KR102576727B1 - 분자간 및/또는 분자 내 상호 작용을 측정하는 방법 - Google Patents

분자간 및/또는 분자 내 상호 작용을 측정하는 방법 Download PDF

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Abstract

다음 단계를 포함하는 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 방법:
a) 용액 내에 표지된 입자 및 리간드를 포함하는 샘플을 제공하되, 상기 표지된 입자는 상기 용액에 용해 또는 분산되거나 또는 고체 지지체 상에 고정화되는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
c) 용액 내 리간드의 상이한 농도에서 단계 (a) 및 (b)를 여러 번 반복하는 단계; 및
d) 상기 표지된 입자의 리간드 농도 의존적 형광 변화에 기초하여 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 단계,
상기 표지된 입자는 하나 이상의 염료로 표지된다.

Description

분자간 및/또는 분자 내 상호 작용을 측정하는 방법
본 발명은 입자의 분자간 및/또는 분자 내 상호 작용 및/또는 입자의 변형을 측정하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
용매-민감성 형광 염료, 즉 메로시아닌 염료는 단백질에 공유 결합하여 인비보 이미징에 적합한 것으로 보고되었다. 이들 염료는 단백질의 형태 변화를 연구하는데 사용될 수 있다 (Hahn et al. in J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 4132-4145).
폴리메틴 염료는 이들 염료와 핵산 및 단백질과 같은 '생체거대분자(Biomacromolecules)과의 비공유 상호 작용을 연구하기 위한 스펙트럼-형광 프로브로서 유용한 것으로 보고되었다 (Tatikolov in Journal of Photochemistry and Photobiology C : Photochemistry Reviews 2012, 13, 55-90).
또한, 시아닌 염료의 광물리학적 특성은 생체 분자 내의 분자 환경에 의해 영향을 받으므로, 이러한 염료는 생물 물리학적 연구에서 형광 프로브로 적합하게 만든다고 보고되었다 (Levitus et al., Quaterly Review of Biophysics 2010, 1-29).
단백질-유도 형광 증진은 단백질이 형광 프로브에 근접한 핵산에 결합할 때 발생하는 형광 강도의 증가를 설명하는 것으로 보고된 효과이다. 특히, DNA에 공유 결합된 시아닌 염료는 단백질이 DNA에 결합할 때 형광 강도 증가시킨다 (Myong et al. in PNAS 2011, 108, 7414-7418; Levitus et al. in J. Phys. Chem. Lett. 2015, 6, 1819-1823).
메로시아닌 염료는 형태 변화 및 리간드 결합과 같은 단백질 활성을 검출하고 정량화하기 위한 염료로서 유용한 것으로 보고되었다. 또한, 선택된 표적에 결합할 수 있는 바이오센서 분자 및 표적 생체 분자 및 단백질 활성을 검출하기 위한 방법이 WO 2005/088308 A2에 개시되어 있다.
열-광학 특성화에 의해 입자의 상호 작용, 특히 생체 분자와 리간드의 상호 작용을 측정하는 방법은 WO 2008/061706 A1에 개시되어 있다. 이 열-광학 특성화는 강한 온도 구배 생성으로 인한 열영동을 기반으로 한다.
발명의 요약
본 발명은 입자의 분자간 및/또는 분자 내 상호 작용 및/또는 입자의 변형을 측정하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 개선된 감도를 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 종래 공지된 방법으로는 충분한 감도로 측정될 수 없었던 상호 작용의 검출을 허용하는 염료를 사용한다. 또한, 상기 방법은 가열 방법/공급원과 독립적이며 또한 반응 용기의 기하학적 구조와 무관하다 (즉, 실험은 모세관뿐만 아니라 웰 플레이트에서 수행될 수 있다).
본 발명의 방법에서, 표지된 입자는 하나 이상의 온도-민감성 염료로 표지된 것을 사용한다.
제 1 양태에서, 본 발명은 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 방법에 관한 것이다. 제 1 양태의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 용액 내에 표지된 입자 및 리간드를 포함하는 샘플을 제공하되, 상기 표지된 입자는 상기 용액에 용해 또는 분산되거나 고체 지지체 상에 고정화되는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
c) 용액 내 리간드의 상이한 농도에서 단계 (a) 및 (b)를 여러 번 반복하는 단계; 및
d) 상기 표지된 입자의 리간드 농도 의존적 형광 변화에 기초하여 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 단계.
제 2 양태에서, 본 발명은 분자간 및/또는 분자 내 상호 작용을 측정하는 방법에 관한 것이다. 제 2 양태의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 표지된 입자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고, 제 1의 온도에서 여기된 입자의 제 1의 형광을 검출하는 단계;
c) 샘플을 제 2의 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
d) 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 2의 온도에서 여기된 입자의 제 2의 형광을 검출하는 단계;
e) 제 1 및 제 2의 형광에 기초하여 입자의 분자간 및/또는 분자 내 상호 작용 및/또는 변형/변경을 특성화하는 단계.
제 3 양태에서, 본 발명은 시간 의존적 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다. 제 3 양태의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 표지된 입자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 여기된 입자의 제 1 형광을 검출하는 단계;
c) 미리 설정된 시간을 기다리는 단계;
d) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 여기된 입자의 제 2 형광을 검출하는 단계;
e) 제 1 및 제 2 형광에 기초하여 입자의 시간 의존적 변화를 특성화하는 단계.
제 4 양태에서, 본 발명은 환경 의존적 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다. 제 4 양태의 방법은 다음 단계를 포함한다 :
a) 표지된 입자를 포함하는 제 1 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 1 샘플에서 여기된 입자의 제 1 형광을 검출하는 단계;
c) 실질적으로 동일한 농도로 표지된 입자를 포함하는 제 2 샘플을 제공하ㄴ는 단계(여기서 제 2 샘플은 제 1 샘플과 상이함);
d) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 2 샘플에서 여기된 입자의 제 2 형광을 검출하는 단계;
e) 제 1 및 제 2 형광에 기초한 입자의 환경 의존적 변화를 특성화하는 단계.
제 5 양태에서, 본 발명은 2개의 반응성 염료를 포함하는 단백질 라벨링 키트에 관한 것으로, 여기서 염료는 스페이서기를 가지며, 상기 스페이서기는 염료를 단백질에 접합할 수 있는 반응성기를 갖는다.
도 1은 펠티어(Peltier) 디바이스 또는 IR 레이저를 열 원으로 사용하여 선택된 폴리메틴 및 크산텐 염료의 온도 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 2는 펠티어 디바이스를 열 원으로 사용하여 다양한 염료의 온도 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 3은 환경(예, pH)에 의해 조절되는 염료 모노설포Cy5 및 DY647P1의 온도 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 4는 Cy5-ssDNA에 대한 리간드 EcoSSB의 결합 친화도를 측정하기 위해 열 원으로 펠티어 디바이스 또는 IR 레이저를 사용하여 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 5는 모노설포Cy5-TEM1용 리간드 BLIP의 결합 친화도를 측정하기 위해 단일 승온에서 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 6은 모노설포Cy5 (A) 또는 D647P1 (B)로 표지된 탄산 탈수효소(CAII)용 리간드 푸로세미드의 결합 친화도를 측정하기 위해 35 ℃에서 표지된 입자의 온도 유도 형광 강도 변화 및 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 7은 모노설포Cy5-포테인 A용 리간드 트라스투주맙의 결합 친화도를 측정하기 위해 6 ℃ 및 23 ℃에서 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 8은 DyLight655 B1 내지 B4로 표지된 IL-R1 단백질에 대한 리간드 아나킨 라의 결합 친화도를 측정하기 위해 37 ℃에서 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 9는 Cy5로 표지된 p38α 단백질용 리간드 PD169316의 결합 친화도를 측정하기 위해 35 ℃ 내지 23 ℃ 사이에서 냉각 시 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 10은 Cy5, Z-Cy5, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 488-트리스NTA, TAMRA 또는 TAMRA X로 표지된 p38α 단백질용 리간드 PD169316 및 BIRB의 결합 친화도를 측정하기 위해 가열 시 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 11은 모노설포Cy5 또는 DY647P1으로 표지된, TEM1용 리간드 BLIP 및 p38α 단백질용 리간드 BIRB의 결합 친화도를 측정하기 위해 37 ℃ 내지 45℃에서 가열 시 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 12는 모노설포Cy5, DY630 또는 DY631로 표지된, TEM1용 리간드 BLIP 및 p38α 단백질용 리간드 PD169316의 결합 친화도를 결정하기 위해 37 ℃ 내지 45 ℃에서 가열 시 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 13은 독특한 열-광학 프로파일을 초래하는 단일의 특정 온도에서 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 14는 표지된 입자의 리간드 유도 형광 강도 변화에 대한 염료와 입자 사이의 스페이서 길이의 영향을 개략적으로 나타낸다.
도 15는 펠리어 디바이스를 이용하여 모노설포Cy5 및 SeTau 단독과 p38α 단백질 및 TEM1에 접합된 염료들의 온도 유도 형광 강도 변화를 나타낸다.
도 16은 열 언폴딩(thermal unfolding)을 측정하기 위해, MBK 및 TEM1에 접합된 모노설포Cy5의 온도 유도 형광 강도 변화를 나타내어 한다.
도 17 및 18은 결합 및 비결합 상태의 온도에 따른 형광 변화에 대한 예시적인 개략도를 나타낸다.
도 19a 내지 19e는 특정 염료의 구조를 나타낸다.
본 발명은 입자의 분자간 및/또는 분자 내 상호 작용 및/또는 입자의 변형을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 개선된 감도를 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 종래 공지된 방법으로는 충분한 감도로 검출될 수 없었던 상호 작용의 검출을 허용하는 염료를 사용한다.
본 발명에 따르면, 입자의 변형은 예를 들어 입자의 글리코실화, 인산화, 지질화, 카르보닐화, 산화 등을 포함한다.
상호 작용이라는 용어는 생체 분자들(예를 들어, 단백질, DNA, RNA, 히알루 론산 등) 사이뿐만 아니라 (개질된) (나노)입자/(마이크로)비드와 생체 분자 사이의 상호 작용을 포함한다.
특히, 본 발명의 방법은 생체 분자와 같은 분자의 안정성, 또는 분자, 특히 생체 분자와, 예를 들어 추가의 (생체)분자, 특히 변형된 생체 분자, 입자, 예를 들어 나노 입자 또는 마이크로 입자, 비드, 예를 들어, 마이크로비드와의 상호 작용을 측정할 수 있게 한다. 또한, 이들 특성의 조합은 이 발명의 수단 및 방법에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 본 발명은 생체 분자의 측정/특성화에 제한되지 않는다는 점에 유의한다. 따라서, 다른 화합물/입자의 특성은 또한 본원에 개시된 수단 및 방법에 의해 측정 및 결정될 수 있으며, 예를 들어 분자의 운동 이벤트 및 상호 작용이 결정 및/또는 측정될 수 있다. 따라서, (무기 또는 유기 반응과 같은) 화학 반응은 본 발명의 방법에 의해 측정될 수 있다. 복잡한 형성 및/또는 이들의 해리를 결정하는 것도 고려된다.
이 특성화는 특히 융점 또는 녹는 곡선, 복합체 형성, 단백질-단백질 상호 작용, 단백질 또는 펩타이드 폴딩/언폴딩, 분자 내 상호 작용, 분자간 상호 작용, 입자 또는 분자 사이의 상호 작용의 측정 등과 같은 생체 물리학적 특성의 측정을 포함한다.
따라서, 본원에 제공된 방법으로, 특히 생물학적, 화학적 또는 생물 물리학 적 과정을 측정, 검출 및/또는 검증하고/하거나 생물학적 또는 제약학적 샘플과 같은 샘플을 조사, 연구 및/또는 검증하는 것이 가능하다. 또한, 진단 테스트가 가능하며 본 발명의 구현예이다. 특히, 단백질 또는 핵산 분자, 예를 들면 이중 가닥 DNA 또는 이중 가닥 RNA(dsDNA/dsRNA) 또는 DNA/RNA 하이브리드와 같은 하이브리드 핵산 분자의 용융 특징을 측정하는 것, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 검출 및/또는 측정과 같은 핵산 서열을 측정 및/또는 분석하는 것 또는 상응하고 핵산의 상대 길이의 함수로서 핵산 분자의 안정성을 측정하는 것; PCR 최종 산물, 예를 들어, 일반적인 의료 진단, 또한 극체 진단, 이식 전 진단, 법의학 분석을 측정 및/또는 검증하는 것이 예상되고 실현 가능하다. 따라서, 당업자에게는 본 발명에 제공된 수단 및 방법이 비제한적이며, 특정 입자/분자의 다른 분자/입자에 대한 친화도가 중요한 측정 및/또는 검증에 유용하다는 것이 명백하다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법뿐만 아니라 디바이스는 핵산 분자 및 단백질의 융점뿐만 아니라 온도 안정성의 검출 및 측정에 유용하다. 따라서, 예를 들어, (DNA-) 프라이머 및 (DNA- 또는 RNA-) 프로브는 합성 후 또는 합성 동안 측정 및/또는 검증되는 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, DNA- 칩과 같은 주형상의 핵산 분자의 측정이 예상된다. 본 발명의 문맥에서 용융이라는 용어는 핵산(예, RNA, DNA) 또는 단백질과 같은 생체 분자의 열 변성을 의미한다.
본 발명의 문맥에서 핵산 분자, 예를 들어, 단일-가닥 입체 형태 다형성 (SSCP) 또는 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 등의 형태의 돌연변이 및 유전자 변이의 측정, 검출 및/또는 검증이 또한 예상된다. 본 발명은 또한 이종 이합체(heteroduplexes)를 분석할 수 있는 가능성을 제공한다. 이종 이합체는 예를 들어 야생형 및 돌연변이 DNA 분자의 혼합물의 열 변성 및 재어닐링에 의해 생성된다. 특히, 후자의 안정성에 대한 DNA 분자에 대한 단백질 결합의 효과를 측정하는 것이 또한 가능하다. 또한 단백질의 열 안정성 및 분자(예, 소분자, 약물, 약물 후보 물질)가 열 변성에 미치는 영향을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 범위 내에는, 예를 들어 단백질성 구조 또는 단백질 또는 이의 단편의 복합체 형성과 같은 단백질-단백질 상호 작용의 측정이 있다. 이러한 측정은 항체-항원 결합 반응(또한 단일 사슬 항체, 항체 단편, 염색체 등의 형태)의 측정을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나, 본 발명의 구현예는 또한 예를 들어 단백질 복합체의 해리와 같은 해리 이벤트의 검출 및/또는 측정에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 단백질성 복합체, 예를 들어 항체-항원 복합체 등의 해리를 측정할 때와 같이 해리 이벤트의 측정, 결정 및/또는 검증에 유용하다.
본 발명은 짧은 DNA의 검출 또는 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자의 결정에 제한되지 않는다. 또한, 입자/분자, 형태, 유체역학적 반경, 입자/분자, 예를 들어 단백질, 핵산(예, DNA, RNA, PNA, LNA), 나노 입자, 비드, 특히 마이크로 비드, 지질, 리포좀, 소포, 세포, 바이오폴리머(히알루 론산, 알기네이트 등), 2차원 지질 시트 간의 상호 작용 무기 물질(예, 탄소-나노 튜브, 버키볼 등), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 결합 동역학 및 안정성이 측정될 수 있다.
제 1 양태에서 본 발명은 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 상기 표지된 입자와 리간드의 상호 작용은 리간드의 농도에 따라 측정될 수 있다.
본 발명의 제 1 양태 다음 단계를 포함한다:
a) 용액 내에 표지된 입자 및 리간드를 포함하는 샘플을 제공하되, 상기 입자는 상기 용액에 용해 또는 분산되거나 고체 지지체 상에 고정화되는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
c) 용액 내 리간드의 상이한 농도에서 단계 (a) 및 (b)를 여러 번 반복하는 단계; 및
d) 상기 표지된 입자의 리간드 농도 의존적 형광 변화에 기초하여 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 단계.
바람직하게는, 단계 a)에서 표지된 입자 및 리간드가 용액에 미리 설정된 농도로 제공되거나, 표지된 입자가 고체 지지체 상에 고정된 경우, 표지된 입자가 미리 설정된 양으로 제공되고 리간드가 미리 설정된 농도로 제공된다. 이는 각각의 형광 측정에서 표지된 입자 및 리간드의 양이 미리 정의되고 단계 a)와 b) 사이, 예를 들면 세척 단계에 의해 변하지 않음을 의미한다. 또한, 단계 a)에서 제공된 용액은 단계 b)에서 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하기 위해 사용된다.
본 발명의 제 1 양태의 방법을 사용하여, 상기 표지된 입자의 리간드 농도 의존적 형광 변화를 나타내는 결합 곡선을 얻을 수 있다. 결합 곡선("열-광학 프로파일"이라고도 함)으로부터 입자와 리간드의 해리 상수를 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 방법은 입자-리간드 결합의 해리 상수와 같은 입자 및 리간드의 해리 상수를 측정하는 방법이다.
바람직하게는, 생체 분자/리간드, 단백질/리간드, 단백질/단백질 또는 수용체/리간드 사이의 상호 작용은 본 발명의 제 1 양태의 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 제 1 양태의 바람직한 구현예에서, 단계 (b)는 다음 단계를 포함한다:
ba) 용액을 미리 설정된 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
bb) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계.
