CN117795312A - 用于通过比率表征荧光粒子的方法和设备 - Google Patents
用于通过比率表征荧光粒子的方法和设备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117795312A CN117795312A CN202280046789.7A CN202280046789A CN117795312A CN 117795312 A CN117795312 A CN 117795312A CN 202280046789 A CN202280046789 A CN 202280046789A CN 117795312 A CN117795312 A CN 117795312A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fluorescent
- wavelength
- particles
- fluorescence
- labeled
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 271
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 108
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 92
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 59
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 56
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 51
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 47
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 32
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 22
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 22
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 22
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 16
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 11
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 11
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 5
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 5
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 3
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 3
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 claims description 2
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 abstract description 9
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 abstract description 9
- 230000009073 conformational modification Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 124
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 89
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 63
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 55
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 54
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 47
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 46
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 41
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 30
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 30
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 28
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 28
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 28
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 25
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 25
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 24
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 24
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 23
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 23
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 22
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 22
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 20
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 14
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 14
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 12
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 11
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 9
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 9
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 9
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 description 9
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 description 9
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 8
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 7
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 7
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 7
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 7
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001005711 Homo sapiens MARVEL domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 101001109518 Homo sapiens N-acetylneuraminate lyase Proteins 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 6
- 102100022686 N-acetylneuraminate lyase Human genes 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 6
- 238000004093 laser heating Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 5
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 5
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 5
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 5
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 5
- 101001024442 Cellulomonas fimi Beta-N-acetylglucosaminidase/beta-glucosidase Proteins 0.000 description 5
- -1 FLAG tags Chemical class 0.000 description 5
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 5
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 5
- BZKPWHYZMXOIDC-UHFFFAOYSA-N acetazolamide Chemical compound CC(=O)NC1=NN=C(S(N)(=O)=O)S1 BZKPWHYZMXOIDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000571 acetazolamide Drugs 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Chemical group 0.000 description 4
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 4
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003883 furosemide Drugs 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 101000984310 Bos taurus Carbonic anhydrase 2 Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- WZZVUHWLNMNWLW-VFCSDQTKSA-N beta-D-GlcpNAc-(1->4)-beta-D-GlcpNAc-(1->4)-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 WZZVUHWLNMNWLW-VFCSDQTKSA-N 0.000 description 3
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 3
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- QMOLHJKSZMURCV-UHFFFAOYSA-N Flavidin Chemical compound O1CC2=CC(O)=CC3=C2C2=C1C=C(O)C=C2CC3 QMOLHJKSZMURCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000604027 Homo sapiens Nuclear protein localization protein 4 homolog Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108700012928 MAPK14 Proteins 0.000 description 2
- 102100023482 Mitogen-activated protein kinase 14 Human genes 0.000 description 2
- 102100038438 Nuclear protein localization protein 4 homolog Human genes 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 238000010461 azide-alkyne cycloaddition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 239000011146 organic particle Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000000985 reactive dye Substances 0.000 description 2
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 2
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HMLGSIZOMSVISS-ONJSNURVSA-N (7r)-7-[[(2z)-2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)-2-(2,2-dimethylpropanoyloxymethoxyimino)acetyl]amino]-3-ethenyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(C=C)CSC21)C(O)=O)=O)C(=O)\C(=N/OCOC(=O)C(C)(C)C)C1=CSC(N)=N1 HMLGSIZOMSVISS-ONJSNURVSA-N 0.000 description 1
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- MUPNITTWEOEDNT-TWMSPMCMSA-N 2,3-bis[[(Z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol Chemical compound CC(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2[C@@H]3CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MUPNITTWEOEDNT-TWMSPMCMSA-N 0.000 description 1
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRFJOIPOPUJUMI-KWXKLSQISA-N 2-[2,2-bis[(9z,12z)-octadeca-9,12-dienyl]-1,3-dioxolan-4-yl]-n,n-dimethylethanamine Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCCC1(CCCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC)OCC(CCN(C)C)O1 LRFJOIPOPUJUMI-KWXKLSQISA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- AJNUQUGWNQHQDJ-UHFFFAOYSA-N 4',5'-bis(1,3,2-dithiarsolan-2-yl)-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound S1CCS[As]1C=1C(O)=CC=C(C23C4=CC=CC=C4C(=O)O3)C=1OC1=C2C=CC(O)=C1[As]1SCCS1 AJNUQUGWNQHQDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027715 4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical compound [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031480 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710146526 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229940127406 Estrogen Receptor Agonists Drugs 0.000 description 1
