KR20240032892A - 형광 입자의 비율계량 특성화 방법 및 장치 - Google Patents
형광 입자의 비율계량 특성화 방법 및 장치 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자의 특성화하는 장치 및 방법에 관한 것이다. 특히, 형광 표지된 입자의 샘플은 형광 여기 및 해당 형광 방출 검출을 통해 상이한 조건/환경에서 분석된다. 상기 입자는 이러한 상이한 조건/환경에서 검출된 형광 방출을 분석하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명은 형광 표지된 입자의 분자간 및/또는 분자내 상호작용의 비율계량 특성화 및/또는 형태 변형 및/또는 위치화를 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
Description
본 발명은 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자를 특성화하는 장치 및 방법에 관한 것이다. 특히, 형광 표지된 입자의 샘플은 형광 여기 및 해당 형광 방출 검출을 통해 상이한 조건/환경에서 분석된다. 상기 입자는 이러한 상이한 조건/환경에서 검출된 형광 방출을 분석하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명은 형광 표지된 입자의 분자간 및/또는 분자내 상호작용의 비율계량 특성화(ratiometric characterization) 및/또는 형태 변형(conformational modification) 및/또는 위치화(localization)를 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
형광 라벨의 형광 스펙트럼은 주변 화학 물질의 변화 및 온도 변화 등 환경 변화에 민감하다. 따라서 동일한 형광 라벨은 강도 및/또는 스펙트럼 이동 및/또는 스펙트럼 모양 측면에서 형광 스펙트럼의 변경을 나타낼 수 있다.
이 효과는 잘 알려져 있기 때문에, 본질적으로 또는 외부적으로 형광 표지된 입자의 상호 작용을 연구하는 데 사용된다. 해당 분야에서 형광 강도의 변경은 해리 상수(Kd)(NPL1, NPL2)를 결정하여 결합 반응을 특성화하는데 주로 사용된다. 더불어, 분자간 상호작용을 특성화하고 상호작용을 결정하는 것은 분자간 상호작용 및/또는 형광 표지된 입자의 변형(형태 변화) 및/또는 위치화(변화)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 형태 변화는 및 분석물 농도는 포스터 공명 에너지 전달(Forster resonance energy transfer, FRET)이라는 메커니즘과 관련된 방법을 기반으로 해당 분야(WO 2017/087912 A2)에서 결정된다. FRET의 기본 메커니즘은 여기된 전자 상태에서 공여체 형광 단을 포함하며, 두 형광 단 사이의 거리 및/또는 각도의 상호 작용-매개 (예를 들어, 리간드-매개) 변화로 인해 쌍극자-쌍극자 커플 링을 통해 여기 에너지를 근처의 수용체 형광 단으로 전달할 수 있다. 따라서, FRET 측정은 2 개 이상의 형광 라벨, 즉 적어도 하나의 공여자 및 적어도 하나의 수용체 형광 단을 필요로 한다. 그러나, 환경 변화에 대한 감도가 상이 할 수 있는 두 가지 다른 형광 라벨이 사용되기 때문에, 형광 단의 국소 환경에서 바람직하지 않은 변화에 의해 FRET 측정이 위조될 수 있다. 또한, 에너지 전달을 통해 여기될 때 수용체 형광 단으로부터의 형광 방출은 일반적으로 직접 여기로 인한 수용체 형광 단 방출 강도의 측정보다 낮은 신호 강도를 제공한다. 일반적으로 FRET 측정은 예를 들어, 두 개의 부위별 표지 화학 물질(site-specific labeling chemistries)을 적용하여 표적 분자에서 정해진 거리 내에 공여 형광 단과 수용체 형광 단을 정확하게 배치해야 하는데, 이는 모든 종류의 표적에 대해 실행 가능하지 않을 수 있다. 대조적으로, 예를 들어 라이신 반응성 염료 또는 시스테인 반응성 염료에 의한 무작위 표지는 다양한 FRET 거리를 초래하여 FRET의 측정을 실패하게 된다. 요약하면, 본 발명에서와 같이 단일 형광 표지만을 포함하는 측정과 비교하여, FRET 측정은 더 낮은 신호 대 잡음 비율을 가지며, 분석할 형광 표지된 입자는 한 가지 유형의 형광 표지로만 표지되는 것이 바람직하다.
상호 작용과 형광 라벨 자체의 특성에 따라, 형광 스펙트럼의 변경은 1% 보다 작을 수 있으며, 이는 일반적인 피펫팅 오류 범위에 속한다. 현재, 해당 분야에서 이용 가능한 방법/장치로는 1% 미만의 변화를 해결하는 것이 불가능하지는 않더라도 어렵다.
형광 표지의 형광 스펙트럼 변화는 일반적으로 형광 분광 광도계로 감지되며, 이는 넓은 스펙트럼 범위에 걸쳐 기록/측정하도록 설계되어, 형광 강도의 작은 변화를 해결하지 못한다. 또한, 상업적으로 이용 가능한 형광 표지는 현재 환경 변화에 대해 보다 강력하게 설계되었으므로, 분광 광도계 측정의 해상도를 높이기 위해 초 민감한 형광 표지를 맞춤화할 필요가 있다(NPL3, NPL4, NPL5).
복수의 측정 값을 결합하여 분광 광도 측정의 해상도를 향상시킬 수 있는 또 다른 가능성을 달성할 수 있다. 이 경우, 검사할 샘플은 제1파장에서 여기되고. 제1측정의 제2파장에서 방출을 측정한 다음, 제1파장에서 여기 단계를 반복하고 제2측정의 제3파장에서 방출의 측정을 반복한다. 그런 다음 제1측정 및 제2측정에서 얻은 검출된 방출 강도를 결합한다. 따라서, 예를 들어 수동 취급으로 인해 도입된 모든 인공물과 무관한 관심의 정보를 결정할 수 있다. 그러나 2개의 측정의 후속 구현으로 인해, 이 방법은 더 번거롭고 시간이 많이 걸린다. 또한, 제1측정 및 제2측정의 조건은 다를 수 있다. 또한 탈색(bleaching)이 발생하여 결과가 변조될 수 있다. 이 접근법을 사용함으로써 실온에서 측정될 때 형광 변화가 4.5%로 감소되었다(NPL2).
일반적으로, 상업적으로 이용 가능한 형광 분광 광도계 장치를 이용한 측정에는 큰 샘플 부피(즉, 석영 큐벳 또는 다중 웰 플레이트를 사용)가 필요하며, 결과적으로 형광 강도의 변화를 충분히 해결하기 위해 더 높은 샘플 농도가 필요하다. 다음에서, 더 작은 샘플 부피(즉, 10 ㎕)가 필요한 해당 분야에 알려진 추가 방법에 대해 논의한다.
예를 들어, 실온에서의 절대 강도 변화가 피펫팅 오류에 비해 너무 작기 때문에, 온도 관련 강도 변경(TRIC)을 기반으로 특성화 방법을 적용하여 피펫팅 오류를 제거할 수 있다(WO 2018/234557). FHOT/FCOLD, 즉 실온에서 측정된 강도에 기초한 형광 강도와 전형적으로 더 높은 온도에서 1초에서 측정된 강도에 기초한 형광 강도의 비율을 계산함으로써, 의미있는 측정, 분자간 및 분자내 상호 작용은 여전히 결정될 수 있다.
그러나 섭씨 몇 도(℃)만으로도 온도가 증가한다:
- 측정할 입자에 의해 항상 허용되는 것은 아니다. 따라서, 이 방법은 불안정한 단백질과 같은 불안정한 샘플을 포함하는 상호 작용을 특성화하는데 적합하지 않다.
- 형광 강도는 형광 표지된 입자 및 리간드와 복합된 형광 표지 된 입자에 대해 동일하게 변화할 수 있다. 이 경우, "FHOT/FCOLD"는 두 경우 모두에서 동일한 값을 가지며 상호 작용 파트너 사이의 상호 작용이 발생하지만 결합 곡선은 얻을 수 없다.
- 일정 부분의 응집체를 함유하는 샘플과 같은 불균일한 샘플은 대류로 인한 돌이킬 수 없는 형광 흔적(fluorescence trace)를 유발할 수 있으며, 이는 "FHOT/FCOLD"의 노이즈가 실질적으로 커질 수 있음을 의미한다. 따라서, 신호 진폭이 작은 시스템에 대한 결합 곡선을 얻는 것은 불가능하다.
더욱이, 표지된 분자 A, A에 결합하는 다른 분자 B, 및 B에 결합하는 제3의 분자를 함유하는 복합체와 같은 3원 복합체의 상호 작용을 분석시 TRIC의 변경은 종종 상기 상호 작용을 해결하기에 충분하지 않다.
온도에 따라 상호 작용이 빠르게 변화하고 리간드의 결합이 형광 강도 변화를 일으키는 경우, TRIC 방법은 2상 용량-반응-커브(biphasic dose-response-curves)를 초래할 수 있으며, 이는 s자 1-1 결합 모델(sigmoidal 1-to-1 binding model)로 분석할 수 없거나, 해리 상수의 측정된 값은 실제 값에서 벗어날 수 있다(예를 들어, 측정된 결합 친화력은 낮은 온도 대신 더 높은 온도에서 약한 결합에 해당한다).
형광 입자의 분자내 및/또는 분자 간 상호 작용을 조사하기 위한 다른 접근법은 나노 차동 주사 형광 측정법이다(WO 2017/055583). 이 방법은 트립토판(Trp) 및 티로신(Tyr) 잔기를 함유하는 단백질의 고유 형광 강도의 측정 변화에 기초한다. 그러나, 단백질은 전형적으로 이들 형광 방향족 아미노산 잔기 중 몇몇을 포함한다. 일반적으로 이들 모두가 결합 반응에 관여하는 것은 아니기 때문에, 여기시 신호의 진폭을 감소시키는 높은 형광 배경이 발생한다. 또한, Trp 및 Tyr 잔기는 전형적으로 단백질의 소수성 코어에 위치하며 리간드의 결합에 의해 크게 영향을 받지 않을 수 있다. 종종 Trp 및 Tyr의 형광과 같은 범위에 놓여 있기 때문에 리간드의 자가 형광은 판독을 방해한다.
대조적으로, 외적 형광 표지로 표지함으로써 하나의 염료(즉, 하나의 유형의 염료)만이 표적 분자에 부착되고, 상기 염료만이 리간드 결합에 의해 영향을 받을 필요가 있음을 제어할 수 있다. 또한, 화학적 미세 환경(chemical micro-environment)(예를 들어, 리간드 결합 부위의 근접성)의 변화를 검출하는 데 최적의 위치에 염료를 배치할 수 있도록 표지 화학을 조정할 수 있다. 또한, 외적 염료는 일반적으로 단백질 표면에 위치하므로, 화학적 미세 환경에 대한 감각 변화에 이상적인 노출이 있다. 염료 형광 범위는 리간드의 자가 형광을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 마지막으로, 외적 염료는 훨씬 더 밝고, 측정은 표적 분자의 훨씬 낮은 농도에서 발생하여 샘플 소비를 줄이고, 심지어 피코 몰라 친화도(picomolar affinities)를 측정할 수 있게 한다.
따라서, 분자간 및/또는 분자내 상호작용의 특성화, 및/또는 형광 표지된 입자의 변형(형태 변화) 및/또는 국소화(변화)를 위한 개선된 또는 대안적인 방법 또는 개선된 또는 대안적인 장치가 필요하다.
본 발명은 독립항의 특징에 의해 정의된 바와 같이 분자간 및/또는 분자내 상호작용 및/또는 형광 표지된 입자의 변형(형태 변화) 및/또는 위치화(변화)를 특성화하기 위한 새로운 방법 및 장치를 제공한다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시예는 종속항에 정의된다. 특히, 본 발명은 바람직하게는 정확히 하나의 형광 표지에 기초하고 형광 표지된 입자의 특성(예를 들어, 온도 안정성, 응집체 형성) 및 크기와 무관하게 표지된 형광 입자의 형광 스펙트럼에서 임의의 작은 변경을 경제적으로 해결하는 기술적 문제를 해결한다.
본 발명은 형광 표지된 입자의 분자간 및/또는 분자내 상호작용의 비율계량 특성화 및/또는 형태 변형 및/또는 위치화를 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 이전에 공지된 방법으로는 해결할 수 없었던 작은 샘플 부피의 형광 표지된 입자 내에서 형광 표지의 형광 스펙트럼의 변경을 검출하는 데 개선된 감도를 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 온도에 민감하며 및/또는 불안정한 샘플의 빠른 측정을 가능하게 한다. 정의된 온도 섭동과 결합하여, 본 발명의 방법은 상호작용의 열역학적 및 동역학적 매개변수의 측정을 가능하게 한다. 본 발명의 방법에서, 바람직하게는 적어도 하나의 형광 표지로 표지된 형광 표지된 입자가 사용된다. 본 발명의 방법은 (예를 들어, 형광 표지된 입자가 지질 나노입자(LNP) 및/또는 세포 및/또는 LNP 및 세포를 둘러싸는 완충 용액 내에 위치하는 경우) 형광 표지된 입자의 위치를 확인할 수 있다.
제1측면에서, 본 발명은 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변경을 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자를 특성화하는 방법에 관한 것이다. 제1측면의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 제1조건 하에서 용액 내 형광 표지된 입자의 샘플을 제공하는 단계,
b) 제1파장에서 형광 표지된 입자를 여기시키는 단계,
c) 제2파장 및 제3파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하는 단계,
d) 제2파장 및 제3파장에서의 형광 강도 사이의 비율을 계산하되,
제3파장은 제2파장과 상이한 단계.
e1) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 샘플에 대해 b)단계 내지 d)단계를 반복하거나, 또는
e2) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 제2샘플에 대해 a)단계 내지 d)단계를 반복하되,
제2조건은 제1조건과 상이한 단계인 것이 추가로 바람직하다.
f) 상이한 조건에 대해 얻은 계산된 비율을 기반으로 형광 표지된 입자를 특성화하되,
제2파장과 제3파장은 바람직하게는 동시에 검출되고, 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 형광 방출의 최대 방출보다 제2파장은 바람직하게는 더 짧고, 제3파장은 바람직하게는 더 길다.
제2측면에서, 본 발명은 정의된 온도 섭동/온도 변화와 함께 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자를 특성화하는 방법에 관한 것이다. 제2측면의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 제1조건 하에서 용액 내 형광 표지된 입자의 샘플을 제공하는 단계,
b) 제1파장에서 형광 표지된 입자를 여기시키는 단계,
c) 제2파장 및 제3파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하는 단계로서,
상기 강도는 정의된 온도 섭동 동안 검출되는 단계;
제2파장과 제3파장에서의 형광 강도 사이의 비율을 계산하는 단계로서, 제2파장과 제3파장은 상이한 단계.
제1측면과 같이,
e1) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 샘플에 대해 b)단계 내지 d)단계를 반복하거나, 또는
e2) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 제2샘플에 대해 a)단계 내지 d)단계를 반복하되,
제2조건은 제1조건과 상이한 단계;
f) 상이한 조건에 대해 얻은 계산된 비율을 기반으로 형광 표지된 입자를 특성화하되,
제2파장과 제3파장은 바람직하게는 동시에 검출되고, 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 형광 방출의 최대 방출보다 제2파장은 바람직하게는 더 짧고, 제3파장은 더 긴 단계를 포함하는 것 또한 바람직하다.
제3측면에서, 본 발명은 정의된 온도 섭동/온도 변화와 함께 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자의 열역학적 및/또는 동역학적 매개변수를 특성화하는 방법에 관한 것이다.
제4측면에서, 본 발명은 정의된 온도 섭동/온도 변화와 함께 또는 정의된 온도 섭동/온도 변화 없이 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자의 위치를 특성화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, c)단계의 제2파장 및 제3파장에서의 형광 방출 강도가 동시에 검출되는 것이 바람직하며, 이는 바람직하게는 1초 미만, 보다 바람직하게는 750ms 미만, 보다 바람직하게는 500ms 미만, 보다 바람직하게는 250ms 미만, 보다 바람직하게는 100ms 미만, 보다 바람직하게는 50ms 미만, 보다 바람직하게는 25ms 미만, 보다 바람직하게는 10ms 미만, 보다 바람직하게는 5ms 미만, 보다 더 바람직하게는 2.5ms 미만의 짧은 시간 간격 내를 의미한다. 이러한 맥락에서 일반적인 시간 간격은 50ms, 10ms 및 1ms이다.
본 발명의 일부 특정 측면은 다음과 같이 요약될 수 있다:
일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 방법은 a) 제1조건 하에서 용액 내 형광 표지된 입자의 샘플을 제공하는 단계, b) 제1파장에서 형광 표지된 입자를 여기시키는 단계, c) 제2파장 및 제3파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하는 단계, d) 제2파장 및 제3파장에서의 형광 강도 사이의 비율을 계산하되, 제3파장은 제2파장과 상이한 단계, e1) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 샘플에 대해 b)단계 내지 d)단계를 반복하거나, 또는e2) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 제2샘플에 대해 a)단계 내지 d)단계를 반복하되, 제2조건은 제1조건과 상이한 단계, f) 상이한 조건에 대해 얻은 계산된 비율을 기반으로 형광 표지된 입자를 특성화하되, 제2파장과 제3파장은 동시에 검출되고, 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 형광 방출의 최대 방출보다 제2파장은 더 짧고, 제3 파장은 더 긴 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 형광 표지된 입자를 함유하는 샘플 부피는 100μl 미만, 바람직하게는 1μl 내지 25μl이며, 즉, 형광 표지된 입자를 함유하는 샘플은 100μl 미만, 바람직하게는 1μl 내지 25μl의 부피로 제공된다.
본 발명의 일부 측면에서, 형광 표지된 입자를 함유하는 샘플은 1μl 내지 25μl의 부피로 제공되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일부 측면에서, 형광 표지된 입자를 함유하는 샘플은 모세관에 제공된다.
본 발명의 일부 측면에서, 형광 표지된 입자는 환경 민감성 표지로 표지된다.
본 발명의 일부 측면에서, 상기 입자는 유기 분자, 생체분자, 나노입자, 마이크로입자, 소포, 생물학적 세포 또는 하위 세포 단편(sub-cellular fragment), 생물학적 조직, 바이러스 입자, 바이러스, 세포 소기관, 지질 나노입자(LNP) 및 바이러스 유사 입자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 측면에서, 생체분자는 아미노산, 단백질, 펩티드, 단당류 및 이당류, 다당류, 지질, 당지질, 지방산, 스테롤, 비타민, 신경전달물질, 효소, 뉴클레오티드, 대사산물, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 측면에서, 용액 내 형광 표지된 입자의 농도는 10pM 내지 10μM, 바람직하게는 50pM 내지 500nM이다.
본 발명의 일부 측면에서, 형광 표지된 입자의 검출된 형광 강도의 변화는 스펙트럼 이동, 스펙트럼의 확장, 스펙트럼의 축소, 또는 이들의 조합으로부터 발생한다.
본 발명의 일부 측면에서, 형광 표지된 입자의 형태적 변화, 형광 표지된 입자의 재배치, 형광 표지된 입자와 하나 이상의 리간드 사이의 상호작용 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 메커니즘으로 인해 형광 표지된 입자의 형광 강도가 변화한다.
본 발명의 일부 측면에서, f)단계에서 얻은 계산된 비율은 형광 표지된 입자의 위치 또는 해리 상수, 최대 유효 농도의 절반(EC50), 평형 상수, 결합 동역학, 효소 반응 동역학, 열역학, 동역학 매개변수, 언폴딩 또는 리폴딩 동역학(unfolding or refolding kinetics), 열기 및 닫기 반응(opening and closing reactions) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매개변수를 결정하는 데 사용된다.
본 발명의 일부 측면에서, e)단계의 제2조건은 리간드를 첨가하거나 및/또는 리간드의 상이한 농도에 의해 변경되고, f)단계에서 얻은 계산된 비율은 형광 표지된 입자와 리간드의 해리 상수를 결정하는 데 사용된다.
본 발명의 일부 측면에서, 형광 표지된 입자의 제1조건과 제2조건은 온도 및/또는 화학적 조성에 관하여 상이하다.
본 발명의 일부 측면에서, c)단계의 제2파장 및 제3파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도는 정의된 온도 섭동(temperature perturbation) 동안 검출된다.
또한, 본 명세서에서 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자를 특성화하는 장치 및 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 본 발명의 장치는 본 명세서에 기술된 방법을 수행하는데 적합하다. 본 발명의 일부 측면에서, 상기 장치는 복수의 조건(예를 들어 다수의 상이한 조건) 하에서 용액 내 형광 표지된 입자 샘플을 고정하기 위한 샘플 홀더; 제1파장에서 형광 표지된 입자를 여기시키는 수단; 제2파장 및 제3 파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하기 위한 수단; 제2파장과 제3파장에서의 형광 강도 사이의 비율을 계산하기 위한 수단으로서, 제2파장과 제3파장은 상이하고, 상기 장치는 연속적으로 형광을 여기시키고, 형광 방출을 검출하고, 상이한 조건에서 샘플에 대한 비율을 계산하도록 구성되는 수단; 상이한 조건에 대해 얻은 계산된 비율을 기반으로 형광 표지된 입자를 특성화하는 수단으로서, 상기 장치는 제2파장과 제3파장은 동시에 검출되고, (상이한 조건 중) 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 형광 방출의 최대 방출보다 제2파장은 더 짧고, 제3 파장은 더 긴 수단을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 여기 수단은 여기 광원, 바람직하게는 레이저, 레이저 섬유 레이저(laser fibre laser), 다이오드-레이저, LED, HXP, 할로겐, LED-어레이, HBO로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 광원이다.