추가 가열 또는 냉각 단계는 미리 설정된 온도의 특정 조절에 유리하다. 1/1000의 형광의 상대적인 차이를 측정하기 위해, 펠티어 소자 또는 IR 레이저와 같은 가열 또는 냉각 요소를 사용하여 미리 설정된 온도를 제어하는 것이 바람직하다. 시간에 따른 온도 드리프트를 피하고 온도 변화가 +/-1K 보다, 바람직하게 +/-0.5K 보다 작도록 미리 설정된 온도를 제어하는 것이 유리하다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제 1 양태의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 용액 내에 표지된 입자 및 리간드를 포함하는 샘플을 제공하되, 상기 표지된 입자는 상기 용액에 용해 또는 분산되거나 또는 고체 지지체 상에 고정화되는 단계;
ba) 용액을 미리 설정된 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
bb) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
c) 용액 내 리간드의 상이한 농도에서 단계 (a) 및 (b)를 여러 번 반복하는 단계; 및
d) 상기 표지된 입자의 리간드 농도 의존적 형광 변화에 기초하여 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 단계.
이론에 얽매이지 않고, 리간드가 표지된 입자에 결합할 때 표지된 입자의 형광 변화, 즉 입자에 접합된 염료의 변화는 다음의 이론적 원리에 기초하는 것으로 여겨진다:
열 광학 측정에서 가장 중요한 매개 변수 중 하나는 다음과 같이 정의된 바인딩 진폭 ΔFnorm이다.
여기서, F는 온도 T에서의 측정된 형광 값이다. 형광 값은 시작 온도 Tstart 및 상이한 종료 온도 Tend에서 비교된다. 두 형광 값의 비율은 정규화된 형광 Fnorm을 제공한다. 최적의 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)로 최적의 측정 결과를 얻으려면 ΔFnorm의 값, 즉 결합(바운드) 상태와 비결합(언바운드) 상태에 대한 Fnorm 값의 차이가 가능한 한 커야 한다. 도 17은 결합 및 비결합 상태의 온도에 따른 형광의 변화에 대한 예시적인 개략도를 도시한다. 사용된 형광 값이 그에 따라 표시된다. 곡선의 실제 과정은 크게 다를 수 있다. 또한, 용액이 냉각되는 방식, 즉 Tstart와 Tend가 상호 교환되는 방식으로 측정을 수행할 수 있다.
ΔFnorm은 일반적으로 Tstart와 Tend 사이의 온도 차이가 증가함에 따라 더 높다. 그러나, ΔFnorm은 항상 사용된 형광단뿐만 아니라 표지된 분자 및 적정 리간드에 의존한다.
많은 상호 작용에서 은 이미 적정 리간드의 농도에 대한 의존성을 보여준다. 즉, 온도 변화없이 Tstart (즉, 미리 설정된 온도)의 경우 절대 형광 값의 리간드 의존성이 이미 보여질 수 있다. 그러나 결합 상태와 비결합 상태 사이 형광의 상대적인 변화 는 대부분의 경우 (몇 퍼센트 범위 내호) 매우 적다. 샘플을 제조하는 동안, 수동 및 자동 액체 처리 공정 모두에 의해 수 퍼센트의 표적 농도 (및 절대 형광 값)의 무작위 편차가 생성되어, Tstart에서 절대 형광의 리간드 의존성이 마스킹된다 (즉, 불리한 신호 대 잡음 비). 따라서, 2개의 상이한 온도에서 형광을 측정하고 (상이한 온도에서 측정된) 2개 값의 몫을 계산하는 것이 바람직하며, 이에 의해 액체 취급 오류가 정정될 수 있다.
그러나, 리간드의 함수로서 온도 변화에 따른 형광의 상대적인 변화, 즉 상대 결합 진폭 Ar, 는 또한 종종 몇 퍼센트의 범위로 작으며 ΔT에 의존한다. 상대적인 값을 고려하기 때문에 피펫팅 오류는 아무런 역할을 하지 않지만 알 수 없는 온도 TX 보다 작은 모든 온도에서 Ar은 약 1이다 (도 18).
TX 보다 높은 온도에 대해서만 Ar이 1에서 벗어나기 시작하며, 이 경우에만 고정밀로 결합을 측정할 수 있다. Ar이 클수록 크거나 작을수록, 즉 Ar이 1에서 벗어날수록 측정 결과가 좋다.
요약하면, 이는 피펫팅 오류를 제거하기 위해 하나 이상의 온도에서 형광을 측정해야 함을 의미한다. 한편, 측정 시작 시 Ar이 1에서 벗어난 온도 TX는 사용된 형광단, 표지된 표적 분자 및 적정 리간드에 의존한다. 이는 TX를 측정하기 위해 넓은 온도 범위를 스캔해야 함을 의미한다. 온도 Tend는 TX 보다 이상적으로 높다. Ar이 1과 얼마나 다른지에 따라, 충분한 신호 대 잡음 비를 달성하기 위해 어떤 경우에는 더 큰 ΔT도 바람직하다. 그러나, ΔT에 대한 값이 클수록 결합의 열역학적 평형은 Tstart에서 열역학적 평형과 크게 다를 수 있기 때문에, ΔT의 작은 값이 바람직하다.
도 18은 결합 및 비결합 상태의 온도에 따른 형광의 변화에 대한 예시적인 개략도를 나타낸다. 상기 언급된 추가 용어 및 값들이 표시되어 있다. 이 도면에서 또한 Tstart > TX인 경우에만 ΔFstart는 Tstart가 클수록 커진다. 표시된 형광 변화는 반드시 선형일 필요는 없으며, 지수함수형 붕괴도 일어날 수 있다. 도 18은 단순화를 위한 선형 함수를 보여준다.
본 발명의 방법은 강한 공간 온도 구배의 생성으로 인한 열 영동에 기초한 열-광학적 특성화에 의존하지 않는다는 점에 유의한다.
따라서, 본 발명의 제 1 양태 중 보다 바람직한 구현예에서, 단계 (b)는 다음 단계를 포함한다:
b1) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고, 제 1의 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
b2) 용액을 제 2의 미리 설정된 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
b3) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 2의 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계.
이 바람직한 구현예에서, 표지된 입자의 형광은 2가지 상이한 온도에서 다양한 농도의 리간드의 존재 하에 측정된다. 상술한 바와 같이, 이러한 절차를 통해 피펫팅 오류를 없앨 수 있다.
이 바람직한 구현예에서, 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용은 제 2의 미리 설정된 온도에서 형광 F2를 제 1의 미리 설정된 온도에서 형광 F1으로 나눈 비율, 즉 F2/F1의 리간드 농도 의존적 변화에 기초하여 측정될 수 있다.
본 발명의 제 1 양태에서, 미리 설정된 온도는 리간드가 표지된 입자에 결합하는 온도이다. 즉, 미리 설정된 온도는 표지된 입자에 대한 리간드의 결합으로 인해 형광 여기에서 형태 변화를 겪는 염료의 일부가 변화하는 온도이다. 또한, 미리 설정된 온도는 표지된 입자에 대한 리간드의 결합으로 인해 염료의 광 이성화 속도 또는 내부 전환 속도가 변하는 온도이다.
본 발명의 맥락에서, 표지된 입자에 대한 리간드의 "결합"이라는 용어는 공유 결합 또는 분자간 힘, 예컨대 이온 결합, 수소 결합 및 반데르발스 힘에 의한 결합을 지칭한다.
이하에서 "미리 설정된 온도"를 언급할 때, 본 발명의 제 1 양태 중 보다 바람직한 구현예에서 제 1의 미리 설정된 온도 및 제 2의 미리 설정된 온도에도 동일하게 적용된다.
각각의 입자의 성질에 따라 미리 설정된 온도를 선택하는 것이 유리하다. 이와 관련하여, 미리 설정된 온도는 바람직하게 입자가 용해, 언폴딩 및/또는 변경되는 온도 보다 낮아야 한다. 예를 들어 입자가 단백질인 경우, 미리 설정된 온도는 바람직하게 단백질의 열 변성 개시 온도 보다 낮게 조정될 수 있다. 개시 온도는 특히 WO 2017/055583 A1에 기재된 열 안정성 측정을 수행함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 제 1 양태에서 미리 설정된 온도는 바람직하게 -20 ℃ 내지 115 ℃, 바람직하게 0.1 ℃ 내지 100 ℃, 보다 바람직하게 10 ℃ 내지 60 ℃, 가장 바람직하게 10 ℃ 내지 40 ℃의 범위이다. 안정적인 미리 설정된 온도를 생성하는 것, 즉 미리 설정된 온도를 좁은 범위, 바람직하게 +/-1K 이내, 보다 바람직하게 +/-0.5K 이내로 제어하는 것이 바람직하다.
일반적으로 실온은 예를 들어 에어컨에 의해 능동적으로 제어되더라도 +/-1K 이상 변동한다. 따라서, 미리 설정된 온도가 실온인 경우, 안정된 미리 설정된 온도를 달성하기 위해 미리 설정된 온도의 추가 제어가 필요하다. 보다 바람직하게, 미리 설정된 온도는 실온과 상이하다. 실온은 20 ℃ 내지 25 ℃, 바람직하게는 25 ℃의 온도를 의미한다.
마찬가지로, 본 발명의 제 1 양태의 보다 바람직한 구현예에서, 가열 또는 냉각 단계에서 제 1 및 제 2 미리 설정된 온도는 -20 ℃ 내지 115 ℃, 바람직하게 0.1 ℃ 내지 100 ℃, 보다 바람직하게 5 ℃ 내지 60 ℃의 범위, 더욱 바람직하게 10 ℃ 내지 60 ℃의 범위, 가장 바람직하게 10 ℃ 내지 40 ℃의 범위이다. 제 1 미리 설정된 온도는 -20 ℃ 내지 115 ℃, 바람직하게 0.1 ℃ 내지 100 ℃, 보다 바람직하게 5 ℃ 내지 60 ℃, 더욱 바람직하게 10 ℃ 내지 60 ℃, 가장 바람직하게 10 ℃ 내지 40 ℃의 범위이다. 제 2 미리 설정된 온도는 -20 ℃ 내지 115 ℃, 바람직하게 0.1 ℃ 내지 100 ℃, 보다 바람직하게 5 ℃ 내지 60 ℃, 더욱 바람직하게 10 ℃ 내지 60 ℃, 가장 바람직하게 10 ℃ 내지 40 ℃의 범위이다. 가열 단계의 경우, 제 1의 미리 설정된 온도는 제 2의 미리 설정된 온도가 상기 상한을 초과하지 않도록 충분히 낮게 선택되는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 냉각 단계의 경우, 제 1의 미리 설정된 온도는 제 2의 미리 설정된 온도가 상기 하한을 초과하지 않도록 충분히 높게 선택된다. 상술한 바와 같이, 여기서도 제 1 및 제 2의 미리 설정된 온도는 저온 변동, 바람직하게 +/-1K 미만으로 안정적으로 제어되는 것이 유리하다.
제 1의 미리 설정된 온도와 제 2의 미리 설정된 온도의 차이는 일반적으로 +/-0.1K 내지 +/-90K의 범위이다. 이는 온도 차의 절대 값 |T2nd - T1st| 0.1K 내지 90K, 즉 온도 차이는 양 (가열) 또는 음 (냉각)일 수 있다. 바람직하게, 온도 차이는 +/-1K 및 +/-40K의 범위에 있고, 보다 바람직하게는 +/-1K 내지 +/-20K의 범위에 있다. 온도 변화에 의해 시스템이 가능한 한 적게 방해되기 때문에 저온 차이가 유리하다. 당업자는 전체 샘플을 냉각시켜 온도에 민감한 물질에 손상을 주지 않으면서 (즉, 레이저 가열에 의한) 더 높은 온도 증가 진폭이 가능하다는 것을 알고 있다.
본 발명의 제 1 양태의 바람직한 구현예에서, 가열 또는 냉각은 가열 또는 냉각 유체 또는 가스, 가열 요소(예, 가열 저항 또는 금속 가열 요소, 세라믹 가열 요소, 폴리머 PTC 가열 요소, 복합 가열 요소, 반도체 가열 요소와 같은 줄(joule) 가열에 기반한 기타 요소), 또는 열전 요소, 예를 들어 펠티어(Peltier) 요소, 또는 전자기 방사선(예, IR-LED와 같은 LED 또는 IR-레이저 또는 마이크로파와 같은 레이저)으로 이루어진 군에서 선택된 열 또는 냉각 원을 사용하여 수행될 수 있다.
펠티어 요소는 샘플을 가열 및/또는 샘플을 냉각시키는데 (예, 샘플을 환경 온도 이하로 냉각시키기 위해) 사용될 수 있으므로 바람직하게 사용된다. 특히, 펠티어 요소를 통한 전류의 방향을 반대로 함으로써 가열에서 냉각으로 전환할 수 있다. 펠티어 요소는 가열할 수 있지만 실온에서 활발하게 냉각되는 몇 안되는 요소 중 하나이다. 레이저는 바람직하게는 전자기 방사선이 샘플에 의해 직접 흡수되는 레이저인 것이 바람직한데, 왜냐하면 샘플에 기계적으로 접촉하지 않고 온도가 샘플에서 신속하고 직접적으로 변화될 수 있기 때문이다.
레이저 방사선은 샘플에 의해 직접 흡수되어 열로 변환된다, 예를 들면 파장 980nm +/- 30 nm, 1480 nm +/- 30 nm, 1550 nm +/- 30 nm, 1940 nm +/- 30 nm의 IR 레이저 광은 물에 잘 흡수되어 매우 빠르게 가열된다. 이 가열 방법은 비접촉식으로, 즉 오염 위험이 없고 빠르다. 샘플 챔버는 레이저 소자에만 투명해야 하지만 가열 요소에 의한 열 접촉과 달리 열전도율이 좋지 않아도 된다.
온도 유도 형광 강도 변화는 염료의 물리 화학적 특성에만 의존한다 (도 1). 온도 유도 형광 강도 변화의 정도는 염료의 물리 화학적 특성에만 의존하기 때문에 사용되는 열 원과 무관하다. 따라서, 정의된 IR-레이저 온-타임에서 염료의 형광 강도에 기초하여, 프로브의 온도가 추정될 수 있다.
레이저를 사용하면 나노리터 부피 범위만 가열되고 이 중 형광은 형광 광학으로 측정된다 (검출 부피는 종종 100 μm x 100 μm x 100 μm = 1 nl 부피임). 형광 광학계가 종종 형광을 검출할 수 없는 큰 부피를 가열할 필요는 없다.
본 발명의 제 1 양태의 바람직한 구현예에서, 단계 (b2) 및 (b3)은 연속적으로 또는 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 제 1 양태에 따르면, 입자는 생체 분자, 나노입자, 마이크로입자 및 소포를 포함한다. 입자는 또한 생물학적 세포 (예, 박테리아 또는 진핵 세포) 또는 아세포 단편, 바이러스 입자 또는 바이러스 및 세포 소기관 등을 포함한다. 나노입자는 또한 나노디스크를 포함한다. 나노디스크는 2개의 양친매성 단백질에 의해 스크린된 소수성 에지를 갖는 인지질의 지질 이중층으로 구성된 합성 모델 막 시스템이다.
생체 분자는 바람직하게 아미노산, 단백질, 펩타이드, 단당- 및 이당류, 다당류, 지질, 당지질, 지방산, 스테롤, 비타민, 신경 전달 물질, 효소, 뉴클레오타이드, 대사 산물, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직하게 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 효소, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직하게, (표지된 입자에서) 입자는 생체 분자, 가장 바람직하게 단백질 또는 핵산이다.
단백질은 효소(예, 탄산 탈수 효소, 베타 락타마제 TEM1, 또는 MEK1 및 p38와 같은 키나아제), 수송 단백질 (예, MBP), 억제 단백질 (예, 베타 락타마제 억제 단백질 BLIP, 아나킨라), 구조 단백질, 신호 단백질, 리간드-결합 단백질, 샤페론 (예, 열충격 단백질 HSP90), 항체 (예, 트라스투주맙) 및 수용체 (예, 인터루킨 1 수용체)로 이루어진 군에서 선택된다
핵산은 DNA, RNA, LNA 및 PNA를 포함한다. 종종 접근 불가능한 RNA로 지칭되는 잠금 핵산 (LNA)은 변형된 RNA 뉴클레오타이드이다. LNA 뉴클레오타이드의 리보스 모이어티는 2 '산소 및 4'탄소를 연결하는 여분의 브릿지로 개질된다. 펩타이드 핵산 (PNA)은 DNA 또는 RNA와 유사한 인공적으로 합성된 중합체이다. DNA 및 RNA는 각각 데옥시 리보스 및 리보스 당 골격을 갖는 반면, PNA의 골격은 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복적인 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위와 같은 펩타이드로 구성된다. 다양한 퓨린 및 피리미딘 염기는 메틸렌 브릿지 (-CH2-) 및 카르보닐기 (-(C = O)-)에 의해 골격에 연결된다.
본 발명의 맥락에서, 나노입자는 100 nm 미만의 평균 크기를 갖는 입자이다. "평균 크기"라는 용어는 예를 들어 Brookhaven Instruments의 90Plus 또는 Malvern Zetasizer Z90 입자 크기 측정기를 사용하여 동적 광산란으로 측정한 평균 유효 직경을 나타낸다. 바람직하게, 입자 크기는 1nm 내지 100nm, 바람직하게 1 내지 70nm의 범위이다. 나노입자는 유기 또는 무기 입자일 수 있다. 나노입자는 또한 이의 표면에 부착된 유기 분자를 갖는 무기 코어와 같은 복합 입자로서 존재할 수 있다.
마이크로입자는 가장 긴 치수가 1mm 미만이지만 일반적으로 100nm 이상인 미세한 입자이다. TEM (transmission electron microscopy), SEM (scanning electron microscopy) 및 QELS (quasi-elastic light scattering)를 사용하는 사이징 방법을 사용하여 마이크로입자를 특성화할 수 있다. 마이크로입자는 또한 마이크로비드 형태로 존재할 수 있다.