- 229940102550 Estrogen receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 244000187656 Eucalyptus cornuta Species 0.000 description 1
- 240000006829 Ficus sundaica Species 0.000 description 1
- 101710182268 Heat shock protein HSP 90 Proteins 0.000 description 1
- 101001081225 Homo sapiens 4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000974007 Homo sapiens Nucleosome assembly protein 1-like 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001099181 Homo sapiens TATA-binding protein-associated factor 2N Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000051628 Interleukin-1 receptor antagonist Human genes 0.000 description 1
- 108700021006 Interleukin-1 receptor antagonist Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124647 MEK inhibitor Drugs 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001042190 Medicago scutellata Bowman-Birk type proteinase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100094105 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NPL6 gene Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038917 TATA-binding protein-associated factor 2N Human genes 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate;hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N 0.000 description 1
- NRLNQCOGCKAESA-KWXKLSQISA-N [(6z,9z,28z,31z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl] 4-(dimethylamino)butanoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCCC(OC(=O)CCCN(C)C)CCCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC NRLNQCOGCKAESA-KWXKLSQISA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004238 anakinra Drugs 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010002833 beta-lactamase TEM-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003508 chemical denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 239000012943 hotmelt Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 150000002692 maltoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002107 nanodisc Substances 0.000 description 1
- 239000007908 nanoemulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000006070 nanosuspension Substances 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N pemoline Chemical compound O1C(N)=NC(=O)C1C1=CC=CC=C1 NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 238000002310 reflectometry Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002165 resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012883 sequential measurement Methods 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 239000005361 soda-lime glass Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000001089 thermophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明涉及用于通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化来表征在溶液中的荧光标记粒子的设备和方法。特别是，在不同的条件/环境下通过荧光激发、并测量相应的荧光发射来分析所述荧光标记粒子的样品。通过分析在不同的条件/环境下测得的荧光发射来表征所述粒子。更具体而言，本发明涉及用于通过比率表征所述荧光标记粒子的分子间和/或分子内相互作用、和/或构象修饰和/或定位的方法和设备。
Description
发明领域
本发明涉及用于通过分析荧光标记粒子(fluorescently labeled particles)的荧光光谱的变化来表征在溶液中的荧光标记粒子的设备和方法。特别是，将所述荧光标记粒子的样品在不同的条件/环境下通过荧光激发、并测量相应的荧光发射进行分析。通过分析在这些不同的条件/环境下测得的荧光发射来表征所述粒子。更具体而言，本发明涉及用于通过比率(ratiometric)表征所述荧光标记粒子的分子间和/或分子内相互作用、和/或构象修饰和/或定位的方法和设备。
背景技术
荧光标记的荧光光谱是对环境变化敏感的，例如化学环境的变化和温度的变化。因此，相同的荧光标记可以显示在其荧光光谱中的强度和/或光谱位移和/或光谱形状方面的变化。
因为此作用是已知的，所以研究了以固有和外源性方式荧光标记的粒子的相互作用。在本领域中，荧光强度的变化主要用于通过确定离解常数(K4)来表征结合反应(NPL1，NPL2)。除了表征分子间相互作用之外，待测量的相互作用还可以包括分子内相互作用，和/或荧光标记粒子的修饰(构象的变化)和/或定位(变化)。例如，在本领域中涉及基于称为共振能量转移(FRET)的机理的方法来确定蛋白质的构象变化和被分析物的浓度(WO 2017/087912 A2)。FRET的基础机理包括处于被激发的电子态的给体荧光团，其可以将激发能量经由偶极-偶极耦合作用转移到附近的受体荧光团，这是由于在这两个荧光团之间的距离和/或角度方面的相互作用调节的(例如，配体调节的)变化。如此，FRET测量法需要两个或更多个荧光标记，即至少一个给体荧光团和至少一个受体荧光团。但是，因为使用两个不同的荧光标记，其中每个标记可以对于环境变化具有不同的敏感性，所以FRET测量法可能由于在荧光团的局部环境中的非所需的变化而出错。此外，当经由能量转移被激发时，来自受体荧光团的荧光发射通常提供比来自直接激发的受体荧光团的发射强度更低的信号强度。通常，FRET测量法需要给体荧光团和受体荧光团在靶分子上限定距离内的精确定位，例如通过采用两个特定位点的标记化学，这进而可能对每种类型的靶点而言是不实际的。相比之下，无规律的标记，例如通过赖氨酸反应性染料或半胱氨酸反应性染料标记，会导致不同的FRET距离，因此导致FRET测量法失败。总之，FRET测量法具有与涉及如本发明所述使用仅仅单个荧光标记的测量法相比更低的信噪比，和期望待分析的荧光标记粒子用仅仅一种类型的荧光标记进行标记。
根据荧光标记自身的相互作用和特征，荧光光谱的变化可以小于1％，这处于移液误差的常规范围内。目前，这是困难的，因为使用现有技术的方法/设备无法分辨小于1％的变化。
荧光标记的荧光光谱中的变化通常用荧光分光光度计测量，其设计用于在大的光谱范围内记录/测量，因此无法分辨荧光强度的小变化。另外，因为市售的荧光标记目前设计用于更牢靠地抵抗环境变化，所以需要设计超级敏感的荧光标记以提高荧光分光光度计测量的分辨率(NPL3，NPL4，NPL5)。
改善荧光分光光度计测量的分辨率的另一个可能性可以通过合并多次测量来实现。在此情况下，将待测样品在第一波长处激发，并在第一次测量中测量其在第二波长处的发射，然后重复进行在第一波长处的激发步骤，并在第二次测量中测量其在第三波长处的发射。然后，将从第一次和第二次测量测得的发射强度合并。所以，可以确定受关注的纯信息，且与任何假象无关，例如由于手动操作引入的假象。但是，由于随后进行两次测量，该方法更繁杂且更耗费时间。而且，在第一次测量和第二次测量期间的条件可能变化。此外，可能出现漂白，这可以进一步导致测量结果不准确。通过使用此方式，当在室温下测量时能分辨低至4.5％的荧光变化(NPL2)。
一般而言，使用市售的荧光分光光度计设备进行的测量需要大的样品体积(即，使用石英小容器或多孔板)，所以需要较高的样品浓度以充足地分辨荧光强度的变化。下面讨论本领域已知的其它方法，其中需要较小的样品体积(即10μl)。
例如，在室温下的绝对强度变化与移液误差相比过小的情况下，可以使用基于与温度相关的强度变化的表征方法(TRIC)来消除移液误差(WO 2018/234557)。通过计算F热/F冷，即基于在室温下测量的强度与在第二个、通常较高的温度下测量的强度之间的荧光强度比率，仍然可以确定有意义的分子间和/或分子内相互作用的测量。
但是，温度的升高，甚至在温度仅仅升高几度(℃)时：
-待测量的粒子不总是能忍受这种升温。因此，该方法不适用于表征涉及不稳定样品的相互作用，例如不稳定的蛋白质。
-对于荧光标记粒子和对于与配体络合的荧光标记粒子，荧光强度可出现同样的变化。在此情况下，“F热/F冷”在这两种情况下具有相同的值，和虽然在相互作用的参与者之间发生相互作用，但无法得到结合曲线。
-不均匀的样品，例如含有特定比例的聚集体的样品，可以由于对流而导致不可重现的荧光踪迹，这意味着在“F热/F冷”中的噪声可以显著变大。因此，对于信号幅度小的体系而言，无法得到结合曲线。
另外，在分析三元复合物的相互作用时，例如含有已标记的分子A、另一个与A结合的分子B和与B结合的第三个分子C的三元复合物，TRIC的变化通常不足以分辨出相互作用。
在随着温度和配体结合而快速变化的相互作用引起荧光强度出现变化的情况下，TRIC方法可以得到双阶段的剂量-响应曲线，其不能用S形1-to-1结合模型分析，或者离解常数的测量值可以偏离实际值(例如，测量的结合亲合力对应于在较高温度下的较弱结合，而不是在较低温度下)。
一种研究荧光粒子的分子内和/或分子间相互作用的不同途径是微量差示扫描荧光技术(WO2017/055583)。该方法基于测量含有色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)残基的蛋白质的固有荧光强度的变化。但是，蛋白质通常含有多个荧光芳族氨基酸残基。因为通常不是所有的残基都参与结合反应，所以在激发时出现高的荧光背景，这降低了信号幅度。另外，Trp和Tyr残基通常位于蛋白质的疏水性核中，可能不太受到配体结合的影响。因为通常处于与Trp和Tyr的荧光相同的范围内，所以配体的自动荧光会干扰读数。
相比之下，通过用外源性荧光标记进行标记，可以控制仅仅一种染料(即，一种类型的染料)连接到靶分子，和仅仅染料需要受到配体结合的影响。此外，可以设计标记化学，以使染料可布置在对于测量在化学微环境中的变化而言最佳的位置(例如，在配体结合位点的附近)。另外，外源性染料通常位于蛋白质的表面上，所以能理想地暴露以感知化学微环境的变化。可以选择染料的荧光范围以使其不会干扰配体的自动荧光。最后，外源性染料是显著更亮的，可以在显著更低的靶分子的浓度下进行测量，从而减少样品的消耗，并允许测量甚至皮摩尔(picomolar)级别的亲合力。
因此，仍然需要改善的或替代性的方法或者改善的或替代性的设备用于表征荧光标记粒子的分子间和/或分子内相互作用、和/或修饰(构象变化)和/或定位(的变化)。
发明概述
本发明提供用于表征荧光标记粒子的分子间和/或分子内相互作用、和/或修饰(构象变化)和/或定位(的变化)的新方法和设备，如独立权利要求的特征所定义。本发明进一步优选的实施方案如从属权利要求中所定义。特别是，本发明解决了基于优选仅仅一个荧光标记且在与荧光标记粒子的特征(例如温度稳定性、聚集体的形成)和尺寸无关的情况下，以经济可行的方式分辨所述荧光标记粒子的荧光光谱中的任意小变化的技术问题。
本发明涉及用于通过比率表征荧光标记粒子的分子间和/或分子内相互作用、和/或构象修饰和/或定位的方法和设备。特别是，本发明方法提供在荧光标记粒子的小样品体积内测量荧光标记的荧光光谱变化时的改进的灵敏度，这尚未通过现有技术已知的方法实现。另外，本发明方法能够快速测量甚至温度敏感的和/或不稳定的样品。与限定的温度扰动组合，本发明方法能测量相互作用的热力学参数和动力学参数。在本发明方法中，使用荧光标记粒子，其优选用至少一个荧光标记进行标记。本发明方法能够确定荧光标记粒子的定位(例如，如果荧光标记粒子位于类脂纳米粒子(LNPs)内、和/或位于细胞内和/或位于LNPs和细胞周围的缓冲液内)。
在第一方面，本发明涉及通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化来表征在溶液中的荧光标记粒子的方法。第一方面的方法包括以下步骤：
a)在第一个条件下提供在溶液中的荧光标记粒子的样品，
b)在第一波长处激发所述荧光标记粒子，
c)测量所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度，
d)计算在所述第二波长和第三波长处的荧光强度之间的比率，其中所述第三波长与所述第二波长不同。进一步优选的是：
e1)使所述荧光标记粒子的样品在第二个条件下重复进行步骤b)至d)，或
e2)使所述荧光标记粒子的第二个样品在第二个条件下重复进行步骤a)至d)，
其中所述第二个条件与所述第一个条件不同。
f)然后可以基于在所述不同条件下得到的比率计算值，表征所述荧光标记粒子，
其中优选同时测量第二波长和第三波长，和其中第二波长优选比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更短，且第三波长优选比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更长。
在第二方面，本发明涉及通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化与限定的温度扰动/温度变化的组合来表征在溶液中的荧光标记粒子的方法。第二方面的方法包括以下步骤：
a)在第一个条件下提供在溶液中的荧光标记粒子的样品，
b)在第一波长处激发所述荧光标记粒子，
c)测量所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度，其中所述强度是在限定的温度扰动期间测量的，
d)计算在所述第二波长和第三波长处的荧光强度之间的比率，其中所述第三波长与所述第二波长不同。
与第一方面相似，该方法也优选：
e1)使所述荧光标记粒子的样品在第二个条件下重复进行步骤b)至d)，或
e2)使所述荧光标记粒子的第二个样品在第二个条件下重复进行步骤a)至d)，
其中所述第二个条件与所述第一个条件不同，和
f)基于在所述不同条件下得到的比率计算值，表征所述荧光标记粒子，
其中优选同时测量第二波长和第三波长，和其中第二波长优选比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更短，且第三波长优选比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更长。
在第三方面，本发明涉及通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化与限定的温度扰动/温度变化的组合来表征在溶液中的荧光标记粒子的热力学和/或动力学参数的方法。
