Ｂは、ＥＧＦＰ−ｗｔおよび異なるＣａ２＋センサー構築物の可視吸光度および蛍光発光スペクトルを示す。Ｃａ２＋センサーの減衰係数および量子収量を含む分光学的特性を表３に要約する。
Figure 0006158087
ＥＧＦＰ（Ｃａ−Ｇ２’およびＣａ−Ｇ２（Ｃａ−Ｇ２’のみを図２Ａおよび２Ｂに示す）、図１Ａ）のＧｌｎ１５７−Ｌｙｓ１５８におけるＣａＭのループ−ＩＩＩの挿入により、吸光度強度がわずかに減少したＥＧＦＰ−ｗｔと同様の分光学的特性を有するタンパク質が得られた。４９０ｎｍにおける主要な吸光度ピークおよび３９８ｎｍにおける微小な吸光度ピークは、クロモフォアのアニオン性および中性状態の相対的集団を反映することに留意すべきである。図２Ｂは、３９８ｎｍにおける励起（中性状態）が５１０ｎｍにおける発光ピークに非常に寄与していたことを示す。
表３に示すように、Ｇｌｎ１５７−Ｌｙｓ１５８（２位）（Ｃａ−Ｇ２’およびＣａ−Ｇ２）に移植したＣａ２＋結合モチーフを有する構築物は、ＥＧＦＰ−ｗｔのものと同様の分光学的特性（３９８ｎｍおよび４９０ｎｍの両方における減衰係数および量子収量定数）を有した。ＥＧＦＰ（Ｃａ−Ｇ１’）のＧｌｕ１７２−Ａｓｐ１７３におけるＣａＭの組み込んでいるループＩＩＩにより、ＥＧＦＰ−ｗｔと比較して、３９８ｎｍにおける吸光度のわずかな増加および４９０ｎｍにおける吸光度の低下を示したタンパク質の形成が得られた。さらに、同じ位置（Ｃａ−Ｇ１）にて隣接するＥＦ−ヘリックスを含有するループＩＩＩの挿入により、３９８ｎｍにおける吸光度がさらに増加し、４９０ｎｍにおいて低下したタンパク質が得られた。Ｃａ−Ｇ１の減衰係数は、ＥＧＦＰ−ｗｔと比較して３９８ｎｍにおいて２．６倍増加し、４９０ｎｍにおいて約６０％低下した。同時に、蛍光発光の対応する増加がＣａ−Ｇ１’およびＣａ−Ｇ１の両方について観察された（図２Ｂ）。
対照的に、クロモフォアはＥＧＦＰ（Ｃａ−Ｇ３’）のＡｓｎ１４４−Ｔｙｒ１４５におけるループＩＩＩの挿入後に形成されず、細菌発現および精製したタンパク質における緑色蛍光の欠如により示された。したがって、ＥＧＦＰ内のＧｌｕ１７２−Ａｓｐ１７３におけるＣａ２＋結合モチーフの組み込みは、４９０ｎｍピークにより示されるアニオン性状態から３９８ｎｍピークにより示される中性状態までのクロモフォアの集団を著しく変化させる。ＥＧＦＰのＧｌｕ１７２−Ａｓｐ１７３はクロモフォア感受性位置の可能性がある。
Ｃａ２＋センサー構築物のクロモフォア特性の変化が構造的変化に起因するかどうかを試験するために、ＣＤ分析を実施した。すべてのＣａ２＋センサー構築物はＥＧＦＰ−ｗｔ（図７）のものと同様のＣＤスペクトルを呈示し、Ｃａ２＋結合モチーフのＥＧＦＰ内への挿入が、ＧＦＰのβ−シート構造の折り畳みを著しく変化させなかったことを示唆している。
Ｃａ−Ｇ１’の光学的特性のｐＨ感受性は、少数のＧＦＰに基づいたバイオセンサーであるので、ｐＨ感受性であると報告されている。図８Ａおよび８Ｂは、ｐＨに応じたＣａ−Ｇ１’の吸光度スペクトルを示す。９．０〜５．０までのｐＨの変化により、３９８ｎｍにおける吸光度の増加および４８８ｎｍにおける吸光度の低下が生じた。Ｃａ−Ｇ１’のｐＫａは７．４５±０．０５であるのに対して、ＥＧＦＰのｐＫａは６．０である。これらのデータは、設計したＣａ２＋センサーの光学的特性が、ＥＧＦＰ−ｗｔのものより生理学的ｐＨにおいてｐＨに対して、より感受性であることを示唆している。
（実施例８）
ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーの分光学的特性に対するＣａ２＋結合の効果：図３Ａに示すように、４９０ｎｍにおける低下と同時に起こる３９８ｎｍにおける吸光度の増加が、Ｃａ−Ｇ１−３７へのＣａ２＋の添加に応答して観察された。同様に、Ｃａ２＋結合により、３９８ｎｍにおける励起での蛍光の増加（図３Ｂ）および４９０ｎｍにおける励起での低下（図３Ｃ）が生じた。
ダイナミックレンジ値は１．８であり、Ｃａ２＋が飽和した状態（Ｒｍａｘ）の３９８および４９０ｎｍにて励起される蛍光発光比を、Ｃａ２＋を含まない状態（Ｒｍｉｎ）のもので割ることにより算出した（実験手順を参照のこと）。図３Ｄは、Ｃａ２＋濃度に応じたＣａ−Ｇ１−３７の蛍光発光比、Ｆ（３９８ｎｍ）／Ｆ（４９０ｎｍ）を示す。正規化した蛍光発光比の変化は、１：１のＣａ−Ｇ１−３７−Ｃａ２＋複合体（式２）として適合でき、そのＣａ２＋結合親和性についての見かけの解離定数（Ｋｄ＝０．４４±０．０４ｍＭ）が得られる。ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーのＣａ２＋結合親和性もまた、ローダミン−５Ｎ競合滴定アプローチを使用して決定した。これらのＣａ２＋センサーのＣａ２＋結合親和性は、異なる技術により決定されるように、０．４〜２ｍＭまで変化した（表４）。
Figure 0006158087
これらの値は、ＥＲなどの細胞コンパートメント内で見いだされたおおよそのカルシウム濃度と一致し、これらのＣａ２＋センサーを、生細胞における生理学的実験のための有望な候補にした。
（実施例９）
ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーのＣａ２＋選択性：Ｃａ２＋についての開発したＣａ２＋センサーの結合選択性を、種々の金属イオンの添加前後に、１．０ｍＭのＣａ２＋の存在下で、比Ｆ（３９８ｎｍ）／Ｆ（４９０ｎｍ）の変化を測定することにより検査した。細胞中で、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、およびＭｇ２＋についての全金属濃度をそれぞれ、約１０μＭ、約０．１ｍＭ、および１０ｍＭ超と推定する。しかしながら、これらの金属イオンの遊離レベルは全濃度より著しく低く、潜在的な毒性反応に対して細胞を保護する。例えば、細胞内遊離銅は検出されず、その標的タンパク質に直接、銅を割り当てるために銅シャペロンがｉｎ ｖｉｖｏで使用される。
図４Ａは、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｔｂ３＋、およびＬａ３＋の存在下で、センサーＣａ−Ｇ１−３７のＣａ２＋応答を示す。Ｃａ２＋についてのセンサーの蛍光応答に対するＣｕ２＋（０．１μＭ）の効果は観察されなかった（１．０ｍＭのＣａ２＋についての１００％の基準値と比較して１０１．９５±３．０２％）ことは留意すべきである。Ｚｎ２＋（０．１ｍＭ）およびＭｇ２＋（１０．０ｍＭ）は蛍光応答のわずかな変化のみを生じた（それぞれ８５．７１±３．３４％および７４．２９±１．２２％に減少）。Ｔｂ３＋（５．０μＭ）およびＬａ３＋（５．０μＭ）などの非生理学的金属イオンは、Ｃａ２＋と同様の金属配位特性を有し、センサーのＣａ２＋応答とより強力に競合できる（それぞれ０．１５±５．４％および１６．０±９．０％）。これらの結果は、開発されたＣａ２＋センサー、Ｃａ−Ｇ１−３７が、Ｃａ２＋、Ｌａ３＋およびＴｂ３＋についての十分な金属選択性を有し、他の生理学的金属イオンではより低い程度のみであることを示唆している。
ＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーのＣａ２＋応答に対する、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、およびグルタチオン（ＧＳＨ）を含む低分子の効果もまた、それらの添加前後に、１．０ｍＭのＣａ２＋の存在下で、比Ｆ（３９８ｎｍ）／Ｆ（４９０ｎｍ）の変化を測定することにより分析した。
図４Ｂは、ＡＴＰ（０．２ｍＭ）、ＡＤＰ（０．２ｍＭ）、ＧＴＰ（０．１ｍＭ）、ＧＤＰ（０．１ｍＭ）、およびＧＳＨ（１．０ｍＭ）の添加が蛍光応答のわずかな低下のみを生じたことを示す（それぞれ、８５．７５±１３．９８％、９６．１７±１．３６％、８８．３０±８．０９％、９３．２９±１．０１％、および８９．１８±２．９０％に減少）。これらの結果は、開発したＣａ２＋センサー、Ｃａ−Ｇ１−３７が、細胞内環境中でＡＴＰ、ＡＤＰ、ＧＴＰ、ＧＤＰ、およびＧＳＨを含む低分子と競合する高いＣａ２＋結合親和性を有することを示す。
（実施例１０）
ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーに対するＣａ２＋結合のカイネティクス：図５Ａに示すように、Ｃａ−Ｇ１と種々の濃度のＣａ２＋との混合により、３９８ｎｍでの励起を用いて５１０ｎｍにおいて蛍光発光の急速な増加が生じた。蛍光シグナルの変化は単一指数関数（式６）と一致し、蛍光発光変化についての観察比（ｋｏｂｓ）および振幅（Ａｍｐ）が得られる。
図５Ｂに示すように、Ｃａ−Ｇ１のｋｏｂｓ値はＣａ２＋の濃度を増加させるにつれて低下し、これはスキーム１の動力学モデルと一致し、ここでＣａ２＋は、バイオセンサーの第２の形態と平衡にあるＣａ−Ｇ１の１つの種と急速に会合する。図５Ａに示すようにＣａ２＋結合時に観察されるＣａ−Ｇ１の３９８ｎｍにおいて励起される蛍光発光の増加はさらに、Ｃａ−Ｇ１の中性形態がＣａ２＋に結合する種（スキーム１におけるＥ＊＊）であるのに対して、バイオセンサーのアニオン性形態（Ｅ＊）はＣａ２＋に結合しないことを示唆している。
この動力学モデルによれば、ｋ１はＣａ−Ｇ１の中性種へのアニオン性種の変換のための一次速度定数（ｓ−１）であり、ｋ２はＣａ−Ｇ１のアニオン性形態への中性種の変換のための一次速度定数（ｓ−１）であり、Ｋｄ２はＣａ−Ｇ１（ｍＭ）の中性形態へのＣａ２＋の結合のための見かけの解離定数を表す。
Figure 0006158087
Ｃａ２＋濃度に応じて決定したｋｏｂｓ値を式８に適合させることにより、ｋ１およびｋ２値をそれぞれ、９．５±０．３ｓ−１および１４．０±０．６ｓ−１であると推定し、０．８±０．１ｍＭのＫｄ２値を決定した。式２を使用することによりＣａ２＋の濃度に応じた蛍光発光における正規化した振幅を適合することにより、Ｋｄ２値を０．６±０．１ｍＭであると独立して推定した（図５Ｃ）。測定と関連する誤差の範囲内で、ストップフロー蛍光分光法を使用して決定したＫｄ値は、分光蛍光光度計を使用する静的滴定において独立して決定したＫｄ値と一致し、０．８±０．１ｍＭのＫｄ値を生じた（表１）。同様に、これは、Ｃａ−Ｇ１へのＣａ２＋結合についてのスキーム１の提案されている最小動力学的機構の妥当性を強力に支持し、ここでＣａ−Ｇ１の中性種へのＣａ２＋結合に関連する蛍光変化の比は、バイオセンサーへのおよびバイオセンサーからのＣａ２＋の急速な会合および解離と比較して、Ｃａ−Ｇ１の中性およびアニオン性形態の相互変換の比を反映する。
Figure 0006158087
スキーム１の最小動力学的機構および図５Ａに示したデータによれば、予め負荷したＣａ−Ｇ１からのＣａ２＋の放出は蛍光の低下と関連すると予想され、その蛍光変化の比は、Ｃａ−Ｇ１の中性からアニオン性形態への変換の遅速性、すなわちｋ２を表す。その結果として、ストップフロー分光法を利用して、等体積のＣａ２＋が飽和したセンサーと、１０ｍＭのＴｒｉｓおよび１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．４）とを混合することによりｋ２を独立して決定した。予想されるように、５１０ｎｍにおける蛍光強度はＣａ２＋放出後に低下し、蛍光変化の経時変化は単一指数プロセスと一致した（式６）。
図５Ｄに示すように、１６．９±１．０ｓ−１のｋｏｂｓ値を、データを式６に適合させることによってこの実験において推定し、図５Ｂにおけるデータからのｋ２について決定した１４ｓ−１の値と十分に一致している。同時に、速度論データは、Ｃａ２＋がＣａ−Ｇ１の中性形態と急速に会合し、それから解離し、Ｃａ−Ｇ１からの蛍光シグナルの強度の変化と関連する中性およびアニオン性種の相対量の変化を生じるという結論を支持している。
Ｃａ−Ｇ１に対するＣａ２＋結合により、そのアニオン性と中性状態との間にクロモフォアの化学平衡の急速な変化が生じる（スキーム１）。この結論は、可視吸収、蛍光発光、およびストップフロー蛍光データにより支持される。クロモフォアのアニオン性および中性状態の相互変換についての順および逆速度定数を含む、速度論および熱力学パラメータの両方、ならびにＣａ−Ｇ１へのＣａ２＋の結合についての見かけの解離定数を、ストップフロー蛍光測定を使用して決定した。このアプローチにより、センサーへのおよびセンサーからのＣａ２＋会合および解離の比が、約１０から約２０ｓ−１の間である、クロモフォアの化学平衡を規定する順および逆一次速度定数（スキーム１におけるｋ１およびｋ２）の両方より著しく高くなければならないことが証明された。タンパク質に対するＣａ２＋会合の速度は一般に、１×１０６Ｍ−１ｓ−１と等しいか、またはそれより大きいオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋｏｎ）を有する拡散律速プロセスである。Ｃａ−Ｇ１についてのこの研究において決定したＣａ２＋結合プロセスについての見かけの解離定数はＣａ−Ｇ１について約０．８ｍＭであるため、約８００ｓ−１のオフ速度（ｋｏｆｆ）がｋｏｆｆ＝ｋｏｎ×Ｋｄから推定できる。ＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーのオン速度は一般に、Ｃａ２＋測定における要因を制限しないのに対して、Ｃａ２＋センサーにより呈示される遅いオフ速度は、特に速いＣａ２＋振動について、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣａ２＋濃度の変化をモニターする際にそれらの有用性を制限する。この制限を克服するために、２５６ｓ−１へのオフ速度定数ｋｏｆｆの改良を、ＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーにおいてカルモジュリンとそのターゲティングペプチドとの間の結合界面を再設計することにより得た。ＧＦＰに基づいたＣａ２＋センサーにおいてクロモフォアのプロトン化速度を最適化することにより、高時間分解能を用いてＣａ２＋シグナルを測定できる、さらなる精度を向上させる手段が提供されるだろう。