마이크로입자는 코팅되거나 코팅되지 않은 실리카-/유리-/생분해성 입자, 폴리스티렌-/코팅된-/유동 세포계측-/PMMA-/멜라민-/NIST 입자, 아가로스 입자, 자성 입자, 코팅 또는 코팅되지 않은 금 입자 또는 은 입자 또는 기타 금속 입자, 전이 금속 입자, 생물학적 재료, 반도체, 유기 및 무기 입자, 형광 폴리스티렌 마이크로 스피어, 비-형광 폴리스티렌 마이크로스피어, 복합 재료, 리포솜, 세포 등일 수 있다.
시판되는 미세 입자는 세라믹, 유리, 중합체 및 금속을 포함한 다양한 재료로 이용 가능하다. 일상 생활에서 발생하는 미세 입자에는 꽃가루, 모래, 먼지, 밀가루 및 가루 설탕이 포함된다. 생물학적 시스템에서, 미세 입자는 혈소판 및 내피 세포와 같이 혈류와 접촉하는 세포로부터 유래된 혈액에서 순환하는 작은 막 결합 소포(vesicle)이다.
마이크로비드는 바람직하게는 최대 치수가 5mm 미만인 고체 플라스틱 입자로 제조된다. 마이크로비드는 또한 전형적으로 직경이 0.5 내지 500 마이크로미터인 균일한 중합체 입자일 수 있다.
용어 "개질된 입자" 또는 "개질된 비드"는 특히 분자, 바람직하게는 생체 분자를 포함하거나 이에 연결된 비드 또는 입자에 관한 것이다. 이는 또한 이러한 (바이오)분자로 그러한 비드 또는 입자를 코팅하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 입자 또는 비드는 예를 들어 생체 분자, 예를 들어 DNA, RNA 또는 단백질이 입자 또는 비드에 (일부 구현예에서 구체적으로 및/또는 공유적으로) 결합할 수 있는 방식으로 변형될 수 있다. 따라서, 비드 및/또는 입자, 및 특히 이러한 비드 또는 입자에 부착되거나 연결된 분자의 특성 분석은 본 발명의 범위 내에 있다. 특히, 이러한 분자는 생체 분자이다. 따라서, 용어 "개질된 (마이크로)비드/(나노- 또는 마이크로) 입자"는 특히 분석되거나 특성화될 추가 분자를 포함하는 비드 또는 입자에 관한 것이다. 개질된 또는 비개질된 마이크로 입자/(나노- 또는 마이크로) 입자는 용액에서 생체 분자 (예, DNA, RNA 또는 단백질)와 같은 다른 입자/분자와 상호 작용할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 표지된 입자는 하나 이상의 온도 민감성 염료로 표지된 것을 사용한다. 본 발명의 맥락에서, "표지된 입자"는 형광 수단, 예를 들어 고유 형광 단을 포함하는 분자/입자, 또는 형광 단이 부착된 입자/분자에 의해 검출될 수 있는 형광적으로 표지된 분자/입자 또는 다른 분자/입자를 지칭한다. 특히, 표지된 입자는 부착된, 바람직하게 예를 들어 염료에 공유 결합되거나 폴리히스티딘-태그, FLAG-태그 등과 같은 고친화성 단백질 태그를 통해 염료에 가역적으로 결합된, 입자이다.
단백질 태그는 재조합 단백질 상에 유전적으로 이식된 펩타이드 서열이다. 이들은 폴리(His) 태그, FLAG-태그와 같은 폴리 음이온성 아미노산, V5-태그, Myc-태그, HA-태그 및 NE-태그와 같은 에피토프 태그, (비오틴 리가아제에 의한 비오틴화와 같은) 특이 효소적 변형 또는 (형광 이미징용 FlAsH-EDT2와의 반응과 같은) 화학적 변형을 허용할 수 있는 태그를 포함한다.
본 발명에 유용한 염료는 온도-의존적 형광 강도를 나타내는 염료, 즉, 냉각 또는 가열에 의해 온도가 변할 때 염료의 형광 강도가 증가 또는 감소하는 염료이다. 이 현상을 온도-관련 형광 강도 변화라고 한다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 거동을 나타내는 염료는 "온도-민감성 염료"로 지칭된다. 바람직하게는, 본 발명에 사용된 염료는 형광 강도의 온도 유도 변화뿐만 아니라 입자, 즉 표지된 입자에 결합될 때 형광 강도의 온도 의존성의 리간드 결합 유도 변화를 나타낸다.
본 발명자들은 생체 분자와 같은 입자에 결합된 염료의 온도 의존성이 리간드와 생체 분자 사이의 상호 작용 파라미터를 결정하는데 사용될 수 있음을 발견 하였다.
이론에 얽매이지 않고, 이 발견은 다음과 같은 이론적 원리에 근거한 것으로 여겨진다:
Cy5와 같은 시아닌 염료의 트랜스 형태는 형광성이지만 시스 형태는 비형광성이다. 시아닌 염료의 트랜스 형태는 다음과 같이 비편재화된 전자에 의해 발생하는 공명 또는 메소머성으로 인한 형광이다:
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폴리메틴 염료의 형광 양자 수율은 프로브가 위치한 분자 환경에 크게 의존하여 시스-트랜스 광 이성질화의 효율을 결정한다. 이성질화는 큰 분자 운동을 수반하는 활성화된 공정이므로 형광 수명은 온도 및 용매 점도에 크게 의존한다. 염료가 생체 분자와 같은 입자에 결합될 때 관찰되는 바와 같이 결합 회전이 입체적으로 방해될 때 형광의 효율이 상당히 증가한다. 단백질 상에 또는 단백질 내에 결합된 염료 분자는 여기-상태 C=C 회전으로부터 입체적으로 방해되며, 시스 이성질체로 전환될 가능성이 적다. 온도가 높을수록 단백질에 결합된 염료의 진동 자유도가 증가하여 '짙은' 시스 상태로의 전환율이 높아져 측정된 형광이 감소한다. 실시예에 나타낸 실험에 의해 입증된 바와 같이, 생체 분자의 리간드-유도 입체 형태 변화는 염료의 형광 강도를 조절한다 (이는 단백질에 결합된 염료의 진동 자유도의 변화의 결과임). 이 때문에, 단일 온도에서의 결합 친화도의 측정이 가능하다. 염료의 온도 의존성만이 리간드와 생체 분자 사이의 상호 작용 파라미터를 결정하는데 사용되는 접근법은 이전에 보고된 바 없다.
일단 형성되면, 광 이성질체는 열역학적으로 안정한 올(all)-트랜스 이성질체를 얻기 위해 열 역이성질화 반응을 겪는다. 다른 두 공정에 대한 광 이성질체 화의 상대적 효율은 온도, 용매 점도 및 입체 장애를 야기할 수 있는 치환기의 존재에 의존한다. 중요하게, 온도가 낮을수록 이성질화 비율이 낮아지고 형광 수율이 높아진다.
염료의 온도 의존성, 즉 형광 강도의 변화에 따른 온도 변화에 반응하는 염료의 고유 특성은 전적으로 염료의 화학 구조에 의존한다. 형광 분자의 온도 의존성은 그 치환기의 회전 자유에 의해 영향을 받는다. ATTO647N, ATTO655 및 CF640R과 같은 (단, 이에 제한되지는 않음) 강성이 강화된 구조를 갖는 염료는 형광 강도의 변화가 무시할 정도로 온도 상승에 반응한다 (도 2). 따라서, 이들 염료는 본 발명의 목적에 적합하지 않다. 덜 단단한 구조를 갖는 염료(플루오레세인, 오레곤 그린 488, DY495, 로다민, TAMRA, IR640 등, 이에 제한되지 않음)는 온도 증가 시 형광 강도의 현저한 감소를 나타낸다. 가장 민감한 염료는 폴리메틴 염료 계열 (Cy3, monosulfoCy3, DY567, Cy5, monosulfoCy5, DY630, DY647P1, DY650, Alexa 647 및 DyLight 655 B1-B4 등, 이에 제한되지 않음)에 속한다. 이 염료의 형광은 온도에 크게 의존한다 (도 2).
염료의 온도 의존성은 입자 (생체 분자)와의 접합에 의해 조절되어 독특한 열-광학 프로파일을 생성한다 (도 15). 폴리메틴 염료의 대표로서 모노술포Cy5에 대해 나타낸 바와 같이 생체 분자의 존재 하에 온도-유도 형광 강도 변화가 강하게 감소되며, 이는 염료에 접합된 생체 분자의 특성에 크게 의존한다 (도 15A). SeTau와 같은 스쿠아레인 로탁산의 형광 강도는 온도 변화에 훨씬 덜 민감하다. 온도에 대한 민감도는 SeTau가 생체 분자와 접합될 때 크게 변하지 않는다 (도 15B).
크산텐 염료(예, 플루오레세인, 로다민, TAMRA 및 DY495) 및 폴리메틴 염료? (예, Cy3, monosulfoCy3, DY547, Cy5, monosulfoCy5, DY630, DY631 및 DY647P1)와 같지만 이에 제한되지 않는 중간 정도 내지 강한 온도 의존성을 갖는 염료는 열 광학 조사에 적합하다. 온도 의존성은 생체 분자와의 접합에 의해 크게 영향을 받는다.
온도 의존성이 큰 염료 (DyLight 655 B3, IR650 등, 이에 제한되지 않음)는 온도 감도가 생체 분자와의 접합에 의해 영향을 받지 않기 때문에 열-광학 조사에 적합하지 않을 수 있다.
따라서 온도 유도 형광 강도 변화를 야기하는 염료의 온도 의존성이 요구되지만 열-광학 연구를 위한 최적의 염료에는 충분하지 않다. 염료와 생체 분자의 상호 작용은 염료의 열광학적 프로파일의 효과와 감도를 독특하게 결정한다 (도 5 및 도 13). 염료의 온도 의존성 만이 리간드와 생체 분자 사이의 상호 작용 파라미터를 결정하기 위해 사용되는 본 접근법은 이전에 설명되지 않았다.
본 발명에 사용될 수 있는 염료는 바람직하게 > 0.3%/K, 더욱 바람직하게 > 0.5%/K, 가장 바람직하게는 > 1%/K인 유리 형태의 온도 의존성을 나타내어야 한다.
염료의 온도 의존성은 표지된 입자와의 접합에 의해 조절되어야 한다. 염료는 바람직하게 > 0.3%/K, 더욱 바람직하게 > 0.5%/K, 가장 바람직하게 > 1%/K인 접합된 형태의 온도 의존성을 나타내어야 한다.
염료는 바람직하게 표지(라벨링) 시 표지된 입자의 응집을 유발하는 경향이 낮아야 한다.
설포네이트 또는 유사한 기의 염료로의 혼입은 표지된 생체 분자의 응집 감소를 초래하지만, 생체 분자와의 접합 시 염료의 낮은 순 전하 (바람직하게 ≥ -2)가 염료의 최적의 열-광학 프로파일에 바람직하다.
리간드↔표지된 입자 상호 작용의 열-광학 측정 또는 생체 분자의 열적 언폴딩을 위한 최적의 염료는 폴리메틴 염료(공액 이중 결합을 갖는 메틴 기(=CH-)로 구성된 사슬을 함유하는 유기 화합물로 정의됨), 바람직하게 비제한적으로 대칭 및 비대칭 시아닌 염료, 즉 일반식 R2N[CH=CH]nCH=N+R2 ↔ R2N+=CH[CH=CH]nNR2 (여기서, n은 소수임)(여기서, 질소 및 선택적으로 공액 사슬의 일부는 이미다졸, 피리딘, 피롤, 퀴놀린 및 티아졸 등이나, 이에 제한되지 않는 일반적으로 헤테로사이클릭 시스템의 일부임)를 갖는 합성 염료에 속한다.
리간드↔표지된 입자 상호 작용의 열-광학 측정 또는 생체 분자의 열적 언폴딩에 대한 최적의 염료는 또한 크산텐 염료, 즉 플루오레세인 및 로다민계 염료를 포함하나 이에 제한되지 않는 크산텐의 유도체이며, 이의 치환기의 회전 자유도로 특성화된 유기 화합물에 속할 수 있다.
열-광학 판독 값의 감도는 염료와 생체 분자 사이의 스페이서의 길이와 화학적 특성을 변경하여 조작할 수 있다 (도 10 및 14). Z-Cy5 내 쯔비터이온 특성과 같은 독특한 화학적 특성를 갖는 긴 링커 기는 고전적인 헥사노일 스페이서를 갖는 Cy5와 비교하여 리간드-유도 형태 변화를 광범위하게 검출하는데 기여한다 (도 10A). 오레곤그린 488 또는 TAMRA처럼 아주 짧은 스페이서는 생체 분자의 리간드-유도 형태 변화로 인해 미세 환경 변화의 효율적인 감지를 막을 수 있다 (도 10B-C). 염료와 생체 분자 사이의 스페이서의 길이 및 화학적 특성은 열-광학 프로파일링의 감도를 결정한다. 접합 시 염료와 생체 분자 사이의 거리를 지배하는 스페이서 길이는 가장 바람직하게는 2개의 CH2 기 보다 길어야 한다.
생체 분자에 의한 염료의 온도 의존성의 조절은 생체 분자에 접합 후 염료가 나타내는 순 전하에 의존한다. 설포네이트기의 수의 증가는 실험에서 입증된 바와 같이 열-광학 판독의 품질과 음의 상관 관계가 있으며 (도 8), 여기서 IL-R1은 벤조피릴륨 코어 및 다수의 설포네이트 기를 함유하는 폴리메틴 염료로 표지되었다. 표지된 IL-R1에 대한 리간드 아나킨라의 친화도를 측정하였다. 더 큰(>2) 수의 설포네이트 기는 열-광학 프로파일링에 대한 염료의 적용성을 감소시켰다. 1개와 2개의 설포네이트 기를 각각 갖는 카보시아닌 염료 모노설포Cy5와 DY647P1의 비교에 의해 유사한 효과가 나타나는데, 이는 설포네이트 기의 수가 열-광학 연구를 위한 염료의 적용성을 결정적으로 결정한다는 것을 보여준다 (도 11).
특정 염료는 특정 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)를 달성하기 위해 특정 응용 분야에 사용될 수 있다. 잡음(noise)은 리간드의 결합에 의해 야기되지 않는 열-광학적 신호의 변화로 정의된다. 도 12에 도시된 바와 같이, 비대칭 폴리메틴 염료 DY630 및 DY631은 단백질-단백질 상호 작용을 검출하는 분석에서 우수하지만 (도 12A), 단백질에 대한 소분자의 결합을 검출하는 분석에서 열-광학 프로파일이 열악하다 (도 12B). 한편, 대칭 카보시아닌 염료 모노설포Cy5는 소분자가 단백질에 결합하는 것을 검출하는 분석에서 우수한 프로파일을 나타낸다.
본 발명에 사용될 수 있는 온도-민감성 염료는 바람직하게 폴리메틴 염료 및 크산텐 염료로 이루어진 군에서 선택된다. 폴리메틴 염료는 바람직하게 대칭 및 비대칭 시아닌 염료 또는 벤조피릴륨 코어를 갖는 폴리메틴 염료를 포함한다. 크산텐 염료는 로다민 염료 및 플루오레세인 염료를 포함한다.
벤조피릴륨 코어를 갖는 바람직한 폴리메틴 염료는 크로메오 P543, DY630, DY631, DY650, DyLight 655 B2, 디라이트(DyLight) 655 B3을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 시아닌 염료는 시아닌 2, Cy3, 모노설포 Cy3, Cy5, 모노설포 Cy5 (버전 1), 모노설포 Cy5 (버전 2), 디설포 Cy5, Z-Cy2, Z-Cy5, 모노설포 Z-Cy5, Alexa647, DY547P1 및 DY647P1을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 크산텐 염료는 TAMRA, TAMRA X, DY495 및 오레곤 그린을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 보다 바람직한 크산텐 염료는 TAMRA X 및 DY495를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특히 바람직한 염료는 DY630, DY631, 디라이트 655 B2, 디라이트 655 B3, 시아닌 2, Z-Cy2, Z-Cy5, 모노설포 Cy5 (버전 1), 모노설포 Cy5 (버전 2) 및 TAMRA X이다. 도 19a 내지 19e는 상기 언급된 염료의 구조식을 나타낸다. 도 19a 내지 19e에서, 염료는 때때로 스페이서기가 없는 순수한 염료, 때때로 스페이서 및 반응성 기를 포함하는 반응성 염료로서 도시된다.
본 발명의 제 1 양태에 따르면, 본 발명의 표지된 입자는 바람직하게 일반식 (I), (IIa), (IIb) 또는 (III)으로 표시되는 염료로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염료로 표지된다:
(I)
여기서
X1은 O, S 또는 CR5R6이고;
X2는 O, S 또는 CR7R8이며;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 및 치환될 수 있는 알킬기로 이루어진 군에서 선택되고;
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기 (바람직하게는 C1-4 알킬), 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되며;
단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8 중 적어도 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길고;
a는 0 내지 4의 정수이며;
b는 0 내지 4의 정수이고; 및
n은 1 내지 3, 바람직하게 1 또는 2의 정수이며;
(IIa)
(IIb)
여기서
X3 및 X4 중 하나는 NR9이고 X3 및 X4 중 다른 하나는 O, S 또는 CR13R14이고;
R9는 수소 및 치환될 수 있는 알킬기로 이루어진 군에서 선택되며;
R10, R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기 (바람직하게는 C1-4 알킬), 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되고;
단, R9, R10, R11, R12, R13 및 R14 중 적어도 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길고;
c는 0 내지 4의 정수이며;
d는 0 내지 2의 정수이고;
e는 0 내지 4의 정수이며; 및
m은 1 내지 3, 바람직하게는 1 또는 2의 정수이고; 및
(III)
여기서
Y는 OR18 또는 NR19R20이며;
Z는 O 또는 +NR21R22이고;
R15, R16 및 R17은 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기 (바람직하게는 C1-4 알킬), 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되며;
단, R17 중 적어도 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고;
R18은 H 또는 알칼리 금속 이온이며,
R19, R20, R21 및 R22는 각각 독립적으로 수소 및 치환될 수 있는 알킬기로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게 R19, R20, R21 및 R22는 각각 동일하고;
f는 0 내지 3의 정수이며;
g는 0 내지 3의 정수이고; 및
h는 1 내지 5의 정수이다.
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R19, R20, R21 및 R22의 알킬기는 바람직하게 제한 없이 메틸, 에틸, 프로필, n-부틸, tert-부틸, 메톡시 에틸과 같이 치환될 수 있는 C1-4 알킬기이다.
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R19, R20, R21 및 R22의 기는 바람직하게 표지된 입자에 리간드의 결합 시 형광 강도 변화를 방해할 수 있는 큰 입체 장애를 도입하는 아릴기와 같은 큰 기를 함유하지 않는다.
R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16 및 R17의 알케닐기는 바람직하게 치환될 수 있는 C1-4 알케닐기이다. R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16 및 R17의 알톡시기는 바람직하게 치환될 수 있는 C1-4 알콕시기이다.
R1 및 R2의 알킬기는 알콕시 및 술포네이트, 바람직하게는 메톡시 및 술포네이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8의 카르복실레이트 에스테르기, 알킬기, 알케닐기 또는 알콕시기는 바람직하게 치환기가 없는 옥소기 및 술포네이트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
R9의 알킬기는 R1 및 R2의 알킬기와 동일한 치환기로 치환될 수 있고, 바람직하게 하나 이상의 설포네이트기로 치환될 수 있다.
R10, R11, R12, R13 및 R14의 카르복실레이트 에스테르기, 알킬기, 알케닐기 또는 알콕시기는 R3, R4, R5, R6, R7 및 R8의 알킬기, 알케닐기 또는 알콕시기와 동일한 치환기로 치환될 수 있고, 바람직하게 하나 이상의 알킬기, 바람직하게 메틸기로 치환될 수 있다.
R15, R16 및 R17의 카르복실레이트 에스테르기, 알킬기, 알케닐기 또는 알콕시기는 R3, R4, R5, R6, R7 및 R8의 알킬기, 알케닐기 또는 알콕시기와 동일한 치환기로 치환될 수 있고, 바람직하게 치환기를 갖지 않을 수 있다.
R19, R20, R21 및 R22의 알킬기는 R1 및 R2의 알킬기와 동일한 치환기로 치환될 수 있으며, 바람직하게 치환기를 갖지 않을 수 있다.
스페이서기는 염료가 입자에 접합되는 기이다. 가장 바람직하게 상기 스페이서기는 헥사노일 스페이서기와 같은 2개의 CH2- 기 보다 길다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "술폰산" 및 "술포네이트기"는 상호 교환적으로 사용되며 "-SO3 -"기를 지칭한다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 이 기는 음전하이다. 이러한 음전하는 표지된 입자 (내부 염) 내에 상응하는 양전하를 요구하거나 상응하는 양이온이 용액에 존재해야 한다. 양이온은 표지된 입자를 포함하는 용액에 가용성이고 바람직하게 암모늄 이온, 알칼리 금속 이온 및 알칼리 토금속 이온, 가장 바람직하게 나트륨 또는 칼륨 이온으로부터 선택될 수 있는 임의의 이온일 수 있다. 마찬가지로, 전체 양전하를 갖는 표지된 입자는 용액에서 상응하는 음이온을 필요로 한다. 음이온은 표지된 입자를 포함하는 용액에 가용성인 임의의 이온일 수 있으며, 바람직하게 할로겐 이온, 술페이트 이온, 헥사플루오로포스페이트 및 테트라플루오로보레이트 이온으로부터 선택될 수 있다.
일반식 (I)의 염료는 바람직하게 일반식 (I')로 표시되는 염료이다:
(I')
여기서
X1은 O 또는 CR5R6이고;
X2는 O 또는 CR7R8이며;
R1, R2, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 치환될 수 있는 C1-20 알킬기이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 및 술폰산 또는 이의 염으로 이루어진 군에서 선택되고;
단, R1, R2, R5, R6, R7 및 R8 중 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서 기는 2개의 CH2- 기 보다 길고; 및
n은 1 또는 2와 같은 정수이다.
일반식 (IIa) 또는 (IIb)의 염료는 바람직하게 일반식 (IIa') 또는 (IIb')로 표시되는 염료이다:
(IIa')
(IIb')
여기서
X3 및 X4 중 하나는 NR9이고 X3 및 X4 중 다른 하나는 CR13R14이고;
술포네이트기는 NR9에 대하여 4-위치에 있으며;
R9는 치환될 수 있는 C1-C20 알킬기이고;
R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기(바람직하게 C1-4 알킬), 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되며;
단, R9, R13 및 R14 중 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길고;
d는 0 내지 2의 정수이며;
e는 0 내지 3의 정수이고; 및
m은 1 또는 2와 같은 정수이다.
더욱 바람직하게, 일반식 (IIa') 또는 (IIb')의 염료는 일반식 (IIa") 또는 (IIb")로 표시되는 염료이다:
(IIa")
(IIb")
여기서
X3 및 X4 중 하나는 NR9이고 X3 및 X4 중 다른 하나는 CR13R14이고;
술포네이트기는 NR9에 대하여 4-위치에 있으며;
R9는 치환될 수 있는 C3-6 알킬기이고;
R13 및 R14는 각각 독립적으로 치환될 수 있는 C1-4 알킬기이며;
단, R9, R13 및 R14 중 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길고; 및
m은 1 또는 2와 같은 정수이다.
일반식 (III)의 염료는 바람직하게 일반식 (III')으로 표시되는 염료이다:
(III')
여기서,
Y는 OH 또는 N(CH3)2이고;
Z는 O 또는 +N(CH3)2이며;
R15 및 R16은 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고;
R17은 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이며; 및
R17a는 카르복시기 또는 이의 염이다.
바람직하게, 상기 일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 염료에서 스페이서기는 치환될 수 있는 C4 내지 C20의 알킬렌 사슬, 여기서 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자는 독립적으로 지환족기, 아릴기, 헤테로사이클릭기, 헤테로아릴기 또는 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자로 대체될 수 있다. 보다 바람직하게, 일반식 (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 염료는 이러한 바람직한 스페이서기를 포함한다. 더욱 더 바람직하게 일반식 (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 염료는 생체 분자에 접합된, 바람직하게 단백질에 접합된 이러한 바람직한 스페이서기를 포함한다.
보다 더 바람직하게, 일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 스페이서기는 치환될 수 있는 C4 내지 C6 알킬렌 사슬이고, 여기서 하나의 탄소 원자는 하나의 아릴기로 대체될 수 있다. 더욱 더 바람직하게 일반식 (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 염료는 보다 더 바람직한 이러한 스페이서기를 포함한다. 더욱 바람직하게 일반식 (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 염료는 생체 분자에 접합된, 보다 더 바람직하게 단백질에 접합된 이 바람직한 스페이서기를 포함한다.
바람직하게, 상기 일반식 (III) 또는 (III')의 염료에서 스페이서기는 치환될 수 있는 C2 내지 C10 알킬렌 사슬이고, 여기서 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자는 독립적으로 지환족기, 아릴기, 헤테로아릴기, 헤테로사이클릭기 또는 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자로 대체될 수 있다. 보다 바람직하게, 일반식 (III')의 염료는 이러한 바람직한 스페이서기를 포함한다. 보다 더 바람직하게, 일반식 (III')의 염료는 생체 분자에 접합된, 바람직하게 단백질에 접합된 이러한 바람직한 스페이서기를 포함한다.
더욱더 바람직하게는, 상기 화학식 (III) 또는 (III')의 염료에서 스페이서 기는 치환될 수 있는 C3 내지 C7 알킬렌 사슬이고, 여기서 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자는 독립적으로 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자로 대체될 수 있다. 보다 더 바람직하게, 일반식 (III')의 염료는 이러한 보다 바람직한 스페이서기를 포함한다. 가장 바람직하게, 일반식 (III')의 염료는 생체 분자에 접합된, 더욱 바람직하게 단백질에 접합된 이러한 더욱 바람직한 스페이서기를 포함한다.
일반식 (III) 또는 (III')의 염료는 또한 일반식 (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 염료의 스페이서기와 관련하여 정의된 스페이서기를 포함할 수 있다.
일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa"), (IIb"), (III) 또는 (III')의 스페이서기는 일반적으로 두 개의 연속 헤테로원자를 포함하지 않는다. 임의의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14 및 R17 중 하나의 스페이서기는 일반적으로 메틸렌기를 통해 염료 구조에 결합된 기이며, 즉, 스페이서기 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14 및 R17은 말단에서 시작하며, 이는 메틸렌기로, 염료 구조에 근접한다. 스페이서기의 말단, 즉 입자에 부착된 스페이서기의 말단은 종종 카보닐기이다. 또한, 일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa"), (IIb"), (III) 또는 (III')은 바람직하게 치환될 수 있는 C4 내지 C20 알킬렌 사슬이고, 여기서 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자는 독립적으로 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자로 대체될 수 있으며, 상기 스페이서기의 말단은 TrisNTA-Ni 착물이며, 이는 3개의 Ni(II) 이온을 포함한다. 다시 말해, 스페이서기는 TrisNTA647 및 trisNTA 오레곤 그린 488에 대한 도 19e에 예시적으로 도시된 바와 같이 염료에 부착된다. TrisNTA는 Ni 이온을 통해 입자에 접합된다.
일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa"), (IIb"), (III) 또는 (III')의 스페이서기의 치환기는 옥소기, C1-4 알킬렌술포네이트 및 C1-4 알킬로부터 선택될 수 있다.
일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 스페이서기의 C4 내지 C20 알킬렌 사슬은 옥소기, C1-4 알킬렌술포네이트 및 C1-4 알킬, 바람직하게 옥소기, 메틸렌술포네이트 및 C1-4 알킬로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 스페이서기의 C4 내지 C6 알킬렌 사슬은 각각의 C4 내지 C20 알킬렌 사슬과 동일한 치환기로 치환될 수 있고, 바람직하게 옥소기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 상기 C4 내지 C20 알킬렌 사슬에서 임의의 N-헤테로원자는 수소 및 C1-4 알킬로 이루어진 군에서 선택된 치환기로 치환될 수 있다.
일반식 (III) 또는 (III')의 스페이서기의 C2 내지 C10 알킬렌 사슬은 옥소기 및 C1-4 알킬, 바람직하게 옥소기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
일반식 (III) 또는 (III')의 상기 C2 내지 C10 알킬렌 사슬에서 임의의 N-헤테로원자는 수소 및 C1-4 알킬, 바람직하게 수소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa"), (IIb"), (III) 또는 (III')의 스페이서기의 알킬렌 사슬에서 임의의 지환족기, 아릴기, 헤테로아릴기, 헤테로사이클릭기는 옥소기, 및 C1-4 알킬, 바람직하게는 옥소기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
염료는 Dyomics, Thermo Fischer Scientific, Lumiprobe, Cyandye 또는 Kerafast에서 얻을 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 사용된 염료는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. DY631과 같은 벤조피릴륨 염료의 구체적인 제조 방법은 US 6,924,372 B2에 기술되어 있으며; DY647P1 및 모노설포 DY647P1의 제조는 US 2013/0251637 A9에 기재되어 있고; Z-Cy5와 같은 염료의 합성은 US 8,197,758 B2에 기재되어 있으며; 모노설포Cy5의 제조 방법은 US 5,268,486에 제공된다. 이들 문헌들은 그 전체가 참고문헌으로 포함된다.
표지된 입자는 (생체 분자와 같은) 입자에 염료의 접합을 가능하게 하는 반응성기를 갖는 반응성 염료와 입자를 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 특히, 바람직한 반응성 기는 실시예에서 사용된 N-하이드록시숙신이미드 활성화 에스테르 (NHS) 기이다. 그러나, 반응성 기는 NHS로 제한되지 않지만, 말레이미드, 아미드, 술폰아미드, 우레아 및 N-히드록시숙신이미드 활성화 에스테르, 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 아지드, 알킨, 히드라지드, 카르복실산 및 아민기로 티오 우레아 형성과 같이 염료를 입자에 접합시킬 수 있는 다른 기가 사용될 수 있다. 원칙적으로, 생체 분자와의 접합을 가능하게 하는 염료의 임의의 변형이 사용될 수 있다. 생체 분자를 변형시키는 방법은 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009; 48(38): 6974?6998의 E. M. Sletten 및 C. R. Bertozzi에 의해 연구되었으며, 이는 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
예시의 일반적인 단백질 표지 절차는 다음 단계를 포함한다:
1. 상응하는 라벨링 버퍼에서 입자를 제조하는 단계;
2. 염료를 첨가하고 입자와 혼합하는 단계;
3. 특정 온도 (주로 얼음, RT 또는 37 ℃)에서 특정 시간 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하는 단계; 및
4. 겔 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피와 같은 비제한적인 정제 방법에 의해 비-결합 염료를 제거하는 단계; 용출 버퍼로 어세이 버퍼가 사용될 수 있다.
단백질-태그의 라벨링을 위해, 모든 염료가 태그에 결합되는 화학량론적 라벨링 비율로 인해 유리 염료의 제거가 일반적으로 필요하지 않다.
염료는 스페이서기를 통해 입자에 부착되기 때문에, 상기 언급된 반응성 기는 일반적으로 반응성 염료 내 스페이서기의 다른 말단에 부착되고, 즉 스페이서기는 하나의 말단이 염료에, 다른 하나의 말단이 반응성 기에 부착된다. 반응성 기를 갖는 반응성 염료와 입자의 반응 후, 염료는 스페이서기를 통해 입자에 부착된다.
반응성 염료는 단백질 라벨링 키트에 제공될 수 있다. 각 키트는 다중 단백질 라벨링 반응, 예컨대 2 내지 8개, 바람직하게 3 내지 5개의 단백질 라벨링 반응에 충분한 물질을 함유할 수 있다. 사용된 단백질의 양에 따라, 대략 1000 마이크로스케일 실험을 위한 충분한 재료가 제공될 수 있다.
라벨링 키트에는 반응성 염료가 주성분으로 포함되어 있다. 바람직하게, 상기 키트는 본 발명의 제 5 양태에서와 같이, 하나 이상의 염료, 예를 들어 2개 또는 3개의 상이한 염료, 보다 바람직하게 2개의 상이한 염료를 개별적으로 포함할 수 있다. 단백질 라벨링 키트는 바람직하게는 본 발명의 방법 중 적어도 하나에서 키트의 사용을 설명하는 사용 설명서를 추가로 포함한다.
또한, 키트는 종종 버퍼 교환 컬럼, 정제 컬럼, 라벨링 버퍼, 어댑터 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함한다.
단백질과 같은 표적 생체 분자에 대한 리간드 결합은 아미노산 측쇄, 루프 또는 도메인 이동과 같은 광범위한 형태 변화를 야기할 수 있다. 본 발명의 제 1 양태에서 사용될 수 있는 리간드는 이온, 금속, 화합물, 약물 단편 (생물학적 표적에 약하게 결합할 수 있는 작은 화학 단편), 탄수화물, ATP (저분자량을 갖는 유기 화합물 (< 900 달톤)와 같은 소분자; 소분자는 생물학적 과정을 조절하는데 도움을 줄 수 있으며 일반적으로 1nm 정도의 크기를 가짐), 약물, 전구 약물, 지질, 생체 분자, 케모카인 및 사이토카인과 같은 단백질, 펩타이드, 펩토이드, 효소, 항원, 보조 인자, 핵산, 앱타머, 억제제, Fc 수용체, ssDNA, 나노입자, 리포솜, 단층 소포 (작은 단층 소포 (SUV) 및 거대한 단층 소포 (GUV) 포함), 중합체, 유기 분자, 무기 분자, 금속 착물, 호르몬, 향미제, 방향제, 입자 및 (마이크로)비드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다(하지만, 이에 제한되지는 않는다). 바람직하게, 상기 리간드는 이온, 금속, 화합물, 약물 단편, 탄수화물, 소분자, 약물, 전구 약물, 지질, 단백질, 펩타이드, 펩토이드, 효소, 핵산, 앱타머, 호르몬, 향미제 및 방향제로 이루어진 군에서 선택된다.
다음에서, 입자-리간드 조합은 "입자→리간드" 표기법을 사용하여 나타내며, 즉 상기 입자는 화살표의 왼쪽에 표시되고 해당 리간드는 화살표의 오른쪽에 표시된다.
바람직한 입자→리간드 조합은 효소→지질, 수용체→호르몬, 수용체→케모카인, 효소→억제제, 수용체→신경 전달 물질, 수용체→사이토카인, 효소→이온, 수용체→이온, 수용체→아미노산, 효소→보조 인자, 수용체→지질, 수용체→스테롤, 효소→단편, 수용체→펩타이드, 수용체→단편, 효소→대사 산물, 수용체→수용체, 수용체→당지질, 효소→DNA, 수용체→방향제, 수용체→전구 약물, 효소→RNA, 수용체→ 약물, 효소→단-/이- 또는 다당류, 효소→지방산, 효소→비타민, 효소→전구 약물, 효소→약물, 리포솜→단백질, 수송 단백질→기질, 항체→항원, 바이러스 입자→수용체, 바이러스→구조 단백질, 항체→Fc 수용체, 샤페론→ATP, ssDNA→ssDNA, 앱타머→리간드, 샤페론→이온, RNA→소분자, 다당류→소분자, 샤페론→단백질, DNA→소분자, 구조 단백질→구조 단백질, 신호 단백질→신호 단백질, 신호 단백질→소분자, 신호 단백질→전구 약물, 신호 단백질→약물, 신호 단백질→지질, 구조 단백질→이온, 나노입자→단백질, 세포 소기관→단백질, 나노입자→DNA, 세포 소기관→지질, 나노입자→RNA로 이루어진 군에서 선택된다. 보다 바람직한 입자→리간드 조합은 효소→지질, 수용체→호르몬, 수용체→케모카인, 효소→억제제, 수용체→신경 전달 물질, 수용체→사이토카인, 효소→이온, 수용체→이온, 수용체→아미노산, 효소→보조 인자, 수용체→지질, 수용체→스테롤, 효소→단편, 수용체→펩타이드, 수용체→단편, 효소→대사 산물, 수용체→수용체, 수용체→당지질, 효소→DNA, 수용체→방향제, 수용체→전구 약물, 효소→RNA, 수용체→ 약물, 효소→단-/이- 또는 다당류, 효소→지방산, 효소→비타민, 효소→전구 약물, 효소→약물, 리포솜→단백질, 수송 단백질→기질, 항체→항원, 바이러스 입자→수용체, 바이러스→구조 단백질, 항체→Fc 수용체, 샤페론→ATP, ssDNA→ssDNA, 앱타머→리간드, 샤페론→이온, RNA→소분자, 샤페론→단백질, DNA→소분자, 구조 단백질→구조 단백질, 신호 단백질→신호 단백질, 신호 단백질→소분자, 신호 단백질→전구 약물, 신호 단백질→약물, 신호 단백질→지질, 구조 단백질→이온으로 이루어진 군에서 선택된다.
가장 바람직한 입자→리간드 조합은 효소→지질, 수용체→호르몬, 수용체→케모카인, 효소→억제제, 수용체→신경 전달 물질, 수용체→사이토카인, 효소→이온, 수용체→이온, 수용체→아미노산, 효소→보조 인자, 수용체→지질, 수용체→스테롤, 효소→단편, 수용체→펩타이드, 수용체→단편, 효소→대사 산물, 수용체→수용체, 수용체→당지질, 효소→DNA, 수용체→방향제, 수용체→전구 약물, 효소→RNA, 수용체→ 약물, 효소→단-/이- 또는 다당류, 효소→지방산, 효소→비타민, 효소→전구 약물, 효소→약물, 리포솜→단백질, 수송 단백질→기질, 항체→항원, 항체→Fc 수용체, 샤페론→ATP, ssDNA→ssDNA, 앱타머→리간드, 샤페론→이온, RNA→소분자, 샤페론→단백질, DNA→소분자, 구조 단백질→구조 단백질, 신호 단백질→신호 단백질, 신호 단백질→소분자, 신호 단백질→전구 약물, 신호 단백질→약물, 신호 단백질→지질, 구조 단백질→이온으로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 가장 바람직한 입자→리간드 조합에서, 입자 및 리간드는 바람직하게 진핵 세포, 보다 바람직하게 인간, 마우스, 래트 또는 영장류 세포로부터; 또는 플라스모디엄(Plasmodium) ssp., 트리파노소마(Trypanosoma) ssp., 비브리오(Vibrio) ssp., 살모넬라(Salmonella) ssp., 결핵균(Mycobacterium tubercolosis) 및 지카(Zika), 에볼라(Ebola), 마버그 바이러스(Marburg virus), 니파(Nipah)와 같은 바이러스 및 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스(MERS-CoV), 크림-콩고 출혈열(CCHF), 리프트 밸리 열(RVF), HIV와 같은 병원체로부터 유래된다.
염료의 온도 의존성은 염료가 존재하는 로컬 환경에 영향을 받기 때문에, 리간드-유도 입체 형태 변화는 시스템 내 리간드의 농도에 따라 독특한 열-광학 프로파일로 변환될 것으로 예상된다 (도 13). 단백질 EcoSSB에 대한 Cy5-ssDNA의 결합에 대해 나타낸 바와 같이 (즉, 대장균 단일 가닥 DNA 결합 단백질, 도 4), 염료가 존재하는 로컬 환경에 의한 염료의 온도 의존성의 조절은 열 광학 접근법과 열 원으로서 펠티어 디바이스 또는 IR 레이저를 사용하여 결합 친화도를 결정하는데 사용될 수 있다 (도 4). 프로브가 냉각될 때 열 광학 방식을 적용할 수도 있다. 도 9와 같이, 프로브를 IR-레이저로 예열하고 냉각 시 온도 유도 형광 변화를 모니터링하였다. 추가 냉각 원인 펠티어 디바이스로는 냉각 유체 또는 가스 (공기 포함)를 사용할 수 있다.
단백질과 같은 생체 분자의 열적 언폴딩은 큰 형태 변화를 특징으로 한다. 염료의 온도 의존성은 로컬 미세 환경에 의해 영향을 받으며 이 환경은 언폴딩 시 변하기 때문에, MBP 및 TEM1에 대해 나타낸 바와 같이 열-광학 접근법은 생체 분자의 녹는 온도를 결정하는데 사용될 수 있다 (도 16).
본 발명의 제 1 양태의 방법에 사용되는 샘플은 표지된 입자 및 리간드를 포함하는 용액이다. 여기서, 표지된 입자는 용액 내 용해 또는 분산될 수 있다. 대안적으로, 표지된 입자는 리간드를 함유하는 용액과 접촉되는 고체 지지체 상에 고정 될 수 있다. 바람직하게, 표지된 입자는 용액 내 용해 또는 분산된다. 수용액은 버퍼를 사용하여 바람직하게 2 내지 10, 보다 바람직하게 4 내지 10, 더욱 바람직하게 5 내지 9, 가장 바람직하게 6 내지 8.5의 pH 값으로 조정된다.
본 발명의 제 1 양태에서, 용액 내 표지된 입자의 바람직한 농도는 10 피코몰 내지 1 마이크로몰, 보다 바람직하게 100 피코몰 내지 100 나노몰이다. 리간드의 농도는 바람직하게 0.01 피코몰 내지 1 몰, 보다 바람직하게 1 피코몰 내지 100 밀리몰, 더욱 바람직하게 10 피코몰 내지 10 밀리몰이다. 샘플은 바람직하게 다중-웰 플레이트, 미세 유체 칩, 모세관, 큐벳, 반응 튜브, 피펫 팁, 미세 유체, 액적 및 반투명 용기로 이루어진 군에서 선택된 샘플 챔버에 제공된다. 반투명 용기는 유리 용기 또는 플라스틱 용기일 수 있다.
형광 여기 빔의 방향으로 1㎛ 내지 500㎛, 특히 1μm 내지 250μm, 특히 1μm 내지 100μm, 특히 3μm 내지 50μm, 특히 5μm 내지 30μm의 두께를 갖는 챔버 내에 샘플 프로브를 제공하는 것이 유리하다. 당업자는 챔버라는 용어가 또한 예를 들어 모세관, 미세 유체 칩 또는 다중-웰 플레이트와 관련이 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "형광"은 "형광" 그 자체로 제한되지 않고 본원에 개시된 수단, 방법 및 디바이스는 다른 수단, 특히 인광(phosphorescence)과 같은 발광의 사용에 의해 사용될 수 있음을 당업자는 이해하고 있다. 따라서, "표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 여기된 입자의 제 1 형광을 검출 및/또는 측정하는"이라는 용어는 상기 확인된 방법에서의 "여기 단계"와 관련되며, 상응하는 발광의 여기를 포함할 수 있고, 즉, 여기 방출은 다음 방출의 검출 보다 짧은 파장으로 수행된다. 따라서, 본 발명과 관련하여 "입자의 제 2 형광을 검출 및/또는 측정하는"이라는 용어는 여기 후에 상기 방출을 검출하는 단계를 의미한다. 당업자는 본 발명의 맥락에서 "여기" 파장 및 "방출" 파장이 분리되어야 한다는 것을 알고 있다.
표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 여기된 입자의 형광을 검출하는 수단은 제한되지 않으며 당업자에게 알려진 임의의 적합한 수단을 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 표지된 입자/분자를 여기시키고, 바람직하게 형광 여기시키기 위한 바람직한 수단은 레이저, 파이버 레이저, 다이오드-레이저, LED, 할로겐, LED-어레이, HBO(HBO 램프는 예를 들어 고압 하에 수은 증기 대기에서 방전 아크가 발생하는 짧은 아크 램프이다), HXP(HXP 램프는 방전 아크가 매우 높은 압력에서 수은 증기 분위기 내 연소되는 짧은 아크 램프임. 예를 들어, HBO 램프와 달리, 이 램프는 실질적으로 더 높은 압력에서 작동하며 할로겐 사이클을 사용함. HXP 램프는 상당량의 적색광을 포함하여 UV 및 가시 광선을 생성함)로 이루어진 군에서 선택된 임의의 적합한 디바이스일 수 있다.
본 발명에 따르면, 용액에서 여기된 입자를 검출하기 위한 바람직한 수단, 특히 형광을 검출하기 위한 바람직한 수단은 CCD 카메라 (2D 또는 라인 스캔 CCD), 라인 카메라, PMT (Photomultiplier Tube), APD (Avalanche Photodiode), CMOS 카메라로 이루어진 군에서 선택된 임의의 적합한 디바이스일 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 적합한 디바이스에서 수행될 수 있다. 바람직하게 상기 방법은 다음 디바이스 중 하나를 사용하여 수행될 수 있다: 모노리스 NT.115 G/R MO-G009, 모노리스 NT.115 R/B MO-G008, 모노리스 NT.115 B/G MO-007, 또는 모노리스 NT.115 Pico MO-006을 포함하나, 이에 제한하지 않는다.
제 2 양태에서, 본 발명은 분자 간 및/ 또는 분자 내 상호 작용을 측정하는 방법에 관한 것이다. 제 2 양태의 방법은 다음 단계를 포함한다 :
a) 표지된 입자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고, 여기된 입자의 제 1 형광을 제 1의 온도에서 검출하는 단계;
c) 샘플을 제 2의 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
d) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 2 온도에서 여기된 입자의 제 2 형광을 검출하는 단계;
e) 제 1 및 제 2 형광에 기초하여 입자의 분자 간 및/또는 분자 내 상호 작용 및/또는 변형/변경을 특성화하는 단계.
본 발명의 제 2 양태의 방법은 본 발명의 제 1 양태에서와 같이 리간드-표지된-입자 결합 상호 작용을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 제 2 양태의 방법은 복합체 형성 및/또는 이들의 해리뿐만 아니라 화학 반응(글리코실화, 인산화, 지질화, 카르보닐화, 입자 산화를 포함한 무기 또는 유기 반응)을 측정하는 방법을 포함한다.
제 3 양태에서, 본 발명은 시간 의존적 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다. 제 3 양태의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 표지된 입자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 여기된 입자의 제 1 형광을 검출하는 단계;
c) 미리 설정된 시간을 기다리는 단계;
d) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 여기된 입자의 제 2 형광을 검출하는 단계;
e) 제 1 및 제 2 형광에 기초하여 입자의 시간 의존적 변화를 특성화하는 단계.
본 발명의 제 3 양태의 방법은 예를 들어 입체 형태 변화, 결합 동역학 또는 안정성 측정의 동역학적 측정, 또는 품질 관리 측정을 위해 표지된 입자의 시간 의존적 변화를 측정하는데 유용하다.
제 4 양태에서, 본 발명은 환경 의존적 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다. 제 4 양태의 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 표지된 입자를 포함하는 제 1 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 1 샘플에서 여기된 입자의 제 1 형광을 검출하는 단계;
c) 실질적으로 동일한 농도로 표지된 입자를 포함하는 제 2 샘플을 제공하는 단계(여기서 제 2 샘플은 제 1 샘플과 상이함);
d) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 2 샘플에서 여기된 입자의 제 2 형광을 검출하는 단계;
e) 제 1 및 제 2 형광에 기초하여 입자의 환경 의존적 변화를 특성화하는 단계.
본 발명의 제 4 양태의 방법은 표지된 입자에 대한 환경 변화의 영향을 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 환경 변화는 pH 변화, 온도 변화, 압력 변화, 용매 변화, 염과 같은 다른 용질의 농도 변화 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 제 2, 제 3 및 제 4 양태의 방법에서, 동일한 염료로 표지된 동일한 표지된 입자가 본 발명의 제 1 양태에서 사용된다. 상호 작용이라는 용어는 본 발명의 제 1 양태에서와 동일한 방식으로 사용된다. 본 발명의 제 2, 제 3 및 제 4 양태의 방법이 수행되는 온도는 바람직하게 본 발명의 제 1 양태의 미리 정해진 온도에 해당한다. 본 발명의 제 2 양태의 온도 차이는 바람직하게는 본 발명의 제 1 양태와 동일하다. 가열 및 냉각 방법에도 동일하게 적용된다. 본 발명의 제 2, 제 3 및 제 4 양태에서 샘플 용액 중 표지된 입자의 농도는 바람직하게 본 발명의 제 1 양태에서와 동일하다. 본 발명의 제 2, 제 3 및 제 4 양태에서 바람직한 입자-리간드 조합은 바람직하게는 본 발명의 제 1 양태에서와 동일하다. 또한 동일한 샘플 챔버가 사용될 수 있다. 본 발명의 제 2, 제 3 및 제 4 양태에서 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고, 여기된 입자를 검출하기 위한 수단은 또한 바람직하게 본 발명의 제 1 양태와 동일하다.
미국 특허 US 9,676,787 B2는 특정 벤조피릴륨 화합물 및 이들의 생체 분자 라벨링 용도를 개시하고 있다. 이 문서에서는 리간드만 탐지되었다. 기존의 염료와 비교하여 개시된 벤조피릴륨 염료의 개선된 검출 범위를 나타내기 위해 희석 시리즈만 만들었다. 원칙적으로 단일 리간드 농도가 이 효과를 입증하기에 충분했을 것이다. 따라서, 해당 염료가 면역 블롯과 같은 표준 응용에 적합하다는 것만이 입증되었다. 형광 강도는 측정된 샘플에 남아있는 형광단의 수에 따라 달라진다. 이 문서는 다음 절차에 대해 자세히 설명한다.
(a) 정해진 농도의 용액에서 항원 (리간드)은 표면에 결합된다.
(b) 항원 용액을 제거하고 표면을 세척한다.
(c) 이어서, 형광 염료로 표지된 항체를 표면에 첨가하고 인큐베이션한다.
(d) 표지된 항체를 함유하는 용액을 제거하고 표면을 세척한다.
(e) 항원을 통해 표면에 결합된 항체의 형광이 검출된다.
(f) 실험 수행 온도는 기재되지 않는다. 그러나 형광 변화가 크므로 온도를 신중하게 제어할 필요가 없었다.
US 9,676,787 B2를 읽는 당업자는 결합할 항원이 많거나 적기 때문에 형광 강도 변화가 형광 검출 시 다소간의 항체가 표면에 결합되어 있다는 사실에 기인한다고 가정 할 것이다. 리간드의 결합 여부에 관계없이 각각의 항체는 동일한 형광 강도를 나타내는 것으로 암시된다. 또한, 항원의 검출을 위해서는 단일 농도의 항원으로 충분하다. 이는 본 발명과 근본적으로 다르다.
본 발명의 방법에서, 단순히 리간드의 존재가 아니라 리간드와 입자 사이의 결합 상수가 검출될 수 있다. 따라서, 어세이 개시 시 이미 리간드 및 입자의 농도가 미리 정의되어 있다. 주요 차이점은, 측정되는 형광 강도의 변화가 형광적으로 표지된 입자의 양 변화가 아니라 환경을 감지하는 형광 염료의 밝기 변화에 기인하며 따라서 입자의 결합 상태에 따라 밝기가 변화한다는 것이다. 구체적으로, 본 발명은 다음과 같이 상기 문헌과 상이하다
(a) 각각의 형광 측정에서 입자 및 리간드의 양은 (예를 들어 세척 단계에 의해) 미리 정의되고 변경되지 않는다.
(b) 각 표지 (형광단) 밝기는 표지된 입자가 리간드에 결합되어 있는지 여부에 따라 달라진다.
(c) 예상되는 형광 변화가 매우 작을 수 있고 작은 온도 의존적 형광 변화에 의해 가려질 수 있기 때문에 온도가 신중하게 제어된다.
본 발명에서, 형광 변화는 상이한 양의 형광 입자로부터 기인하는 것이 아니라, 리간드의 결합 여부에 기초하여 개별 입자의 형광 강도의 변화에 기인한다. 특히, 리간드가 표지된 (형광) 입자에 결합될 때 형광이 증가하거나 감소할 수 있다. 결합 상수 (Kd 또는 Ka로 명명)를 측정하려면 희석 시리즈가 필요하다. 또한, 리간드 및 입자는 형광 측정 동안 미리 정의된 것과 동일한 농도로 존재한다. 세척 단계는 없다.
본 발명은 다음 항목으로 요약된다:
1. 다음 단계를 포함하는 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 방법:
a) 용액 내 표지된 입자 및 리간드를 포함하는 샘플을 제공하되, 상기 표지된 입자는 용액에 용해 또는 분산되거나 또는 고체 지지체 상에 고정화되는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
c) 용액 내 리간드의 상이한 농도에서 단계 (a) 및 (b)를 여러 번 반복하는 단계; 및
d) 상기 표지된 입자의 리간드 농도 의존적 형광 변화에 기초하여 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 단계,
여기서 상기 표지된 입자는 일반식 (I), (IIa), (IIb) 또는 (III)으로 표시되는 염료로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염료로 표지되고:
(I)
여기서
X1은 O, S 또는 CR5R6이며;
X2는 O, S 또는 CR7R8이고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 및 치환될 수 있는 알킬기로 이루어진 군에서 선택되며;
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기 (바람직하게는 C1-4 알킬), 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8 중 적어도 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이며, 여기서 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길고;
a는 0 내지 4의 정수이며;
b는 0 내지 4의 정수이고; 및
n은 1 내지 3의 정수, 바람직하게 1 또는 2이며;
(IIa)
(IIb)
여기서
X3 및 X4 중 하나는 NR9이고 X3 및 X4 중 다른 하나는 O, S 또는 CR13R14이고;
R9는 수소 및 치환될 수 있는 알킬기로 이루어진 군에서 선택되며;
R10, R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기 (바람직하게는 C1-4 알킬), 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되고;
단, R9, R10, R11, R12, R13 및 R14 중 적어도 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길고;
c는 0 내지 4의 정수이며;
d는 0 내지 2의 정수이고;
e는 0 내지 4의 정수이며; 및
m은 1 내지 3의 정수, 바람직하게 1 또는 2이며; 및
(III)
여기서
Y는 OR18 또는 NR19R20이고;
Z는 O 또는 +NR21R22이며;
R15, R16 및 R17은 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기 (바람직하게는 C1-4 알킬), 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되고;
단, R17 중 적어도 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이며;
R18은 H 또는 알칼리 금속 이온이고,
R19, R20, R21 및 R22는 각각 독립적으로 수소 및 치환될 수 있는 알킬기로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 R19, R20, R21 및 R22는 각각 동일하고;
f는 0 내지 3의 정수이며;
g는 0 내지 3의 정수이고; 및
h는 1 내지 5의 정수이다.
2. 항목 1에 있어서, 단계 a)에서 상기 표지된 입자 및 리간드가 용액 내 미리 설정된 농도로 제공되거나 또는 상기 표지된 입자가 고체 지지체 상에 고정된 미리 설정된 양으로 제공되고 상기 리간드가 미리 설정된 농도로 제공되며; 단계 a)에서 제공된 상기 용액은 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하기 위해 단계 b)에서 사용되는 방법.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 단계 (b)는 다음 단계를 포함하는 방법:
ba) 용액을 미리 설정된 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
bb) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계.
4. 항목 1 또는 2에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 용액 내 표지된 입자 및 리간드를 포함하는 샘플을 제공하되, 상기 표지된 입자는 용액에 용해 또는 분산되거나 또는 고체 지지체 상에 고정화되는 단계;
ba) 용액을 미리 설정된 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
bb) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
c) 용액 내 리간의 상이한 농도에서 단계 (a) 및 (b)를 여러 번 반복하는 단계; 및
d) 상기 표지된 입자의 리간드 농도 의존적 형광 변화에 기초하여 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 단계.
5. 항목 1 또는 2에 있어서, 단계 (b)는 다음 단계를 포함하는 방법:
b1) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고, 제 1의 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
b2) 용액을 제 2의 미리 설정된 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
b3) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 2의 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 일반식 (I)의 염료가 일반식 (I')로 표시되는 염료인 방법:
(I')
여기서
X1은 O 또는 CR5R6이고;
X2는 O 또는 CR7R8이며;
R1, R2, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 치환될 수 있는 C1-20 알킬기이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 및 술폰산 또는 이의 염으로 이루어진 군에서 선택되며;
단, R1, R2, R5, R6, R7 및 R8 중 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길며; 및
n은 1 또는 2의 정수이다.
7. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 일반식 (IIa) 또는 (IIb)의 염료는 하기 일반식 (IIa') 또는 (IIb')로 표시되는 염료인 방법:
(IIa')
(IIb')
여기서
X3 및 X4 중 하나는 NR9이고 X3 및 X4 중 다른 하나는 CR13R14이고;
술포네이트기는 NR9에 대하여 4-위치에 있으며;
R9는 치환될 수 있는 C1-C20 알킬기이고;
R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기(바람직하게 C1-4 알킬), 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되며;
단, R9, R13 및 R14 중 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길고;
d는 0 내지 2의 정수이며;
e는 0 내지 3의 정수이고; 및
m은 1 또는 2의 정수이다.
8. 항목 7에 있어서, 상기 일반식 (IIa') 또는 (IIb')의 염료는 일반식 (IIa") 또는 (IIb")로 표시되는 염료인 방법:
(IIa")
(IIb")
여기서
X3 및 X4 중 하나는 NR9이고 X3 및 X4 중 다른 하나는 CR13R14이고;
술포네이트 기는 NR9에 대하여 4-위치에 있으며;
R9는 치환될 수 있는 C3-6 알킬기이고;
R13 및 R14는 각각 독립적으로 치환될 수 있는 C1-4 알킬기이며;
단, R9, R13 및 R14 중 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길고; 및
m은 1 또는 2의 정수이다.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa") 또는 (IIb")의 염료에서 스페이서기는 치환될 수 있는 C4 내지 C20의 알킬렌 사슬이며, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자는 독립적으로 지환족기, 아릴기, 헤테로사이클릭기, 헤테로아릴기 또는 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자로 대체될 수 있는 방법.
10. 항목 9에 있어서, 상기 스페이서기는 치환될 수 있는 C4 내지 C6 알킬렌 사슬이고, 상기 하나의 탄소 원자는 하나의 아릴기로 대체될 수 있는 방법.
11. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 일반식 (III)의 염료는 하기 일반식 (III')로 표시되는 염료인 방법:
(III')
여기서,
Y는 OH 또는 N(CH3)2이고;
Z는 O 또는 +N(CH3)2이며;
R15 및 R16은 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고;
R17은 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이며; 그리고
R17a는 카르복시기 또는 이의 염이다.
12. 항목 1 내지 5 또는 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 일반식 (III) 또는 (III')의 염료에서 스페이서기는 치환될 수 있는 C2 내지 C10의 알킬렌 사슬이며, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자는 독립적으로 지환족기, 아릴기, 헤테로아릴기, 헤테로사이클릭기 또는 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자로 대체될 수 있는 방법.
13. 항목 12에 있어서, 상기 스페이서기는 치환될 수 있는 C3 내지 C7 알킬렌 사슬이며, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자는 독립적으로 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자로 대체될 수 있는 방법.
14. 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 미리 설정된 온도는 -20 내지 115 ℃, 바람직하게 0.1 내지 100 ℃, 보다 바람직하게 5 내지 60 ℃, 더욱 바람직하게 10 내지 60 ℃, 가장 바람직하게 10 ℃ 내지 40 ℃의 범위인 방법.
15. 항목 14에 있어서, 미리 설정된 온도는 실온과 상이한 방법.
16. 항목 14 또는 15에 있어서, 미리 설정된 온도는 리간드가 표지된 입자에 결합하는 온도인 방법.
17. 항목 14 또는 15에 있어서, 미리 설정된 온도는 형광 여기에서 형태적 변화를 겪는 염료의 분율이 표지된 입자에 리간드의 결합으로 인해 변화하는 온도인 방법.
18. 항목 14 또는 15에 있어서, 미리 정해진 온도는 염료의 광이성질화 속도 또는 내부 전환율이 표지된 입자에 리간드의 결합으로 인해 변화하는 온도인 방법.
19. 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 미리 설정된 온도는 +/-1K, 바람직하게 +/-0.5K 내에서 제어되는 방법.
20. 항목 3 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 가열 또는 냉각은 가열 또는 냉각 유체, 가열 또는 냉각 가스, 가열 요소, 펠티어 요소, 전자기 방사선 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 열 또는 냉각 원을 사용하여 수행되는 것 인 방법.
21. 항목 5 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 제 1의 미리 설정된 온도가 -20 ℃ 내지 115 ℃의 범위, 바람직하게 0.1 ℃ 내지 100 ℃, 보다 바람직하게 5 ℃ 내지 60 ℃의 범위, 더욱 바람직하게 10 ℃ 내지 60 ℃의 범위, 가장 바람직하게 10 ℃ 내지 40 ℃의 범위인 방법.
22. 항목 5 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제 2의 미리 설정된 온도가 -20 ℃ 내지 115 ℃의 범위, 바람직하게 0.1 ℃ 내지 100 ℃, 보다 바람직하게 5 ℃ 내지 60 ℃의 범위, 더욱 바람직하게 10 ℃ 내지 60 ℃의 범위, 가장 바람직하게 10 ℃ 내지 40 ℃의 범위인 방법.
23. 항목 5 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 제 1 및 제 2의 미리 설정된 온도가 -20 ℃ 내지 115 ℃의 범위, 바람직하게 0.1 ℃ 내지 100 ℃, 보다 바람직하게 5 ℃ 내지 60 ℃의 범위, 더욱 바람직하게 10 ℃ 내지 60 ℃의 범위, 가장 바람직하게 10 ℃ 내지 40 ℃의 범위인 방법.
24. 항목 5 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 제 1 및 제 2의 미리 설정된 온도는 +/-1K, 바람직하게 +/-0.5K 내에서 제어되는 방법.
25. 항목 5 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 제 2의 온도와 제 1의 온도 사이의 차이가 +/-0.1K 내지 +/-90K의 범위, 바람직하게 +/-1K 내지 +/-40K의 범위, 보다 바람직하게 +/-1K 내지 +/-20K의 범위인 방법.
26. 항목 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플은 다중-웰 플레이트, 모세관, 큐벳, 반응 튜브, 피펫 팁, 미세 유체, 액적 및 반투명 용기로 이루어진 군에서 선택된 챔버에 제공되는 방법.
27. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 입자는 유기 분자, 생체 분자, 나노입자, 마이크로입자, 소포, 생물학적 세포 또는 아세포 단편, 생물학적 조직, 바이러스 입자, 바이러스 및 세포 소기관으로 이루어진 군에서 선택된 방법.
28. 항목 27에 있어서, 상기 생체 분자는 아미노산, 단백질, 펩타이드, 단- 및 이당류, 다당류, 지질, 당지질, 지방산, 스테롤, 비타민, 신경 전달 물질, 효소, 뉴클레오타이드, 대사 산물, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 방법.
29. 항목 28에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 효소, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 방법.
30. 항목 29에 있어서, 상기 단백질은 효소, 수송 단백질, 억제 단백질, 구조 단백질, 신호 단백질, 리간드-결합 단백질, 샤페론, 항체 및 수용체로 이루어진 군에서 선택된 방법.
31. 항목 30에 있어서, 상기 단백질은 효소, 수송 단백질, 억제 단백질, 샤페론, 항체 및 수용체로 이루어진 군에서 선택된 방법.
32. 항목 29에 있어서, 상기 핵산은 DNA RNA, LNA 및 PNA로부터 선택된 방법.
33. 항목 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 용액 내 표지된 입자의 농도는 10 피코몰 내지 1 마이크로몰, 바람직하게 100 피코몰 내지 100 나노몰인 방법.
34. 항목 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 리간드의 농도는 0.01 피코몰 내지 1 몰, 바람직하게 1 피코몰 내지 100 밀리몰, 더욱 바람직하게 10 피코몰 내지 10 밀리몰인 방법.
35. 항목 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 리간드는 이온, 금속, 화합물, 약물 단편, 탄수화물, 소분자, 약물, 전구 약물, 지질, 단백질, 펩타이드, 펩토이드, 효소, 핵산, 나노입자, 리포솜, SUV, GUV, 중합체, 유기 분자, 무기 분자, 금속 착물, 호르몬, 향미제, 방향제, 입자 및 (마이크로)비드로 이루어진 군에서 선택된 방법.
36. 항목 1 내지 35 중 하나에 있어서, 상기 입자 및 리간드는 입자→리간드 로 표시되는 다음의 조합으로 구성된 군에서 선택된다:
효소→지질, 수용체→호르몬, 수용체→케모카인, 효소→억제제, 수용체→신경 전달 물질, 수용체→사이토카인, 효소→이온, 수용체→이온, 수용체→아미노산, 효소→보조 인자, 수용체→지질, 수용체→스테롤, 효소→단편, 수용체→펩타이드, 수용체→단편, 효소→대사 산물, 수용체→수용체, 수용체→당지질, 효소→DNA, 수용체→방향제, 수용체→전구 약물, 효소→RNA, 수용체→약물, 효소→단-/이- 또는 다당류, 효소→지방산, 효소→비타민, 효소→전구 약물, 효소→약물, 리포솜→단백질, 수송 단백질→기질, 항체→항원, 바이러스 입자→수용체, 바이러스→구조 단백질, 항체→Fc 수용체, 샤페론→ATP, ssDNA→ssDNA, 앱타머→리간드, 샤페론→이온, RNA→소분자, 다당류→소분자, 샤페론→단백질, DNA→소분자, 구조 단백질→구조 단백질, 신호 단백질→신호 단백질, 신호 단백질→소분자, 신호 단백질→전구 약물, 신호 단백질→약물, 신호 단백질→지질, 구조 단백질→이온, 나노입자→단백질, 세포 소기관→단백질, 나노입자→DNA, 세포 소기관→지질, 나노입자→RNA.
37. 항목 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 방법은 입자 및 리간드의 해리 상수를 측정하는 방법인 방법.
38. 다음 단계를 포함하는 분자간 및/또는 분자 내 상호 작용을 측정하는 방법:
a) 표지된 입자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고, 제 1의 온도에서 여기된 입자의 제 1 형광을 검출하는 단계;
c) 샘플을 제 2의 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
d) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 2의 온도에서 여기된 입자의 제 2 형광을 검출하는 단계;
e) 제 1 및 제 2 형광에 기초하여 입자의 분자간 및/또는 분자 내 상호 작용 및/또는 변형/변경을 특성화하는 단계,
여기서 상기 표지된 입자는 항목 1 또는 6 내지 13 중 어느 하나로 정의된 일반식 (I), (IIa), (IIb) 또는 (III)으로 표시되는 염료로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염료로 표지된다.
39. 다음 단계를 포함하는 시간 의존적 변화를 측정하는 방법:
a) 표지된 입자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 여기된 입자의 제 1 형광을 검출하는 단계;
c) 미리 설정된 시간을 기다리는 단계;
d) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 여기된 입자의 제 2 형광을 검출하는 단계;
e) 제 1 및 제 2 형광에 기초하여 입자의 시간 의존적 변화를 특성화하는 단계,
여기서 상기 표지된 입자는 항목 1 또는 6 내지 13 중 어느 하나로 정의된 일반식 (I), (IIa), (IIb) 또는 (III)으로 표시되는 염료로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염료로 표지된다.
40. 다음 단계를 포함하는 환경 의존적 변화를 측정하는 방법:
a) 표지된 입자를 포함하는 제 1 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고, 제 1 샘플에서 여기된 입자의 제 1 형광을 검출하는 단계;
c) 실질적으로 동일한 농도로 표지된 입자를 포함하는 제 2 샘플을 제공하는 단계, 여기서 제 2 샘플은 제 1 샘플과 상이하고;
d) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고, 제 2 샘플에서 여기된 입자의 제 2 형광을 검출하는 단계;
e) 제 1 및 제 2 형광에 기초하여 입자의 환경 의존적 변화를 특성화하는 단계,
여기서 상기 표지된 입자는 항목 1 또는 6 내지 13 중 어느 하나로 정의된 일반식 (I), (IIa), (IIb) 또는 (III)으로 표시되는 염료로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염료로 표지된다.
41. 둘 이상의 반응성 염료를 포함하되, 각각의 염료는 독립적으로 항목 1 또는 6 내지 13 중 어느 하나에 정의된 일반식 (I), (IIa), (IIb) 또는 (III)으로 표시되는 구조 단위를 포함하고, 상기 염료는 스페이서기를 가지며, 상기 스페이서기는 염료를 단백질에 접합할 수 있는 반응기를 갖는 단백질 라벨링 키트.
42. 항목 41에 있어서, 항목 1 내지 31 중 어느 하나의 방법 중 적어도 하나에서 키트의 사용을 설명하는 사용 설명서를 추가로 포함하는, 단백질 라벨링 키트.
43. 항목 41 또는 42에 있어서, 버퍼 교환 컬럼. 정제 컬럼, 라벨링 버퍼, 어댑터 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 단백질 라벨링 키트.
실시예
시약:
NHS(NH-Hydroxysuccinimide) 유도체화된 염료는 Thermo Fischer Scientific (fluorescein, Oregon Green 488, TAMRA), Lumiprobe (Cy3, Cy5, disulfoCy5, Cy5.5), 다이오믹스 (DY495, DY567P1, DY630, DY631, DY6471), Seta Biochemicals (SeTau-647), Cyandye (monosulfoCy3, monosulfoCy5) 및 ATTO TECH (ATTO488, ATTO647N, ATTO 655)에서 구입하였다. 사용된 모든 염료의 구조는 도 19a 내지 19e에 도시되어 있다. 단백질은 Crelux (Hsp90, p38α (p38α), TEM1, BLIP, 말토오스 결합 단백질 (MBP))에서, 탄산 탈수효소 II (CAII)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. NHS 라벨링 버퍼 및 염료 분리 컬럼은 나노템퍼 테크놀로지 GmbH에서 구입하였다. 어세이 버퍼로 0.05% 트윈 20이 보충된 트리스-MgCl2 버퍼를 사용하였다 [50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2].
단백질 라벨링:
표적 단백질 (p38α, 탄산 탈수효소, TEM1, Hsp90)을 pH 8.2에서 카보네이트 버퍼에 라벨링(표지)하였다. 염료 대 단백질 비는 3 : 1 내지 5 : 1로 다양하였다. 라벨링 반응을 실온에서 30분 동안 수행하였다. 유리 염료는 나노템퍼 테크놀로지에 의해 제공된 염료 분리 컬럼을 사용하여 표지된 단백질로부터 분리되었다.
사용 디바이스:
A) IR.적색, IR.녹색 또는 IR.청색: 적색, 녹색 또는 청색 형광 검출 채널과 IR 레이저 (파장 1480nm)를 통합한 나노템퍼 테크놀로지 프로토타입이 열 원으로 사용되었다. 사용된 광학 필터는 (소멸/방출 (nm)) : IR.적색 500-580/655-720 nm, IR.녹색 515-555/618-652 nm, IR.청색 450-490/600-650 nm. 사용된 LED는 다음과 같다: IR. 적색 20 mA, 2.1 V, 630 nm; IR.녹색 20 mA, 3.4 V, 540 nm; 및 IR.청색 20 mA, 3.4, V, 480 nm. 이들 디바이스는 상이한 형광단의 열-광학적 특성 및 결합 이벤트 기록용 감도에 사용되었다.
B) 프로메테우스(Prometheus) NT.48: UV 범위 여기 및 검출 광학 디바이스를 가진 나노템퍼 테크놀로지의 표준 NT.48 장치. 펠티어 디바이스로 샘플 가열을 달성하였다. 주요 응용은 단백질의 용융 곡선의 검출이다.
C) PR.적색: 적색 형광 검출 채널 (500-580/655-720 nm)과 함께 펠티어 디바이스 기반 샘플 가열을 사용하는 나노템퍼 테크놀로지 프로토 타입. 이 디바이스는 상이한 형광단의 열-광학적 특성 및 결합 이벤트 및 단백질의 열 언폴딩용 감도에 사용되었다.
형광 측정:
가열 시 형광 강도의 변화는 IR.적색, IR.녹색 또는 IR.청색을 사용하여 IR 레이저를 사용하여 프로브를 가열하거나 PR.적색을 사용하여 펠리어 디바이스를 사용하여 프로브를 가열하는 방법으로 측정되었다. 실험을 위해 프로브를 384-웰 플레이트 또는 맞춤형 유리 용기에 넣었다. 프로브는 특정 농도에서 단독으로 형광적으로 표지된 표적 유리 염료 또는 특정 농도에서 형광적으로 표지된 표적과 혼합된 일련의 특정 리간드를 함유하였다.
데이터 수집 및 분석:
데이터를 수집하는 동안 아날로그-디지털 변환기의 로우 데이터는 형광 강도 (임의의 단위)로 표시되었다. 각각의 개별 미량은 1에서 시작하도록 정규화되었다. 결합 곡선을 묘사하기 위해, 가열 전후 간격을 설정하고 간격 내의 데이터를 평균하고 F norm 을 계산하였다. 결합 곡선의 각 데이터 포인트는 특정 리간드 농도에서 평균 F norm 을 나타낸다.
해리 상수(K d )는 MO 친화도 분석 소프트웨어(NanoTemper Technologies GmbH) 또는 오리진(Origin Lab)으로 측정하였다. 형광 강도의 온도에 의한 변화는 다음과 같이 정규화되었다: 초기 형광 (F i ) 강도를 1로 정의하고 데이터를 F T /F i 로 정규화하였다, 여기서 F T 는 특정 증가된 온도에서의 형광 강도이다. 결과 F norm 은 특정 리간드의 증가하는 농도에 대해 플롯팅되었다. 해리 상수(K d )는 질량 작용 법칙에 따라 1 : 1 화학량론과 분자 상호 작용을 기술하는 적합도에 따라 측정되었다. K d 는 다음 수학식으로 추정된다:
여기서 f(c)는 특정 리간드 농도 c에서 결합된 분율(fraction)이고, Unbound는 표적의 F norm 신호이며, Bound는 복합체의 F norm 신호이고, K d 는 해리상수 또는 결합 친화도이며, c target 은 어세이에서 표적의 최종 농도이다.
참고예 1
어세이 버퍼 내 100 nM의 NHS-에스테르 형광단 (IR 염료 650 (LI-COR Biotechnology), CF647 (바이오튬), Dylight 655 B1, B2 및 B3 (Thermo Scientific) 및 CF640R (Biotium))을 프로메테우스 NT.48 표준 처리된 모세관 (NanoTemper Technologies)에 이중으로 로딩하고, 모노리스 NT.115 청색/적색 광학을 갖는 IR-디바이스에서 4, 8, 16, 24, 32 및 40mW IR 레이저 출력을 사용하여 열-광학 실험을 수행하였다. IR-레이저 유도 형광 변화는 20초 동안 모니터링되었다. 동일한 샘플을 펠티어 요소를 통해 1K/분으로 가열함으로써 선형 온도 램프(ramp)에적용하였다. 모노리스 NT.115 청색/적색 광학 (NanoTemper Technologies)을 사용하여 샘플 형광을 수집하였다. 분석을 위해, 열-광학 실험의 상대적인 형광 손실은 펠티어 디바이스의 선형 가열을 사용하여 실험에서의 온도 및 상대적인 형광 손실과 연관되었다. 그 결과는 도 1에 제공된다.
PR.적색으로 관찰된 형광 강도의 온도 유도 변화는 동일한 온도에서 IR.적색으로 관찰된 형광 강도의 온도 유도 변화와 밀접하게 관련된다 (도 1A 및 1B).
참고예 2
염료를 DMSO에 미리 희석하고 어세이 버퍼에 추가로 100 nM의 최종 농도로 희석하였다. 이어서 염료를 고감도 프로메테우스(Prometheus) 유리 모세관에 채우고 PR.적색에 3회 로딩하였다. 가열 램프(ramp)는 1K/분으로 설정되었고 데이터는 293-368 K로 기록되었으며, 그 결과는 도 2로 제공된다.
참고예 3
염료를 DMSO에 미리 희석하고 특정 버퍼에 추가로 100nM의 최종 농도로 희석하였다. 이어서 염료를 고감도 프로메테우스(Prometheus) 유리 모세관에 채우고 PR.적색에 3회 로딩하였다. 가열 램프(ramp)는 1K/분으로 설정되었고 데이터는 293-368 K로 기록되었다.
온도 유도 형광 강도 변화는 도 3에 도시된 바와 같이 염료가 존재하는 환경에 의해 추가로 조절되는 것으로 밝혀졌다.이 감도의 정도는 염료의 구조에 의존한다. DY647P1 및 모노설포Cy5는 폴리메틴 염료이며, 술포네이트기의 수가 상이하다. DY647P1은 2개를 갖고, 모노설포Cy5는 단 하나의 술포네이트기를 갖는다.
실시예 1
재조합 EcoSSB 단백질은 Curth U. et al. Biochemistry, 1993, 32 (10), pp 2585-2591에 기술되어 있듯이 정제하였고, 상기 문헌의 전문은 본원에 참고문헌으로 포함된다. 단백질을 농도 당 10㎕의 최종 부피로 50mM 헤페스 pH 7.4, 150mM NaCl 및 2mM EDTA에서 연속 희석으로 1μM에서 0.4nnM까지 희석시켰다. 이어서, 동일한 버퍼에 20㎕ nM Cy5-올리도dT35 (Metabion)를 함유하는 용액 10㎕를 각 EcoSSB 농도에 첨가하였다. 각 용액 10ml를 모노리스 NT.라벨프리 프리미엄 코팅된 모세관 (PR.Red Peltier 디바이스를 사용한 실험용) 및 모노리스 NT.115 프리미엄 코팅된 모세관 (레이저 디바이스 IR.Red 실험용)에 채웠다. PR.적색에서는 7K/분으로 293K에서 368K까지의 선형 구배로 IR.적색에서는 16 mW의 레이저 출력으로 가열을 수행하였다. 302K의 온도에서 정규화된 형광 변화를 EcoSSB의 농도에 대해 플롯팅하였다. 그 결과는 도 4에 제공된다.
실시예 2
단백질 라벨링: 단백질 TEM1을 NHS 라벨링 버퍼 및 1 : 3 단백질 대 염료 라벨링 비율을 사용하여 모노설포-Cy5로 라벨링(표지)하였다. 따라서, 100μl의 24μM 염료 용액을 100μl의 8μM 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 크기-배제 크로마토 그래피를 사용하여 유리 염료를 제거하였다. 이를 위해, 라벨링 반응이 로딩되어 수지로 들어가기 전에 9 ㎖의 어세이 버퍼를 사용하여 B 컬럼을 평형화시켰다. 300㎕ 어레이 버퍼를 첨가한 후, 600㎕ 어세이 버퍼를 사용하여 표지된 단백질을 용출시켰다. 여기서 첫 100㎕는 어떠한 단백질도 포함하지 않으며 폐기되었다.
연속 희석의 제조: 단백질 라벨링 후, 리간드의 연속 희석을 제조하였다. BLIP를 어세이 버퍼에서 1μM로 희석시켰다. 이 용액으로 시작하여, 10㎕의 샘플 부피를 사용하여 16 단계 연속 희석을 제조하였다. 연속 희석의 제조 후, 10 μl의 132 nM 표지된 TEM1을 희석 시리즈에 첨가하였다. 샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다. 프리미엄 코팅된 유리 모세관을 로딩하기 전에, 샘플을 4 ℃ 및 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다.
PR.적색을 사용한 측정 및 데이터 분석: PR.적색을 사용하여 실험을 수행하였다. BLIP에 대한 TEM1 친화도의 측정은 20% LED를 사용하여 수행되었다. MO 친화도 분석 소프트웨어 (NanoTemper Technologies)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과는 도 5에 제공된다.
실시예 3
단백질 라벨링: 단백질 CAII를 NHS 라벨링 버퍼 및 1 : 3 단백질 대 염료 라벨링 비율을 사용하여 모노설포Cy5 또는 DY647P1로 라벨링(표지)하였다. 따라서, 100μl의 24μM 염료 용액을 100μl의 8μM 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 유리 염료를 실시예 2에 기재된 바와 같은 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 제거하였다.
연속 희석의 제조 : 단백질 라벨링 후, 리간드의 연속 희석을 제조하였다. 푸로세미드를 어세이 버퍼에서 50μM로 희석시켰다. 이 용액으로 시작하여, 10㎕의 샘플 부피를 사용하여 16단계 연속 희석을 제조하였다. 연속 희석의 제조 후, 10㎕의 100 nM 표지된 CAII를 희석 시리즈에 첨가하였다. 샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다. 프리미엄 코팅된 유리 모세관을 로딩하기 전에, 샘플을 4 ℃ 및 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다.
PR.적색을 사용한 측정 및 데이터 분석: PR.적색을 사용하여 실험을 수행하였다. 푸로세미드에 대한 CAII 친화도의 측정은 20% LED를 사용하여 수행하였다. 오리진 소프트웨어 (Origin Lab Corporation)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과는 도 6에 제공된다.
실시예 4
단백질 라벨링: 단백질 A를 NHS 라벨링 버퍼 및 1 : 3 단백질 대 염료 라벨링 비율을 사용하여 모노설포Cy5로 라벨링(표지)하였다. 따라서, 100μl의 24μM 염료 용액을 100μl의 8μM 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 유리 염료를 실시예 2에 기재된 바와 같은 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 제거하였다.
연속 희석의 제조: 단백질 라벨링 후, 리간드의 연속 희석을 제조하였다. 트라스투주맙을 PBS-0.05% 트윈 20 버퍼에서 2.5μM로 희석시켰다. 이 용액으로 시작하여, 10㎕의 샘플 부피를 사용하여 16단계 연속 희석을 제조하였다. 연속 희석의 제조 후, 10㎕의 10 nM 표지된 단백질 A를 희석 시리즈에 첨가하였다. 샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다. 프리미엄 코팅된 유리 모세관을 로딩하기 전에, 샘플을 4 ℃ 및 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다.
IR.적색을 사용한 측정 및 데이터 분석: IR.적색을 사용하여 실험을 수행하였다. 트라스투주맙에 대한 단백질 A 친화도의 측정은 20% LED를 사용하여 수행하였고 IR-레이저 스위치를 껐다. MO 친화도 분석 소프트웨어 (NanoTemper Technologies) 및 GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc.)을 사용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과는 도 7에 제공된다.
실시예 5
단백질 라벨링: IL-R1 단백질을 표준 NHS 라벨링 프로토콜에 따라 DyLight655 유도체로 라벨링(표지)하였다. 이를 위해, 염료를 DMSO에 미리 희석시키고 NHS 라벨링 버퍼에 최종 농도 6μM로 추가로 희석하였다. 단백질을 동일한 라벨링 반응 최적화 버퍼에서 2μM의 최종 농도로 희석시켰다. 라벨링 반응을 위해 100㎕의 염료 용액을 100㎕의 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 이후, 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 유리 염료를 제거하였다. 이를 위해, 라벨링 반응이 로딩되어 수지로 들어가기 전에 9 ㎖의 어세이 버퍼를 사용하여 B 컬럼을 평형화시켰다. 300㎕ 어세이 버퍼를 첨가한 후, 600㎕ 어세이 버퍼를 사용하여 라벨링된 단백질을 용출시켰다. 여기서 첫 100㎕는 어떠한 단백질도 포함하지 않으며 폐기되었다.
연속 희석의 제조: 단백질 라벨링 후, 리간드 아나킨라의 연속 희석을 10㎕의 샘플 부피로 제조하였다. 연속 희석의 제조 후, 10㎕의 1μM 표지된 단백질을 모든 리간드 희석액에 첨가하였다. 샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다. 프리미엄 코팅된 유리 모세관을 로딩하기 전에, 샘플을 4 ℃ 및 15,000 g에서 1분 동안 원심분리하였다.
IR.적색을 사용한 측정 및 데이터 분석: 12 mW의 IR-레이저 전력으로 IR.적색을 사용하여 60%의 LED 전력에서 프로브를 310K로 가열하기 위해 실험을 수행하였다. MO 친화도 분석 소프트웨어(NanoTemper Technologies)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과는 도 8에 제공된다.
실시예 6
단백질 라벨링: p38 알파 단백질을 NHS 라벨링 케미스트리를 사용하여 Cy5로 라벨링(표지)하였다. 이를 위해, 염료를 DMSO에 미리 희석하고 NHS 라벨링 버퍼에 24μM의 최종 농도로 추가로 희석시켰다. 동일한 라벨링 반응 최적화 버퍼를 사용하여 단백질을 8μM의 최종 농도로 희석시켰다. 라벨링 반응을 위해 100㎕의 염료 용액을 100㎕의 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 이후, 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 유리 염료를 제거하였다. 이를 위해, 라벨링 반응이 로딩되어 수지로 들어가기 전에 9 ㎖의 어세이 버퍼를 사용하여 B 컬럼을 평형화시켰다. 300㎕ 어세이 버퍼를 첨가한 후, 600㎕ 어세이 버퍼를 사용하여 표지된 단백질을 용출시켰다. 여기서 첫 100㎕는 어떠한 단백질도 포함하지 않으며 폐기되었다.
연속 희석의 제조: 단백질 라벨링 후, 리간드의 연속 희석을 제조하였다. 4% DMSO를 갖는 어세이 버퍼는 어세이 버퍼로 작용하였다. PD169316을 어세이 버퍼에서 10μM 및 4% DMSO로 희석시켰다. 이 용액으로 시작하여, 10㎕의 샘플 부피를 사용하여 16단계 연속 희석을 제조하였다. 연속 희석의 제조 후, 10㎕의 100nM 표지된 단백질을 모든 리간드 희석에 첨가하였다. 샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다. 프리미엄 코팅된 유리 모세관을 로딩하기 전에, 샘플을 4 ℃ 및 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다.
IR.적색을 사용한 측정 및 데이터 분석: 24mW의 IR-레이저 전력 및 20%의 LED 전력에서 IR.적색을 사용하여 실험을 수행하였다. 프로브는 IR-레이저로 308K의 온도로 예열되었다. 프로브 296K로 냉각 시, 형광 변화를 모니터링하였다. MO 친화도 분석 소프트웨어 (NanoTemper Technologies)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과는 도 9에 제공된다.
실시예 7
단백질 라벨링: 히스태그된 p38α를 오레곤 그린 488 트리스-NTA 유도체로 라벨링(표지)하였다. 이를 위해, 염료를 PBST에서 최종 농도 100nM로 희석하고, 단백질 농도는 PBST 버퍼를 사용하여 200nM로 조정하였다. 두 샘플을 최종 부피 200㎕와 1 : 1로 혼합하고, 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 라벨링 반응을 수행하였다. 이후, 반응 혼합물을 4 ℃ 및 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다.
히스태그된 p38 알파를 NHS 라벨링 케미스트리를 사용하여 오레곤 그린 488, Cy5, Z Cy5, TAMRA 및 TAMRAX로 라벨링(표지)하였다. 이를 위해 염료를 DMSO에 미리 희석하고 NHS 라벨링 버퍼에 Z-Cy5의 경우 6μM, 다른 염료의 경우 24μM의 최종 농도로 추가 희석하였다. 단백질은 동일한 라벨링 반응 최적화 버퍼를 사용하여 Z-Cy5의 경우 2μM 및 다른 염료의 경우 8μM의 최종 농도로 희석되었다. 라벨링 반응을 위해 100㎕의 염료 용액을 100㎕의 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 이후, 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 유리 염료를 제거하였다. 이를 위해, 라벨링 반응이 로딩되어 수지로 들어가기 전에 9 ㎖의 어세이 버퍼를 사용하여 B 컬럼을 평형화시켰다. 300㎕ 어세이 버퍼를 첨가한 후, 600㎕ 어세이 버퍼를 사용하여 표지된 단백질을 용출시켰다. 여기서 첫 100㎕는 어떠한 단백질도 포함하지 않으며 폐기되었다.
연속 희석의 제조: 단백질 라벨링 후, 리간드의 연속 희석을 제조하였다. 4% DMSO를 갖는 어세이 버퍼는 어세이 버퍼로 작용하였다. Z-Cy5 라벨링된 p38용 PD169316 및 다른 라벨링 생성물용 BIRB를 어세이 버퍼에서 10μM 및 4% DMSO로 희석시켰다. 이 용액으로 시작하여, 10㎕의 샘플 부피를 사용하여 16단계 연속 희석을 제조하였다. 연속 희석의 제조 후, 10㎕의 100 nM 표지된 단백질을 모든 리간드 희석에 첨가하였다. 샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다. 프리미엄 코팅된 유리 모세관을 로딩하기 전에, 샘플을 4 ℃ 및 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다.
IR.적색을 사용한 측정 및 데이터 분석: 24mW의 IR-레이저 전력에서 IR.적색을 사용하여 실험을 수행하였다. 염료 Cy5, Z-Cy5, 오레곤 그린 488 및 오레곤 그린 488-트리스 NTA의 경우, 프로브를 296K에서 310K로, TAMRA 및 TAMRA X의 경우 318K로 가열하였다. 염료의 형광 강도의 본질적인 차이로 인해, LED 전력은 각 염료에 대해 최적화되어야 했다. p38α-Cy5의 경우에는 20%를 사용하여 측정하였고, p38 알파 Z-Cy5의 경우에는 60% LED 전력을 사용하여 분석하였다. TAMRA 및 TAMRAX로 표지된 p38 알파를 100% 및 40% LED 전력을 사용하여 시험하였다. 오레곤 그린 488 및 오레곤 그린 488-트리스-NTA 표지된 p38 알파는 각각 100% 및 40% LED 전력을 사용하여 검출되었다. MO 친화도 분석 소프트웨어 (NanoTemper Technologies)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과는 도 10에 제공된다.
실시예 8
단백질 라벨링: 단백질 TEM1 및 p38 알파 둘다 NHS 라벨링 버퍼 및 1 : 3 단백질 대 염료 라벨링 비율을 사용하여 DY647P1 및 모노설포-Cy5로 둘다 라벨링(표지)하였다. 따라서, 100μl의 24μM 염료 용액을 100μl의 8μM 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 유리 염료를 실시예 2에 기재된 바와 같은 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 제거하였다.
연속 희석의 제조: 단백질 라벨링 후, 리간드의 연속 희석을 제조하였다. 4% DMSO를 갖는 어세이 버퍼는 BIRB에 대한 p38 알파용의 어세이 버퍼로 작용하는 반면, 어세이 버퍼는 BLIP에 대한 TEM1용으로 사용되었다. BIRB 및 BLIP는 각각 어세이 버퍼에서 10μM 및 4% DMSO 및 1μM으로 둘다 희석되었다. 이들 용액으로 시작하여, 10㎕의 샘플 부피를 사용하여 16단계 연속 희석을 제조하였다. 연속 희석의 제조 후, 10㎕의 100 nM의 표지된 p38 알파 또는 132nM의 표지된 TEM1을 희석 시리즈에 첨가하였다. 샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다. 프리미엄 코팅된 유리 모세관을 로딩하기 전에, 샘플을 4 ℃ 및 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다.
IR.적색을 사용한 측정 및 데이터 분석: 실험을 310K 내지 318K의 온도에서 24 mW의 IR-레이저 전력에서 IR.적색을 사용하여 수행하였다. 염료의 형광 강도의 본질적인 차이로 인해, LED 전력은 각 염료에 대해 최적화되어야 했다. BLIP에 대한 TEM1 친화도의 측정은 DY647P1 표지된 TEM1의 경우 30% LED 전력 및 모노설포-Cy5 표지된 TEM1의 경우 80% LED 전력을 사용하여 수행하였다. BIRB에 대한 p38 α-DY647P1의 친화도는 30% LED 전력을 사용하여 측정하였고, 반면에 p38 모노설포-Cy5는 80% LED 전력을 사용하여 분석하였다. MO 친화도 분석 소프트웨어 (NanoTemper Technologies)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과는 도 11에 제공된다.
실시예 9
단백질 라벨링: 단백질 TEM1 및 p38 알파를 NHS 라벨링 케미스트리 및 각각 1 : 3, 1 : 3 및 1 : 5 염료 대 단백질 라벨링 비율을 사용하여 모노설포-Cy5, DY630 및 DY631로 라벨링(표지)하였다. 따라서, 100μl의 24μM 염료 용액을 100μl의 8μM 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 유리 염료를 실시예 2에 기재된 바와 같은 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 제거하였다.
연속 희석 제조: 단백질 라벨링 후, 리간드 BLIP 및 PD169316의 연속 희석을 제조하였다. 4% DMSO를 갖는 어세이 버퍼는 PD169316에 대한 p38 알파용 어세이 버퍼로서 작용하는 반면, 상기 어세이 버퍼는 BLIP에 대한 TEM1용으로 사용되었다. PD169316 및 BLIP는 각각 어세이 버퍼에서 10μM 및 4% DMSO 및 1μM로 둘다 희석되었다. 이들 용액으로 시작하여, 10㎕의 샘플 부피를 사용하여 16단계 연속 희석을 제조하였다. 연속 희석의 제조 후, 10㎕의 100 nM의 표지된 p38 알파 또는 132 nM의 표지된 TEM1을 희석 시리즈에 첨가하였다. 샘플을 위아래로 피펫팅하여 혼합하였다. 프리미엄 코팅된 유리 모세관을 로딩하기 전에, 샘플을 4 ℃ 및 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다.
IR.적색을 사용한 측정 및 데이터 분석: 실험을 310 K 내지 318 K의 온도로 프로브를 가열하기 위해 24 mW의 IR-레이저 전력에서 IR.적색을 사용하여 수행하였다. 염료의 형광 강도의 본질적인 차이로 인해, LED 전력은 각 염료에 대해 최적화되어야 했다: DY630으로 표지된 TEM1의 경우 100% LED 전력, DY631으로 표지된 TEM1의 경우 80% LED 전력 및 모노설포-Cy5로 표지된 TEM1의 경우 60% LED 전력. MO 친화도 분석 소프트웨어 (NanoTemper Technologies)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과는 도 12에 제공된다.
실시예 10
단백질 p38α 및 TEM1 둘다 모노설포-Cy5로 라벨링(표지)하였다. 추가로 p38 알파를 SeTau647을 사용하여 라벨링(표지)하였다. 이를 위해, 염료를 DMSO에 용해시키고 NHS 라벨링 버퍼를 사용하여 최종 농도 24μM로 추가로 희석시켰다. 1 : 3의 단백질 대 염료 비의 경우, NHS 라벨링 버퍼를 사용하여 단백질을 최종 농도 8μM로 희석시켰다. 라벨링 반응을 위해 100㎕의 염료 용액을 100㎕의 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 이후, 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 유리 염료를 제거하였다. 이를 위해, 라벨링 반응이 로딩되어 수지로 들어가기 전에 9 ㎖의 어세이 버퍼를 사용하여 B 컬럼을 평형화시켰다. 300㎕ 어세이 버퍼를 첨가한 후, 600㎕ 어세이 버퍼를 사용하여 표지된 단백질을 용출시켰다. 여기서 첫 100㎕는 어떠한 단백질도 포함하지 않으며 폐기되었다. B 컬럼 정제 후, 단백질을 고감도 프로메테우스 유리 모세관 (1.6μM)에 직접 로딩하고 다음 디바이스 설정을 갖는 PR.적색을 사용하여 2회 측정하였다: 293-368K에서 1K/분.
유리 염료를 DMSO에 미리 희석하고 어세이 버퍼에서 최종 농도 100nM로 희석시켰다. 염료를 고감도 프로메테우스(Prometheus) 유리 모세관에 채우고 PR.적색 디바이스에 3회 로딩하였다. 가열 램프(ramp)는 1K/분으로 설정되었고 데이터는 293-368K로 기록되었다. 데이터는 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 분석되었다. 그 결과는 도 15에 제공된다.
실시예 11
단백질 TEM1 및 MBP 둘다 NHS 라벨링 버퍼 및 1 : 3 단백질 대 염료 라벨링 비율을 사용하여 모노설포-Cy5로 라벨링(표지)하였다. 이를 위해, 염료를 DMSO에 용해시키고 NHS 라벨링 버퍼에서 24μM의 최종 농도로 추가로 희석시켰다. 단백질을 동일한 라벨링 반응 최적화 버퍼를 사용하여 최종 농도 8μM로 희석시켰다. 라벨링 반응을 위해 100㎕의 염료 용액을 100㎕의 단백질 용액과 혼합하고 어두운 곳에서 RT로 30분 동안 반응을 수행하였다. 이후, 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 유리 염료를 제거하였다. 이를 위해, 라벨링 반응이 로딩되어 수지로 들어가기 전에 9 ㎖의 어세이 버퍼를 사용하여 B 컬럼을 평형화시켰다. 300㎕ 어세이 버퍼를 첨가한 후, 600㎕ 어세이 버퍼를 사용하여 표지된 단백질을 용출시켰다. 여기서 첫 100㎕는 어떠한 단백질도 포함하지 않으며 폐기되었다. B 컬럼 정제 후, 단백질을 고감도 프로메테우스 유리 모세관 (1.6μM)에 직접 로딩하고 2개의 디바이스를 사용하여 2회 측정하였다: 293-368K에서 1K/분을 사용한 PR.적색 및 293-368K에서 5K/분을 사용한 프로메테우스 NT.48. 디바이스 소프트웨어에서 데이터를 직접 내보냈다. 그 결과는 도 16에 제공된다.

Claims (24)

  1. 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 방법에 있어서,
    상기 방법은,
    a) 용액 내에 표지된 입자 및 리간드를 포함하는 샘플을 제공하되, 상기 표지된 입자는 상기 용액에 용해 또는 분산되거나 또는 고체 지지체 상에 고정화되는 단계;
    b) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 미리 설정된 온도에서 상기 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
    c) 용액 내 리간드의 상이한 농도에서 단계 (a) 및 (b)를 여러 번 반복하는 단계; 및
    d) 상기 표지된 입자의 리간드 농도 의존적 형광 변화에 기초하여 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 강한 공간 온도 구배의 생성으로 인한 열 영동에 기초한 열-광학적 특성화에 의존하지 않으며,
    여기서, 상기 표지된 입자는 일반식 (I), (IIa), (IIb) 또는 (III)으로 표시되는 염료로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염료로 표지되고:
    (I)
    여기서
    X1은 O, S 또는 CR5R6이고;
    X2는 O, S 또는 CR7R8이며;
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 및 치환될 수 있는 알킬기로 이루어진 군에서 선택되고;
    R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기, 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되며;
    단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8 중 적어도 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2-기 보다 길고;
    a는 0 내지 4의 정수이며;
    b는 0 내지 4의 정수이고; 및
    n은 1 내지 3의 정수이며;

    (IIa)
    (IIb)
    여기서
    X3 및 X4 중 하나는 NR9이고 X3 및 X4 중 다른 하나는 O, S 또는 CR13R14이고;
    R9는 수소 및 치환될 수 있는 알킬기로 이루어진 군에서 선택되며;
    R10, R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기, 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되고;
    단, R9, R10, R11, R12, R13 및 R14 중 적어도 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2-기 보다 길며;
    c는 0 내지 4의 정수이고;
    d는 0 내지 2의 정수이며;
    e는 0 내지 4의 정수이고; 및
    m은 1 내지 3의 정수이며; 및
    (III)
    여기서
    Y는 OR18 또는 NR19R20이고;
    Z는 O 또는 +NR21R22이며;
    R15, R16 및 R17은 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기, 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되고;
    단, R17 중 적어도 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고;
    R18은 H 또는 알칼리 금속 이온이며,
    R19, R20, R21 및 R22는 각각 독립적으로 수소 및 치환될 수 있는 알킬기로 이루어진 군에서 선택되고;
    f는 0 내지 3의 정수이고;
    g는 0 내지 3의 정수이며; 및
    h는 1 내지 5의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단계 (b)는 다음 단계를 포함하는 방법:
    b1) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 1의 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계;
    b2) 용액을 제 2의 미리 설정된 온도로 가열 또는 냉각시키는 단계;
    b3) 상기 표지된 입자를 형광적으로 여기시키고 제 2의 미리 설정된 온도에서 여기된 입자의 형광을 검출하는 단계.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 일반식 (I)의 염료가 일반식 (I')로 표시되는 염료인 방법:
    (I')
    여기서
    X1은 O 또는 CR5R6이고;
    X2는 O 또는 CR7R8이며;
    R1, R2, R5, R6, R7 및 R8은 각각 독립적으로 치환될 수 있는 C1-20 알킬기이고;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소 및 술폰산 또는 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    단, R1, R2, R5, R6, R7 및 R8 중 하나는 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2- 기 보다 길고; 및
    n은 1 또는 2의 정수이다.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 일반식 (IIa) 또는 (IIb)의 염료는 하기 일반식 (IIa') 또는 (IIb')로 표시되는 염료인 방법:
    (IIa')
    (IIb')
    여기서
    X3 및 X4 중 하나는 NR9이고 X3 및 X4 중 다른 하나는 CR13R14이고;
    상기 술포네이트기는 NR9에 대하여 4-위치에 있으며;
    R9는 치환될 수 있는 C1-C20 알킬기이고;
    R11, R12, R13 및 R14는 각각 독립적으로 히드록시, 카르복시, 술폰산, 티올 또는 이의 염, 수소, 할로겐, 치환될 수 있는 카르복실레이트 에스테르기, 니트로기, 아민, 아미드, 치환될 수 있는 알킬기, 치환될 수 있는 알콕시기 및 치환될 수 있는 알케닐기로 이루어진 군에서 선택되며;
    단, R9, R13 및 R14 중 하나는 상기 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이고, 상기 스페이서기는 2개의 CH2-기 보다 길고;
    d는 0 내지 2의 정수이며;
    e는 0 내지 3의 정수이고; 그리고
    m은 1 또는 2의 정수이다.
  5. 제 1 항, 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 일반식 (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb')의 염료에서 스페이서기는 치환될 수 있는 C4 내지 C20의 알킬렌 사슬이며, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자는 독립적으로 지환족기, 아릴기, 헤테로사이클릭기, 헤테로아릴기, 또는 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자로 대체될 수 있는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 일반식 (III)의 염료는 하기 일반식 (III')로 표시되는 염료인 방법:
    (III')
    여기서,
    Y는 OH 또는 N(CH3)2이고;
    Z는 O 또는 +N(CH3)2이며;
    R15 및 R16은 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이고;
    R17은 상기 염료가 입자에 접합되는 스페이서기이며; 및
    R17a는 카르복시기 또는 이의 염이다.
  7. 제 1 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 일반식 (III) 또는 (III')의 염료에서 스페이서기는 치환될 수 있는 C2 내지 C10의 알킬렌 사슬이며, 상기 알킬렌 사슬의 하나 이상의 탄소 원자는 독립적으로 지환족기, 아릴기, 헤테로아릴기, 헤테로사이클릭기, 또는 O, N 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자로 대체될 수 있는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 미리 설정된 온도는 -20 내지 115 ℃의 범위인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 미리 설정된 온도는 실온과 상이한 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 미리 설정된 온도는 +/-1K 내에서 제어되는 방법.
  11. 제 2 항에 있어서,
    상기 가열 또는 냉각은 가열 또는 냉각 유체, 가열 또는 냉각 가스, 가열 요소, 펠티어 요소, 전자기 방사선 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 열 또는 냉각 원을 사용하여 수행되는 방법.
  12. 제 2 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2의 미리 설정된 온도가 -20 ℃ 내지 115 ℃의 범위인 방법.
  13. 제 2 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2의 미리 설정된 온도는 +/-1K 내에서 제어되는 방법.
  14. 제 2 항에 있어서,
    상기 제 2의 온도와 제 1의 온도 사이의 차이가 +/-0.1K 내지 +/-90K의 범위인 방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 입자는 유기 분자, 생체 분자, 나노 입자, 마이크로 입자, 소포, 생물학적 세포 또는 아세포 단편, 생물학적 조직, 바이러스 입자, 바이러스 및 세포 소기관으로 이루어진 군에서 선택된 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 생체 분자가 단백질, 펩타이드, 효소, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 용액 중 표지된 입자의 농도가 10 피코몰 내지 1 마이크로몰인 방법.
  18. 제 1 항에 있어서,
    상기 리간드의 농도가 0.01 피코몰 내지 1 몰인 방법.
  19. 제 1 항에 있어서,
    상기 리간드는 이온, 금속, 화합물, 약물 단편, 탄수화물, 소분자, 약물, 전구 약물, 지질, 단백질, 펩타이드, 펩토이드, 효소, 핵산, 나노 입자, 리포좀, SUV, GUV, 중합체, 유기 분자, 무기 분자, 금속 착물, 호르몬, 향미제, 방향제, 입자 및 (마이크로)비드로 이루어진 군에서 선택된 방법.
  20. 제 1 항에 있어서,
    상기 입자 및 리간드는 입자→리간드로 표시되는 다음의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 방법:
    효소→지질, 수용체→호르몬, 수용체→케모카인, 효소→억제제, 수용체→신경 전달 물질, 수용체→사이토카인, 효소→이온, 수용체→이온, 수용체→아미노산, 효소→보조 인자, 수용체→지질, 수용체→스테롤, 효소→단편, 수용체→펩타이드, 수용체→단편, 효소→대사 산물, 수용체→수용체, 수용체→당지질, 효소→DNA, 수용체→방향제, 수용체→전구 약물, 효소→RNA, 수용체→약물, 효소→단-/이- 또는 다당류, 효소→지방산, 효소→비타민, 효소→전구 약물, 효소→약물, 리포솜→단백질, 수송 단백질→기질, 항체→항원, 바이러스 입자→수용체, 바이러스→구조 단백질, 항체→Fc 수용체, 샤페론→ATP, ssDNA→ssDNA, 앱타머→리간드, 샤페론→이온, RNA→소분자, 다당류→소분자, 샤페론→단백질, DNA→소분자, 구조 단백질→구조 단백질, 신호 단백질→신호 단백질, 신호 단백질→소분자, 신호 단백질→전구 약물, 신호 단백질→약물, 신호 단백질→지질, 구조 단백질→이온, 나노 입자→단백질, 세포 소기관→단백질, 나노 입자→DNA, 세포 소기관→지질, 나노 입자→RNA.
  21. 제 1 항에 있어서,
    상기 표지된 입자와 리간드 사이의 상호 작용을 측정하는 방법은 입자 및 리간드의 해리 상수를 측정하는 방법인 방법.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
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