在第四方面，本发明涉及通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化单独地或与限定的温度扰动/温度变化的组合来表征在溶液中的荧光标记粒子的定位的方法。
在本发明中优选的是，在步骤c)中同时测量在第二波长和第三波长处的荧光发射强度，这优选表示在小于1s的短时间间隔内测量，更优选小于750ms，更优选小于500ms，更优选小于250ms，更优选小于100ms，更优选小于50ms，更优选小于25ms，更优选小于10ms，更优选小于5ms，甚至更优选小于2.5ms。在此方面，典型的时间间隔是50ms、10ms和1ms。
本发明的一些具体方面可以如下汇总：
在一些方面，本文所述的方法包括以下步骤：a)在第一个条件下提供在溶液中的荧光标记粒子的样品；b)在第一波长处激发所述荧光标记粒子；c)测量所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度；d)计算在所述第二波长和第三波长处的荧光强度之间的比率，其中所述第三波长与所述第二波长不同；e1)使所述荧光标记粒子的样品在第二个条件下重复进行步骤b)至d)，或e2)使所述荧光标记粒子的第二个样品在第二个条件下重复进行步骤a)至d)，其中所述第二个条件与所述第一个条件不同；f)基于在所述不同条件下得到的比率计算值，表征所述荧光标记粒子；其中同时测量第二波长和第三波长，和其中第二波长比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更短，且第三波长比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更长。
在本发明的一些方面，含有荧光标记粒子的样品的体积小于100μl，优选为1μl至25μl，即以小于100μl、优选1μl至25μl的体积提供含有荧光标记粒子的样品。
优选的是，在本发明的一些方面，以1μl至25μl的体积提供含有荧光标记粒子的样品。
在本发明的一些方面，在毛细管中提供含有荧光标记粒子的样品。
在本发明的一些方面，所述荧光标记粒子用对环境敏感的标记进行标记。
在本发明的一些方面，所述粒子选自有机分子、生物分子、纳米粒子、微粒、囊泡、生物细胞或亚细胞片段、生物组织、病毒粒子、病毒、细胞器、类脂纳米粒子(LNPs)和病毒样粒子。
在本发明的一些方面，所述生物分子选自氨基酸、蛋白质、肽、单糖和二糖、多糖、类脂、糖脂、脂肪酸、甾醇、维生素、神经递质、酶、核苷酸、代谢物、核酸及其组合。
在本发明的一些方面，所述荧光标记粒子在溶液中的浓度是10pM至10μM，优选50pM至500nM。
在本发明的一些方面，所测量的荧光标记粒子的荧光强度的变化是来源于光谱位移、或光谱变宽、或光谱变窄、或其组合。
在本发明的一些方面，荧光标记粒子的荧光强度由于选自以下的机理而变化：荧光标记粒子的构象变化，荧光标记粒子的再定位，在荧光标记粒子与一种或多种配体之间的相互作用，及其组合。
在本发明的一些方面，在步骤f)中得到的比率计算值用于确定荧光标记粒子的定位或选自以下的参数：离解常数，有效浓度最大值的一半(EC50)，平衡常数，结合动力学，酶催反应动力学，热力学参数，去折叠(unfolding)或再折叠动力学，开放和闭合反应，及其组合。
在本发明的一些方面，步骤e)的第二个条件通过添加配体和/或不同浓度的配体来改变，并且在步骤f)中得到的比率计算值用于确定荧光标记粒子和配体的离解常数。
在本发明的一些方面，所述荧光标记粒子的第一个条件和第二个条件在它们的温度和/或化学组成方面不同。
在本发明的一些方面，在步骤c)中，所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度是在限定的温度扰动期间测量的。
本发明也提供用于通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化来表征在溶液中的荧光标记粒子的设备。在一些方面，本发明的设备适用于进行本文所述的方法。在一些方面，该设备包括：样品容器，其用于容纳在多个条件(即，多个不同的条件)下在溶液中的荧光标记粒子的样品；用于在第一波长处激发所述荧光标记粒子的装置；用于测量所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度的装置；用于计算在第二波长和第三波长处的荧光发射强度之间的比率的装置，其中所述第三波长与所述第二波长不同；其中所述设备构造为连续地进行荧光激发、测量荧光发射并计算样品在不同条件下的比率；用于基于在不同条件下得到的比率计算值表征所述荧光标记粒子的装置，其中该设备构造为同时测量第二波长和第三波长，和其中第二波长比所述荧光标记粒子在(所述不同条件中的)第一个条件下的荧光发射的发射最大值更短，且第三波长比所述荧光标记粒子在(所述不同条件中的)第一个条件下的荧光发射的发射最大值更长。
在本发明的一些方面，所述用于激发的装置是激发光源，优选至少一个选自激光器、激光纤维激光器(laser fibre laser)、二极管激光器、LED、HXP、卤素、LED阵列、HBO的光源。
在本发明的一些方面，所述用于测量的装置是光探测器，优选至少一个选自PMT、siPM、APD、CCD或CMOS摄影机的探测器。
本发明也提供包含指令的计算机程序，当由计算机执行该程序时，所述指令使得计算机进行本文所述的方法。
本发明也提供包含指令的计算机可读取的数据载体，当由计算机执行时，所述指令使得计算机进行本文所述的方法。
本发明也提供设备用于根据本文所述的方法表征在溶液中的荧光标记粒子的用途。
本发明也提供毛细管用于通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化来表征在溶液中的荧光标记粒子的用途，其中将所述在溶液中的荧光标记粒子的样品装入毛细管并根据本文所述的方法进行分析。
附图简述
下文参考附图更详细地描述本发明的优选实施方案。
图1(A)显示被相同荧光染料标记的四种不同的蛋白质样品的激发光谱。将这些样品在520nm和670nm之间激发。记录这些样品在690nm处的发射。(B)是(A)中的激发峰的放大图像。
图2(A)显示被相同荧光染料标记的四种不同的蛋白质样品的发射光谱。将这些样品在605nm处激发。记录这些样品在620nm和750nm之间的发射。(B)是(A)中的发射峰的放大图像。
图3显示标记的分子的(A)配体邻近和(B)构象变化对荧光染料的荧光光谱变化的潜在影响，所述荧光光谱的变化包括(C)蓝移(蓝色)或红移(红色)的移动和/或(D)光谱的变宽或变窄。
图4(A)显示荧光标记的蛋白质链霉亲和素(streptavidin)自身的发射峰，以及荧光标记的蛋白质链霉亲和素与其天然配体生物素组合的发射峰。(B)是(A)中的发射峰的放大图像。
图5(A)显示荧光标记的蛋白质溶菌酶(lysozyme)自身的发射峰，以及荧光标记的蛋白质溶菌酶与抑制剂三-N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG3)组合的发射峰。(B)是(A)中的发射峰的放大图像。
图6(A)显示碳酸酐酶(Carbonic anhydrase)作为与呋塞米(furosemide)的复合物的比率踪迹，这使用本发明的双发射(dual-emission)构造测量。碳酸酐酶在与呋塞米结合时的荧光比率变化是0.5％。(B)显示所得的结合相互作用的剂量-响应曲线。
图7(A)显示未标记的溶菌酶和不同浓度的NAG3在升高温度过程中的固有色氨酸荧光的比率350nm/330nm。为了监测变性温度，将每个样品从35℃加热到95℃。NAG3浓度的增加导致溶菌酶的热稳定化，即热位移。这种位移不能用于提取该相互作用的离解常数。(B)通过相对于NAG3的浓度绘制在35℃下的固有蛋白质荧光的初始比率350nm/330nm，得到S形(sigmoidal)的剂量-响应曲线，进而得到在所述温度下的离解常数(Kd)。
图8显示本发明的不同实施方案。(A)显示具有双发射光学和红外(IR)激光的优选实施方案。(B)显示具有双发射光学的实施方案。(C)显示具有双激发(dual-excitation)光学和红外激光的实施方案。(D)显示具有双激发光学的实施方案，(E)显示具有双激发和双发射光学以及红外激光的实施方案。(F)显示具有双激发和双发射光学的实施方案。
图9显示示例性的滤波器构造，其可适用于(A)双激发构造和(B)双发射构造，分别用于红色(Cy5)荧光染料和绿色(Cy3)荧光染料。
图10显示Cy5标记DNA适配体(aptamer)与AMP之间的剂量-响应曲线，通过基于以下之一的比率法表征得到：(A)用市售的酶标仪(microplate-reader)测量，或(B&C)用本发明的双发射构造测量。
图11显示与稀释系列的AMP混合的被Cy5-标记的DNA适配体的荧光踪迹。在0s的时间点，开启红外激光器，并在31s时间内测量荧光强度的响应。在本发明的双发射构造中，同时记录在以下波长处的发射的荧光踪迹：(A)在628至653nm的波长处(“650nm”)和(B)在665至727nm的波长处(“670nm”)。
图12显示对于图9测得的初始荧光强度的分析。基于对于(A)650nm和(B)670nm得到的初始荧光强度，没有得到S形的剂量-响应曲线，进而没有得到相互作用的亲合力。
图13(A)显示对于图11测得的荧光强度踪迹的比率分析，这通过用在670nm处的荧光踪迹逐点(pointwise)除以在650nm处的荧光踪迹得到。标记出测量的三个不同阶段，即阶段1至阶段3。(B)通过分析在阶段1期间、即在开启红外激光器之前的比率，得到信噪比大于300的剂量-响应曲线。
图14(A)显示图13A所示比率数据的Kd随时间变化的曲线。分析在200ms间隔内提取的“垂直切片”，以得到每个时间间隔的剂量-响应曲线。当已知随着时间的温度变化、并且在比温度变化更快的时间规模上平衡相互作用时，可以得到Kd随温度变化的关系。(B)通过进行范特霍夫(Van’t Hoff)分析，可以从所述Kd随温度变化的关系确定相互作用的结合焓(ΔH)和结合熵(ΔS)。
图15显示与AMP的稀释系列混合的Cy3标记DNA适配体的荧光踪迹。在0s的时间点，开启红外激光器，并在6s时间内测量荧光强度的响应。在本发明的双激发构造中，随后通过单个探测器在以下情况下记录发射的荧光踪迹：(A)用蓝色LED在475至495nm的波长处进行第一次激发，和(B)用绿色LED在550至575nm的波长处进行后续激发。
图16(A)显示对于图15测得的初始荧光强度的比率分析，这通过用在绿色LED激发时测得的荧光踪迹逐点除以在用蓝色LED激发时测得的荧光踪迹得到。标记出测量的三个不同阶段，即阶段1至阶段3。(B)通过分析在阶段1期间、即在开启红外激光之前的比率，得到信噪比为约80的剂量-响应曲线。(C)通过分析在阶段3期间、即在开启红外激光之后的比率，得到具有改进的大于130的信噪比的剂量-响应曲线。
图17显示与荧光标记链霉亲和素混合的12点(12-point)稀释系列生物素的剂量-响应曲线，这通过具有双发射构造的比率法测量得到。虚线是1-to-1结合模型拟合。由于目标浓度显著高于离解常数(Kd)，所以可以观察到在化学计量点处的特征弯曲。
图18与荧光标记的牛碳酸酐酶II混合的12点稀释系列的小分子乙酰唑胺(acetazolamide)的剂量-响应曲线，这通过使用双发射构造的比率法测量得到。虚线是1-to-1结合模型拟合。比率仅仅变化约0.7％。
图19(A)显示未标记的单克隆抗体赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗)的16点稀释系列与(B)生物素化蛋白质L和荧光标记单价链霉亲和素的预制复合物混合的剂量-响应曲线，这得到三元复合物，通过使用双发射构造的比率法测量得到。
图20(A)示意性地显示麦芽糖、生物素化麦芽糖结合蛋白质、链霉亲和素和荧光标记的生物素化DNA的复合物。(B)显示生物素化麦芽糖结合蛋白质，通过未标记的链霉亲和素和荧光标记的生物素化DNA混合而荧光标记，与麦芽糖之间的剂量-响应曲线，这通过使用双发射构造的比率法测量得到。
图21显示与20nM Cov-19刺突蛋白混合的14点稀释系列的血管紧张素转换酶2(ACE2)的剂量-响应曲线，其通过添加5nM的荧光标记的治疗抗体CR3022进行标记。
图22显示荧光标记的丝裂原活化蛋白激酶14(p38-a)在约20分钟时间内的荧光比率的四次后续测量。对于这四次测量，荧光比率不是恒定的，而是似乎线性增加，这表明这种蛋白质在室温下不稳定，而且逐渐变性。
图23显示Kd随时间变化的曲线，关于在(A)用于腺苷的Cy5-标记DNA适配体与小分子AMP之间的相互作用。(B&C)在两个11-mer互补DNA链之间的DNA杂交，其中一个链用Cy5标记，在(B)32℃和(C)22℃下测量。Kd随时间变化的曲线如何快速地跟随红外激光的温度扰动，表明相互作用的结合和解离动力学如何快速进行。
图24(A)显示在22℃和32℃之间DNA杂交的归一化Kd随时间变化的曲线。y-轴代表在测量过程中的Kd倍数的增加(为了对比，全部归一化到1)。x-轴代表红外激光器的开启时间。(B)显示根据本发明使用红外激光器和双发射构造测量DNA杂交时，Kd随时间变化的曲线。样品的温度是22℃，在红外激光加热之后的温度是约32℃。在按时间开启红外激光器的过程中，Kd值从约10nM变化至约500nM。(C)显示在两个不同温度下的两个Kd值的范特霍夫分析结果。(D&E)显示从在六个不同的样品温度(22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃)下得到的荧光比率测量进行经典范特霍夫分析而得到的相互作用的热力学参数，这得到非常相似的热力学参数，但是需要比使用红外激光器的热力学测量时更长的时间。
图25显示对于不同解离速率的模拟的Kd随时间变化的曲线。该图例表示在模拟中使用的不同离线速率(off-rates)。(A)显示可以使用包括20s红外激光加热的常规测量分辨出在10s-1和0.001s-1之间的离解速率。(B)表明甚至在0.036s-1和0.154s-1之间的小差异也能很好地分辨出来。
图26显示使用荧光标记纳米抗体的混合-和-测量途径的比率荧光信号测量慢速结合动力学，所述抗体快速地与六个不同浓度的Cov-19刺突RBD混合。2nM的荧光标记纳米抗体快速地与六个不同浓度(20nM至625pM)的COV-19刺突RBD混合。接着，每90s进行比率荧光测量以遵循慢速结合动力学。全球拟合模型可以得到相互作用的k开(kon)、k关(koff)和Kd。
图27(A)示意性地显示荧光标记的mRNA、类脂纳米粒子(LNP)和细胞。比率测量可以用于确定荧光标记的mRNA分子的定位。(B)显示所有的荧光标记mRNA分子位于LNP内。(C)显示所有荧光标记的mRNA分子位于含有缓冲液的室内。(D)显示所有的荧光标记mRNA分子位于细胞内。(E)显示标记mRNA分子均匀地分布在LNP、缓冲液室和细胞中。
图28(A)显示在不同状态下用荧光标记mRNA负载的LNPs的比率测量。(B)可以通过分析在单个波长(这里是670nm)处的荧光踪迹得到关于LNPs状态的附加信息，在该波长处显示在20分钟的离心步骤后得到“凹凸不平”的聚集踪迹，或在90℃下加热10分钟后得到“平滑”的踪迹。
图29(A)示意性地显示四聚体链霉亲和素、两个生物素化的荧光标记连接体分子与生物素化靶分子之间的复合物。在双发射构造中的比率测量可以用于确定(B)在四聚体链霉亲和素与生物素化的荧光标记连接体分子之间的复合物的化学计量关系，和(C)在链霉亲和素-连接体复合物与生物素化靶分子之间的剂量-响应曲线。
发明详述
本发明提供用于通过比率法表征荧光标记粒子的分子间和/或分子内相互作用、和/或构象修饰和/或定位的方法和设备。特别是，本发明方法提供在荧光标记粒子的小样品体积内测量荧光标记的荧光光谱变化时的改进的灵敏度，这无法通过先前已知的方法分辨(例如参见实施例1)。另外，本发明方法不需要依赖于温度诱导的荧光光谱变化，进而能够快速测量甚至温度敏感的和/或不稳定的样品。与限定的温度扰动组合，本发明方法能够测量相互作用的热力学和动力学参数。
本发明方法能够确定荧光标记粒子的定位(即，如果荧光标记粒子位于类脂纳米粒子(LNPs)内、和/或位于细胞内和/或位于LNPs和细胞周围的缓冲液内)。在本发明方法中，使用这样的荧光标记粒子，其用仅仅一个荧光标记进行标记。这里，“用仅仅一个荧光标记进行标记”表示“用仅仅一种类型的荧光标记进行标记”。进而，这可以用仅仅一个类型的单个荧光结构部分(例如一个Cy5分子)来标记，或仅仅单个类型的两个或更多个荧光结构部分(例如两个或更多个Cy5分子)来标记。
在本发明中，测量在荧光标记粒子的荧光光谱中的变化，并进行比率法分析以表征所述荧光标记粒子的相互作用，包括结合亲合力等。
本发明方法的步骤包括提供在溶液中的荧光标记粒子的一个或多个样品。一个或多个样品优选在恒定的激发波长处进行荧光激发。发射的荧光优选同时在两个不同的发射波长处测量，优选在预定的恒定温度下进行。可以确定在两个发射波长处的荧光强度的比率。因此，所得的两个发射荧光测量结果可以比率方式进行表征。
因为两个发射波长的测量优选同时进行，相同的干扰值或误差影响测量结果，所以所述比率表征能提取纯信息，从而改进测量方法的分辨率。
本发明人发现，在与粒子、例如生物分子结合的荧光标记的荧光光谱中的变化可以用于尤其确定构象状态(折叠状态/去折叠的状态)和/或在配体与生物分子之间的相互作用参数。
在本发明中，术语“测量”和“记录”可以互换使用，并表示测定荧光标记粒子的荧光信号。
在第一方面，本发明涉及通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化来表征在溶液中的荧光标记粒子的方法，例如在预定温度下。
本发明第一方面所述的方法包括以下步骤：
a)在第一个条件下提供在溶液中的荧光标记粒子的样品，
b)在第一波长处激发所述荧光标记粒子，
c)测量所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度，