（実施例１１）
細胞におけるＥＲ Ｃａ２＋応答のモニタリング：Ｃａ２＋センサー、Ｃａ−Ｇ１−ＥＲの局在化を、哺乳動物細胞においてこの領域にだけ局在化することが示されているＥＲマーカーＤｓＲｅｄ２−ＥＲを細胞に共トランスフェクトすることによりＨｅＬａ細胞において確認した。図６は、４８８および５４３ｎｍにおいてそれぞれ励起された緑色（Ａ、Ｃａ−Ｇ１−ＥＲ）および赤色（Ｂ、ＤｓＲｅｄ２−ＥＲ）チャネルを通して撮った画像を示す。融合した画像（図６Ｃ）は、ＨｅＬａ細胞のＥＲにおいてＥＲマーカーＤｓＲｅｄ２−ＥＲとのＣａ−Ｇ１−ＥＲの完全な共局在化を示す。図６Ｄは、ＢＨＫ−２１細胞、哺乳動物線維芽細胞系統におけるＣａ−Ｇ１−ＥＲのＥＲ分布を示す。図６Ａおよび６ＤにおけるＣａ−Ｇ１−ＥＲの同じ粒状分布は、Ｃａ２＋センサーがまた、ＢＨＫ細胞のＥＲに特異的に局在化することを示唆していることに留意すべきである。対照的に、ＥＲシグナルペプチドを欠いているＣａ−Ｇ１は細胞の細胞質全体にわたって散在的に発現され、それにより、陰性対照（データは図示せず）としての役割を果たした。
ＢＨＫ−２１細胞は、小さな低親和性のＣａ２＋インジケータを使用することによりインタクトな細胞において［Ｃａ２＋］ＥＲの生理学的役割を調べるために以前に使用されている。ＡＴＰ（１００μＭ）は、この細胞種のＣａ２＋動員アゴニストであり、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３媒介性経路を通してＥＲからのＣａ２＋放出を引き起こす。図６Ｅに示すように、ＡＴＰ（１００μＭ）の添加により、５１０ｎｍ（３８５および４８０ｎｍにおける励起）において測定した蛍光比の著しい低下（７．３±０．６％の相対変化）が生じた。その実験は同じ実験において画像化した５個の代表的な細胞を示し、その結果は５回の独立した実験において得た典型的な結果である。［Ｃａ２＋］ＥＲのこの低下はまた、Ｃａ２＋を含まない緩衝液中のＡＴＰの適用後に観察され、ＡＴＰが、細胞外Ｃａ２＋から独立してＥＲからＣａ２＋を放出したことを示唆している。Ｃａ２＋保存の補充は、培地中の通常の細胞外Ｃａ２＋の存在下で数分を必要とした。同様に、Ｃａ２＋を含まない条件下でのＣａ２＋イオノフォア、イオノマイシンの添加は、低下した３８５ｎｍ／４８０ｎｍ蛍光比により示されるようにＥＲ保存を著しく空にした。［Ｃａ２＋］ＥＲの推定を得るために、式７および表１に示したＣａ−Ｇ１について０．８ｍＭのＫｄを使用してＢＨＫ−２１細胞において疑似校正を実施した（図６Ｆ）。３８５ｎｍ／４８０ｎｍ蛍光比は、Ｃａ２＋を含まない培地（ＥＧＴＡ）での洗浄およびその後のＣａ２＋を含まない培地へのイオノマイシン（約５μＭ）の添加後、最小値（Ｒｍｉｎ）まで低下した（フリーウェアプログラム「Ｂｏｕｎｄ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ」を使用して１０ｎＭ未満のＣａ２＋を含有すると推定した）。ミリモル濃度の細胞外Ｃａ２＋（約１ｍＭ）の添加により、３８５ｎｍ：４８０ｎｍ蛍光比の最大（Ｒｍａｘ）で飽和状態に近づいたプラトーを有するＣａ２＋シグナルの大きな増加が生じた。ＢＨＫ−２１細胞のＥＲの開始Ｃａ２＋濃度は式７を使用して１ｍＭ未満であると推定し、ＡＴＰ（１００μＭ）の添加により、［Ｃａ２＋］ＥＲが約０．１５ｍＭまで減少した（図６Ｆ）。予想されるように、野生型対照構築物、ＥＧＦＰ−ｗｔ−ＥＲをトランスフェクトした細胞において上記の実験プロトコールに応答する顕著な蛍光シグナルの変化は観察されなかった（データ
は図示せず）。これらの画像化実験により、生細胞におけるこの新規クラスのＣａ２＋センサーの有用性が実証され、それらの将来の適用が、Ｃａ２＋シグナル伝達およびＣａ２＋恒常性におけるＥＲの役割の調査を促進すると予測される。
（実施例１２）
変異体構築物：不連続カルシウム結合部位（Ｓ２Ｄ、Ｓ８６Ｄ、Ｌ１９４Ｅ）、サイクル３（Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ）突然変異体を有するＧＦＰ変異体ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）を、開始テンプレートとしてＥＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ、Ｆ６４Ｌ、Ｖ２２Ｌ、Ｍ２１８Ｉ、Ｈ２３１Ｌ）を用いる製造業者の指示に従って、ＰＣＲおよびターボｐｆｕ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を用いて部位特異的突然変異誘発法により作製した。
ＥＧＦＰ−Ｇ１は、ターボｐｆｕを利用するＰＣＲの数ラウンドによって挿入された連続したＥＦ−ハンドＣａ２＋結合モチーフＩＩＩを含有する。線状ＤＮＡを、製造業者の指示書に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲーションし、環状ＤＮＡを、ＤＮＡ増幅のための大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞内に形質転換した。自動化シークエンシングにより変異ＤＮＡを検証した。Ｎ末端とＣ末端との間にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を有するＥＧＦＰ変異体をコードするｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを使用する哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋内にサブクローニングした。
（実施例１３）
細菌発現および精製：ＬＢ−カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）中で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して６×Ｈｉｓ−タグを有するベクターｐｅｔ２８ａ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からタンパク質を発現させた。０．２ｍＭのＩＰＴＧを用いて０．６のＯ．Ｄ６００において発現を誘導し、細胞を遠心分離により収集する前に、発現を２１時間継続させた。これらの研究のために、誘導後、３０℃および３７℃の両方に温度を制御した。ＥＧＦＰおよびその変異体の発現を、Ｆｌｕｏ−ｓｔａｒ機器を用いて５１０ｎｍにおける蛍光強度および４８８ｎｍの励起波長でモニターした。
ニッケルを充填したＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ ５ｍＬ ＨｉＴｒａｐキレートＨＰカラムを用いてタンパク質精製を行った。２０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ８．８中で細胞ペレットを再懸濁し、超音波処理した。遠心分離により細胞残屑を除去し、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡｋｔａＰｒｉｍｅ ＦＰＬＣに接続した準備したＨｉＴｒａｐカラム上にタンパク質を負荷した。汚染タンパク質を除去するために洗浄後、イミダゾール勾配を用いて対象のタンパク質を溶出させた。透析により汚染イミダゾールを除去し、ｐＨ８．０にてＮａＣｌ勾配を用いてＨｉＴｒａｐ Ｑイオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してタンパク質をさらに精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質精製を検証した。
（実施例１４）
哺乳動物細胞培養：５％のＣＯ２加湿インキュベーションチャンバーを用いて３７℃にて、４４ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．２を有し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）入りの６０ｍｍ培養ディッシュ上でＨｅＬａ細胞を増殖させた。ＨｅＬａ細胞を、一過性トランスフェクション前にコンフルエンスまで増殖させた。
トランスフェクションのために使用したプラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮのミニプレッププロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して形質転換した大腸菌（ＤＨ５α）から回収した。９個のＧＦＰ変異体の各々を、製造業者の指示書により、Ｌｉｐｔｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＨｅＬａ細胞内に個々にかつ一過性にトランスフェクトした。典型的なトランスフェクションは、タンパク質構築物に応じて１：１から１：３（μｇ／μｌ）の間のＤＮＡ対Ｌｉｐｔｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの比を有する１または２μｇのプラスミドＤＮＡからなった。倒立落射蛍光画像化の前に、タンパク質発現を４８および７２時間進行させた。ＥＧＦＰによる対照トランスフェクションを各構築物と同じ条件で実施した。
（実施例１５）
蛍光強度の測定：３つの１ｍｌ試料を発現全体にわたる時点で収集し、１４Ｋｒｐｍで３分間、遠心分離した。ｐＨ７．４にて１ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁し、３９０および／または４６０ｎｍの励起フィルタならびに５１０ｎｍにおける発光フィルタを有するＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）プレートリーダーを使用して２００μｌを分析した。
（実施例１６）
蛍光顕微鏡検査／画像化およびその定量化：ｉｎ ｖｉｖｏでの蛍光強度スクリーニングのために倒立落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００）を利用した。顕微鏡は、標準的なＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄフィルタ、ならびに透過光を有する、３９８ｎｍ励起および５１０ｎｍ発光を用いるＳａｐｐｈｉｒｅ ＧＦＰ用のキセノンアークランプ、フィルタを備えていた。Ａｘｉｏｃａｍ５ＣＣＤカメラをステージに直角で顕微鏡に接続し、データ収集および分析のためにＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｌ４．３ソフトウェアを使用した。蛍光強度測定のために、Ｓａｐｐｈｉｒｅ ＧＦＰおよびＦＩＴＣフィルタを用いて、５０〜２０００ｍｓの露光時間で４０×乾燥対物レンズを使用した。ダイナミックレンジ内の蛍光強度を可能にする露光を用いた画像をデータ分析のために利用した。この時間範囲内で測定した蛍光強度は露光時間の線形関数であった。
トランスフェクトした細胞（ｎ＞２０個の細胞／画像）の面積および平均蛍光強度の両方を測定し、各々の画像化領域における細胞の全平均蛍光強度を、式（９）の計算により得た。
Figure 0006158087
式中、Ｆは各々の画像内で細胞の３９８ｎｍまたは４８０ｎｍにおいて励起した全平均蛍光強度であり、ｎは蛍光細胞の数である。Ｓｉはｉ番目の蛍光細胞の面積であり、Ｆｉはｉ番目の蛍光細胞の３９８ｎｍまたは４８０ｎｍにおいて励起される平均（mea）蛍光強度である。
ＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ３によるトランスフェクションの３日後に、ＨｅＬａ細胞の３９８ｎｍまたは４８０ｎｍにおいて励起される全平均蛍光強度を基準として使用し、他のＧＦＰ変異体と共に異なる時間の間増殖させたＨｅＬａ細胞の異なる波長で励起される蛍光強度を、式（１０）に従ってＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ３蛍光の百分率として表した。
Figure 0006158087
