CN105612426B - 金属离子传感器和检测金属离子的方法 - Google Patents

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Abstract

一种构建金属离子结合基序的方法，其通过以下进行：鉴定特异性结合金属离子的金属离子结合肽，确定编码金属离子结合肽的核酸序列的至少一部分，将编码金属离子结合肽的核酸序列修剪成金属离子结合位点，鉴定宿主蛋白和宿主蛋白的核酸序列的相关部分，将编码金属离子结合肽的修剪的核酸序列与宿主蛋白核酸序列可操作地连接成金属离子结合基序序列，并表达金属离子结合基序序列，其中修剪编码金属离子结合肽的核酸序列以便获得具有对金属离子的所需特异性的金属离子结合基序。另外，由根据该方法构建的金属离子结合基序序列编码的蛋白质。

Description

金属离子传感器和检测金属离子的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年8月6日提交的标题为“ANALYTE SENSORS,METHODS FORPREPARING AND USING SUCH SENSORS,AND METHODS OF DETECTING ANALYTE ACTIVITY”的美国临时专利申请序列号：61/862,663、于2014年1月3日提交的标题为“ANALYTE SENSORS,METHODS FOR PREPARING AND USING SUCH SENSORS,AND METHODS OF DETECTING ANALYTEACTIVITY”的美国临时专利申请序列号：61/923,252的优先权，其全文内容通过引用并入本文中。
技术领域
本公开内容涉及用于检测金属离子分析物的工程化蛋白金属离子传感器，和它们在体内和体外的使用方法，所述工程化蛋白金属离子传感器包含被工程化到荧光多肽中的金属离子结合位点。
序列表
本公开内容包括通过引入全文并入本文的序列表。
背景
钙瞬变(calcium transient)源自跨生物膜的钙浓度梯度，并且由钙结合亲和力与钙通道/泵和细胞内钙结合蛋白的动力学来确定。时空钙浓度变化导致不同的生理信号转导，包括肌肉收缩、心脏跳动、神经递质释放和基因表达等(Clapham DE(2007)Cell 131:1047-1058；Berridge等人,(1998)Nature 395:645-648；Berridge MJ(1998)Neuron 21:13-26；Bers&Guo(2005)Ann.N.Y.Acad.Sci.1047:86-98；Spitzer NC(2008)Nat.Neurosci.11:243-244)。
钙信号传导的时间尺度是多种多样的，范围从毫秒到分钟。由于经由膜电压门控钙通道的钙流入和从内部存储的钙释放，快速钙信号传导尤其与动作电位相关的快速钙信号传导，通常伴随快速局部钙上升(毫秒)发生，例如在肌肉细胞中的兴奋-收缩耦连(EC耦连)和在神经元细胞中的神经元递质释放(Berridge MJ(1998)Neuron 21:13-26；Rios&Pizarro(1991)Physiol.Rev.71:849-908；Schneider MF(1994)Ann.Rev.Physiol.56:463-484；Baylor&Hollingworth(2003)J.Physiol.551:125-138；Bean BP(2007)Nat.Revs.Neurosci.8:451-465；Locknar等人,(2004)J.Physiol.555:627-635；Sandler&Barbara(1999)J.Neurosci.19:4325-4336；Borst&Sakmann(1999)Philosoph.TransR.Soc.London.Series B,Biol.Sci.354:347-355；Lopez-Lopez等人,(1995)Science 268:1042-1045；Cannell等人,(1995)Science 268:1045-1049；Polakova等人,(2008)J.Physiol.586:3839-3854；Fill&Copello(2002)Physiol.Rev.82:893-922)。缓慢钙信号传导通常发生在诸如免疫反应的细胞事件中，这可以持续数分钟至数小时。在缓慢钙信号传导途径中，钙瞬变由几个因素和第二信使(如DAG、IP3和ATP)控制，涉及更复杂的调节机制。
为了在动力学、幅度和持续时间方面准确监测钙瞬变，需要钙指示剂具有几个关键性质。必要的是将钙指示剂的解离平衡常数Kd与102s-1数量级的亚细胞隔室的静息钙浓度匹配。为了检测来自肌肉和神经元细胞钙池(calcium pool)中的快速钙释放，在0.1-1mM范围内的钙结合亲和力和指示剂大于500s-1的钙解离速率是必要的。
基因编码的指示剂(GECI)的开发允许实时探测时空细胞事件和细胞信号传导。GECI是一个大家族，包括但不限于GCaMP、GECO、TN和Cameleon系列。它们包括荧光蛋白部分，并利用天然细胞溶质钙结合蛋白(CBP)钙调蛋白(CaM)或肌钙蛋白C(TnC)来感测钙和钙诱导的总体构象重排。每个CaM或TnC可以以协作方式结合四个钙离子，具有在细胞溶质钙变化时的高钙结合亲和力(Kd＝10-7M)并且它们的钙结合的结合速率(calcium-binding onrate)在107M-1s-1的数量级。高钙结合亲和力和结合速率使它们能够感测在细胞溶质中的直接[Ca2+]上升。
然而，可能由于与多个钙结合位点协作缔合和多层构象变化，这些GECI具有约0.1-10s-1的缓慢解离速率。信号衰减的缓慢动力学对探测生理快速钙瞬变尤其在神经元细胞和骨骼肌细胞中的快速钙瞬变不利。因此，已经作出努力以减少钙结合亲和力。一个典型的例子是Cameleon D1ER，其具有约0.8和60μM的多重Kd和约256s-1的解离速率。然而，它仍然不足够快以捕获在小鼠FDB纤维中刺激后来自肌质网(SR)的钙释放。
概述
因此，为了实现快速的钙指示剂的未满足的需要，在不通过将钙结合位点工程化到单个荧光蛋白EGFP中而掺入天然钙结合结构域的情况下，产生钙指示剂，命名为“CatchER”。钙结合化学计量为1：1，且体外Kd为0.18mM，原位校准的Kd为0.8mM，允许测量在不同细胞系中的基础钙及其响应不同药物的变化。相比Cameleon D1ER，CatchER呈现更快的动力学，使其在骨骼肌细胞中能够捕捉在SR中的钙变化。
本方法提供了通过定点诱变在可用于组织和动物成像的荧光物上创建钙结合位点来设计钙结合+生物传感器，以精确测量细胞中的实时钙离子浓度。提供了具有不同信号肽和多个数量级的结合亲和力的增强的传感器，其可以帮助检测在不同细胞类型的不同亚细胞器中对不同激动剂的Ca2+信号传导响应。
因此，本公开内容的一个方面涵盖多肽金属离子传感器的实施方案，所述多肽金属离子传感器包含具有异源金属离子结合位点的工程化红色荧光多肽(RFP)，所述异源金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，所述多个带负电荷的残基在结合至其的金属离子的存在下包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，并且其中所述金属离子结合位点与所述工程化RFP的发色团区域协作相互作用，使得当所述传感器不具有结合至其的金属离子时它发出第一荧光信号，并且当所述传感器具有结合至其的金属离子时它发出第二荧光信号，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地可检测的，并且其中所述金属离子传感器具有至少10s-1的对所述金属离子的koff值。
本公开内容的另一个方面涵盖重组核酸的实施方案，所述重组核酸具有与选自由SEQ ID NO：7-36组成的组的序列至少95％的相似性或将多肽金属离子传感器编码成选自由SEQ ID NO：41-63组成的组的氨基酸序列的核苷酸序列。
本公开内容的另一个方面涵盖多肽金属离子传感器的实施方案，所述多肽金属离子传感器包含具有异源金属离子结合位点的工程化绿色荧光多肽(GFP)，其中所述工程化GFP为具有与氨基酸序列SEQ ID NO：37至少90％相似性并具有在序列SEQ ID NO：37中并且选自由L22V、S175G及I218M组成的组的至少一个氨基酸取代的变体，并且所述工程化GFP当具有结合至其的金属离子物质时，具有与结合至相同的金属离子物质的多肽SEQ ID NO：37相比在37℃升高的荧光输出。
本公开内容的又另一个方面涵盖重组核酸的实施方案，所述重组核酸可具有与选自SEQ ID NO：65-75和79-82的序列具有至少95％的相似性的核苷酸序列。
本公开内容的又另一个方面涵盖检测生物样品中的金属离子的方法的实施方案，所述方法包括：(i)提供多肽金属离子传感器，所述多肽金属离子传感器选自：(a)具有异源金属离子结合位点的工程化红色荧光多肽(RFP)，所述异源金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，所述多个带负电荷的残基在结合至其的金属离子的存在下包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，并且其中所述金属离子结合位点与所述工程化RFP的发色团区域协作相互作用，使得当所述传感器不具有结合至其的金属离子时它发出第一荧光信号，并且当所述传感器具有结合至其的金属离子时它发出第二荧光信号，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地可检测的，并且其中所述金属离子传感器具有至少10s-1的对所述金属离子的koff值，以及(b)具有异源金属离子结合位点的工程化绿色荧光多肽(GFP)，其中所述工程化GFP为具有与氨基酸序列SEQ ID NO：37至少90％相似性并具有在序列SEQ ID NO：37中并且选自由L22V、S175G及I218M组成的组的至少一个氨基酸取代的变体，并且所述工程化GFP当具有结合至其的金属离子物质时，具有与结合至相同的金属离子物质的多肽SEQ ID NO：37相比在37℃升高的荧光输出；(ii)将所述多肽金属离子传感器或具有编码所述金属传感器的核酸序列的表达载体递送至生物样品；(iii)检测由所述传感器发出的第一荧光信号；(iii)在所述生物样品中产生生理或细胞变化；(iv)检测在步骤(iii)之后由所述传感器发出的第二荧光信号；以及(v)比较所述第一荧光信号和所述第二荧光信号，其中在所述第一荧光信号和所述第二荧光之间在波长、强度和寿命中的至少一个中的比率(ratiometric)变化指示样品中金属离子的释放速率或细胞内浓度的变化。
本公开内容的又另一个方面涵盖遗传修饰的细胞的实施方案，所述遗传修饰的细胞包含根据本公开内容的重组核酸。
附图说明
当结合附图时，本公开内容的另外的方面当查阅它的下述各种实施方案的详细描述时将更容易理解。
图1A示出mCherry(SEQ ID NO：40)的结构分析，显示了mCherry的发色团环境(PDBID 2H5Q)。
图1B示出mCherry(SEQ ID NO：40)的结构分析，显示了mCherry的发色团环境(PDBID 2H5Q)。
图1C示出从野生型mCherry(SEQ ID NO：40)至突变体RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的静电密度图。通过Delphi使用Amber力场ff99SB计算静电电位，并且通过PyMol可视化。
图1D示出了在RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)模型中的Ca2+配位氧(上图)和碳α(下图)几何学。Ca2+通过AUTODOCK-VINA.RTM和MUG.RTM对接(dock)。
图1E示出Ca2+与RapidER(MCD1)(SEQ ID NO:43)缔合的动力学分析。(上图)荧光增加的幅度是钙离子浓度的函数。插图示出在以不同的钙浓度快速混合10μM终浓度的RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)后荧光增加的停流迹线；(下图)在(a)混合20μM RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)与0.6mM Ca2+，(b)混合预装有0.6mM Ca2+的20μM MCD1(SEQ ID NO：43)与10mM EGTA，和(c)混合20μM RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)与缓冲液之后荧光变化的停流迹线。
图2A示出在不存在和存在钙的情况下，利用UV/光谱的RapidER(MCD1)(SEQ IDNO：43)的光谱特性。
图2B示出在不存在和存在钙的情况下，野生型mCherry(SEQ ID NO：40)与RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的pH曲线。
图2C示出RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)荧光寿命的测量。apo形式为在5μM EGTA存在下，并且holo形式为在5mM Ca2+存在下。10μM蛋白质样品在pH 7.4的10mM Tris中制备。
图2D示出通过荧光监测的钙滴定。插图示出在5μM EGTA和5mM Ca2+存在下的发射光谱(在587nm处激发)。所有测量中的荧光在587nm处激发并且在610nm监测发射。
图3A示出使用Tb3+作为探针以确定与RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的钙结合。解离常数为0.05±0.01mM。插图示出在不同浓度的Tb3+下的荧光光谱，这通过荧光分光光度计以282nm的激发从500至570nm来记录。
图3B示出使用Tb3+作为探针以确定与MCD15(SEQ ID NO：45)的钙结合。解离常数为0.27±0.01mM。插图示出通过荧光分光光度以282nm激发从500至570nm记录的在不同浓度的Tb3+下的荧光光谱。
图3C示出使用Tb3+-RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)发色团FRET以获取Ca2+和发色团之间的距离。在265nm处记录荧光寿命，以及在545nm处的发射。分别使用双指数和三指数方程拟合Rapidggg和Rapid的寿命。
图3D示出RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的结构模型。
图3E示出Ca2+-RapidER的结构模型。
图3F示出Ca2+-CatchER的结构模型。
图4示出在CaM中的第一EF手基序(EF-hand motif)和RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的工程化模型之间Ca2+配位氧和Cα几何学的比较。
图5A示出钙滴定迹线。在室温将钙加入到10μM RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)中。
图5B示出在pH 7.2的10mM MOPS、100mM KCl中针对x-Rhod-5F的钙滴定。通过混合10mM Ca2+-EGTA和10mM EGTA缓冲液获得钙浓度。
图5C示出通过停流荧光光谱研究的钙解离速率。通过用EGTA螯合钙，x-Rhod-5F的荧光降低，并且仅观察到平台期。
图6A和6B示出用于钙解离常数确定的平衡透析测定。
图6A示出所计算的Kd。
图6B示出计算出的钙浓度的平均值。为了比较，假设蛋白质浓度是相同的，反过来计算钙浓度。使用消光系数E280＝38.9mM-1cm-1。总蛋白野生型mCherry(SEQ ID NO：40)、MCD1(SEQ ID NO：43)、MCD14(SEQ ID NO：44)、MCD15(SEQ ID NO：45)和mcP6平衡时的浓度分别为15μM、11μM、45μM、38μM和30μM。黑色柱子表示在透析袋中的蛋白质样品，且白色柱子表示在透析袋外收集的缓冲液样品。
图7A和7B示出所计算的离子和发色团之间的距离。
图7A示出游离形式和呈FRET对的Tb3+的寿命。根据方程S1通过双指数拟合获得平均寿命。
图7B示出在Ca2+-RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的模型化结构中测量的Ca2+-发色团的距离，范围在
图8A-8D示出在瞬时转染的BHK、HeLa和C2C12细胞系中MCD15er(SEQ ID NO：42)荧光变化对药物的响应。黑色柱子表示在标准林格氏溶液中应用细胞，并且白色柱子表示药物在标准林格氏溶液中的处理。荧光迹线ΔF/F0为N个细胞的平均值。
图8A示出在瞬时转染的BHK细胞系中MCD15er(SEQ ID NO：42)荧光变化对药物的响应。
图8B示出在瞬时转染的HeLa细胞系中MCD15er(SEQ ID NO：42)荧光变化对药物的响应。
图8C示出在瞬时转染的C2C12细胞系中MCD15er(SEQ ID NO：42)荧光变化对药物的响应。