d)计算在所述第二波长和第三波长处的荧光强度之间的比率，
其中所述第三波长与所述第二波长不同，
e1)使所述荧光标记粒子的样品在第二个条件下重复进行步骤b)至d)，或
e2)使所述荧光标记粒子的第二个样品在第二个条件下重复进行步骤a)至d)，
其中所述第二个条件与所述第一个条件不同，
f)基于在所述不同条件下得到的比率计算值，表征所述荧光标记粒子，
其中同时测量第二波长和第三波长，和其中第二波长比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更短，且第三波长比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更长。
粒子
根据本发明，术语“粒子”包括分子，特别是有机分子、生物分子、纳米粒子、微粒和囊泡(vesicles)。本发明应用于生物分子例如核酸和蛋白质是特别重要的。术语“粒子”还包括生物细胞(例如细菌细胞或真核细胞)或亚细胞片段，生物组织，病毒粒子，病毒样粒子或病毒和细胞器，类脂纳米粒子(LNPs)等。纳米粒子还包括纳米盘(nanodisc)。纳米盘是由磷脂的脂质双层构成的合成模型膜系统，其具有被两个两亲性蛋白质屏蔽(screened)的疏水性边缘。
生物分子优选选自氨基酸、蛋白质、肽、单糖和二糖、多糖、类脂、糖脂、脂肪酸、甾醇、维生素、神经递质、酶、核苷酸、代谢物、核酸、以及其组合或其复合物。更优选地，生物分子选自蛋白质、肽、酶、核酸、以及其组合或其复合物。
优选地，(在标记粒子中的)粒子是生物分子，最优选蛋白质或核酸。
蛋白质选自酶(例如碳酸酐酶、β内酰胺酶TEM1、或激酶如MEK1和p38)、转运蛋白(例如MBP)、抑制蛋白(例如β内酰胺酶抑制蛋白BLIP、阿那白滞素)、结构蛋白、信号蛋白、配体结合蛋白、陪伴分子(例如热休克蛋白HSP90)、抗体(例如曲妥珠单抗)、膜蛋白和受体(例如白介素1受体)。
核酸包括DNA、RNA(例如mRNA、tRNA、rRNA等)、LNA和PNA。而且，在本发明中可以分析经过修饰(例如化学修饰)的核酸。锁核酸(LNA)，通常被称为不可达RNA(inaccessibleRNA)，是一种经过修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。肽核酸(PNA)是类似于DNA或RNA的人工合成聚合物。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖骨架，而PNA的骨架由肽构成，例如通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸重复单元。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲桥(-CH2-)和羰基(-(C＝O)-)连接到骨架。
在本发明中，纳米粒子是具有小于100nm的平均粒度的粒子。术语“平均粒度”描述了如通过动态光散射测得的平均有效直径，使用例如Brookhaven Instruments’90Plus或Malvern Zetasizer Z90粒度分析仪进行。优选地，纳米粒子的粒度为1nm至100nm，优选1至70nm。纳米粒子可以是有机粒子或无机粒子。纳米粒子也可以作为复合粒子存在，例如具有附着于其表面的有机分子的无机核。
微粒是最长维度小于1mm但通常大于100nm的微观粒子。可使用透射电子显微术(TEM)、扫描电子显微术(SEM)和准弹性光散射(QELS)的粒度分析法来表征微粒。微粒也可以微珠的形式存在。
微粒可以是例如涂布或未涂布的二氧化硅-/玻璃-/可生物降解粒子，聚苯乙烯-/涂布-/流式细胞术(flow cytometry)-/PMMA-/三聚氰胺-/NIST粒子，琼脂糖粒子，磁性粒子，涂布或未涂布的金粒子或银粒子或其它金属粒子，过渡金属粒子，生物材料，半导体，有机和无机粒子，荧光聚苯乙烯微球，非荧光聚苯乙烯微球，复合材料，脂质体，细胞等。
市售微粒可以多种多样的材料获得，包括陶瓷、玻璃、聚合物和金属。日常生活中遇到的微粒包括花粉、砂、粉尘、面粉和糖粉。在生物系统中，微粒是衍生自与血流接触的细胞(例如血小板和内皮细胞)的在血液中循环的小的膜结合囊泡。
微珠优选是制造的固体塑料粒子，其最大维度小于5毫米。微珠也可以是均匀聚合物粒子，其直径通常为0.5至500微米。
术语“修饰的粒子”或“修饰的珠粒”特别涉及包含或连接至分子(优选生物分子)的珠粒或粒子。这也包含用这些(生物)分子涂布这样的珠粒或粒子。
可以修饰根据本发明的粒子或珠粒，以使例如生物分子如DNA、RNA或蛋白质能够结合(在一些实施方案中特异性和/或共价结合)到粒子或珠粒上。因此，在本发明的范围内包括珠粒和/或粒子、特别是附着于或连接至这些珠粒或粒子的分子的特征分析。特别地，这样的分子是生物分子。相应地，术语“修饰的(微)珠粒/(纳米-或微)粒子”特别涉及包含要分析或表征的附加分子的珠粒或粒子。修饰或未修饰的微粒/(纳米-或微)粒子能与溶液中的其它粒子/分子例如生物分子(例如DNA、RNA或蛋白质)发生相互作用。
用于本发明中的荧光标记粒子的优选浓度是优选10pM至10μM，甚至更优选50pM至500nM。
优选的是，在本发明方法中，荧光标记粒子在溶液中的浓度是50pM至500nM。
在本发明的方法中，使用被至少一个荧光标记所标记的粒子，优选被仅仅一个荧光标记所标记的粒子。在本发明方法中，被多于一个荧光标记所标记的粒子是用仅仅一种类型的荧光标记(即，仅仅单个类型的标记/每个粒子)所标记的。在本发明中，“标记的粒子”是指可通过荧光手段检测的带有荧光标记的分子/粒子或其它分子/粒子，例如包含固有荧光团的分子/粒子，或带有融合蛋白质标签的粒子/分子，或附有外源性荧光团的粒子/分子。
特别地，标记的粒子优选是附着至、例如共价结合至标记(例如经由NHAs标记、马来酰亚胺标记等)的粒子，或经高亲和性蛋白标签例如HIS-标签、AVI-标签、SPOT-标签、SNAP-标签等可逆结合至标记的粒子，或经由铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、应力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)等生物共轭的粒子(也称为连接化学(click-chemistry))，等等。
蛋白标签是基因移植到重组蛋白上的肽序列。这些包括poly(His)标签，聚阴离子氨基酸，如FLAG标签，表位标签(epitope tags)，如V5-标签、Myc-标签、HA-标签和NE-标签，它们可允许特异性酶法修饰(例如通过生物素连接酶进行生物素化)或化学修饰(例如与FlAsH-EDT2反应以供荧光成像)的标签。
荧光标记
在本发明中，术语“标记”和“染料”可互换使用，并表示荧光团/荧色物，即荧光化学化合物，其在受激发时再发射出光。
可用于本发明的标记是对环境变化敏感的标记，即染料的荧光光谱在环境变化时发生变化，例如化学微环境的变化(配体结合、构象变化)和/或宏观环境(例如，在LNPs中的位置vs.在细胞中的位置)和/或温度变化(例如加热或冷却)。
在本发明中，荧光标记有利地在所述粒子上的预期发生结合相互作用的定位/位置的附近附着至该粒子，例如蛋白质的结合口袋(binding pocket)等。
根据本发明使用的荧光标记可以选自固有荧光标记、融合蛋白、外源性荧光标记等。
固有荧光标记包括色氨酸残基、酪氨酸残基、苯基丙氨酸残基。融合蛋白可以选自发射蓝色的荧光蛋白，发射花青色的荧光蛋白质，发射绿色-的荧光蛋白，发射黄色的荧光蛋白和发射红色的荧光蛋白等。可以参见本领域中的FPbase已知数据库，其提供目前已知的荧光蛋白的广泛列表(https：//www.fpbase.org/table/；Lambert，TJ(2019)FPbase：公共可编辑的荧光蛋白数据库，Nature Methods，16，277-278.doi：10.1038/s41592-019-0352-8)。
在本发明的一个优选实施方案中，荧光标记是外源性荧光标记。外源性荧光标记可以包括但不限于市售的标记，例如花青染料，包括Cy5、Cy3、Atto647、Atto647N、Alexa647Dy647等。
优选的外源性荧光标记是对环境敏感的染料，例如参见WO 2018/234557中，将该文献引入本文以供参考。对环境敏感的染料是本领域已知的，例如参见Klymchenko,A.S.(2017)(“溶致变色和荧光染料用作对环境敏感的探针：设计和生物应用”，Accounts ofchemical research，50(2)，366-375)。特别是，WO 2018/234557涉及对环境变化非常敏感的荧光标记，例如化学组成的变化、温度变化等。根据一个优选实施方案，这些染料选自NanoTemper RED、GREEN和BLUE染料(可例如作为蛋白标记试剂盒商购，来自NanoTemperTechnologies GmbH，Munich，德国)。
通过用外源性荧光标记进行标记，可以控制仅仅一种染料附接到靶分子，并且仅仅染料需要受到配体结合的影响。此外，可以设计标记化学，以使染料可布置在对于测量化学环境的变化而言最佳的位置(例如，在配体结合位点的附近)。另外，外源性染料通常位于蛋白质的表面上，所以能理想地暴露以感知化学微环境的变化。可以选择染料的荧光范围，其不会干扰配体的自动荧光。最后，外源性染料是显著更亮的，和可以在显著更低的钯分子浓度下进行测量，从而减少样品的消耗和允许测量甚至皮摩尔级别的亲合力。
根据本发明，荧光光谱的变化包括荧光标记的荧光强度的变化，而且包括光谱位移(参见图3C)和/或其光谱的变宽或变窄(参见图3D)。根据本发明，优选测量在不同的波长或波长范围处的荧光，这可以例如使用带通型滤波器实现。在这些不同的波长/波长范围处测量的强度和相应的比率允许测量整个发射光谱的光谱位移、光谱的变宽和/或变窄。
在本发明中，光谱位移优选包括红移(即，红色)位移和/或蓝移(即，蓝色)位移。
在本发明中，光谱位移的幅度优选是至少50pm，更优选至少100pm，甚至更优选至少500pm。
根据本发明，荧光标记粒子的荧光强度优选由于选自以下的机理而变化：荧光标记粒子的构象变化，荧光标记粒子的再定位，在荧光标记粒子与一种或多种配体之间的相互作用，或其组合等。
样品室
用于本发明中的样品优选在样品室中提供，样品室优选选自毛细管、多孔板、微流体芯片、比色皿、反应管、吸管端、微流路(microfluidics)、小滴(droplets)、天然组织、细胞器、3D打印的组织、3D打印的细胞器和半透明容器。半透明容器可以是玻璃容器或塑料容器。
在本发明的一个优选实施方案中，在毛细管中提供含有荧光标记粒子的样品。
在本发明的另一个优选实施方案中，在多孔板中提供含有荧光标记粒子的样品，例如96孔板、384孔板或1536孔板。
优选，毛细管由以下材料制成：玻璃，和/或聚合物，和/或硼硅酸盐玻璃、硼硅酸盐3.3玻璃(例如DURAN-玻璃)、石英玻璃如Suprasil、Infrasil、合成熔融二氧化硅、钠钙玻璃、Bk-7、ASTM Type 1Class A玻璃、ASTM Type 1Class B玻璃中的至少一个元件。聚合物可以包含PTFE、PMMA、ZeonorTM、ZeonexTM、Teflon AF、PC、PE、PET、PPS、PVDF、PFA、FEP和/或丙烯酸玻璃。
特别是，优选毛细管的至少一个范围对于波长为200nm至1000nm、优选250nm至900nm的光是透明的。特别优选但不限于此，所述毛细管的范围也对具有以下波长范围的光是透明的：940nm至1040nm(优选980nm+/-10nm)，1150nm至1210nm，1280nm至1600nm(优选1450nm+/-20nm，和/或1480nm+/-20nm，和/或1550nm+/-20nm)，1900nm至2000nm(优选1930nm+/-20nm)。本领域技术人员能理解，透明的范围也可以扩展到整个毛细管。换言之，毛细管可以是透明的，优选完全由上述材料之一制成。
优选地，所用的毛细管具有0.1mm至0.8mm的内直径，优选0.2mm至0.6mm，更优选0.5mm。优选毛细管的外直径是优选0.2mm至1.0mm，优选0.3mm至0.65mm。
毛细管的几何构造不限于特定形状。优选，使用具有圆形或椭圆形横截面的管状毛细管。但是，也可以使用具有不同横截面的毛细管，例如三角形、四边形、五边形或多边形。优选，毛细管包含在整个毛细管长度上的特定横截面之一。另外进一步优选，毛细管的内部尺寸和/或外部尺寸是沿着毛细管的整个长度恒定的。例如，优选的是，圆柱形(管状)毛细管沿着毛细管的整个长度包含相同的内直径和相同的外直径。换言之，可以使用具有沿着毛细管长度恒定或不恒定的直径和/或横截面的毛细管。
特别是，用于本发明的样品室显示在宽光谱范围中的低的自动荧光。所述自动荧光优选低于20％，更优选低于10％，甚至更优选低于5％。
有利的是，在沿着荧光激发光束方向的厚度为1μm至20mm、1μm至6mm、1μm至500μm、特别是1μm至250μm、特别是1μm至100μm、特别是3μm至50μm、特别是5μm至30μm的室内提供样品探针。本领域技术人员会理解，术语“室”也代表例如毛细管、微流体芯片或多孔板。
硅表面
优选的在其上放置样品室的表面例如描述在WO 2017/055583中，将该文献引入本文以供参考。特别是，WO 2017/05558涉及硅表面，在其上/上方优选放置本发明的样品室(例如毛细管)。
样品体积
通常，含有荧光标记粒子的样品的体积小于500μl，优选小于200μl，更优选小于100μl，甚至更优选为1μl至25μl。
样品
通常，用于本发明方法中的样品是包含荧光标记粒子和配体的溶液。在这里，所述标记粒子可以溶解或分散在溶液中。
所述标记粒子可以固定在固体载体上，使其与含有配体的溶液接触。优选，标记粒子溶解或分散在选自以下的溶液中：有机溶液和/或水溶液，特别是缓冲水溶液。缓冲水溶液优选使用缓冲剂调节到2至10的pH值，更优选4至10，甚至更优选5至9，最优选6至8.5。
荧光测量(激发/发射)
根据本发明，用于激发、优选荧光激发所述标记粒子/分子的优选手段可以是选自以下的任何合适的装置：激光器，纤维激光器、二极管激光器、发光二极管(LED)、卤素、LED阵列、HBO(HBO灯例如是短弧灯，其中放电电弧在高压下在汞蒸气气氛中点火)、HXP(HXP灯例如是短弧灯，其中放电电弧在极高压力下在汞蒸气气氛中燃烧。例如，与HBO灯相比，HXP灯在明显更高的压力下运行并且它们使用卤素循环。HXP灯生成紫外线和可见光，包括显著部分的红光)等。
优选，在本发明中，激发光源能够高度聚焦地激发。在本发明中，激发光源优选是激光，甚至更优选LED。
本领域技术人员会理解，本文所用的术语“荧光”不限于“荧光”本身，本文中公开的手段、方法和装置也可以利用其它手段，特别是冷光(luminescence)、例如磷光来使用和利用。相应地，步骤b)中的表述“在第一波长处激发所述荧光标记粒子”涉及在上文指定的方法中的“激发步骤”，并可以包含冷光的相应激发，例如在比后续发射的测量时更短的波长下进行激发。因此，在本文中的表述“在第二波长和第三波长处测量所述荧光标记粒子的荧光发射强度”是指测量在激发后的所述发射的步骤。本领域技术人员认识到，在本发明中，“激发”波长和“发射”波长必须分开。另外，本领域技术人员认识到，在本发明中，测量的第三波长与测量的第二波长不同。比率分析所需的两个信号可以通过使用“双激发”构造或“双发射”构造得到。
通常，比率分析是基于“双发射”构造，例如使用图8B所示的示例性的双发射光学。特别是，将含有所述荧光标记粒子的一个或多个样品在单个恒定波长处激发，并在两个不同的波长处测量它们的发射光谱(参见实施例1和2分别与图10和13组合，以及实施例4至12与图17至28组合)。通过使用“双发射”构造，可以在相同的位置和相同的时间测量两个发射信号。此外，很多荧光标记(例如Cy5)具有较小的第二激发峰，其可以用于有效激发，且同时允许在较大波长处的足够带宽，从而将发射光谱分成两个(图9A)。
在本发明的一个优选实施方案中。“双发射”构造与“红色”荧光标记例如Cy5、RFP等组合使用。因为这些标记具有在约650nm处的激发最大值，而第二个激发峰在约600nm处，且发射最大值在约660nm处，非常适用的激发波长和发射波长包括在约570nm和615nm之间激发，在约625nm和650nm之间测量第一次发射，和在约670nm和725nm之间测量第二次发射(图9A)。表1提供可用于“双发射”构造的示例性组分。
表1
根据本发明，优选第二波长在比所述荧光标记粒子在第一个条件下的发射最大值更短的波长下测量，且第三波长在比所述荧光标记粒子在第一个条件下的发射最大值更长的波长下测量。本领域技术人员认识到，在本发明中，发射最大值可以是局部的发射最大值或是绝对的发射最大值。可选地，代替发射最大值，可以在发射光谱的大约鞍点处检测。
在位于发射最大值侧面的区域中的小变化(例如波长的位移)较大地影响荧光光谱的变化(例如在强度方面)。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，在接近发射最大值的附近检测发射荧光强度，例如，第二波长是在比所述荧光标记粒子在第一个条件下的发射最大值短至少2.5nm的波长(例如，短10nm的波长)处测量，第三波长是在比所述荧光标记粒子在第一个条件下的发射最大值长至少2.5nm的波长(例如，长10nm的波长)处测量。
根据本发明，用于检测受激发的荧光标记粒子、特别用于检测荧光的装置可以是选自以下的任何合适的装置：电偶联装置(CCD)摄影机(2D或线扫描CCD)，Line-Camera，光电倍增管(PMT)，硅光电倍增管(siPMs)，雪崩光电二极管(APD)，发光二极管阵列(PDAs)，互补金属氧化物-半导体(CMOS)摄影机等。
可选的荧光测量
在本发明的另一个实施方案中，比率分析是基于“双激发”构造，例如使用图8D所示的示例性的双激发光学。特别是，将含有荧光标记粒子的一个或多个样品在两个不同的波长处激发，和在单个波长下测量它们的发射光谱(参见实施例3以及图16)。通过使用这种构造，不能同时检测两个激发光谱，这意味着需要依次获取。此方式更耗费时间，并且在两个依次测量之间的时间延迟可能导致这两个测量结果之间的显著差异，例如由于在第一次激发之后诱导的漂白现象、样品聚集等所致。