式中、Ｆ’はＨｅＬａ細胞の３９８ｎｍまたは４８０ｎｍにおいて励起される相対蛍光強度であり、ＦはＨｅＬａ細胞の３９８ｎｍまたは４８０ｎｍにおいて励起される全平均蛍光強度であり、Ｆ０は、ＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ３によるトランスフェクション後に３日間インキュベートしたＨｅＬａ細胞の３９８ｎｍまたは４８０ｎｍにおいて励起される全平均蛍光強度である。
（実施例１７）
紫外線（ＵＶ）および可視吸収スペクトルの測定：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶおよび６００〜２２０ｎｍの可視光分光光度計を用いてＵＶおよび可視吸収スペクトルによりＥＧＦＰおよびその変異体の分光学的特性を測定した。芳香族残基（１Ｔｒｐおよび１１Ｔｙｒ）（ＴｒｐおよびＴｙｒについてそれぞれ、５５００および１４９０Ｍ−１ｃｍ−１）の寄与から算出した２１，８９０Ｍ−１ｃｍ−１のモル減衰係数を使用して２８０ｎｍにおけるＵＶ−ｖｉｓ吸光度によりタンパク質の濃度を決定した。ＥＧＦＰ変異体の３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおける減衰係数を式（１１）により得た。
Figure 0006158087
式中、εｐはＥＧＦＰ変異体の３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおける減衰係数であり、εｐ，２８０ｎｍはＥＧＦＰ変異体の２８０ｎｍにおける減衰係数であり、Ａｐは３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおけるＥＧＦＰ変異体の吸収であり、Ａｐ，２８０ｎｍは２８０ｎｍにおけるＥＧＦＰ変異体の吸収である。変異体の減衰係数の測定における基準としてＥＧＦＰを使用した。
（実施例１８）
蛍光励起および発光スペクトル：ＥＧＦＰおよびその変異体の分光学的特性もまた、室温ならびに１０ｍＭのＴｒｉｓおよび１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．４）中の１μＭの濃度にて、１ｃｍの経路長の石英セルを有する蛍光分光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）において測定した、それらの蛍光スペクトルと共にモニターした。励起および発光のためにそれぞれ３ｎｍおよび５ｎｍのスリット幅を使用した。異なる励起波長を用いてＥＧＦＰ変異体の量子収量を式（１２）の計算により得た。
Figure 0006158087
式中、φｐはＥＧＦＰ変異体の３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおいて励起される相対量子収量であり、φｒは基準試料の３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおいて励起される相対量子収量であり、Ａｐは３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおけるＥＧＦＰ変異体の吸収であり、Ａｒは３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおける基準試料の吸収であり、ＦｐはＥＧＦＰ変異体の３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおいて励起される５００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲における積分蛍光強度であり、Ｆｒは基準試料の３９８ｎｍまたは４９０ｎｍにおいて励起される５００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲における積分蛍光強度であり、ｎｐはＥＧＦＰ変異体の屈折率であり、ｎｒは基準試料の屈折率である。
ＥＧＦＰ変異体の量子収量の測定における基準試料としてＥＧＦＰを使用した。
（実施例１９）
統計的分析：ソフトウェアパッケージＳｕｐｅｒ ＡＮＯＶＡ（Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を用いて統計的分析を実施した。値は平均±ＳＥＭとして表した。対照および処理群を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施することにより比較した。統計的有意性のｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定のためにフィッシャーの制約付最小有意差検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ Ｌｅａｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｓｔ）（フィッシャーのＰＬＳＤ）を利用した。１日目と比較した有意水準を以下のように示す：＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。
（実施例２０）
ＥＧＦＰに基づいたカルシウム結合タンパク質の設計：２つの異なる種類のカルシウム結合部位を高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）において作製した。図９Ａは、一般的な五角両錐形状および化学特性に基づいた不連続カルシウム結合部位を含有するＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）の設計を示す（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：２０８５〜２０９３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：６１６５〜６１７１）。それを、突然変異したアミノ酸位置、Ｓ２Ｄ、Ｌ１９４Ｅ、Ｓ８６Ｄ、ならびにＤ８２およびＥ５の天然リガンドにより側鎖カルボキシル基からの５個の負荷電リガンド残基からの酸素により形成した。図９Ａはまた、ＥＧＦＰの残基Ｅ１７２とＤ１７３との間のループ９上に挿入したカルモジュリンのＥＦハンドカルシウム結合モチーフＩＩＩを組み込むことによる連続したカルシウム結合部位ＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）の操作を示す。適切な局所的カルシウム結合形状特性および荷電配置を有するようにカルシウム結合についての必要な基準を満たすことに加えて、これらのカルシウム結合部位をまた、クロモフォア形成を補助する基準に基づいて選択した：（ｉ）部位の位置および残基突然変異により、クロモフォア合成またはタンパク質の折り畳みを無効にすべきではない。蛍光タンパク質において保存され、タンパク質構造および折り畳みに必須であるいずれかの残基は突然変異されず、（ｉｉ）その位置は、カルシウム結合を可能にする十分な接近可能性を有するように溶媒に曝露された領域にあるべきであり、（ｉｉｉ）導入された荷電したカルシウムリガンド残基によるタンパク質折り畳みおよびクロモフォア形成の劇的な変化を回避するために、必要な少しの突然変異を有するカルシウム結合ポケットが好ましい。
さらなる突然変異体もまた、両方の温度における蛍光に対する折り畳み突然変異の効果を試験するために作製した。サイクル３の突然変異を、適用した突然変異に従って蛍光の相違を検査するために各々のカルシウム結合部位の２つまたは３つのセットに適用した。２つの突然変異、Ｍ１５３ＴおよびＶ１６３Ａをそれぞれ、ＥＧＦＰ−Ｄ２およびＥＧＦＰ−Ｇ１に適用して、ＥＧＦＰ−Ｄ２−Ｃ２およびＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ２（配列番号１９）構築物を作製した。最後の突然変異Ｆ９９Ｓをさらに組み込んで、Ｃ３構築物、ＥＧＦＰ−Ｄ２−Ｃ３およびＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ３（配列番号３４）を作製した。同じ突然変異体（Ｃ２およびＣ３）もまた、ＥＧＦＰ−ｗｔに適用した。
図９Ｂは修飾した移植ＥＧＦＰセンサーのモデル構造を例示する。１つのＥＦ−ハンドをＥＧＦＰの蛍光感受性位置に挿入し、ＥＧＦＰ−Ｇ１を生成した。３つの存在する負荷電残基を有するＣａ２＋結合部位を形成するために負荷電残基を導入しているベータシート表面上での部位特異的突然変異誘発。
ＥＧＦＰカルシウム結合タンパク質の細菌発現：９個のタンパク質、ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ−Ｃ２、ＥＧＦＰ−Ｃ３、ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）、ＥＧＦＰ−Ｄ２−Ｃ２、ＥＧＦＰ−Ｄ２−Ｃ３、ＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）、ＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ２（配列番号１９）、およびＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ３（配列番号３４）を、３０℃および３７℃にて細菌中で最初に発現させて、５１０ｎｍ（４９０ｎｍにおいて励起される）における蛍光強度をモニターすることによりクロモフォア成熟の相違を検査した。９個のタンパク質の平均強度を、発現全体を通して５回の時点で得た。
図１０はＩＰＴＧ誘導の２２時間後の平均蛍光強度を記載している。３０℃と３７℃の発現蛍光強度の間の相違もまた、算出した。図１０に示すように、３０℃での両方の種類のカルシウム結合部位のＥＧＦＰへの付加はクロモフォア形成を変化させない。しかしながら、細菌において発現した特性である蛍光強度は著しく減少した。
ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）およびＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）の両方の蛍光強度は、３０℃および３７℃の両方でＥＧＦＰにおいてより著しく低い。ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）におけるＣ２およびＣ３突然変異体によりそれぞれ、３０℃におけるその蛍光強度の３７倍および１８倍の増加が生じた。蛍光強度の増加（６倍および４倍）はまた、３０℃でのＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）におけるＣ２およびＣ３突然変異体でも観察された。しかしながら、同様の蛍光強度の増加は、３０℃でのＥＧＦＰにおけるＣ２およびＣ３突然変異体では観察されなかった。３０℃にてカルシウム結合部位Ｄ２およびＧ１を加えたタンパク質の５１０ｎｍにおける蛍光強度はそれぞれ３７℃におけるものよりも高かった。ＥＧＦＰはＣ２およびＣ３変異体の両方について蛍光強度の顕著な相違を有さないが、Ｄ２およびＧ１についてのＣ２構築物は驚くべきことに、Ｃ３変異体よりも増加した蛍光を呈示した。サイクル３の突然変異体を加えたタンパク質変異体ほど蛍光が低くはないが、このことは、Ｍ１５３Ｔ／Ｖ１６３Ａ構築物に適用される場合、Ｆ９９Ｓが実際にタンパク質変異体の折り畳みを妨げることを示す。
（実施例２１）
ＥＧＦＰに基づいたカルシウム結合タンパク質の哺乳動物細胞発現：哺乳動物細胞におけるＥＧＦＰカルシウムタンパク質の発現に対するＣ２およびＣ３突然変異の効果もまた、蛍光顕微鏡検査を使用してモニターした。図１１は、ＥＧＦＰ−Ｇ１、ＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ２、およびＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ３のトランスフェクション後、３０℃および３７℃での２日の発現におけるＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像化を示す。図１１Ａ〜１１Ｃに示すように、２日のトランスフェクションおよび３０℃での発現後、ＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）変異体ならびにそのＣ２およびＣ３突然変異体を、それらの強い蛍光シグナルによって示されるように多数のＨｅＬａ細胞において発現させ、折り畳んだ。しかしながら、図１１Ｄに示すように、ＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）は３７℃にてその蛍光シグナルを失い、この温度が、ＨｅＬａ細胞におけるＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）の突然変異に適切ではなかったことを示す。対照的に、ＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）中へのＣ２およびＣ３突然変異体の付加により、図１１Ｅおよび１１Ｆに示すように、ＨｅＬａ細胞中で３７℃においてタンパク質の成熟が得られた。