图8D为示出在C2C12细胞中感测来自内质网的Ca2+释放的MCD15(SEQ ID NO：45)的数字图像。
图9A和9B示出原位监测钙离子浓度变化。
图10A是示出对在C2C12细胞中表达的MCD15(SEQ ID NO：45)的钙离子浓度校准的图。
图10B是示出对在C2C12细胞中表达的MCD15(SEQ ID NO：45)的钙离子浓度校准的图。
图11A是示出对在HeLa细胞中表达的MCD15(SEQ ID NO：45)的钙离子浓度校准的图。
图11B是示出对在HeLa细胞中表达的MCD15(SEQ ID NO：45)的钙离子浓度校准的图。
图12A是示出对在HEK 293细胞中表达的MCD15(SEQ ID NO：45)的钙离子浓度校准的图。在粗总可溶性蛋白提取物中，HEK293细胞中表达的MCD15(SEQ ID NO：45)的表观Kd比大肠杆菌(E.coli)中表达的MCD15(SEQ ID NO：45)大2倍。
图12B是示出对在HEK 293细胞中表达的野生型mCherry(SEQ ID NO：40)的钙离子浓度校准的图。
图13是示出通过MCD15er(SEQ ID NO：40)测量的细胞内钙离子振荡期间从内质网释放的钙的测量的图。
图14是示出用MCD15er(SEQ ID NO：40)确定的在多种哺乳动物细胞中4-cmc诱导的钙离子释放的图。
图15示出本公开内容的RFP(基于mCherry)金属离子传感器的氨基酸序列比对。发色团用粗体表示。虚线表示相同氨基酸，且空白表示缺失或不存在的残基。在以下说明书和实例中更详细地描述了这些图。
图16示出本公开内容的CatchER金属离子传感器的变体的氨基酸序列比对。发色团用粗体表示。虚线表示相同氨基酸，且空白表示缺失或不存在的残基。
图17示出ER-锚定的CatchER变体的构建。(上图)Zozrato的RyR1拓扑模型。Z5和Z10结构域为选择的锚定序列。(下图)Z10-CatchER-Z5的嵌合体。
图18示出在未分化的C2C12成肌细胞中的靶向的CatchER的数字共聚焦图像。
图19示出在未分化的C2C12成肌细胞中的靶向的CatchER的数字共聚焦图像。抗GFP和抗钙联接蛋白抗体两者一起使用。与Alexa Fluor488缀合的二抗用于GFP并且与Alexa Fluor597缀合的二抗用于钙联接蛋白。在用甲醛固定之前，将25μM的最终浓度的毛地黄皂苷加入到PBS中，并孵育3分钟以透化质膜。与PBS中的0.2％Triton X-100持续5min的孵育用于破坏所有细胞膜。
图20A示出在非分化的C2C12细胞中CatFKBP对药物的响应。
ΔF/F0时程由N个细胞/ROI平均，并且标记实验事件标志物。在时程开始和结束时的荧光和明场图像在底部图中示出。
图20B示出在诱导分化的C2C12细胞中CatFKBP对药物的响应。
ΔF/F0时程由N个细胞/ROI平均，并且标记实验事件标志物。在时程开始和结束时的荧光和明场图像在底部图中示出。
图21A示出CatZ5转染至C2C12成肌细胞的钙成像。应用咖啡因、4-cmc和毛地黄皂苷，并且标记试剂加入的时间点。
图21B示出CatZ5转染至分化的C2C12细胞的钙成像。插图示出在一个不是用咖啡因处理的细胞的细胞中的4-cmc诱导的荧光变化。在成像记录开始和结束时拍摄荧光和明场图像。
图22A示出Z10Cat转染至C2C12成肌细胞的钙成像。应用咖啡因、4-cmc、离子霉素和毛地黄皂苷，并且标记时间点。荧光和明场图像在实验开始和结束时拍摄。插图示出在图片A中的荧光的时程是从其他细胞收集的数据。
图22B示出Z10Cat转染至分化的C2C12细胞的钙成像。应用咖啡因、4-cmc、离子霉素和毛地黄皂苷，并且标记时间点。荧光和明场图像在实验开始和结束时拍摄。插图示出在图片A中的荧光的时程是从其他细胞收集的数据。
图23是示出在37℃将离子霉素和钙加入到表达金属离子传感器CatchER-T的HEK293细胞的影响的图。
图24示出如使用来自胞内传感器多肽的荧光信号成像的在37℃将离子霉素和钙加入到表达金属离子传感器CatchER-T的HEK293细胞的影响。
图25是示出来自传感器变体CatchER-T(SEQ ID NO：65)的荧光信号的亮度(强度)的增加的图。
图26是示出如使用传感器CatchER-t(SEQ ID NO：65)确定的监测在细胞溶质钙振荡期间的内质网钙释放的迹线。
图27示出显示与亲本传感器CatchER-T相比，由钙传感器CatchER-T1(CatchERY39N，SEQ ID NO：72)、CatchER-T2(CatchER S30R，SEQ ID NO:73)和CatchER-T’(CatchERS30R Y39N，SEQ ID NO：74)发射的荧光的可检测的强度增加的图，CatchER-T本身能够具有比CatchER更明亮的发射。
图28示出了显示使用传感器CatchER-T’来检测用不同药物处理的C2C12细胞中钙浓度变化的一系列图。
在以下说明书和实例中更详细地描述附图。
本公开内容的方法和系统的一些示例性实施方案的细节在以下说明书中列出。当审查以下说明书、附图、实施例和权利要求时，本公开内容的其他特征、目的和优点对本领域技术人员将是明显的。预期将所有此类附加系统、方法、特征和优点包括在本说明书内，在本公开内容的范围内，并且由所附权利要求保护。
具体实施方式
在更详细地描述本公开内容之前，应理解本公开内容不局限于所描述的具体实施方案，并且因此当然可变化。还应当理解的是，本文所用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本公开内容的范围将仅由所附的权利要求限定。
当提供数值的范围时，应理解的是，除非上下文另有明确说明，在该范围的上限和下限之间的至下限的单位的十分之一的每个中间值和在规定的范围内的任何其它规定的值或中间值涵盖在本公开内容内。服从于规定的范围中任何被特定排除的界限，这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本公开内容中。在规定范围包括一个或两个界限时，排除那些所包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本公开内容中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属于的领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似或等同于本文描述的任何方法和材料也可用于本公开内容的实践或测试中，现将描述优选的方法和材料。
在本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用被并入本文，如同每个单独的出版物或专利被特别且单独地指明通过引用并入一样，并且通过引用被并入本文以公开和描述与出版物引用的方法和/或材料相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是由于其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本公开内容由于在先公开内容而不能享有先于此公开内容的权利。此外，提供的公开日期可能不同于可能需要单独确认的实际公开日期。
在阅读本公开内容时对本领域技术人员来说将明显的是，本文所描述和示出的各个实施方案中的每个具有离散的要素和特征，其可在不脱离本公开内容的范围或精神的情况下与其它几个实施方案中的任一个的特征容易地分离或组合。任何记载的方法可以以记载的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。
除非另有说明，否则本公开内容的实施方案将采用在本领域技术内的医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等的技术。此类技术在文献中充分说明。
必须指出的是，除非上下文另有明确指出，否则如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数对象。因此，例如，提及“一个支持体”包括多个支持体。在本说明书和在随后的权利要求中，引用是对应被限定为具有以下含义的一些术语作出的，除非相反意图是明显的。
除非另外指出，如本文所用的，以下术语具有赋予它们的含义。在本公开内容中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可以具有在美国专利法中赋予它们的含义，并且可以意为“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由...组成(consisting essentially of)或“基本上由...组成(consists essentially)”等，当应用至由本公开内容涵盖的方法和组合物时，是指如同本文公开的那些组合物，但其可包含附加的结构组、组合物组分或方法步骤(或如以上所讨论的其类似物或衍生物)。然而，这样的附加的结构组、组合物组分或方法步骤等与本文所公开的那些相应组合物或方法相比，并不实质上影响组合物或方法的基本和新的特征(一个或更多个)。
定义
在描述和要求保护所公开的主题中，将根据下文阐述的定义使用以下术语。在以下上下文中提供了进一步的定义。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如分子生物学领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在某些情况下，具有通常所理解的含义的术语在本文中被定义用于清楚和/或用于随时参考，并且本文中此类定义的包含不应当必然被解释为表示与本领域通常理解的实质差异。本文所描述或提及的技术和程序通常被本领域技术人员良好理解并且通常使用常规方法被利用，诸如例如在Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual第三版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.和Current Protocols inMolecular Biology(Ausbel等人编,John Wiley&Sons,Inc.2001)中描述的广泛利用的分子克隆方法。视情况而定，除非另有说明，涉及使用市售可得的试剂盒和试剂的程序通常按照制造商说明的程序和/或参数进行。
如本文所用的术语“多肽金属离子传感器”是指包括由带负电荷的氨基酸侧链和金属离子的相互作用产生的金属离子结合位点的多肽。有利的是，传感器可以结合钙和Tb3+，但本公开内容的传感器可以能够结合其它离子，最有利地二价离子。
如本文所用的术语“工程化多肽”是指已被设计成具有异源金属离子结合位点的多肽。如本文所用的术语“工程化”是指在多肽传感器(诸如荧光蛋白)的氨基酸序列中的突变的产生，以引入带负电荷的氨基酸，该带负电荷的氨基酸在多肽的折叠时形成钙结合位点，或者如果不参与该位点，产生传感器中的在非突变的亲本传感器中没有发现的有利特性。例如，但不旨在进行限制，此类有利特性可以是在发射荧光的可检测波长、荧光信号的强度、升高的温度下信号的幅度、金属离子分析物的结合和解离动力学等方面的变化。
如本文所用的术语“异源金属离子结合位点”是指工程化多肽的金属离子特异性结合位点，并且其未在天然或野生型荧光蛋白中发现。虽然在一些条件下天然蛋白可以吸引金属离子，但是本公开内容的上下文中的异源位点是指取代的且非天然带负电荷的氨基酸侧链的并置(juxtaposition)，该并置可以形成在野生型中未发现的结合位点。
如本文所用的术语“协作相互作用(co-operative interaction)”是指改变荧光蛋白的荧光信号，所述改变由金属离子的结合(诸如钙与钙结合位点的结合)并且导致由于该蛋白质的构象变化而与蛋白质内的发色团位点形成新的键而产生。
如本文所用的术语“异源带负电荷的氨基酸取代”是指在天然或野生型蛋白质相同位置中未发现的带负电荷的氨基酸。
如本文所用的术语“多肽”是指蛋白质及其片段。多肽在本文中作为氨基酸残基序列被公开。这些序列从左到右以氨基末端至羧基末端方向书写。按照标准命名法，氨基酸残基序列通过如下所示的三字母或单字母代码命名：丙氨酸(Ala，A)、精氨酸(Arg，R)、天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)、半胱氨酸(Cys，C)、谷氨酰胺(Gln，Q)、谷氨酸(Glu，E)、甘氨酸(Gly，G)、组氨酸(His，H)、异亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)、赖氨酸(Lys，K)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、色氨酸(Trp，W)、酪氨酸(Tyr，Y)和缬氨酸(Val，V)。
如本文所用的术语“变体”是指不同于参考多肽或多核苷酸但保留基本特性的多肽或多核苷酸。典型的多肽变体在氨基酸序列上不同于另一个参考多肽。通常，限制差异使得参考多肽和变体的序列整体非常相似(同源的)，并且在许多区域中是相同的。变体和参考多肽在氨基酸序列上可以由一个或更多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)而不同。
可以在本公开内容的多肽的结构中进行修饰和变化，并且仍然产生具有与多肽类似特性的分子(例如，保守氨基酸取代)。例如，序列中的某些氨基酸可以被取代为其它氨基酸，而无活性的明显损失。由于多肽的相互作用能力和性质定义了多肽的生物学功能活性，可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列的取代，但是仍然获得具有类似特性的多肽。
在作出此类变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。亲水氨基酸指数在赋予多肽相互作用生物学功能中的重要性在本领域中通常被理解。已知某些氨基酸可以被取代为具有相似亲水指数或分数的其它氨基酸，并且仍然产生具有类似生物活性的多肽。每个氨基酸已基于其疏水性和电荷特性被分配了亲水指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
据认为，氨基酸的相对亲水特征决定了所得多肽的二级结构，该二级结构继而限定多肽与其它分子(例如酶、底物、受体、抗体、抗原等)的相互作用。本领域已知，氨基酸可以被具有相似亲水指数的另一氨基酸取代，并仍然获得功能上等同的多肽。在此类变化中，亲水指数在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1内的那些是特别优选的，并且在±0.5内的那些是甚至更特别优选的。
相似氨基酸的取代也可以基于亲水性(hydrophilicity)进行，特别当由此产生的生物学功能等同的多肽或肽旨在用于免疫学实施方案中的情况下。以下亲水性值(hydrophilicity value)已被分配至氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可以被取代为具有相似亲水性值的另一氨基酸，并仍然获得生物学上等同的，且特别是免疫学上等同的多肽。在此类变化中，亲水性值在±2内的氨基酸的取代是优选的，在±1内的那些是特别优选的，且在±0.5内的那些是甚至更特别优选的。
如以上概述的，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑上述特性中的一个或更多个的示例性取代对本领域技术人员来说是公知的，并且包括但不限于(原始残基：示例性取代)：(Ala：Gly、Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln、His)、(Asp：Glu、Cys、Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn、Gln)、(Ile：Leu、Val)、(Leu：Ile、Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu、Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Tip：Tyr)、(Tyr：Trp、Phe)和(Val：Ile、Leu)。因此，本公开内容的实施方案构思了如以上列出的多肽的功能或生物学等同物。具体地，多肽的实施方案可包括具有与感兴趣的多肽约50％、60％、70％、80％、90％和95％序列同一性的变体。
如本文所用的术语“同一性”是指如通过比较序列确定的两个或更多个多肽序列之间的关系。通过举例的方式，多肽序列可以与参考序列相同，即为100％相同，或者它可包括相比于参考序列多达某一整数的氨基酸改变，使得同一性％小于100％。此类改变选自：至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入，并且其中所述改变可发生在参考多肽序列的氨基末端位置处或羧基末端位置处或在那些末端位置之间的任何位置处，单独散布在参考序列的氨基酸中，或者以一个或更多个连续的组散布在参考序列内。给定同一性百分比的氨基酸改变的数目是通过参考多肽中的氨基酸总数乘以各自的同一性百分比的百分比数值(除以100)，且然后从所述参考多肽中的氨基酸总数减去该乘积来确定的。