通过使用“频闪”激发方式可能解决一些上述问题，在该方式中，两个激发光源在小于1s的时间或甚至更快地切换成打开和关闭，并交替地收集数据。但是，两个不同的激发光源可以导致样品的不同的漂白速率，这可能对在用更长的获取时间处理以评估比率信号产生不利的影响。
在本发明的另一个实施方案中，“双激发”构造与“绿色”荧光标记例如Cy3、GFP等组合使用。因为这些标记具有在约540nm处的激发最大值和在约560nm处的发射最大值，并且第二次发射峰在约600nm处，所以非常适用的激发波长和发射波长包括在约475nm和495nm之间激发，在约550nm和575nm之间测量第一次发射，和在约590nm和680nm之间测量第二次发射(图9B)。表2提供可用于“双发射”构造的示例性组分。
表2
激发体积通常是一部分的样品体积，这部分的体积受到激发光源的荧光激发。测量体积是一部分的样品体积，对这部分的体积测量发射光谱。根据本发明，激发体积和/或测量体积具有优选2mm x 2mm x 5mm或更小的尺寸，更优选1mm x 1mm x 5mm或更小，甚至更优选0.5mm x 0.5mm x 5mm或更小。
但是，用于激发所述荧光标记粒子和用于测量受激发的粒子的荧光的手段不受限制，可以使用本领域技术人员任何合适的手段。
比率表征
根据本发明，比率分析优选基于通过逐点除法(pointwise division)构建在第二波长和第三波长处测量的荧光强度之间的比率。本领域技术人员认识到，在本发明中，所述荧光强度的比率可以通过用第三波长除以第二波长得到，或反之(例如，用第二波长除以第三波长)。
在本发明中，比率的相对百分率变化(即，在光谱位移之后的比率的百分率变化)例如是至少0.5％，至少1.1％，至少5.5％，至少37.3％。这里优选的是，相对百分率变化是至少3％。
相互作用的表征
在本发明中，荧光标记粒子的相互作用特别包括生物分子与例如其它(生物)分子、粒子、珠以及(生物)分子的稳定性，它们对于折叠和去折叠的构象或其化学环境(例如它们在水溶液、类脂纳米粒子或细胞内的位置)。进一步的相互作用表征用于测量平衡，测量结合动力学和测量热力学参数。
根据本发明，比率的计算值优选用于确定荧光标记粒子的定位或选自以下的参数：离解常数，最大有效浓度值的一半(EC50)，平衡常数，结合动力学，酶催反应动力学，热力学参数，稳定性参数(例如蛋白质的热变性，蛋白质的化学变性等)，去折叠或再折叠的动力学，开放和闭合反应，和/或其组合等。
在本发明中，本领域技术人员认识到，可以从所得的荧光强度比率用朗缪尔(Langmuir)公式拟合该数据来确定相互作用的离解常数(Kd)，和可以从所得的荧光强度比率用Hill公式拟合来确定最大有效浓度值的一半(EC50)(Ganellin，C.R.，Jefferis，R.，&Roberts，S.M.(Eds.)(2013)，生物和小分子药物的研究和进展：理论和案例研究，AcademicPress.，第1章，第38和39页)。
根据本发明，所述荧光标记粒子的第一个条件和第二个条件可以在其化学组成和/或温度和/或在化学宏观环境内的定位方面不同(例如荧光标记粒子的第一个条件涉及粒子在第一个载体、例如媒介物内的位置；第二个条件涉及粒子在第二个载体内的位置，例如在配料中，或在含有这两种载体的缓冲液中。
根据本发明的荧光标记的荧光光谱也可以在荧光标记粒子/分子是与一种或多种其它分子、例如配体的复合物时变化(例如，经过配体附近(参见图3B)和/或在配体结合时的构象变化(参见图3B)。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，第二个条件可以通过添加配体和/或不同浓度的配体来改变，所得的比率计算值用于确定剂量-响应曲线以及荧光标记粒子和配体的离解常数(Kd)。
在本发明中，术语配体“结合”至标记粒子优选表示共价结合，或通过分子间力例如离子键、氢键和范德华力来结合。
配体结合至靶生物分子例如蛋白质，可引起宽范围的构象变化，例如氨基酸侧链、环(loop)或域移动。根据本发明可用的配体可以选自(但不限于)离子、金属、化合物、药物片段(小化学片段，其只能弱结合到生物靶)、碳水化合物、小分子(具有低分子量(<900道尔顿)的有机化合物；小分子可有助于调节生物过程并通常具有约1nm的尺寸)、药物、前药、类脂、蛋白质、肽、类肽、酶、核酸、适配体、纳米粒子、脂质体、单层囊泡(包括小单层囊泡(SUV)和巨单层囊泡(GUV))、聚合物、有机分子、无机分子、金属复合物、激素、香料、加臭剂、粒子和(微)珠。优选地，配体选自离子、金属、化合物、药物片段、碳水化合物、小分子、药物、前药、类脂、蛋白质、肽、类肽、酶、核酸、适配体、激素、香料和加臭剂。
配体的浓度优选是0.01pM至1M，优选1pM至100mM，更优选1pM至10mM。
与温度相关的强度变化(TRIC)和微量热泳动(MSTI)的组合：
虽然根据本发明对荧光标记粒子的比率分析不是必须依赖于温度诱导的荧光强度变化，但是荧光强度的测量可以在恒定的预定温度下或在限定的温度扰动期间进行。
在第二方面，本发明涉及通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化与限定的温度扰动/温度变化的组合来表征在溶液中的荧光标记粒子的方法。
本发明第二方面所述的方法包括以下步骤：
a)在第一个条件下提供在溶液中的荧光标记粒子的样品，
b)在第一波长处激发所述荧光标记粒子，
c)测量所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度，其中所述强度是在限定的温度扰动期间测量的，
d)计算在所述第二波长和第三波长处的荧光强度之间的比率，其中所述第三波长与所述第二波长不同，
e1)使所述荧光标记粒子的样品在第二个条件下重复进行步骤b)至d)，或
e2)使所述荧光标记粒子的第二个样品在第二个条件下重复进行步骤a)至d)，
其中所述第二个条件与所述第一个条件不同，
f)基于在所述不同条件下得到的比率计算值，表征所述荧光标记粒子，
其中同时测量第二波长和第三波长，和其中第二波长比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更短，且第三波长比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更长。
在本发明第二方面的优选实施方案的方法中，加热或冷却可以使用选自以下的调合元件(即，加热和/或冷却源)进行：加热或冷却流体或气体，加热元件(例如加热电阻器，或基于焦耳加热的其它元件，例如金属加热元件，陶瓷加热元件，聚合物PTC加热元件，复合加热元件，半导体加热元件)，或热电元件，例如Peltier元件，或电磁辐射(例如LED，例如IR-LED，或激光器，例如红外(IR)激光器，或微波)。红外激光器的使用能够快速加热样品。
优选使用Peltier元件，这是因为其可以用于加热样品和/或冷却样品(例如，用于将样品冷却到低于环境温度)。特别是，通过逆转经过Peltier元件的电流方向，可以从加热切换到冷却。Peltier元件是不仅能加热而且能活性冷却到室温以下的温度的几种元件之一。
优选使用激光器，优选电磁辐射直接被样品吸收的激光器，因为可在样品中快速和直接地改变温度，且不需要机械接触样品。
也优选的是，所述激光器是在0.01W至10W的范围内的高功率激光器，优选4W至6W。
也优选的是，所述激光器是在1mW至1W范围内的激光器，优选1mW至500mW，更优选1mW至250mW。
激光辐射直接被样品吸收并转化成热，例如波长为980nm+/-30nm、1480nm+/-30nm、1550nm+/-30nm、1940nm+/-30nm的红外激光极好地被水吸收并极快地加热。这种加热方法是无接触的，因此可以是快速的，并且没有污染风险。样品室必须仅对激光透明，但不需要良好的热导率，这不同于借助加热元件的接触加热。
借助红外激光器，可以非常小的体积(例如纳升体积的范围)通过荧光光学器件测量其荧光(通常仅仅为100μm x 100μm x 100μm＝1nl体积)。根据本发明，待研究的样品也可以通过加热和/或冷却调和元件以限定的恒定速率经历线性升温，例如1℃/min或1K/min。通常，使用接触式加热的加热和/或冷却速率是0.1K/min至50K/min，例如使用Peltier元件。
在另一个实施方案中，样品可以用红外激光以1K/s至100K/s的典型加热速率加热(“光学加热”)。
本发明第二方面所述的方法优选在-20℃至160℃的温度范围内进行，更优选0℃至120℃。
用于测量初始比率的优选的数据采集时间是1s至5s，用于在温度扰动期间得到的比率的优选的数据采集时间是5s至20s，但是这些采集时间也可以更短，例如仅仅10ms至100ms，或可以更长，例如数分钟、数小时或甚至数天。
也可以在温度变化的任何后续时间分析该比率。这可以当幅度在室温下非常小、但在较高温度下升高时是有益的(参见实施例2和图13A，其中在阶段3时的分析导致比在阶段1时的分析更大的幅度)。
在本发明第二方面的一个优选实施方案中，比率分析是基于“双发射”构造与温度扰动的组合，即通过使用如图8A所示的示例性的双发射光学和红外激光。
在本发明的另一个实施方案中，比率分析是基于“双激发”构造与温度扰动的组合，例如使用如图8C所示的示例性的双激发光学和红外激光。
在本发明的另一个实施方案中，比率分析是基于“双-激发”和“双发射”构造两者，即通过如图8F所示的示例性的“双激发/双发射”光学。
在本发明的另一个实施方案中，比率分析是基于“双激发”和“双发射”构造与温度扰动的组合，例如使用如图8E所示的示例性的“双-激发/双发射”光学和红外激光。
通过比率法与TRIC/MST的组合来测量热力学参数和动力学参数：
在第三方面，本发明涉及通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化与限定的温度扰动/温度变化的组合来表征在溶液中的荧光标记粒子的热力学参数和/或动力学参数的方法。
在本发明中，热力学参数包括但不限于焓、熵、热容(cp)。
在本发明中，动力学参数包括但不限于平衡常数、解离速率、缔合速率、酶催速率、折叠和去折叠速率、释放速率(例如，在LNPs的情况下有效载荷的释放速率)、聚集速率、侵入速率(例如，有效载荷如mRNA侵入细胞的速率)。
根据本发明的第三方面，优选，相互作用的热力学参数可以在从单个测量使用红外激光器收集比率荧光数据时确定。因为样品在测量的每个时间点时的温度是已知的(在校准检测中确定，其中以受控方式加热托盘，并检测参比标记的荧光)，所以可以得到在每个时间点时的离解常数Kd(参见实施例2与图14A)。
另外，根据本发明的第三方面，反应热力学也可以通过在不同的、完全平衡的样品温度下进行经典Kd测量来确定，例如通过随后将样品温度设定为22℃、24℃、26℃、28℃、30℃和32℃，并对于每个温度测量结合亲合力(参见实施例10与图24)。即使如果该方式的精确度不总是达到现有技术的等温滴定量热法(ITC)测量的精确度，目前的测量也是约100倍更快的，而且显著更低的样品消耗量可以超过缺少精确度的缺点。例如，关于特定的分子，如果信息是熵或焓的结合，则该信息可以在早期发展的阶段中是特别有价值的。
根据本发明的第三方面，优选，当从单个测量用红外激光器收集比率荧光数据时，可以确定相互作用的热力学参数。
应用：通过比率法与TRIC/MST的组合来监测荧光标记mRNA的定位
在第四方面，本发明优选涉及通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化单独地或与限定的温度扰动/温度变化的组合来表征在溶液中的荧光标记粒子的定位的方法。
在本发明中，术语“位置”和“定位”可以互换使用，并表示确定荧光标记粒子的定位/位置。
涉及核酸例如DNA和RNA等的所有基因和细胞治疗方法具有确定药物成功递送的固有问题(例如，通过引入并从载体例如溶解在缓冲液中的类脂纳米粒子(LNPs)释放出来，负载的核酸被递送到靶细胞中；参见图27A)。
甚至在确定递送成功之前，生物制备(例如，递送体系的负载是关键的步骤，包括LNPs的卸载、部分负载、完全负载和/或过载状态，这需要充分评估)。
根据本发明的第四方面，载体可以选自：金属纳米粒子和纳米结构体，聚合物纳米粒子，基于类脂的载体体系(例如脂质体、其它含类脂的复合物)，碳质载体，纳米乳液，纳米悬浮液，纳米胶束，树枝状体，乳源性载体，胞内体，病毒载体(例如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒)，病毒样粒子(VLPs)，真核细胞，原核细胞，细胞片段等。鉴于以上，所述载体的组合也在本发明的范围内。
在本发明第四方面的一个优选实施方案中，荧光标记粒子是荧光标记的mRNA，且载体是LNP。
LNP表示具有小于1000nm、500nm、250nm、200nm、50nm、100nm、75nm、50nm或25nm的直径的任何粒子。例如，在合适的缓冲剂中，被mRNA填充的LNP可以具有65nm至85nm的水力学直径。作为替代，纳米粒子的粒度可以是1-1000nm、1-500nm、1-250nm、25-200nm、25-100nm、35-85nm或25-60nm。
LNPs可以从阳离子性、阴离子性或中性的类脂制得。中性类脂，例如基因融合磷脂DOPE或膜组分胆固醇，可以作为“辅助的类脂”包括在LNPs中以改善转染活性和纳米粒子稳定性。阳离子性类脂的限制包括由于稳定性差和快速清除所致的低效力，以及产生发炎或抗炎响应。
LNPs也可以包含疏水性类脂、亲水性类脂或同时具有疏水性和亲水性的类脂。
本领域已知的任何类脂或类脂组合可以用于产生LNP。用于产生LNPs的类脂的实例是：DOTMA，DOSPA，DOTAP，DMRIE，DC-胆固醇，DOTAP-胆固醇，GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子性类脂的实例是：98N12-5，C12-200，DLin-KC2-DMA(KC2)，DLin-MC3-DMA(MC3)，XTC，MD1和7C1。
中性类脂的实例是DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。PEG修饰的类脂的实例是PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
因为荧光标记的荧光光谱是对环境变化非常敏感的，例如化学环境的变化，并且所述光谱在环境变化时出现变化，所以荧光标记粒子(例如mRNA)的位置可以通过本发明的比率法测量推导出来。
染料与第二和第三发射波长的组合的一个非限制性实例是：如果所有的荧光标记mRNA分子恰当地位于LNPs内，则在根据本发明方法表征之后的比率对应于2.1(参见实施例12与图27B)。如果所有的荧光标记mRNA分子位于LNPs之外，则所得的比率对应于1.2(参见实施例12与图27C)。
因为细胞内的化学环境是与在LNP或缓冲液中的化学环境十分不同的，所以本领域技术人员认识到，在本发明中，当所有的荧光标记mRNA分子被成功地递送到靶细胞中时，所得的比率是与上述值(即1.2和2.1)十分不同的(参见实施例12与图27D)。此外，在中间状态的情况下，例如荧光标记mRNA分子部分地位于细胞、LNP和缓冲液内，所得的荧光比率是这三种状态所得的比率的线性组合。
根据本发明的此示例性方面，荧光标记粒子(例如mRNA)的位置的确定是基于非常小的样品体积和测量体积以及短时间的试验程序。在相同的情况下，现有技术已知的方法(例如场流分离法和液相色谱法)是基于不同的方法，并且不仅需要较长的时间，而且需要较高的样品体积，这些样品是常规的、受限的和昂贵的样品。
用于生物素化分子的试剂盒
在第五方面，本发明涉及试剂盒以及试剂盒用于根据本发明方法表征在溶液中的荧光标记粒子的用途，所述荧光标记粒子例如是用一种或多种生物素分子标记的粒子(即，生物素化粒子)。
试剂盒包括按照限定的化学计量比率的以下组分作为主要组分：(i)(优选四聚体)生物素结合蛋白(biotin-binding protein)，其包含至少两个(优选四个)用于生物素的结合位点，和(ii)连接部分(这里也称为“连接体”)。试剂盒优选还包含指导手册，其用于解释试剂盒在至少一个本发明方法中的使用。
根据本发明的第五方面，生物素结合蛋白可以选自链霉亲和素、抗生物素蛋白及其突变体。在本发明中，突变体包括中性亲和素、含黄菲素(flavidin)、二价链霉亲和素等。
可用于本发明的试剂盒可以包括包含(i)生物素结合蛋白和(ii)连接体的单个小瓶(vial)，该连接体优选在其一端被生物素分子修饰/标记，而在另一端被荧光标记修饰/标记。在本发明第五方面的一个优选实施方案中，生物素结合蛋白优选是四聚体蛋白，甚至更优选四聚体链霉亲和素。
链霉亲和素是均聚四聚体，其对生物素具有特别高的亲合力(也称为维生素B7)。其广泛用于分子生物学和生物纳米技术中，这是由于链霉亲和素-生物素复合物具有耐受有机溶剂、变性剂(例如氯化胍)、洗涤剂(例如SDS、Triton)、蛋白水解酶和极限温度和pH的性质。
在本发明第五方面的另一个优选实施方案中，荧光标记连接到连接体，例如现有技术中所述(NPL6)。
根据本发明的第五方面，连接体是聚合物，优选核酸，优选单链核酸，更优选单链DNA，甚至更优选单链DNA低聚体(即，低聚核苷酸)，优选具有6至24个核苷酸的长度。例如，可以使用12-mer oligo-dT链。
但是，用于本发明中的连接体不受长度(只要连接体足够长以使荧光团能到达靶即可)和/或连接体的类型(只要连接体的类型具有其长度可调节的性质即可，例如DNA、含芳基的芳环等)的限制，和可以使用本领域技术人员已知的任何合适的连接体，以将荧光标记间接地连接到要通过本发明方法表征的粒子。
用于本发明的连接体在其一端含有生物素分子，和在其另一端含有荧光标记。在本发明第五方面的一个优选实施方案中，连接体在其3’末端被生物素修饰，并在其5’末端被荧光标记修饰，或反之。