본 발명의 일부 측면에서, 검출 수단은 광 검출기, 바람직하게는 PMT, siPM, APD, CCD 또는 CMOS 카메라로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 검출기이다.
또한, 본 명세서에서, 프로그램이 컴퓨터에 의해 실행될 때, 컴퓨터가 본 명세서에서 설명된 방법을 수행하는데 사용되도록 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램이 제공된다.
또한, 본 명세서에서, 컴퓨터에 의해 실행될 때 컴퓨터가 본 명세서에서 설명된 방법을 수행하는데 사용되도록 명령어를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 데이터 매체를 제공된다.
또한, 본 명세서에서, 용액 내 형광 표지된 입자의 특성화를 위한 장치의 용도가 제공된다.
또한, 본 명세서에서, 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자의 특성화를 위한 모세관의 용도로서, 용액 내 형광 표지된 입자의 샘플은 모세관에 채워지고, 본 명세서에서 제시된 방법에 따라 분석하기 위해 제공된 용도가 제공된다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
도 1(A)는 동일한 형광 염료로 표지된 4가지 서로 다른 단백질 샘플의 여기 스펙트럼을 도시한다. 샘플은 520 내지 670nm 사이에서 여기되었다. 샘플의 방출은 690nm에서 기록되었다. 도 1(B)는 도 1(A)의 여기 피크의 확대 이미지이다.
도 2(A)는 동일한 형광 염료로 표지된 4가지 서로 다른 단백질 샘플의 방출 스펙트럼을 도시한다. 샘플은 605nm 사이에서 여기되었다. 샘플의 방출은 620 내지 750nm에서 기록되었다. 도 2(B)는 도 2(A)의 여기 피크의 확대 이미지이다.
도 3은 (C) 저색소성(블루) 또는 수변색성(레드) 이동 및/또는 (D) 스펙트럼의 확대 또는 축소를 포함하는 형광 염료의 형광 스펙트럼 변화에 대한 표지된 분자의 (A) 리간드 근접성 및 (B) 구조적 변화의 잠재적인 영향을 도시한다.
도 4(A)는 형광 표지된 단백질 스트렙타비딘 단독 및 천연 리간드 비오틴과 결합된 단백질의 방출 피크를 도시한다. 도 4(B)는 도 4(A)의 여기 피크의 확대 이미지이다.
도 5(A)는 형광 표지된 단백질 리소자임 단독 및 억제제 Tri-N-아세틸-D-글루코사민과 결합된 단백질의 방출 피크를 도시한다. 도 5(B)는 도 5(A)의 여기 피크의 확대 이미지이다.
도 6(A)는 본 발명의 이중 방출 구성을 사용하여 검출된 푸로세마이드와 복합체의 탄산탈수효소의 비율 흔적을 도시한다. 푸로세미드 결합 시 탄산 탈수효소의 형광 비율 변화는 0.5%이다. 도 6(B)는 결합 상호작용의 결과적인 용량-반응 곡선(dose-response curve)을 도시한다.
도 7(A)는 온도의 증가 동안 미표지된 리소자임과 다양한 농도의 NAG3의 고유 트립토판 형광의 350nm/330nm 비율을 도시한다. 변성 온도를 모니터링하기 위해, 각 샘플을 35℃에서 95℃로 가열한다. NAG3의 농도가 증가하면 리소자임의 열 안정화, 즉 열 이동이 발생한다. 이 이동은 이 상호 작용의 해리 상수를 추출하는 데 사용할 수 없다. 도 7(B)는 NAG3 농도에 대해 35℃에서 내재 단백질 형광의 초기 비율 350nm/330nm를 플로팅하여 S자형 용량-반응 곡선과 그에 따른 상기 온도에서의 해리 상수(Kd)를 얻는다.
도 8은 본 발명에 따른 다양한 실시예를 도시한다: (A) 이중 방출 광학 및 IR 레이저를 사용하는 바람직한 실시예; (B) 이중 방출 광학을 사용한 실시예; (C) 이중 여기 광학 및 IR 레이저를 사용한 실시예; (D) 이중 여기 광학 장치를 사용한 실시예; (E) 이중 여기 및 이중 방출 광학 장치와 IR 레이저를 사용한 실시예; (F) 이중 여기 및 이중 방출 광학을 사용한 실시예.
도 9는 각각 레드(Cy5) 및 그린(Cy3) 형광 염료에 대한 (A) 이중 여기 및 (B) 이중 방출 구조에 적용 가능한 예시적인 필터 구성을 도시한다.
도 10은 (A) 상업적으로 이용 가능한 마이크로플레이트 판독기를 사용한 측정 또는 (B) 및 (C) 본 발명에 따른 이중 방출 구조를 사용한 측정을 기반으로 비율계량 특성화를 통해 얻은 Cy5-표지된 DNA 앱타머와 AMP 사이의 용량-반응 곡선을 도시한다.
도 11은 AMP의 희석 시리즈와 혼합된 Cy5-표지된 DNA 앱타머의 형광 흔적을 도시한다. 시점 0초에서 IR 레이저가 켜지고 형광 강도의 반응이 31초에 걸쳐 측정된다. 본 이중 방출 구조에서, 방출된 형광 흔적은 (A) 628 내지 653 nm("650nm")의 파장 및 (B) 665 내지 727 nm("670nm")의 파장에서 동시에 기록되었다.
도 12는 도 9의 측정에 대한 초기 형광 강도 분석을 보여준다. (A) 650 nm 및 (B) 670 nm에 대해 얻은 초기 형광 강도를 기반으로, S자형 용량-반응 곡선이 없으므로 상호 작용의 친화력이 얻어지지 않는다.
도 13(A)는 670 nm에서의 형광 흔적을 650 nm에서의 형광 흔적으로 점별로 나누어 얻은, 도 11의 측정의 형광 강도 흔적의 비율계량 분석을 보여준다. 측정의 세 가지 다른 단계, 즉 1단계에서 3단계까지 강조 표시된다. 도 13(B)에서, 1단계, 즉 IR 레이저가 켜지기 전의 비율을 분석하여, 신호 대 잡음 비가 300보다 큰 용량-반응 곡선을 얻는다.
도 14(A)는 도 13(A)의 비율계량 데이터에 대한 시간 대비 Kd 곡선(Kd-over-time curve)을 도시한다. 200ms 간격으로 촬영한 "수직 슬라이스"를 분석하여, 각 시간 간격에 대한 용량-반응 곡선을 얻는다. 시간에 따른 온도 변화가 알려져 있고, 온도 변화가 발생하는 것보다 더 빠른 시간 단위로 상호 작용이 평형을 이루는 경우 온도 대비 Kd(Kd-over-temperature) 관계를 얻을 수 있다. 도 14(B)에서는 Van’t Hoff 분석을 수행함으로써, 상호작용의 결합 엔탈피(ΔH)와 결합 엔트로피(ΔS)는 상기 온도 대비 Kd 관계로부터 결정될 수 있다.
도 15은 AMP의 희석 시리즈와 혼합된 Cy3-표지된 DNA 앱타머의 형광 흔적을 도시한다. 시점 0초에서 IR 레이저가 켜지고 형광 강도의 반응이 6초에 걸쳐 측정된다. 본 이중 여기 구조에서, 방출된 형광 흔적은 (A) 475 내지 495 nm 파장의 블루 LED를 사용한 제1여기 및 (B) 550 내지 575 nm 파장의 그린 LED를 사용한 후속 여기시 단일 검출기에 의해 기록된다.
도 16(A)는 그린 LED로 여기시 측정된 형광 흔적을 블루 LED로 여기시 측정된 형광 흔적으로 점별로 나누어 얻은, 도 15의 측정의 초기 형광 강도의 비율계량 분석을 보여준다. 측정의 세 가지 다른 단계, 즉 1단계에서 3단계까지 강조 표시된다. 도 13(B)에서, 1단계, 즉 IR 레이저가 켜지기 전의 비율을 분석하여, 신호 대 잡음 비가 대략 80인 용량-반응 곡선을 얻는다. 도 13(C)에서, 3단계, 즉 IR 레이저가 켜진 후의 비율을 분석하여, 신호 대 잡음 비가 130보다 큰 향상된 용량-반응 곡선을 얻는다.
도 17은 이중 방출 구조를 사용한 비율계량 측정으로 얻은 형광 표지된 스트렙타비딘과 혼합된 비오틴의 12점 희석 시리즈의 용량 반응 곡선을 보여준다. 점선은 1:1 바인딩 모델 핏이다. 목표 농도가 해리 상수(Kd)보다 훨씬 높기 때문에, 화학량론 지점에서 특징적인 꼬임이 관찰될 수 있다.
도 18은 이중 방출 구조를 이용한 비율계량 측정에 의해 얻은 형광 표지된 소 탄산 탈수효소 II와 혼합된 소분자 아세타졸아미드의 15점 희석 시리즈의 용량 반응 곡선을 보여준다. 점선은 1:1 바인딩 모델 핏이다. 비율은 대략적으로 0.7%만 변경된다.
도 19(A)는 (B) 비오티닐화 단백질 L 및 형광 표지된 1가 스트렙타비딘의 미리 형성된 복합체와 혼합되어 3원 복합체를 생성한 미표지된 단일클론 항체 허셉틴(트라스투주맙)의 16점 희석 시리즈의 용량 반응 곡선을 보여주며, 이는 이중 방출 구조를 사용한 비율계량 측정으로 얻은 것이다.
도 20(A)는 말토스, 비오틴화된 말토스 결합 단백질, 스트렙타비딘 및 형광 표지된 비오티닐화된 DNA의 복합체의 도식적 표현을 보여준다. 도 20(B)는 미표지된 스트렙타비딘 및 형광 표지된 비오티닐화 DNA 및 말토스와 혼합하여 형광 표지된 비오티닐화 말토스 결합 단백질과 이중 방출 구조를 사용한 비율계량 측정으로 얻은 용량-반응 곡선을 보여준다.
도 21은 형광 표지된 치료 항체 CR3022 5nM을 첨가하여 표지된 20nM Cov-19 스파이크 단백질과 혼합된 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)의 14점 희석 시리즈의 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 22는 약 20분의 기간에 걸쳐 형광 표지된 미토겐-활성화 단백질 키나제 14(p38-α)의 형광 비율에 대한 4개의 후속 측정을 보여준다. 4번의 측정에서 형광 비율은 일정하지 않지만 선형적으로 증가하는 것으로 보이며, 이는 단백질이 실온에서 안정적이지 않고 점차적으로 변성됨을 나타낸다.
도 23은 (A) 아데노신에 대한 Cy5-표지된 DNA 앱타머와 소분자 AMP 사이의 상호작용에 대한 시간 대비 Kd 곡선을 보여준다. 한 가닥이 Cy5로 표지된 2개의 11-량체 상보적 DNA 가닥 사이의 DNA 혼성화는 (B) 32℃ 및 (C) 22℃에서 측정되었다. 시간 대비 Kd 곡선이 IR 레이저의 온도 섭동을 얼마나 빨리 따라갈 수 있는지는 해당 상호작용의 결합 및 해리 동역학이 얼마나 빠른지를 나타낸다.
도 24(A)는 22℃와 32℃ 사이의 DNA 혼성화에 대한 정규화된 시간 대비 Kd 곡선을 보여준다. y축은 측정 전반에 걸쳐 Kd의 배수 증가를 나타낸다(비교를 위해 모두 1로 표준화됨). x축은 IR 레이저의 켜짐 시간을 나타낸다. 도 24(B)는 본 발명에 따른 IR 레이저를 이용한 이중 방출 구조로 DNA 혼성화를 측정하기 위한 시간 대비 Kd 곡선을 보여준다. 샘플 온도는 22℃였으며 IR 레이저 가열 후 온도는 대략 32℃였다. Kd 값은 IR 레이저의 온타임 동안 대략 10nM 내지 대략 500nM사이에서 변한다. 도 24(C)는 서로 다른 두 온도에서 두 Kd 값에 대한 van't Hoff 분석 결과를 보여준다. 도 24(D) 및 (E)는 6개의 서로 다른 샘플 온도(22℃, 24℃, 26℃, 28℃, 30℃, 32℃)에서 형광 비율 측정의 고전적인 van't Hoff 분석에서 얻은 상호 작용의 열역학적 매개 변수를 보여주며, 이는 매우 유사한 열역학적 매개변수를 생성하지만 IR 레이저를 사용한 열역학 측정보다 시간이 더 오래 걸린다.
도 25는 다양한 해리 속도에 대한 시뮬레이션된시간 대비 Kd 곡선을 보여준다. 범례는 시뮬레이션에 사용된 다양한 오프율(off-rate)을 나타낸다. 도 25(A)는 10 s-1과 0.001 s-1 사이의 해리 속도가 20초의 IR 레이저 가열을 포함하는 일반적인 측정으로 해결될 수 있음을 보여준다. 도 25(B)는0.036 s-1과 0.154 s-1사이의 작은 차이도 잘 해결될 수 있음을 나타낸다.
도 26은 6개의 서로 다른 농도의 Cov-19 스파이크 RBD와 빠르게 혼합되는 형광 표지된 나노바디의 혼합 측정 접근법(mix-and-measure)에 대한 비율계량 형광 신호를 사용한 느린 결합 동역학의 측정을 보여준다. 2nM의 형광 표지된 나노바디를 6가지 다른 농도의 COV-19 스파이크 RBD(20nM 내지 625pM)와 빠르게 혼합한다. 다음으로, 느린 결합 동역학을 따르기 위해 비율계량 형광 측정이 90초마다 수행된다. 글로벌 피팅 모델(global fitting model)은 상호작용의 kon, koff 및 Kd 를 산출할 수 있다.
도 27(A)는 형광 표지된 mRNA, 지질 나노입자(LNP) 및 세포의 도식적 표현을 보여준다. 비율계량 측정은 형광 표지된 mRNA 분자의 위치를 결정하는 데 사용될 수 있다. 도 27(B)는 모든 형광 표지된 mRNA 분자가 LNP 내에 위치함을 보여준다. 도 27(C)는 모든 형광 표지된 mRNA 분자가 완충 함유 챔버에 위치함을 보여준다. 도 27(D)는 형광 표지된 모든 mRNA 분자가 세포 내에 위치함을 보여준다. 도 27(E)는 LNP, 완충 챔버 및 세포에서 표지된 mRNA 분자의 균일한 분포를 보여준다.
도 28(A)는 다양한 상태에서 형광 표지된 mRNA가 로딩된 LNP의 비율계량 측정을 보여준다. 도 28(B)에서, LNP 상태에 대한 추가 보는 단일 파장(여기: 670 nm)에서 형광 흔적을 분석하여 얻을 수 있으며, 이는 20분 원심분리 단계 후의 얻은 "울퉁불퉁한" 응집 흔적을 나타내며, 또는 "90℃에서 10분 동안 가열한 후 얻은 "부드러운" 흔적을 나타낸다.
도 29(A)는 사량체 스트렙타비딘, 2개의 비오틴화된 형광 표지된 링커 분자 및 비오틴화된 표적 분자 사이의 복합체의 도식적 표현을 보여준다. 이중 방출 구조의 비율계량을 사용하여 (B) 사량체 스트렙타비딘과 비오티닐화 형광 표지 링커 분자 사이 복합체의 화학량론 및 (C) 스트렙타비딘-링커 복합체와 비오틴화 표적 사이의 용량-반응 곡선을 결정할 수 있다.
도 1(A)는 동일한 형광 염료로 표지된 4가지 서로 다른 단백질 샘플의 여기 스펙트럼을 도시한다. 샘플은 520 내지 670nm 사이에서 여기되었다. 샘플의 방출은 690nm에서 기록되었다. 도 1(B)는 도 1(A)의 여기 피크의 확대 이미지이다.
도 2(A)는 동일한 형광 염료로 표지된 4가지 서로 다른 단백질 샘플의 방출 스펙트럼을 도시한다. 샘플은 605nm 사이에서 여기되었다. 샘플의 방출은 620 내지 750nm에서 기록되었다. 도 2(B)는 도 2(A)의 여기 피크의 확대 이미지이다.
도 3은 (C) 저색소성(블루) 또는 수변색성(레드) 이동 및/또는 (D) 스펙트럼의 확대 또는 축소를 포함하는 형광 염료의 형광 스펙트럼 변화에 대한 표지된 분자의 (A) 리간드 근접성 및 (B) 구조적 변화의 잠재적인 영향을 도시한다.
도 4(A)는 형광 표지된 단백질 스트렙타비딘 단독 및 천연 리간드 비오틴과 결합된 단백질의 방출 피크를 도시한다. 도 4(B)는 도 4(A)의 여기 피크의 확대 이미지이다.
도 5(A)는 형광 표지된 단백질 리소자임 단독 및 억제제 Tri-N-아세틸-D-글루코사민과 결합된 단백질의 방출 피크를 도시한다. 도 5(B)는 도 5(A)의 여기 피크의 확대 이미지이다.
도 6(A)는 본 발명의 이중 방출 구성을 사용하여 검출된 푸로세마이드와 복합체의 탄산탈수효소의 비율 흔적을 도시한다. 푸로세미드 결합 시 탄산 탈수효소의 형광 비율 변화는 0.5%이다. 도 6(B)는 결합 상호작용의 결과적인 용량-반응 곡선(dose-response curve)을 도시한다.
도 7(A)는 온도의 증가 동안 미표지된 리소자임과 다양한 농도의 NAG3의 고유 트립토판 형광의 350nm/330nm 비율을 도시한다. 변성 온도를 모니터링하기 위해, 각 샘플을 35℃에서 95℃로 가열한다. NAG3의 농도가 증가하면 리소자임의 열 안정화, 즉 열 이동이 발생한다. 이 이동은 이 상호 작용의 해리 상수를 추출하는 데 사용할 수 없다. 도 7(B)는 NAG3 농도에 대해 35℃에서 내재 단백질 형광의 초기 비율 350nm/330nm를 플로팅하여 S자형 용량-반응 곡선과 그에 따른 상기 온도에서의 해리 상수(Kd)를 얻는다.
도 8은 본 발명에 따른 다양한 실시예를 도시한다: (A) 이중 방출 광학 및 IR 레이저를 사용하는 바람직한 실시예; (B) 이중 방출 광학을 사용한 실시예; (C) 이중 여기 광학 및 IR 레이저를 사용한 실시예; (D) 이중 여기 광학 장치를 사용한 실시예; (E) 이중 여기 및 이중 방출 광학 장치와 IR 레이저를 사용한 실시예; (F) 이중 여기 및 이중 방출 광학을 사용한 실시예.
도 9는 각각 레드(Cy5) 및 그린(Cy3) 형광 염료에 대한 (A) 이중 여기 및 (B) 이중 방출 구조에 적용 가능한 예시적인 필터 구성을 도시한다.
도 10은 (A) 상업적으로 이용 가능한 마이크로플레이트 판독기를 사용한 측정 또는 (B) 및 (C) 본 발명에 따른 이중 방출 구조를 사용한 측정을 기반으로 비율계량 특성화를 통해 얻은 Cy5-표지된 DNA 앱타머와 AMP 사이의 용량-반응 곡선을 도시한다.
도 11은 AMP의 희석 시리즈와 혼합된 Cy5-표지된 DNA 앱타머의 형광 흔적을 도시한다. 시점 0초에서 IR 레이저가 켜지고 형광 강도의 반응이 31초에 걸쳐 측정된다. 본 이중 방출 구조에서, 방출된 형광 흔적은 (A) 628 내지 653 nm("650nm")의 파장 및 (B) 665 내지 727 nm("670nm")의 파장에서 동시에 기록되었다.
도 12는 도 9의 측정에 대한 초기 형광 강도 분석을 보여준다. (A) 650 nm 및 (B) 670 nm에 대해 얻은 초기 형광 강도를 기반으로, S자형 용량-반응 곡선이 없으므로 상호 작용의 친화력이 얻어지지 않는다.
도 13(A)는 670 nm에서의 형광 흔적을 650 nm에서의 형광 흔적으로 점별로 나누어 얻은, 도 11의 측정의 형광 강도 흔적의 비율계량 분석을 보여준다. 측정의 세 가지 다른 단계, 즉 1단계에서 3단계까지 강조 표시된다. 도 13(B)에서, 1단계, 즉 IR 레이저가 켜지기 전의 비율을 분석하여, 신호 대 잡음 비가 300보다 큰 용량-반응 곡선을 얻는다.