図１２Ａおよび１２Ｂは、３０℃および３７℃の両方にてＥＧＦＰ−Ｄ２およびＥＧＦＰ−Ｇ１シリーズの両方をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞（２０より多い細胞／画像）の蛍光強度の定量分析を示す。ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の低い蛍光強度が、ＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）のものと比較して３０℃および３７℃（図１２Ａ）の両方において観察された。ＥＧＦＰ−Ｄ２におけるＣ２突然変異体は蛍光強度の増加を生じたが、Ｃ３突然変異体においてはさらなる増加は観察されなかった。哺乳動物細胞によるこの結果は大腸菌で観察されたものと対応していた。同様の結果がまた、３７℃でのＥＧＦＰ−Ｇ１におけるＣ２突然変異体でも示されたが、ＥＧＦＰ−Ｇ１のＣ２およびＣ３突然変異の効果は、図１２Ｂに示すように、３０℃では観察されなかった。
（実施例２２）
カルシウム結合ＧＦＰの分光学的特性：この現象をさらに調査するために、タンパク質を精製した。ＥＧＦＰ−Ｄ２−Ｃ２およびＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ２（配列番号１９）は、増加した濃度のタンパク質にて親タンパク質より精製することが非常に難しく、タンパク質の折り畳みがより効果的であり、超音波処理の間に容易に放出され得る可溶性画分がより多く存在したことを示す。これにより、ＥＧＦＰ−Ｄ２−Ｃ２およびＥＧＦＰ−Ｇ１−Ｃ２（配列番号１９）が、「折り畳み突然変異体」を有さないそれらの相対物より３７倍および１９倍高い蛍光を有すると予想された。
精製したタンパク質を使用して、ＥＧＦＰに基づいたＣａ２＋結合タンパク質の分光学的特性を調べた。図１３Ａおよび１３Ｂは、ｐＨ７．４におけるＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）、およびＥＧＦＰ−Ｇ１（配列番号４）の可視吸光度および蛍光発光スペクトルを示す。
Figure 0006158087
表５は、ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ−Ｄ２、およびＥＧＦＰ−Ｇ１ならびにそれらのＣ２およびＣ３突然変異体の分光学的特性を要約する。図１３Ａに示すように、４８８ｎｍにおける主要な吸光度ピークおよび３９８ｎｍにおける微小な吸光度ピークがＥＧＦＰの可視スペクトルで現れ、クロモフォアのアニオン性状態がＥＧＦＰにおける主要形態であったことを示す。５１０ｎｍにおける蛍光発光ピークがＥＧＦＰ蛍光スペクトルにおいて観察された（図１３Ｂ）。３９８ｎｍおよび４８８ｎｍにおける減衰係数および量子収量定数の両方を含む同様の分光学的特性（表１）はＥＧＦＰ−Ｃ２およびＥＧＦＰ−Ｃ３における可視吸収スペクトルに対するＣ２およびＣ３突然変異の効果がないことを示す。３つの突然変異したリガンドＳ２Ｄ、Ｌ１９４ＥおよびＳ８６ＤならびにＥＧＦＰ（ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４））の２つの天然リガンドＤ８２およびＥ５を使用することによるＣａ２＋結合部位の形成により、図１３Ａにおいて観察されるように３９８ｎｍおよび４８８ｎｍの両方において可視吸収の低下が生じた。ＥＧＦＰと比較して、例えば、ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）の４８８ｎｍにおける減衰係数は５５，９００Ｍ−１ｃｍ−１から９，３２４Ｍ−１ｃｍ−１まで低下した。同時に、５１０ｎｍにおける蛍光発光ピークはその蛍光スペクトルが低下した（図１３Ｂ）が、ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）の量子収量はＥＧＦＰのものとほぼ同じであった。顕著なことに、ＥＧＦＰ−Ｄ２（配列番号６４）におけるＣ２およびＣ３突然変異体の両方は、ＥＧＦＰのものと同様に４８８ｎｍにおける主要な吸光度ピークおよび３９８ｎｍにおける微小な吸光度ピークを再生した（表５）。まとめると、量子収量は、両方の種類のカルシウム結合部位を有するＥＧＦＰ変異体について著しく増加するが、クロモフォアのイオン中性状態の相対分布は折り畳み突然変異体の付加により変化しなかった。
（実施例２３）
コンピュータによる設計：カルシウム結合部位の設計は、３７℃での発現を用いた野生型ＧＦＰより３０，０００倍高いその蛍光に起因して、ＧＦＰｃ３構造、１ｂ９ｃを使用した。潜在的なカルシウム結合部位を、所望の酸素−カルシウム−酸素角度、酸素−カルシウム距離、リガンド種類、およびリガンドの数を用いてコンピュータにより構築した。１つのアンカーＡｓｐおよびＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、または骨格由来の４つのさらなる潜在的なリガンドを利用した。カルシウム−酸素長さは２．０〜３．０Åの範囲であった。酸素−カルシウム−酸素角度は、理想的な五角両錐形状の理論的角度から±４５°の範囲であった（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：８２６７〜７３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：２０８５〜２０９３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：６１６５〜６１７１）。
（実施例２４）
ＧＦＰ変異体のクローニングおよび精製：部位特異的突然変異誘発法を、ｐｆｕまたはターボｐｆｕ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ならびに開始テンプレートとしてＥＧＦＰ ＤＮＡを用いて古典的ポリメラーゼ連鎖反応により実施し、フォワードプライマー配列は
Figure 0006158087
であり、リバース配列は
Figure 0006158087
である。線状ＤＮＡはＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲーションし、環状ＤＮＡは大腸菌（ＤＨ５αまたはＴｏｐ１０のいずれか）コンピテント細胞中で増幅させた。１７７ｃ３を操作するために突然変異体は、サイクル３（Ｃ３）として既知のＦ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、およびＶ１６３Ａを付加した、上記の突然変異体を含んだ。Ｆ９９Ｓフォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ、
Figure 0006158087
および
Figure 0006158087
である。Ｍ１５３ＴおよびＶ１６３Ａを、フォワードプライマー
Figure 0006158087
およびリバースプライマー
Figure 0006158087
と一緒に作製した。Ｆ９９Ｓについて６１℃および１５３／１６３について６３℃のアニーリング温度を用いて製造業者のプロトコールに従って、ターボｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を利用して突然変異を実施した。Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用いてＤＮＡを精製し、ＧＳＵコア施設において自動化シークエンシングにより環状変異体ＤＮＡを検証した。
突然変異生成の間に、および細胞質ゾル中での哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現のために、ベクターｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用した。ＥＲにおけるタンパク質の発現のために、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターを、タンパク質のＮ末端においてカルレティキュリンシグナルペプチドおよびＣ末端においてＫＤＥＬ保持配列を含有するようにＰＣＲにより修飾した。カルレティキュリン由来のＮ末端タグ、ＭＬＬＳＶＰＬＬＬＧＬＬＧＬＡＡＡＤ（配列番号１１２）は、ＥＲにおいて開始するために遺伝子の発現を命令する。Ｃ末端タグ、ＫＤＥＬは、ＥＲにおいて発現したタンパク質を保持する保持配列であり、それはゴルジにシャッフルされ得ない。Ｎ末端タグを、その長さに起因して４つのプライマーを用いて２ラウンドのＰＣＲにおいて挿入した。３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地中でｐｅｔ２８ａベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてタンパク質を６×ヒスチジンタグに融合させて発現させた。０．２ｍＭのＩＰＴＧを用いて０．６のＯＤ６００にてタンパク質発現を誘導させ、９５００ｇにて２０分間遠心分離により収集する前に、３〜４時間増殖を継続した。超音波処理により細胞を破壊した後、タンパク質を８Ｍの尿素で溶解した。変性タンパク質を緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＤＴＴ、１％のグリセロール、ｐＨ７．４）中に１０倍希釈によりリフォールディングし、遠心分離して細胞残屑を除去した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５サイズ排除ＦＰＬＣ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．３）を使用してリフォールディングしたタンパク質を９５％超の純度まで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の発現および純度を分析した。２８０ｎｍにて２１，８９０Ｍ−１ｃｍ−１の算出した減衰係数を使用してタンパク質濃度を推定した。精製のために使用したヒスチジンタグは、カルシウムおよびテルビウム結合に対するいかなる効果も有さなかった。
（実施例２５）
テルビウム蛍光：この作業における金属結合およびコンフォメーション分析研究についてのすべての緩衝液を、Ｃｈｅｌｅｘ−１００樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて前処理した。タンパク質のテルビウム結合を、２８０ｎｍにおける励起を用いて５４５ｎｍにおける発光後にＰＴＩ蛍光光度計を用いて測定した。テルビウム滴定に関して、開始タンパク質濃度は、タンパク質ＧＦＰ．Ｃａ１−３について２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１％のグリセロール、ｐＨ６．８およびＧＦＰ．Ｃａ２’’について１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＤＴＴ、１％のグリセロール、ｐＨ７．４中で３μＭであった。同じ濃度のタンパク質を含有する１．０または５．０ｍＭストックのテルビウムをタンパク質試料内に直接加えた。ブランク試料は、タンパク質を有さずテルビウムを増加させた緩衝液からなった。データは補正したベースラインであり、５４５ｎｍにおけるピークの積分面積を１：１のテルビウム：タンパク質結合を仮定することにより適合させた（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：６１６５〜６１７１）。Ｓｐｅｃｆｉｔ／３２（Ｔａｌａｎｔａ、３３、９４３）を使用してデータをまた分析した。各々の結合親和性は４〜６回の滴定の平均である。金属選択性を調査するために、２０μＭのテルビウムを有するＧＦＰ．Ｃａ１およびＧＦＰ．Ｃａ２’（３μｍ）を、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＤＴＴ、１％のグリセロール、ｐＨ７．４中の０．１および１ｍＭのカルシウム、１０ｍＭのマグネシウム、または１００μＭのランタンと共にインキュベートし、各試料のテルビウム蛍光を測定した。
（実施例２６）
カルシウム結合色素競合：タンパク質（３０または４０μＭ）およびローダミン−５Ｎ（約２０μＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９４４９〜１９４５７）を、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＤＴＴ、１％のグリセロール、ｐＨ７．４中でインキュベートした。１００ｍＭのＣａＣｌ２ストックは同じ濃度の色素を含有していた。タンパク質を混合物に徐々に加え、１ｃｍの経路長のセルおよび５５２ｎｍの励起を用いて蛍光を測定した。滴定後、６３，０００Ｍ−１ｃｍ−１の減衰係数を用いて５５２ｎｍにおける吸光度により色素濃度を検証した。金属−リガンド−リガンドモデルを用いるＳｐｅｃｆｉｔ／３２（Ｔａｌａｎｔａ、３３、９４３）を使用して５６０〜６５０ｎｍのスペクトルを全体的に適合することによりデータを分析した。
（実施例２７）
哺乳動物細胞トランスフェクション：トランスフェクトしていないＨｅＬａ細胞を、加湿インキュベーションチャンバー内で５％のＣＯ２を用いて３７℃にて、４４ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．２を有し、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ）を添加した、フィルタ滅菌したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）入りの１００ｍｍの組織培養ディッシュ上に維持した。設計したタンパク質ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化により哺乳動物細胞中で発現させるためにｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングし、続いてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした。自動化シークエンシングにより確認したＤＮＡを、６０ｍｍの細胞培養処理したディッシュ上のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、以前に調製した９０％コンフルエントのＨｅＬａ（ＨＥＫ２９３、Ｖｅｒｏ、またはＣＨＯ）細胞内にトランスフェクトした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＤＮＡ（３μｇ）を１：３比でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と混合し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地中で細胞に加える前に、暗所で室温にて２０分間平衡化させた。３７℃および５％のＣＯ２にて４時間、トランスフェクションを進行させた。トランスフェクション培地を除去し、ＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液と置き換え、３０℃、５％のＣＯ２にて７２時間、細胞を増殖させた。Ｍｏｃｋ−トランスフェクトＨｅＬａ細胞を、バックグラウンド対照に対してＤＮＡを添加せずに同じように処理した。
（実施例２８）
顕微鏡画像化：ＧＦＰ．Ｃａ１をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞をトランスフェクションの７２時間後に画像化した。細胞を有するカバースリップを、マイクロインキュベーションチャンバー（モデルＭＳＣ−ＴＤ、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）に移動させた。簡潔には、ＧＦＰ．Ｃａ１蛍光の画像化を、ＧＦＰ光学（λｅｘ４８０、λｅｍ５１０、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ、Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ、ＶＴ）のために最適化したＮｉｋｏｎフィルタブロック、励起光露光時間を調節するためのＭｅｔａｌｔｅｋフィルタホイール（Ｍｅｔａｌｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）、７５ワットのキセノンショートアークランプ、ＨａｍａｍａｔｓｕＣＣＤデジタルカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）を備え、防振台上に支持したＮｉｋｏｎ ＴＥ３００（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｃ．、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）倒立顕微鏡で実施した。画像収集のためにＭｅｔａＦｌｕｏｒソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．、ｖ３．５、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を利用した。トランスフェクション効率に応じて１〜３のゲインを用いて収集時間は５０ｍｓであった。
一過性にトランスフェクトしたＧＦＰ．Ｃａ１またはＧＦＰ．Ｃａ１ｃ３の蛍光強度を数分間モニターして、２μＭの最終濃度までの槽緩衝液（ｂａｔｈ ｂｕｆｆｅｒ）へのイオノマイシンの添加前にベースライン値を得た。蛍光強度が安定になるまで（典型的には２分間）、設計したタンパク質の蛍光を画像化し、次いで後の濃縮したＣａＣｌ２の添加により細胞内カルシウム濃度を操作して、標的とする細胞外カルシウム濃度を得た。ＣａＣｌ２の複数回添加は典型的に１分の間隔をあけた。細胞外カルシウム濃度を、ＨＢＳＳ＋＋緩衝液の槽灌流により基礎レベルに戻した。カルシウム結合部位を有さないＥＧＦＰを対照として利用した。
ＥＲにおいて発現したセンサーのカルシウム応答を試験するために、５０〜１００μＭのＡＴＰおよび１００μＭのヒスタミンを浸漬培地（ｂａｔｈｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）に添加して、ＥＲからのカルシウム放出を誘導した。ＥＲ膜を透過処理し、浸漬培地（１０〜１００ｍＭ）にカルシウムを添加してカルシウム取り込みを可能にするために、より高い濃度のイオノマイシン（２．５〜５μＭ）を利用した。タプシガルギン（１μＭ）およびカルミダゾリウム（ｃａｌｍｉｄｏｚｏｌｉｕｍ）（２μＭ）を浸漬培地に添加して、ＥＲ中のカルシウムをゆっくりと空にした。
（実施例２９）
Ｐｂ２＋およびＧｄ３＋イオンに対する高親和性および選択性を有する分析物センサーとしてのＥＧＦＰの操作した変異体の適用：毒性金属（例えば、Ｇｄ３＋、Ｌａ３＋、Ｔｂ３＋、Ｐｂ２＋、Ｓｍ３＋、Ｓｒ２＋、Ｈｇ２＋およびＣｄ２＋）は生物系と悪い相互作用を起こし得る。金属の毒性効果は広範囲に研究されているが、タンパク質との相互作用に対する毒性機構は十分に理解されていない。鉛（Ｐｂ２＋）は難分解性であり、神経学的障害、貧血症、腎損傷、高血圧症および雄の妊性低下に関連する種々の健康問題の原因となる人為的毒性金属である（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２００５）．２０：２２１〜２２８、（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｅｄ．３８：３１０〜３１５、（２００５）Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌ．Ｔｅｒａｔｏｌ．２７：２４５〜２５７、（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１７：３７〜５０、（２００１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０：１１３〜１２０、（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：７９１〜７９５、（１９８７）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１４：１９１〜２０３）。ランタニドはヒトおよび動物細胞においてカルシウムチャネルを遮断することが知られており、Ｐｂ２＋、Ｃｄ２＋、およびＨｇ２＋は電位依存性カルシウムチャネルを特異的に標的化する（（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２００３．３５：５０７〜５３２）。したがって、天然系において毒性金属を検出し、中和するため、および生物学的修復のための安価な無害の物質を開発する強い必要性が存在する。したがって、本開示は、Ｐｂ２＋およびＧｄ３＋イオンなどに対して高親和性および選択性を有する分析物センサーとしてのこの開示のＥＧＦＰの操作した変異体の適用を包含する。ＧＦＰおよびその変異体の自己蛍光により、それは、タンパク質におけるクロモフォアへの金属カチオンの近接の結果として蛍光ピークの検出可能な消光を生じる金属結合研究についての多用途のタグとなる（（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６８：４６２〜４６５）。
（実施例３０）
ＥＧＦＰに基づいたＰｂ２＋およびＬｎ３＋センサーの開発：金属結合およびプロテアーゼ研究のために設計したＥＧＦＰタンパク質変異体を、ＰＣＲを使用するサブクローニングにより開発した。６×Ｈｉｓ−タグを添加することによるＮｉ２＋−キレートセファロースカラムでの精製のためにタンパク質を調製した。これらの変異体は突然変異誘発研究のための足場を提供して、高い金属選択性を有し、プロテアーゼセンサーとしての使用のためのタンパク質変異体を提供する。ＥＭＤ Ｏｍｎｉｐｕｒトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）またはＴＲＩＳは発現タンパク質のための緩衝剤であった。
形質転換：ＥＧＦＰ変異体をコードする領域を含む組換えｐＥＴ２８ａベクターを、４２℃にて９０秒間、熱ショックにより大腸菌細胞株ＤＥ３内に形質転換した。その試料を２分間、氷上に置いた。ＬＢ培地（５０μＬ）を加え、選択的培地上に播く前に、試料を３７℃にて３０分間インキュベートした。
発現：カナマイシンを０．０３ｍｇ／ｍＬで使用した。１．０ＬのＬＢ培地培養物を、０．６±０．１のＡ６００までインキュベートし、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．２ｍＭの濃度まで加え、温度を２０〜２５℃に低下させた。１．０ｍＬの試料を３時間、１時間ごとに除去し、続いて次の日に最終試料を除去して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用してタンパク質発現を評価した。細胞を回収し、４℃で保存した。
精製：約２０ｍＬの抽出緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００）中に細胞ペレットを懸濁し、氷上に置いた。約５分間隔の超音波処理により、試料を６×３０秒間、超音波処理し、約５×１０４ｇで２０分間、遠心分離した。上清を０．４５μｍの細孔径フィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ＮＪ）を用いて濾過し、ＦＰＬＣシステムへの注入前に適切な結合緩衝液を用いて希釈した。
ＵＶ検出器および２８０ｎｍの光学フィルタを備えたＡｋｔａｐｒｉｍｅ ＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用してＥＧＦＰ変異体の精製を完了した。大部分の精製のために、Ｈｉｔｒａｐ５ｍＬのＨＰキレートセファロースカラムを使用した。結合緩衝液Ａは１ＭのＫ２ＨＰＯ４、１ＭのＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４であり、溶出緩衝液Ｂは緩衝液Ａおよび０．５Ｍのイミダゾールであった。
１００ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０を用いてカラムを最初に洗浄して、金属を除去し、蒸留水で洗浄した。次いでカラムを０．１ＭのＮｉＳＯ４で洗浄して、そのカラム上にＮｉ２＋を結合させ、そのカラムを蒸留水で再び洗浄して、未結合のＮｉＳＯ４を除去した。
さらなるタンパク質精製のために、Ｈｉｔｒａｐ Ｑイオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した。結合緩衝液Ａは２０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０であり、溶出緩衝液Ｂは２０ｍＭのＴＲＩＳ、１ＭのＮａＣｌ、およびｐＨ８．０であった。
カラム上へのタンパク質注入を５〜８ｍＬに制限し、溶出した結合タンパク質を８ｍＬ画分中で回収し、それを次いでさらに、２．０Ｌの１０ｍＭのＴＲＩＳ、１ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ７．４中で透析により精製した。タンパク質画分を、７２時間、３，５００Ｄａの分子量カットオフ値を有する透析バッグ中で透析して、イミダゾールおよび他の不純物を除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して精製を評価した。
（実施例３１）
分光学的分析：ＥＧＦＰ変異体の蛍光スペクトル分析を、タンパク質の光退色を減少させるために励起スリット幅を１ｎｍに設定して行い、発光スリット幅を２ｎｍに設定した。３９８ｎｍおよび４９０ｎｍの励起波長を使用した。蛍光光度計からのデータを１ｎｍ間隔で収集した。
Ｐｂ２＋およびＧｄ３＋に対するＥＧＦＰに基づいたセンサーの選択性を、試験金属イオンの存在下で、１．０ｍＭのＣａ２＋で得た蛍光比Ｆ（３９８ｎｍ）／Ｆ（４９０ｎｍ）の変化をモニターすることにより検査した。
金属を含まないタンパク質から金属−タンパク質複合体までのレシオメトリック変化を、各々１ｎｍ間隔で記録した強度の合計として５００〜６００ｎｍの発光スキャン（３９８ｎｍおよび４８８ｎｍ）の各々についてピーク面積を積分することにより算出し、次いで式１３に見られるように（Ｆ３９８／Ｆ４８８）の比を評価した。
Figure 0006158087
この比は、機器の変化に起因する絶対強度値に関連する起こり得る誤差を除外している。
１．０μＭのＥＧＦＰ変異体について蛍光レシオメトリック変化（Ｆ３９８／Ｆ４９０）を評価して、１０ｍＭのＴＲＩＳ−Ｃｌ、ｐＨ７．４中でＣａ２＋と、Ｐｂ２＋またはＧｄ３＋のいずれかとの間の選択性を評価した。最初に、１ｍＭのＣａ２＋をタンパク質に加え、続いて競合金属のアリコートを加えた。
競合イオンの親和性は、式１１を使用して算出したように、比（Ｆ３９８／Ｆ４９０）の変化に正比例すると仮定した。競合滴定についてのＫｅｑを算出するために、競合イオン（Ｆ）の画分についての値を評価した濃度の範囲にわたって正規化した。このＦの正規化した値（ＦＮｏｒｍ）を、式１４を用いて算出した。
Figure 0006158087
式１４において、ＦＣａ ｉｎｉｔｉａｌはＣａ２＋の添加後の初期比（Ｆ３９８／Ｆ４９０）であり、ＦＭ＋は競合金属イオンの添加の各点における比であり、ＦＭ＋ ｆｉｎａｌは最終濃度の金属における比である。曲線適合式：
Figure 0006158087
を使用して競合滴定についてのＫを算出した。式中、最後の項、（Ｃ＊［Ｍ］ｔ）は非特異的結合である。Ｐｂ２＋またはＧｄ３＋についてのＫｄを、式１５から算出したＫを用いて式１６を使用して算出し、Ｃａ２＋についてのＫｄはＥＧＦＰ−Ｃ２変異体について以前に決定したものである４４０μＭであった。
Figure 0006158087
吸光度スキャンは６００〜２２０ｎｍの範囲を包含した。
（実施例３２）
この開示の操作したＥＧＦＰ変異体の結合部位においてＧｄ３＋およびＰｂ２＋をＣａ２＋と置換する競合滴定から決定した。図１８は、Ｐｂ２＋によるＣａ２＋の置換に関連する正規化したレシオメトリック変化を示す。図１９Ａ〜Ｄは、Ｐｂ２＋によるＣａ２＋の置換、および１０μＭのＰｂ２＋付近のスペクトルの２〜３ｎｍの赤方偏移から生じる蛍光強度の変化を示す。赤方偏移は、既に起こったＣａ２＋の置換と関連しない、クロモフォアに対するコンフォメーション変化の結果であると考えられている。次いでこれらのデータを使用して、Ｇｄ３＋およびＰｂ２＋の両方についての結合親和性を算出した。
この作業で分析したＥＧＦＰ−Ｃ２変異体に関して、Ｐｂ２＋およびＧｄ３＋に対する結合親和性の両方が、Ｃａ２＋についてのものより約２００倍高いことを見いだした（図１９Ｂおよび１９Ｄ）。他のＥＧＦＰ変異体（配列番号１８および１９）に関して、Ｐｂ２＋に対する結合親和性がＣａ２＋より１００倍を超えて高いことを見いだした（図１９Ｃ）。これらのより高い親和性はこれらの金属の結合に関連するコンフォメーション変化と結び付けられ、毒性との重要な関係を示唆している。それはまた、Ｐｂ２＋およびＧｄ３＋に対して高親和性結合できるセンサーも提供する。
（実施例３３）
ＣａｔｃｈＥＲバイオセンサーファミリーの設計戦略： 蛍光タンパク質のＣａ２＋結合親和性およびＣａ２＋誘導性コンフォメーション変化および確立したクロモフォア特性の微調整に重要な決定因子に基づいて、クロモフォアコンフォメーションを調節するために伸ばしたタンパク質間の相互作用に依存するというよりむしろ、クロモフォアに直接Ｃａ２＋結合部位を結合することにより速い蛍光応答を伴うＣａ２＋センサーを設計した。
コンピュータで補助した設計は以下の基準および考慮に基づいた。（ｉ）それは、天然のＣａ２＋結合タンパク質の球状配置特性に位置するタンパク質残基（典型的に、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑのカルボキシル基）から４または５つの酸素リガンド原子を必要とする。（ｉｉ）残基変化および種類の適切な選択はＣａ２＋結合親和性および金属選択性を微調整するために選択され得る。（ｉｉｉ）部位に対するＣａ２＋の拡散律速は十分な溶媒接近可能性を必要とする。（ｉｖ）クロモフォアへのＣａ２＋誘導性、局所的コンフォメーションおよび静電的変化の伝搬は、それに対して荷電したリガンド残基を適切に位置づけることにより達成され得る。（ｖ）これらの変化は、これらのクロモフォアの原因により中性からアニオン性状態までの変換の速度より急速に起こらなければならない。（ｖ）作製した結合部位はクロモフォアの合成および形成を妨げてはならない。Ｍ１５３Ｔ／Ｖ１６３Ａ突然変異体（ＥＧＦＰサイクル２）を有するＥＧＦＰ変異体を、その高蛍光強度、折り畳み効率、および耐熱性のために、骨格タンパク質として選択した。
（実施例３４）
プラスミド構築物、タンパク質発現、および精製：ＥＧＦＰ変異体Ｄ８〜Ｄ１２のための細菌発現プラスミドを、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位との間のベクターであるｐＥＴ２８ａベクター（ＥＭＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に挿入したサイクル２ＥＧＦＰ（Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｔ／Ｍ１５３Ｔ／Ｔ１６３Ａ）において部位特異的突然変異誘発法により構築した。これらの２つの制限部位の間の設計したＥＧＦＰ変異体のＤＮＡ配列を切断し、ｐｃＤＡＮ３．１＋ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）内に挿入した。カルレティキュリンＥＲターゲティング配列（ＣＲｓｉｇ）ＭＬＬＳＶＰＬＬＬＧＬＬＧＬＡＡＡＤ（配列番号１１２）およびＥＲ保持配列ＫＤＥＬをそれぞれＮ末端およびＣ末端に加えて、哺乳動物細胞発現プラスミドを構築した。ＣａｔｃｈＥＲ（Ｄ１１）およびその変異体（Ｄ８〜Ｄ１０およびＤ１２）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において細菌で発現し、確立した方法を使用して精製した（Ｈｅｉｍ ＆ Ｔｓｉｅｎ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８〜１８２、Ｚｏｕら、（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６：１２２７５〜１２２８８）。
（実施例３５）
ＣａｔｃｈＥＲのＣａ２＋解離定数のｉｎ ｓｉｔｕ測定：ＢＨＫおよびＣ２Ｃ１２細胞中でＣａｔｃｈＥＲのＣａ２＋解離定数（Ｋｄ）を測定した。リンゲル０ Ｃａ２+緩衝液中の１００μＭのヒスタミンおよび５μＭのタプシガルギンを適用することによりＢＨＫ細胞中のＥＲ Ｃａ２＋を枯渇させた。１４０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２５を含有する細胞内様溶液中の１００μＭのジギトニン中で細胞を透過処理した。Ｃａ２＋を細胞内様溶液に添加することにより校正緩衝液を調製し、０．０５、０．１、０．５、１、５、および１０ｍＭ、ならびに２００μＭのＥＧＴＡ緩衝液の最終濃度に到達させた。Ｃａ２＋イオノフォアをそれぞれ有さない２００μＭのＥＧＴＡおよび１０ｍＭのＣａ２＋中でＦｍｉｎおよびＦｍａｘを決定した。
同様のｉｎ ｓｉｔｕでのＫｄ校正をＣ２Ｃ１２筋芽細胞中で行った。１０μＭのＩＰ３および２μＭのタプシガルギンを含有する細胞内緩衝液中で透過性細胞のＥＲ Ｃａ２＋を枯渇させた。校正のために、１、３、１０、および２０ｍＭのＣａ２＋緩衝液を５μＭのイオノマイシンの存在下で適用した。３ｍＭのＥＧＴＡおよび２０ｍＭのＣａ２＋中でそれぞれＦｍｉｎおよびＦｍａｘを決定した。
以下の式：
Figure 0006158087
に従って蛍光を正規化し、Ｋｄはヒルの式：
Figure 0006158087
により決定した。ＫｄはＢＨＫ細胞中で１．０７±０．２６ｍＭ（０．９０±０．１９ヒル係数）およびＣ２Ｃ１２細胞中で１．０９±０．２０ｍＭ（０．９４±０．１７ヒル係数）であった。
（実施例３６）
ストップフローによるＣａｔｃｈＥＲへのＣａ２＋結合の動力学的分析：細菌で発現したＣａｔｃｈＥＲの蛍光カイネティクスを、２２℃にてＳＦ−６１ストップフロー分光蛍光光度計（Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＵＫ；室温にて１０−ｍｍの経路長、２．２−ｍｓの不感時間）を使用して調べた。３９５ｎｍにおける励起を用いる４５５ｎｍのロングパスフィルタを用いて蛍光強度変化を記録した。ｐＨ７．４にて１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ中の等体積のＣａ２＋を含まないタンパク質および同じ緩衝液中のＣａ２＋をストップフロー分光蛍光光度計で混合し、１０μＭのＣａｔｃｈＥＲならびに５０、１００、２００、３００、５００、および１０００μＭのＣａ２＋の最終濃度を得た。ストップフロートレースを式１７〜１９に適合させた。式中、Ｆは任意の所与の時間における蛍光強度、Ｆ∞は無限時間における蛍光、およびΔＦは蛍光変化の振幅を示している。
Figure 0006158087
（実施例３７）
ｐＨプロファイルによる見かけのｐＫａ決定：Ｃａ２＋を含まないか、またはＣａ２＋が負荷されたＣａｔｃｈＥＲの見かけのｐＫａを、５１０ｎｍ（λｅｘ＝４８８／３９５ｎｍ）における蛍光強度変化を適合することにより細菌で発現したタンパク質を用いて決定した。５μＭのタンパク質を、１０μＭのＥＧＴＡ（アポ）または４ｍＭのＣａ２＋（ホロ）のいずれかの存在下で、４．５〜９．５の範囲のｐＨを有する異なる緩衝液中に溶解し、蛍光を測定した後に実際のｐＨを決定した。提案される相互作用スキームは
Figure 0006158087
である。Ｈ＋はプロトンであり、ＰはＣａｔｃｈＥＲタンパク質であり、ｆは正規化したΔＦ変化であり、［Ｐ］Ｔは全タンパク質濃度であり、ｃ１またはｃ２はそれぞれ、ＨＰ＋またはＰ蛍光の減衰係数であり、Ｆはリアルタイム蛍光であり、Ｆｍｉｎは最も低いｐＨにおける蛍光であり、Ｆｍａｘは最も高いｐＨにおける蛍光であり、ｃは調整のための定数である。値は理論的にｌｇｅに等しい。単一指数（式１１）により適合した見かけのｐＫａは、４８８ｎｍにおいて励起したアポおよびホロ型について、それぞれ７．５９±０．０３および６．９１±０．０３ならびに３９５ｎｍにおいて７．１４±０．０２および６．９５±０．０６であった。
（実施例３８）
Ｊｏｂのプロットにより研究したＣａｔｃｈＥＲ：Ｃａ２＋化学量論：ＣａｔｃｈＥＲおよびＣａ２＋相互作用の化学量論を、Ｊｏｂのプロット（１５）におけるＣａ２＋が結合したＣａｔｃｈＥＲの最大相対量において決定した。Ｃａ２＋を含まない、および結合した［ＣａｔｃｈＥＲ］を、式：Ｆ＝Ｓｆ・Ｃｆ＋Ｓｂ・Ｃｂ（式中、Ｆは見かけの蛍光強度であり、ＳｆおよびＳｂはそれぞれ、Ｃａ２＋を含まない、および結合したＣａｔｃｈＥＲの係数であり、ＣｆおよびＣｂはそれぞれ、Ｃａ２＋を含まない、および結合したＣａｔｃｈＥＲの濃度である）に従って蛍光強度に変換した。式（１２）を使用してＣａ２＋が結合したＣａｔｃｈＥＲ（Ｃｂ・Ｖ、Ｖ＝１）の相対量を算出した。［Ｃａ２＋］：１１．３、１６．７、２０．６、２４．９、２８．４μＭのそれぞれに応答する［ＣａｔｃｈＥＲ］：２８．７、２３．３、１９．４、１５．１、１１．６μＭを用いて蛍光発光（λｅｘ＝４８８／３９５ｎｍ）および吸光度スペクトルを記録した。
Figure 0006158087
（実施例３９）
ＮＭＲ分光法：Ｖａｒｉａｎ８００または６００ＭＨｚの分光計を使用してすべてのＮＭＲ実験を３７℃で実施した。典型的には、ＮＭＲ試料は、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＫＣｌ、１０％のＤ２Ｏ、ｐＨ７．４中で０．３ｍＭの１５Ｎ−または１３Ｃ、１５Ｎ−標識タンパク質を含有した。１Ｈ、１３Ｃ、および１５Ｎ共鳴の骨格割り当てのために、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ８００ＭＨｚ分光計でＨＮＣＡを収集し、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ６００ＭＨｚ分光計でＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨを収集し、両方は低温プローブを備えていた。Ｃａ２＋滴定のために、｛１Ｈ、１５Ｎ｝ＨＳＱＣスペクトルを収集し、化学シフト摂動を、式Δδａｖ＝｛０．５［Δδ（１ＨＮ）２＋（０．２Δδ（１５Ｎ））２］｝１／２（式中、ΔδはアポとＣａ２＋が負荷された型との間の化学シフトの変化である）を使用して算出した。共有一定時間相互相関緩和（ｓｈａｒｅｄ，ｃｏｎｓｔａｎｔ−ｔｉｍｅ，ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）（ＳＣＴ−ＣＣＲ）パルスシーケンスを使用して回転相関時間（τｃ）を測定した。この測定において、０〜約１００ｍｓの緩和取得時間において一連の高感度ＨＳＱＣスペクトルを収集した。次いで残基特異的τｃ値を指数関数的減衰率から抽出した。Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ６００ＭＨｚ分光計でＴ１およびＴ２を収集した。０、３０、６０、１００、２４０、４８０、７２０、１０００、および１５００ｍｓ（Ｔ１）ならびに１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、および１５０ｍｓ（Ｔ２）において収集したピークの積分を、Ｉ＝Ｉ０ｅｘｐ（−ｔ／Ｔ１／２）（式中、Ｉ０はゼロ減衰における強度であり、ｔは緩和減衰である）に適合させた。以下の式：
Figure 0006158087
に従ってτｃ値を算出した。
（実施例４０）
ＮＭＲによるＣａｔｃｈｅｒおよびその変異体の構造分析ならびにＸ線による検証
センサーに対するカルシウム結合の現実性は、蛍光強度とカルシウム濃度との間の関係の構築後のＮＭＲによるカルシウム滴定によりさらに証明され得る。タンパク質は凝集する傾向を有するベータシートタンパク質であるので、試料調製の条件がＮＭＲスペクトルの質に影響を与えるために非常に重要である。要因の１つはピークの崩壊（ｄｅｓｐｅｒａｔｉｏｎ）に影響を与える温度であるので、本発明者らは、５００ＭＨｚのＮＭＲにおいて異なる温度でＤ１１スペクトルの質を試験する。図３２は、ＣａｔｃｈＥＲの温度依存性のＮＭＲ ＨＳＱＣスペクトル変化を示す。
２０℃〜３７℃までの温度上昇と共にピーク数は１２８〜１９４にまで増加する。ＥＧＦＰの全アミノ酸数は２３８であるので、実験操作についての最適温度は３７℃超である。
ｇＮｈｓｑｃカルシウム滴定の前に、化学シフトをおおよそ検出するために１Ｄ ＮＭＲカルシウム滴定を操作し、側鎖は約０〜６ｐｐｍに分散することに加えて、ＮＨ基の主要な化学シフトは約６．６〜７．８ｐｐｍであり、これは側鎖ＮＨ由来であると後で証明された。８〜１１ｐｐｍの領域は、識別するのに感受性がなかったものとの膨大な数のピーク重複に起因して明確なシフトを呈示しなかった。
１Ｄ実験は、このような巨大なタンパク質を調査するには十分に効果的ではないので、各残基の化学シフトを検証するためにｇＮｈｓｑｃを行う。０．３ｍＭの濃度を有するタンパク質を１０ｍＭのｐＨ７．４のＴｒｉｓ緩衝液および１０％のＤ２Ｏ中に最終濃度で溶解する。操作温度は６００ＭＨｚのＮＭＲについて４０℃である。図３３は、Ｃａ２＋により引き起こされたＣａｔｃｈＥＲの化学シフト変化の１Ｄ ＮＭＲスペクトルを示す。
Ｄ１１が一価のカチオンに非特異的に結合できるかどうかを検証するために塩の効果を最初に検査すべきである。開始点として０．１ｍＭのＥＧＴＡを試料に加え、次いで１０ｍＭのＫＣｌで滴定して化学シフトをモニターした。これらの２つのスペクトルを重複させた後、それらは完全に一致した。これは、高濃度の塩がタンパク質のコンフォメーション変化の原因とはなり得ず、その結果、非特異的結合が存在しないことを暗示した。
Ｃａ２＋を含まないＣａｔｃｈＥＲ、Ｃａ２＋が負荷されたＣａｔｃｈＥＲのＸ線結晶構造
Ｃａ２＋を含まないＣａｔｃｈＥＲは、３９５ｎｍにおいて主要な吸収ピークおよび４９０ｎｍにおいて微小なピークを呈示し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した３９５ｎｍ対４９０ｎｍの比が３．０であるｗｔＧＦＰと同様である（Ｔａｎｇら）。Ｃａ２＋を含まないおよび負荷された形態のＣａｔｃｈＥＲの結晶構造（図３４）から、２２２の側鎖が回転して、側鎖Ｇｌｕ２２２およびＳｅｒ２０５のカルボキシル基とクロモフォアのヒドロキシル基との間の水素結合の距離を変化させた。クロモフォア周囲の提案される水素ネットワークは、ｗｔＧＦＰ（ｐｄｂコード：１ＥＭＢ）およびＥＧＦＰ（ｐｄｂコード：１ＥＭＡ）の以前に報告されている結晶構造に基づく。クラゲ由来の以前に報告されているｗｔＧＦＰは、３９０ｎｍ（主要）および４９０ｎｍ（微小）において２つの吸収ピークを有し、クロモフォアの２つの形態の混合物が１つの蛍光タンパク質中に同時に存在したことを示唆している（Ｈｅｉｍ、１９９６）。ＤＮＡ配列アラインメントからの考察だが、部位特異的突然変異誘発法Ｓ６５Ｔは大きな相違の原因であるが、しかし、ｗｔＧＦＰおよびＥＧＦＰのクロモフォアは結晶構造から十分に重複され得るが、クロモフォア周囲の側鎖は、特にＴｈｒ２０３およびＧｌｕ２２２について異なるコンフォメーションを呈示した（Ｂａｉｒｄ、１９９７）。ｗｔＧＦＰにおいて、Ｔｈｒ２０３の主鎖は、水分子を介してクロモフォアと離れて相互作用する（Ｒｅｍｉｎｔｏｎ、１９９６およびＴｓｉｅｎ、１９９８）のに対して、ＥＧＦＰについて、極性側鎖ヒドロキシル酸素はクロモフォアの酸素原子と直接相互作用し、短い水素結合２．５Ａを形成し、アニオン性形態でクロモフォアを安定化し、４９０ｎｍにおいて主要な吸収ピークを生じる。安定化はさらに、Ｅ２２２の側鎖カルボキシル基の特別な方向により高められ、負荷電残基のみがクロモフォアに対して突出し、クロモフォア内でコンジュゲートしたＥ２２２、Ｖ６１およびＴ６５の間で制限された水素ネットワークを形成する。しかしながら、ｗｔＧＦＰのＴｙｒ６６の酸素のみは、極性残基との水素結合を形成せずにＨ２Ｏと直接相互作用し、中性形態を維持し、３９５ｎｍにおける主要な吸収ピークの原因となる。Ｅ２２２のカルボキシル基の２個の酸素原子は同様に部分的に荷電し、Ｓｅｒ２０５およびクロモフォアとの水素結合を形成する。Ｔ６５およびＹ６６のヒドロキシル基の間の水素ブリッジは、Ｅ２２２、Ｓ２０５および水分子を介して形成され、クロモフォア内の極性残基の間の効果的な電子移動を確実にする。Ｅ２２２のカルボキシル基がＣａ２＋を含まない形態のＣａｔｃｈＥＲとＣａ２＋を負荷された形態のＣａｔｃｈＥＲとの間で回転し、Ｅ２２２〜Ｓ２０５のカルボキシル基とクロモフォアとの間の水素結合の距離を変化させる、結晶構造からの観察は興味深い。今まで、特に光学特性の変化と相関する、分析物結合により引き起こされたＧｌｕ２２２の回転は報告されていなかった。単一残基の回転はＦＲＥＴ対に基づいたセンサーにおける長距離のタンパク質間相互作用より速いので、Ｃａ２＋に応答するＥ２２２側鎖の回転はＣａｔｃｈＥＲの速いカイネティクスの原因となり得る可能性がある。しかしながら、Ｇｌｕ２２２のこの側鎖回転は、Ｇｄ３＋を含まないＣａｔｃｈＥＲ構造とＧｄ３＋を負荷されたＣａｔｃｈＥＲ構造とを比較した場合には観察されず（図３５）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ滴定の間のＧｄ３＋の添加後にＣａｔｃｈＥＲの蛍光強度が劇的に増加したにもかかわらず、ＧＦＰのベータ−バレル構造内部に埋もれた残基は、金属浸漬の間でさえ、結晶化後にさらなるコンフォメーションの変化を呈示しなかったことは妥当である。ＣａｔｃｈＥＲの他の重要な残基Ｔｈｒ２０３は、ｗｔＧＦＰと同様に、金属を含まない形態のＣａｔｃｈＥＲ、Ｃａ２＋が負荷された形態のＣａｔｃｈＥＲ、およびＧｄ３＋が負荷された形態のＣａｔｃｈＥＲのすべてにおいて、主鎖の酸素とクロモフォアに近接する水との間に１つの水素結合を維持し、Ｃａ２＋が負荷されたＣａｔｃｈＥＲの蛍光強度がＥＧＦＰの５０％しか回復しないという示唆は、ｗｔＧＦＰと同様に維持されるクロモフォアのＴｙｒ６６のフェノール基に近接する固定された水素結合ネットワークにおそらく起因している。

Claims (35)

  1. 複数の負荷電残基を含む金属イオン結合部位を有する工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドからなる分析物センサーであって、
    前記分析物センサーのアミノ酸配列が、配列番号１０４〜１０５および１２１〜１３９からなる群から選択される配列と一致し、
    前記負荷電残基が五角両錐形状に配向された複数のカルボキシル酸素を含み、
    工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドのクロモフォア領域と作動的に相互作用する、金属イオン結合部位が、前記形状によりもたらされ、その結果、金属イオン分析物と分子認識モチーフとが結合することにより、蛍光ホストポリペプチドにより放出される蛍光シグナルの放出、または工学的に作製された蛍光ホストポリペプチドの吸収スペクトルが調節され、
    前記金属イオン結合部位が、配列番号１０４、１２１〜１２４、および１２６〜１３９のアミノ酸配列のうちの１つのアミノ酸配列のアミノ酸位置１４７、２０２、２０４、２２３、および２２５のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置において、あるいは、配列番号１０５および１２５のうちの１つのアミノ酸配列のアミノ酸位置１６５、２２０、２２２、２４１、および２４３のうちの少なくとも２つのアミノ酸位置において、負荷電残基をもたらすアミノ酸を含み、
    配列番号１０５および１２５のアミノ酸配列からなる前記分析物センサーが、細胞の小胞体を選択的にターゲティングするためのターゲティングモチーフを含む、
    分析物センサー。
  2. 分析物センサーのアミノ酸配列が配列番号１０５の配列と一致する、請求項１に記載の分析物センサー。
  3. カルシウムイオン、鉛イオン、ガドリニウムイオン、ランタンイオン、テルビウムイオン、アンチモンイオン、ストロンチウムイオン、水銀イオン、およびカドミウムイオンからなる群から選択される金属イオンと結合する、請求項１または２に記載の分析物センサー。
  4. カルシウムイオンと結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析物センサー。
  5. 分析物センサーと結合した分析物の存在下で蛍光シグナルを放出し、その蛍光シグナルにより分析物と分析物センサーとの結合が示される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析物センサー。
  6. 分析物の不在下で第１の蛍光シグナルを放出し、分析物センサーと結合した分析物の存在下で第２の蛍光シグナルを放出し、第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルが区別できる状態で検出可能である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析物センサー。
  7. 可溶化している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析物センサー。
  8. 固体表面に付着している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析物センサー。
  9. 負荷電残基が３つの逆平行ベータシートの表面上にある、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分析物センサー。
  10. 負荷電残基がベータカン構造を有するタンパク質の３つの鎖に広がっている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分析物センサー。
  11. 試験試料において分析物を検出するために配合されている、請求項１から１０のいずれか１項に記載の分析物センサーを含む組成物。
  12. 動物宿主またはヒト宿主の組織または細胞において分析物を検出するために配合されている、請求項１１に記載の組成物。
  13. 単離された細胞もしくは組織において、または培養細胞もしくは培養組織において、分析物を検出するために配合されている、請求項１１に記載の組成物。
  14. 液体において分析物を検出するために配合されている、請求項１１に記載の組成物。
  15. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の分析物センサーと、分析物センサーにより分析物を検出するために分析物センサーを使用するための説明書を含むパッケージとを含むキット。
  17. 分析物を検出する方法であって、
    （ｉ）請求項１から１０のいずれか１項に記載の分析物センサーを用意するステップと、
    （ｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料を用意するステップと、
    （ｉｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料の不在下で分析物センサーにより放出される第１の蛍光シグナルを検出するステップと、
    （ｉｖ）分析物センサーを試験試料と接触させるステップと、
    （ｖ）試験試料と接触している分析物センサーにより放出される第２の蛍光シグナルを検出するステップと、
    （ｖｉ）第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルを比較するステップであって、シグナルのレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示されるステップ
    とを含む方法。
  18. 分析物の不在下での第１の蛍光シグナルがゼロ放出である、請求項１７に記載の方法。
  19. 第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルの波長が異なり、波長の違いと、任意選択でシグナル強度の違いとにより、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示される、請求項１７に記載の方法。
  20. 第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルの強度が異なり、強度の違いにより、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示される、請求項１７に記載の方法。
  21. シグナルの強度のレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物の定量的測定値がもたらされる、請求項２０に記載の方法。
  22. 分析物が、カルシウムイオン、鉛イオン、ガドリニウムイオン、ランタンイオン、テルビウムイオン、アンチモンイオン、ストロンチウムイオン、水銀イオン、およびカドミウムイオンからなる群から選択される金属イオンである、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 試験試料が、動物対象もしくはヒト対象の細胞もしくは組織、または動物対象もしくはヒト対象から単離された細胞もしくは組織である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 請求項１から１０のいずれか１項に記載の分析物センサーをコードする組換え核酸。
  26. ベクター核酸配列をさらに含む、請求項２５に記載の組換え核酸。
  27. 請求項２５または２６に記載の組換え核酸を含む遺伝子改変細胞。
  28. 組換え核酸によりコードされる分析物センサーを発現する、請求項２７に記載の遺伝子改変細胞。
  29. 細胞において発現した分析物センサーにより、検出可能な蛍光シグナルがもたらされ、前記シグナルにより、細胞中の分析物の定性的指標または定量的指標がもたらされる、請求項２７または２８に記載の遺伝子改変細胞。
  30. 分析物の細胞活性を特徴付けるための方法であって、
    （ｉ）請求項１から１０のいずれか１項に記載の分析物センサーを発現する組換え核酸を含む遺伝子改変細胞を用意するステップと、
    （ｉｉ）遺伝子改変細胞において分析物センサーを発現させ、分析物センサーから生じるシグナルを測定するステップと、
    （ｉｉｉ）分析物センサーにより放出される第１の蛍光シグナルを検出するステップと、
    （ｉｖ）細胞において生理的事象が誘導された後に分析物センサーにより放出される第２の蛍光シグナルを検出するステップと、
    （ｖ）第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルを比較するステップであって、シグナルのレシオメトリック変化により、細胞における生理的事象に関連する、細胞における分析物のレベルの変化が示されるステップ
    とを含む方法。
  31. 遺伝子改変細胞が、単離された遺伝子改変細胞である、請求項３０に記載の方法。
  32. 分析物が、カルシウムイオン、鉛イオン、ガドリニウムイオン、ランタンイオン、テルビウムイオン、アンチモンイオン、ストロンチウムイオン、水銀イオン、およびカドミウムイオンからなる群から選択される金属イオンである、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 分析物がカルシウムイオンである、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 分析物を検出する方法であって、
    （ｉ）請求項１から１０のいずれか１項に記載の分析物センサーを用意するステップと、
    （ｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料を用意するステップと、
    （ｉｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料の不在下で、分析物センサーに由来する第１の吸収シグナルを検出するステップと、
    （ｉｖ）分析物センサーを試験試料と接触させるステップと、
    （ｖ）試験試料と接触している分析物センサーに由来する第２の吸収シグナルを検出するステップと、
    （ｖｉ）第１の吸収シグナルと第２の吸収シグナルを比較するステップであって、吸収シグナルのレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示されるステップ
    とを含む方法。
  35. 分析物を検出する方法であって、
    （ｉ）請求項１から１０のいずれか１項に記載の分析物センサーを用意するステップと、
    （ｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料を用意するステップと、
    （ｉｉｉ）分析物センサーの分子認識モチーフに対する親和性を有する分析物を含むことが疑われる試験試料の不在下で、分析物センサーにより放出される第１の蛍光シグナルを検出するステップと、
    （ｉｖ）分析物センサーを試験試料と接触させるステップと、
    （ｖ）試験試料と接触している分析物センサーにより放出される第２の蛍光シグナルを検出するステップと、
    （ｖｉ）第１の蛍光シグナルと第２の蛍光シグナルを比較するステップであって、シグナルの寿命のレシオメトリック変化により、試験試料中の分析物が分析物センサーと相互作用していることが示されるステップ
    とを含む方法。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10852296B2 (en) 2011-12-27 2020-12-01 BiOMICom Incorporated Micro-sampling for cell, tissue, and micro-organism monitoring
JP6179918B2 (ja) * 2013-02-08 2017-08-16 三菱ケミカル株式会社 水質監視方法
CN108164591B (zh) * 2013-08-06 2022-12-20 佐治亚州立大学研究基金会公司 金属离子传感器和检测金属离子的方法
CA2951712A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Ross BEIGHLEY Automated cell culture system and corresponding methods
CN104359888B (zh) * 2014-11-26 2019-04-05 环境保护部华南环境科学研究所 一种基于镧系金属铕离子配合物探针的pH值检测方法
US10845305B1 (en) 2015-11-20 2020-11-24 Verily Life Sciences Llc Method for increasing sensor resolution by spectrally stacking responsive dyes
KR102002589B1 (ko) * 2016-07-21 2019-07-22 주식회사 올리브헬스케어 주파수 도메인 기반의 다파장 생체신호 분석 장치 및 그 방법
EP3813651B1 (en) * 2018-06-28 2023-09-06 Becton, Dickinson and Company Systems and methods for normalizing signals in blood culture measurement systems
US11643474B2 (en) 2018-08-01 2023-05-09 Kagoshima University Peptide fusion protein
WO2020204601A1 (ko) * 2019-04-05 2020-10-08 한국세라믹기술원 Csq-태그를 이용한 단백질의 발현 및 정제 방법
WO2021056188A1 (en) * 2019-09-24 2021-04-01 Peking University Electrical conductors and methods of conducting ions using calsequestrin proteins
CN112540178B (zh) * 2020-08-06 2023-12-19 武汉天德生物科技有限公司 一种检测早期老年痴呆症的免疫组化试剂盒及其使用方法
EP4363826A1 (en) * 2021-07-01 2024-05-08 NanoTemper Technologies GmbH Methods and devices for ratiometric characterization of fluorescent particles
CA3230197A1 (en) * 2021-08-25 2023-03-02 Jenny YANG Fluorescent sensor for monitoring calcium dynamics
CN113999320B (zh) * 2021-11-02 2022-09-27 深圳先进技术研究院 以cd28和4-1bb为共刺激结构域的靶向cd276的嵌合抗原受体及其应用
CN114199846B (zh) * 2021-12-15 2023-05-23 上海理工大学 一种基于肽-寡核苷酸共轭识别的铅（ii）荧光生物传感器及其应用
CN116429950B (zh) * 2023-06-07 2023-08-11 成都佩德生物医药有限公司 多肽pd-dp-005的有关物质分析方法
CN117169129B (zh) * 2023-11-02 2024-01-23 苏州市药品检验检测研究中心（苏州市药品不良反应监测中心） 一种基于液晶的组胺检测用可视化检测器

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US5952236A (en) * 1995-10-26 1999-09-14 Thompson; Richard B. Enzyme-based fluorescence biosensor for chemical analysis
JP2002253261A (ja) * 2001-03-05 2002-09-10 Inst Of Physical & Chemical Res 蛍光タンパク質
EP2284195A1 (en) 2001-09-18 2011-02-16 Carnegie Institution Of Washington Fusion proteins useful for detecting analytes
US9151767B2 (en) 2004-08-09 2015-10-06 Georgia State University Research Foundation, Inc. Analyte sensors
CA2576849C (en) * 2004-08-09 2017-09-26 Georgia State University Research Foundation, Inc. Analyte sensors and method for constructing analyte binding motifs
JP2007049943A (ja) * 2005-08-18 2007-03-01 Kyoto Univ 細胞内カルシウムイオン指示機能を有するポリペプチド
WO2008019123A2 (en) * 2006-08-04 2008-02-14 Georgia State University Research Foundation, Inc. Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity
CA2671431C (en) * 2006-12-14 2019-03-26 Georgia State University Research Foundation, Inc. Analyte sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting analyte activity
EP2020418A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fluorescent GFP variant displaying highly increased fluorescence intensity without a spectral shift
CN101520416B (zh) * 2009-04-10 2011-05-04 北京化工大学 牛血清白蛋白传感器检测、吸附水中重金属离子的方法
JP2011097930A (ja) * 2009-10-07 2011-05-19 Hokkaido Univ 光活性化生理機能センサータンパク質
CN103293689B (zh) 2013-05-31 2015-05-13 京东方科技集团股份有限公司 一种可在不同显示模式之间切换的方法和显示装置

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