每个试剂盒可以含有足以进行多次标记反应的材料。根据试剂盒的尺寸和生物分子的用量，可以提供用于大约500至3840个单点比率表征试验的充足材料。
在本发明第五方面的一个优选实施方案中，荧光标记粒子是四聚体链霉亲和素分子、生物素化的荧光标记连接体分子和生物素化靶分子之间的复合物(参见图29A)。特别优选的是，荧光标记粒子是一个四聚体链霉亲和素分子、两个生物素化的荧光标记连接体分子和一个生物素化靶分子之间的复合物。
四聚体生物素结合蛋白与修饰的连接体之间的化学计量比率优选以这样的方式调节：在四聚体生物素结合蛋白的四个结合位点中的平均两个点位被占据(例如，通过向小瓶提供2nM链霉亲和素和4nM连接体)，剩余的两个结合位点可以用于与受关注的生物素化粒子结合。
因此，在本发明第五方面中还优选的是，四聚体链霉亲和素与连接体按照1：2的比率以这样的方式混合，其中平均一个链霉亲和素分子被两个连接体分子标记，即一个链霉亲和素分子带有两个荧光标记。链霉亲和素分子的剩余的两个结合位点可以捕捉生物素化分子(例如蛋白质)。通过以1：1的比率混合标记的链霉亲和素和生物素化分子，可以实现平均仅仅一个生物素化分子连接到链霉亲和素-连接体复合物。但是，也可以利用化学计量关系，以促进生物素化的二聚体蛋白(例如，生物素化的干扰素基因刺激因子(STING)，二价链霉亲和素)，其中官能二聚体可以被一个链霉亲和素-连接体复合物标记。在二价生物素结合蛋白的情况下，二价生物素结合蛋白与修饰的连接体之间的比率可以这样的方式调节：在二价生物素结合蛋白上的两个自由结合位点中的平均一个点位被占据(例如，通过向小瓶提供2nM链霉亲和素和2nM连接体)，并且剩余的结合位点可以用于与受关注的生物素化粒子结合。
正确的化学计量关系可以在根据本发明测量光谱位移的标记过程中验证(例如，通过使用双发射构造)，其中用连接体滴定链霉亲和素。
虽然自由连接体分子(即，12-mer poly-T链，在其3’末端被生物素标记，和在其5’末端被Cy5标记)具有小于0.8的比率(参见图29B，自由连接体)，并且被仅仅一个连接体分子标记的链霉亲和素具有约1.05的比率(参见图29B，单个连接体)，但是被两个连接体分子标记的链霉亲和素具有较高的比率，即约1.15，这对应于在双阶段的剂量-响应曲线中的峰，这是由于荧光标记与链霉亲和素分子的剩余的两个结合位点的相互作用(参见图29B，理想比率)。当将生物素化分子加入链霉亲和素-连接体复合物时，该比率降低。因为所有的生物素结合位点保持其全部活性，所以生物素化分子可以极高的亲合力被捕获，导致在剂量-响应曲线中在化学计量点处的特征弯曲(参见图29C)。
根据本发明的此示例性方面，使用非常低的试剂盒组分和生物素化靶分子的最终浓度(例如，1nM链霉亲和素、2nM连接体和1nM生物素化分子)。因此，根据本发明第五方面的试剂盒适用于测量皮摩尔级别的亲合力，这是基于通过本发明方法的高度可控和可重现的标记过程(与现有技术已知的标记试剂盒相比，例如，蛋白质His-标签标记试剂盒RED-tris-NTA第二代(NanoTemper Technologies)。在相同的情况下，现有技术中目前使用的试剂盒(例如蛋白质His-标签标记试剂盒RED-tris-NTA第二代)具有其它限制，包括缓冲剂的限制，缓慢的标记结合动力学，与生物素化分子之间的不相容性；另外，现有技术已知的标记试剂盒是昂贵的和劳动密集型的。
一般性原则和示例性方面
在下文中，基于本发明的示例性实施例或优选实施方案，更详细地讨论本发明的一般性原则。
因为荧光标记的荧光光谱强烈取决于其所处的微环境，所以相同的标记可以显示十分不同的荧光，例如根据与其连接的分子或粒子。特别是，在每个蛋白质上在荧光标记的连接点周围的微环境是就氨基酸残基而言不同的，这可能淬灭标记，与标记冲突，暂时与标记相互作用，或导致堆叠。
图1A显示用相同荧光标记进行标记的四种不同蛋白质的激发光谱(蛋白标记试剂盒RED-NHS第二代(NanoTemper Technologies))。在690nm的波长下测量发射。激发在520nm和670nm之间变化。虽然用相同的荧光标记进行标记，但四种蛋白质的最大发射峰波长是不同的，并在约659nm至约664nm的范围内(图1B)。
从图2A可见，当在恒定波长(即605nm)下激发四种不同的蛋白质、并记录在620nm和750nm之间的发射时，检测到相同的效应/现象。与以上相似，虽然这些蛋白质被相同的荧光标记所标记，但是最大发射峰波长在约659nm至约664nm的范围内(图2B)。
微环境可以还基于在所述分子/粒子上的位置而变化(例如标记连接到蛋白质的哪个赖氨酸残基，或者标记连接到核酸分子的3’末端或5’末端)，所述分子/粒子的构象(例如折叠的或去折叠的蛋白质)或所述分子/粒子和标记之间的长度/连接体组成。荧光标记的宏观环境也会影响其荧光光谱。例如，根据粒子/分子的位置(例如在缓冲水溶液中，在LNP中，在细胞中)，所述标记的荧光光谱是不同的。
另外，当荧光标记的粒子/分子是与一种或多种其它分子(即，配体)的复合物时，荧光标记的荧光光谱也可以变化。例如，配体附近(图3A)和/或在结合配体时的构象变化(图3B)可以导致荧光标记的激发或发射荧光光谱的位移(图3C)和/或变宽或变窄(图3D)。通过使用本发明的比率表征方法，不仅可以测量荧光强度的变化，而且可以测量在荧光标记的微环境发生变化时的完整吸收和发射光谱的变化。
鉴于以上，图4显示当链霉亲和素(200nM)是与其天然配体生物素(2mM)的复合物形式时，将其在605nm波长下激发，链霉亲和素的最大发射峰波长从约664nm变化到约661nm的位移(即，3nm)。同样，图5显示溶菌酶(100nM)单独地和作为与溶菌酶抑制剂三-N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG3)的复合物(80μM)时，将其在585nm的波长下激发，出现最大发射峰波长的轻微位移(即，<1nm)。3nm的位移和约500pm的位移分别对应于荧光比率的相对变化为约37.3％和5.5％(表3)。
表3
| 光谱位移 | 比率变化 |
| 3nm | 37.3％ |
| 2nm | 23.6％ |
| 1nm | 11.2％ |
| 500pm | 5.5％ |
| 100pm | 1.1％ |
| 50pm | 0.5％ |
因为荧光标记的激发和/或发射光谱的变化可以非常小(例如仅仅几埃)，所以无法用本领域已知的方法/设备以所需的精度测量/分辨它们。但是，通过使用本发明的方法和设备，即使荧光光谱的小变化也可以分辨出来。例如，如在碳酸酐酶与呋塞米结合的情况下(图6A)，可以容易地检测/测量仅仅50pm的波长位移，这导致荧光比率变化0.5％(表3)，并可以得到S形的剂量-响应曲线(图6B)。
荧光光谱的变化与荧光标记的性质无关，即，这些变化同样地出现在固有荧光标记和外源性荧光标记中。但是，对于特定类型的标记，荧光光谱的变化程度可以增加。图7A显示使用荧光比率法测量在从35℃至95℃的热熔融升温过程中的色氨酸荧光，用于表征变性以及天然溶菌酶与其抑制剂三-N-乙酰基-D-葡糖胺(NAG3)之间的结合亲合力。非常高浓度的NAG3导致热稳定化，即，溶菌酶的热位移。虽然该位移不能用于得到离解常数(Kd)，但是当用在35℃下的初始比率相对于NAG3的浓度绘图(图7B)时，可以得到S形的剂量-响应曲线，其中显示Kd(在此处：在35℃下)。
图8A至8F显示根据本发明的测量设备的不同的示例性实施方案。一般而言，根据本发明的设备优选包括样品容器，其用于容纳在多个条件下在溶液中的荧光标记粒子的样品。如上所述，本发明的样品容器可以是毛细管，但不限于这种毛细管。另外，也可以使用用于容纳样品的其它装置，例如多孔板或芯片。
图8A至8F显示光学元件的排布的实例，用于帮助将光从样品导出和测量从样品的荧光发射，其中该图未显示样品本身。优选，样品容器，例如毛细管，位于透镜1的下方。所述透镜1优选是非球面透镜或具有多个透镜的透镜系统，在下文中也统称为目镜。
本发明的设备也至少包括用于在第一波长处激发荧光标记粒子的装置。例如可以提供光源8，其用于提供激发光。如上所述，本发明不受限于单个激发光源。作为替代，除了使用一个光源之外，可以提供第二个激发光源16或甚至更多个额外光源(未显示)(特别用于“双激发”模式)。本发明的比率分析可以通过使用“双激发”构造或“双发射”构造进行。对于“双发射”构造而言，优选提供至少一个光源。对于“双激发”构造而言，优选提供两个或甚至更多个光源。但是，本领域技术人员还能理解，对于“双发射”构造，可以提供多个光源。但是，在此情况下，若这些光源之一用于激发，则是足够的。
第一个激发光源8优选是激光器、纤维激光器、二极管激光器、LED、HXP、卤素、LED阵列、HBO中的至少一个。这同样适用于第二个激发光源16。
优选第一个光分离元件7，例如二向色反射镜，用于将激发光导向样品和优选用于将荧光激发光从荧光发射光分开。可以提供用于将激发光导向样品的附加光学元件，例如透镜系统9，例如用于确定激发光源的光束性质(例如一个、两个或更多个透镜)。另外，也可以提供激发滤波器10，从而过滤激发光，例如带通型/长通型滤波器。
本领域技术人员会理解何种类型的滤波器优选用于不同的光源。同样，可以对于第二个激发光源16提供相似的光学元件。例如，如图8C、8D、8E和8F所示，可以提供透镜系统17，例如用于确定第二个激发光源16的光束性质。另外，可以使用另一个光分离元件18，例如二向色反射镜，例如用于合并来自两个不同的激发光源8和16的光。
本发明的设备还包括用于测量荧光标记粒子的荧光发射强度的装置。对于“双发射”构造而言，优选提供用于测量两个不同波长的装置；对于“双激发”构造而言，如果用于测量的装置构造为测量仅仅单个波长或单个波长范围，则是足够的。根据本发明，优选提供对于每个波长或波长范围的至少一个光探测器。例如，对于“双激发”构造而言，如果提供单个光探测器14，则是足够的(参见例如图8C和8D)。对于“双发射”构造而言，优选提供两个分开的光探测器14和15，如图8A、8B、8E和8F所示)。但是，本领域技术人员也会理解，可以提供两个光探测器用于“双激发”构造。但在此情况下，如果这些光探测器14和15中的仅仅一个用于测量发射，则是足够的。第一个和/或第二个光探测器可以是选自以下的光探测器：PMT，siPM，APD，CCD或CMOS摄影机。
同样，为了将发射光分开到第一和第二光探测器14和15，可以提供附加的光学元件，例如光分离元件11。例如，图8B显示用于“单激发”“双发射”构造的一种优选构造，其具有激发光源8以及两个光探测器14和15。送至各个探测器的发射光被光分离元件11、例如二向色反射镜分开。可以提供位于两个探测器14和15上游的附加滤波器12和13，用于限定不同的发射波长，例如第二波长和第三波长，其中第二波长比该荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更短，且第三波长比该荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更长。所述发射滤波器12和13可以选自任何合适类型的滤波器元件，例如带通型或长通型滤波器。
如图8A、8C和8E所示，可以另外提供热镜2，其优选用于将红外光从红外激光器3导向样品。例如，热镜2可以提供高的红外反射率和优选>80％的可见光透射率。红外光源3优选是至少一个红外激光器，优选具有例如1455nm、1480nm、1550nm和/或980nm的发射波长。另外，红外激光器的功率优选是0.01W-10W。为了将红外光导向样品，可以使用其它光学元件，例如激光纤维4(单模式或多模式)、激光纤维耦合器5(具有或不具有准直仪)和/或光束成型模块6，例如用于确定激光束的直径和焦点(例如，包含一个、两个或更多个透镜的透镜系统)(参见图8A、8C和8E)。但是，对于额外的温度依赖性测量或额外测量而言，红外光的输入仅仅是任选的。
本发明的设备还包括用于计算所述在第二波长和第三波长处的荧光强度之间的比率的装置，其中所述第三波长与所述第二波长不同。该装置优选由处理器或包含至少一个处理器的电路提供。
实施例
实施例1
本实施例显示使用本领域已知的比率表征方法与使用本发明的比率表征方法时的区别，从而得到两种分子之间的剂量-响应曲线。所以，用市售的荧光分光光度计和用本发明的双发射构造测量含有荧光标记DNA适配体和腺苷单磷酸酯(AMP)的样品。
样品的准备
准备未标记的AMP的14点1-to-1稀释系列。DNA适配体用Cy5进行荧光标记，并以相同的量加入AMP稀释系列中以得到20nM的最终样品浓度。AMP的最高浓度对应于5mM。对于使用标准荧光酶标仪(CLARIOstar，BMG Labtech)进行测量，将95μl的样品装入微孔板。对于使用本发明的双发射构造进行测量，将5至10μl的样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
对于使用酶标仪的测量，将样品在590nm波长处激发，并在628nm至652nm的波长下第一次测量发射。然后，将样品再次在590nm波长处激发，并在665nm至725nm的波长下测量发射。这些稀释系列随后进行三次荧光强度测量。对于根据本发明的比率法测量，将每个样品在591nm波长处激发。在628nm至653nm的第二波长和665nm至727nm的第三波长处同时测量荧光踪迹。
比率数据分析
为了用荧光酶标仪表征相互作用，使用市售的计算工具(Microsoft Excel)，手动计算每个孔的荧光强度之间的比率。用在较高波长处测得的荧光除以在较低波长处测得的荧光。如图10A所示的S形剂量-响应曲线在约0.95的比率值起始，并在约0.90的比率值结束。中点对应于相互作用的离解常数(Kd)，处于约20-30μM。但是，相互作用的信噪比(S/N)是非常低的，并且在重复测量之间的偏差非常大。
相比之下，通过使用本发明方法测量相同的样品，如图10B所示的剂量-响应曲线显示改进的信噪比(S/N)，并清楚地表明相互作用的Kd为39.3μM。当使用较低的样品浓度、即250pM时，对于根据本发明的比率法测量，信噪比(S/N)仍然非常好(19.8)，并且可以容易地确定相互作用的Kd(图10C)。
总之，此实施例证实了与使用酶标仪测量的情况相比，通过本发明的比率表征方法，约1000倍更少的样品仍然得到更好的数据。对于使用市售酶标仪的测量，噪声比要测量的信号幅度高出10倍。
实施例2
本实施例描述使用本发明的比率表征方法，基于双发射构造得到两种分子之间的剂量-响应曲线。所以，将含有荧光标记DNA适配体和AMP的样品在第一波长处激发，并在第二波长和第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
准备未标记的AMP的12点1-to-1稀释系列。DNA适配体用Cy5进行荧光标记，并以相同的量加入AMP稀释系列中以得到20nM的最终样品浓度。AMP的最高浓度对应于2mM。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在591nm波长处激发。在0s的时间点，开启红外激光器。同时在31s内测量荧光强度的响应。在图11A中提供在628nm至653nm记录的荧光踪迹(“650nm”)。在图11B中提供在665nm至727nm记录的荧光踪迹(“670nm”)。因为初始记录的荧光强度显示大的变化，所以无法得到用于确定亲合力的S形剂量-响应曲线。结果，从图12所示的两个发射波长中的任一个的初始荧光都无法获取结合信息。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用670nm和650nm的荧光踪迹进行逐点除法。所得的比率踪迹可以在开启红外激光器之前(图13A，阶段1)或在开启红外激光器之后(图13A，阶段2或阶段3)分析。通过对在开启红外激光器之前(图13A，阶段1)记录的数据进行比率分析，得到信噪比(S/N)大于300的剂量-响应曲线，由此获得在样品温度、即室温下这两个分子之间的Kd(图13B)。
通过在开启红外激光器之后(图13A，阶段2或阶段3)进行比率分析，可以得到在较高温度下的Kd值。如果幅度在室温下很小、并预期在较高的温度下增加，则特别推荐此方式。
确定相互作用的热力学参数
为了得到相互作用的Kd随时间变化的曲线，在200ms间隔内获取如图13A所示的比率踪迹的“垂直切片”，并对于每个切片确定剂量-响应曲线的Kd(图14A)。因为已经从校准检测(即，将样品盘以受控方式加热并检测参比染料的荧光)知道温度随着时间的变化，并且在比出现温度变化时更快的时间规模上平衡该相互作用，所以可以得到Kd随温度变化的关系。通过进行范特霍夫分析：
确定相互作用的结合焓(ΔH)和结合熵(ΔS)(图14B)。对于这种相互作用，发现AMP主要以焓的形式结合(ΔH<0)。
实施例3
本实施例描述使用本发明的比率表征方法，基于双激发构造得到两种分子之间的剂量-响应曲线。所以，将含有荧光标记DNA适配体和AMP的样品在第一波长和第二波长处激发，并在第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
准备未标记的AMP的16点1-to-1稀释系列。DNA适配体用Cy3进行荧光标记，并以相同的量加入AMP稀释系列中以得到250nM的最终样品浓度。AMP的最高浓度对应于12.5mM。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在480nm波长处激发(“蓝色”LED)。在0s的时间点，开启红外激光器。在6s内从590nm至680nm测量荧光强度的响应。随后，将每个样品在540nm的第二波长处激发(“绿色”LED)。在0s的时间点，开启红外激光器。用探测器在6s内从590nm至680nm记录荧光强度的响应。图15A提供通过用“蓝色”LED激发样品得到的荧光踪迹。图15B提供通过用“绿色”LED激发样品得到的荧光踪迹。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用经由绿色LED激发得到的荧光踪迹以点方式除以经由蓝色LED激发得到的荧光踪迹。所得的比率踪迹可以在开启红外激光器之前(图16A阶段1)或在开启红外激光器之后(图16A，阶段2或阶段3)分析。通过对在开启红外激光器之前(图16A，阶段1)记录的数据进行比率分析，得到信噪比(S/N)为约80的剂量-响应曲线，由此获得在样品温度、即室温下这两个分子之间的Kd(图16B)。通过对在开启红外激光器之后(图16A，阶段3)记录的数据进行比率分析，得到信噪比(S/N)大于130的剂量-响应曲线，由此获得这两个分子之间的Kd(图16C)。与在室温下的分析相比，当在较高温度下分析这些比率时，获得改进的信噪比。