도 14(A)는 도 13(A)의 비율계량 데이터에 대한 시간 대비 Kd 곡선(Kd-over-time curve)을 도시한다. 200ms 간격으로 촬영한 "수직 슬라이스"를 분석하여, 각 시간 간격에 대한 용량-반응 곡선을 얻는다. 시간에 따른 온도 변화가 알려져 있고, 온도 변화가 발생하는 것보다 더 빠른 시간 단위로 상호 작용이 평형을 이루는 경우 온도 대비 Kd(Kd-over-temperature) 관계를 얻을 수 있다. 도 14(B)에서는 Van’t Hoff 분석을 수행함으로써, 상호작용의 결합 엔탈피(ΔH)와 결합 엔트로피(ΔS)는 상기 온도 대비 Kd 관계로부터 결정될 수 있다.
도 15은 AMP의 희석 시리즈와 혼합된 Cy3-표지된 DNA 앱타머의 형광 흔적을 도시한다. 시점 0초에서 IR 레이저가 켜지고 형광 강도의 반응이 6초에 걸쳐 측정된다. 본 이중 여기 구조에서, 방출된 형광 흔적은 (A) 475 내지 495 nm 파장의 블루 LED를 사용한 제1여기 및 (B) 550 내지 575 nm 파장의 그린 LED를 사용한 후속 여기시 단일 검출기에 의해 기록된다.
도 16(A)는 그린 LED로 여기시 측정된 형광 흔적을 블루 LED로 여기시 측정된 형광 흔적으로 점별로 나누어 얻은, 도 15의 측정의 초기 형광 강도의 비율계량 분석을 보여준다. 측정의 세 가지 다른 단계, 즉 1단계에서 3단계까지 강조 표시된다. 도 13(B)에서, 1단계, 즉 IR 레이저가 켜지기 전의 비율을 분석하여, 신호 대 잡음 비가 대략 80인 용량-반응 곡선을 얻는다. 도 13(C)에서, 3단계, 즉 IR 레이저가 켜진 후의 비율을 분석하여, 신호 대 잡음 비가 130보다 큰 향상된 용량-반응 곡선을 얻는다.
도 17은 이중 방출 구조를 사용한 비율계량 측정으로 얻은 형광 표지된 스트렙타비딘과 혼합된 비오틴의 12점 희석 시리즈의 용량 반응 곡선을 보여준다. 점선은 1:1 바인딩 모델 핏이다. 목표 농도가 해리 상수(Kd)보다 훨씬 높기 때문에, 화학량론 지점에서 특징적인 꼬임이 관찰될 수 있다.
도 18은 이중 방출 구조를 이용한 비율계량 측정에 의해 얻은 형광 표지된 소 탄산 탈수효소 II와 혼합된 소분자 아세타졸아미드의 15점 희석 시리즈의 용량 반응 곡선을 보여준다. 점선은 1:1 바인딩 모델 핏이다. 비율은 대략적으로 0.7%만 변경된다.
도 19(A)는 (B) 비오티닐화 단백질 L 및 형광 표지된 1가 스트렙타비딘의 미리 형성된 복합체와 혼합되어 3원 복합체를 생성한 미표지된 단일클론 항체 허셉틴(트라스투주맙)의 16점 희석 시리즈의 용량 반응 곡선을 보여주며, 이는 이중 방출 구조를 사용한 비율계량 측정으로 얻은 것이다.
도 20(A)는 말토스, 비오틴화된 말토스 결합 단백질, 스트렙타비딘 및 형광 표지된 비오티닐화된 DNA의 복합체의 도식적 표현을 보여준다. 도 20(B)는 미표지된 스트렙타비딘 및 형광 표지된 비오티닐화 DNA 및 말토스와 혼합하여 형광 표지된 비오티닐화 말토스 결합 단백질과 이중 방출 구조를 사용한 비율계량 측정으로 얻은 용량-반응 곡선을 보여준다.
도 21은 형광 표지된 치료 항체 CR3022 5nM을 첨가하여 표지된 20nM Cov-19 스파이크 단백질과 혼합된 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)의 14점 희석 시리즈의 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 22는 약 20분의 기간에 걸쳐 형광 표지된 미토겐-활성화 단백질 키나제 14(p38-α)의 형광 비율에 대한 4개의 후속 측정을 보여준다. 4번의 측정에서 형광 비율은 일정하지 않지만 선형적으로 증가하는 것으로 보이며, 이는 단백질이 실온에서 안정적이지 않고 점차적으로 변성됨을 나타낸다.
도 23은 (A) 아데노신에 대한 Cy5-표지된 DNA 앱타머와 소분자 AMP 사이의 상호작용에 대한 시간 대비 Kd 곡선을 보여준다. 한 가닥이 Cy5로 표지된 2개의 11-량체 상보적 DNA 가닥 사이의 DNA 혼성화는 (B) 32℃ 및 (C) 22℃에서 측정되었다. 시간 대비 Kd 곡선이 IR 레이저의 온도 섭동을 얼마나 빨리 따라갈 수 있는지는 해당 상호작용의 결합 및 해리 동역학이 얼마나 빠른지를 나타낸다.
도 24(A)는 22℃와 32℃ 사이의 DNA 혼성화에 대한 정규화된 시간 대비 Kd 곡선을 보여준다. y축은 측정 전반에 걸쳐 Kd의 배수 증가를 나타낸다(비교를 위해 모두 1로 표준화됨). x축은 IR 레이저의 켜짐 시간을 나타낸다. 도 24(B)는 본 발명에 따른 IR 레이저를 이용한 이중 방출 구조로 DNA 혼성화를 측정하기 위한 시간 대비 Kd 곡선을 보여준다. 샘플 온도는 22℃였으며 IR 레이저 가열 후 온도는 대략 32℃였다. Kd 값은 IR 레이저의 온타임 동안 대략 10nM 내지 대략 500nM사이에서 변한다. 도 24(C)는 서로 다른 두 온도에서 두 Kd 값에 대한 van't Hoff 분석 결과를 보여준다. 도 24(D) 및 (E)는 6개의 서로 다른 샘플 온도(22℃, 24℃, 26℃, 28℃, 30℃, 32℃)에서 형광 비율 측정의 고전적인 van't Hoff 분석에서 얻은 상호 작용의 열역학적 매개 변수를 보여주며, 이는 매우 유사한 열역학적 매개변수를 생성하지만 IR 레이저를 사용한 열역학 측정보다 시간이 더 오래 걸린다.
도 25는 다양한 해리 속도에 대한 시뮬레이션된시간 대비 Kd 곡선을 보여준다. 범례는 시뮬레이션에 사용된 다양한 오프율(off-rate)을 나타낸다. 도 25(A)는 10 s-1과 0.001 s-1 사이의 해리 속도가 20초의 IR 레이저 가열을 포함하는 일반적인 측정으로 해결될 수 있음을 보여준다. 도 25(B)는0.036 s-1과 0.154 s-1사이의 작은 차이도 잘 해결될 수 있음을 나타낸다.
도 26은 6개의 서로 다른 농도의 Cov-19 스파이크 RBD와 빠르게 혼합되는 형광 표지된 나노바디의 혼합 측정 접근법(mix-and-measure)에 대한 비율계량 형광 신호를 사용한 느린 결합 동역학의 측정을 보여준다. 2nM의 형광 표지된 나노바디를 6가지 다른 농도의 COV-19 스파이크 RBD(20nM 내지 625pM)와 빠르게 혼합한다. 다음으로, 느린 결합 동역학을 따르기 위해 비율계량 형광 측정이 90초마다 수행된다. 글로벌 피팅 모델(global fitting model)은 상호작용의 kon, koff 및 Kd 를 산출할 수 있다.
도 27(A)는 형광 표지된 mRNA, 지질 나노입자(LNP) 및 세포의 도식적 표현을 보여준다. 비율계량 측정은 형광 표지된 mRNA 분자의 위치를 결정하는 데 사용될 수 있다. 도 27(B)는 모든 형광 표지된 mRNA 분자가 LNP 내에 위치함을 보여준다. 도 27(C)는 모든 형광 표지된 mRNA 분자가 완충 함유 챔버에 위치함을 보여준다. 도 27(D)는 형광 표지된 모든 mRNA 분자가 세포 내에 위치함을 보여준다. 도 27(E)는 LNP, 완충 챔버 및 세포에서 표지된 mRNA 분자의 균일한 분포를 보여준다.
도 28(A)는 다양한 상태에서 형광 표지된 mRNA가 로딩된 LNP의 비율계량 측정을 보여준다. 도 28(B)에서, LNP 상태에 대한 추가 보는 단일 파장(여기: 670 nm)에서 형광 흔적을 분석하여 얻을 수 있으며, 이는 20분 원심분리 단계 후의 얻은 "울퉁불퉁한" 응집 흔적을 나타내며, 또는 "90℃에서 10분 동안 가열한 후 얻은 "부드러운" 흔적을 나타낸다.
도 29(A)는 사량체 스트렙타비딘, 2개의 비오틴화된 형광 표지된 링커 분자 및 비오틴화된 표적 분자 사이의 복합체의 도식적 표현을 보여준다. 이중 방출 구조의 비율계량을 사용하여 (B) 사량체 스트렙타비딘과 비오티닐화 형광 표지 링커 분자 사이 복합체의 화학량론 및 (C) 스트렙타비딘-링커 복합체와 비오틴화 표적 사이의 용량-반응 곡선을 결정할 수 있다.
본 발명은 형광 표지된 입자의 분자간 및/또는 분자내 상호작용의 비율계량 특성화 및/또는 형태 변형 및/또는 위치화를 위한 방법 및 장치를 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 이전에 공지된 방법으로는 해결할 수 없었던 작은 샘플 부피의 형광 표지된 입자 내에서 형광 표지의 형광 스펙트럼의 변경을 검출하는 데 개선된 감도를 제공한다(예를 들어, 실시예 1 참조). 또한, 본 발명의 방법은 반드시 온도 유도된 형광 스펙트럼 변화에 의존하지 않으므로 온도에 민감하고 및/또는 불안정한 샘플의 빠른 측정을 가능하게 한다. 정의된 온도 섭동과 결합하여, 본 발명의 방법은 상호작용의 열역학적 및 동역학적 매개변수의 측정을 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 (즉, 형광 표지된 입자가 지질 나노입자(LNP) 및/또는 세포 및/또는 LNP 및 세포를 둘러싸는 완충 용액 내에 위치하는 경우) 형광 표지된 입자의 위치를 확인할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 단 하나의 형광 표지로 표지된 형광 표지된 입자가 사용된다. 본 명세서에서 "단 하나의 형광 표지로 표지된(Labeled with only one fluorescent label)"이란 "한 가지 유형의 형광 표지로만 표지된(labeled with only one type of fluorescent label)"을 의미한다. 이는 결국 단 하나의 단일 형광 부분(예: 하나의 Cy5 분자) 또는 단일 유형의 두 개 이상의 형광 부분(예: 두 개 이상의 Cy5 분자)으로 표지될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화는 상기 형광 표지된 입자의 결합 친화도 등을 포함하는 상호작용을 특성화하기 위해 측정되고 비율계량적으로 분석된다.
본 발명의 방법의 단계는 용액 내 형광 표지된 입자의 하나 이상의 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 하나 이상의 샘플은 바람직하게는 일정한 여기 파장에서 형광으로 여기된다. 방출된 형광은 바람직하게는 2개의 서로 다른 방출 파장에서, 바람직하게는 미리 결정된 일정한 온도에서 동시에 검출된다. 2개의 방출 파장에서 형광 강도의 비율을 결정할 수 있다. 따라서, 2개의 획득된 방출된 형광 측정값은 비율계량 방식으로 특성화될 수 있다.
2개의 방출 파장의 검출은 바람직하게 동시에 수행되고, 따라서 동일한 교란 값 또는 오류가 측정에 영향을 주기 때문에, 비율계량 특성화는 순수한 정보의 추출로 이어지며, 따라서 측정 방법의 분해능이 향상된다.
본 발명자들은 생체분자와 같은 입자에 결합된 형광 표지의 형광 스펙트럼의 변화가 특히 리간드와 리간드 사이의 구조적 상태(폴딩/언폴딩 상태) 및/또는 상호작용 매개변수를 결정하는 데 사용될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 맥락에서, "검출된(detected)" 및 "기록된(recorded)"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 형광 표지된 입자의 형광 신호의 결정을 지칭한다.
제1측면에서, 본 발명은 예를 들어, 미리 결정된 온도에서 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자를 특성화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제1측면의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 제1조건 하에서 용액 내 형광 표지된 입자의 샘플을 제공하는 단계,
b) 제1파장에서 형광 표지된 입자를 여기시키는 단계,
c) 제2파장 및 제3파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하는 단계로서,
d) 제2파장과 제3파장에서의 형광 강도 사이의 비율을 계산하는 단계로서, 제2파장과 제3파장은 상이한 단계;
e1) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 샘플에 대해 b)단계 내지 d)단계를 반복하거나, 또는
e2) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 제2샘플에 대해 a)단계 내지 d)단계를 반복하되,
제2조건은 제1조건과 상이한 단계;
f) 상이한 조건에 대해 얻은 계산된 비율을 기반으로 형광 표지된 입자를 특성화하되,
제2파장과 제3파장은 동시에 검출되고, 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 형광 방출의 최대 방출보다 제2파장은 더 짧고, 제3 파장은 더 긴 단계.
입자(particle)
본 발명에 따르면, "입자"라는 용어는 분자, 특히 유기 분자, 생체분자, 나노입자, 마이크로입자 및 소포를 포함한다. 본 발명을 핵산, 단백질 등의 생체분자에 적용하는 것은 특히 중요하다. “입자"라는 용어는 또한 생물학적 세포(예를 들어, 박테리아 또는 진핵 세포) 또는 하위 세포 단편, 생물학적 조직, 바이러스 입자, 바이러스 유사 입자 또는 바이러스 및 세포 소기관, 지질 나노입자(LNP) 등을 포함한다. 나노입자는 나노디스크도 포함한다. 나노디스크는 2개의 양친매성 단백질에 의해 가려진 소수성 엣지를 갖는 인지질의 지질 이중층으로 구성된 합성 모델 막 시스템이다.
생체분자는 바람직하게는 아미노산, 단백질, 펩티드, 단당류 및 이당류, 다당류, 지질, 당지질, 지방산, 스테롤, 비타민, 신경전달물질, 효소, 뉴클레오티드, 대사산물, 핵산, 및 이들의 조합 또는 복합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 생체분자는 단백질, 펩티드, 효소, 핵산, 및 이들의 조합 또는 복합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는, (표지된 입자 내) 입자는 생체분자이고, 가장 바람직하게는 단백질 또는 핵산이다.
단백질은 효소(예: 탄산 탈수효소, 베타 락타마제 TEM1 또는 MEK1 및 p38과 같은 키나제), 수송 단백질(예: MBP), 억제 단백질(예: 베타 락타마제 억제 단백질 BLIP, Anakinra), 구조 단백질, 신호 단백질, 리간드- 결합 단백질, 샤페론(예: 열 충격 단백질 HSP90), 항체(예: Trastuzumab), 막 단백질 및 수용체(예: 인터루킨 1 수용체)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
핵산은 DNA, RNA(예: mRNA, tRNA, rRNA 등), LNA 및 PNA를 포함한다. 또한, 변형된(예를 들어 화학적으로 변형된) 핵산이 본 발명의 맥락에서 분석될 수 있다. 종종 접근 불가능한 RNA라고도 불리는 잠긴 핵산(LNA)은 변형된 RNA 뉴클레오티드이다. LNA 뉴클레오티드의 리보스 부분은 2' 산소와 4' 탄소를 연결하는 추가 브릿지로 변형된다. PNA(펩타이드핵산)는 DNA나 RNA와 유사한 인공적으로 합성된 고분자이다. DNA와 RNA는 각각 디옥시리보스와 리보스 당 골격을 갖고 있는 반면, PNA의 골격은 펩타이드 결합으로 연결된 반복적인 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위와 같은 펩타이드로 구성된다. 다양한 퓨린 및 피리미딘 염기는 메틸렌 브릿지(-CH2-)와 카르보닐기(-(C=O)-)를 통해 골격에 연결된다.
본 발명의 맥락에서, 나노입자는 100nm 미만의 평균 크기를 갖는 입자이다. "평균 크기"라는 용어는 예를 들어 Brookhaven Instruments' 90Plus 또는 Malvern Zetasizer Z90 입자 크기 측정 기기를 사용하여 동적 광산란에 의해 측정된 평균 유효 직경을 나타낸다. 바람직하게는, 나노입자 크기는 1nm 내지 100nm, 바람직하게는 1 내지 70nm 범위이다. 나노입자는 유기 또는 무기 입자일 수 있다. 나노입자는 표면에 유기 분자가 부착된 무기 코어와 같은 복합 입자로 존재할 수도 있다.
마이크로입자는 가장 긴 치수가 1mm 미만이지만 일반적으로 100nm를 초과하는 미세한 입자이다. 투과전자현미경(TEM), 주사전자현미경(SEM), 준탄성 광산란(QELS)을 사용하는 크기 측정 방법을 사용하여 마이크로입자를 특성화할 수 있다. 마이크로입자는 마이크로비드 형태로도 존재할 수 있다.
마이크로입자는 예를 들어 코팅되거나 코팅되지 않은 실리카-/유리-/생분해성 입자, 폴리스티렌-/코팅된-/유세포 분석기-/PMMA-/멜라민-/NIST 입자, 아가로스 입자, 자성 입자, 코팅되거나 코팅되지 않은 금 입자 또는 은 입자 또는 기타 금속 입자, 전이 금속 입자, 생물학적 재료, 반도체, 유기 및 무기 입자, 형광 폴리스티렌 미소구, 비형광 폴리스티렌 미소구, 복합 재료, 리포솜, 세포 등일 수 있다.
상업적으로 이용 가능한 마이크로입자는 세라믹, 유리, 폴리머 및 금속을 포함한 다양한 재료로 이용될 수 있다. 일상생활에서 접하는 마이크로입자는 꽃가루, 모래, 먼지, 밀가루, 슈가파우더를 포함한다. 생물학적 시스템에서 마이크로입자는 혈소판 및 내피 세포와 같이 혈류와 접촉하는 세포에서 파생된 혈액에서 순환하는 작은 막 결합 소포이다.
마이크로비드는 바람직하게는 가장 큰 치수로 5mm 미만으로 제조된 고체 플라스틱 입자이다. 마이크로비드는 일반적으로 직경이 0.5 내지 500μm인 균일한 폴리머 입자일 수도 있다.
"변형된 입자" 또는 "변형된 비드"라는 용어는 특히 분자, 바람직하게는 생체분자를 포함하거나 이에 연결된 비드 또는 입자에 관한 것이다. 이는 또한 이러한 (생)분자로 이러한 비드 또는 입자를 코팅하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 입자 또는 비드는 예를 들어 생체분자, 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질이 입자 또는 비드에 (일부 실시예에서는 특이적으로 및/또는 공유적으로) 결합할 수 있는 방식으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위 내에는 비드 및/또는 입자, 특히 이러한 비드 또는 입자에 부착되거나 연결된 분자의 특성 분석이다. 특히, 그러한 분자는 생체분자이다. 따라서, "변형된 (마이크로)비드/(나노- 또는 마이크로)입자"라는 용어는 특히 분석되거나 특성화될 추가 분자를 포함하는 비드 또는 입자에 관한 것이다. 변형되거나 변형되지 않은 마이크로입자/(나노 또는 마이크로)입자는 용액 내 생체분자(예: DNA, RNA 또는 단백질)와 같은 다른 입자/분자와 상호작용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 형광 표지된 입자의 바람직한 농도는 바람직하게는 10pM 내지 10μM, 더욱 바람직하게는 50pM 내지 500nM이다.
본 발명의 방법에서, 용액 내 형광 표지된 입자의 농도는 50pM 내지 500nM인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 적어도 하나의 형광 표지, 바람직하게는 정확히 하나의 형광 표지로 표지된, 표지된 입자가 사용된다. 본 발명의 맥락에서, 하나 이상의 형광 표지로 표지된 입자는 단지 한 가지 유형의 형광 표지(즉, 입자당 단지 단일 유형의 표지)로 표지된다. 본 발명의 맥락에서, "표지된 입자"는 형광 표지된 입자 또는 형광 수단에 의해 검출될 수 있는 다른 입자, 예를 들어 예를 들어 고유 형광단을 포함하는 분자/입자, 또는 융합 단백질로 태그된 입자/분자 또는 외부 형광단이 부착된 분자/입자를 지칭한다.
특히, 표지된 입자는 바람직하게는 고친화성 단백질 태그, 예를 들어, HIS-tag, AVI-tag, SPOT-tag, SNAP-tag 등 또는 구리(I)-촉매화 아지드-알킨 고리첨가(CuAAC), 변형 촉진 아지드-알킨 고리첨가(SPAAC) 등 (클릭 화학(click-chemistry)이라고도 함)을 통해 생체접합되거나 유사물 위의 표지에 가역적으로 결합된, 표지에 부착, 예를 들어 공유 결합된 (예를 들어 NHA 표지, 말레이미드 표지 등을 통한) 입자이다.