如本文所用的术语“多核苷酸”是指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。因此，例如，如本文所用的多核苷酸是指除其他的以外单链DNA和双链DNA、为单链和双链区域的混合物的DNA、单链RNA和双链RNA、以及为单链和双链区域的混合物的RNA、包含可为单链或更典型为双链或单链和双链区域的混合物的DNA和RNA的杂交分子。术语“核酸”、“核酸序列”或“寡核苷酸”还涵盖如上文所定义的多核苷酸。
将领会的是，已经对DNA和RNA作出用于本领域技术人员已知的许多有用的目的的各种修饰。术语多核苷酸如其在本文使用的涵盖多核苷酸的此类化学的、酶促的或代谢的修饰形式，以及病毒和细胞(除其他的以外，包括简单和复杂细胞)的特征性DNA和RNA的化学形式。
通过举例的方式，本公开内容的多核苷酸序列可以与参考序列相同，即100％相同，或者它可包括相比于参考序列多达某一整数的氨基酸改变。此类改变选自包括以下的组：至少一个核苷酸缺失、取代(包括转换(transition)和颠换(transversion))或插入，并且其中所述改变可发生在参考核苷酸序列的5'末端位置处或3'末端位置处，或那些末端位置之间的任何位置处，单独散布在参考序列的核苷酸中，或者以一个或更多个连续组散布在参考序列内。核苷酸改变的数目通过参考核苷酸中的核苷酸总数乘以各自的同一性百分比的百分比数值(除以100)，且然后从所述参考核苷酸中的核苷酸总数减去该乘积来确定的。编码多肽的多核苷酸序列的改变可在这样的改变之后改变由多核苷酸编码的多肽。
如本文所用的，DNA可以通过任何方法获得。例如，DNA包括由mRNA制备的互补DNA(cDNA)、由基因组DNA制备的DNA、通过化学合成制备的DNA、用RNA或DNA作为模板通过PCR扩增得到的DNA、以及通过适当组合这些方法构建的DNA。
cDNA可通过例如以下方法从编码蛋白质的mRNA克隆：首先，从以上提及的表达和产生所选择的蛋白质的组织或细胞制备编码蛋白质的mRNA。mRNA可以通过以下来制备：通过已知方法诸如硫氰酸胍法(Chirgwin等人，(1979)Biochemistry 18：5294)、热酚法或AGPC法分离总RNA，并使其经受使用寡聚-dT纤维素或多聚-U琼脂糖的亲和层析。
然后，cDNA例如使用逆转录酶通过公知方法诸如Okayama等人，(1982)Mol.Cell.Biol.2:161；(1983)Mol.Cell.Biol.3:280，或Hoffman等人,(1983)Gene 25:263的方法来合成，并且被转换成双链cDNA。cDNA文库通过用具有该cDNA的质粒载体、噬菌体载体或粘粒载体转化大肠杆菌或通过体外包装后转染大肠杆菌来制备。
如本文所用的关于给定的多肽或多核苷酸的术语“基本上纯的”是指该多肽基本上不含其他生物大分子。例如，基本上纯的多肽或多核苷酸是按干重计至少75％、80％、85％、95％或99％纯的。纯度可以通过本领域中已知的任何适当的标准方法测量，例如通过柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等测量。
如本文所用的术语“引物”是指与待扩增或复制的DNA区段互补的寡核苷酸。典型地，引物在PCR中使用。引物与模板DNA杂交(或“退火”至模板DNA)，并被聚合酶使用作为复制/扩增过程的起点。“互补”是指引物序列可与模板形成稳定的氢键络合物。
如本文所用的术语“载体”是指基因单元(或复制子)，其他DNA区段可掺入至其或到其中以实现所附接的区段的复制以及任选地表达。实例包括但不限于质粒、粘粒、病毒、染色体和迷你染色体(mini-chromosome)。示例性表达载体包括但不限于杆状病毒载体、修饰的牛痘安卡拉(MVA)载体、质粒DNA载体、重组痘病毒载体、细菌载体、重组杆状病毒表达系统(BEVS)、重组弹状病毒载体、重组甲病毒载体、重组腺病毒表达系统、重组DNA表达载体以及其组合。
本文中使用的质粒载体不受限制，只要它们在宿主中被复制并保持即可。也可以使用可以在宿主中复制的任何噬菌体载体。通常使用的克隆载体的实例是pUC19、λgt10、λgt11等。优选使用具有可以在宿主中表达编码所需的蛋白质的基因的启动子的载体。
cDNA可通过例如Maniatis等人的方法(Molecular Cloning,A LaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,p.1.53,1989)插入到质粒中。这些方法可以通过使用市售可得的克隆试剂盒简单地进行。由此获得的重组质粒或噬菌体载体被引入适当的宿主细胞诸如原核细胞(例如，大肠杆菌菌株HB101、DH5α、MC1061/P3等)或如本文所公开的宿主细胞中。
用于将质粒引入宿主中的方法的实例为氯化钙法、氯化钙/氯化铷法、脂质体法和电穿孔法。噬菌体载体可通过例如其中噬菌体DNA在体外包装后被引入生长的宿主中的方法被引入到宿主细胞中。体外包装可用市售可得的体外包装试剂盒容易地进行。
如本文所用的术语“重组载体”是指可以使用的任何载体，只要它能够在原核和/或真核细胞的每个宿主细胞中保持复制或自我增殖即可，所述载体包括质粒载体和噬菌体载体。重组载体可以通过以下容易地制备：通过常规方法将编码蛋白质的DNA与本领域可获得的用于重组的载体(质粒DNA和细菌噬菌体(bacteriophage)DNA)连接。
所用的用于重组的载体的具体实例为源自大肠杆菌的质粒，诸如pBR322、pBR325、pUC12、pUC13和pUC19；源自酵母的质粒，诸如pSH19和pSH15；以及源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的质粒，诸如pUB110、pTP5和pC194。噬菌体(phage)的实例为细菌噬菌体诸如λ噬菌体，以及动物或昆虫病毒(pVL1393，Invitrogen)，诸如反转录病毒、牛痘病毒和核型多角体病毒。
如本文所用的术语“表达载体”是指用于表达编码本文所用的蛋白质的DNA以及用于生产该蛋白质有用的载体。表达载体不受限制，只要它在各种原核和/或真核宿主细胞中表达编码蛋白质的基因并生产该蛋白质即可。其实例为但不限于pMAL C2、pEF-BOS((1990)Nucleic Acids Res.18:5322等)、pME18S pCDNA(Experimental Medicine:SUPPLEMENT,"Handbook of Genetic Engineering"(1992))等等。
当细菌，尤其是大肠杆菌，被用作宿主细胞时，表达载体通常至少包括启动子/操纵子区、起始密码子、编码蛋白质终止密码子的DNA、终止子区和复制子。
当酵母、动物细胞或昆虫细胞被用作宿主时，表达载体优选至少包括启动子、起始密码子、编码蛋白质的DNA和终止密码子。它也可以包含编码信号肽的DNA、增强子序列、编码蛋白质的基因的5'-非翻译区和3'-非翻译区、剪接点(splicing junction)、多聚腺苷酸化位点、可选择的标志物区以及复制子。如果需要的话，表达载体还可以含有通常使用的用于基因扩增的基因(标志物)。DNA质粒也可以直接被引入到哺乳动物的动物细胞以表达蛋白质。
在细菌中表达蛋白质的启动子/操纵子区包含启动子、操纵子和Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AAGG)。例如，当宿主是大肠杆菌时，它优选包括Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、tac启动子等。在酵母中表达蛋白质的启动子的实例是PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等等。当宿主是芽孢杆菌属(Bacillus)时，其实例可以是SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等等。当宿主是诸如哺乳动物细胞的真核细胞时，其实例是源自SV40的启动子、逆转录病毒启动子、热休克启动子等等，并优选地是源自SV-40和逆转录病毒的启动子。当然，启动子不限于上述实例。此外，使用增强子对表达有效。
术语“密码子”是指在DNA链或mRNA中组成氨基酸或终止信号的特定单核苷酸三联体。优选的起始密码子为例如甲硫氨酸密码子(ATG)。通常使用的终止密码子，例如TAG、TAA、TGA，被例示为终止密码子。通常，所使用的天然的或合成的终止子被用作终止子区。
可以根据常规方法使用通常采用的可选择的标志物。其实例为对抗生素诸如四环素、氨苄青霉素或卡那霉素的抗性基因。
可以在序列末端添加诸如His-标签和GST的亲和标签以促进蛋白质通过蛋白印迹和拉下实验(pulldown assay)的纯化和识别。还可添加其他标签的实例诸如HA和FLAG以允许构建体的另外的操作。
如本文所用的“转化子”可以通过将以上所提及的表达载体引入宿主细胞中来制备。
如本文所用的“宿主”细胞不受限制，只要它们与以上所提及的表达载体兼容，并且可以被转化即可。其实例是各种细胞，诸如通常在技术领域中使用的野生型细胞或人工建立的重组细胞(例如，细菌(埃希氏菌属(Escherichia)和芽孢杆菌属)、酵母(酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)等)、动物细胞或昆虫细胞)。
优选使用大肠杆菌细胞或动物细胞。具体的实例为大肠杆菌菌株DH5α、TB1、HB101等，源自小鼠的细胞(COP、L、C127、SP2/0、NS-1、NIH 3T3等等)，源自大鼠的细胞(PC12、PC12h)，源自仓鼠的细胞(BHK、CHO等等)，源自猴的细胞(COS1、COS3、COS7、CV1、Velo等等)，以及源自人的细胞(Hela、源自二倍体成纤维细胞的细胞、骨髓瘤细胞和HepG2等等)。本文所公开的蛋白质可以通过在营养培养基中培养如以上提及的制备的包含表达载体的转化子(在下文中，该术语包括转染子)产生。
营养培养基优选包含宿主细胞(转化子)生长必要的碳源、无机或有机氮源。碳源的实例为葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉和蔗糖，无机或有机氮源的实例为铵盐、硝酸盐、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、大豆饼和土豆提取物。如果需要的话，它们可包含其它营养物(例如，无机盐(例如氯化钙、磷酸二氢钠和氯化镁)、维生素、抗生素(例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)。
术语“简并核苷酸序列”表示包括一个或更多个简并密码子(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(例如，GAU和GAC三联体均编码Asp)。
如本文所用的术语“外源DNA”或“外源核酸序列”或“外源多核苷酸”是指从外部来源引入到细胞或细胞器中的核酸序列。通常，引入的外源序列是重组序列。
如本文所用的术语“转染”是指将核酸序列引入活细胞的膜封闭空间的内部，包括将核酸序列引入细胞的细胞溶质中以及线粒体、细胞核或叶绿体的内部空间中。核酸可以是与各种蛋白质相缔合的裸露的DNA或RNA的形式，或者核酸可以被掺入载体中。
术语“嵌合”、“融合”和“复合”被用于表示包含在它们没有被以其他方式发现在自然界中直接(共价地)连接的意义上相互异源的至少两个组成部分的蛋白、肽结构域或核苷酸序列或分子。更具体地，该组成部分并未在自然界中相同的连续的多肽或基因中被发现，至少没有呈与在嵌合蛋白或复合结构域中存在的相同的顺序或方向或相同的间距。此类材料包含源自至少两个不同的蛋白质或基因或源自相同的蛋白质或基因的至少两个非相邻的部分的组分。复合蛋白和编码它们的DNA序列为在它们含有没有被以其他方式发现在自然界中直接(共价地)连接在一起的至少两个组成部分的意义上为重组体。
如本文所用的“插入”或“添加”是指与相应的天然存在的分子相比分别导致一个或更多个氨基酸或核苷酸残基的添加或插入的氨基酸或核苷酸序列的改变。
如本文所用的“缺失”或“消减(subtraction)”是指与相应的天然存在的分子相比分别导致一个或更多个氨基酸或核苷酸残基的缺失或消减的氨基酸或核苷酸序列的改变。
如本文所用的“取代”是指一个或更多个氨基酸或核苷酸分别被不同氨基酸或核苷酸替换。
“突变”为相对于参考“野生型”DNA序列在DNA序列中的可遗传的改变。突变可由于单碱基改变、多碱基改变或对于DNA序列多于一个核苷酸的添加或缺失而发生。
术语“突变体”被广泛地使用，指在某些方面不同于参考野生型蛋白质的蛋白质，其中蛋白质可以保留参考野生型(例如，天然存在)的蛋白质的生物学特性，或者可以具有不同于参考野生型蛋白质的生物学特性。术语对象蛋白质的“生物学特性”包括但不限于光谱特性，诸如最大发射(emission maximum)、量子产率和亮度等；体内和/或体外稳定性(例如，半衰期)；等等。突变体可以包括单个氨基酸改变(点突变)、一个或更多个氨基酸缺失(点缺失)、N-末端截短、C-末端截短、插入等。可以使用标准的分子生物学技术产生突变体。
“野生型”菌株能够具有全部范围的代谢活性。例如，沙门氏菌属(Salmonella)的野生型菌株能够由单一碳源合成所有20种氨基酸。如本文所使用的“野生型”蛋白或多肽是指在自然界中发现的序列未修饰的氨基酸序列。
“点突变”是在DNA序列中一个或少量碱基对的改变。点突变可以由于碱基对取代或由于小的插入或缺失。
“转换”是一种点突变，其中用嘌呤替换嘌呤或用嘧啶替换嘧啶。
“颠换”是一种点突变，其中用嘧啶替换嘌呤或用嘌呤替换嘧啶。一般来说，转换比颠换更常见，因为前者不会被校正酶检测到。
根据本公开内容，本公开内容的传感器的“可检测地有效量”被定义为足以使用用于临床用途可得的设备产生可接受的图像的量。本公开内容的传感器的可检测地有效量可以在一次以上的注射中施用。本公开内容的传感器的可检测地有效量可根据诸如个体的敏感程度、年龄、性别、个体的体重、个体的特应性应答、剂量学等等的因素而变化。本公开内容的传感器的可检测地有效量还可以根据仪器和胶片相关的因素而变化。此类因素的优化完全在本领域技术人员的水平内。
“施用”是指将本公开内容的传感器引入受试者中。传感器的优选施用途径是静脉内。然而，可以使用任何施用途径，诸如口服、局部、皮下、腹膜内、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻、引入到脑脊髓液中，或滴注入体室(body compartment)中。
“荧光蛋白”是指当用适当的电磁辐射激发时能够发射光的任何蛋白质。荧光蛋白包括具有天然的或工程化氨基酸序列的蛋白质，诸如来自多管水母属(Aequorea)相关荧光蛋白的绿色荧光蛋白或来自香菇珊瑚(Discosoma sp.)的红色荧光蛋白。
“物理连接”是指在本领域中已知的用于功能性连接两个分子(其被称为“物理连接的”)的任何方法，包括但不限于具有或不具有间隔结构域的重组融合、非共价缔合、共价键合(例如，二硫键键合和其他共价键合)、氢键键合；静电键合；和构象键合，例如抗体-抗原和生物素-亲和素缔合。“融合”是指通过共价键合的连接。
如本文所用的术语“细胞器”是指细胞膜限制的结构，诸如叶绿体、线粒体和细胞核。术语“细胞器”包括天然的和合成的细胞器。
如本文所用的术语“无核细胞器”是指存在于细胞中的除细胞核外的任何细胞膜限制的结构。
如本文所用的术语“宿主”或“生物体”包括人类、哺乳动物(例如，猫、狗、马等)、活细胞和其它活生物体。活生物体可以简单至例如单个真核细胞，或复杂至哺乳动物。本公开内容的实施方案可以施用至其的典型的宿主将是哺乳动物，特别是灵长类，尤其是人类。对于兽医应用，各种各样的受试者将是合适的，例如家畜诸如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家禽诸如鸡、鸭、鹅、火鸡等；和家养动物特别是宠物，诸如狗和猫。对于诊断或研究应用，各种各样的哺乳动物将是适当的受试者，包括啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、兔、灵长类和猪，诸如近交猪等。此外，对于体外应用，例如体外诊断和研究应用，上述受试者的体液和细胞样品将适合于使用，诸如哺乳动物(特别是灵长类诸如人)的血液、尿液或组织样品，或所提到的用于兽医应用的动物的血液、尿液或组织样品。
如本文所用的术语“分析物”是指可以结合蛋白质或肽的原子、分子或离子。分析物可以可逆地或不可逆地结合，并且因此键可以是共价的或非共价的。尽管Ca2+、Tb3+、Ln3+和Pb2+在本公开内容的优选实施方案中被用作示例性分析物，应理解的是适于本公开内容的分析物包括但不限于金属离子，包括第IIA族金属离子、过渡金属离子和镧系离子。
“结合基序”是通常在较大蛋白质中的结合位点的一部分。术语结合位点可以与术语结合基序互换使用，且反之亦然。
“化学反应”可以包括离子的、共价的或非共价的结构通过已知方法的形成或解离。化学反应可包括在环境条件诸如pH、离子强度和温度下的变化。
“构象”是分子(包括在分子中的侧基)的一级、二级和三级结构和在某些情况下分子的四级结构的三维排布；当分子的三维结构改变时发生构象改变。构象改变可以是从α-螺旋到β-折叠的转变或从β-折叠到α螺旋的转变。
“可检测的改变”或“响应性”是指蛋白质对其微环境的任何响应。这种可检测的改变或响应性可以是在传感器多肽的氨基酸或肽片段的方向上的小改变或转变，以及例如在多肽的一级、二级或三级结构和在某些情况下多肽的四级结构方面的改变，包括在质子化、电势和化学势和或构象方面的改变。在活性状态和无活性状态之间的任何荧光特性的“可测量的差异”足以用于在活性测定中利用本公开内容的荧光蛋白底物。可测量的差异可以通过测量任何定量荧光特性的量来确定，所述定量荧光特性例如，在特定波长处的荧光信号或经过整个发射光谱的荧光积分。
“可操作地插入”或“连接”是指并置，其中如此描述的组分处于允许它们以其预期的方式发挥作用的关系中。可操作地连接到编码序列的控制序列被连接(ligated)，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
“响应的”旨在涵盖多肽或蛋白对与分析物的相互作用的任何响应。
描述
细胞溶质钙水平的快速瞬变导致各种生理作用。对于开发具有快速钙结合动力学特性和pH非依赖性荧光变化的钙传感器以探测在高钙环境如内质网中的钙波动存在持续需要。本公开内容提供了红色钙传感器RapidER(MCD1)的工程化变体的实施方案，该工程化变体具有约800s-1和约2500s-1之间的koff，包括但不限于约1900s-1的koff，和大于2.7x107M- 1s-1的kon的快速动力学。半壳配位(Half-shell coordination)、带负电荷的溶剂可及的区域、静电结合能变化、以及发色团的氢键键合网络提供了控制钙结合亲和力、动力学和光学特性的钙结合依赖性变化的因素。
钙结合导致量子产率的增加，并且钙滴定显示荧光信号增加，具有0.1mM的Kd。色氨酸-Tb3+FRET和Tb3+-RapidER(MCD1)FRET支持钙结合到本公开内容的传感器的人工(即工程化)的结合位点。与工程化的GFP衍生的钙传感器相比，红色传感器的pH稳定性增强，具有低于5的pKa。结果进一步显示本公开内容的改进的钙传感器能够监测内质网(ER)膜中响应钙通道的活化剂和抑制剂的ER钙释放，并从而证明本公开内容的金属离子传感器可用于检测活细胞中的钙离子浓度的定性的和定量的快速变化。示出在本公开内容的红色荧光传感器中发生的光学特性的变化的体外数据提供了对它们在非细胞环境中(诸如在水性溶液中)或者如果传感器结合到诸如固体支持物，用作金属离子(例如钙，但并不限于此)检测器的支持。
结合亲和力和动力学性质的关键因素：钙结合接受3-8的灵活配位数。因为它是软金属，氧优选为配位物(coordinator)。根据在蛋白质数据库中的钙结合位点的统计分析，天冬氨酸、谷氨酸和水是提供氧以结合钙离子的三个主要残基。
基于蛋白质的钙指示剂的钙结合特征已经主要由涉及的钙结合部分(钙调蛋白(CaM)或肌钙蛋白C(TnC))确定。CaM和TnC两者的钙结合亲和力为约10-6-10-7M。钙调蛋白和肌钙蛋白C两者的化学计量为1：4，在每个末端结构域中两个钙离子。在每个结构域中钙-结合遵循协作的方式，这可有助于约0.2-s-1至约20s-1的缓慢钙解离速率。此外，这两个结构域是相对独立的，导致在传感器Cameleon中观察到双相钙结合曲线。
已经作出努力以降低之前已知的GECI的Kd。因此，在传感器Cameleon3中，位于CaM结构域中的第三EF-手基序(EF-hand motif)中的突变E104Q消除了CaM C-结构域的高钙结合组分，并且Kd值为4.4μM。对于Cameleon4，位于第一EF-手基序中的突变E31Q进一步降低在CaM N-结构域中的结合亲和力，但没有显著影响高亲和性C-结构域。得到的Cameleon 4的Kd为83nM和700μM，分别具有1.5和0.87的希尔系数。在M13与CaM之间转换的接触面处的带电荷的残基降低了表观Kd值(0.8和60μM)，并增加Koff(256s-1)，尽管原来的目的是通过与它们的固有靶蛋白的相互作用来消除正常钙信号传导的扰动。相似的情况在通过改变M13与CaM之间的接触面(interface)以及CaM和cpEGFP之间的接触面产生的最近的版本GCaMP中观察到。GCaMP6f表现出与其他GcaMP相比对神经元活性中的动作电位更快的钙响应。这些结果表明，涉及CaM和M13肽的钙指示剂的表观Kd值不仅由钙结合基序来确定，而且还由接头和结构域接触面确定。
TnC也具有如CaM的两个末端结构域。N-末端结构域以比C-结构域更低的亲和力结合Ca2+，所述C-结构域是调节位点。TnC分子在钙结合后经历结构重排。具有比TN-L15更快的动力学的TN-XL是通过转换在TnC的C-末端结构域中的第三和第四EF-手基序处的位置109、111、145和147处的残基N和D产生，由此钙结合亲和力降低(Kd＝2.2μM，希尔系数1.7)。镁干扰也被消除。通过停流光谱仪测定的所得的TN-XL解离速率为约5s-1，比TN-L15和TN-XXL高约5倍。
协作结合(cooperative binding)、缓慢解离动力学和高钙结合亲和力是GECI的天然钙结合蛋白的特征。此外，由于荧光信号变化所需的多个步骤，Kd不被单独的钙结合控制。因此，已证明难以通过合理设计来调整结合亲和力和动力学以及避免在相同的构建体中的协作性。相反，基于GFP的传感器CatchER(SEQ ID NO：37)通过避免天然钙结合部分具有改善的快速动力学、低钙结合亲和力以及1：1的化学计量。在这样的简化的钙指示剂如CatchER(SEQ ID NO：37)中，钙的传感依赖于在钙-结合位点中的局部动态。因此，工程化到CatchER(SEQ ID NO：37)中的简单的钙结合位点是用于修饰以进一步通过降低结合位点周围的带正电荷的残基增加动力学的有益基础。
与CatchER(SEQ ID NO：37)相比，本公开内容的基于RFP的RapidER(MCD1)(SEQ IDNO：43)以及其变体具有较高的钙结合亲和力以及更快的动力学，与静电结合能变化和带负电荷的溶剂可及的表面区域的计算一致。在CatchER(SEQ ID NO：37)和RapidER(MCD1)(SEQID NO：43)两者中的比以前使用的EF-手基序更快的钙解离速率可以归因于所设计的半壳钙结合位点的几何学，其中存在钙释放的小空间屏障。然而，与CatchER(SEQ ID NO：37)相比，在RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)中的钙结合位点周围存在三个带正电荷的残基：K74、K166和R220，CatchER(SEQ ID NO：37)中的钙结合位点附近仅存在一个K42。放大的负电荷圆环的边缘也可以被这些正电荷残基中和，并且因此增加解离速率。关于结合位点周围的正电荷残基的作用的证据可以在Ca2+-CatchER(具有结合至其的钙离子的CatchER)的晶体结构中被发现)，其中存在观察到的两个群体的钙离子位置，这两个位置都被E147配位但是远离接近K42的E223和E225。可能的是，钙结合位点周围的带正电荷的残基吸引电子密度以增加解离速率。
将MCD1和其变体中的静电能变化和溶剂可及的区域与CatchER的比较示于表1中。
表1：静电结合能计算
钙结合位点的位置：红色荧光蛋白(RFP)具有比绿色荧光蛋白(GFP)更大的共轭系统，其被延伸至在环化的发色团三肽前F65的主链。如同GFP，RFP的发色团环境在维持荧光中起重要作用。在β折叠中相邻残基的侧链取向通常是相反的。突出到β折叠内部的那些残基可以形成疏水或静电相互作用以参与或保护发色团环境，而面向溶剂的其他残基协助保持蛋白质避免聚集或降解。在蛋白质的内部中具有侧链的残基具有与发色团更直接的接触，从而直接影响光学特性。
例如，在mCherry中的E215的突变导致光谱的蓝移(blue shift)，其中原始E215被质子化并且形成质子化的羧基和咪唑啉酮环氮之间的氢键。然而，在β桶的表面的钙结合主要涉及外突的侧链。为了通过钙结合改变光谱特性，设计的钙配位物需要影响在发色团环境中的那些残基。
如图1所示，在mCherry的发色团中，发色团酚羟基接近β桶的开口，在该开口中环区被定位。在GFP中相应位置作为通道以允许在激发态质子转移过程中的质子迁移。该酚氧与S146的侧链(两种状态)以及通过桥连的水分子(wat1)与E144的主链以及与Q163的侧链形成H键。已经提出在mCherry中的E215被质子化以与咪唑啉酮氮形成H键。该残基的位置由于在发色团、E215、Q42、S69和水分子(图1所示的wat4)之间观察到网络而是相对刚性的。这三个残基的主链和侧链两者连同发色团一起彼此接触，从而导致紧密缔合。从R95和Q64的侧链与咪唑啉酮氧发现H键。由于连接F64和发色团的肽键为mCherry中的共轭体系的一部分，F64中的主链氧也在考虑中，其经由水分子与侧链Q109和S111形成H键。
因此，选择三个潜在的钙结合位点以影响酚基。RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的袋1为一个，包括E144和S146之间的突变A145E。袋2包括E144，并且袋3具有毗邻Q163的突变E164。袋1和袋2具有紧挨着E215的突变R216E。袋4被选定为接近R95和Q109，包括突变K92E和T108E。结果表明，仅袋1和袋2的变体显示出钙依赖性荧光变化。平衡透析测定证实属于袋6变体的变体MCP6(SEQ ID NO：48)(K92E/E94/T108E/D110)也以与袋1和袋2的变体相当的结合亲和力结合钙。
Tb3+-RapidER(MCD1)FRET的寿命证实钙到达RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)中的预期位置。钙结合增加RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的寿命，并因此提高了量子产率。因此，酚羟基比其他基团对静电环境的变化更敏感，并因此具有影响光学特性的主要潜力。
因此，结合发色团环境和钙结合位点的本公开内容的设计策略将钙结合和荧光变化关联。半壳设计允许具有0.1-0.5mM范围的体外解离常数的单一钙结合位点的创建。突变的引入导致消光系数和量子产率的降低。钙结合不会改变消光系数，但增加了量子产率回到与野生型mCherry的量子产率类似的水平。RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)如此命名是因为认识到其快速钙结合动力学。与基于GFP的钙结合蛋白相比，RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)显示在生理范围中较小的pH依赖性荧光变化。其成功地检测到由于向哺乳动物细胞施用钙离子载体(calcium ionophore)、RyR和IP3R的活化剂和SERCA的抑制剂所导致的来自内质网的钙释放。本公开内容的变体蛋白有利于改善在钙结合后的荧光变化的动态范围并扩展可用的钙传感器的频谱窗口(spectrum window)和钙浓度的可测量范围。
根据本公开内容的金属离子传感器的实施方案包括荧光宿主多肽和分子识别基序，所述分子识别基序在其微环境中与分析物(例如，钙(或如本文所指出的其他金属)或钙流(flux of calcium)相互作用。在金属离子分析物与分子识别基序的相互作用之后，传感器产生光学可检测的信号(或光学可检测的信号被改变)，该光学可检测的信号在暴露至分析物的过程中产生。将分子识别基序整合或可操作地连接到(在氨基酸序列内)荧光宿主多肽中。分析物与分子识别基序的相互作用产生基于分析物的量的金属离子传感器的荧光特性的可检测的变化(例如，强度的变化，或最大波长或吸收成像、透射光、荧光激发或发射的变化，光散射和/或发色团和蛋白质的能量转移)。
使用相关的分子识别基序，本公开内容的金属离子敏感传感器可用于在体外、活细胞中和体内研究疾病的机制，跟踪疾病的过程和诊断与分析物活性相关的一些疾病。此外，特定信号肽也可用于实时和原位研究诸如它们的与在各细胞隔室中钙(或如本文所指出的其它金属)活性相关的疾病的激活或抑制的机制，其可用于生物技术、细胞生物学和药物化学、疾病诊断和预后、钙抑制剂筛选和药物开发中。
因此，本公开内容的金属离子传感器的实施方案包括具有金属离子结合位点的工程化荧光宿主多肽，所述金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，其中所述带负电荷的残基包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，其中所述几何学提供与所述工程化荧光宿主多肽的发色团区域可操作地相互作用的金属离子结合位点，使得金属离子分析物与分子识别基序的结合调节由荧光宿主多肽发射的荧光信号的发射，以及任选地，工程化荧光宿主多肽的吸收光谱。
在分析物(例如，钙、铅和/或镧系元素)与分析物结合位点相互作用之后，金属离子传感器产生相对于相互作用前金属离子传感器的改变的信号。在这方面，在荧光宿主多肽内的发色团的相对的三维位置在分析物与分析物结合位点相互作用后被改变，其中这种改变产生改变的信号。相互作用后信号(发色团信号)的比率变化(ratiometric change)允许分析物活性的精确测量(例如，体外和体内，用标准化传感器浓度)。结构基序的包含通过并入特定类型的分析物所需的基本结构和化学特性允许最佳分子识别。例如，结构基序的包含允许：易于到达钙的溶剂可及性、识别所需的灵活性、用于相互作用的特定的几何袋(geometric pocket)、促进结合过程的亲水性表面或带电荷的环境和用于快速动力学速率诸如实时测量所需的良好的解离速率的所需环境。
换言之，金属离子传感器具有呈三维空间的折叠排列，其产生特定信号。金属离子传感器可在利用分析物结合位点诱导分析物(例如，钙、铅或镧系元素)情况下随着发色团微环境的变化经历局部构象变化成另一种折叠排列。该构象变化可以被检测和测量，并与和分析物相互作用之前由钙传感器产生的信号比较。
本公开内容的实施方案的优点可以包括以下的一种或更多种：(i)本公开内容的实施方案能够通过活细胞成像监测活细胞或生物体中的许多细胞事件。本公开内容的实施方案可提供细胞事件以及它们通过刺激或药物的响应的连续的和动态的影片。本公开内容的实施方案大大地克服了目前市售可得的小分子染料、肽/模拟物探针关于分析物活动的一个快照的限制；(ii)本公开内容的实施方案包括单个荧光蛋白，该单个荧光蛋白相比于使用两种荧光蛋白的FRET对，在细胞环境下更容易且更好地易位以原位探测分析物反应。通过添加信号肽，这些金属离子传感器可在细胞环境诸如ER、线粒体、高尔基体或核处特异性表达/放置，以便以空间分辨率和时间分辨率监测细胞事件。目前可用的染料检测方法简单地依赖于探针通过膜的被动扩散，并仅允许钙活动的短的快照而没有在靶向的细胞位置处检测反应的能力。这些探针由于有限的细胞寿命和特异性不提供钙活动的连续动态成像；(iii)本公开内容的实施方案不使用现有的/天然钙结合蛋白以感测金属离子(例如，钙、铅或镧系元素)，因此它们具有最小的细胞网络的扰动；(iv)本公开内容的实施方案包括单个荧光蛋白单元，该单个荧光蛋白单元克服了基于FRET的传感器所观察到的局限性，所述基于FRET的传感器易受荧光光漂白、由于其大尺寸在细胞隔室中差的取向和易位；(v)具有在诸如398和490nm的波长处的吸收或激发的本公开内容的实施方案的比率信号的变化，允许通过标准化传感器的浓度变化和荧光信号的细胞和器械干扰的钙(或如本文所指出的其他金属)活动的定量的和准确的测量；(vi)产生具有不同的金属离子亲和力的不同传感器允许以高准确度和灵敏度监测细胞应答；(vii)在本公开内容的实施方案中使用的结构基序允许最大光响应以及化学反应所需的最佳分子识别；及(viii)开发的金属离子传感器可以在细菌、哺乳动物细胞和动物诸如小鼠中表达，具有良好的光学特性，诸如本文所述的那些。本公开内容的工程化多肽通过金属离子结合可诱导的荧光和吸收特性的变化也可以用于检测导致反向变化的金属离子的去除。
因此，本公开内容的系统、传感器和方法可用于体外和体内检测、测量、定量和成像分析物与分析物结合位点之间的相互作用。具体地，本公开内容的实施方案可用于体外以及体内检测(和可视化)和/或定量钙相互作用或事件。此外，本公开内容的系统、传感器和方法可用于通过分析物结合位点体外和体内检测、测量、定量pH变化。此外，本公开内容的系统、传感器和方法可以用于控制系统中分析物的浓度。
根据金属离子传感器的荧光特性，金属离子传感器的DNA构建体可以被插入到重组载体或可以方便地经历重组DNA过程的任何合适的载体中。具体的载体可取决于宿主细胞的类型。例如，可以作为染色体外的实体存在的重组DNA质粒载体，可以是合适的载体。可选地，载体可以是当引入到宿主细胞中时整合入宿主细胞基因组中并与其被整合进入其中的染色体一起复制的载体。构建金属离子传感器之后，包括荧光核酸分子的载体可被配制成各种组合物，诸如待在转染宿主细胞中使用的溶液(例如缓冲溶液)。
根据本公开内容的荧光宿主多肽或其变体可以使用在蛋白质-分子复合物暴露到其的条件下稳定的任何连接(linkage)直接或间接地连接到分子。因此，荧光宿主多肽和分子可以经由存在于蛋白质和分子上的反应性基团之间的化学反应连接，或该连接可通过接头部分介导，该接头部分包含对荧光宿主多肽和分子特异性的反应性基团。将认识到，用于连接荧光宿主多肽变体和分子的适当的条件是根据例如分子的化学性质和所期望的连接的类型来选择的。在感兴趣的分子是多肽的情况下，用于连接荧光宿主多肽变体和分子的方便的方法是通过从重组核酸分子将它们表达为融合蛋白，所述重组核酸分子包括编码例如荧光宿主多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到编码多肽分子的多核苷酸。
金属离子传感器可以通过重组DNA技术作为嵌合蛋白产生。包括荧光宿主多肽的蛋白质的重组产生涉及表达具有编码所述蛋白质的序列的核酸。编码荧光宿主多肽的核酸可以通过本领域已知的方法获得。例如，编码蛋白质的核酸可以使用基于香菇珊瑚RFP的DNA序列的引物通过来自香菇珊瑚的DNA的聚合酶链式反应来分离。荧光宿主多肽的突变体形式可通过其他编码荧光蛋白的核酸的定点诱变，或通过随机诱变来进行，所述随机诱变由用0.1mM MnCl2和不平衡核苷酸浓度增加原始多核苷酸的PCR的错误率导致。
分子识别基序可以包括分析物结合位点、一个或更多个结构基序和靶向基序。分析物结合位点和结构基序可以包括上述的那些。靶向基序可以靶向细胞器和亚细胞器，例如但不限于ER、线粒体、高尔基体、核、离子通道、间隙连接和细胞外空间。靶向基序包括但不限于在靶细胞器中定位的蛋白质中的编码的信号肽。如以上公开的，基序可与本文描述的定位不同，只要它们具有与所公开的实施方案相一致的特征即可。下面提供了描述本公开内容的具体实施方案的另外的细节和实例。
本公开内容提供了金属离子传感器，所述金属离子传感器包括结合金属离子分析物(例如，钙、铅和/或镧系元素)的分子识别基序和荧光宿主多肽，其中所述分子识别基序被可操作地连接到或整合到所述荧光宿主多肽中。分析物与分子识别基序的相互作用产生可检测的改变。本公开内容的金属离子传感器可以具有包括分子识别基序和荧光宿主多肽的选自SEQ ID NO：41-63或其保守变体的蛋白质序列。
使用方法：预期本公开内容的金属离子传感器可以在体内和/或体外使用。本公开内容的金属离子传感器或表达此类传感器的系统可被引入细胞或宿主中，所述金属离子传感器或系统可以在细胞或宿主中表达，和/或所述金属离子传感器或系统可以被包括在转基因动物或植物中。金属离子传感器可以包括用于将金属离子传感器传递到不同亚细胞隔室(诸如细胞溶质、核、线粒体基质、内质网、高尔基体和过氧化物酶体等)的特定信号肽。
本公开内容的实施方案提供了检测和测量金属离子分析物的方法。该方法可以包括：将金属离子传感器引入到系统中；允许金属离子传感器与感兴趣的分析物相互作用，所述感兴趣的分析物可与金属离子传感器的分析物结合位点相互作用；并检测或测量源自可操作连接到分析物结合位点的荧光团的荧光特性或变化。由于金属离子传感器的荧光活性的变化是感兴趣的分析物的活性的代表，所以这种方法提供了用于研究和评价分析物活性的手段。
本公开内容的方法的实施方案可以包括：通过标准的基因转移方法将编码金属离子传感器的质粒引入到宿主细胞中；在宿主细胞中表达金属离子传感器；允许金属离子传感器与感兴趣的分析物相互作用，所述感兴趣的分析物可与金属离子传感器的分析物结合位点相互作用，并且由此检测或测量荧光信号或变化。由于金属离子传感器的荧光活性的变化是感兴趣的分析物的活性的代表，所以这种方法提供了用于研究和评价分析物活性的手段。
该方法可以包括：将金属离子传感器引入到系统中；允许金属离子传感器与金属离子分析物相互作用，所述金属离子分析物可与金属离子传感器的分析物结合位点相互作用；以及检测或测量可以与pH变化关联的荧光特性或变化。
本公开内容的实施方案可进一步提供控制一种或更多种金属离子分析物的浓度的方法。在一个实施方案中，该方法可以包括：将金属离子传感器引入到系统中；允许金属离子传感器与分析物相互作用，所述分析物可与金属离子传感器的分析物结合位点相互作用。分析物与分析物结合位点的键合控制了细胞或宿主中分析物的量。
对本公开内容有用的样品包括生物样品、环境样品或期望确定特定分子是否存在于其中的任何其他样品。样品可以是但不限于可从动物或植物中获得的活细胞或细胞提取物。可选地，细胞可以来源于或源自细菌细胞。此外，细胞可以从此类细胞的培养物诸如细胞系中获得，或可以从生物体分离。在使用完整的活细胞或新鲜分离的组织或器官样品执行该方法的情况下，可鉴定活细胞中感兴趣的分子的存在，从而提供实时确定例如分子的细胞内的区室化的手段。
用金属离子传感器检测：用于用金属离子传感器或表达或含有金属离子传感器的细胞检测的方法可以包括但不限于：用照明源照射金属离子传感器或表达传感器的细胞，使得金属离子传感器或表达金属离子传感器的细胞发射辐射。此类检测方法可以使用照明源，诸如白炽光源、荧光光源、卤素光源、太阳光、激光以及其它等同的源。当通过此类照明源照射时，金属离子传感器可发射荧光，该荧光可通过无协助的光学观察或者通过其他定性或定量的方法来检测。用于测量样品的荧光的合适方法是已知的并且是本领域的普通技术人员所理解的。
CatchER变体钙传感器
为了解决检测在高钙环境诸如ER/SR中的钙浓度的迫切需要，设计了修饰的EGFP，指定的CatchER(用于检测ER中高浓度的钙传感器(Calcium sensor for detecting highconcentration in the ER))，作为灵敏的荧光钙探针(Tang等人,(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:16265-16270)。CatchER通过将由5个钙配体残基(残基147、202、204、223和225)形成的钙结合位点添加到β-桶中来产生，所述β-桶接近来自携带1.20分辨率的去质子化的发色团(CRO)的单个增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的发色团的酚基。中性发色团和阴离子发色团两者的激发导致在510nm处的占优势的(dominating)阴离子发射，表明激发态质子转移(ESPT)的发生。伴随着增加的钙浓度的荧光增加遵循1:1结合曲线。吸收光谱表明，当钙浓度增加时，中性形式(ROH)的群体减少而阴离子形式(RO-)的群体增加。荧光研究表明，当CatchER在中性(λabs 395nm)形式和阴离子(λabs 488nm)形式两者处被激发时，Ca2+-结合的CatchER的荧光强度增加。CatchER表现出具有估计约700s-1的解离速率的前所未有的Ca2+释放动力学和用于检测ER中的高浓度的适当的Ca2+结合亲和力。CatchER能够测量在各种细胞类型中的钙浓度变化和监测在趾短屈肌肌肉纤维中的SR细胞腔Ca2+，以使用基于强度的荧光成像确定在衰老小鼠中减弱的SR Ca2+释放的机制。
本公开内容现在提供了特异性靶向细胞器的EGFP衍生的金属离子(钙)传感器的实施方案，允许细胞内钙浓度和细胞内钙水平变化动力学的测量。相比于CatchER本身，本文公开的Catcher变体的实施方案具有增加的热稳定性。该实施方案还包括异源靶特异性基序，该异源靶特异性基序允许表达的传感器定位到参与(complicit in)基于钙的细胞过程中的靶细胞器中。例如但不旨在限制，来自RyR1的跨膜结构域的区段的靶向序列，以及使用FKBP12(FK506结合蛋白)-CatchER嵌合蛋白将传感器诸如CatchER锚定到ER膜，并允许CatchER面向胞质以能够调查在CICR过程中来自SR的钙释放的幅度和动力学。
在一个实施方案中，为了获得CatchER-FKBP融合蛋白(由核苷酸序列SEQ ID NO：6编码)的克隆，在pcDNA3.1(+)中没有任何靶向序列的情况下，将FKBP12融合到CatchER的C-末端。Gly-Gly-Ser-Gly-Gly接头连同限制酶ClaI位点被插入在CatchER和FKBP12之间。
根据Zorato的RyR1拓扑模型(Ma等人,(2004)Cell Biochem.Biophys.40:207-224)，兔兰尼碱(ryanodine)受体1(GenBank：X15209)跨膜结构域M5和M10被应用为ER膜锚定序列。延伸的Z5(4551-4597)(SEQ ID NO：76)只能锚定GFP到ER膜(Meur等人,(2007)J.Biol.Chem.282:23096-23103)。延伸的Z10(4907-4943)(SEQ ID NO：77)包括37个氨基酸，并且为在兔兰尼碱受体1模型中的最后的跨膜(TM)结构域。
如图17所示，将延伸的Z5(4551-4597)(SEQ ID NO：76)、Z5(4561-4583)(SEQ IDNO：78)和Z10(4907-4943)(SEQ ID NO：77)基序分别融合到既无钙网蛋白靶向序列也无ER滞留序列(Lys-Asp-Glu-Leu)的CatchER的C末端或N末端，以允许蛋白质面向细胞溶质。将共有的翻译起始Kozak序列(gccaccATGG)置于随后为脯氨酸的Z10(SEQ ID NO：77)序列和CatchER之间。将包括四个氨基酸Ser-Leu-Pro-Ala的接头插入CatchER和延伸的Z5(eZ5)(4551-4597)(SEQ ID NO：76)之间以分隔跨膜区域与钙传感器。将热启动的KOD DNA聚合酶试剂盒用于PCR反应。使用T4DNA连接酶(New England Biolabs)在4℃进行48h的连接。
通过更换2％FBS DMEM诱导C2C12成肌细胞分化，并将其用于研究CatchER变体向ER/SR膜的特异性靶向。将包括CatZ5、CateZ5、CatLeZ5和Z10Cat的所有ER膜靶向的构建体通过对细胞分布C2C12成肌细胞的荧光免疫染色来测试。将C2C12细胞的汇合保持在约30-40％以避免分化。使用0.5mm厚的盖玻片接种细胞，并且转染编码钙传感器的1.5μg质粒DNA。将细胞在30℃培养48小时，然后成像。用3.7％甲醛将细胞固定到盖玻片。将Triton X-100和毛地黄皂苷用于使膜透化。毛地黄皂苷能够与为细胞膜而不是ER膜的组分的甾醇类胆固醇络合，并因此破坏了脂质双层的包装。Triton X-100是可以溶解所有膜的去垢剂。用含有5％BSA的PBS封闭盖玻片，并且添加一抗(抗GFP或抗钙联接蛋白)。应用与Alexa Fluor染料缀合的二抗用于使用具有约50-100nm分辨率的共聚焦显微术ZEISS LSM 700成像，其不能够区分蛋白质锚定在ER膜中还是游离在ER腔中。
在没有预固定的情况下用毛地黄皂苷处理，在C2C12成肌细胞中表达的Z10Cat的自体荧光显示网状结构(图18)，其与钙联接蛋白共定位。CatZ5、CateZ5和CatLeZ5的荧光不如CatchER明亮。因此，应用抗GFP抗体用于可视化靶向的传感器的分布。与Z10Cat类似地，对于这三种靶向的序列，观察到ER网状网络(图19)，表明膜缔合和在细胞溶质侧的定位。然而，仍存在一些Z10Cat保留在ER腔中的可能性。
进行细胞成像研究以评价CatchER FKBP和ER锚定序列融合。编码靶向的CatchER的质粒DNA(1.5-2.0μg)被转染到约30％汇合的未分化的C2C12成肌细胞中，并且在30℃培养细胞36-48小时。为了在诱导分化的C2C12细胞中表达基于CatchER的传感器，当细胞汇合达到70％时，用含有2％FBS的分化培养基代替DMEM。在更换培养基之后转染质粒DNA(2μg)72小时。在30℃培养细胞1周，然后成像。
图20A示出了在C2C12成肌细胞中通过CatFKBP监测的由RyR1激动剂4-cmc(100μM)、ATP(100μM)、SERCA泵抑制剂毒胡萝卜素(1μM)、离子霉素(10μM)和毛地黄皂苷(25μg/ml)诱导的钙浓度变化。
分化开始后，C2C12细胞通常平行生长，并且看起来细长(图20B)。在分化的C2C12细胞中的DNA转染效率低，因此仅记录了在观察视野中的单个细胞。荧光强度不如在C2C12细胞中表达的CatchER明亮。在核和细胞质之间形成的颜色对比可以被区分，并且在核区域较暗。在毛地黄皂苷透化后，荧光保持在核周区域，而在其他区域只看到自发荧光，这意味着大多数CatFKBP在细胞溶质中游离存在，并且一部分能够结合RyR1。施加咖啡因导致荧光强度下降约7％。在没有细胞外钙的情况下，4-cmc触发的荧光减少之后没有恢复。被透化后，通过添加4-cmc，强度略有下降。药物处理表明ER腔中表达有CatchER。
对于分化的C2C12细胞，可以在长管样细胞中发现几个细胞核(图21)。基础荧光强度非常低。观察到荧光的核周模式。在透化之后，强度下降约40％，表明约一半的CatZ5在细胞溶质中游离或未锚定至膜。剩余CatZ5响应低钙溶液和高钙溶液的转换。
由于CateZ5的亮度的限制，难以从总观测荧光中减去光漂白和自发荧光。因此，为了增强荧光，将包括四个氨基酸Ser-Leu-Pro-Ala(SLPA)的接头插入到CatchER和eZ5片段之间，如由核苷酸序列SEQ ID NO：5编码的。
虽然通过插入接头增强了亮度，但是游离细胞溶质和腔CatLeZ5的存在仍是问题。将RyR1的另一跨膜结构域Z10(SEQ ID NO：77)融合到CatchER的N-末端。所得到的由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的构建体Z10Cat比CatLeZ5更明亮，并在显微镜下的亮度与CatchER相当。
对于分化的C2C12细胞，如图22所示，Z10Cat如同ER腔CatchER一样响应，其中4-cmc和咖啡因诱导6％(2min)和10％(40mM)和4％(10mM)的荧光减少。在毛地黄皂苷处理后，存在约30％的荧光减少，大于在未分化的C2C12细胞中观察到的。观察到响应于10mM Ca2+的10％的动态范围。
FKBP与RYR1的结合是CatFKBP靶向ER的先决条件。因此，CatFKBP未能在缺乏RyR1表达的C2C12成肌细胞中形成网状网络，并且它可以在质膜透化后在分化的肌管中形成核周模式，如图20B所示。CatFKBP的钙成像证实了该构建体可用于质膜透化之后的分化的C2C12细胞中。然而，内源性FKBP占据RyR1使得CatFKBP的结合降低。
为了最小化CatchER和靶向结构域之间的相互作用，保持肽长度尽可能短。因此，首先考虑单个跨膜结构域。Z5基序(SEQ ID NO：78)未能在C2C12成肌细胞或分化的C2C12细胞中将融合蛋白靶向膜。相比于Z5，较长序列eZ5(SEQ ID NO：76)在C2C12成肌细胞中在ER靶向方面更好。结果与表明单独的eZ5序列足够用于在COS细胞中的RyR1的ER靶向的报道一致。然而，eZ5在分化的C2C12细胞中也没有成功。除此之外，与跨膜结构域的融合在亮度方面也打折扣(traded)。在目前的四个RyR1跨膜片段融合的CatchER中，CatLeZ5是最有利的，因为它利用了在分化的C2C12细胞中良好的靶向和相对好的亮度。
表2列出了在C2C12成肌细胞和分化的细胞中通过具有不同靶向片段(eZ5、Z5和Z10)的CatchER检测的4-cmc-诱导的钙释放的幅度和到达峰值的时间(time-to-peak)，以及在毛地黄皂苷透化后CatchER荧光的损失。因此，本公开内容的传感器允许将CatchER靶向到SR膜以调查在胞质/SR膜接合处的钙动态。
表2在钙成像中具有不同标签的CatchER的数据总结
a在与加标签的CatchER相同的设置下达到最大检测范围的强度。
bCatFKBP的暴露时间比其他加标签的CatchER短，分别为0.13秒和0.20秒。
当将任一序列融合到CatchER时牺牲了亮度。CatZ5和CateZ5经受低的基础强度的问题，所述低的基础强度估计只有CatchER的10％。由于低的起始强度，使用接头来提高亮度是有利的。与CateZ10和Z10Cat相比，Kozak共有序列确实有助于表达。
因此，本公开内容的钙传感器的实施方案对测量骨骼肌中的SR扁囊(cisternae)和横小管之间的间隙的时空钙变化是有用的，设计了一系列靶向序列以将钙指示剂锚定到SR膜。为了避免过度表达的固有SR膜蛋白的干扰，选择RyR1膜结构域片段作为候选物。将四个RyR1跨膜片段和FKBP融合到CatchER。通过免疫荧光染色观察细胞蛋白定位，并且结果显示CatchER成功锚定在C2C12细胞中的ER膜中。通过钙成像技术评价的钙传感性能表明CatchER存在于ER腔和细胞溶质两者中。
进一步出乎意料地发现，被命名为CatchER-T(具有氨基酸序列SEQ ID NO：71和其变体(SEQ ID NOS：71和SEQ ID NOS：72))，并具有突变L22V、S175G和I218M的钙传感器有利地呈现比传感器CatchER(SEQID NO：37)发射的更大的荧光亮度水平，如图27和28所示。这样的传感器变体已被发现提供在37℃更大的可检测的荧光信号，从而使他们更有利于检测在培养的细胞中的钙水平或体内检测在动物中的钙水平。
本公开内容的一个方面涵盖一种多肽金属离子传感器的实施方案，所述多肽金属离子传感器包含具有异源金属离子结合位点的工程化红色荧光多肽(RFP)，所述异源金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，所述多个带负电荷的残基在结合至其的金属离子的存在下包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，并且其中所述金属离子结合位点与所述工程化RFP的发色团区域协作相互作用，使得当所述传感器不具有结合至其的金属离子时它发出第一荧光信号，并且当所述传感器具有结合至其的金属离子时它发出第二荧光信号，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地可检测的，并且其中所述金属离子传感器具有至少10s-1的对所述金属离子的koff值。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述红色荧光多肽(RFP)可具有与氨基酸序列SEQ ID NO：40至少95％的相似性。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述工程化红色荧光多肽(RFP)可在氨基酸序列SEQ ID NO：40的氨基酸位置152、203、205、207、221、223和227中的至少一个中具有异源带负电荷的氨基酸取代。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述传感器可被缀合到特异性识别细胞的结构特征的至少一个靶向多肽基序。在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述至少一个靶向多肽基序可特异性识别细胞的内质网或肌质网的靶组分。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述靶向多肽基序可具有与选自SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：76-78的氨基酸序列至少90％的序列同一性和序列KDEL。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述金属离子结合位点可特异性结合选自由以下组成的组的金属离子：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、镁、汞和镉。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述第一荧光信号和所述第二荧光信号可在强度、波长和寿命中的至少一个方面不同。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述传感器的氨基酸序列可具有与选自由SEQ ID NO：41-63组成的组的序列至少90％的相似性。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述传感器的氨基酸序列可具有与选自由SEQ ID NO：41-63组成的组的序列至少95％的相似性。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述传感器的氨基酸序列可具有与选自由SEQ ID NO：41-45组成的组的序列至少95％的相似性。
本公开内容的另一个方面涵盖一种重组核酸的实施方案，所述重组核酸具有与选自由SEQ ID NO：7-36组成的组的序列具有至少95％的相似性或将多肽金属离子传感器编码成选自由SEQ ID NO：41-63组成的组的氨基酸序列的核苷酸序列。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，重组核酸可以可操作地插入到表达载体核酸序列中。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，重组核酸在细胞内。
本公开内容的另一个方面涵盖一种多肽金属离子传感器的实施方案，所述多肽金属离子传感器包含具有异源金属离子结合位点的工程化绿色荧光多肽(GFP)，其中所述工程化GFP为具有与氨基酸序列SEQ ID NO：37至少90％的相似性并具有在序列SEQ ID NO：37中并且选自由L22V、S175G及I218M组成的组的至少一个氨基酸取代的变体，并且所述工程化GFP当具有结合至其的金属离子物质时，具有与结合至相同的金属离子物质的多肽SEQID NO：37相比在37℃升高的荧光输出。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述传感器可被缀合到特异性识别细胞的结构特征的至少一个靶向多肽基序。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述至少一个靶向多肽基序可特异性识别细胞的内质网或肌质网的靶组分。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述靶向多肽基序可具有与选自由序列SEQ ID NO：64、76、77、78组成的组的氨基酸序列至少90％的序列同一性和序列KDEL。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述金属离子结合位点特异性结合选自由以下组成的组的金属离子：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、镁、汞和镉。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述传感器的氨基酸序列可具有与选自SEQ ID NO：65-75和79-82的序列至少90％的相似性。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述传感器的氨基酸序列可具有与选自SEQ ID NO：65-75和79-82的序列至少95％的相似性。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述传感器的氨基酸序列可具有选自SEQ ID NO：65-75和79-82的序列。
本公开内容的又另一个方面涵盖一种重组核酸的实施方案，所述重组核酸可具有与编码多肽金属离子传感器的序列具有至少95％的相似性的核苷酸序列，所述多肽金属离子传感器具有选自SEQ ID NO：65-75和79-82的氨基酸序列。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，重组核酸可以可操作地插入到表达载体核酸序列中。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，重组核酸可在细胞内。
本公开内容的又另一个方面涵盖一种检测生物样品中的金属离子的方法的实施方案，所述方法包括：(i)提供多肽金属离子传感器，所述多肽金属离子传感器选自：(a)具有异源金属离子结合位点的工程化红色荧光多肽(RFP)，所述异源金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，所述多个带负电荷的残基在结合至其的金属离子的存在下包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，并且其中所述金属离子结合位点与所述工程化RFP的发色团区域协作相互作用，使得当所述传感器不具有结合至其的金属离子时它发出第一荧光信号，并且当所述传感器具有结合至其的金属离子时它发出第二荧光信号，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地可检测的，并且其中所述金属离子传感器具有至少10s-1的对所述金属离子的koff值，以及(b)具有异源金属离子结合位点的工程化绿色荧光多肽(GFP)，其中所述工程化GFP为具有与氨基酸序列SEQ ID NO：37至少90％的相似性并具有在序列SEQ ID NO：37中并且选自由L22V、S175G及I218M组成的组的至少一个氨基酸取代的变体，并且所述工程化GFP当具有结合至其的金属离子物质时，具有与结合至相同的金属离子物质的多肽SEQ ID NO：37相比在37℃升高的荧光输出；(ii)将所述多肽金属离子传感器或具有编码所述金属传感器的核酸序列的表达载体递送至生物样品；(iii)检测由所述传感器发出的第一荧光信号；(iii)在所述生物样品中产生生理或细胞变化；(iv)检测在步骤(iii)之后由所述传感器发出的第二荧光信号；以及(v)比较所述第一荧光信号和所述第二荧光信号，其中在所述第一荧光信号和所述第二荧光之间在波长或强度中的至少一个中的比率变化指示样品中金属离子的释放速率或细胞内浓度的变化。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，信号强度中的比率变化可提供样品中的金属离子的定量测量。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，所述生物样品可以是动物或人受试者的细胞或组织或从动物或人受试者中分离的细胞或组织。
在本公开内容的这个方面的多肽金属离子传感器的一些实施方案中，当金属离子结合至所述传感器时产生的荧光信号可用于生成图像。
本公开内容的又另一个方面涵盖一种遗传修饰的细胞的实施方案，所述遗传修饰的细胞包含根据本公开内容的重组核酸。
列出以下实施例以便对本领域普通技术人员提供如何进行本文所公开和要求保护的方法和组合物和化合物的用途的完整公开内容和描述。已经作出努力以确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑一些误差和偏差。除非另外指出，否则份数为重量份数，温度以℃计，且压力为大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。
应当指出的是比率、浓度、量和其它数值数据可以在本文中以范围形式表示。应该理解的是，此类范围形式是为了方便和简洁而使用，并且因此应该以灵活的方式解释为不仅包括作为范围的界限明确记载的数值，而且还包括包含在该范围内的所有单个数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确地记载。作为说明，浓度范围“约0.1％至约5％”应解释为不仅包含约0.1wt％至约5wt％的明确记载的浓度，而且还包括在所指示的范围内的单个浓度(例如，1％、2％、3％和4％)以及子范围(例如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％和4.4％)。术语“约”可包括被修饰的(一个或更多个)数值的±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％或更多。
实施例
实施例1
红色荧光钙结合蛋白的设计策略：图1A示出了设计到红色荧光蛋白mCherry(SEQID NO：40)(也表示为RapidER(MCD1))中的由残基E145、D196、D198、E216和E218形成的钙结合位点的模型化的结构。选择mCherry是因为它显示出光稳定性、快速发色团成熟率和低pKa值(如在Shaner等人(2008)Nat.Methods 5:545-551中所描述的)。基于对有利的快速动力学和钙诱导的荧光变化的考虑，这种钙结合位点是基于钙结合几何学和由不同类别的钙结合蛋白的统计分析得到的带电荷的残基的偏好性的特征构建的，如由Tang等人(2011)Proc Natl Acad Sci U.S.A.108:16265-16270；Kirberger等人(2008)J.Biol.Inorg.Chem.13:1169-1181；以及Yang等人(2003)J.Am.Chem.Soc.125:6165-6171所描述的。
不同于由6-7个氧原子组成并且形成具有高钙结合亲和力和选择性的双锥形的经典钙结合袋，将具有减少的配位数的“半壳”用于在β桶的表面上产生钙结合位点，这允许钙的容易进入和释放而无来自钙结合位点本身的空间屏障。由于这种具有Asp和Glu作为主要的钙结合配体残基的半壳钙结合位点，预期钙结合亲和力会低于经典EF-手基序所发现的。为了获得比用CatchER(SEQ ID NO.:37)所观察到的更快的钙缔合速率，设计的钙结合位点周围的带负电荷的区域被扩大，其基于蛋白质和配体之间的静电驱动的相互作用的动力学研究，如在Schreiber&Fersht(1996)Nat.Struct.Biol.3:427-431；Radic等人,(1997)J.Biol.Chem.272:23265-23277；以及Scott等人,(2013)J.Biol.Chem.288:16905-16915中所描述的。
为了耦连钙结合过程与光学特性变化，同时允许发色团形成，根据发色团氢键合网络将钙结合位点安装在袋1中(如图1A所示)。在袋1中，涉及残基145，其与E144和S146侧接。E144的主链氧与发色团酪氨酰通过桥连的水分子形成氢键，并且S146的侧链羟基基团具有双构象异构体，直接作为发色团酪氨酰的氢键供体。此位点也见于CatchER(SEQ IDNO.:37)中的相应位置处。将编码RapidER(MCD1)(MCD1；SEQ ID NO.:43)的核苷酸序列进行密码子优化用于哺乳动物表达条件，原位动态范围增强，并被命名为MCD15(E145、D196、E198、E216、E218、E220)(SEQ ID NO：45)。
实施例2
克隆构建和PCR：Pfu DNA聚合酶和大肠杆菌菌株XL-10Gold来自Stratagene。KOD热启动PCR试剂盒(Novagen)来自EMD Millipore。大肠杆菌菌株DH5α和质粒载体pCDNA3.1(+)来自Invitrogen。所有限制性内切酶、T4DNA连接酶和T4多核苷酸激酶(PNK)来自NewEngland Biolabs。快速DNA连接酶试剂盒来自Roche。引物来自Integrated DNATechnologies。对于所有克隆的DNA测序由GENEWIZ Inc.执行。
具有设计的结合位点的mCherry或cp-mKate变体使用Pfu DNA聚合酶通过定点诱变产生。将接枝法用于插入Ca2+-结合基序或替代DNA区段，例如用Ca2+-结合基序取代原来的环。通过限制退火的片段的解链温度Tm在55-65℃的范围内，不长于45个碱基对(bp)和小于70％的GC含量来设计引物。使用盐调整的方式(salt adjusted equation)计算Tm：
Tm＝81.5+16.6×(log10([Na+]+[K+])+0.41×(％GC)-675/N
亚克隆到pRSETb的mCherry包括从5'到3'末端的顺序His-标签、增强外来DNA在大肠杆菌中表达的T7噬菌体基因10前导区、肠激酶(EK)切割位点以及mCherry基因。将BamHI限制性位点紧接EK切割位点后插入，并且将EcoRI定位在终止密码子后。对于哺乳动物表达，将编码设计的蛋白的DNA通过插入来自pRSETb载体的BamHI/EcoR双消化的DNA亚克隆到pCDNA3.1(+)载体。使用相同的双消化法将mCherry DNA亚克隆到pET28α用于细菌表达。为了将蛋白质靶向内质网(ER)腔中，将ER滞留序列“KDEL”融合到C-末端在终止密码子前，并且将钙网蛋白MLLSVPLLLGLLGLAAAD(SEQ ID NO：64)的ER靶向序列插入到N-端在pCDNA3.1(+)的SacI识别位点后和BamHI位点前。
实施例3
细菌表达和纯化：使用大肠杆菌BL21(DE3)在LB卡那霉素(30μg/mL)中从载体pET28a(EMD Biosciences)表达具有6×His-标签的蛋白。表达在O.D600为0.6下用0.2mM的IPTG诱导，并且允许表达持续21小时，然后通过离心收获细胞。对于这些研究，在诱导之后将温度控制在30℃和37℃。EGFP及其变体的表达用Fluo-star仪器和488nm的激发波长通过510nm处的荧光强度来监测。
蛋白质纯化用装填有镍的Amersham-Pharmacia 5mL HiTrap螯合HP柱进行。细胞沉淀被重悬在20mM Tris、10mM NaCl、0.1％Triton X-100、pH 8.8中并且被声处理。通过离心移出细胞碎片，并且将蛋白质装载到制备的连接至Amersham-Pharmacia AktaPrimeFPLC的HiTrap柱上。在冲洗以除去污染物蛋白质之后，用咪唑梯度洗脱感兴趣的蛋白质。通过透析去除污染物咪唑，并且使用HiTrap Q离子交换柱(Amersham)用NaCl梯度在pH 8.0下进一步纯化蛋白质。通过SDS-PAGE验证蛋白质纯度。
实施例4
蛋白质表达和纯化：颗粒状的LB肉汤miller培养基、酵母提取物、胰蛋白胨和琼脂分别来自EMD Millipore。用于蛋白质表达的大肠杆菌菌株BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS和Rosetta gami DE3pLysS来自Novagen。多克隆抗DsRed抗体来自Clontech。同位素标记的15NH4Cl来自剑桥同位素实验室公司(Cambridge Isotope Laboratories Inc.)。FPLC系统(AKTA prime和AKTA FPLC)、Ni-螯合的Hi-Trap柱、离子交换Q和SP柱、凝胶过滤的Superdex-75柱和疏水相互作用HIC柱都来自GE Healthcare。
对于1升培养基，将25g LB肉汤培养基的pH调节至7.0，并在121℃、15MPa下进行高压灭菌15分钟。筛选大肠杆菌BL21(DE3)以表达野生型EGFP及其变体、野生型mCherry和MCD1及其衍生物，而选择BL21(DE3)PlysS以表达MCD2及其衍生物。
将mCherry及其变体融合到具有相关的氨苄青霉素抗性的pRSETb中；将EGFP及其变体融合到具有相关的卡那霉素抗性的pET28b中。将具有所需质粒的细菌在37℃在含有100μg/ml氨苄青霉素或30μg/ml卡那霉素的10ml LB培养基中预培养过夜。将预培养物与1L含抗生素的新鲜LB培养基混合，并在37℃培养至OD600为0.5-0.6。然后添加IPTG(200μl，1M原液)以诱导表达，并且将温度降至25℃过夜。为了在Rosetta gami(DE3)PlysS中表达蛋白质，在将10ml预培养物混合到在37℃预温热的1L培养基中之后将温度调节至30℃，这允许在IPTG诱导前使细菌适应该温度变化。
通过在4℃以5,000g离心10分钟收获细胞沉淀。添加提取缓冲液(20mM Tris、100mM NaCl、0.1％Triton X-100，pH 8.0)以重悬沉淀。使用弗氏细胞压碎器(FrenchPress)(1240CELL DIS)和声处理(Brenson Sonifier 450)两者破碎细胞。对于弗氏细胞压碎器，将20mL提取缓冲液用于1L培养物，并且采用1000psi。对于声处理，将10ml提取缓冲液用于1L培养物，并且将仪器设定为输出控制为6、占空比(duty cycle)为80％和每周期30个脉冲。应用6个周期，每个周期之间5分钟。将提取物在4℃以17,000rpm离心30分钟，用0.45μm膜(Millipore)过滤，并施加到用Ni2+装填的5ml Hi-Trap柱中。
将FPLC用于使用AKTA prime纯化感兴趣的蛋白质。在装载蛋白质之前，将柱装填0.1M NiSO4，并且用缓冲液A(50mM磷酸盐、250mM NaCl，pH 7.4)平衡，并且用缓冲液B(50mM磷酸盐，250mM NaCl、0.5M咪唑，pH 7.4)洗涤。用300ml缓冲液A去除未结合片段。用10ml10％缓冲液B进行另外的洗涤步骤。用10-100％缓冲液B的梯度洗脱结合的蛋白质。级分的纯度通过SDS-PAGE测定。
使用另外的Mono-Q和凝胶过滤Superdex-75柱去除杂质。收集纯化的级分，在2L10mM Tris(pH 7.4)缓冲液中透析三次，并且然后浓缩并储存在-20℃或立即使用。
实施例5
细胞培养和转染：BHK-21和HeLa细胞两者在100mm培养皿或在35mm培养皿中的玻璃盖玻片(0.5-1.0×106个细胞/皿)上在具有44mM NaHCO3，pH 7.2并补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(Pen/Strep)的Dulbecco Modified Eagles培养基(DMEM，Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中在加湿的培养室中在37℃，5％CO2下生长。接种细胞，并生长过夜，然后用Ca2+传感器质粒构建体瞬时转染。
使用QIAGEN Miniprep方案(Qiagen)从转化的大肠杆菌(DH5α)收获用于转染的质粒DNA。根据制造商的说明书用Lipofectamine-2000(Invitrogen Life Technologies)和无血清Opti-MEMI(Gibco Invitrogen Corporation)将各GFP变体单独且瞬时地转染到BHK-21和HeLa细胞中。具有在1：1和1：3(μg/μl)之间的DNA与Lipofectamine的比的质粒DNA(2μg)通常在典型的转染中使用。在37℃孵育4小时之后，去除含DNA-Lipofectamine复合物的培养基，并用富含FBS和Pen/Strep的DMEM替换。然后，在具有5％CO2的加湿的室中在30℃或37℃使细胞生长1至3天，之后进行荧光或共聚焦显微镜成像。
实施例6
变体构建体：
本公开内容的金属离子传感器的实施方案的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，和靶特异性标签基序的实例列于表3中。
表3
变体DNA通过自动化测序验证。将编码在N和C端之间具有BamHI和EcoRI限制性内切酶位点的EGFP变体的cDNA亚克隆到使用CMV启动子的哺乳动物表达载体pcDNA3.1+中。
实施例7
荧光强度的测量：在贯穿表达的时间点收集三个1ml样品，并在14K rpm下离心3分钟。在pH 7.4的1ml Tris缓冲液中重悬细胞沉淀，并将200μl使用具有390nm和/或460nm激发滤光片和510nm发射滤光片的FLUOstar OPTIMA(BMG Labtech)板读取器来分析。
荧光显微术/成像和其定量：使用倒置落射荧光显微镜(Zeiss Axiovert200)用于体内荧光强度筛选。显微镜配备有氙弧灯、用于Sapphire GFP的具有398nm激发和510nm发射的滤光片、配备有标准的DAPI、FITC和Texas Red滤光片以及透射光。将Axiocam 5CCD照相机以与平台成直角连接到显微镜，并且使用Zeiss Axiovision Rel 4.3软件用于数据收集和分析。对于荧光强度测量，将40×干式物镜与Sapphire GFP和FITC滤光片一起使用，并且曝光时间为50ms至2000ms。使用具有允许荧光强度在动态范围内的曝光的图像用于数据分析。在这个时间范围内测量的荧光强度为曝光时间的线性函数。
测量转染细胞(每幅图像>20个细胞)的面积和平均荧光强度，并在每个成像视野中的细胞的总平均荧光强度用以下方程获得
其中，F为在各图像中的细胞在398nm或480nm处激发的总平均荧光强度，且n为荧光细胞的数目。Si为第i个荧光细胞的面积，且Fi为在第i个荧光细胞在398nm或480nm处激发的平均荧光强度。
在用EGFP-G1-C3转染三天后，HeLa细胞在398nm或480nm处激发的总平均荧光强度用作参考，并且具有其他GFP变体生长不同时间的HeLa细胞在不同波长处激发的荧光强度根据以下方程被表示为EGFP-G1-C3荧光的百分比：
其中，F'为HeLa细胞在398nm或480nm处激发的相对荧光强度，F为HeLa细胞在398nm或480nm处激发的总平均荧光强度，且F0为HeLa细胞在398nm或480nm处激发的总平均荧光强度。
实施例8
为了测量mCherry变体的发色团pKa，在各待测pH下制备单独的样品，并且检查样品的吸光度和荧光。
每个突变体的蛋白质浓度为约10μM。在4℃平衡样品过夜。对于UV-vis光谱，在测定样品UV-vis光谱之前测定适当缓冲液的每个pH值的基线。测量220nm至700nm的吸光度。用在587nm处的激发测量荧光，并且收集595nm至700nm的发射光谱，同时通过固定发射最大值在610nm处进行激发扫描，并且光谱为450nm至600nm。首先测量pH 9的样品，以便狭缝的宽度可以被设置为最佳强度，并测量pH逐渐降低的样品。在采集光谱后使用以下方程计算pH值。
为了计算发色团的消光系数，碱变性的发色团的消光系数用作参照。只要发色团是相同的，在pH 13处的发色团具有相同的消光系数和转移到约455nm的最大吸光度。将10MNaOH加入到该样品中以达到pH 13，并且立即收集光谱。以下方程用于计算消光系数。
其中ε为消光系数；A为吸光度。ε587nm和A587nm在pH 7.4从mCherry及其变体获得，而ε455nm和A455nm来自在pH 13.0的蛋白质。
实施例9
蛋白质的量子产率(Φ)被定义为作为荧光发射的光子数除以在激发中产生的激发态的数目，即由蛋白质发射的荧光除以蛋白质的光吸收。量子产率为零意味着没有荧光，且量子产率为1意味着100％荧光。mCherry蛋白质的量子产率通过测量在不同蛋白质浓度下在610nm处的发射的荧光强度和在586nm处发色团的吸光度来测定。mCherry WT被用作对照以计算其他变体的量子产率。
通过计算特定变体的摩尔消光系数和量子产率，该蛋白质的亮度，定义为视觉感知，其中源表现发射或反射给定量的光，即由可见靶的亮度引起的感知，其由以下方程确定。
为感兴趣的蛋白质的量子产率；F/A为荧光强度作为吸光度的函数的斜率；下标P表示感兴趣的蛋白质；r表示参考蛋白野生型mCherry。
当在587nm处激发时收集在595-750nm之间的荧光发射光谱；当在610nm处发射时测量在400-600nm之间的激发光谱。
实施例10
设计的钙结合蛋白的金属结合分析
解离常数(Kd)测定：将钙滴定至蛋白质样品中以触发荧光的增加直到获得最大值。使用氯化钙(100mM)用于滴定。所有滴定均一式三份。对于CatchER，测试浓度为2μM、10μM和20μM的蛋白质样品以验证Kd为蛋白质浓度非依赖性的。对于mCherry，使用5μM和10μM蛋白质。使用下式计算Kd：
F为从荧光计读取的荧光强度；Fmax和Fmin为在单个实验中读取的最高和最低荧光强度；[P]T和[Ca2+]T为蛋白质和钙的总浓度；a为荧光变化的动态范围。
使用Tb3+作为探针的钙结合：为了进一步显示钙与基于mCherry的钙传感器的结合，采用Tb3+-FRET。滴定通过荧光分光光度计以282nm处的激发和在500-570nm范围内的发射来监测。为了避免由于Tb(OH)3的形成所导致的沉淀，使用20mM PIPES将pH保持在6.5。添加KCl(10mM的终浓度)以最小化非特异性金属结合。Tb3+原液是在相同缓冲液中，具有10mM和100mM的终浓度。蛋白质浓度为约6μM以确保用于FRET的供体的量，并最小化沉淀。
金属选择性：钙传感器对其它生理金属和小分子的选择性是重要标准。将生理金属诸如Mg2+、Zn2+、Cu2+、Na+和K+以及小分子诸如ATP、GTP、ADP和GDP添加到预装载有1mM Ca2+的传感器。光学特性通过UV-vis和荧光分光光度计两者监测。每个竞争剂的浓度多至在生理条件中的游离形式的那些的至少5倍。
实施例11
平衡透析分析
平衡透析分析的模拟：使用透析平衡验证钙与蛋白质的直接结合。以下方案示出了典型的1：1的结合反应：
在平衡状态：
Pfree＝Pt-Ca2+P
Ca2+P＝Ca2+ it-Ca2+ free
使用ICP-OES的总金属测量：使用阳性(α乳清蛋白)和阴性(w.t.--mCherry和缓冲液)对照。为了获得[Ca2+]袋([Ca2+]bag)与[Ca2+]外([Ca2+]out)的大比例，使用高浓度的蛋白质和小浓度的钙。针对1.6L含有15μM Ca2+、10mM Tris的pH 7.4的缓冲液在4℃下将蛋白质(5ml，在10mM Tris中的30μM，pH 7.4)透析48小时。使用ICP-OES分析来自透析袋内部和外部的样品。为了获得“良好折叠”的mCherry变体，通过UV在587nm处测定浓度，并且使用在280nm处的消光系数测定总蛋白质浓度。
在以下波长(nm)处监测钙浓度：396.847、317.933、219.779、370.602、643.907、220.861和373.690。在360.074nm和371.029nm处监测[Y3+]。
实施例12
钙结合的动力学研究：在20℃在配备有汞氙灯(10mm光程，2ms的死区时间(deadtime))的Hi-Tech SF-61停流分光荧光计上用1：1(v/v)比的蛋白质传感器和钙进行停流动力学测量。与钙结合到蛋白质相关的荧光发射变化通过将0.2x Kd至5x Kd范围的钙与10mMpH 7.4的Tris缓冲液混合以587nm处的激发和长通600nm的滤光片来测定。
与钙从蛋白质解离相关的荧光变化通过在相同的缓冲液中混合预装载等于Kd的浓度的钙的蛋白质和10倍等同于蛋白质浓度的EGTA来测量的。对每个点进行六次重复测量，并且根据以下所示单指数函数通过拟合停流迹线来拟合最后三次测量以获得所观察到的速率，kobs：
F＝F0+amp[1-exp(-kobs×t)]
F＝F∞-amp×exp(-kobs×t)
amp＝F∞-F0
kobs＝kon×[Ca2+]+koff
kobs×τ＝ln2
对于具有在0.5mM的Kd的变体MCD15，最终的Ca2+浓度为：100μM、200μM、300μM、500μM、900μM、1300μM、2500μM。将钙溶液制备为：200μM、400μM、600μM、1000μM、1800μM、2600μM、5000μM。为了获得高S/N比，荧光强度是高的。最低钙浓度比蛋白质浓度高至少5倍，以符合[Ca2+]>>[蛋白质]的设想。因此，最终蛋白质浓度为10μM和20μM。
使用从在大肠杆菌BL21(DE3)中的pET28α纯化的MCD15用于动力学研究。首先采取最低(缓冲液)和最高信号(与最高浓度的钙混合的蛋白质)以算出动态范围，并且调整仪器设置以提高动态范围。
F为从荧光计中读取的荧光强度；F0为初始荧光强度，其也是最低的荧光强度；F∞为荧光最大值；amp为荧光的幅度；Kobs为所观察到的速率常数，其通过指数拟合荧光时程获得；kon和koff是钙结合的结合速率和解离速率；τ为所观察到的钙解离的寿命。
实施例13
荧光寿命测量
样品制备：用于寿命测量的蛋白质由大肠杆菌BL21(DE3)Gold表达并使用Ni2+装填的预先填充的Hi-Trap柱和填充有Superdex-75(GE医疗)的尺寸排阻柱纯化。将在10mMTris，pH 7.4中的浓缩的纯蛋白质冻干并溶解在H2O和D2O(95％D)中。检查最终pH和pD并将其分别调节至7.4和7.8。
为了获得在寿命测量中的最佳信号，收集吸收光谱，并且调节蛋白质浓度以实现在395nm处的峰高度最大值在0.2-0.3范围内。
寿命测量：荧光计配备有372nm和467nm的激光。施加两种波长以激发中性和阴离子形式的蛋白质。监测的发射波长对于中性形式为440nm，对于阴离子形式为510nm。针对分别用0.004883ns和0.019531ns的步长(step)，分别在5ns和20ns内在372nm处激发和在440nm处发射的设置，收集1024个数据点。对于在510nm处发射的设置，分别用0.019531ns和0.04883ns的步长在20ns和50ns内收集1024个数据点。所有测量在25℃进行。
数据分析：考虑仪器响应函数并且使用方程2.10解卷积。使用指数方程(2.11拟合荧光衰减的时程。忽略被认为是反映衰减前初始荧光上升的负幅度(negative amplitude)的人工组分，组分具有小于10ps和大于15ns的寿命。有效拟合满足卡方在0.9-1.3范围内并且余差在±4范围内的条件。通过下式计算平均寿命：
Fi(t)＝∫I(x+t+si)fi(x)dx
fi(t)＝Ai0+∑Aijexp(-t/τj)
Fi(t)为在任何给定时间t处的荧光强度；I为仪器响应函数；fi(x)为在时间x处的发色团/蛋白的实时荧光；A为背景荧光的幅度；Ti为组分i的寿命。
实施例14
通过设计的钙结合蛋白原位监测钙响应
材料和供应商：Dulbecco modified Eagle培养基(DMEM)和Hank氏平衡盐溶液(HBSS)来自Sigma Chemical Co.。胎牛血清(FBS)、Opti-MEM还原血清培养基和lipofectamine 2000来自Invitrogen。FuGENE HD转染试剂来自Roche。SERCA泵抑制剂环匹阿尼酸(CPA)和毒胡萝卜素、细胞膜渗透剂毛地黄皂苷、IP3R激动剂组胺和IP3、兰尼碱受体激动剂4-氯-间甲酚(4-cmc)和咖啡因、钙离子载体离子霉素，以及溶剂DMSO来自Sigma。
细胞培养和DNA转染：HEK293和C2C12细胞在100mm培养皿或在35mm培养皿中的玻璃盖玻片(0.5-1.0×106细胞/皿)上在对于HEK293具有高糖且对于C2C12具有44mM NaHCO3(pH 7.2)，并补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素和0.1mg/ml链霉素(Pen/Strep)的DMEM中在加湿的培养室中在37℃，5％CO2下生长。接种细胞并且生长过夜，然后用Ca2+-传感器质粒构建体瞬时转染。
使用QIAGEN Miniprep方案(Qiagen)从转化的大肠杆菌(DH5α)收获用于转染的质粒DNA。根据制造商说明书使用FuGENE HD转染试剂或lipofectamine 2000和无血清Opti-MEM将各mCherry变体单独且瞬时地转染到细胞中。具有DNA与转染试剂的比为1:2-1:3(μg/μl)的质粒DNA(1.5μg)通常在典型转染中使用。随后，细胞在具有5％CO2的加湿室中于37℃生长2天，然后进行荧光显微镜成像。对于C2C12细胞系，在30℃下孵育是有利的。
实施例15
钙校准和响应的细胞成像：校准方案(Hofer AM(2006)Methods Mol.Biol.312:229-247)用于靶向ER腔的基于mCherry的钙传感器。在ER中积累的Mag-Fura-2AM用于比较。药物4-氯-间甲酚(4cmc)、环匹阿尼酸(CPA)、肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)、毒胡萝卜素和腺苷-5'-三磷酸(ATP)用于激活钙通道，诸如兰尼碱受体(RyR)和三磷酸肌醇受体(IP3R)，以释放ER钙或抑制肌质网Ca2+-ATP酶(SERCA)泵重新加载钙进入ER中。
表4：用于诱导钙变化的激动剂和拮抗剂
标准林格氏缓冲液在使用前补充10mM葡萄糖。将细胞内缓冲液制备为125mM KCl、25mM NaCl、10mM HEPES、0.2mM MgCl2、200μM CaCl2、500μM EGTA，以得到最终约100nM的游离[Ca2+]并且在使用前添加0.5mM Na2ATP；调节pH为7.25。将KCl溶液制备为125mM KCl、25mM NaCl、10mM HEPES、0.2mM MgCl2、pH 7.25，将其与钙原液(1M CaCl2)和次氮基三乙酸(NTA)原液(1M)一起用于校准。
为了校准靶向ER中的钙指示剂，膜必需被在细胞内缓冲液中的25μg/mL终浓度的毛地黄皂苷透化。制备钙缓冲液以获得在微摩尔水平的低钙浓度。
实施例16
共聚焦显微镜成像：将BHK-21和HeLa细胞从DMEM转移到具有10mM HEPES、5mMNaHCO3、1mM EGTA，不含二价阳离子的且pH 7.2的Hank氏平衡盐溶液(HBSS(--)，SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)中，用于在LSM 510激光共聚焦显微镜上使用100x油浸物镜(Zeiss,Fluar,1.30n.a.)进行活体成像实验。在成像前，将细胞和缓冲液恢复至环境温度并使其对室内空气平衡。基于EGFP的Ca2+传感器的定位通过使用488nm线的氩激光器激发EGFP可视化，并且采用最窄带通滤光片(505-530nm)用于发射。使用543nm线的He-Ne激光器激发DsRed2-ER，并且通过长通滤光片(560nm以上发射)检测发射。使用Zeiss LSM 510软件(Carl Zeiss,Inc.)控制图像采集参数。所有图像都在高分辨率(1024×1024)下采集。
实施例17
荧光显微镜成像及其定量：用GFP变体转染后1-3天将BHK-21细胞进行成像。具有双重激发能力的运行Metafluor软件(Universal Imaging)的尼康TE200显微镜用于细胞成像实验。在时间序列实验中测量基于EGFP的Ca2+传感器响应于385nm和480nm的激发波长的荧光发射(在510nm处测量)的比率，以监测[Ca2+]ER的变化。在BHK-21细胞中的[Ca2+]ER根据以下方程进行定量：
其中R为在初始状态下385nm/480nm激发的荧光发射比率(在510nm处测定)，Rmin为在无Ca2+状态下确定的发射比率的最小值，Rmax为在Ca2+饱和状态下发射比率的最大值，Kd为表观解离常数(mM)，且n为希尔系数(n＝1)。无Ca2+和Ca2+饱和状态在用5μM离子霉素处理并且分别暴露于1.0mM EGTA和1.0mM Ca2+的细胞上获得。
实施例18
与RapidER(MCD1)的钙结合的动力学研究：将命名为RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)和MCD15(SEQ ID NO：45)的氨基酸序列在细菌中表达并纯化，如在Shu等人(2006)Biochemistry 45:9639-9647中所描述的，通过引用其全文并入本文。
图2A和2B(图a和图b)示出在不存在和存在钙的情况下RapidER(MCD1)(SEQ IDNO：43)的吸光度和荧光光谱，其类似于MCD15(SEQ ID NO：45)的光谱特性。观察到Ca2+诱导的荧光增加，并且使用钙滴定数据(图5)由方程1拟合的解离常数Kd为0.10±0.03mM。
钙结合动力学通过停流荧光计研究(图3)。因此，将RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)与不同浓度的钙混合导致荧光的立即上升。然而，结合过程在死区时间完全消失。因此，在甚至应用的最低钙浓度下存在拟合kobs的较小可能性。类似地，解离速率太快以至于难以捕捉。如图2B所示，停流迹线的叠加示出在EGTA螯合Ca2+之后，荧光信号回落到基态水平。考虑99％的荧光在测量仪器的2ms死区时间中消失，基于在仪器死区时间内完成了4×半衰期的假设，可估计koff为至少1.9×103s-1。假设与RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的钙结合遵循简单的1：1结合模式，kon可以被估计为至少2.7×107M-1s-1。
解离常数是使用荧光增加的幅度的平台期拟合的(0.07±0.01mM)，这与通过分光光度计监测的通过钙滴定独立地确定的Kd值一致，具有在可接受范围内的误差。对于x-Rhod-5F(Invitrogen)观察到相似的快速钙解离速率。通过将预装载的x-Rhod-5F与钙或与EGTA混合确定koff。钙从染料解离的过程也在死区时间内消失，并且仅观察到平台期，如图5所示。
相比于较早的CatchER蛋白(SEQ ID NO：37)，RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)显示更强的钙结合亲和力和更快的动力学。所计算的RapidER(MCD1)(SEQ ID NO:43)的静电结合能变化比CatchER(SEQ ID NO：37)的更大，如表5所示，与由停流荧光光谱术获得的Kd一致。
表5：静电结合能计算
所计算的在设计的钙结合位点中的带负电荷的溶剂可及的表面面积(SASA)在RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)中也大于在CatchER(SEQ ID NO：37)中的。在RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)中的一个带负电荷更多的残基Asp200可有助于Ca2+离子与结合位点的取向，并从而提高结合速率。作为平衡解离常数Kd和结合速率kon的结果，解离速率也增加。
实施例19
所设计的RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的生物物理特性的测定：mCherry(SEQID NO：40)、RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)和MCD15(SEQ ID NO：45)的生物物理特性总结于表6中。
表6：设计的钙结合蛋白的生物物理特性
a由Seefeldt等人(2008)J.Biophotonics 1:74-82报道
如图2B中图c所示的pH曲线，表明荧光变化在pH值高于约6.0下是钙非依赖性的。当pH低于约6.0时，钙结合影响发色团质子化/去质子化的平衡，并导致较高的pKa，与钙对CatchER的作用相反。四个带负电荷的残基的引入降低了量子产率，这在钙离子存在的情况下被补救。与光学光谱一致，消光系数不是钙依赖性的。因此，在没有钙的情况下，所得亮度比野生型低，并且钙结合将其恢复至原来的水平。
实施例20
验证Ca2+-RapidER(MCD1)相互作用的金属结合测定：荧光滴定显示钙依赖性荧光强度随着RapidER(MCD1)增加。为了进一步验证与RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的钙结合，使用平衡透析平衡测定。在平衡时，缓冲液和蛋白质的钙浓度通过ICP-OES确定。α乳清蛋白和野生型mCherry(SEQ ID NO：40)分别作为阳性和阴性对照，如(图6)所示。
仅具有Tris缓冲液的样品用于校正钙离子对透析袋的非特异性粘附的影响。获自透析平衡测定的校正的RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)Kd为0.07±0.04mM，这与通过荧光测量的一致。MCD15(SEQ ID 45)的解离常数未明显低于RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的解离常数。然而，使用通过荧光监测的钙滴定拟合的Kd则约10倍更高，这表明MCD15的荧光相比RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)对钙结合较不敏感。
尽管不希望受任何一种理论的束缚，具有六个负电荷的MCD15(SEQ ID NO：45)中的结合位点可将钙结合中心转移远离发色团酪氨酰，酪氨酰在发色团氢键合网络中起着重要作用。接近发色团敏感区域的局部构象变化需要较大量的Ca2+积累，并且阈值增加。因此，由钙滴定确定的表观解离常数仅反映对荧光变化有效的钙结合而不反映蛋白质本身的钙结合能力。
钙诱导的局部构象变化还在色氨酸-Tb3+荧光共振能量转移(FRET)中观察到。镧系离子与钙共享相似的结合特性(Pidcock&Moore(2001)J.Biol.Inorg.Chem.6:479-489；Brittain等人,(1976)J.Am.Chem.Soc.98:8255-8260)。因此，Tb3+离子可以模拟Ca2+用于结合测定。
在mCherry(SEQ ID NO：40)中存在三个色氨酸残基。W143是靠近RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的设计的钙结合位点的一个，其可能是能量供体的主要来源。当在282nm处激发色氨酸时，Tb3+作为能量受体。因此，Trp-Tb3+FRET的读数可用于验证钙的结合。
当Tb3+(<150μM)加入到RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)中时，观察到在545nm处的荧光强度增加，如图2A所示，这表明发生从色氨酸残基到Tb3+的能量转移。当Tb3+浓度大于150μM时，野生型mCherry和RapidER(MCD1)中观察到颗粒沉淀。MCD15能够耐受Tb3+至约2mM。由于较大电荷与离子半径比率，Tb3+的结合亲和力比Ca2+的结合亲和力强。Tb3+-FRET表明Tb3+能够到达所设计的钙结合位点，这诱导能量从附近的色氨酸转移到Tb3+。
表7.mCherry变体的解离常数
a在587nm处激发蛋白质，并且在610nm处的最大荧光发射强度用于计算。
b激发/发射分别设定为587/610nm。在平台期的平均荧光强度用于计算。
c平均值从五个Ca2+特征发射波长：317.933、370.602、373.690、396.847、643.907nm处获得。
d在10mM PIPES、pH 6.5、10mM KCl下进行实验。在350nm处激发，且采集从420-600nm的发射。
Tb3+荧光用于确定发色团和结合的Tb3+之间的距离。在此，由于在545nm处Tb3+的发射光谱和RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)的激发光谱之间的重叠，FRET对包括Tb3+和RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)。在FRET供体和受体之间的距离与供体在受体的不存在和存在下的寿命比率相关。其中发色团MYG突变为GGG的RapidER(MCD1)ggg与RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)一样折叠，但不发荧光。在不存在受体的情况下，Tb3+-RapidER(MCD1)ggg的寿命是FRET供体的寿命。
图2B示出了当结合RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)时，Tb3+的荧光衰减更快。FRET的效率为94％，且比率r/R0为0.6。通过Hink等人,(2003)J.Fluoresc.13:185-188的方案确定临界距离。所计算的临界距离以及发色团和Tb3+离子之间的距离分别为和在RapidER(MCD1)(SEQ ID NO：43)模型中测量的Ca2+与发色团的距离在的范围内，与所计算的距离和Ca2+-CatchER的晶体结构一致，证实了在mCherry(SEQ ID NO：43)中的钙离子位点的定位，如图2C所示。
实施例21
红色荧光钙结合蛋白的原位评价：为了在高钙环境中原位评价设计的钙结合蛋白，将蛋白在N末端与钙网蛋白内质网(ER)标签融合并且在C末端与ER滞留肽序列KDEL融合。
应用兰尼碱受体(4-cmc)的激动剂、SERCA泵的拮抗剂(CPA)和钙离子载体离子霉素，并且通过设计的蛋白质监测钙反应。这些药物对细胞的应用导致从ER的钙释放。因此，预期在添加这些药物之后，来自ER靶向的钙传感器的信号降低。
四个细胞系(HEK-293、BHK、HeLa和C2C12)用于验证这些传感器。离子霉素、4-cmc和CPA处理对所有细胞系都导致荧光强度的程度降低，如图7)所示。图4示出通过MCD15ER(具有ER标签的MCD15)(SEQ ID NO：42)和Fura-2同时监测的由离子霉素触发的钙从ER的释放。
内质网钙([Ca2+]ER)浓度在添加离子霉素后降低，而胞质钙([Ca2+]cyt)浓度增加。由于没有胞外钙供应，在钙于胞质中积累的早期阶段后钙被泵出。当补充钙时，胞质和ER的[Ca2+]两者的浓度增加。不像胞质钙，即使胞外钙为约10mM，ER中的钙仅恢复到它的静息水平。
实施例22
金属选择性：钙传感器对其它生理金属和小分子的选择性是重要标准。将生理金属诸如Mg2+、Zn2+、Cu2+、Na+和K+以及小分子诸如ATP、GTP、ADP和GDP添加到预装载有1mM Ca2+的传感器。通过UV-vis和荧光分光光度计两者检测光学特性。每个竞争剂的浓度多至在生理条件下的游离形式的那些的至少5倍。

Claims (14)

1.一种多肽金属离子传感器，所述多肽金属离子传感器包含具有异源金属离子结合位点的工程化红色荧光多肽，所述异源金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，所述多个带负电荷的残基在结合至其的金属离子的存在下包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，并且其中所述异源金属离子结合位点与所述工程化红色荧光多肽的发色团区域协作相互作用，使得当所述多肽金属离子传感器不具有结合至其的金属离子时它发出第一荧光信号，并且当所述多肽金属离子传感器具有结合至其的金属离子时它发出第二荧光信号，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地可检测的，其中所述多肽金属离子传感器具有至少10s-1的对所述金属离子的koff值，其中所述工程化红色荧光多肽的氨基酸序列为SEQ ID No:41-45、48或56。
2.根据权利要求1所述的多肽金属离子传感器，其中所述多肽金属离子传感器被缀合到特异性识别细胞的结构特征的至少一个靶向多肽基序。
3.根据权利要求2所述的多肽金属离子传感器，其中所述至少一个靶向多肽基序特异性识别细胞的内质网或肌质网的靶组分。
4.根据权利要求2-3的任一项所述的多肽金属离子传感器，其中所述至少一个靶向多肽基序的序列选自SEQ ID NO：64、76-78和序列KDEL。
5.根据权利要求1所述的多肽金属离子传感器，其中所述异源金属离子结合位点特异性结合选自由以下组成的组的金属离子：钙、铅、钆、镧、铽、锑、锶、镁、汞和镉。
6.根据权利要求1所述的多肽金属离子传感器，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号在强度、波长和寿命中的至少一个中不同。
7.一种重组核酸，所述重组核酸的核苷酸序列将多肽金属离子传感器编码成选自由SEQ ID NO：41-45、48和56组成的组的氨基酸序列。
8.一种重组核酸，所述重组核酸的核苷酸序列是SEQ ID NO:7、8、9、17-18或31。
9.根据权利要求7或8所述的重组核酸，其中所述重组核酸可操作地插入到表达载体核酸序列中。
10.根据权利要求9所述的重组核酸，其中所述重组核酸在细胞内。
11.一种检测生物样品中的金属离子的方法，所述方法包括：
(i)提供多肽金属离子传感器，所述多肽金属离子传感器为：具有异源金属离子结合位点的工程化红色荧光多肽，所述异源金属离子结合位点包括多个带负电荷的残基，所述多个带负电荷的残基在结合至其的金属离子的存在下包括五角双锥几何学取向的多个羧基氧，并且其中所述异源金属离子结合位点与所述工程化红色荧光多肽的发色团区域协作相互作用，使得当所述多肽金属离子传感器不具有结合至其的金属离子时它发出第一荧光信号，并且当所述多肽金属离子传感器具有结合至其的金属离子时它发出第二荧光信号，其中所述第一荧光信号和所述第二荧光信号是可区分地可检测的，其中所述多肽金属离子传感器具有至少10s-1的对所述金属离子的koff值，其中所述工程化红色荧光多肽的氨基酸序列为SEQ ID No:41-45、48或56；
(ii)将所述多肽金属离子传感器或具有编码所述多肽金属离子传感器的核酸序列的表达载体递送至生物样品中；
(iii)检测由所述多肽金属离子传感器发出的第一荧光信号；
(iv)在所述生物样品中产生生理或细胞变化；
(v)检测在步骤(iv)之后由所述多肽金属离子传感器发出的第二荧光信号；以及
(vi)比较所述第一荧光信号和所述第二荧光信号，其中在所述第一荧光信号和所述第二荧光信号之间在波长、强度和寿命中的至少一个中的比率变化指示所述生物样品中金属离子的释放速率或细胞内浓度的变化。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述信号强度中的比率变化提供了所述生物样品中的金属离子的定量测量。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物样品是动物或人受试者的细胞或组织或从动物或人受试者中分离的细胞或组织。
14.根据权利要求11所述的方法，其中当金属离子结合到所述多肽金属离子传感器时所产生的荧光信号用于生成图像。
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