实施例4
本实施例描述使用本发明的比率表征方法，基于双发射构造得到两种分子之间的剂量-响应曲线。所以，将含有荧光标记链霉亲和素和天然配体生物素的样品在第一波长处激发，并在第二波长和第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
准备未标记的生物素的12点1-to-1稀释系列。链霉亲和素用蛋白标记试剂盒RED-NHS第二代(NanoTemper Technologies)进行荧光标记，并以相同的量加入生物素稀释系列中以得到20nM的最终样品浓度。生物素的最高浓度对应于500nM。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在591nm波长处激发。同时在628nm至653nm(“650nm”)的第二波长和665nm至727nm(“670nm”)的第三波长处测量荧光踪迹。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用“670nm”的结果逐点除以“650nm”的结果。从图17所示的剂量-响应曲线显然可见，当链霉亲和素分别是未结合的或作为与生物素的复合物时，比率的数值从约2.2变化到约1.2。因为靶浓度显著高于Kd，所以可以观察到在80nM生物素的浓度时在化学计量点处的特征弯曲。
实施例5
本实施例描述使用本发明的比率表征方法，基于双发射构造得到两种分子之间的剂量-响应曲线。所以，将含有荧光标记的牛碳酸酐酶II和乙酰唑胺的样品在第一波长处激发，并在第二波长和第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
准备未标记的乙酰唑胺的15点1-to-1稀释系列。牛碳酸酐酶II用蛋白标记试剂盒RED-NHS第二代(NanoTemper Technologies)进行荧光标记，并以相同的量加入乙酰唑胺的稀释系列中以得到20nM的最终样品浓度。乙酰唑胺的最高浓度对应于2.5μM。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在591nm波长处激发。同时在628nm至653nm(“650nm”)的第二波长和665nm至727nm(“670nm”)的第三波长处测量荧光踪迹。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用“670nm”的结果逐点除以“650nm”的结果。从图18所示的剂量-响应曲线可见，比率的数值从约0.944变化到约0.951，即约0.7％。所得的剂量-响应曲线具有大于30的信噪比(S/N)。这表明即使比率的小变化也能用本发明的比率表征方法测量。
实施例6
本实施例描述使用本发明的比率表征方法，基于双发射构造得到三种分子之间的剂量-响应曲线。所以，将含有荧光标记的单价链霉亲和素、生物素化蛋白质L和抗体赫赛汀的样品在第一波长处激发，并在第二波长和第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
准备未标记的抗体赫赛汀的16点1-to-1稀释系列。单价链霉亲和素用蛋白标记试剂盒RED-NHS第二代(NanoTemper Technologies)进行荧光标记，将20nM的该物质与相同体积的4nM生物素化蛋白质L混合。该混合物然后以相同的量加入赫赛汀的稀释系列中以得到在分析中5nM标记单价链霉亲和素和1nM生物素化蛋白质L的最终样品浓度。赫赛汀的最高浓度对应于1μM。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(MonolithNT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在591nm波长处激发。同时在628nm至653nm(“650nm”)的第二波长和665nm至727nm(“670nm”)的第三波长处测量荧光踪迹。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用“670nm”的结果逐点除以“650nm”的结果。从图19A所示的剂量-响应曲线可见，本发明方法能够测量三元复合物，其中间接地经由标记的第三分子、例如标记的链霉亲和素进行标记(图19B)，用于测量在生物素化蛋白质与配体之间的相互作用。
实施例7
本实施例描述使用本发明的比率表征方法，基于双发射构造得到小分子与生物素化蛋白质(即，生物素分子共价连接至蛋白质)之间的剂量-响应曲线。对于荧光标记，将生物素化蛋白质与蛋白质链霉亲和素(SA)以及在其3’末端被生物素修饰和在其5’末端被荧光团Cy5修饰的短核酸(bDNA)混合。SA是均聚四聚体，其对生物素具有特别高的亲合力(也称为维生素B7)。其广泛用于分子生物和生物纳米技术中，这是由于链霉亲和素-生物素复合物具有耐受有机溶剂、变性剂(例如氯化胍)、洗涤剂(例如SDS、Triton)、蛋白水解酶和极限温度和pH的性质。
在本实施例中，含有麦芽糖结合蛋白质(MBP)的样品通过以下方式进行荧光标记。然后，将MBP与小分子麦芽糖混合，将其在第一波长处激发，并在第二波长和第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
以1mg/mL的原料浓度准备链霉亲和素(约19mM)，然后在磷酸盐缓冲的盐水中稀释到4nM。bDNA(12-mer oligo-dT序列，在其5’末端处连接Cy5分子，并在其3’末端处连接生物素分子)是化学合成的，并从DNA供应商订购。制备100μM原料溶液，然后在双蒸馏水(ddH2O)中稀释到8nM的最终浓度。然后将SA和bDNA以1:1的体积比率混合，由此得到4nM SA、8nMbDNA溶液(1:2的化学计量比)。通过此步骤，SA通过结合至Cy5-标记的生物素化bDNA而进行荧光标记。
接着，将100μL的100nM生物素化MBP与100μL的4nM SA、8nM bDNA溶液混合，由此得到200μL的2nM SA、4nM bDNA、50nM MBP溶液。因为SA是四聚体蛋白质，所以在其对于生物素的四个结合位点中的平均两个位点未被占据，并可以结合生物素化MBP以形成bDNA-SA-MBP复合物，即荧光标记MBP(图20A)。
接着，准备未标记的麦芽糖的16点1-to-1稀释系列。将荧光标记MBP以相同的量加入麦芽糖的稀释系列中以得到1nM SA、2nM bDNA和25nM MBP的最终目标浓度。麦芽糖的最高浓度对应于500μM。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在591nm波长处激发。同时在628nm至653nm(“650nm”)的第二波长和665nm至727nm(“670nm”)的第三波长处测量荧光踪迹。每个毛细管检测3秒的时间。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用在“670nm”的结果逐点除以“650nm”的结果。从图20B中的剂量-响应曲线可见，本发明方法能够测量四元复合物，其中间接地经由未标记的第三分子和已标记的第四分子进行标记，例如未标记的SA和已标记的生物素化单链DNA低聚体。
实施例8
本实施例描述使用本发明的比率表征方法，基于双发射构造得到两种分子之间的剂量-响应曲线。所以，将含有荧光标记的治疗性抗体CR3022、Cov-19(“SARS CoV-2”)刺突蛋白和蛋白质血管紧张素转换酶2(ACE2)的样品在第一波长处激发，并在第二波长和第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
准备未标记的蛋白质ACE2的14点1-to-1稀释系列。治疗性抗体CR3022用蛋白标记试剂盒RED-NHS第二代(NanoTemper Technologies)进行荧光标记，并将10nM的该物质与相同体积的80nM Cov-19刺突蛋白混合。该混合物然后以相同的量加入ACE2稀释系列中以得到5nM标记CR3022和20nM刺突蛋白的最终样品浓度。ACE2的最高浓度对应于250nM。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在591nm波长处激发。同时在628nm至653nm(“650nm”)的第二波长和665nm至727nm(“670nm”)的第三波长处测量荧光踪迹。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用“670nm”的结果逐点除以“650nm”的结果。从图21所示的剂量-响应曲线可见，本发明方法能够测量三元复合物，其中间接地经由已标记的第三分子、例如已标记的抗体进行标记。
实施例9
本实施例描述使用本发明的比率表征方法，基于双发射构造表征蛋白质的构象状态。所以，将含有荧光标记蛋白的样品在第一波长处激发，并在第二波长和第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
丝裂原活化蛋白激酶14(p38-a)用蛋白标记试剂盒RED-NHS第二代(NanoTemperTechnologies)进行荧光标记。标记的蛋白质然后被稀释到20nM的浓度，并装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemperTechnologies)中。
测量
将样品在591nm波长处激发。同时在628nm至653nm(“650nm”)的第二波长和665nm至727nm(“670nm”)的第三波长处测量荧光踪迹。所述测量在稀释之后直接进行(t＝0分钟)，并再次在毛细管内在3、8和19分钟之后测量。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用“670nm”的结果逐点除以“650nm”的结果。当荧光比率随着测量的起始时间绘图时，如图22所示，表明该比率随着四次测量的时间不是恒定的，并随着时间的进程线性增加。这种比率的增加表明，标记的蛋白质在室温下是不稳定的，并逐渐变性。
实施例10
本实施例描述使用本发明方法基于双发射构造测量快速结合动力学。所以，将含有用于腺苷的荧光标记DNA适配体和小分子AMP的样品以及含有两个11-mer互补DNA链的样品(其中一个DNA链用Cy5进行荧光标记)在第一波长处激发。在第二波长和第三波长处测量所述样品的发射的荧光强度。
样品的准备
对于适配体，准备未标记的AMP的12点1-to-1稀释系列。DNA适配体用Cy5进行荧光标记，并以相同的量加入AMP稀释系列中以得到20nM的最终浓度。AMP的最高浓度对应于2mM。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(MonolithNT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
对于DNA杂交，准备未标记的11-mer的16点1-to-1稀释系列(序列：5’CCT GAA GTCC 3’)。互补11-mer(序列：5’GGA CTT CAG G 3’)在其5’末端用Cy5进行荧光标记，并以相同的量加入该稀释系列中以得到10nM的最终浓度。未标记的11-mer的最高浓度对应于100μM。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在591nm波长处激发。在0s的时间点，开启红外激光器。同时在6s(适配体)、21s(DNA杂交)的时间内分别测量荧光强度的响应。在628nm至653nm(“650nm”)的第二波长和665nm至727nm(“670nm”)的第三波长处测量荧光踪迹。
从上述可见，当本发明方法与快速红外激光加热组合使用时，可以从任何“垂直”切片的随着时间变化的比率踪迹，推导出关于结合相互作用的信息(例如Kd)。可以生成新型的曲线，其可以描述为Kd随时间变化的曲线。从该曲线，不仅可以确定关于热力学的信息，而且可以确定关于f相互作用的结合动力学的信息。特别是，如果相互作用的平衡动力学比红外激光加热更慢，则Kd随时间变化的曲线会显示特征性的延迟。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用“670nm”的结果逐点除以“650nm”的结果。图23显示Kd随时间变化的曲线，表明具有不同的离解常数Kd和结合动力学的三种不同的相互作用。对于Cy5-标记DNA适配体与AMP之间的相互作用，确定Kd为约30μM，估计k关(koff)大于10s-1(图23A)。在32℃下检测两个11-mer互补DNA链之间的相互作用，即DNA杂交，确定Kd为约500nM，估计koff为约1s-1(图23B)。在22℃下检测上述两个11-mer互补DNA链，显示Kd为约5nM，koff小于0.01s-1(图23C)。
图24A提供如上所述关于DNA杂交在22℃和32℃之间测量Kd随时间变化的详细信息。y-轴显示在整个测量期间的Kd倍数增加。对于具有较慢动力学的相互作用，Kd随时间变化的曲线没有立即跟随温度变化，而是显示明显的延迟；这种延迟越大，相互作用动力学就越慢。所以，对这种延迟的分析可以提供关于相互作用的结合动力学的有价值的信息。即使如果不能得到koff和kon的实际值，能比较各配体并确认能更快离解的配体的能力也是此方法的巨大益处。
此外，假定在20s的红外激光加热之后，在新的较高温度下重新达到平衡，在两个不同温度、即在作为初始样品温度的22℃下和作为在红外激光加热之后温度的约32℃下进行范特霍夫分析(从如上所述的校准试验确定)，得到相互作用的焓和熵(参见图24B和图24C)。所得的热力学参数与从经典的范特霍夫分析所得的结果相似，其中将样品托盘的温度调节到多个不同的温度(例如22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃)并测量在每个温度下的Kd(参见图24D和图24E)。
图25提供在Kd随时间变化的曲线上对于不同解离速率的模拟数据。图25A提供模拟的Kd随时间变化的曲线，表明通过本发明方法与20s的红外激光加热组合，可以分辨10s-1至0.001s-1的解离速率。图25B提供模拟的Kd随时间变化的曲线，表明即使0.036s-1至0.154s-1的小差异也能分辨出来。
实施例11
本实施例描述使用本发明方法基于双发射构造测量慢速结合动力学。所以，将含有荧光标记的纳米抗体和Cov-19刺突RBD蛋白的样品在第一波长处激发，并在第二波长和第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
针对Cov-19刺突蛋白的纳米抗体用蛋白标记试剂盒RED-NHS第二代(NanoTemperTechnologies)进行荧光标记。将2nM的荧光标记纳米抗体快速地与在20nM至625pM范围内的六个不同浓度的Cov-19刺突RBD蛋白混合。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在591nm波长处激发。同时在628nm至653nm(“650nm”)的第二波长和665nm至727nm(“670nm”)的第三波长处测量荧光踪迹。在本实施例中没有开启红外激光器，当重复检测这些样品时，温度的变化可以影响结合动力学。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用“670nm”的结果逐点除以“650nm”的结果。图26显示比率随时间变化的曲线，表明当采用这种“混合-和-测量”方式时，本发明方法能够遵循慢速结合动力学，并且结合动力学比准备样品和开始检测所需的时间更慢。通过使用全球模拟模式，确定对于所述纳米抗体与Cov-19刺突RBD蛋白之间的相互作用，kon＝6.9x105M-1s-1，koff＝2.9x10-4s-1，且Kd＝415pM。
实施例12
本实施例描述使用本发明方法，基于双发射构造来定位荧光标记粒子(图27)。所以，将含有荧光标记mRNA的样品在第一波长处激发，并在第二波长和第三波长处测量发射的荧光强度。
样品的准备
mRNA用Atto647N荧光染料进行荧光标记，并将其引入类脂纳米粒子(LNPs)中。将双份的这些含有mRNA的LNP制剂暴露于不同类型的应力下，即添加0.25％的洗涤剂Polysorbate 20(Tween-20)，将其在90℃下煮沸10分钟，在旋转中保持1分钟，或在14,000rpm下离心20分钟。未处理的含有mRNA的LNP制剂用作对照品。然后，将这些样品装入被聚合物涂布的硼硅酸盐玻璃毛细管(Monolith NT.115Premium毛细管，MO-K025，NanoTemper Technologies)中。
测量
将每个样品在591nm波长处激发。同时在628nm至653nm(“650nm”)的第二波长和665nm至727nm(“670nm”)的第三波长处测量荧光踪迹。
对于测量以仅仅确定绝对荧光比率，每个毛细管进行3秒的测量时间。对于测量以确定LNPs的聚集状态，用红外激光进行测量(激光器开启时间为60秒)。
从先前进行的对照检测，显然可见，在本发明的双发射构造中，位于LNPs内的荧光标记mRNA与Atto647N的比率荧光信号等于约2.1。相比之下，当所有的荧光标记mRNA分子位于LNPs之外时，比率荧光信号等于约1.2。
比率数据分析