단백질 태그는 재조합 단백질에 유전적으로 접목된 펩타이드 서열이다. 여기에는 폴리(His)-tag, FLAG-tag와 같은 다중음이온성 아미노산, V5-tag, Myc-tag, HA-tag 및 NE-tag와 같은 에피토프 태그를 포함하고, 이는 (비오틴 리가제에 의한 비오티닐화와 같은) 특정 효소 변형 또는 (형광 이미징을 위한 FlAsH-EDT2와의 반응 같은) 화학적 변형을 허용할 수 있다.
형광 표지(Fluorescent Label)
본 발명의 맥락에서, "표지(label)" 및 "염료(dye)"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고 형광단/형광색소, 즉 여기 시 광을 재방출하는 형광 화학 화합물을 지칭한다.
본 발명에 유용한 표지는 환경 변화에 민감한 표지이며, 즉, 염료의 형광 스펙트럼은 화학적 미세환경(리간드 결합, 형태 변화), 및/또는 거대환경(예를 들어, LNP의 위치 대 세포의 위치)에서의 변화, 및/또는 온도 변화(예: 가열 또는 냉각)와 같은 환경 변화에 따라 변경된다.
본 발명의 맥락에서, 형광 표지는 유리하게는 결합 상호작용이 일어날 것으로 예상되는 상기 입자 상의 위치/장소, 예를 들어 단백질의 결합 포켓 등에 근접하여 입자에 부착된다.
본 발명에 따라 용도를 위한 형광 표지는 고유 형광 표지, 융합 단백질, 외부 형광 표지 등으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
고유 형광 표지는 트립토판 잔기, 티로신 잔기, 페닐알라닌 잔기를 포함한다. 융합 단백질은 청색 방출 형광 단백질, 청록색 방출 형광 단백질, 녹색 방출 형광 단백질, 황색 방출 형광 단백질 및 적색 방출 형광 단백질 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 현재 알려진 형광 단백질의 포괄적인 목록을 제공하는 해당 분야에 잘 알려진 데이터베이스인 FPbase를 참조한다(https://www.fpbase.org/table/; Lambert, TJ (2019) FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278. Doi: 10.1038/s41592-019-0352-8).
본 발명의 바람직한 구현예에서, 형광 표지는 외부 형광 표지이다.
외부 형광 표지는 Cy5, Cy3, Atto647, Atto647N, Alexa647 Dy647 등을 포함한 시아닌 염료와 같은 시판 표지를 포함할 수 있지만 이에 국한되지는 않는다.
바람직한 외부 형광 표지는 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함된 WO 2018/234557에 설명된 환경 민감성 염료이다. 환경 민감성 염료는 관련 기술 분야에 알려져 있으며, 예를 들어 Klymchenko, A. S. (2017)(Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: design and biological applications. Accounts of chemical research, 50(2), 366-375.)에 기술되어 있다. 특히 WO 2018/234557은 환경 변화, 예를 들어, 화학적 조성의 변화, 온도 변화 등에 매우 민감한 형광 표지에 관한 것이다. 바람직한 구현예에 따르면, 이들 염료는 NanoTemper RED, GREEN 및 BLUE 염료(예를 들어, 독일 뮌헨 소재 NanoTemper Technologies GmbH의 Protein Labeling Kits로 시판됨)로 이루어진 그룹에서 선택된다.
외부 형광 표지를 사용하여 표지하면, 하나의 염료만 표적 분자에 부착되고, 해당 염료만 리간드 결합의 영향을 받도록 제어할 수 있다. 또한, 화학 환경의 변화를 감지하는 데 최적인 위치(예를 들어, 리간드 결합 부위 근처)에 염료가 배치될 수 있도록 표지 화학(labeling chemistry)을 조정할 수 있다. 또한, 외부 염료는 일반적으로 단백질 표면에 위치하므로, 화학적 미세 환경에 대한 감각 변화에 이상적인 노출이 있다. 염료 형광 범위는 리간드의 자가 형광을 방해하지 않도록 선택될 수 있다. 마지막으로, 외부 염료는 훨씬 더 밝고, 측정은 표적 분자의 훨씬 낮은 농도에서 발생하여 샘플 소비를 줄이고, 심지어 피코 몰라 친화도(picomolar affinities)를 측정할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 형광 스펙트럼의 변화는 형광 표지의 형광 강도의 변경을 포함하지만, 스펙트럼 이동(도 3(C) 참조) 및/또는 스펙트럼의 확장 또는 축소(도 3(D) 참조)도 포함한다. 본 발명에 따르면, 예를 들어 대역통과 필터(bandpass filter)를 사용하여 달성될 수 있는 상이한 파장 또는 파장 범위에서 형광을 검출하는 것이 바람직하다. 이러한 상이한 파장/파장 범위 및 각각의 비율에서 검출된 강도를 통해 전체 방출 스펙트럼의 스펙트럼 이동, 스펙트럼의 확장 및/또는 축소를 검출할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 스펙트럼 이동은 바람직하게는 수변색(즉, 레드) 이동 및/또는 저색소(즉, 블루) 이동을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 스펙트럼 이동의 크기는 바람직하게는 50pm 이상, 보다 바람직하게는 100pm 이상, 보다 더 바람직하게는 500pm 이상이다.
본 발명에 따르면, 형광 표지된 입자의 형광 강도는 바람직하게는 형광 표지된 입자의 형태적 변경, 형광 표지된 입자의 재배치, 형광 표지된 입자와 하나 이상의 리간드 또는 이들의 조합 사이의 상호작용 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 메커니즘으로 인해 변경된다.
샘플 챔버
본 발명에 사용되는 샘플은 바람직하게는 모세관, 다중웰 플레이트, 미세유체 칩, 큐벳, 반응 튜브, 피펫 팁, 미세유체, 액적, 네이티브 조직, 소기관, 3D 프린팅된 조직, 3D 프린팅된 소기관 및 반투명 용기로 이루어진 그룹에서 선택되는 샘플 챔버에 제공된다. 반투명 용기는 유리용기일 수도 있고 플라스틱 용기일 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 형광 표지된 입자를 함유하는 샘플은 모세관에 제공된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 형광 표지된 입자를 함유하는 샘플은 다중 웰 플레이트, 예를 들어 96-웰, 384-웰 또는 1536-웰 플레이트에 제공된다.
바람직하게는, 모세관은 유리 및/또는 중합체 및/또는 붕규산염 유리, 붕규산염 3.3 유리(예를 들어 DURAN-유리), 수프라실, 인프라실, 합성 용융 실리카, 소다석회 유리, Bk-7, ASTM 유형 1 클래스 A 유리, ASTM 유형 1 클래스 B 유리와 같은 석영 유리 중 적어도 하나로 만들어진다. 폴리머는 PTFE, PMMA, Zeonor™ Zeonex™, Teflon AF, PC, PE, PET, PPS, PVDF, PFA, FEP 및/또는 아크릴 유리를 포함할 수 있다.
특히, 모세관의 적어도 하나의 범위는 200 nm 내지 1000 nm, 바람직하게는 250 nm 내지 900 nm의 파장을 갖는 광에 대해 투명한 것이 바람직하다. 특히 바람직하지만 이에 제한되지는 않으며, 모세관의 상기 범위는 또한 다음 파장 범위를 갖는 광에 대해 투명하다: 940 nm 내지 1040 nm(바람직하게는 980 nm +/- 10 nm), 1150 nm 내지 1210 nm, 1280 nm 내지 1600nm(바람직하게는 1450nm+/-20nm 및/또는 1480nm+/-20nm 및/또는 1550nm+/-20nm), 1900nm 내지 2000nm(바람직하게는 1930nm+/-20nm). 당업자는 투명 범위(들)가 전체 모세관에 걸쳐 확장될 수도 있음을 이해한다. 즉, 모세관은 투명할 수 있으며 바람직하게는 위에서 언급한 재료 중 하나로 일체로 만들어진다.
바람직하게는, 사용되는 모세관은 0.1mm 내지 0.8mm, 바람직하게는 0.2mm 내지 0.6mm, 더욱 바람직하게는 0.5mm의 내경을 갖는다. 바람직한 모세관의 외경은 바람직하게는 0.2mm 내지 1.0mm, 바람직하게는 0.3mm 내지 0.65mm이다.
모세관의 기하학적 구조는 특정 모양으로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 원형 단면 또는 타원형 단면을 갖는 관형 모세관이 사용된다. 그러나 다른 단면, 예를 들어 삼각형, 사각형, 오각형 또는 다각형을 갖는 모세관을 사용하는 것도 가능하다. 바람직하게는, 모세관은 모세관의 전체 길이에 걸쳐 특정 단면 중 하나를 포함한다. 더욱이, 모세관의 내부 및/또는 외부 치수는 모세관의 전체 길이를 따라 일정한 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, 원통형(관형) 모세관은 모세관의 전체 길이를 따라 동일한 내경과 동일한 외경을 포함하는 것이 바람직하다. 즉, 모세관의 길이에 걸쳐 일정하거나 일정하지 않은 직경 및/또는 단면을 갖는 모세관이 사용될 수 있다.
특히, 본 발명에 사용된 샘플 챔버는 넓은 스펙트럼 범위에 걸쳐 낮은 자가형광을 나타낸다. 상기 자가형광은 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 보다 더 바람직하게는 5% 미만이다.
형광 여기 빔 방향의 두께가 1μm 내지 20mm, 특히 1μm 내지 6mm, 특히 1μm 내지 500μm, 특히 1μm 내지 250μm, 특히 1μm 내지 100μm, 특히 3μm 내지 50μm, 특히 5μm 내지 30μm인 챔버 내에 샘플 프로브를 제공하는 것이 유리하다. 당업자는 챔버라는 용어가 예를 들어 모세관, 미세유체 칩 또는 다중웰 플레이트와도 관련된다는 것을 이해할 것이다.
실리콘 표면
샘플 챔버가 배치되는 바람직한 표면은 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함된 WO 2017/055583에 설명되어 있다. 특히, WO 2017/055583은 본 발명의 샘플 챔버(예를 들어, 모세관)가 바람직하게 배치되는 실리콘 표면에 관한 것이다.
샘플 부피
일반적으로 형광 표지된 입자를 함유하는 샘플 부피는 500μl 미만, 바람직하게는 200μl 미만, 보다 바람직하게는 100μl 미만, 보다 더 바람직하게는 1μl 내지 25μl이다.
샘플
전형적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 샘플은 형광 표지된 입자 및 리간드를 포함하는 용액이다. 여기서, 표지된 입자는 용액에 용해되거나 분산될 수 있다.
표지된 입자는 리간드를 함유한 용액과 접촉하게 되는 고체 지지체에 고정될 수 있다. 바람직하게는, 표지된 입자는 유기 용액 및/또는 수용액, 특히 완충 수용액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용액에 용해되거나 분산된다. 완충 수용액은 완충액을 사용하여 pH 값을 바람직하게는 2 내지 10, 더욱 바람직하게는 4 내지 10, 보다 바람직하게는 5 내지 9, 가장 바람직하게는 6 내지 8.5로 조정된다.
형광 측정(여기/방출)
본 발명에 따르면, 표지된 입자/분자를 여기, 바람직하게는 형광 여기시키기 위한 바람직한 수단은 레이저, 파이버 레이저, 다이오드 레이저, 발광 다이오드(LED), 할로겐, LED 어레이, HBO(HBO 램프는 예를 들어 고압 수은 증기 대기에서 방전 아크가 연소되는 짧은 아크 램프임), HXP(HXP 램프는 예를 들어, HBO 램프와 달리 훨씬 더 높은 압력에서 작동하며 할로겐 사이클을 사용하며, 매우 높은 압력의 수은 증기 대기에서 방전 아크가 연소되는 짧은 아크 램프임)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 적합한 장치일 수 있다. HXP 램프는 UV 및 가시광선(적색광의 상당 부분 포함) 등을 생성한다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 여기 광원은 고도로 집중된 여기를 가능하게 한다. 본 발명의 맥락에서 여기 광원은 바람직하게는 레이저, 보다 더 바람직하게는 LED이다.
본 명세서에 사용된 용어 "형광"은 그 자체로 "형광"에 제한되지 않고, 본 명세서에 개시된 수단, 방법 및 장치가 또한 다른 수단, 특히 인광과 같은 발광을 사용하여 사용되고 채용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 따라서, b)단계에서 "형광 표지된 입자를 제1파장에서 여기"이라는 용어는 위에서 확인된 방법의 "여기 단계"에 관련되며, 상응하는 발광 여기, 예를 들어 다음 방출을 검출하는 것보다 더 짧은 파장에서 수행되는 여기를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 "제2파장 및 제3파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하는"이라는 용어는 여기 후 상기 방출을 검출하는 단계를 의미한다. 당업자는 본 발명의 맥락에서 "여기" 파장과 "방출" 파장이 분리되어야 한다는 것을 인식한다. 추가적으로, 당업자는 본 발명의 맥락에서 검출된 제3파장이 검출된 제2파장과 상이하다는 것을 인식한다. 비율계량 분석에 필요한 2개의 신호는 "이중 여기(dual-excitation)" 구조 또는 "이중 방출(dual-emission)" 구조를 사용하여 얻을 수 있다.
일반적으로 비율계량 분석은 "이중 방출" 구조 예를 들어 도 8(B)에 제공된 예시적인 이중 방출 광학 장치를 사용하여 기반으로 한다. 특히, 형광 표지된 입자를 함유하는 하나 이상의 샘플은 단일 상수 파장(single constant wavelength)에서 여기되고, 이들의 방출 스펙트럼은 2개의 상이한 파장에서 검출된다(도 10 및 13과 함께 각각 실시예 1과 2를 참조할 뿐만 아니라 도 17 내지 28과 함께 도 4 내지 12를 참조함). "이중 방출" 구조를 사용하여 2개의 방출 신호가 동일한 위치에서 동시에 감지될 수 있다. 또한 많은 형광 표지(예를 들어, Cy5)는 더 작은 두 번째 여기 피크를 가지며, 이는 방출 스펙트럼을 2개로 분할하기 위해 더 큰 파장에서 충분한 대역폭을 허용하면서, 효율적인 여기에 사용될 수 있다(도 9(A)).
본 발명의 바람직한 실시예에서, "이중 방출" 구조는 Cy5, RFP 등과 같은 "적색" 형광 표지와 조합하여 사용된다. 이러한 표지는 대략 650nm에서 여기 최대값을 갖고, 대략 600nm에서 제2여기 피크 및 대략 660nm에서 방출 최대값을 갖기 때문에, 잘 적합한 여기 및 방출 파장은 대략 570nm 내지 615nm 사이의 여기, 대략 625nm 내지 650nm 사이의 제1방출의 검출 및 대략 670nm 내지 725nm 사이의 제2방출의 검출을 포함한다(도 9(A)). "이중 방출" 구조에 사용할 수 있는 예시적인 구성 요소가 표 1에 제공된다.
| 구성요소 | 실시예 | ||||
| 종류 | 제조사 | 이름 | 부품 번호 | 파장 범위 | |
| 여기 광원 | LED | Cree | LM1-UYL1-11-N1-00001 | LM1-UYL1-11-N1-00001 | 591nm |
| 여기 필터 | Band pass | Semrock | 593/46 BrightLine HC AOI 0°, 직경 25 mm, 링 두께 3.5 mm |
F39-593 (FF01-593/46-25) | 570...615nm |
| 광 분리 부재 | Dichroic mirror | Custom by AHF | Beam splitter T 622LPXR AOI 45°, 반사 465-615 nm >90%, 투과 626-900 nm >90%, 치수 25.5 x 36 x 1 mm |
F48-622 (T622LPXR) | 615...626nm |
| 제2광 분리 부재 | Dichroic mirror | Semrock | Beam splitter T 660 LPXR AOI 45°, 반사 500-653 nm >90%, 투과 661-800 nm >90%, 치수 25.5 x 36 x 1 mm |
F48-660 (T660LPXR) | 653...661nm |
| 방출 필터 | Band pass | Semrock | 640/20 BrightLine HC AOI 0°, 직경 25 mm, 링 두께 3.5 mm |
F39-641 (FF01-640/20-25) | 628...653nm |
| 제2방출 필터 | Band pass | Semrock | 697/58 BrightLine HC AOI 0°, 직경 25 mm, 기판 두께 1.05 mm, 링 두께 3.5 mm |
F37-697 (FF01-697/58-25) | 665...727nm |
| 검출기 | PMT | Hamamatsu | H10722-20 | H10722-20 | 230...920nm |
본 발명에 따르면, 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 방출 최대값에 비하여, 제2파장은 바람직하게는 더 짧은 파장에서 검출되고, 제3파장은 더 긴 파장에서 검출된다. 당업자는 본 발명의 맥락에서 방출 최대값이 국부적 방출 최대값(local emission maximum) 또는 절대 방출 최대값(absolute emission maximum)일 수 있다는 것을 인식한다. 대안적으로, 검출은 방출 최대값 대신 방출 스펙트럼의 안장점(saddle point) 주변에서 이루어질 수 있다.
방출 최대값 측면에 있는 영역의 작은 변경(예를 들어, 파장 이동)은 형광 스펙트럼의 변경(예를 들어, 강도 측면에서)에 상대적으로 큰 영향을 미친다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서 방출 형광 강도는 방출 최대값에 근접하여 검출되며, 예를 들어 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 상기 방출 최대치보다 제2파장은 적어도 2.5nm 더 짧은 파장(예를 들어, 10nm 더 짧은 파장)에서 검출되고, 제3파장은 적어도 2.5nm 더 긴 파장(예를 들어, 10nm 더 긴 파장)에서 검출된다.
본 발명에 따르면, 여기된 형광 표지된 입자를 검출하기 위한, 특히 형광을 검출하기 위한 바람직한 수단은 전하 결합 소자(CCD), 카메라(2D 또는 라인 스캔 CCD), 라인 카메라, 광전자 증배관(PMT), 실리콘 광전자 증배관(siPM), 애벌런치 포토다이오드(APD), 포토다이오드 어레이(PDA), 상보형 금속 산화물 반도체 (CMOS) 카메라 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 적절한 장치일 수 있다.
대체 형광 측정
본 발명의 다른 구현예에서, 비율계량 분석은 "이중 여기" 구조 예를 들어 도 8(D)에 제공된 예시적인 이중 여기 광학 장치를 사용하여 기반으로 한다. 특히, 형광 표지된 입자를 함유하는 하나 이상의 샘플은 2개의 서로 다른 파장에서 여기되고, 이들의 방출 스펙트럼은 단일 파장에서 검출된다(도 16과 함께 실시예 3 참조). 이 구조를 사용하면 2개의 여기 스펙트럼을 동시에 검출할 수 없으며, 이는 후속적으로 이들을 획득할 필요가 있음을 의미한다.
이 접근 방식은 시간이 더 많이 걸리며, 2개의 후속 측정 사이의 시간 지연은, 예를 들어 제1여기 후 유도된 탈색 이벤트(bleaching event), 샘플 응집 등으로 인해 해당 측정 간에 상당한 차이를 초래할 수 있다.
2개의 여기 광원이 1초 미만 또는 그보다 빠른 속도로 켜지고 꺼지고 데이터가 교대로 수집되는 "스트로보스코픽(stroboscopic)" 여기 접근 방식을 사용하여, 위에서 언급한 문제 중 일부가 해결될 수 있다. 그러나, 2개의 서로 다른 여기 광원은 샘플의 탈색 속도(bleaching rate)가 다를 수 있으며, 이는 더 긴 획득 시간을 처리할 때 비율계량 신호의 평가에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, "이중 여기" 구조는 Cy3, GFP 등과 같은 "녹색" 형광 표지와 조합하여 사용된다. 이러한 표지는 대략 540nm에서 여기 최대값 및 대략 560nm에서 방출 최대값을 갖고, 대략 600nm에서 제2여기 피크를 갖기 때문에, 잘 적합한 여기 및 방출 파장은 대략 475nm 내지 495nm 사이의 여기, 대략 550nm 내지 575nm 사이의 제1방출의 검출 및 대략 590nm 내지 680nm 사이의 제2방출의 검출을 포함한다(도 9(B)) "이중 방출" 구조에 사용할 수 있는 예시적인 구성 요소가 표 2에 제공된다.
| 구성요소 | 실시예 | ||||
| 종류 | 제조사 | 이름 | 부품 번호 | 파장 범위 | |
| 여기 광원 | LED | Cree | LM1-EBL1-01-N2 | LM1-EBL1-01-N2 | 480nm |
| 제2여기 광원 | LED | Cree | LM1-EPG1-01-N2 | LM1-EPG1-01-N2 | 540nm |
| 여기 필터 | Dual band | Chroma | FITC/CY3 ET 듀얼밴드 여기 필터 | F59-023 FITC/CY3 | 475...495nm550...575nm |
| 제2광 분리 부재 | Dichroic mirror | Chroma | ET듀얼밴드bs FITC/CY3 | F58-023 FITC/CY3 | 500??540nm590...680nm |
| 방출 필터 | Dual band | Chroma | FITC/CY3 ET듀얼밴드 컷 필터 | F57-023 FITC/CY3 | 590...680nm |
| 검출기 | PMT | Hamamatsu | H10722-20 | H10722-20 | 230...920nm |
여기 부피는 일반적으로 여기 광원에 의해 형광으로 여기되는 샘플 부피의 일부이다. 검출 부피는 방출 스펙트럼이 검출되는 샘플 부피의 일부이다. 본 발명에 따르면, 여기 부피 및/또는 검출 부피는 바람직하게는 2mm x 2mm x 5mm 이하, 보다 바람직하게는 1mm x 1mm x 5mm 이하, 보다 더 바람직하게는 0.5mm x 0.5mm x 5mm 이하의 크기이다.
그러나, 형광 표지된 입자를 여기시키고 상기 여기된 입자의 형광을 검출하기 위한 수단은 제한되지 않으며, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 수단이 사용될 수 있다.
비율계량 특성화
본 발명에 따르면, 비율계량 분석은 바람직하게는 점별 분할(pointwise division)에 의해 제2파장과 제3파장에서 검출된 형광 강도 사이의 비율을 구축하는 것에 기초한다. 당업자는 본 발명의 맥락에서 상기 형광 강도의 비율이 제3파장을 제2파장으로 나누거나 그 반대로 나누어(예를 들어, 제2파장을 제3 파장으로) 얻을 수 있다는 것을 인식한다.
본 발명의 맥락에서, 비율의 예시적인 상대 백분율 변경(즉, 스펙트럼 이동 후 비율의 백분율 변경)은 적어도 0.5%, 적어도 1.1%, 적어도 5.5%, 적어도 37.3%이다. 바람직하게는, 상대적인 백분율 변경은 적어도 3%이다.
상호작용의 특성화
본 발명의 맥락에서, 형광 표지된 입자의 상호작용은 특히 생체분자와 예를 들어 추가 (생)분자, 입자, 비드뿐만 아니라 (생)분자의 안정성, 폴딩 및 언폴딩에 대한 형태 또는 (수용액, 지질 나노입자 또는 세포 내 위치와 같은) 이의 화학적 환경의 안정성을 포함한다.
추가 상호작용 특성화 평형 측정, 결합 동역학 측정 및 열역학적 매개변수 측정을 포함한다.
본 발명에 따르면, 계산된 비율은 바람직하게는 형광 표지된 입자의 위치 또는 해리 상수, 최대 유효 농도의 절반(EC50), 평형 상수, 결합 동역학, 효소 반응 동역학, 열역학, 동역학 매개변수, 안정성 매개변수(예를 들어, 단백질의 열적 변성, 단백질의 화학적 변성 등), 언폴딩 또는 리폴딩 동역학(unfolding or refolding kinetics), 열기 및 닫기 반응(opening and closing reactions) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매개변수를 결정하는 데 사용된다.
본 발명의 맥락에서, 당업자는 상호작용의 해리 상수(Kd)가 데이터를 Langmuir 방정식으로 피팅함으로써 얻은 형광 강도 비율로부터 결정될 수 있고, 최대 유효 농도의 절반 (EC50)은 Hill 방정식을 사용하여 얻은 형광 강도 비율로부터 결정될 수 있다다는 것을 인식한다 (Ganellin, C. R., Jefferis, R., & Roberts, S. M. (Eds.).(2013). Introduction to biological and small molecule drug research and development: theory and case studies. Academic Press., chapter 1, page 38 and 39).
본 발명에 따르면, 형광 표지된 입자의 제1조건 및 제2조건은 화학적 조성 및/또는 온도 및/또는 화학적 미세환경 내 위치에 따라 다를 수 있다(예를 들어, 형광 표지된 입자의 제1조건은 제1캐리어(carrier), 예를 들어 벡터 내 입자의 위치와 관련이 있고, 제2조건은 제2캐리어, 예를 들어 수용자(recipient) 또는 양 캐리어를 포함하는 완충 용액 내 입자의 위치와 관련이 있음).
본 발명에 따른 형광 표지의 형광 스펙트럼은 형광 표지된 입자/분자가 하나 이상의 다른 분자, 예를 들어 리간드와 복합체를 이루는 경우에도 (예를 들어, 리간드 근접성(도 3(B) 참조) 및/또는 리간드 결합 시 형태 변화(도 3(B) 참조)를 통해) 변경될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 제2조건은 리간드를 첨가하거나 및/또는 리간드의 상이한 농도에 의해 변화되고, 획득한 계산된 비율은 형광 표지된 입자와 리간드의 용량-반응 커브(dose-response curve) 및 해리 상수(Kd)를 결정하는 데 사용된다.
본 발명의 맥락에서, 표지된 입자에 대한 리간드의 "결합(binding)"이라는 용어는 바람직하게는 공유결합 또는 이온 결합, 수소 결합 및 반데르발스 힘과 같은 분자간 힘에 의한 결합을 의미한다.
단백질과 같은 표적 생체분자에 리간드가 결합하면 아미노산 측쇄, 루프 또는 도메인 이동과 같은 광범위한 형태 변화가 발생할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 리간드는 이온, 금속, 화합물, 약물 단편(생물학적 표적에 약하게만 결합할 수 있는 작은 화학 단편), 탄수화물, 소분자(저분자량(< 900 달톤)을 갖는 유기 화합물, 소분자는 생물학적 과정을 조절하는 데 도움이 될 수 있고, 일반적으로 1nm 정도의 크기를 가짐), 약물, 전구약물, 지질, 단백질, 펩타이드, 펩토이드, 효소, 핵산, 압타머, 나노입자, 리포솜, 단층 소포(소형 단층 소포(SUV) 및 거대 단층 소포 포함) (GUV)), 중합체, 유기 분자, 무기 분자, 금속 착물, 호르몬, 향료, 취기제, 입자 및 (마이크로)비드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 리간드는 이온, 금속, 화합물, 약물 단편, 탄수화물, 소분자, 약물, 전구약물, 지질, 단백질, 펩티드, 펩토이드, 효소, 핵산, 압타머, 호르몬, 향료 및 취기제로 이루어진 그룹으로 선택된다.
리간드의 농도는 바람직하게는 0.01pM 내지 1M, 바람직하게는 1pM 내지 100mM, 보다 바람직하게는 1pM 내지 10mM이다.
온도 관련 강도 변화(TRIC) 및 마이크로 규모 열영동(MST)의 조합
본 발명에 따른 형광 표지된 입자의 비율계량 분석이 온도 유도된 형광 강도 변화에 반드시 의존하는 것은 아니지만, 형광 강도의 측정은 미리 결정된 일정한 온도에서 또는 정의된 온도 섭동 동안 수행될 수 있다.
제2측면에서, 본 발명은 정의된 온도 섭동과 조합하여 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자를 특성화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제2측면의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 제1조건 하에서 용액 내 형광 표지된 입자의 샘플을 제공하는 단계,
b) 제1파장에서 형광 표지된 입자를 여기시키는 단계,
c) 제2파장 및 제3파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하는 단계로서,
상기 강도는 정의된 온도 섭동 동안 검출되는 단계;
d) 제2파장과 제3파장에서의 형광 강도 사이의 비율을 계산하는 단계로서, 제2파장과 제3파장은 상이한 단계;
e1) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 샘플에 대해 b)단계 내지 d)단계를 반복하거나, 또는
e2) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 제2샘플에 대해 a)단계 내지 d)단계를 반복하되,
제2조건은 제1조건과 상이한 단계;
f) 상이한 조건에 대해 얻은 계산된 비율을 기반으로 형광 표지된 입자를 특성화하되,
제2파장과 제3파장은 동시에 검출되고, 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 형광 방출의 최대 방출보다 제2파장은 더 짧고, 제3 파장은 더 긴 단계.
본 발명의 제2측면의 바람직한 구현예의 방법에서, 가열 또는 냉각은 가열 및/또는 냉각 유체 또는 가스, 가열 소자(예를 들어, 가열 저항기 또는 금속 가열 소자, 세라믹 가열 소자, 폴리머 PTC 가열 소자, 복합 가열 소자, 반도체 가열 소자와 같은 줄 가열을 기반으로 하는 기타 소자) 또는 열전 소자, 예를 들어 펠티에(Peltier) 소자, 또는 전자기 복사(예를 들어, IR-LED와 같은 LED 또는 IR 레이저와 같은 레이저 또는 마이크로파)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 템퍼링 소자(즉, 가열 및/또는 냉각 소스)를 사용하여 수행될 수 있다. IR 레이저를 사용하면 샘플을 빠르게 가열할 수 있다.
펠티에 소자는 샘플을 가열하고 및/또는 샘플을 냉각(예를 들어, 환경 온도 아래로 샘플을 냉각)하는 데 사용될 수 있기 때문에 바람직하게 사용된다. 특히, 펠티에 소자를 통과하는 전류의 방향을 반대로 하여, 가열에서 냉각으로 전환하는 것이 가능하다. 펠티에 소자는 가열할 수 있지만 실온에서 적극적으로 냉각할 수도 있는 몇 안 되는 소자 중 하나이다.
레이저, 바람직하게는 전자기 방사선이 샘플에 의해 직접 흡수되는 레이저가 바람직하게 사용되는데, 그 이유는 온도가 샘플에 기계적 접촉 없이 샘플 내에서 신속하고 직접적으로 변화될 수 있기 때문이다.
또한, 상기 레이저는 0.01W 내지 10W, 바람직하게는 4W 내지 6W 범위 내의 고출력 레이저인 것이 바람직하다.
또한, 상기 레이저는 1mW 내지 1W, 바람직하게는 1mW 내지 500mW, 보다 바람직하게는 1mW 내지 250mW 범위 내의 레이저인 것이 바람직하다.
레이저 방사선은 샘플에 직접 흡수되어 열로 변환되며, 예를 들어, 980nm +/- 30nm, 1480nm +/- 30nm, 1550nm +/- 30nm, 1940nm +/- 30nm 파장의 IR 레이저 광은 물에 매우 잘 흡수되고 매우 빠르게 가열된다. 이 가열 방법은 비접촉식이므로 빠르며 오염 위험이 없다. 샘플 챔버는 레이저 광에 대해서만 투명해야 하지만. 가열 소자를 통한 접촉 가열과 달리 우수한 열 전도성이 필요하지 않는다.
IR 레이저를 사용하면, 아주 작은 부피(예를 들어, 나노리터 부피 범위)를 가열할 수 있으며, 그 중 형광은 형광 광학 장치로 측정된다(일반적으로 100μm x 100μm x 100μm = 1nl 부피).
본 발명에 따르면, 조사할 샘플은 예를 들어 정의된 일정한 속도(1℃/분 또는 1K/분)로 템퍼링 소자를 가열 및/또는 냉각함으로써 선형 온도 상승을 겪을 수도 있다. 일반적으로 가열 및/또는 냉각 속도는 예를 들어 펠티에 소자를 사용한 접촉 가열을 사용하여 0.1K/min 내지 50K/min이다.
다른 구현예에서, 샘플은 1K/s 내지 100K/s의 일반적인 가열 속도로 IR 레이저("광학 가열")로 가열될 수 있다.
본 발명의 제2측면에 따른 방법은 바람직하게는 -20℃ 내지 160℃, 보다 바람직하게는 0℃ 내지 120℃의 온도 범위 내에서 수행된다.
초기 비율 측정에 바람직한 데이터 수집 시간은 1초에서 5초 사이이고, 온도 섭동 중에 얻은 비율에 대해 바람직한 데이터 수집 시간은 5초에서 20초 사이이지만 수집 시간은 더 짧을 수도 있으며, 예를 들어, 단지 10ms 내지 100m이고, 또는 더 길 수도 있으며, 예를 들어 분, 시간, 또는 몇일일 수 있다.
이 비율은 나중에 온도 변화가 발생한 시점에 분석될 수도 있다. 이는 진폭이 실온에서 매우 작지만 더 높은 온도에서 증가할 때 유익할 수 있다(도 13(A)와 결합된 실시예 2를 참조하고, 3단계 분석은 1단계 분석보다 진폭이 더 크다).
본 발명의 제2측면의 바람직한 구현예에서, 비율계량 분석은 온도 섭동과 결합된 "이중 방출" 구조, 즉 도 8(A)에 제공된 예시적인 이중 방출 광학 장치 및 IR 레이저를 사용하여 기반으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 비율계량 분석은 온도 섭동과 결합된 "이중 여기" 구조, 즉 도 8(C)에 제공된 예시적인 이중 기여 광학 장치 및 IR 레이저를 사용하여 기반으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 비율계량 분석은 "이중 여기" 및 “이중 방출" 구조 모두, 예를 들어 도 8(F)에 제공된 예시적인 “이중 여기/이중 방출” 광학 장치를 사용하여 기반으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 비율계량 분석은 온도 섭동과 결합된 "이중 여기" 및 “이중 방출” 구조, 즉 도 8(E)에 제공된 예시적인 “이중 기여/이중 방출” 광학 장치 및 IR 레이저를 사용하여 기반으로 한다.
비율계량법과 TRIC/MST를 결합함에 의한 열역학적 및 동역학적 매개변수 결정
제3측면에서, 본 발명은 정의된 온도 섭동/온도 변화와 함께 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자의 열역학적 및/또는 동역학적 매개변수를 특성화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 열역학적 매개변수는 엔탈피, 엔트로피, 열용량(cP)dmf 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 맥락에서, 동역학 매개변수는 평형 상수, 해리 속도, 결합 속도, 효소 속도, 폴딩 및 언폴딩 속도, 방출 속도(예를 들어, LNP의 경우 페이로드 방출 속도(payload release rate)), 응집 속도, 침입 속도(예를 들어, mRNA와 같은 페이로드가 세포에 침입하는 속도)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 제3측면에 따르면, 바람직하게는 상호작용의 열역학적 매개변수는 단일 측정으로부터 IR 레이저를 사용하여 비율계량 형광 데이터를 수집할 때 결정될 수 있다. 각 측정 시점의 샘플 온도가 알려져 있으므로(트레이가 제어된 방식으로 가열되고 참조 표지의 형광이 측정되는 교정 측정에서 결정), 각 시점에 대해 해리 상수 Kd를 얻을 수 있다 (도 14(A)와 함께 실시예 2 참조).
본 발명의 제3측면에 따르면, 반응의 열역학은 완전히 평형화된 서로 다른 샘플 온도에서 고전적인 Kd 측정을 수행함으로써, 예를 들어 후속적으로 샘플 온도를 22℃, 24℃, 26℃, 28℃, 30℃ 및 32℃로 설정하고 각 온도에 대한 결합 친화도 측정을 수행함으로써 결정될 수도 있다(도 24와 함께 실시예 10 참조).
이 접근 방식의 정확도가 항상 최첨단 등온 적정 열량계(ITC) 측정의 정확도에 도달하지 못하더라도, 현재 측정이 대략 100배 더 빠르고, 훨씬 적은 샘플 소비로 인해 정확도가 떨어지는 것보다 더 중요할 수 있다. 예를 들어, 특정 분자의 경우 엔트로피 또는 엔탈피 결합제인지 여부에 대한 정보는 특히 초기 발달 단계에서 매우 중요할 수 있다.
본 발명의 제3측면에 따르면, 바람직하게는 상호작용의 열역학적 매개변수는 단일 측정으로부터 IR 레이저를 사용하여 비율계량 형광 데이터를 수집할 때 결정될 수 있다.
응용: 비율계량법과 TRIC/MST를 결합함에 의한 형광 표지된 mRNA의 위치 모니터링
제4측면에서, 본 발명은 바람직하게는 정의된 온도 섭동/온도 변화와 함께 또는 정의된 온도 섭동/온도 변화 없이 형광 표지된 입자의 형광의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자의 위치를 특성화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, "위치(location)" 및 "위치화(localization)”은 상호교환적으로 사용되며 형광 표지된 입자의 위치(locus)/위치(position)의 결정을 지칭한다.
DNA 및 RNA와 같은 핵산을 포함하는 모든 유전자 및 세포치료 방법은 약물 전달의 성공 여부를 결정하는 본질적인 문제를 안고 있다 (예를 들어, 완충 용액에 용해된 지질 나노입자(LNP)와 같은 캐리어로부터 혼입 및 방출을 통한 윤반된 핵산을 표적 세포로 전달)(도 27(A) 참조).
전달 성공 여부를 결정하기 전에도, 생물생산(예를 들어, LNP의 언로드, 부분 로드, 완전 로드 및/또는 과부하 상태를 포함한 전달 시스템의 로드)은 철저한 평가가 필요한 중요한 단계이다.
본 발명의 제4측면에 따르면, 캐리어는 금속 나노입자 및 나노구조물, 중합체 나노입자, 지질 기반 캐리어 시스템(예를 들어, 리포솜, 기타 지질 함유 복합체), 탄소성 캐리어, 나노에멀젼, 나노현탁액, 나노마이셀, 덴드리머, 우유 유래 캐리어, 엔도솜, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스), 바이러스 유사 입자(VLP), 진핵 세포, 원핵 세포, 세포 단편 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 위의 관점에서, 상기 캐리어들의 조합도 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 제4측면의 바람직한 구현예에서, 형광 표지된 입자는 형광 표지된 mRNA이고 캐리어는 LNP이다.
LNP는 직경이 1000nm, 500nm, 250nm, 200nm, 150nm, 100nm, 75nm, 50nm 또는 25nm 미만인 입자를 지칭한다. 예를 들어, 적절한 완충액에서, mRNA로 채워진 LNP는 65nm에서 85nm 사이의 유체역학적 직경을 가질 수 있다 대안적으로, 나노입자의 크기는 1 내지 1000nm, 1 내지 500nm, 1 내지 250nm, 25 내지 200nm, 25 내지 100nm, 35 내지 85nm, 또는 25 내지 60nm의 범위일 수 있다.
LNP는 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질로 만들어질 수 있다. 융합생성 인지질 DOPE 또는 막 성분 콜레스테롤과 같은 중성 지질은 형질감염 활성 및 나노입자 안정성을 향상시키기 위해 LNP에 '도우미 지질(helper lipids)'로 포함될 수 있다. 양이온성 지질의 한계는 불량한 안정성과 빠른 제거로 인한 낮은 효능뿐만 아니라 염증 또는 항염증 반응의 생성을 포함한다.
LNP는 소수성 지질, 친수성 지질, 또는 소수성과 친수성 지질 모두로 구성될 수도 있다.
당업계에 공지된 임의의 지질 또는 지질의 조합을 사용하여 LNP를 생성할 수 있다. LNP를 생산하는 데 사용되는 지질의 예는: DOTMA, DOSPA, DOTAP, DMRIE, DC-콜레스테롤, DOTAP-콜레스테롤, GAP-DMORIE-DPyPE 및 GL67A-DOPE-DMPE-폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 양이온성 지질의 예는: 98N12-5, C12-200, DLin-KC2-DMA (KC2), DLin-MC3-DMA (MC3), XTC, MD1, 및 7C1이다.
중성 지질의 예는: DPSC, DPPC, POPC, DOPE 및 SM이다. PEG 변형 지질의 예는 PEG-DMG, PEG-CerC14 및 PEG-CerC20이다.
형광 표지의 형광 스펙트럼은 화학적 환경의 변화와 같은 환경 변화에 매우 민감하고, 상기 스펙트럼은 환경 변화에 따라 달라지므로, 형광 표지된 입자(예를 들어, mRNA)의 위치는 본 발명에 따른 비율계량 측정을 통해 추론될 수 있다.
염료와 제2 및 제3방출 파장의 비제한적인 조합에 대한 예로서: 모든 형광 표지된 mRNA 분자가 LNP 내에 적절하게 위치하는 경우, 본 방법에 따른 특성화 후 비율은 2.1에 해당한다(도 27(B)와 함께 실시예 12 참조). 모든 형광 표지된 mRNA 분자가 LNP 외부에 위치하는 경우, 획득된 비율은 1.2에 해당한다(도 27(C)와 함께 실시예 12 참조).
세포 내부의 화학적 환경은 LNP나 완충액의 화학적 환경과 매우 다르기 때문에, 당업자는 본 발명의 맥락에서 모든 형광 표지된 mRNA 분자가 표적 세포 내로 성공적으로 전달될 때 획득된 비율이 위에서 언급한 값(즉, 1.2 및 2.1)과 다르다는 것을 알고 있다(도 27(D)와 함께 실시예 12 참조). 또한, 중간 상태의 경우, 예를 들어, 형광 표지된 mRNA 분자는 세포, LNP 및 완충 용액에 부분적으로 위치하며, 얻은 형광 비율은 위에서 언급한 3가지 상태에 대해 얻은 비율의 선형 조합이다.
본 발명의 이러한 예시적인 측면에 따르면, 형광 표지된 입자(예를 들어, mRNA)의 위치화 결정은 매우 작은 샘플 부피뿐만 아니라 검출 부피 및 짧은 실험 절차를 기반으로 한다. 동일한 맥락에서, 현재 적용되는 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 장유동 분별(field-flow fractionation) 및 액체 크로마토그래피)은 다른 방법을 기반으로 하며, 더 많은 시간을 필요로 할 뿐만 아니라 드물지 않게 제한적이고 값비싼 샘플의 훨씬 더 많은 샘플 부피를 필요로 한다.
비오티닐화 분자용 키트
제5측면에서, 본 발명의 방법에 따라 형광 표지된 입자, 예를 들어 용액 중 하나 이상의 비오틴 분자(즉, 비오틴화된 입자)로 표지된 입자의 특성화를 위한 키트 및 키트의 용도에 관한 것이다.
키트는 (i) 비오틴에 대한 적어도 2개(바람직하게는 4개)의 결합 부위를 포함하는 (바람직하게는 사량체) 비오틴 결합 단백질과 (ii) 연결 부분(본 명세서에서는 "링커"로도 지정됨)의 정의된 화학량론적 비율이 주요 구성 요소로 포함한다. 키트는 바람직하게는 본 발명의 방법 중 적어도 하나에서 키트의 용도를 설명하는 사용 설명서를 추가로 포함한다.
본 발명의 제5번째 측면에 따르면, 비오틴 결합 단백질은 스트렙타비딘, 아비딘 및 이들의 돌연변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 돌연변이체는 뉴트라비딘, 플라비딘, 2가 스트렙타비딘 등을 포함한다.
본 발명에 유용한 키트는 (i) 비오틴 결합 단백질 및 (ii) 바람직하게는 한쪽 끝은 비오틴 분자로 변형/표지되고 다른 쪽 끝은 형광 표지되는 링커를 포함하는 단일 바이알을 포함할 수 있다. 비오틴 결합 단백질이 바람직하게는 사량체 단백질, 보다 바람직하게는 사량체 스트렙타비딘인 것이 본 발명의 제5측면의 바람직한 구현예이다.
스트렙타비딘은 비오틴(비타민 B7이라고도 함)에 대한 친화력이 매우 높은 동종 사량체이다. 이는 유기 용매, 변성제(예를 들어, 구아니디늄 클로라이드), 세제(예를 들어, SDS, Triton), 단백질 분해 효소 및 극한의 온도와 pH에 대한 스트렙타비딘-비오틴 복합체의 저항성으로 인해 분자 생물학 및 바이오 나노기술에 광범위하게 사용된다.
본 발명의 제5측면의 추가로 바람직한 구현예는 형광 표지가 예를 들어 관련 기술 분야(NPL6)에 기술된 바와 같이 링커에 부착된다는 것이다.
본 발명의 제5측면에 따르면. 링커는 중합체, 바람직하게는 핵산, 바람직하게는 단일 가닥 핵산, 보다 바람직하게는 단일 가닥 DNA, 보다 더 바람직하게는 단일 가닥 DNA 올리고머(즉, 올리고뉴클레오티드)이며, 바람직하게는 6 내지 24개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 예를 들어, 12-량체 올리고-dT 가닥이 사용될 수 있다.
그러나, 본 발명의 맥락에서 사용되는 링커는 (형광단이 표적에 도달할 수 있을 만큼 링커가 충분히 긴 경우라면) 길이에 의해 제한되지 않으며, 및/또는 (링커의 종류가 길이를 조정할 수 있는 특성을 갖는 한, 예를 들어 DNA, 아릴 그룹을 포함하는 방향족 고리 등) 링커의 종류에 제한되지 않으며, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 링커를 사용하여 본 발명의 방법에 의해 특성화될 입자에 형광 표지를 간접적으로 부착할 수 있다.
본 발명에 따른 용도를 위한 링커는 한쪽 말단에 비오틴 분자를 함유하고 다른 말단에 형광 표지를 함유한다. 본 발명의 제5측면의 바람직한 구현예에서, 링커는 3' 말단에 비오틴으로 변형되고, 5' 말단에 형광 표지로 변형되거나 그 반대로 변형된다.
각 키트는 여러 표지 반응에 충분한 재료를 포함할 수 있다. 키트의 크기와 사용된 생체분자의 양에 따라. 약 500 내지 3,840개의 단일 지점 비율계량 특성화 실험에 충분한 재료가 제공될 수 있다.
본 발명의 제5측면의 바람직한 구현예에서, 형광 표지된 입자는 사량체 스트렙타비딘 분자, 비오티닐화 형광 표지된 링커 분자 및 비오티닐화 표적 분자 사이의 복합체이다(도 29(A) 참조). 형광 표지된 입자가 1개의 사량체 스트렙타비딘 분자, 2개의 비오티닐화된 형광 표지된 링커 분자 및 1개의 비오티닐화된 표적 분자 사이의 복합체인 것이 특히 바람직하다.
사량체 비오틴 결합 단백질과 변형된 링커의 화학량론적 비율은 바람직하게는 사량체 비오틴 결합 단백질의 4개의 결합 부위 중 평균 2개가 (예를 들어, 바이알에 2 nM 스트렙타비딘 및 4 nM 링커를 공급함으로써) 점유하고 및 나머지 2개의 결합 부위는 관심 있는 비오티닐화 입자와의 결합 이벤트에 사용할 수 있도록 조정된다.
따라서, 본 발명의 제5측면에서는 평균적으로 1개의 스트렙타비딘 분자가 2개의 링커 분자에 의해 표지, 즉, 1개의 스트렙타비딘으로 2개의 형광 표지를 가지는 방식으로 사량체 스트렙타비딘과 링커가 1:2 비율로 혼합되는 것이 더욱 바람직하다. 스트렙타비딘 분자의 나머지 2개의 결합 부위는 비오티닐화된 분자(예를 들어, 단백질)를 포착할 수 있다. 표지된 스트렙타비딘과 비오틴화된 분자를 1:1 비율로 혼합함으로써, 평균적으로 단 1개의 비오티닐화된 분자가 스트렙타비딘-링커 복합체에 부착되는 것을 얻을 수 있다. 그러나 화학량론은 기능적 이량체가 1개의 스트렙타비딘-링커 복합체로 표지될 수 있는 생체티닐화 이량체 단백질(예를 들어, 생체티닐화 인터페론 유전자 자극제(STING), 2가 스트렙타비딘)에 유리하게 활용될 수도 있다. 2가 비오틴 결합 단백질의 경우, 2가 비오틴 결합 단백질과 변형된 링커 사이의 비율은 2가 비오틴 결합 단백질의 2개의 자유 결합 부위 중 평균 1개가 (예를 들어, 바이알에 2 nM 스트렙타비딘 및 4 nM 링커를 공급함으로써) 점유하고, 나머지 결합 부위는 관심 있는 비오티닐화된 입자와의 결합 이벤트에 사용할 수 있도록 조정되는 것이다.
올바른 화학량론은 (예를 들어, 이중 방출 구조를 사용하여) 본 발명에 따른 스펙트럼 이동 측정에 의해 표지 과정 동안 검증될 수 있으며, 스트렙타비딘은 링커에 대해 적정된다.
자유 링커 분자(즉, 3' 말단에 비오틴, 5' 말단에 Cy5로 표지된 12머 폴리-T 가닥)의 비율은 0.8보다 작고(도 29(B) 참조, 자유 링커), 단 1개의 링커 분자로 표지된 스트렙타비딘의 비율은 대략 1.05(도 29(B) 참조, 1개의 링커)인 반면, 2개의 링커 분자로 표지된 스트렙타비딘은 더 높은 비율, 즉 대략 1.15를 가지며, 이는 양 형광 표지와 스트렙타비딘 분자의 나머지 2개의 결합 부위(도 29(B) 참조, 이상적인 비율)의 상호 작용으로 인해 발생하는 이상 용량-반응 곡선의 피크에 해당한다. 비오티닐화 분자가 스트렙타비딘-링커 복합체에 첨가되면 비율이 감소된다. 모든 비오틴 결합 부위는 전체 활성을 유지하기 때문에 비오티닐화된 분자는 극도로 높은 친화도로 포획될 수 있으며, 그 결과 용량-반응 곡선의 화학량론 지점에서 특징적인 꼬임(kink)이 발생한다(도 29(C) 참조).
본 발명의 이러한 예시적인 측면에 따르면, 매우 낮은 최종 농도의 키트 구성요소 및 비오티닐화 표적 분자(예를 들어, 1nM 스트렙타비딘, 2nM 링커 및 1nM 비오티닐화 분자)가 사용된다. 이와 같이, 본 발명의 제5측면에 따른 키트는 본 발명의 방법을 사용하여, (당업계에 알려진 표지 키트, 예를 들어 Protein His-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA 2nd Generation(NanoTemper Technologies)와 비교하여) 고도로 제어 가능하고 재현성이 뛰어난 표지화 과정을 기반으로 피코몰 친화도(picomolar affinity)를 측정하는데 적합하다. 동일한 맥락에서, (Protein His-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA 2nd Generation와 같은) 현재 적용되는 당업계에 공지된 키트는 완충액 제한, 느린 표지화 결합 동역학, 이미 비오티닐화된 분자와의 비호환성을 포함하는 추가적인 제한을 갖고 있으며, 또한 당업계에 공지된 표지화 키트는 비용 집약적이고 노동 집약적이다.
일반 원칙 및 설명 측면
이하에서, 본 발명의 일반적인 원리는 본 발명의 예시적인 실시예 또는 바람직한 구현예에 기초하여 더욱 상세하게 논의될 것이다.
형광 표지의 형광 스펙트럼은 해당 표지가 위치한 미세 환경에 따라 크게 달라지기 때문에 동일한 표지라도 그것이 부착된 분자나 입자에 따라 매우 다른 형광을 나타낼 수 있다. 특히, 형광 표지의 부착 부위 주변의 각 단백질의 미세 환경은 표지를 소멸하거나, 표지와 충돌하거나, 일시적으로 표지와 상호 작용하거나 스태킹으로 이어질 수 있는 아미노산 잔기와 관련하여 상이하다.
도 1(A)는 동일한 형광 표지로 표지된 4가지 상이한 단백질의 여기 스펙트럼을 도시한다 보여줍니다(단백질 라벨링 키트 RED-NHS 2nd Generation(NanoTemper Technologies)). 방출은 690nm의 파장에서 검출되었다. 여기는 520nm에서 670nm 사이로 다양하였다. 동일한 형광 표지로 표시되어 있지만 4가지 단백질의 최대 방출 피크 파장은 대략 659 nm에서 대략 664 nm까지 다양하다(도 1(B)).
도 2(A)에서 4가지 서로 다른 단백질을 일정한 파장(즉, 605nm)에서 여기시키고 620nm 내지 750nm 사이의 방출을 기록할 때, 동일한 효과/현상이 감지되었다는 것이 분명하다. 위와 유사하게, 단백질이 동일한 형광 표지로 표지되었지만, 최대 방출 피크 파장은 대략 659nm에서 대략 664nm 범위였다(도 2(B)).
미세환경은 상기 분자/입자 (예를 들어, 표지가 부착된 단백질의 라이신 잔기 또는 표지가 핵산 분자의 3' 또는 5' 말단에 부착되었는지 여부) 상의 위치 및 상기 분자/입자의 형태(예를 들어 접힌 또는 접힌 단백질) 또는 상기 분자/입자와 표지 사이의 링커의 길이/조성을 기반으로 추가로 변경될 수 있다. 형광 표지의 거대환경도 형광 스펙트럼에 영향을 미친다. 예를 들어, (예를 들어, 수성 완충 용액 내, LNP 내, 세포 내) 입자/분자의 위치에 따라 상기 표지의 형광 스펙트럼이 다르다.
추가적으로, 형광 표지된 입자/분자가 1개 이상의 다른 분자(즉, 리간드)와 복합체일 때 형광 표지의 형광 스펙트럼이 변경될 수도 있다. 예를 들어, 리간드 근접성(도 3(A)) 및/또는 리간드 결합 시 형태 변화(도 3(B))는 형광 표지의 여기 또는 방출 형광 스펙트럼의 이동(도 3(C)) 및/또는 확대 또는 축소(도 3(D))로 이어질 수 있다. 본 발명의 비율계량 특성화 방법을 이용하여, 형광 강도의 변경을 검출할 수 있을 뿐만 아니라 형광 표지의 미세환경 변화에 따른 완전 흡수 및 방출 스펙트럼의 변경도 검출할 수 있다.
위의 관점에서, 도 4는 605nm의 파장에서 여기시 천연 리간드인 비오틴(2μM)과 복합체를 이루는 경우, 스트렙타비딘(200nM)의 최대 방출 피크 파장은 대략 664nm 내지 대략 605nm에서의 이동(3nm)하는 것을 나타낸다. 같은 선상에서, 도 5는 585nm의 파장에서 여기시 천연 리간드인 비오틴(2μM)과 복합체를 이루는 경우, 리소자임(100nM) 단독 및 리소자임 억제제 Tri-N-아세틸-D-글루코사민(NAG3)(80μM)과 복합된 경우, 최대 방출 피크 파장의 약간의 이동(즉, < 1 nm)하는 것을 나타낸다. 3nm 및 대략 500pm의 이동은 각각 약 37.3%와 5.5%의 형광 비율의 상대적 변경에 해당한다(표 3).
| 스펙트럼 이동 | 비율 변경 |
| 3 nm | 37.3% |
| 2 nm | 23.6% |
| 1 nm | 11.2% |
| 500 pm | 5.5% |
| 100 pm | 1.1% |
| 50 pm | 0.5% |
형광 표지의 여기 및/또는 방출 스펙트럼의 변경은 매우 작을 수 있으므로(예를 들어, 단 몇 Å), 당업계에 알려진 방법/장치를 사용하여 요구되는 정밀도로 이를 측정/분해하는 것이 불가능하다. 그러나, 본 발명의 방법 및 장치를 사용하여 형광 스펙트럼의 작은 변화 조차도 해결할 수 있다. 예를 들어, 탄산탈수효소와 푸로세미드 사이의 결합(그림 6(A))의 경우처럼 형광 비율이 0.5%(표 3) 변경되는 50pm의 파장 이동을 쉽게 측정/검출할 수 있으며 S자형 용량-반응 곡선을 얻을 수 있다(도 6(B)).
형광 스펙트럼의 변경은 형광 표지의 특성과 무관하며, 즉, 내인성 형광 표지뿐만 아니라 외인성 형광 표지에서 동일하게 나타난다. 그러나 특정 종류의 표지에 대해서는 형광 스펙트럼의 변화 범위가 증가할 수 있다. 도 7(A)는 변성의 특성화 및 천연 리소자임과 그 억제제 TTri-N-acetyl-D-glucosamine (NAG3) 사이의 결합 친화도를 위해 35℃에서 95℃까지 열 용융 램프 동안 트립토판 형광의 형광 비율 측정의 용도를 도시한다. NAG3의 농도가 매우 높으면 리소자임의 열 안정화, 즉 열 이동이 발생한다. 이러한 이동을 해리 상수(Kd)를 얻는 데 사용할 수는 없지만, NAG3 농도에 대해 35℃에서 초기 비율을 플롯할 때 Kd(여기서는 35℃에서)를 나타내는 S자형 용량-반응 곡선을 얻을 수 있다(도 7(B)).
도 8(A) 내지 도 8(F)는 본 발명에 따른 측정 장치의 다양한 예시적인 실시예를 도시한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 장치는 바람직하게는 복수의 조건 하에서 용액 내 형광 표지된 입자의 샘플을 고정하기 위한 샘플 홀더를 포함한다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 샘플 홀더는 이러한 모세관에 국한되지 않고, 모세관일 수 있다. 또한, 멀티-웰이나 칩 등 샘플을 고정하기 위한 다른 수단을 사용할 수도 있다.
도 8(A) 내지 도 8(F)는 샘플로 여기되는 광의 방향을 지정하고 샘플로부터 형광 방출(들)을 검출하는 데 도움이 되는 광학 부재의 배열에 대한 실시예를 보여주며, 샘플 자체는 도면에 표시되지 않는다. 바람직하게는, 샘플 용기, 예를 들어 모세관은 렌즈(1) 아래에 위치한다. 상기 렌즈(1)는 바람직하게는 비구면 렌즈 또는 복수의 렌즈를 갖는 렌즈 시스템일 수 있으며, 이하 대물렌즈라고도 한다.
본 발명의 장치는 또한 적어도 제1파장에서 형광 표지된 입자를 여기시키기 위한 수단을 포함한다. 예를 들어, 여기 광을 제공하는 광원(8)이 제공될 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명은 단일 여기 광원에 제한되지 않는다. 대안적으로, 1개의 광원을 사용하는 것에 대해, 제2여기 광원(16) 또는 보다 많은 추가 광원(미도시)이 (특히 "이중 여기" 모드의 경우) 제공될 수 있다. 본 발명의 비율계량 분석은 "이중 여기" 구조 또는 "이중 방출" 구조를 사용하여 얻을 수 있다. "이중 방출" 구조의 경우 적어도 하나의 광원을 제공하는 것이 바람직하다. "이중 여기" 구조의 경우 두 개 이상의 광원을 제공하는 것이 바람직하다. 그러나 당업자는 "이중 방출" 구조를 위해 복수의 광원이 제공될 수 있다는 것을 추가로 이해한다. 그러나 이 경우에는 이들 광원 중 하나를 여기용으로 사용하면 충분할 것이다.
제1여기 광원(8)은 바람직하게는 레이저, 파이버 레이저, 다이오드-레이저, LED, HXP, 할로겐, LED-어레이, HBO로 이루어진 그룹 중 적어도 하나이다. 제2여기 광원(16)에 대해서도 마찬가지이다.
바람직하게는, 제1광 분리 부재(7), 예를 들어, 이색성 거울은 여기광을 샘플로 향하게 하고, 바람직하게는, 형광 방출광으로부터 형광 여기광을 분리하는 데 사용된다. 여기 광을 샘플로 향하게 하기 위한 추가 광학 부재, 예를 들어, 렌즈 시스템(9)이 제공될 수 있으며, 예를 들어, 여기 광원(예를 들어, 하나, 두 개 또는 그 이상의 렌즈)의 빔 특성을 결정한다. 또한, 여기된 광, 예를 들어, 밴드패스/롱패스를 필터링하기 위해 여기 필터(10)가 제공될 수도 있다. 당업자는 상이한 광원에 대해 어떤 종류의 필터가 바람직한지 이해할 것이다. 다시, 유사한 광학 부재가 제2여기 광원(16)과 관련하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 도 8(C), 8(D), 8(E) 및 8(F)에 도시한 바와 같이, 렌즈 시스템(17)이 제공되어, 예를 들어, 제2여기 광원(16)의 빔 특성을 결정할 수 있다. 또한, 추가적인 광 분리 부재(18), 예를 들어 이색성 거울이 사용되어, 2개의 상이한 여기 광원(8, 16)의 광을 결합할 수 있다.
본 발명의 장치는 또한 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하기 위한 수단을 포함한다. "이중 방출" 구조의 경우 2개의 상이한 파장을 검출하기 위한 수단을 제공하는 것이 바람직하며, "이중 여기" 구조의 경우 검출 수단이 단일 파장 또는 단일 파장 범위만 검출하도록 구성되면 충분할 것이다. 본 발명에 따르면, 각 파장 또는 파장 범위에 대해 적어도 하나의 광 검출기를 제공하는 것이 바람직하다. 예를 들어, "이중 여기" 구조의 경우 단일 광 검출기(14)를 제공하는 것으로 충분할 것이다.
(예를 들어, 도 8(C) 및 8(D) 참조) "이중 방출" 구조의 경우, 도 8(A), 8(B), 8(E) 및 8(F)에 도시된 바와 같이 2개의 개별 광 검출기(14, 15)를 제공하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자는 "이중 여기" 구조를 위해 2개의 광 검출기가 제공될 수 있다는 것을 추가로 이해한다. 그러나 이 경우에는 이들 광 검출기(14, 15) 중 하나만을 방출 검출에 사용하면 충분할 것이다. 제1 및/또는 제2광 검출기는 PMT, siPM, APD, CCD 또는 CMOS 카메라로 이루어진 그룹의 광 검출기일 수 있다.
다시, 방출 광을 제1 및 제2광 검출기(14, 15)로 분리하기 위해, 광 분리 부재(11)와 같은 추가적인 광학 부재가 제공될 수 있다. 예를 들어, 도 8(B)는 여기 광원(8)과 2개의 광 검출기(14, 15)를 갖춘 "단일 여기" "이중 방출" 구조에 대한 바람직한 구조를 도시한다. 개별 검출기로의 방출 광은 광 분리 부재(11), 예를 들어 이색성 거울에 의해 분리된다. 2개의 검출기(14, 15)의 업스트림에 추가 필터(12, 13)가 제공되어, 상이한 방출 파장, 예를 들어, 제2 및 제3파장을 정의할 수 있으며, 제1조건에서 형광 표지된 입자의 형광 방출의 방출 최대값에 비해 제2파장은 더 짧고, 제3파장은 더 길다. 상기 방출 필터(12, 13)는 임의의 적절한 종류의 필터 부재, 예를 들어 대역 통과 필터 또는 장 통과 필터로부터 선택될 수 있다.
도 8(A), 8(C) 및 8(E)에 도시된 바와 같이, 핫 미러(2)가 추가로 제공될 수 있으며, 이는 바람직하게는 IR 레이저(3)로부터의 IR 광을 샘플로 향하게 하는데 사용된다. 예를 들어, 핫 미러(2)는 높은 IR 반사율, 바람직하게는 가시광선 투과율 > 80%를 제공할 수 있다. IR 광원(3)은 바람직하게는 적어도 하나의 IR 레이저이고, 바람직하게는 방출 파장이 예를 들어 1455nm, 1480nm, 1550nm 및/또는 980nm이다. 더욱이, IR 레이저의 출력은 바람직하게는 0.01W 내지 10W 사이인 것이 바람직하다. IR 광을 샘플로 향하게 하기 위해, 레이저 섬유와 같은 추가 광학 부재(4)(단일 모드 또는 다중 모드), 레이저 파이버 커플러(5)(콜리메이터 포함 또는 제외) 및/또는 예를 들어 레이저 빔 직경을 결정하기 위한 빔 성형 모듈(6) 및 포커싱(예를 들어, 하나, 둘 또는 그 이상의 렌즈를 포함하는 렌즈 시스템)이 사용될 수 있다(도 8(A), 8(C) 및 8(E) 참조). 그러나 IR 광의 입력은 추가 온도 의존 측정 또는 추가 측정의 경우에만 선택 사항이다.
본 발명의 장치는 또한 제2파장과 제3파장에서의 형광 강도 사이의 비율을 계산하는 수단을 포함하며, 상기 제3파장은 상기 제2 파장과 상이하다. 상기 수단은 바람직하게는 프로세서 또는 적어도 하나의 프로세서를 포함하는 회로에 의해 제공된다.
실시예
실시예 1
다음 실시예는 2개의 분자 사이의 용량-반응 곡선을 얻기 위해 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법을 사용하는 것과 비교하여 당업계에 공지된 비율계량 특성화 방법을 사용하는 것의 차이점을 설명한다. 따라서, 형광 표지된 DNA 앱타머와 아데노신 모노포스페이트(AMP)를 포함하는 샘플을 시판되는 형광 분광 광도계 및 본 발명의 이중 방출 구조로 측정하였다.
샘플 제조
미표지된 AMP의 14포인트의 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. DNA 앱타머를 Cy5로 형광 표지하고, AMP 희석 시리즈에 동일한 양을 첨가하여, 20nM의 최종 샘플 농도를 얻었다. AMP의 최고 농도는 5mM에 해당하였다. 표준 형광 마이크로플레이트 판독기(CLARIOstar, BMG Labtech)를 사용한 측정을 위해 샘플 95μl를 다중-웰 플레이트에 로드하였다. 본 발명의 이중 방출 구조를 사용한 측정을 위해, 5 내지 10μl의 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산염 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
마이크로플레이트 판독기 측정을 위해, 샘플은 590 nm의 파장에서 여기되었고 방출은 628 nm 내지 652 nm의 파장에서 처음 검출되었다. 그런 다음, 샘플은 다시 590nm 파장에서 여기되었고 방출은 665nm 내지 725nm의 파장에서 검출되었다. 희석 시리즈의 3개의 후속 형광 강도 측정이 실행되었다. 본 발명에 따른 비율계량 측정을 위해, 각 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 형광 흔적은 628nm 내지 653nm 사이의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이의 제3파장에서 동시에 측정되었다.
비율계량 측정 데이터의 분석
형광 마이크로플레이트 판독기와의 상호 작용을 특성화하기 위해, 웰당 형광 강도 간의 비율을 시중에서 판매되는 계산 도구(Microsoft Excel)를 사용하여 수동으로 계산하였다. 더 높은 파장에서 검출된 형광은 더 낮은 파장에서 검출된 형광으로 나누어졌다. 도 10(A)에 제공된 S자형 용량-반응 곡선은 대략 0.95의 비율 값에서 시작되어, 대략 0.90의 비율 값으로 끝난다. 상호 작용의 해리 상수(Kd)에 해당하는 중간점은 대략 20 내지 30μM에 있다. 그러나 상호 작용의 신호 대 잡음비(S/N)는 매우 낮고 반복실험 간의 편차는 매우 크다.
대조적으로, 본 발명의 방법에 따라 동일한 샘플을 측정함으로써, 도 10(B)에 제공된 용량-반응 곡선은 개선된 신호 대 잡음비(S/N)를 나타내고 39.3μM에서 상호작용의 Kd를 명확하게 드러낸다. 본 발명에 따른 비율계량 측정을 위해 더 낮은 샘플 농도, 즉 250pM을 사용하는 경우 신호 대 잡음비(S/N)는 여전히 매우 좋으며(19.8), 상호 작용의 Kd를 쉽게 결정할 수 있다(도 10(C)).
요약하면, 이 예는 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법에 대해, 대략 1000배 적은 샘플로도 플레이트 판독기를 사용한 측정에 비해 더 나은 데이터를 제공한다. 시중에서 판매되는 마이크로플레이트 판독기를 사용한 측정의 경우 노이즈는 측정해야 하는 신호 진폭보다 10배 이상 높다.
실시예 2
다음 실시예에서는 이중 방출 구조를 기반으로 2개의 분자 사이의 용량-반응 곡선을 얻기 위해, 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법의 용도를 설명한다. 따라서, 형광 표지된 DNA 앱타머와 AMP를 포함하는 샘플은 제1파장에서 여기되고, 방출된 형광 강도는 제2파장 및 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
미표지된 AMP의 12포인트의 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. DNA 앱타머를 Cy5로 형광 표지하고, AMP 희석 시리즈에 동일한 양을 첨가하여, 20nM의 최종 샘플 농도를 얻었다. AMP의 최고 농도는 2mM에 해당하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 0초 시점에 IR 레이저가 켜졌다. 형광 강도의 반응은 31초 동안 동시에 측정되다. 628Nm 내지 653nm('650nm') 사이에 기록된 형광 흔적이 도 11A에 제공된다. 665Nm 내지 727nm("670nm") 사이에 기록된 형광 흔적이 도 11(B)에 제공된다. 처음에 기록된 형광 강도는 큰 변화를 보였으므로, 친화도 측정을 위한 S자형 용량-반응 곡선을 얻을 수 없었다. 결과적으로, 도 12에 제공된 2개의 방출 파장 중 어느 것도 초기 형광으로부터 결합 정보를 추출할 수 없었다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670 nm 및 650 nm에서 형광 흔적의 점별 분할(pointwise division)이 수행되었다. 획득된 비율 흔적은 IR 레이저가 켜진 전(도 13(A), 1단계) 또는 후 (도 13(A), 2단계 또는 3단계)에 분석될 수 있다. IR 레이저가 켜지기 전에 기록된 데이터를 비율계량적으로 분석함으로써(도 13(A), 1단계) 신호 대 잡음비(S/N)가 300보다 높은 용량-반응 곡선이 생성되어, 2개의 분자 사이의 Kd를 샘플 온도, 즉 실온에서 산출하였다(도 13(B)).
IR 레이저(도 13A, 2단계 또는 3단계)를 켠 후, 비율계량 분석을 수행하면 더 높은 온도에서 Kd 값을 얻을 수 있다. 이 접근 방식은 실온에서의 진폭이 매우 작고 더 높은 온도에서 증가할 것으로 예상되는 경우 특히 권장된다.
상호 작용의 열역학적 매개 변수의 결정
상호작용의 시간 대비 Kd 곡선을 얻기 위해, 도 13(A)에 제공된 비율 흔적의 200ms 시간 간격에서 "수직 슬라이스"를 취하였고, Kd는 이들 슬라이스 각각에 대한 용량-반응 곡선을 결정하였다(도 14(A)). 시간 경과에 따른 온도 변경은 교정 측정을 통해 알려졌기 때문에 즉, 샘플 트레이를 제어된 방식으로 가열하고, 참조 염료의 형광을 측정했으며, 상호 작용은 발생하는 온도 변경보다 더 빠른 시간 규모로 평형을 이루었고, Kd-over-온도에 따른 관계를 얻을 수 있었다. Van't Hoff 분석을 수행하여:
상호작용의 결합 엔탈피(ΔH) 및 결합 엔트로피(ΔS)(도 14(B))가 결정되었다. 이 상호작용의 경우 AMP는 주로 엔탈피적으로 결합하는 것으로 나타났다(ΔH < 0).
실시예 3
다음 실시예에서는 이중 여기 구조를 기반으로 2개의 분자 사이의 용량-반응 곡선을 얻기 위해, 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법의 용도를 설명한다. 따라서, 형광 표지된 DNA 앱타머와 AMP를 포함하는 샘플은 제1파장 및 제2파장에서 여기되고, 방출된 형광 강도는 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
미표지된 AMP의 16포인트의 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. DNA 앱타머를 Cy3로 형광 표지하고, AMP 희석 시리즈에 동일한 양을 첨가하여, 250nM의 최종 샘플 농도를 얻었다. AMP의 최고 농도는 12.5mM에 해당하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 480 nm의 제1파장에서 여기되었다(“블루” LED). 0초 시점에 IR 레이저가 켜졌다. 형광 강도의 반응은 6초 동안 590nm 내지 680nm에서 검출되었다. 다음에서 각 샘플은 540 nm("녹색" LED)의 제2파장에서 여기되었다. 0초 시점에 IR 레이저가 켜졌다. 형광 강도의 반응은 6초 동안 590 nm에서 680 nm까지 검출기로 기록되었다. "블루" LED로 샘플을 여기하여 얻은 형광 흔적이 도 15(A)에 제공된다. "그린" LED로 샘플을 여기하여 얻은 형광 흔적이 도 15(B)에 제공된다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 그린 LED를 사용한 여기를 통해 얻은 형광 흔적을 블루 LED를 사용한 여기를 통해 얻은 형광 흔적으로 점별 분할을 수행하였다. 획득된 비율 흔적은 IR 레이저가 켜진 전(도 16(A), 1단계) 또는 후 (도 16(A), 2단계 또는 3단계)에 분석될 수 있다. IR 레이저가 켜지기 전에 기록된 데이터를 비율계량적으로 분석함으로써(도 16(A), 1단계) 신호 대 잡음비(S/N)가 대략 80의 용량-반응 곡선이 생성되어, 양 분자 사이의 Kd를 샘플 온도, 즉 실온에서 산출하였다(도 16(B)). IR 레이저가 켜진 후에 기록된 데이터를 비율계량적으로 분석함으로써(도 16(A), 3단계), 신호 대 잡음비(S/N)가 130 보다 큰 용량-반응 곡선이 생성되었고, 양 분자 사이의 Kd를 산출하였다(도 16(C)). 실온에서의 분석과 비교하여, 더 높은 온도에서 비율을 분석할 때 향상된 신호 대 잡음비가 얻어졌다.
실시예 4
다음 실시예에서는 이중 방출 구조를 기반으로 2개의 분자 사이의 용량-반응 곡선을 얻기 위해, 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법의 용도를 설명한다. 따라서, 형광 표지된 스트렙타비딘 및 이의 자체 발생한 리간드 비오틴을 포함하는 샘플은 제1파장에서 여기되고, 방출된 형광 강도는 제2파장 및 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
미표지된 비오틴의 12포인트의 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. 스트렙타비딘은 단백질 라벨링 키트 RED-NHS 2nd Generation(NanoTemper Technologies)를 사용하여 형광 표지하고. 비오틴 희석 시리즈에 동일한 양을 첨가하여, 20nM의 최종 샘플 농도를 얻었다. 비오틴의 최고 농도는 500mM에 해당하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 형광 흔적은 628nm 내지 653nm 사이(“650nm”)의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이(“670nm”)의 제3파장에서 동시에 측정되었다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670 nm 및 650 nm에서 점별 분할이 수행되었다. 도 17에 표시된 용량-반응 곡선에서 알 수 있듯이, 스트렙타비딘이 각각 비오틴과 결합되지 않거나 비오틴과 복합된 경우 비율은 대략 2.2 내지 대략 1.2 값에서 변경되었다. 목표 농도가 Kd보다 훨씬 높기 때문에, 80nM 비오틴 농도에서 화학량론 지점에서 특징적인 꼬임이 관찰될 수 있다.
실시예 5
다음 실시예에서는 이중 방출 구조를 기반으로 2개의 분자 사이의 용량-반응 곡선을 얻기 위해, 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법의 용도를 설명한다. 따라서, 형광 표지된 소 탄산탈수효소 II 및 아세타졸아미드를 포함하는 샘플은 제1파장에서 여기되고, 방출된 형광 강도는 제2파장 및 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
미표지된 아세타졸아미드의 15포인트의 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. 소 탄산탈수효소 II은 단백질 라벨링 키트RED-NHS 2nd Generation(NanoTemper Technologies)를 사용하여 형광 표지하고. 아세타졸아미드 희석 시리즈에 동일한 양을 첨가하여, 20nM의 최종 샘플 농도를 얻었다. 아세타졸아미드 최고 농도는 2.5μM에 해당하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 형광 흔적은 628nm 내지 653nm 사이(“650nm”)의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이(“670nm”)의 제3파장에서 동시에 측정되었다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670 nm 및 650 nm에서 점별 분할이 수행되었다. 도 18에 제공된 용량-반응 곡선에서 비율은 대략 0.944에서 대략 0.951으로, 약 대략 0.7%의 값으로 변경되었다. 획득한 용량-반응 곡선은 신호 대 잡음비(S/N)가 30보다 컸다. 이는 비율의 작은 변경이라도 본 발명의 비율계량 특성화 방법을 사용하여 측정할 수 있음을 보여준다.
실시예 6
다음 실시예에서는 이중 방출 구조를 기반으로 3개의 분자 사이의 용량-반응 곡선을 얻기 위해, 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법의 용도를 설명한다. 따라서, 형광 표지된 1가 스트렙타비딘, 비오티닐화된 단백질 L 및 항체 허셉틴을 포함하는 샘플은 제1파장에서 여기되고, 방출된 형광 강도는 제2파장 및 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
미표지된 항체 허셉틴의 16포인트의 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. 1가 스트렙타비딘은 단백질 라벨링 키트RED-NHS 2nd Generation(NanoTemper Technologies)을 사용하여 형광 표지되었으며, 20 nM을 동일한 부피의 4 nM 비오티닐화 단백질 L과 혼합하였다. 그런 다음 혼합물을 허셉틴 희석 시리즈에 동일한 양으로 첨가하여 분석에서 5nM 표지된 1가 스트렙타비딘 및 1nM 비오틴화 단백질 L의 최종 샘플 농도를 얻었다. 허셉틴의 최고 농도는 1μM에 해당하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 형광 흔적은 628nm 내지 653nm 사이(“650nm”)의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이(“670nm”)의 제3파장에서 동시에 측정되었다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670nm 및 650nm에서 점별 분할이 수행되었다. 도 19(A)에 제공된 용량-반응 곡선은 본 발명의 방법이 3원 복합체의 측정을 가능하게 함을 나타내고, 비오티닐화된 단백질과 리간드 사이의 상호작용을 측정하기 위해 표지된 스트렙타비딘과 같은 표지된 제3분자를 통해 표지가 간접적으로 수행된다(도 19(B)).
실시예 7
다음 실시예에서는 이중 방출 구조를 기반으로 소분자와 비오티닐화된 단백질 (즉, 비오틴 분자가 이에 공유결합으로 부착됨) 사이의 용량-반응 곡선을 얻기 위해, 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법의 용도를 설명한다. 형광 표지를 위해 비오티닐화된 단백질을 단백질 스트렙타비딘(SA) 및 3' 말단의 비오틴과 5' 말단의 형광단 Cy5(bDNA)로 변형된 짧은 핵산과 혼합하였다. SA 오틴(비타민 B7이라고도 함)에 대한 친화력이 매우 높은 동종 사량체이다. 이는 유기 용매, 변성제(예를 들어, 구아니디늄 클로라이드), 세제(예를 들어, SDS, Triton), 단백질 분해 효소 및 극한의 온도와 pH에 대한 스트렙타비딘-비오틴 복합체의 저항성으로 인해 분자 생물학 및 바이오 나노기술에 광범위하게 사용된다.
예에서, 말토스 결합 단백질(MBP)을 함유한 샘플은 이 접근법에 따라 형광 표지되었다. 그런 다음 MBP를 소분자 말토오스와 혼합하고 제1파장에서 여기시키고, 방출된 형광 강도는 제2파장 및 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
스트렙타비딘은 1mg/mL(약 19μM)의 스톡 농도(stock concentration)제조한 다음 인산염 완충 식염수에 4nM로 희석하였다. bDNA(5' 말단에 Cy5 분자가 부착되고 3' 말단에 비오틴 분자가 부착된 12-량체 올리-dT 시퀀스)를 화학적으로 합성하여 DNA 공급업체에 주문하였다. 100 μM 스톡 용액을 준비한 후 이중 증류수(ddH2O)에 최종 농도 8 nM이 되도록 희석하였다. 그런 다음 SA와 bDNA를 1:1 부피 비율로 혼합하여,4nM SA, 8nM bDNA 용액(1:2 화학량론)을 얻었다. 이 단계를 통해, SA는 Cy5로 표지된 비오티닐화된 bDNA에 결합하여 형광 표지되었다.
다음으로, 100nM 비오티닐화된 MBP 100μl를 4nM SA, 8nM bDNA 용액 100μl와 혼합하여, 2nM SA, 4nM bDNA, 50nM MBP 용액 200μl를 얻었다. SA는 사량체 단백질이고, 평균적으로 비오틴 결합 부위 4개 중 2개는 비어 있으므로, bDNA-SA-MBP 복합체, 즉 형광 표지된 MBP를 생성하기 위해, 비오틴화된 MBP에 결합할 수 있다.
다음으로, 미표지된 말토스의 16포인트의 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. 형광 표지된 MBP를 말토스 희석 시리즈에 동일한 양으로 첨가하여 1 nM SA, 2 nM bDNA 및 25 nM MBP의 최종 목표 농도를 얻었다. 말토스의 최고 농도는 500μM에 해당하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 형광 흔적은 628nm 내지 653nm 사이(“650nm”)의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이(“670nm”)의 제3파장에서 동시에 측정되었다. 각 모세관은 3초 동안 측정되었다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670nm 및 650nm에서 점별 분할이 수행되었다. 도 20(B)에 제공된 용량-반응 곡선은 본 발명의 방법이 4원 복합체의 측정을 가능하게 함을 나타내고, 표지화는 미표지된 SA 및 표지된 비오티닐화 단일 가닥 DNA 올리고머와 같은 미표지된 제3분자 및 표지된 제4분자를 통해 간접적으로 수행된다.
실시예 8
다음 실시예에서는 이중 방출 구조를 기반으로 2개의 분자 사이의 용량-반응 곡선을 얻기 위해, 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법의 용도를 설명한다. 따라서, 형광 표지된 치료 항체 CR3022, Cov-19("SARS CoV-2") 스파이크 단백질 및 단백질 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)를 함유한 샘플을 제1파장에서 여기시키고, 방출된 형광 강도는 제2파장 및 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
미표지된 단백질 ACE2의 14포인트의 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. 치료 항체 CR3022는 Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation(NanoTemper Technologies)을 사용하여 형광 표지되었으며, 이 중 10nM을 동일한 부피의 80nM Cov-19 스파이크 단백질과 혼합하였다. 그런 다음 혼합물을 ACE2 희석 시리즈에 동일한 양으로 첨가하여, 표지된 CR3022 5nM 및 스파이크 단백질 20nM의 최종 샘플 농도를 얻었다. ACE2의 최고 농도는 250nM에 해당하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 형광 흔적은 628nm 내지 653nm 사이(“650nm”)의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이(“670nm”)의 제3파장에서 동시에 측정되었다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670nm 및 650nm에서 점별 분할이 수행되었다. 도 21에 제공된 용량-반응 곡선은 본 발명의 방법이 3원 복합체의 측정을 가능하게 함을 나타내고, 표지화는 표지된 항체와 같은 표지된 제3분자를 통해 간접적으로 수행된다.
실시예 9
다음 실시예에서는 이중 방출 구조를 기반으로 단백질의 구조적 상태를 특성화하기 위해, 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법의 용도를 설명한다. 따라서, 형광 표지된 단백질을 포함하는 샘플은 제1파장에서 여기되고, 방출된 형광 강도는 제2파장 및 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
미토겐 활성화 단백질 키나제 14(p38-α)는 Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation(NanoTemper Technologies)를 사용하여 형광 표지되었다. 그런 다음 표지된 단백질을 20nM의 농도로 희석하고 폴리머 코팅된 붕규산염 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591nm의 파장에서 여기되었다. 형광 흔적은 628nm 내지 653nm 사이(“650nm”)의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이(“670nm”)의 제3파장에서 동시에 측정되었다. 희석 직후(t = 0분) 측정을 수행하고, 모세관 내부에서 3, 8, 및 19분 후에 다시 측정을 수행하였다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670nm 및 650nm에서 점별 분할이 수행되었다. 도 22에 제공된 측정 시작 시간에 대한 형광 비율을 플롯팅하면, 상기 비율이 4회 측정 기간 동안 일정하지 않지만, 시간이 지남에 따라 선형적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 비율의 증가는 표지된 단백질이 실온에서 안정하지 않지만 점차적으로 변성된다는 것을 나타낸다.
실시예 10
다음 실시예에서는 이중 방출 구조에 기초하여 빠른 결합 동역학을 측정하기 위한 본 발명의 방법을 설명한다. 따라서 아데노신과 소분자 AMP에 대한 형광 표지된 DNA 앱타머를 포함하는 샘플과 하나의 DNA 가닥이 Cy5로 형광 표지된 2개의 11-량체 상보적 DNA 가닥을 포함하는 샘플은 제1파장에서 여기되었다. 상기 샘플의 방출된 형광 강도는 제2파장 및제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
앱타머에 대하여, 미표지된 AMP의 12포인트의 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. DNA 앱타머를 Cy5로 형광 표지하고, AMP 희석 시리즈에 동일한 양을 첨가하여, 20nM의 최종 샘플 농도를 얻었다. AMP의 최고 농도는 2mM에 해당하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
DNA 혼성화를 위해, 미표지된 11-량체(시퀀스: 5' CCT GAA GTC C 3')의 16포인트 1:1 희석 시리즈를 제조하였다. 상보적 11-량체(시퀀스: 5' GGA CTT CAG G 3')는 Cy5로 5' 말단에 형광 표지하고 희석 시리즈에 동일한 양을 추가하여, 10 nM의 최종 샘플 농도를 얻었다. 미표지 11-량체의 최고 농도는 100μM에 해당하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 0초 시점에 IR 레이저가 켜졌다. 형광 강도의 반응은 각각 6초(앱타머), 21초(DNA 혼성화) 동안 동시에 측정되었다. 형광 흔적은 628nm 내지 653nm 사이(“650nm”)의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이(“670nm”)의 제3파장에서 측정되었다.
위에서부터, 본 발명의 방법이 고속 IR 레이저 가열과 조합되어 사용될 때, 결합 상호작용에 대한 정보(예를 들어 Kd)가 비율계량 흔적을 따라 시간상 임의의 "수직" 슬라이스로부터 도출될 수 있다는 것이 명백하다. 시간 대비 Kd 곡선으로 설명할 수 있는 새로운 유형의 곡선이 생성될 수 있다. 이 곡선으로부터 열역학에 대한 정보뿐만 아니라 상호작용의 결합 동역학에 대한 정보도 결정할 수 있다. 특히 상호 작용의 평형 동역학이 IR 레이저를 사용한 가열보다 느린 경우 시간 대비 Kd 곡선은 특징적인 지연을 나타낸다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670nm 및 650nm에서 점별 분할이 수행되었다. 도 23에 제공된 시간 대비 Kd 곡선은 서로 다른 해리 상수 Kd 및 결합 동역학과의 3가지 서로 다른 상호작용을 도시한다. Cy5로 표지된 DNA 앱타머와 AMP 사이의 상호작용의 경우 Kd 는 대략 30μM으로 결정되었고 10s-1보다 큰 koff가 추정되었다(도 23(A)). 상호작용, 즉 32℃에서 측정된 두 개의 11-량체 상보적 DNA 가닥 사이의 DNA 혼성화를 위해, Kd가 대략 500nM이 결정되었고 k off가 대략 1 s-1으로 추정되었다(도 23(B)). 위에서 언급한 2개의 11-량체 상보적 DNA 가닥을 22℃에서 측정한 결과 약 Kd가 약 5nM으로, k off가 대략 0.01 s-1미만으로 나타났다(도 23(C)).
위에서 설명한 DNA 혼성화에 대한 22℃와 32℃ 사이의 시간 대비 Kd 측정에 대한 자세한 정보는 도 24(A)에 제공된다. y축은 측정 전반에 걸쳐 Kd의 배수 증가를 보여준다. 느린 동역학과의 상호작용의 경우, 시간 대비 Kd 곡선은 온도 변화를 즉각적으로 따르지 않고, 오히려 뚜렷한 지연(lag)을 나타내며, 즉, 지연이 클수록 상호작용 동역학이 느려진다. 따라서 이 지연을 분석하면 상호작용의 결합 동역학에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있다. koff 및 kon의 정확한 값을 얻을 수 없더라도, 리간드를 비교하고 더 빨리 해리되는 리간드를 식별하는 능력은 이미 이 방법의 엄청난 이점이다.
또한, 20초 동안 IR 레이저를 가열한 후 평형이 새로운 더 높은 온도에서 회복된다고 가정하면, 2가지 다른 온도, 즉 초기 샘플 온도로서 22℃, IR 레이저 가열 후 온도로서 대략 32℃(위에 설명된 보정 실험을 통해 결정됨)에서의 반트호프 분석, 상호작용의 엔탈피와 엔트로피가 얻어졌다(도 24(B) 및 24(C) 참조). 획득된 열역학적 매개변수는 샘플 트레이 온도를 다양한 온도(예: 22℃, 24℃, 26℃, 28℃, 30℃, 32℃)로 조정하고 각 온도에서 Kd를 측정(도 24(D) 및 24(E) 참조)함으로써, 고전적인 반트 호프 분석에서 얻은 것과 유사하다.
다양한 해리 속도에 대한 시간 대비 Kd 곡선에 대한 시뮬레이션 데이터가 도 25에 제공된다. 도 25(A)에 제공된 시뮬레이션된 시간 대비 Kd 곡선은 10s-1과 0.001s-1 사이의 해리 속도가 20초 동안의 IR 레이저 가열과 조합하여 본 발명의 방법을 수행함으로써 해결될 수 있음을 보여준다. 도 25(B)에 제공된 시뮬레이션된 시간 대비 Kd 곡선은 0.036s-1과 0.154s-1 사이의 작은 차이도 해결할 수 있음을 보여준다.
실시예 11
다음 실시예에서는 이중 방출 구조에 기초하여 느린 결합 동역학을 측정하기 위한 본 발명의 방법을 설명한다. 따라서, 형광 표지된 나노바디 및 Cov-19 스파이크 RBD 단백질을 포함하는 샘플은 제1파장에서 여기되고, 방출된 형광 강도는 제2파장 및 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
Cov-19 스파이크 단백질에 대한 나노바디는 단백질 라벨링 키트RED-NHS 2nd Generation(NanoTemper Technologies)를 사용하여 형광 표지되었다. 2nM의 형광 표지된 나노바디를 (20nM 내지 625pM) 범위의 6가지 서로 다른 농도의 Cov-19 스파이크 RBD 단백질과 빠르게 혼합하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 형광 비율은 628nm 내지 653nm 사이(“650nm”)의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이(“670nm”)의 제3파장에서 동시에 측정되었다. 샘플을 반복적으로 측정하고 온도 변화가 결합 동역학에 영향을 미칠 수 있으므로 이 실시예에서는 IR 레이저를 켜지 않았다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670nm 및 650nm에서 점별 분할이 수행되었다. 도 26에 제공된 시간 대비 비율 곡선은 본 발명에 따른 방법이 이러한 "혼합 및 측정(mix-and-measure)" 접근법을 사용할 때 느린 결합 동역학을 따를 수 있고, 결합 동역학이 샘플을 준비하고 측정을 시작하는데 필요한 시간보다 느리다는 것을 보여준다. 글로벌 피팅 모델을 적용함으로써, 나노바디와 Cov-19 스파이크 RBD 단백질 사이의 상호 작용의 koff = 2.9 x 10-4 s-1 및 Kd = 415 pM이 결정하였다.
실시예 12
다음 실시예에서는 이중 방출 구조를 기반으로 형광 표지된 입자를 위치화하기 위해 본 발명에 따른 비율계량 특성화 방법의 용도를 설명한다(도 27(A)). 따라서, 형광 표지된 mRNA를 유하는 샘플은 제1파장에서 여기되고, 방출된 형광 강도는 제2파장 및 제3파장에서 측정되었다.
샘플 제조
mRNA는 Atto647N 형광 염료로 형광 표지되었으며 지질 나노 입자(LNP)에 통합되었다. LNP 제제를 함유하는 이러한 mRNA의 중복물은 다양한 종류의 스트레스에 노출되며, 즉, 0.25%의 세제 폴리소르베이트 20(Tween-20)을 추가하고, 90℃에서 10분 동안 끓이고, 1분 동안 와동시키거나 20분 동안 14,000rpm에서 원심분리되었다. LNP를 함유하는 미처리된 mRNA를 대조군으로 사용하였다. 그런 다음 샘플을 폴리머 코팅된 붕규산 유리 모세관(Monolith NT.115 Premium Capillaries, MO-K025, NanoTemper Technologies)에 로드하였다.
측정
각각의 샘플은 591 nm의 파장에서 여기되었다. 형광 흔적은 628nm 내지 653nm 사이(“650nm”)의 제2파장과 665nm 내지 727nm 사이(“670nm”)의 제3파장에서 동시에 측정되었다.
절대 형광 비율만을 결정하기 위한 측정을 위해 각 모세관을 3초 동안 측정하였다. LNP의 응집 상태를 확인하기 위한 측정을 위해 IR 레이저를 이용한 측정을 수행하였다(레이저 켜짐 시간 60초).
제공된 이전에 수행된 대조 측정으로부터, 본 발명의 이중 방출 구조에서 LNP 내에 위치하는 Atto647N을 갖는 형광 표지된 mRNA의 비율계량 형광 신호가 대략 2.1과 동일하다는 것이 분명하다. 대조적으로, 모든 형광 표지된 mRNA 분자가 LNP 외부에 위치할 때 비율계량 형광 신호는 대략 1.2와 같다.
비율계량 측정 데이터의 분석
비율계량 분석(즉, 형광 흔적의 비율 획득)을 위해, 670nm 및 650nm에서 점별 분할이 수행되었다. 미처리된 대조군, 즉 모든 형광 표지된 mRNA 분자가 LNP 내에 위치하는 경우 비율계량 형광 신호는 약 2.1과 같다(도 28(A), 대조군). 고농도의 세제를 첨가하면 LNP의 지질막이 파열/손상되어, 형광 표지된 mRNA 분자가 더 이상 LNP 내에 통합되지 않는다(도 28(A), +0.25% Tween). 이 경우 비율계량 형광 신호는 1.2와 같다. 대략 2.1의 비율에서 알 수 있듯이, 형광 표지된 mRNA는 와류된 또는 원심분리된 LNP 제제 내에 여전히 위치한다(도 28(A), 1분 와류, 20분 원심분리). 그러나 IR 레이저를 켠 후 얻은 "울퉁불퉁한(bumpy)" 형광 흔적을 분석할 때(도 28(B)), 상기 처리는 LNP 제제의 응집으로 이어졌다. 대조적으로, LNP 제제를 90℃에서 10분 동안 끓일 때 얻은 1.2의 비율은 형광 표지된 mRNA가 더 이상 LNP 내에 통합되지 않음을 나타낸다(도 28(A), 90℃에서 10분). 이는 IR 레이저를 켠 후 형광 흔적을 분석하여 추가로 검증되었다. 끓인 후 울퉁불퉁 없는 형광 흔적이 관찰되었으므로, 형광으로 표지된 mRNA 분자가 (잠재적으로 여전히 응집된) LNP를 이탈하였다는 것을 확인하였다.
상기로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 비율계량 특성화 방법은 형광 표지된 mRNA의 위치를 결정하는 것을 가능하게 한다.
참조 기호 목록:
1. 렌즈(예를 들어, 비구면 렌즈), 또는 렌즈 시스템, 또는 대물렌즈
2. 핫 미러, 높은 IR 반사, 가시광선 투과율 > 80%
3. IR 레이저(예: 1455 nm, 1480 nm, 1550 nm, 980 nm, 0.01 W - 10 W) 또는 포지셔닝용 레이저
4. 레이저 파이버(단일 모드 또는 다중 모드)
5. 콜리메이터가 없는 레이저 파이버 커플러
6. 레이저 빔 직경 및 포커싱을 결정하는 빔 성형 모듈(예를 들어, 1개, 2개 또는 그 이상의 렌즈로 구성된 렌즈 시스템)
7. 형광 여기와 방출을 분리하는 제1 광 분리 요소(예를 들어, 이색성 거울)
8. 제1 여기 광원(예를 들어, 레이저, 파이버 레이저, 다이오드 레이저, LED, HXP, 할로겐, LED 어레이, HBO)
9. 여기 광원의 빔 특성을 결정하는 렌즈 시스템(예를 들어, 1개, 2개 또는 그 이상의 렌즈)
10. 여기 필터(예를 들어, 대역 통과/장거리 통과)
11. 더 낮은 파장과 더 높은 파장 성분으로 방출을 분할하는 제2 광 분리 요소(예: 이색성 거울)
12. 제1 여기 필터(예를 들어, 대역 통과/장거리 통과)
13. 제2 여기 필터(예를 들어, 대역 통과/장거리 통과)
14. 제1 광 검출기(예: PMT, siPM, APD, CCD 또는 CMOS 카메라)
15. 제2 광 검출기(예: PMT, siPM, APD, CCD 또는 CMOS 카메라)
16. 제2 여기 광원(예를 들어, 레이저, 파이버 레이저, 다이오드 레이저, LED, HXP, 할로겐, LED 어레이, HBO)
17. 여기 광원의 빔 특성을 결정하는 렌즈 시스템
18. 2개의 상이한 여기 광원을 결합하는 제3 광 분리 요소(예를 들어, 이색성 거울)
인용된 비특허 문헌
[NPL1] Sindrewicz, P., Li, X., Yates, E. A., Turnbull, J. E., Lian, L. Y., & Yu, L. G. (2019). Intrinsic tryptophan fluorescence spectroscopy reliably determines galectin-ligand interactions. Scientific reports, 9(1), 1-12.
[NPL2] Mayer-Wrangowski, S. C., & Rauh, D. (2015). Monitoring ligand-induced onformational hanges or he dentification f strogen eceptor gonists nd ntagonists. Angewandte Chemie International Edition, 54(14), 4379-4382.
[NPL3] Chen, H. J., Chew, C. Y., Chang, E. H., Tu, Y. W., Wei, L. Y., Wu, B. H., ... & Tan, K. T. (2018). S-cis diene conformation: a new bathochromic shift strategy for near-infrared fluorescence switchable dye and the imaging applications. Journal of the American Chemical Society, 140(15), 5224-5234.
[NPL4] Niu, W., Wei, Z., Jia, J., Shuang, S., Dong, C., & Yun, K. (2018). A ratiometric emission NIR-fluorescent probe for sensing and imaging pH changes in live cells. Dyes and Pigments, 152, 155-160.
[NPL5] Pauli, J., Grabolle, M., Brehm, R., Spieles, M., Hamann, F. M., Wenzel, M., ... & Resch-Genger, U. (2011). Suitable labels for molecular imaging-influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry, 22(7), 1298-1308.
[NPL6] Harroun, S. G., Lauzon, D., Ebert, M. C., Desrosiers, A., Wang, X., & Vallee-Belisle, A. (2022). Monitoring protein conformational changes using fluorescent nanoantennas. Nature methods, 19(1), 71-80.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 비특허 문헌은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
Claims (20)
- 형광 표지된 입자(fluorescently labeled particle)의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자의 특성화 방법으로서,
a) 제1조건 하에서 용액 내 형광 표지된 입자의 샘플을 제공하는 단계,
b) 제1파장에서 형광 표지된 입자를 여기시키는 단계,
c) 제2파장 및 제3파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하는 단계,
d) 제2파장 및 제3파장에서의 형광 강도 사이의 비율을 계산하되,
제3파장은 제2파장과 상이한 단계,
e1) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 샘플에 대해 b)단계 내지 d)단계를 반복하거나, 또는
e2) 제2조건 하에서 형광 표지된 입자의 제2샘플에 대해 a)단계 내지 d)단계를 반복하되,
제2조건은 제1조건과 상이한 단계,
f) 상이한 조건에 대해 얻은 계산된 비율을 기반으로 형광 표지된 입자를 특성화하되,
제2파장과 제3파장은 동시에 검출되고, 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 형광 방출의 최대 방출보다 제2파장은 더 짧고, 제3 파장은 더 긴 단계를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 형광 표지된 입자를 함유하는 샘플 부피는 100 μl 미만, 바람직하게는 1 μl 내지 25 μl인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 형광 표지된 입자를 함유하는 샘플은 모세관에 제공되는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 표지된 입자는 환경 민감성 표지(environment sensitive label)로 표지되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 유기 분자, 생체분자, 나노입자, 마이크로입자, 소포, 생물학적 세포 또는 하위 세포 단편(sub-cellular fragment), 생물학적 조직, 바이러스 입자, 바이러스, 세포 소기관, 지질 나노입자(LNP) 및 바이러스 유사 입자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제5항에 있어서, 생체분자는 아미노산, 단백질, 펩티드, 단당류, 이당류, 다당류, 지질, 당지질, 지방산, 스테롤, 비타민, 신경전달물질, 효소, 뉴클레오티드, 대사산물, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 내 형광 표지된 입자의 농도가 10pM 내지 10μM, 바람직하게는 50pM 내지 500nM인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 표지된 입자의 검출된 형광 강도의 변경은 스펙트럼 이동, 스펙트럼의 확장, 스펙트럼의 축소, 또는 이들의 조합으로부터 발생하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 표지된 입자의 형태적 변화, 형광 표지된 입자의 재배치, 형광 표지된 입자와 하나 이상의 리간드 사이의 상호작용 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 메커니즘으로 인해 형광 표지된 입자의 형광 강도가 변화하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, f)단계에서 얻은 계산된 비율은 형광 표지된 입자의 위치 또는 해리 상수, 최대 유효 농도의 절반(EC50), 평형 상수, 결합 동역학, 효소 반응 동역학, 열역학, 동역학 매개변수, 언폴딩 또는 리폴딩 동역학(unfolding or refolding kinetics), 열기 및 닫기 반응(opening and closing reactions) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매개변수를 결정하는 데 사용되는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, e)단계의 제2조건은 리간드를 첨가하거나 및/또는 리간드의 상이한 농도에 의해 변경되고, f)단계에서 얻은 계산된 비율은 형광 표지된 입자와 리간드의 해리 상수를 결정하는 데 사용되는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 표지된 입자의 제1조건과 제2조건은 온도 및/또는 화학적 조성에 관하여 상이한 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, c)단계의 제2파장 및 제3파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도는 정의된 온도 섭동(temperature perturbation) 동안 검출되는 방법.
- 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자를 특성화하며, 특히 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는데 적합한 장치로서, 상기 장치는:
복수의 조건 하에서 용액 내 형광 표지된 입자 샘플을 고정하기 위한 샘플 홀더;
제1파장에서 형광 표지된 입자를 여기시키는 수단;
제2파장 및 제3 파장에서 형광 표지된 입자의 형광 방출 강도를 검출하기 위한 수단;
제2파장과 제3파장에서의 형광 강도 사이의 비율을 계산하기 위한 수단으로서, 제2파장과 제3파장은 상이하고,
상기 장치는 연속적으로 형광을 여기시키고, 형광 방출을 검출하고, 상이한 조건에서 샘플에 대한 비율을 계산하도록 구성되는 수단;
상이한 조건에 대해 얻은 계산된 비율을 기반으로 형광 표지된 입자를 특성화하는 수단으로서,
상기 장치는 제2파장과 제3파장은 동시에 검출되고, 상이한 조건 중 제1조건 하에서 형광 표지된 입자의 형광 방출의 최대 방출보다 제2파장은 더 짧고, 제3 파장은 더 긴 수단을 포함하는 장치. - 제14항에 있어서, 여기 수단은 여기 광원, 바람직하게는 레이저, 레이저 섬유 레이저(laser fibre laser), 다이오드-레이저, LED, HXP, 할로겐, LED-어레이, HBO로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 광원인 장치.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 검출 수단은 광 검출기, 바람직하게는 PMT, siPM, APD, CCD 또는 CMOS 카메라로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 검출기인 장치.
- 프로그램이 컴퓨터에 의해 실행될 때, 컴퓨터가 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램.
- 컴퓨터에 의해 실행될 때 컴퓨터가 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 명령어를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 데이터 매체.
- 바람직하게는 방법 청구항 1 내지 13 중 어느 하나에 따라 용액 내 형광 표지된 입자의 특성화를 위한 청구항 14 내지 16 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도.
- 형광 표지된 입자의 형광 스펙트럼의 변화를 분석함으로써 용액 내 형광 표지된 입자의 특성화를 위한 모세관의 용도로서, 용액 내 형광 표지된 입자의 샘플은 모세관에 채워지고, 특히 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법에 따라 분석하기 위해 제공된 용도.
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