对于比率分析(即，得到荧光踪迹的比率)，用“670nm”的结果逐点除以“650nm”的结果。对于未经处理的对照品，即所有的荧光标记mRNA分子位于LNPs内，比率荧光信号等于2.1(图28A，对照)。通过添加高浓度的洗涤剂，LNPs的类脂膜受到破坏/损害，进而，所述荧光标记mRNA分子不再被引入LNPs内(图28A，+0.25％Tween)。在这种情况下，比率荧光信号等于1.2。从约2.1的比率显然可见，荧光标记mRNA仍然位于处于旋转或离心的LNP制剂内(图28A，1分钟旋转，20分钟离心)。但是，当分析在开启红外激光器之后得到的“凹凸不平的”荧光踪迹(图28B)时，所述处理导致LNP制剂的聚集。相比之下，当LNP制剂在90℃下沸腾10分钟时得到比率为1.2，这表明荧光标记mRNA不再被引入LNPs内(图28A，在90℃下10分钟)。这通过分析在开启红外激光器之后的荧光踪迹得到进一步证实。因为，在沸腾之后观察到没有凹凸不平之处的荧光踪迹，所以确认了荧光标记mRNA分子已经离开LNPs(潜在地仍然聚集)。
从上述显然可见，本发明的比率表征方法能够确定荧光标记mRNA的定位。
参考符号的列表：
1：透镜(例如非球面透镜)，或透镜系统，或物镜；
2：热镜，高红外反射，可见光透射率>80％；
3：红外激光器(例如1455nm，1480nm，1550nm，980nm，0.01W-10W)或用于定位的激光器
4：激光纤维(单模式或多模式)；
5：激光纤维耦合器w/o准直仪；
6：光束成型模块，用于确定激光束的直径和焦点(例如，包含一个、两个或更多个透镜的透镜系统)；
7：第一个光分离元件(例如二向色反射镜)，用于将荧光激发从发射分开；
8：第一个激发光源(例如激光器、纤维激光器、二极管激光器、LED、HXP、卤素、LED阵列、HBO)；
9：透镜系统，用于确定激发光源的光束性质(例如一个、两个或更多个透镜)；
10：激发滤波器(例如带通型/长通型)；
11：第二个光分离元件(例如二向色反射镜)，用于将发射分成较低波长和较高波长的组分；
12：第一个发射滤波器(例如带通型/长通型)；
13：第二个发射滤波器(例如带通型/长通型)；
14：第一个光探测器(例如PMT、siPM、APD、CCD或CMOS摄影机)；
15：第二个光探测器(例如PMT、siPM、APD、CCD或CMOS摄影机)；
16：第二个激发光源(例如激光器、纤维激光器、二极管激光器、LED、HXP、卤素、LED阵列、HBO)；
17：透镜系统，用于确定激发光源的光束性质；
18：第三个光分离元件(例如二向色反射镜)，用于合并两个不同的激发光源。
引用的非专利文献：
[NPL1]Sindrewicz,P.，Li,X.，Yates,E.A.，Turnbull,J.E.，Lian,L.Y.，&Yu,L.G.(2019)，“固有色氨酸荧光光谱可靠地确定半乳糖凝集素-配体相互作用”，Scientificreports，9(1)，1-12。
[NPL2]Mayer-Wrangowski,S.C.，&Rauh,D.(2015)，“监测配体诱导的构象变化以确认雌激素受体激动剂和拮抗剂”，Angewandte Chemie International Edition，54(14)，4379-4382。
[NPL3]Chen,H.L，Chew,C.Y.，Chang,E.H，Tu,Y.W.，Wei,L.Y.，Wu,B.H.，...&Tan,K.T.(2018)，“S-cis二烯构象：一种用于近红外荧光可切换型染料和成像应用的新型红移策略”，Journal of American Chemical Society，140(15)，5224-5234。
[NPL4]Niu,W.，Wei,Z.，Jia,J.,Shuang,S.，Dong,C.，&Yun,K.(2018)，“用于传感和成像在活细胞中的pH变化的一种比率发射NIR-荧光探针”，Dyes and Pigments，152，155-160。
[NPL5]Pauli,J.，Grabolle,M.，Brehm,R.，Spieles,M.，Hamann,F.M.，Wenzel,M.，...&Resch-Genger，U.(2011)，“适用于分子成像的的标记--染料结构和亲水性对IgG共轭物的光谱性质的影响”，Bioconjugate chemistry，22(7)，1298-1308。
[NPL6]Harroun,S.G.，Lauzon,D.，Ebert,M.C.，Desrosiers,A.，Wang,X.，&Vallee-Belisle,A.(2022)，“使用荧光纳米天线监测蛋白质的构象变化”，NatureMethods，19(1)，71-80。
将本文提到的所有专利和非专利文件的全部内容引入本文以供参考。
Claims (20)
1.一种通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化来表征在溶液中的荧光标记粒子的方法，包括以下步骤：
a)在第一个条件下提供在溶液中的荧光标记粒子的样品，
b)在第一波长处激发所述荧光标记粒子，
c)测量所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度，
d)计算在所述第二波长和第三波长处的荧光强度之间的比率，
其中所述第三波长与所述第二波长不同，
e1)使所述荧光标记粒子的样品在第二个条件下重复进行步骤b)至d)，或
e2)使所述荧光标记粒子的第二个样品在第二个条件下重复进行步骤a)至d)，
其中所述第二个条件与所述第一个条件不同，
f)基于在所述不同条件下得到的比率计算值，表征所述荧光标记粒子，
其中同时测量第二波长和第三波长，和其中第二波长比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更短，且第三波长比所述荧光标记粒子在第一个条件下的荧光发射的发射最大值更长。
2.根据权利要求1所述的方法，其中含有荧光标记粒子的样品的体积小于100μl，优选为1μl至25μl。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中在毛细管中提供所述含有荧光标记粒子的样品。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述荧光标记粒子用对环境敏感的标记进行标记。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述粒子选自有机分子、生物分子、纳米粒子、微粒、囊泡、生物细胞或亚细胞片段、生物组织、病毒粒子、病毒、细胞器、类脂纳米粒子(LNPs)和病毒样粒子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物分子选自氨基酸、蛋白质、肽、单糖和二糖、多糖、类脂、糖脂、脂肪酸、甾醇、维生素、神经递质、酶、核苷酸、代谢物、核酸及其组合。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述荧光标记粒子在溶液中的浓度是10pM至10μM，优选50pM至500nM。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所测量的荧光标记粒子的荧光强度的变化是来源于光谱位移、或光谱变宽、或光谱变窄或其组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述荧光标记粒子的荧光强度由于选自以下的机理而变化：荧光标记粒子的构象变化，荧光标记粒子的再定位，在荧光标记粒子与一种或多种配体之间的相互作用，及其组合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤f)中得到的比率计算值用于确定荧光标记粒子的定位或选自以下的参数：离解常数，有效浓度最大值的一半(EC50)，平衡常数，结合动力学，酶催反应动力学，热力学参数，去折叠或再折叠动力学，开放和闭合反应，及其组合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤e)中的第二个条件通过添加配体和/或不同浓度的配体来改变，并且在步骤f)中得到的比率计算值用于确定荧光标记粒子和配体的离解常数。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述荧光标记粒子的第一个条件和第二个条件在它们的温度和/或化学组成方面不同。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度是在限定的温度扰动期间测量的。
14.一种用于通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化来表征在溶液中的荧光标记粒子的设备，其特别适用于进行根据前述权利要求中任一项所述的方法，该设备包括：
样品容器，其用于容纳在多个条件下在溶液中的荧光标记粒子的样品；
用于在第一波长处激发所述荧光标记粒子的装置；
用于测量所述荧光标记粒子在第二波长和第三波长处的荧光发射强度的装置；
用于计算在第二波长和第三波长处的荧光发射强度之间的比率的装置，其中所述第三波长与所述第二波长不同；
其中所述设备构造为连续地进行荧光激发、测量荧光发射并计算样品在不同条件下的比率；
用于基于在不同条件下得到的比率计算值表征所述荧光标记粒子的装置，
其中该设备构造为同时测量第二波长和第三波长，和其中第二波长比所述荧光标记粒子在所述不同条件中的第一个条件下的荧光发射的发射最大值更短，且第三波长比所述荧光标记粒子在所述不同条件中的第一个条件下的荧光发射的发射最大值更长。
15.根据权利要求14所述的设备，其中所述用于激发的装置是激发光源，优选至少一个选自激光器、激光纤维激光器、二极管激光器、LED、HXP、卤素、LED阵列、HBO的光源。
16.根据权利要求14或15所述的设备，其中所述用于测量的装置是光探测器，优选至少一个选自PMT、siPM、APD、CCD或CMOS摄影机的探测器。
17.一种包含指令的计算机程序，当由计算机执行该程序时，所述指令使得计算机进行根据权利要求1-13中任一项所述的方法。
18.一种包含指令的计算机可读取的数据载体，当由计算机执行时，所述指令使得计算机进行根据权利要求1-13中任一项所述的方法。
19.根据权利要求14-16中任一项所述的设备用于表征在溶液中的荧光标记粒子的用途，优选根据权利要求1-13中任一项所述的方法进行表征。
20.毛细管用于通过分析荧光标记粒子的荧光光谱的变化来表征在溶液中的荧光标记粒子的用途，其中将所述在溶液中的荧光标记粒子的样品装入毛细管并进行分析，特别是根据权利要求1-13中任一项所述的方法进行分析。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21183266 | 2021-07-01 | ||
| EP21183266.2 | 2021-07-01 | ||
| PCT/EP2022/068114 WO2023275274A1 (en) | 2021-07-01 | 2022-06-30 | Methods and devices for ratiometric characterization of fluorescent particles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117795312A true CN117795312A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=77021050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280046789.7A Pending CN117795312A (zh) | 2021-07-01 | 2022-06-30 | 用于通过比率表征荧光粒子的方法和设备 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240159675A1 (zh) |
| EP (1) | EP4363826A1 (zh) |
| KR (1) | KR20240032892A (zh) |
| CN (1) | CN117795312A (zh) |
| CA (1) | CA3222236A1 (zh) |
| WO (1) | WO2023275274A1 (zh) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010535531A (ja) * | 2007-08-10 | 2010-11-25 | カーネギー インスチチューション オブ ワシントン | Ｒｅｔナノセンサーの使用方法 |
| EP2240613B1 (en) * | 2008-02-06 | 2013-09-11 | Ludwig-Maximilians-Universität München | Thermo-optical characterisation of nucleic acid molecules |
| EP2630502B1 (en) * | 2010-10-19 | 2017-08-02 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Analyte sensors, using such sensors, and methods of detecting analyte activity |
| EP3150988B1 (de) | 2015-10-01 | 2021-01-27 | NanoTemper Technologies GmbH | System und verfahren für die optische messung der stabilität und der aggregation von partikeln |
| CA3005883A1 (en) | 2015-11-20 | 2017-05-26 | Duke University | Ratiometric biosensors and non-geometrically modulated fret |
| EP3845902B1 (en) | 2017-06-23 | 2022-09-14 | NanoTemper Technologies GmbH | Methods for measuring inter- and/or intra-molecular interactions |
-
2022
- 2022-06-30 EP EP22735919.7A patent/EP4363826A1/en active Pending
- 2022-06-30 CN CN202280046789.7A patent/CN117795312A/zh active Pending
- 2022-06-30 US US18/575,347 patent/US20240159675A1/en active Pending
- 2022-06-30 KR KR1020247003517A patent/KR20240032892A/ko unknown
- 2022-06-30 CA CA3222236A patent/CA3222236A1/en active Pending
- 2022-06-30 WO PCT/EP2022/068114 patent/WO2023275274A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3222236A1 (en) | 2023-01-05 |
| EP4363826A1 (en) | 2024-05-08 |
| US20240159675A1 (en) | 2024-05-16 |
| KR20240032892A (ko) | 2024-03-12 |
| WO2023275274A1 (en) | 2023-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11099192B2 (en) | Fast thermo-optical particle characterisation | |
| US8741570B2 (en) | Thermo-optical characterisation of nucleic acid molecules | |
| Nagl et al. | Fluorescence analysis in microarray technology | |
| Sahoo | Förster resonance energy transfer–A spectroscopic nanoruler: Principle and applications | |
| CN103026205A (zh) | 使用发光探针检测溶液中稀疏颗粒的方法 | |
| WO2012144528A1 (ja) | 標的粒子の定量方法、光分析装置及び光分析用コンピュータプログラム | |
| US20170370927A1 (en) | Method of measuring the affinity of biomolecules | |
| CN110832324B (zh) | 测量分子间和/或分子内相互作用的方法 | |
| JP6013332B2 (ja) | 標的粒子の計数方法 | |
| EP2743684B1 (en) | Method for detecting fluorescent particles | |
| CN117795312A (zh) | 用于通过比率表征荧光粒子的方法和设备 | |
| Hlaváček et al. | Artificial Intelligence-Aided Massively Parallel Spectroscopy of Freely Diffusing Nanoscale Entities | |
| WO2009082242A2 (en) | Optical analyte detection incorporating a micromirror device |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |