CN108027325A - 采用时间分辨发光确定核酸序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供基于发光寿命和/或强度的分子测序方法。在一些方面中，核酸测序方法包括测定在核酸测序反应期间纳入的一系列经发光标记的核苷酸的发光寿命及任选的发光强度。

Description

采用时间分辨发光确定核酸序列的方法
相关申请案
本申请案根据35 U.S.C.§119(e)主张以下案件的优先权：标题为“核酸测序方法”且在2015年5月20日提出申请的美国临时专利申请案第62/164,482号、标题为“用于所接受光子的时间对帧的整合设备”且在2015年5月20日提出申请的美国临时专利申请案第62/164,506号、标题为“用于探测、检测和分析分子的带外光源的整合设备”且在2015年5月20日提出申请的美国临时专利申请案第62/164,464号及标题为“脉冲激光”且在2015年5月20日提出申请的美国临时专利申请案第62/164,485号，每一者的全部内容以引用方式并入本文中。
本申请案主张标题为“用于探测、检测和分析分子的带外光源的整合设备”且在2015年8月7日提出申请的美国专利申请案第14/821,688号在35 U.S.C.§120下的优先权，该申请案的全部内容以引用方式并入本文中。
技术领域
本申请案整体涉及用于实施生物和/或化学试样的快速、大规模平行、定量分析的方法、组合物及设备及制造该等设备的方法。
现有技术
可使用生物分析(biological assay、bioassay)实施生物试样的检测及分析。生物分析通常涉及大型昂贵实验室设备，其需要培训研究科学家来操作该设备并实施生物分析。此外，生物分析通常大规模实施，从而需要大量特定类型的试样来进行检测及定量。
一些生物分析藉由使用发射特定波长光的发光标记物对试样加标签来实施。使用光源照射标记物以引起发光，且使用光检测器检测发光以量化由标记物发射的发光量。使用发光标记物的生物分析通常包括使用昂贵雷射光源来照射试样以及使用复杂发光检测光学装置和电子装置来收集来自经照射试样的发光。
发明概述
根据本申请案的一个方面，可基于在分子曝光于多个单独光脉冲时自其发射的一系列光子的一或多种性质来鉴别单个分子(例如与反应试样中的其他可能分子进行区分)。在一些实施例中，可使用所发射光子基于不同发光寿命来鉴别/区分分子。在一些实施例中，可计算发光寿命。在一些实施例中，无需计算实际寿命。举例而言，可使用一或多种提示发光寿命的性质(例如局部发射时间、所检测发射的时间分布)。在一些实施例中，可使用所发射光子来测定分子的发光强度，且可使用发光强度来鉴别分子。在一些实施例中，可使用所发射光子来测定分子的发光寿命及发光强度，且可使用发光寿命或发光强度来鉴别分子。在一些实施例中，分子身份可基于发光寿命及发光强度的组合。
在一些实施例中，可使用发光标记来标记分子。在一些实施例中，发光标记是荧光团。在一些实施例中，可基于发光标记的性质来鉴别或区分发光标记。发光标记(例如荧光团)的性质包含(但不限于)发光寿命、吸收光谱、发射光谱、发光量子产率及发光强度。在一些实施例中，基于发光寿命来鉴别或区分发光标记。在一些实施例中，基于发光强度来鉴别或区分发光标记。在一些实施例中，基于观察发射光子所需的递送激发能的波长来鉴别或区分发光标记。在一些实施例中，基于发射光子的波长来鉴别或区分发光标记。在一些实施例中，基于发光寿命及观察发射光子所需的递送激发能的波长来鉴别或区分发光标记。在一些实施例中，基于发光强度及观察发射光子所需的递送激发能的波长来鉴别或区分发光标记。在一些实施例中，基于发光寿命、发光强度及观察发射光子所需的递送激发能的波长来鉴别或区分发光标记。在一些实施例中，基于发光寿命及发射光子的波长来鉴别或区分发光标记。在一些实施例中，基于发光强度及发射光子的波长来鉴别或区分发光标记。在一些实施例中，基于发光寿命、发光强度及发射光子的波长来鉴别或区分发光标记。
在某些实施例中，使用不同发光标记物标记反应混合物或实验中的不同类型分子。在一些实施例中，不同标记物具有可区分的不同发光性质。在一些实施例中，不同标记物的区别在于具有不同发光寿命、不同发光强度、不同的发射光亚波长或其组合。存在多个类型具有不同发光标记物的分子可容许监测复杂反应的不同步骤，或容许鉴别复杂反应产物的不同组份。在一些实施例中，可测定不同类型分子发生反应或相互作用的顺序。
在一些实施例中，可使用不同数量的相同发光分子(例如一个或多个相同荧光染料)来发光标记不同核苷酸。在一些实施例中，改变发光标记中的发光分子的数量可容许基于不同强度来区分不同核苷酸。在一些实施例中，可各自使用不同类型的发光分子和/或不同数量的每一发光分子来标记不同核苷酸。在一些实施例中，不同类型的发光分子容许基于不同强度和/或不同寿命来区分不同核苷酸。
在某些实施例中，使用多个类型具有不同发光标记物的分子的发光性质来鉴别生物分子(例如核酸或蛋白质)的序列。在一些实施例中，在合成生物分子期间纳入时，使用多个类型具有不同发光标记物的分子的发光性质来鉴别单个分子。在一些实施例中，在测序反应期间纳入时，使用具有不同发光标记物的多个类型的核苷酸的发光性质来鉴别单个核苷酸。这可容许测定核酸模板的序列。在一些实施例中，将经发光标记的核苷酸纳入与核酸模板互补的核酸链中。在一些实施例中，互补链包括引物。
在某些实施例中，多个类型具有不同发光标记物的核苷酸包括4类经发光标记的核苷酸。在一些实施例中，4种经发光标记的核苷酸吸收和/或发射在一个光谱范围内的光子。在一些实施例中，三种经发光标记的核苷酸发射在第一光谱范围内，且第四经发光标记的核苷酸吸收和/或发射第二光谱范围内的光子。在一些实施例中，两种经发光标记的核苷酸在第一光谱范围内发射，且第三及第四经发光标记的核苷酸在第二光谱范围内发光。在一些实施例中，两种经发光标记的核苷酸在第一光谱范围内发射，第三核苷酸吸收和/或发射第二光谱范围内的光子，且第四核苷酸吸收和/或发射第三光谱范围内的光子。在一些实施例中，4种经发光标记的核苷酸中的每一者吸收和/或发射不同光谱范围内的光子。在一些实施例中，每一类型吸收和/或发射相同光谱范围内的光子的经发光标记的核苷酸具有不同发光寿命或发光强度或二者。
在一些实施例中，反应混合物中的4种不同类型的核苷酸(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶/尿嘧啶)可各自经一或多个发光分子标记。在一些实施例中，每一类型的核苷酸可连接至一个以上的相同发光分子(例如两个或更多个相同荧光染料连接至一种核苷酸)。在一些实施例中，每一发光分子可连接至一个以上核苷酸(例如两个或更多个相同核苷酸)。在一些实施例中，一个以上核苷酸可连接至一个以上发光分子。在一些实施例中，保护分子用作用于附接一或多个核苷酸(例如相同类型)及一或多个发光分子(例如相同类型)的锚。在一些实施例中，所有4核苷酸皆经在相同光谱范围内(例如520-570nm)吸收及发射的发光分子标记。
在一些实施例中，属4种核苷酸的组内的发光标记可选自包括芳香族或杂芳香族化合物的染料且可为芘、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚、苯并吲哚、噁唑、咔唑、噻唑、苯并噻唑、啡啶、吩噁嗪、卟啉、喹啉、乙锭、苯甲酰胺、青色素、羰花青素、水杨酸盐、邻氨基苯甲酸酯、香豆素、荧光素、罗丹明或其他类似化合物。示例性染料包含氧杂蒽染料(例如荧光素或罗丹明染料)、萘染料、香豆素染料、吖啶染料、青色素染料、苯并噁唑染料、二苯乙烯染料、芘染料、酞青素染料、藻胆蛋白染料、方酸染料及诸如此类。
在一些实施例中，属4种核苷酸的组内的发光标记包括Alexa546、Alexa555及Alexa555及FRET对Alexa555及在一些实施例中，属4种核苷酸的组内的发光标记包括Alexa555、Alexa546及554-R1。在一些实施例中，属4种核苷酸的组内的发光标记包括Alexa555、ATTO Rho6G及554-R1。在一些实施例中，属4种核苷酸的组内的发光标记包括Alexa555、ATTO Rho6G及554-R1。在一些实施例中，属4种核苷酸的组内的发光标记包括Alexa555、ATTO 542及554-R1。在一些实施例中，属4种核苷酸的组内的发光标记包括Alexa555、ATTO 542及Alexa546。在一些实施例中，属4种核苷酸的组内的发光标记包括ATTO Rho6G及554-R1。
在某些实施例中，至少一类、至少两类、至少三类或至少四类经发光标记的核苷酸包括选自由以下组成的群的发光染料：6-TAMRA、5/6-羧基罗丹明6G、Alexa546、Alexa555、Alexa568、Alexa610、Alexa647、AberriorStar 635、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO Rho6G、ATTO 542、ATTO 647N、ATTO Rho14、Chromis 630、Chromis 654A、ChromeoTM 642、CFTM514、CFTM532、CFTM543、CFTM546、CFTM546、CFTM555、CFTM568、CFTM633、CFTM640R、CFTM660C、CFTM660R、CFTM680R、Cy3、Cy5、Cy5.5、Dyomics-530、Dyomics-547P1、Dyomics-549P1、Dyomics-550、Dyomics-554、Dyomics-555、Dyomics-556、Dyomics-560、Dyomics-650、Dyomics-680、DyLightTM 554-R1、DyLightTM 530-R2、DyLightTM 594、DyLightTM 635-B2、DyLightTM 650、DyLightTM 655-B4、DyLightTM 675-B2、DyLightTM 675-B4、DyLightTM680、HiLyteTM Fluor 532、HiLyteTM Fluor 555、HiLyteTM Fluor 594、640R、SetaTM 555、SetaTM 670、SetaTM 700、SetaTMu 647及SetaTMu 665，或具有式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)，如本文中所阐述。
在一些实施例中，至少一类、至少两类、至少三类或至少四类经发光标记的核苷酸各自包括选自由以下组成的群的发光染料：Alexa546、Alexa555、DyLightTM 554-R1、Alexa546、Atto Rho6G、ATTO 425、ATTO465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO Rho6G及ATTO 542。
在一些实施例中，第一类经发光标记的核苷酸包括Alexa546，第二类经发光标记的核苷酸包括第三类经发光标记的核苷酸包括两种Alexa555，且第四类经发光标记的核苷酸包括Alexa555及
在一些实施例中，第一类经发光标记的核苷酸包括Alexa555，第二类经发光标记的核苷酸包括第三类经发光标记的核苷酸包括Alexa546，且第四类经发光标记的核苷酸包括DyLightTM 554-R1。
在一些实施例中，第一类经发光标记的核苷酸包括Alexa555，第二类经发光标记的核苷酸包括第三类经发光标记的核苷酸包括ATTO Rho6G，且第四类经发光标记的核苷酸包括DyLightTM 554-R1。
在一些实施例中，第一类经发光标记的核苷酸包括Alexa555，第二类经发光标记的核苷酸包括第三类经发光标记的核苷酸包括ATTO Rho6G，且第四类经发光标记的核苷酸包括DyLightTM 554-R1。
在一些实施例中，第一类经发光标记的核苷酸包括Alexa555，第二类经发光标记的核苷酸包括第三类经发光标记的核苷酸包括ATTO 542，且第四类经发光标记的核苷酸包括DyLightTM 554-R1。
在一些实施例中，第一类经发光标记的核苷酸包括Alexa555，第二类经发光标记的核苷酸包括第三类经发光标记的核苷酸包括ATTO 542，且第四类经发光标记的核苷酸包括Alexa546。
在一些实施例中，第一类经发光标记的核苷酸包括第二类经发光标记的核苷酸包括第三类经发光标记的核苷酸包括ATTO Rho6G，且第四类经发光标记的核苷酸包括DyLightTM 554-R1。
在一些实施例中，至少一类、至少两类、至少三类或至少四类经发光标记的核苷酸包括选自由以下组成的群的发光染料：Alexa532、Alexa546、Alexa555、Alexa594、Alexa610、CFTM 532、CFTM 543、CFTM 555、CFTM594、Cy3、DyLightTM 530-R2、DyLightTM 554-R1、DyLightTM 590-R2、DyLightTM 594、DyLightTM 610-B1，或具有式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。
在一些实施例中，第一及第二类经发光标记的核苷酸包括选自由以下组成的群的发光染料：Alexa532、Alexa546、Alexa555、CFTM 532、CFTM 543、CFTM 555、Cy3、DyLightTM 530-R2、DyLightTM 554-R1，且第三及第四类经发光标记的核苷酸包括选自由以下组成的群的发光染料：Alexa594、Alexa610、CFTM 594、DyLightTM 590-R2、DyLightTM 594、DyLightTM 610-B1，或具有式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。
在某些实施例中，至少一类、至少两类、至少三类或至少四类经发光标记的核苷酸分子包括选自由以下组成的群的发光蛋白：TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、单体Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、单体Kusabira-Orange、mKOK、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4、iRFP、mKeima Red、LSS-mKate1、LSS-mKate2、mBeRFP、PA-GFP、PAmCherry1、PATagRFP、Kaede(绿色)、Kaede(红色)、KikGR1(绿色)、KikGR1(红色)、PS-CFP2、mEos2(绿色)、mEos2(红色)、PSmOrange或Dronpa。
本申请案的方面提供将激发能递送至待鉴别分子且检测激发后的发射光子的方法及可用于该方法的系统及设备。在某些实施例中，检测包括针对每一所检测的发光记录发光与激发能的先前脉冲之间的持续时间。在某些实施例中，检测包括记录多种检测发光中的每一者的发光与激发能的先前脉冲之间的持续时间。在某些实施例中，递送多个激发能脉冲。拟鉴别分子的发光标记物可由每一脉冲或一部分脉冲激发。在某些实施例中，藉由一或多个传感器检测多种发光。拟鉴别分子的发光标记物可在每一激发或一部分激发之后发光。产生发光的激发事件的分数系基于标记物的发光量子产率。在一些实施例中，增加包括发光标记物的发光分子的数量可增加量子产率(例如增加发光发射的数量)。另外，并非所有由标记物发射的发光皆可检测到，举例而言，一些发光将远离传感器。在某些实施例中，基于发光标记物的发光性质(包含吸收光谱及标记物在给定光谱范围中激发之后发射光子的波长)来选择一或多种激发能。
在某些实施例中，基于拟检测经发光标记的分子的发光性质(例如发光寿命)来选择脉冲激发能的频率。在一些实施例中，脉冲之间的间隙长于所激发一或多种经发光标记的分子的发光寿命。在一些实施例中，间隙长于所激发一或多种经发光标记的分子的发光寿命约两倍至约10倍、约10倍至约100倍或约100倍至约1000倍。在一些实施例中，间隙长于所激发一或多种经发光标记的分子的发光寿命约10倍。
在某些实施例中，基于所监测化学过程来选择脉冲激发能的频率。对于测序反应而言，在纳入经发光标记的核苷酸时递送至靶容积的脉冲数将部分地决定所检测发射光子的数量。在一些实施例中，选择频率以容许在纳入经发光标记的核苷酸期间检测到足够数量的光子，其中足够数量是自多种经发光标记的核苷酸区分经发光标记的核苷酸所需的光子数。在一些实施例中，基于发射光子的波长来区分经发光标记的核苷酸。在一些实施例中，基于发光发射寿命(例如脉冲激发与发射检测之间的时间)来区分经发光标记的核苷酸。在一些实施例中，基于发射光子的波长及发光发射寿命来区分经发光标记的核苷酸。在一些实施例中，基于发射信号的发光强度(例如基于发射频率或一定时间段内的发射事件总数)来区分经发光标记的核苷酸。在一些实施例中，基于发射信号的发光强度及发光寿命来区分经发光标记的核苷酸。在一些实施例中，基于发光强度及波长来区分经发光标记的核苷酸。在一些实施例中，基于发光强度、波长及发光寿命来区分经发光标记的核苷酸。
根据本申请案的一个方面，提供包括激发源模块及集成设备的系统。激发源模块包括经构形以发射具有第一持续时间的激发能脉冲的激发源。集成设备包含：靶容积，其经构形以接收在耦合至激发能脉冲时会发光的分子；第一能量路径，沿该路径激发能脉冲自能量源耦合组件移动至靶容积；传感器，其检测第二持续时间中的发光，其中第二持续时间大于第一持续时间；第二能量路径，沿该路径发光自靶容积移动至传感器；及第三能量路径，沿该路径激发能脉冲自激发源移动至能量源耦合组件。
根据本申请案的另一个方面，提供包括靶容积及传感器的集成设备。靶容积经构形以接收经多种发光标记物中的一者标记的试样，多种发光标记物中的每一者具有不同寿命值。传感器经构形以检测在多个持续时间中来自多种发光标记物中的一者的发光。选择多个持续时间以区别多种发光标记物。
根据本申请案的另一个方面，提供包括靶容积及多个传感器的集成设备。靶容积经构形以接收经多种发光标记物中的一者标记的试样。多种发光标记物中的每一者在多个光谱范围中的一者内发光且多种发光标记物中在多个光谱范围中的一者中发光的一部分各自具有不同发光寿命。多个传感器的每一传感器经构形以在多个持续时间中检测多个光谱范围中的一者且选择多个持续时间以区别多种发光标记物的一部分。
根据本申请案的另一个方面，提供包括多个激发源及集成设备的系统。多个激发源发射多种激发能。多个激发源中的每一者发射多种激发能中的一者的脉冲。集成设备包含：靶容积，其经构形以接收经多种发光标记物中的一者标记的试样；及传感器，其经构形以检测在多种激发能中的一者的脉冲之后于多个持续时间中来自多种发光标记物中的一者的发光。多种在由多种激发能中的一者照射之后发光的发光标记物的一部分各自具有不同寿命值。多个计时脉冲事件与发光发射之间的持续时间的数据的累积结果可区别多种发光标记物。
根据本申请案的另一个方面，提供靶核酸的测序方法。在一些实施例中，靶核酸的测序方法包括以下步骤：(i)提供包括以下部分的混合物：(a)该靶核酸、(b)与该靶核酸互补的引物、(c)核酸聚合酶及(d)纳入与该靶核酸互补的生长核酸链中的核苷酸，其中该核苷酸包含不同类型的经发光标记的核苷酸，其中该经发光标记的核苷酸在依序纳入该生长核酸链期间产生可检测信号，该不同类型经发光标记的核苷酸的该可检测信号在一定时域中彼此区别(例如藉由测定可检测信号的时序和/或频率)；(ii)在足以藉由延伸该引物来产生该生长核酸链的条件下对(i)的该混合物实施聚合反应；(iii)在依序纳入该生长核酸链期间测量来自该等经发光标记的核苷酸的该等可检测信号；及(iv)在依序纳入该生长核酸链中后测定来自该经发光标记的核苷酸的所量测可检测信号的时序和/或频率以鉴别经发光标记的核苷酸纳入该生长核酸链中的时间序列，由此测定该靶核酸的序列。
在一些实施例中，靶核酸或核酸聚合酶附接至载体。在一些实施例中，在对(i)的混合物实施聚合反应后鉴别纳入的时间序列。在一些实施例中，可检测信号是光学信号。在一些实施例中，光学信号是发光信号。在一些实施例中，测定所量测可检测信号的时序和/或频率包括：(i)在一或多个传感器处接收该可检测信号；及(ii)将因应于接收于该一或多个传感器处的该可检测信号所产生多个电荷载子中的电荷载子基于产生该电荷载子的时间选择性引导至至少一个电荷载子储存区中。
在一些实施例中，所量测可检测信号的时序和/或频率包括衰减寿命的量测。在一些实施例中，所量测可检测信号的时序和/或频率包括可检测信号在一或多个检测可检测信号的传感器处的到达时间的量测。在一些实施例中，该方法进一步包括基于可检测信号的到达时间将可检测信号产生的电荷载子分离至与一或多个传感器连接的仓中。在一些实施例中，所量测可检测信号的时序和/或频率是非光谱量测。
附图简要说明
本领域技术人员理解，本文所阐述的图仅用于图解说明目的。应理解，在一些情况下，本发明的各个方面可放大或扩大展示以促进本发明的理解。在各图式中，类似参考特性通常在各个图中指类似特征、功能类似和/或结构类似组件。该等图式未必按比例绘制，而通常着重图解说明教导内容的原理。该图式并非意欲以任何方式限制本发明范围。
在结合图式时，依据下文所陈述的详细说明将较更明了本发明的特征及优点。
在参照图式阐述实施例时，可使用方向参考(“上方”、“下方”、“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“水平”、“垂直”等)。该等参考仅意欲帮助读者以正常定向观看图式。该等方向参考并不意欲阐述所体现设备的较佳或唯一定向。设备可体现于其他定向中。
如自详细说明所知晓，图(例如图1-37)中所绘示且进一步出于阐释目的阐述整个申请案中的实例阐述非限制性实施例，且在一些情形下可出于更清晰阐释的目的简化某些过程或删除某些特征或步骤。
图1展示含有用于核酸测序的各种组份的试样孔(例如试样孔)的非限制性示意图。
图2展示以下4阶段的核酸测序的非限制性、示例性实验：(A)在纳入经发光标记的核苷酸之前；(B)第一纳入事件；(C)在第一纳入事件与第二纳入事件之间的时段；及(D)第二纳入事件；以及在阶段(A)-(D)期间原始数据及经处理数据的相应实例。
图3绘示具有不同发光寿命的4种发光分子的非限制性信号与发射时间及衰减机率的归一化化累积分布函数。
图4展示示例性经发光标记的核苷酸的发光寿命的非限制性图表及发光强度图表。
图5绘示使用4种经发光标记的核苷酸的非限制性测序实验：(A)来自绿色脉冲及红色脉冲的所检测发光的迹线；(B)基于每一核苷酸纳入的发光寿命及强度的来自绿色脉冲的数据的减小；及(C)实验测定序列与模板序列的比对。
图6绘示使用4种经发光标记的核苷酸的非限制性测序实验：(A)来自绿色脉冲的所检测发光的迹线；(B)基于每一核苷酸纳入的发光寿命及强度的来自绿色脉冲的数据的减小；及(C)实验测定序列与模板序列的比对。
图7展示用于表面制备的非限制性、示例性方法，其包含以下步骤：(a)沉积、(b)钝化、(c)硅烷化、(d)复合加载及(e)测序反应启动。
图8展示用磷酸酯-PEG基团钝化金属氧化物表面的两种非限制性方法。
图9展示使用硅烷-PEG-生物素及硅烷-PEG混合物对玻璃实施官能化的两种非限制性方法。
图10绘示经由保护分子连接的一或多个发光分子及一或多个核苷酸的非限制性实例。
图11绘示涉及经由分裂连接子附接至保护分子的一或多个核苷酸和一或多个发光分子的构形的非限制性实例。
图12绘示可用于测序反应及示例性测序实验中的经发光标记的核苷酸分子的构形的非限制性实施例，其中使用经发光标记的核苷酸的发光性质来鉴别纳入测序反应中的碱基。
图13绘示将非功能结合位点改造至保护分子中以在所选位点处附接发光分子和核苷酸的非限制性实例。
图14绘示经由保护分子连接发光分子和核苷酸的非限制性实例，其中将发光分子及核苷酸附接至保护分子的连接子包括寡核苷酸。
图15绘示经由复性互补寡核苷酸将发光分子附接至保护分子的非限制性实例，其中每一寡核苷酸链含有一个与保护分子上的结合位点兼容的非共价结合配体。
图16绘示利用基因编码的标签在保护分子的独立位点处附接发光分子与核苷酸的非限制性实例。
图17绘示利用蛋白质末端基团处的反应性基团在保护分子的独立位点处附接发光分子与核苷酸的非限制性实例。
图18绘示利用非天然氨基酸在保护分子的独立位点处附接发光分子与核苷酸的非限制性实例。
图19A及图19B绘示由非蛋白质保护分子隔离的发光分子与核苷酸的非限制性实例。
图20绘示包括蛋白质-蛋白质结合对的保护分子的非限制性实施例。
图21绘示连接子构形的非限制性实例。
图22绘示用于核苷酸连接子合成及示例性结构的非限制性反应图。
图23A系根据一些实施例可用于生物及化学样品的快速、移动分析的装置的示意性模块图。
图23B系根据一些实施例的集成设备及仪器的模块图。
图24A绘示根据一些实施例的集成设备的像素列。
图24B绘示根据一些实施例耦合至像素列中的试样孔的激发能和来自每一试样孔引导至传感器的发射能。
图25绘示根据一些实施例的集成设备及激发源。
图26绘示根据一些实施例的集成设备及激发源。
图27A绘示根据一实施例形成于集成设备的像素区中的试样孔。
图27B绘示根据一些实施例入射于试样孔上的激发能。
图27C绘示包含凹槽的试样孔，该凹槽在一些实施例中增加了与试样孔连接的激发区处的激发能。
图28绘示根据一些实施例的试样孔及凹槽。
图29A及29B绘示根据一些实施例的具有时间仓(time bin)的传感器。
图30A绘示根据一些实施例用于提供光脉冲的示例性系统。
图30B绘示光强度随时间而变化的绘图。
图31A绘示根据一些实施例用于实施测量的示意图。
图31B绘示根据一些实施例的光信号随时间而变化的绘图。
图31C绘示根据一些实施例的时间仓中的标记物的信号谱图。
图32A绘示根据一些实施例的光信号随时间而变化的绘图。
图32B绘示根据一些实施例的时间仓中的标记物的信号谱图。
图33A绘示根据一些实施例用于实施测量的示意图。
图33B绘示根据一些实施例的寿命随发射波长而变化的绘图。
图34A绘示根据一些实施例的光信号随波长而变化的绘图。
图34B绘示根据一些实施例的光信号随时间而变化的绘图。
图35A绘示根据一些实施例的用于多个传感器的时间仓中的标记物的信号谱图。
图35B绘示根据一些实施例的光信号随时间而变化的绘图。
图35C绘示根据一些实施例的用于多个传感器的时间仓中的标记物的信号谱图。
图36A绘示根据一些实施例用于实施测量的示意图。
图36B绘示根据一些实施例的光信号随波长而变化的绘图。
图37A绘示根据一些实施例的光信号随时间而变化的绘图。
图37B绘示根据一些实施例的用于多个传感器的时间仓中的标记物的信号谱图。
发明详述
发明人已研发了用于基于分子的一或多种发光性质来鉴别单个分子的新方法、组合物及设备。在一些实施例中，基于发光寿命、吸收光谱、发射光谱、发光量子产率、发光强度或其两者或更多者的组合来鉴别分子。鉴别可意指分配分子的确切分子身份，或可意指从可能分子组区分或区别特定分子。在一些实施例中，可基于不同的发光寿命、吸收光谱、发射光谱、发光量子产率、发光强度或其两者或更多者的组合来彼此区分多个单个分子。在一些实施例中，藉由将单个分子曝光于一系列单独光脉冲且评估自分子发射的每一光子的时序或其他性质来鉴别该分子(例如与其他分子区分)。在一些实施例中，综合且评估依序自单个分子发射的多个光子的信息以鉴别分子。在一些实施例中，自依序自分子发射的多个光子来测定分子的发光寿命，且可使用发光寿命来鉴别分子。在一些实施例中，自依序自分子发射的多个光子来测定分子的发光强度，且可使用发光强度来鉴别分子。在一些实施例中，自依序自分子发射的多个光子来确定分子的发光寿命及发光强度，且可使用发光寿命及发光强度来鉴别分子。
本申请案的方面可用于检测和/或鉴别一或多种生物或化学分子。在一些实施例中，可藉由测定一或多种试剂或产物在一或多个时间点处的存在或不存在来评估化学或生物反应。
本申请案的方面藉由将分子曝光于光且测定自分子发射的一或多种光子的一或多种性质来讯问分子。在某些实施例中，藉由将分子曝光于光脉冲且测定自分子发射的光子的一或多种性质来讯问分子。在一些实施例中，将分子曝光于多个单独光脉冲事件且测定在单独光脉冲事件之后发射的单独光子的一或多种性质。在一些实施例中，分子并不响应于每一光脉冲发射光子。然而，可藉由将分子曝光于一系列单独光脉冲且评估在光脉冲事件亚组之后发射的单独光子(例如在约10％的脉冲事件之后发射的光子，或在约1％的脉冲事件之后发射的光子)来评估多个发射光子。
本申请案的方面可用于藉由测定一或多种试剂、中间体和/或反应产物在一或多个时间点处的存在或不存在来监测化学或生物反应。在一些实施例中，可藉由将反应试样曝光于一系列单独光脉冲且分析在每一光脉冲之后检测的任一发射光子来分析反应随时间变化的进展。
因此，在本申请案的一些方面中，将反应试样曝光于多个单独光脉冲且检测并分析一系列发射光子。在一些实施例中，发射光子系列提供关于在反应试样中在实验时间期间存在且并不改变的单个分子的信息。然而，在一些实施例中，发射光子系列提供关于一系列在不同时间存在于反应试样中(例如随反应或方法的进展)的不同分子的信息。
在一些实施例中，可使用本申请案的方面分析生物试样，从而(例如)测定试样中一或多种核酸或多肽的序列和/或测定试样中一或多种核酸或多肽变体(例如所关注基因中的一或多种突变)的存在或不存在。在一些实施例中，可对患者试样(例如人类患者试样)实施测试以提供核酸序列信息或测定一或多种所关注核酸的存在或不存在以用于诊断、预后和/或治疗目的。在一些实例中，诊断测试可包含(例如)藉由对个体生物试样中的无细胞脱氧核糖核酸(DNA)分子和/或表达产物(例如核糖核酸(RNA))实施测序来对个体生物试样中的核酸分子实施测序。
在一些实施例中，使用发光寿命和/或强度分析(例如讯问和/或鉴别)的一或多种分子可为经标记分子(例如已经用一或多种发光标记物标记的分子)。在一些实施例中，可使用标记物鉴别生物分子的个体亚单位。在一些实例中，使用发光标记物鉴别生物分子的个体亚单位。一些实施例使用了发光标记物(在本文中亦称为“标记物”)，其可为外源性或内源性标记物。外源性标记物可为用作用于发光标记的报告子和/或标签的外部发光标记物。外源性标记物的实例可包含(但不限于)荧光分子、荧光团、荧光染料、荧光染剂、有机染料、荧光蛋白、参与荧光共振能量转移(FRET)的物质、酶和/或量子点。其他外源性标记物为业内已知。此类外源性标记物可缀合至特异性结合特定靶或组份的探针或官能基(例如分子、离子和/或配体)。将外源性标签或报导子附接至探针使得可经由检测外源性标签或报导子的存在来鉴别靶。探针的实例可包含蛋白质、核酸(例如DNA、RNA)分子、脂质和抗体探针。外源性标记物和官能基的组合可形成任一用于检测的适宜探针、标签和/或标记，包含分子探针、经标记探针、杂交探针、抗体探针、蛋白质探针(例如生物素结合探针)、酶标记、荧光探针、荧光标签和/或酶报告子。
尽管本发明参照发光标记物，但可针对本文所提供的设备、系统及方法使用其他类型的标记物。此类标记物可为质量标签、静电标签、电化学标记或其任一组合。
尽管可向试样中添加外源性标记物，但内源性标记物可为试样的已有部分。内源性标记物可包含所存在的可在激发能存在下发光或“自发荧光”的任一发光标记物。内源性荧光团的自发荧光可提供无标记及非侵袭性标记且无需引入外源性荧光团。此类内源性荧光团的实例可包含(举例而言且并不加以限制)血红素、氧基血红素、脂质、胶原及弹性蛋白交联物、还原型烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、氧化黄素(FAD及FMN)、脂褐素、角蛋白和/或卟啉。
鉴于已认识到需要简单、较不复杂的装置用于实施单个分子检测和/或核酸测序，发明人设想用于使用发光标签组(例如发光标记物、发光标记)标记不同分子以检测单个分子的技术。此类单个分子可为具有标签的核苷酸或氨基酸。可在结合至单个分子时、在自单个分子释放时或在结合至单个分子并自其释放时，检测标签。在一些实例中，标签是发光标签。所选组中的每一发光标签与各分子缔合。举例而言，可使用一组4个标签“标记”存在于DNA中的核碱基-该组的每一标签与不同核碱基缔合，举例而言，第一标签与腺嘌呤(A)缔合，第二标签与胞嘧啶(C)缔合，第三标签与鸟嘌呤(G)缔合，且第四标签与胸腺嘧啶(T)缔合。此外，标签组中的每一发光标签具有可用于区分该组的第一标签与该组中的其他标签的不同性质。以此方式，每一标签均是使用这些区分特性中的一或多者而可以独特地鉴别的。举例而言且并不加以限制，可用于区分一种标签与另一标签的标签特性可包含因响应激发能由标签发射的光的发射能和/或波长、由特定标签吸收以将标签置于激发态中的激发光的波长和/或标签的发射寿命。
测序
本申请案的一些方面可用于对生物聚合物(例如核酸及蛋白质)实施测序。在一些实施例中，本申请案中所阐述的方法、组合物及设备可用于鉴别一系列纳入核酸或蛋白质中的核苷酸或氨基酸单体(例如藉由检测纳入一系列经标记核苷酸或氨基酸单体的时程)。在一些实施例中，本申请案中所阐述的方法、组合物及设备可用于鉴别一系列纳入由聚合酶合成的模板依赖性核酸测序反应产物中的核苷酸。
在某些实施例中，藉由天然核酸聚合酶实施模板依赖性核酸测序产物。在一些实施例中，聚合酶是天然聚合酶的突变体或经修饰变体。在一些实施例中，模板依赖性核酸序列产物包括一或多个与模板核酸链互补的核苷酸片段。在一个方面中，本申请案提供藉由测定互补核酸链的序列来测定模板(或靶)核酸链的序列的方法。
在另一个方面中，本申请案提供藉由对多个核酸片段实施测序来对靶核酸实施测序的方法，其中靶核酸包括片段。在某些实施例中，该方法包括组合多个片段序列以提供亲本靶核酸的序列或部分序列。在一些实施例中，藉由计算机硬件及软件来实施组合步骤。本文所阐述的方法可使得对一组相关靶核酸(例如整个染色体或基因组)实施测序。
在测序期间，聚合酶可偶合(例如附接)至靶核酸分子的引发位置。引发位置可为与靶核酸分子的一部分互补的引物。作为一替代方式，引发位置是提供于靶核酸分子的双链区段内的间隙或切口。间隙或切口的长度可为0至至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或40个核苷酸。切口可断裂双链序列的一条链，此可提供用于聚合酶(例如链置换聚合酶)的引发位置。
在一些情形下，可将测序引物复性至可固定或可不固定至固体支持物上的靶核酸分子。固体支持物可包括(例如)用于核酸测序的芯片上的试样孔(例如纳米孔口、反应室)。在一些实施例中，可将测序引物固定至固体支持物上且靶核酸分子的杂交亦将靶核酸分子固定至固体支持物上。在一些实施例中，将聚合酶固定至固体支持物上且可溶性引物和靶核酸与聚合酶接触。然而，在一些实施例中，在溶液中形成包括聚合酶、靶核酸和引物的复合物且将复合物固定至固体支持物上(例如经由聚合酶、引物和/或靶核酸的固定)。在一些实施例中，试样孔(例如纳米孔口、反应室)中的任一组份皆不固定至固体支持物上。举例而言，在一些实施例中，在溶液中形成包括聚合酶、靶核酸和引物的复合物且并不将复合物固定至固体支持物上。
在适当条件下，接触复性引物/靶核酸的聚合酶可在引物上添加或纳入一或多种核苷酸，且核苷酸可以5’至3’模板依赖性方式添加至引物中。核苷酸在引物上的这种纳入(例如经由聚合酶作用)通常可称为引物延伸反应。每一核苷酸可与可检测标签缔合，该可检测标签可在核酸延伸反应期间检测及鉴别(例如基于其发光寿命和/或其他特性)且用于测定纳入延伸引物中的每一核苷酸，且由此用于测定新近合成的核酸分子的序列。经由新近合成的核酸分子的序列互补性，亦可测定靶核酸分子的序列。在一些情形下，可在类似反应条件(例如相同或类似反应温度)下或在不同反应条件(例如不同反应温度)下将测序引物复性至靶核酸分子和将核苷酸纳入测序引物中。在一些实施例中，藉由合成方法实施测序可包含存在靶核酸分子群体(例如靶核酸的拷贝)和/或扩增靶核酸以达获得靶核酸群体的步骤。然而，在一些实施例中，使用藉由合成实施的测序来测定所评估每一反应中单个分子的序列(且无需核酸扩增来制备用于测序的靶模板)。在一些实施例中，根据本申请案的方面平行(例如在单个芯片上)实施多个单个分子测序反应。举例而言，在一些实施例中，多个单个分子测序反应各自在单独反应室(例如纳米孔口、试样孔)在单个芯片上实施。
实施例能够以高准确度及长读取长度对单个核酸分子实施测序，例如准确度为至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％或99.9999％，和/或读取长度大于或等于约10个碱基对(bp)、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、1000bp、10,000bp、20,000bp、30,000bp、40,000bp、50,000bp或100,000bp。在一些实施例中，单个分子测序中所使用的靶核酸分子系单链靶核酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)、DNA衍生物、核糖核酸(RNA)、RNA衍生物)模板，其被添加或固定至含有测序反应的至少一种额外组份(例如聚合酶(例如DNA聚合酶)的试样孔(例如纳米孔口)中，所述额外组分被固定或附接至固体支持物(例如试样孔的底部壁或侧壁)上。靶核酸分子或聚合酶可直接或经由连接子附接至试样壁(例如在试样孔的底部壁或侧壁处)。试样孔(例如纳米孔口)亦可含有经由引物延伸反应进行核酸合成所需要的任一其他试剂，例如适宜缓冲剂、辅因子、酶(例如聚合酶)和多磷酸脱氧核糖核苷(例如三磷酸脱氧核糖核苷，包含三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧尿苷(dUTP)及三磷酸脱氧胸苷(dTTP)dNTP)，其包括发光标签例如荧光团。在一些实施例中，每一种类的dNTP(例如含有腺嘌呤的dNTP(例如dATP)、含有胞嘧啶的dNTP(例如dCTP)、含有鸟嘌呤的dNTP(例如dGTP)、含有尿嘧啶的dNTP(例如dUTP)及含有胸腺嘧啶的dNTP(例如dTTP))缀合至不同发光标签，从而对标签所发射光的检测指示了纳入新近合成的核酸中的dNTP的身份。可经由任一适宜设备和/或方法(包含在本文其他处所阐述的用于检测的此类设备及方法)检测来自发光标签的发射光且归因于其适当发光标签(及由此是相关dNTP)。发光标签可在任一位置处缀合至dNTP，从而发光标签的存在并不抑制dNTP在新近合成的核酸链中的纳入或并不抑制聚合酶活性。在一些实施例中，发光标签缀合至dNTP的末端磷酸酯(例如γ磷酸酯)。
在一些实施例中，可使单链靶核酸模板与测序引物、dNTP、聚合酶及核酸合成所需的其他试剂接触。在一些实施例中，可使所有适当dNTP与单链靶核酸模板同时(举例而言，同时存在所有dNTP)接触，从而可连续纳入dNTP。在其他实施例中，可使dNTP与单链靶核酸模板依序接触，其中使单链靶核酸模板与每一适当dNTP单独接触，其中在单链靶核酸模板与不同dNTP的接触之间进行洗涤步骤。可针对拟鉴别单链靶核酸模板的每一连续碱基位置，重复进行使单链靶核酸模板与每一dNTP单独接触并随后洗涤的此一循环。
在一些实施例中，测序引物复性至单链靶核酸模板且聚合酶基于单链靶核酸模板将dNTP(或其他多磷酸脱氧核糖核苷)连续纳入引物中。可在将dNTP纳入引物中期间或之后使用适当激发光激发与每一所纳入dNTP缔合的独特发光标签，且可随后使用任一适宜设备和/或方法(包含本文其他处所阐述用于检测的设备及方法)检测其发射。光的特定发射(例如具有特定发射寿命、强度、光谱和/或其组合)的检测可归因于所纳入的特定dNTP。然后可使用自所检测发光标签的集合获得的序列经由序列互补性来确定单链靶核酸模板的序列。
尽管本发明提及dNTP，但本文所提供的设备、系统及方法可以与各种类型的核苷酸(例如核糖核苷酸及脱氧核糖核苷酸(例如具有至少4、5、6、7、8、9或10个磷酸酯基团的多磷酸脱氧核糖核苷))一起使用。该核糖核苷酸及脱氧核糖核苷酸可包含各种类型的标签(或标记物)及连接子。
核酸测序的实例
下列实例意欲阐释本文所阐述的一些方法、组合物及设备。实例的所有方面系非限制性。图1示意性图解说明单个分子核酸测序方法的设置。1-110系经构形以含有包括核酸聚合酶1-101、拟测序靶核酸1-102及引物1-104的单个复合物的试样孔(例如纳米孔口、反应室)。在此实例中，将试样孔1-110的底部区绘示为靶容积(例如激发区)1-120。
如本文中其他处所阐述，靶容积是激发能所引向的容积。在一些实施例中，该容积是试样孔容积及激发能耦合至试样孔的性质。靶容积可经构形以限制限定于靶容积中的分子或复合物的数量。在一些实施例中，靶容积经构形以限定单个分子或复合物。在一些实施例中，靶容积经构形以限定单个聚合酶复合物。在图1中，包括聚合酶1-101的复合物限定于靶容积1-120中。可任选的藉由附接至试样孔的表面上来固定复合物。用于试样孔表面制备及官能化的示例性方法绘示于本申请案其他处进一步论述的图7-9中。在此实例中，藉由包括一或多种适于将连接子附接至聚合酶1-101的生物分子(例如生物素)的连接子1-103来固定复合物。
孔口(aperture)容积亦含有具有适宜溶剂、缓冲剂及聚合酶复合物合成核酸链所需的其他添加剂的反应混合物。反应混合物亦含有多个类型经发光标记的核苷酸。每一类型的核苷酸由符号*-A、@-T、＄-G、#-C代表，其中A、T、G及C代表核苷酸碱基，且符号*、@、＄及#代表经由连接子-附接至每一核苷酸的独特发光标记。在图1中，#-C核苷酸正被纳入互补链1-102中。所纳入的核苷酸位于靶容积1-120内。
图1亦使用箭头指示递送至靶容积附近的激发能及朝向检测器发射的发光的概念。箭头系示意图，且并不意欲指示激发能递送或发光的特定定向。在一些实施例中，激发能是来自光源的光脉冲。激发能可在光源与靶容积附近之间经过一或多个设备组件(例如波导或滤光片)。发射能亦可在发光分子与检测器之间经过一或多个设备组件(例如波导或滤光片)。一些发光可发射于并不引导至检测器的载体上(例如朝向试样孔侧壁)且不可检测。
图2示意性图解说明单个试样孔(例如纳米孔口)中的随时间的测序制程。阶段A至D绘示如图1中的具有聚合酶复合物的试样孔。阶段A绘示在向引物中添加任一核苷酸之前的初始状态。阶段B绘示经发光标记的核苷酸(#-C)的纳入事件。阶段C绘示纳入事件之间的时段。在此实例中，向引物中添加核苷酸C，且先前附接至经发光标记的核苷酸(#-C)的标记及连接子已发生裂解。阶段D绘示经发光标记的核苷酸(*-A)的第二纳入事件。在阶段D之后的互补链由引物、C核苷酸及A核苷酸组成。
阶段A及C皆绘示纳入事件之前或之间的时段，其在此实例中指示持续约10毫秒。在阶段A及C中，因并未纳入核苷酸，故在靶容积(未绘制于图2中)并无经发光标记的核苷酸，但可检测到背景发光或来自未纳入的经发光标记的核苷酸的假性发光。阶段B及D展示不同核苷酸(分别为#-C及*-A)的纳入事件。在此实例中，这些事件亦指示持续约10毫秒。
标记为“原始仓数据”的列绘示在每一阶段期间生成的数据。在整个实例实验中，将多个光脉冲递送至靶容积附近。对于每一脉冲而言，检测器经构形以记录由检测器接收的任一发射光子。在发射光子由检测器接收时，将其分离成多个时间仓(在此实例中存在3个)中的一者。在一些实施例中，检测器经构形以具有介于2与16个时间仓。“原始仓数据”记录值1(最短条)、2(中等条)或3(最长条)，其分别对应于最短、中等及最长仓。每一条指示发射光子的检测。
因在阶段A或C的靶容积中并不存在经发光标记的核苷酸，故并未检测到光子。对于阶段B及D中的每一者而言，在纳入事件期间检测到多个光子发射事件(如本文所用的发光事件或“发光”)。发光标记#的发光寿命短于发光标记*。阶段B数据由此绘示为其所记录平均仓值低于仓值较高的阶段D。
标记为“经处理数据”的列绘示经处理以指示在相对于每一脉冲的时间下发射光子的数量(计数)的原始数据。因每一条对应于特定时间仓的光子计数，故绘示经处理数据的示例性曲线对应于包括的时间仓多于图中所阐述三个时间仓的原始仓数据。在此实例中，仅处理数据以测定发光寿命，但亦可针对其他发光性质(例如所吸收或发射光子的发光强度或波长)来评估数据。示例性经处理数据接近于靶容积中的发光标记的发光寿命的指数式衰减曲线特性。因发光标记#的发光寿命短于发光标记*，故阶段B的经处理数据在较长持续时间中具有较少计数，而阶段D的经处理数据在较长持续时间中具有相对较多计数。
图2的实例实验将添加至互补链中的前两种核苷酸鉴别为CA。对于DNA而言，在复性至引物的区域紧后的靶链序列由此被鉴别为GT。在此实例中，可仅基于发光寿命在多个C、G、T及A中区分核苷酸C及A。在一些实施例中，可能需要其他性质(例如所吸收或发射光子的发光强度或波长)来区分一或多种特定核苷酸。
在纳入核苷酸后发射的信号可储存于内存中且在稍后时间点加以处理以测定靶核酸模板的序列。这可包含比较此类信号与参考信号以确定随时间所纳入核苷酸的身份。或者或另外，可收集在纳入核苷酸后发射的信号且实时(例如在纳入核苷酸时)处理以实时测定靶核酸模板的序列。
本文所用的术语“核酸”通常指包括一或多个核酸亚单位的分子。核酸可包含一或多个选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)或其变体的亚单位。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其衍生物。核酸可为单链或双链。核酸可为圆形。
本文所用的术语“核苷酸”通常指核酸亚单位，其可包含A、C、G、T或U或其变体或类似物。核苷酸可包含任一可纳入正在生长的核酸链中的亚单位。该亚单位可为A、C、G、T或U，或任一对一或多个互补A、C、G、T或U具有特异性或与嘌呤(例如A或G或其变体或类似物)或嘧啶(例如C、T或U或其变体或类似物)互补的其他亚单位。亚单位可使得能够解析个体核酸碱基或碱基组(例如AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或尿嘧啶-其对应体)。
核苷酸通常包含核苷及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸酯(PO3)基团。核苷酸可包含核碱基、5碳糖(核糖或脱氧核糖)及一或多个磷酸酯基团。核糖核苷酸是其中的糖为核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸是其中的糖为脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可为单磷酸核苷或多磷酸核苷。核苷酸可为包含可检测标签(例如发光标签或标记物(例如荧光团))的多磷酸脱氧核糖核苷，例如三磷酸脱氧核糖核苷，其可选自三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧尿苷(dUTP)及三磷酸脱氧胸苷(dTTP)dNTP。
多磷酸核苷可具有“n”个磷酸酯基团，其中“n”是大于或等于2、3、4、5、6、7、8、9或10的数值。多磷酸核苷的实例包含二磷酸核苷及三磷酸核苷。核苷酸可为末端磷酸酯标记的核苷，例如末端磷酸酯标记的多磷酸核苷。该标记可为发光(例如荧光或化学发光)标记、荧光标记、着色标记、色素原标记、质量标签、静电标记或电化学标记。标记(或标记物)可经由连接子偶合至末端磷酸酯。连接子可包含(例如)至少一个或多个羟基、硫氢基、氨基或卤代烷基，其可适于在天然或经修饰核苷酸的末端磷酸酯处形成(例如)磷酸酯、硫酯、氨基磷酸酯或烷基膦酸酯连接。连接子可(例如)藉助聚合酶发生裂解以使标记与末端磷酸酯分离。核苷酸和连接子的实例提供于美国专利第7,041,812号中，该专利的全部内容以引用方式并入本文中。
核苷酸(例如多磷酸核苷酸)可包括甲基化核碱基。举例而言，甲基化核苷酸可为包括一或多个附接至核碱基上(例如直接附接至核碱基环、附接至核碱基环的取代基)的甲基的核苷酸。示例性甲基化核碱基包含1-甲基胸腺嘧啶、1-甲基尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6，N6-二甲基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、N2-甲基鸟嘌呤及N2，N2-二甲基鸟嘌呤。
如本文所用，术语“引物”通常是指这样的核酸分子(例如寡核苷酸)，其可包括含有A、C、G、T和/或U的序列，或其变体或类似物。引物可以是含有DNA、RNA、PNA或其变体或类似物的合成性寡核苷酸。引物可以经过设计从而其核苷酸序列与靶链互补，或者引物可以包含随机核苷酸序列。在一些实施方案中，引物可以包含尾部(例如聚A尾、指数适配子(index adaptor)、分子条码等等)。在一些实施方案中，引物可以包含5-15个碱基、10-20个碱基、15-25个碱基、20-30个碱基、25-35个碱基、30-40个碱基、35-45个碱基、40-50个碱基、45-55个碱基、50-60个碱基、55-65个碱基、60-70个碱基、65-75个碱基、70-80个碱基、75-85个碱基、80-90个碱基、85-95个碱基、90-100个碱基、95-105个碱基、100-150个碱基、125-175个碱基、150-200或多于200个碱基。
发光性质
如本文中所阐述，发光分子是吸收一或多个光子且可随后在一或多个持续时间之后发射一或多个光子的分子。分子的发光由若干参数阐述，包含(但不限于)发光寿命、吸收光谱、发射光谱、发光量子产率及发光强度。术语吸收和激发可在整个本申请案中互换使用。典型发光分子可吸收多个波长下的光或经受该光的激发。在某些波长下或某些光谱范围内的激发可由发光发射事件松弛(relax)，而在某些其他波长或光谱范围下的激发可能并不由发光发射事件松弛。在一些实施例中，发光分子仅经适宜激发以用于在单个波长下或单个光谱范围内的发光。在一些实施例中，发光分子经适当激发以用于在两个或更多个波长下或两个或更多个光谱范围内的发光。在一些实施例中，藉由测量激发光子的波长或吸收光谱来鉴别分子。
来自发光发射事件的发射光子将在可能波长的光谱范围内的波长下发射。通常，发射光子的波长长于(例如具有较小能量或红移)激发光子的波长。在某些实施例中，藉由测量发射光子的波长来鉴别分子。在某些实施例中，藉由测量多个发射光子的波长来鉴别分子。在某些实施例中，藉由测量发射光谱来鉴别分子。
发光寿命是指激发事件与发射事件之间的持续时间。在一些实施例中，将发光寿命表示为指数式衰减方程式中的常数。在存在一或多个递送激发能的脉冲事件的一些实施例中，持续时间是脉冲与后续发射事件之间的时间。
可使用任一适宜方法(例如藉由使用适宜技术测量寿命或藉由测定发射的时间依赖性特性)来实施分子的“发光寿命测定”。在一些实施例中，测定分子的发光寿命包括测定相对于一或多种分子(例如测序反应中的经发光标记的不同核苷酸)的寿命。在一些实施例中，测定分子的发光寿命包括测定相对于参考的寿命。在一些实施例中，测定分子的发光寿命包括测量寿命(例如荧光寿命)。在一些实施例中，测定分子的发光寿命包括测定一或多种指示寿命的时间特性。在一些实施例中，可基于相对于激发脉冲多个发生于一或多个时间门控窗口中的发射事件(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个发射事件)的分布来测定分子的发光寿命。举例而言，可基于对于激发脉冲测量的光子到达时间的分布，区分单个分子的发光寿命与多个具有不同发光寿命的分子。
应了解，单个分子的发光寿命可指示在单个分子达到激发态之后所发射光子的时序且可藉由指示光子时序的信息来区分单个分子。一些实施例可包含基于分子的发光寿命藉由测量与分子所发射光子有关的时间自多个分子区分某一分子。时间分布可指示可自分布测定的发光寿命。在一些实施例中，可基于时间分布(例如)藉由比较时间分布与对应于已知分子的参考分布自多个分子区分单个分子。在一些实施例中，自时间分布测定发光寿命的值。
发光量子产率是指在给定波长下或在给定光谱范围内引起发射事件的激发事件的分数，且通常小于1。在一些实施例中，本文所阐述分子的发光量子产率介于0与约0.001之间、介于约0.001与约0.01之间、介于约0.01与约0.1之间、介于约0.1与约0.5之间、介于约0.5与0.9之间或介于约0.9与1之间。在一些实施例中，藉由测定或估计发光量子产率来鉴别分子。
如本文中针对单个分子所使用，发光强度是指每单位时间由藉由递送脉冲激发能激发的分子发射的发射光子数。在一些实施例中，发光强度是指每单位时间由通过递送脉冲激发能激发的分子发射的发射光子的检测数，且藉由特定传感器或传感器组来检测。
给定分子的发光寿命、发光量子产率及发光强度可各自在不同条件下有所变化。在一些实施例中，单个分子与分子总体具有不同的观察的发光寿命、发光量子产率或发光强度。在一些实施例中，限定于试样孔(例如纳米孔口)中的分子与并不限定于试样孔中的分子具有不同的观察的发光寿命、发光量子产率或发光强度。在一些实施例中，附接至另一分子的发光标记或发光分子与并不附接至另一分子的发光标记或发光分子具有不同的发光寿命、发光量子产率或发光强度。在一些实施例中，与大分子复合物(例如蛋白质复合物(例如核酸聚合酶))相互作用的分子与并不与大分子复合物相互作用的分子具有不同的发光寿命、发光量子产率或发光强度。
在某些实施例中，本申请案中所阐述的发光分子吸收一个光子且在持续时间之后发射一个光子。在一些实施例中，可藉由测量持续时间来测定或估计分子的发光寿命。在一些实施例中，可藉由测量多个脉冲事件及发射事件的多个持续时间来测定或估计分子的发光寿命。在一些实施例中，可藉由测量持续时间在多种分子的发光寿命中来区别一个分子的发光寿命。在一些实施例中，可藉由测量多个脉冲事件及发射事件的多个持续时间在多种分子的发光寿命中来区别一个分子的发光寿命。在某些实施例中，藉由测定或估计分子的发光寿命在多种分子中鉴别或区别一个分子。在某些实施例中，藉由在多种分子的多个发光寿命中区别一个分子的发光寿命来在多种分子中鉴别或区别该分子。
在某些实施例中，发光发射事件是荧光。在某些实施例中，发光发射事件是磷光。如本文中所使用，术语发光涵盖所有发光事件，包含荧光和磷光。
在一个方面中，本申请案提供测定单个发光分子的发光寿命的方法，其包括：在靶容积中提供发光分子；将多个激发能脉冲递送至靶容积附近；及检测来自发光分子的多个发光。在一些实施例中，该方法进一步包括评估在每一对脉冲与发光之间的多个持续时间的分布。在一些实施例中，该方法进一步包括将单个发光分子固定于靶容积中。
在另一个方面中，本申请案提供测定多个分子的发光寿命的方法，其包括：在靶容积中提供多个发光分子；将多个激发能脉冲递送至靶容积附近；及检测来自发光分子的多个发光。在一些实施例中，该方法进一步包括评估在每一对脉冲与发光之间的多个持续时间的分布。在一些实施例中，该方法进一步包括将发光分子固定于靶容积中。在一些实施例中，多个包括2至约10个分子、约10至约100个分子或约100至约1000个分子。在一些实施例中，多个包括约1000至约106个分子、约106至约109个分子、约109至约1012个分子、约1012至约1015个分子或约1015至约1018个分子。在一些实施例中，所述多个中的所有分子皆是相同类型的分子。
图3展示具有不同发光寿命的4种发光分子(最长至最短，顶部至底部)的示例性衰减图谱3-1。幅值可指来自包括许多分子的试样的发光强度，其基于发光寿命在初始激发之后随时间而指数式降低。或者，幅值可指在多个激发能脉冲之后且在持续时间之后(例如)针对单个分子所检测的发射的数量或计数。对于具有不同发光寿命的4种发光分子(最短至最长，顶部至底部)，归一化累积分布函数3-2对应于3-1。CDF可代表基于发光寿命在初始激发之后随时间变化达到零的发光幅值的归一化机率(例如所有已发光的激发分子的累积机率)。或者，CDF可代表在单个激发能脉冲之后或在多个激发能脉冲中的每一者之后在某一持续时间下发光的单个分子的归一化机率。
在一个方面中，本申请案提供测定单个发光分子的发光强度的方法，其包括：在靶容积中提供发光分子；将多个激发能脉冲递送至靶容积附近；及检测来自发光分子的多个发光。在一些实施例中，该方法进一步包括测定每单位时间的多个所检测发光的数量。在一些实施例中，该方法进一步包括将单个发光分子固定于靶容积中。
在另一个方面中，本申请案提供测定多个分子的发光强度的方法，其包括：在靶容积中提供多个发光分子；将多个激发能脉冲递送至靶容积附近；及检测来自发光分子的多个发光。在一些实施例中，该方法进一步包括测定每单位时间的多个所检测发光的数量。在一些实施例中，该方法进一步包括将发光分子固定于靶容积中。在一些实施例中，多个包括2至约10个分子、约10至约100个分子或约100至约1000个分子。在一些实施例中，多个包括约1000至约106个分子、约106至约109个分子、约109至约1012个分子、约1012至约1015个分子或约1015至约1018个分子。在一些实施例中，所述多个在的所有分子皆是相同类型的分子。
激发能
在本文所阐述方法的一个方面中，使用一或多种激发能来激发拟鉴别或区分的分子的发光标记。在一些实施例中，激发能位于可见光谱中。在一些实施例中，激发能位于紫外光谱中。在一些实施例中，激发能位于红外光谱中。在一些实施例中，使用一种激发能来激发经发光标记的分子。在一些实施例中，使用两种激发能来激发经发光标记的分子。在一些实施例中，使用三种或更多种激发能来激发经发光标记的分子。在一些实施例中，藉由所递送激发能中的仅一者来激发每一经发光标记的分子。在一些实施例中，藉由所递送激发能中的两者或更多者来激发经发光标记的分子。在某些实施例中，激发能可为单色或限定于一定光谱范围中。在一些实施例中，光谱范围的范围介于约0.1nm与约1nm之间、介于约1nm及约2nm之间或介于约2nm与约5nm之间。在一些实施例中，光谱范围的范围介于约5nm与约10nm之间、介于约10nm与约50nm之间或介于约50nm与约100nm之间。
在某些实施例中，以光脉冲形式递送激发能。在某些实施例中，以多个光脉冲的形式递送激发能。在某些实施例中，使用两种或更多种激发能来激发经发光标记的分子。在一些实施例中，同时递送每一激发能(例如在每一脉冲中)。在一些实施例中，在不同时间递送每一激发能(例如在每一能量的单独脉冲中)。可以任一足以容许检测来自靶分子的发光的模式来递送不同激发能。在一些实施例中，在每一脉冲中递送两种激发能。在一些实施例中，以交替脉冲递送第一激发能及第二激发能。在一些实施例中，以一系列连续脉冲递送第一激发能，且以后续一系列连续脉冲递送第二激发能，或以此类系列的交替模式递送。
在某些实施例中，基于经发光标记的分子的发光性质来选择光脉冲的频率。在某些实施例中，基于多种经发光标记的核苷酸的发光性质来选择光脉冲的频率。在某些实施例中，基于多种经发光标记的核苷酸的发光寿命来选择光脉冲的频率。在一些实施例中，频率经选择以便脉冲之间的间隙长于一或多种经发光标记的核苷酸的发光寿命。在一些实施例中，基于多种经发光标记的核苷酸的最长发光寿命来选择频率。举例而言，若4种经发光标记的核苷酸的发光寿命为0.25ns、0.5ns、1.0ns及1.5ns，则光脉冲的频率可经选择以便脉冲之间的间隙超过1.5ns。在一些实施例中，间隙长于一或多种所激发经发光标记的分子的发光寿命约两倍至约10倍、约10倍至约100倍或约100倍至约1000倍。在一些实施例中，间隙长于一或多种所激发经发光标记的分子的发光寿命约10倍。在一些实施例中，间隙介于约0.01ns与约0.1ns之间、介于约1ns与约5ns之间、介于约5ns与约15ns之间、介于约15ns与约25ns之间或介于约25ns与约50ns之间。在一些实施例中，间隙经选择以便存在50％、75％、90％、95％或99％的机率由脉冲激发的分子将以发光方式衰减或激发态藉由另一机制松弛。
在存在多种激发能的某些实施例中，每一激发能的脉冲频率相同。在存在多种激发能的某些实施例中，每一激发能的脉冲频率均不同。举例而言，若使用红色雷射来激发寿命为0.2ns至0.5ns的发光分子，且使用绿色雷射来激发寿命为5ns与7ns的发光分子，则在每一红色激光脉冲之后的间隙可短于(例如5ns)在每一绿色激光脉冲之后的间隙(例如20ns)。
在某些实施例中，基于所监测化学方法来选择脉冲激发能的频率。对于测序反应而言，频率可经选择以便递送足够容许检测足够数量的拟检测发射光子的多个脉冲。在检测光子的背景中，足够数量系指自多种经发光标记的核苷酸鉴别或区分该经发光标记的核苷酸所需的光子数。举例而言，DNA聚合酶可平均每20毫秒一次地纳入额外的核苷酸。经发光标记的核苷酸与复合物相互作用的时间可约为10毫秒，且发光标记物裂解时与下一经发光标记的核苷酸开始相互作用时之间的时间可约为10毫秒。然后可选择脉冲激发能的频率以经10毫秒递送足够脉冲，从而在纳入经发光标记的核苷酸时在10毫秒期间检测到足够数量的发射光子。举例而言，在100MHz频率下，在10毫秒中具有100万个脉冲(纳入事件的近似长度)。若这些脉冲的0.1％产生检测光子，则存在1,000个发光数据点可经分析以测定所纳入经发光标记的核苷酸的身份。任一上述值皆系非限制性。在一些实施例中，纳入事件可耗费1ms至20ms、20ms至100ms或100ms至500ms。在以单独计时脉冲递送多种激发能的一些实施例中，经发光标记的核苷酸可仅由一部分脉冲激发。在一些实施例中，选择多种激发能脉冲的频率及模式，从而该脉冲数量足以激发多种经发光标记的核苷酸中的任一者以容许检测足够数量的发射光子。
在一些实施例中，脉冲频率介于约1MHz与约10MHz之间。在一些实施例中，脉冲频率介于约10MHz与约100MHz之间。在一些实施例中，脉冲频率介于约100MHz与约1GHz之间。在一些实施例中，脉冲频率介于约50MHz与约200MHz之间。在一些实施例中，脉冲频率约为100MHz。在一些实施例中，频率系随机的。
在某些实施例中，激发能介于约500nm与约700nm之间。在一些实施例中，激发能介于约500nm与约600nm或约600nm与约700nm之间。在一些实施例中，激发能介于约500nm与约550nm之间、介于约550nm与约600nm之间、介于约600nm与约650nm之间或介于约650nm与约700nm之间。
在某些实施例中，本文所阐述的方法包括递送两种激发能。在一些实施例中，两种激发能相隔约5nm至约20nm、约20nm至约40nm、约40nm至约60nm、约60nm至约80nm、约80nm至约100nm、约100nm至约150nm、约150nm至约200nm、约200nm至约400nm或至少约400nm。在一些实施例中，两种激发能相隔约20nm至约80nm或约80nm至约160nm。
在激发能被称为位于特定范围中时，激发能可包括单个波长，从而波长位于该范围之间或位于其端点处，或激发能可包括具有最大强度的波长光谱，从而最大强度位于该范围之间或位于其端点处。
在某些实施例中，第一激发能在450nm至500nm范围内且第二激发能在500nm至550nm、550nm至600nm、600nm至650nm或650nm至700nm的范围内。在某些实施例中，第一激发能在500nm至550nm范围内且第二激发能在450nm至500nm、550nm至600nm、600nm至650nm或650nm至700nm的范围内。在某些实施例中，第一激发能在550nm至600nm范围内且第二激发能在450nm至500nm、500nm至550nm、600nm至650nm或650nm至700nm的范围内。在某些实施例中，第一激发能在600nm至650nm范围内且第二激发能在450nm至500nm、500nm至550nm、550nm至600nm或650nm至700nm的范围内。在某些实施例中，第一激发能在650nm至700nm范围内且第二激发能在450nm至500nm、500nm至550nm、550nm至600nm或600nm至650nm的范围内。
在某些实施例中，第一激发能在450nm至500nm范围内且第二激发能在500nm至550nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在450nm至500nm范围内且第二激发能在550nm至600nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在450nm至500nm范围内且第二激发能在600nm至670nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在500nm至550nm范围内且第二激发能在550nm至600nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在500nm至550nm范围内且第二激发能在600nm至670nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在550nm至600nm范围内且第二激发能在600nm至670nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在470nm至510nm范围内且第二激发能在510nm至550nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在470nm至510nm范围内且第二激发能在550nm至580nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在470nm至510nm范围内且第二激发能在580nm至620nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在470nm至510nm范围内且第二激发能在620nm至670nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在510nm至550nm范围内且第二激发能在550nm至580nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在510nm至550nm范围内且第二激发能在580nm至620nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在510nm至550nm范围内且第二激发能在620nm至670nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在550nm至580nm范围内且第二激发能在580nm至620nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在550nm至580nm范围内且第二激发能在620nm至670nm范围内。在某些实施例中，第一激发能在580nm至620nm范围内且第二激发能在620nm至670nm范围内。
用于将激发能脉冲递送至靶容积中的激发能来源及设备的某些实施例阐述于本文其他处。
经发光标记的核苷酸
在一个方面中，本文所阐述的方法及组合物包括一或多种经发光标记的核苷酸。在某些实施例中，一或多种核苷酸包括脱氧核糖核苷。在一些实施例中，所有核苷酸皆包括脱氧核糖核苷。在某些实施例中，一或多种核苷酸包括核糖核苷。在一些实施例中，所有核苷酸皆包括核糖核苷。在一些实施例中，一或多种核苷酸包括经修饰核糖或核糖类似物(例如锁核酸)。在一些实施例中，一或多种核苷酸包括天然碱基(例如胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。在一些实施例中，一或多种核苷酸包括胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶的衍生物或类似物。
在某些实施例中，该方法包括将聚合酶复合物暴露于多种经发光标记的核苷酸的步骤。在某些实施例中，组合物或设备包括含有多种经发光标记的核苷酸的反应混合物。在一些实施例中，多种核苷酸包括4类核苷酸。在一些实施例中，4类核苷酸各自包括胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤及胸腺嘧啶中的一者。在一些实施例中，4类核苷酸各自包括胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤及尿嘧啶中的一者。
在某些实施例中，每一类经发光标记的核苷酸在反应混合物中的浓度介于约50nM与约200nM、约200nM与约500nM、约500nM与约1μM、约1μM与约50μM或约50μM与250μM之间。在一些实施例中，每一类经发光标记的核苷酸在反应混合物中的浓度介于约250nM与约2μM之间。在一些实施例中，每一类经发光标记的核苷酸在反应混合物中的浓度约为1μM。
在某些实施例中，反应混合物含有用于测序反应的其他试剂。在一些实施例中，反应混合物包括缓冲剂。在一些实施例中，缓冲剂包括3-(N-吗啉基)丙烷磺酸(MOPS)。在一些实施例中，缓冲剂系以介于约1mM与约100mM之间的浓度存在。在一些实施例中，MOPS浓度约为50mM。在一些实施例中，反应混合物包括一或多种盐。在一些实施例中，盐包括乙酸钾。在一些实施例中，乙酸钾的浓度约为140mM。在一些实施例中，盐以介于约1mM与约200mM之间的浓度存在。在一些实施例中，反应混合物包括镁盐(例如乙酸镁)。在一些实施例中，乙酸镁的浓度约为20mM。在一些实施例中，镁盐以介于约1mM与约50mM之间的浓度存在。在一些实施例中，反应混合物包括还原剂。在一些实施例中，还原剂系二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施例中，还原剂以介于约1mM与约50mM之间的浓度存在。在一些实施例中，DTT的浓度约为5mM。在一些实施例中，反应混合物包括一或多种光稳定剂。在一些实施例中，反应混合物包括抗氧化剂、除氧剂或三重态淬灭剂。在一些实施例中，光稳定剂包括原儿茶酸(PCA)。在一些实施例中，光稳定剂包括4-硝基苄醇(NBA)。在一些实施例中，光稳定剂系以介于约0.1mM与约20mM之间的浓度存在。在一些实施例中，PCA的浓度约额3mM。在一些实施例中，NBA的浓度约为3mM。含有光稳定剂(例如PCA)的混合物亦可包括酶以再生光稳定剂(例如原儿茶酸二氧酶(PCD))。在一些实施例中，PCD的浓度约为0.3mM。
本申请案涵盖区别多种核苷酸中的核苷酸的不同方法。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命。在某些实施例中，两种或更多种经发光标记的核苷酸具有相同发光寿命或基本上相同的发光寿命(例如不能藉由该方法或设备区分的寿命)。
在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的每一者吸收不同光谱范围中的激发能。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的两者吸收相同光谱范围中的激发能。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的三者吸收相同光谱范围中的激发能。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的四者或更多者吸收相同光谱范围中的激发能。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的两者吸收不同光谱范围中的激发能。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的三者吸收不同光谱范围中的激发能。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的四者或更多者吸收不同光谱范围中的激发能。
在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的每一者发射不同光谱范围中的光子。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的两者发射相同光谱范围中的光子。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的三者发射相同光谱范围中的光子。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的四者或更多者发射相同光谱范围中的光子。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的两者发射不同光谱范围中的光子。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的三者发射不同光谱范围中的光子。在某些实施例中，经发光标记的核苷酸中的四者或更多者发射不同光谱范围中的光子。
在某些实施例中，4种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命。在某些实施例中，两种或更多种经发光标记的核苷酸具有不同发光寿命且吸收和/或发射第一光谱范围中的光子，且一或多种经发光标记的核苷酸吸收和/或发射第二光谱范围中的光子。在一些实施例中，三种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命且在第一光谱范围中发光，且第四经发光标记的核苷酸吸收和/或发射第二光谱范围中的光子。在一些实施例中，两种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命且在第一光谱范围中发光，且第三及第四经发光标记的核苷酸各自具有不同发光寿命并在第二光谱范围中发光。
在某些实施例中，4种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光强度。在某些实施例中，两种或更多种经发光标记的核苷酸具有不同发光强度且在第一光谱范围中发光，且一或多种经发光标记的核苷酸吸收和/或发射第二光谱范围中的光子。在一些实施例中，三种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光强度且在第一光谱范围中发光，且第四经发光标记的核苷酸吸收和/或发射第二光谱范围中的光子。在一些实施例中，两种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光强度且在第一光谱范围中发光，且第三及第四经发光标记的核苷酸各自具有不同发光强度并在第二光谱范围中发光。
在某些实施例中，4种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命或发光强度。在某些实施例中，两种或更多种经发光标记的核苷酸具有不同发光寿命或发光强度且在第一光谱范围中发光，且一或多种经发光标记的核苷酸吸收和/或发射第二光谱范围中的光子。在一些实施例中，三种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命或发光强度且在第一光谱范围中发光，且第四经发光标记的核苷酸吸收和/或发射第二光谱范围中的光子。在一些实施例中，两种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命或发光强度且在第一光谱范围中发光，且第三及第四经发光标记的核苷酸各自具有不同发光寿命或发光强度并在第二光谱范围中发光。
在某些实施例中，两种或更多种经发光标记的核苷酸具有不同发光寿命且吸收第一光谱范围中的激发能，且一或多种经发光标记的核苷酸吸收第二光谱范围中的激发能。在一些实施例中，三种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命且吸收第一光谱范围中的激发能，且第四经发光标记的核苷酸吸收第二光谱范围中的激发能。在一些实施例中，两种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命且吸收第一光谱范围中的激发能，且第三及第四经发光标记的核苷酸各自具有不同发光寿命并吸收第二光谱范围中的激发能。
在某些实施例中，两种或更多种经发光标记的核苷酸具有不同发光寿命或发光强度且吸收第一光谱范围中的激发能，且一或多种经发光标记的核苷酸吸收第二光谱范围中的激发能。在一些实施例中，三种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命或发光强度且吸收第一光谱范围中的激发能，且第四经发光标记的核苷酸吸收第二光谱范围中的激发能。在一些实施例中，两种经发光标记的核苷酸中的每一者具有不同发光寿命或发光强度且吸收第一光谱范围中的激发能，且第三及第四经发光标记的核苷酸各自具有不同发光寿命或发光强度并吸收第二光谱范围中的激发能。
在测序期间，鉴别核苷酸的方法可在序列中的各种碱基对之间有所变化。在某些实施例中，可标记两类核苷酸以吸收第一激发能，且基于不同发光强度来区分该两类核苷酸(例如A、G)，而可标记两种其他类型的核苷酸(例如C、T)以吸收第二激发能，且基于不同发光寿命来区分该两种其他类型的核苷酸。对于此类实施例而言，在测序期间，可仅基于发光强度来确定序列的某些区段(例如仅纳入A及G的区段)，而可仅基于发光寿命来确定序列的其他区段(例如仅纳入C及T的区段)。在一些实施例中，基于发光寿命来区别2至4种经发光标记的核苷酸。在一些实施例中，基于发光强度来区别2至4种经发光标记的核苷酸。在一些实施例中，基于发光寿命及发光强度来区别2至4种经发光标记的核苷酸。
图4展示示例性的经发光标记的核苷酸的发光寿命4-1及相同示例性核苷酸的发光强度4-2。举例而言，第四列展示连接至荧光团Alexa555(AF555)的六磷酸脱氧胸苷(dT6P)核苷酸的数据。该经发光标记的核苷酸具有大约0.25ns的寿命且显示大约20000个计数/s的发光强度。任一经发光标记的核苷酸的所观察发光寿命及发光强度可通常针对核苷酸在纳入条件(例如在单个分子复合物中、在纳米孔口中)与其他较典型条件(例如针对4-1及4-2的条件)有所不同。
发光检测
在本文所阐述方法的一个方面中，藉由一或多个传感器检测一个发射光子(发光)或多个发射光子。对于多种经发光标记的分子或核苷酸而言，每一分子可发射单个光谱范围中的光子，或一部分分子可发射第一光谱范围中的光子且另一部分分子可发射第二光谱范围中的光子。在某些实施例中，藉由单个传感器检测发射光子。在某些实施例中，藉由多个传感器检测发射光子。在一些实施例中，藉由第一传感器检测在第一光谱范围中发射的光子，且藉由第二传感器检测在第二光谱范围中发射的光子。在一些实施例中，藉由不同传感器检测在多个光谱范围中的每一者中发射的光子。
在某些实施例中，每一传感器经构形以基于激发能与发射光子之间的持续时间来向发射光子分配时间仓。在一些实施例中，在较短持续时间之后发射的光子将分配较早时间仓，且在较长持续时间之后发射的光子将分配稍后时间仓。
在一些实施例中，将多个激发能脉冲递送至靶容积附近且检测到多个光子(其可包含光子发射事件)。在一些实施例中，多个发光(例如光子发射事件)对应于将经发光标记的核苷酸纳入核酸产物中。在一些实施例中，经发光标记的核苷酸的纳入持续约1ms至约5ms、约5ms至约20ms、约20ms至约100ms或约100ms至约500ms。在一些实施例中，在纳入经发光标记的核苷酸期间检测到约10至约100、约100至约1000、约1000至约10000或约10000至约100000个发光。
在某些实施例中，若并未纳入经发光标记的核苷酸，则检测不到发光。在一些实施例中，存在发光背景。在一些实施例中，在并未纳入经发光标记的核苷酸时，检测到假性发光。在激发能脉冲期间于靶容积中存在一或多种经发光标记的核苷酸但并未藉由测序反应纳入(例如扩散至靶容积中，或与聚合酶相互作用但并未纳入)时，此类假性发光可出现。在一些实施例中，自靶容积中并未纳入的经发光标记的核苷酸所检测到的多个发光小于(例如10、100倍、1000倍、10000倍)来自经发光标记的核苷酸的多个发光。
在一些实施例中，对于每一多个对应于经发光标记的核苷酸的纳入的所检测发光而言，基于脉冲与发射光子之间的持续时间来向发光分配时间仓。关于纳入事件的该多个在本文中称为“突发”。在一些实施例中，突发系指高于基线(例如噪声临限值)的一系列信号(例如测量)，其中所述信号对应于出现于经发光标记的核苷酸处于激发区内时的多个发射事件。在一些实施例中，突发与先前和/或后续突发相隔代表基线的信号的时间间隔。在一些实施例中，藉由基于多个持续时间测定发光寿命来分析突发。在一些实施例中，藉由基于每单位时间的检测发光数测定发光强度来分析突发。在一些实施例中，藉由测定所检测发光的光谱范围来分析突发。在一些实施例中，分析突发数据使得可分配所纳入经发光标记的核苷酸的身份，或使得可在多种经发光标记的核苷酸中区别一或多种经发光标记的核苷酸。分配或区别可依赖于发射光子的发光寿命、发光强度、光谱范围中的任一者或其任一组合。
图5绘示示例性模板核酸的测序。使用以下4种经发光标记的核苷酸来运行测序实验：连接至Alexa647(A-AF647)的脱氧腺苷、连接至Alex Fluor 555(T-AF555)的脱氧胸苷、连接至DyLightTM 554-R1(G-D554R1)的脱氧胍及连接至DyLightTM 530-R2(C-D530R2)的脱氧胞苷。藉由红色光谱范围中的激发能激发核苷酸A-AF647，且藉由绿色光谱范围中的激发能激发T、G及C核苷酸。在～200s的测序反应中检测的光子数展示于强度迹线5-1中。每一尖峰对应于所检测发光的突发且使用圆点进行标记。每一突发可对应于经发光标记的核苷酸的纳入，且包括数千个所检测的发光。可利用不同颜色的迹线来表示不同激发脉冲。举例而言，紫色迹线可用于绿色激发脉冲，且蓝色迹线可用于红色激发脉冲。来自蓝色迹线的突发可被分配为纳入核苷酸A-AF647(此实例中具有红色发光分子的唯一核苷酸)。
图5展示使用强度对寿命绘图5-2还原原始数据以区别相同颜色的突发(例如T、G及C之间的紫色迹线中的突发)的一种方式。每一圆代表来自紫色迹线的突发。分析每一突发以基于每一检测光子的脉冲与发射之间的持续时间来测定经发光标记的核苷酸的发光寿命。另外，分析每一突发以基于每秒的检测光子数来测定经发光标记的核苷酸的发光强度。纳入事件群集于对应于三种经发光标记的核苷酸中的每一者的三组中。将绘图下部中的暗簇(虚线下方的图形区域)分配为C-D530R2，其具有最长发光寿命及最低发光强度。将绘图下部中的亮簇(虚线下方的图形区域)分配为G-D554R，其具有中间寿命及强度。且将绘图上部中的光簇(虚线上方的图形区域)分配为T-AF555，其具有最短寿命及最高强度。图5展示自数据测得的序列与模板核酸的已知序列之间的比对5-3。垂直条指示以实验方式测得的碱基与靶序列之间的匹配。破折号指示模板序列中并不在所确定序列中分配核苷酸的位置，或指示所确定序列中并不对应于模板序列中的任一位置的额外位置。
图6绘示对模板核酸实施测序的第二实例。使用以下4种经发光标记的核苷酸来运行测序实验：连接至Alexa647(A-AF647)的脱氧腺苷、连接至Alex Fluor 555(T-AF555)的脱氧胸苷、连接至Alexa647(G-AF647)的脱氧胍及连接至Alexa546(C-AF546)的脱氧胞苷。藉由红色光谱范围中的激发能激发核苷酸A-AF647及G-AF647，且藉由绿色光谱范围中的激发能激发T及C核苷酸。在此实验中，A及G具有相同发光标记物，且并不区分。图6在强度迹线6-1中展示在约300s测序反应中检测的光子数。每一尖峰对应于所检测发光的突发且使用圆点进行标记。每一突发可对应于经发光标记的核苷酸的纳入，且包括数千个所检测的发光。该迹线展示绿色激发脉冲的所检测发光(对应于碱基T及C)。
图6展示使用强度对寿命绘图6-2还原原始数据以区别T及C的一种方式。每一圆代表来自强度迹线6-1的突发。分析每一突发以基于每一检测光子的脉冲及发射之间的持续时间来测定经发光标记的核苷酸的发光寿命。另外，分析每一突发以基于每秒的检测光子数来测定经发光标记的核苷酸的发光强度。纳入事件群集于对应于两种经发光标记的核苷酸中的每一者的两组中。将绘图右侧部分中的暗簇(虚线右侧的图形区域)分配至C-AF546，其具有最长发光寿命及最低发光强度。将绘图右侧部分中的光簇(虚线右侧的图形区域)分配为T-AF555，其具有最短寿命及最高强度。图6展示自数据测得的序列与模板核酸的已知序列之间的比对6-3。垂直条指示以实验方式测得的碱基与靶序列之间的匹配。破折号指示模板序列中并不在所测测序列中分配核苷酸的位置，或指示所测测序列中并不对应于模板序列中的任一位置的额外位置。
在一些实施例中，可制备测序反应的一或多种组份且用于试样孔(如展示于图7-9中的非限制性实施例中所绘示)中以(例如)用于分析测序反应背景中的发光标记。
发光标记
术语发光标签、发光标记及发光标记物可通篇互换使用，且涉及包括一或多个发光分子的分子。在某些实施例中，所纳入分子是(例如)并不附接不同发光标记的发光分子。典型核苷酸及氨基酸并不发光，或并不在激发能及发射能的适宜范围内发光。在某些实施例中，所纳入分子包括发光标记。在某些实施例中，所纳入分子系是经发光标记的核苷酸。在某些实施例中，所纳入分子是经发光标记的氨基酸或经发光标记的tRNA。在一些实施例中，经发光标记的核苷酸包括核苷酸及发光标记。在一些实施例中，经发光标记的核苷酸包括核苷酸、发光标记及连接子。在一些实施例中，发光标记是荧光团。
在某些实施例中，发光标记和任选的连接子保持附接至所纳入分子。在某些实施例中，发光标记和任选的连接子在纳入过程期间或之后自分子裂解。
在某些实施例中，发光标记是青色素染料或其类似物。在一些实施例中，青色素染料具有下式：
或其盐、立体异构体或互变异构体，其中：
A1及A2连接形成任选的经取代的芳香族或非芳香族、单环或多环杂环；
B1及B2连接形成任选的经取代的芳香族或非芳香族、单环或多环杂环；
R1及R2中的每一者独立地是氢、任选的经取代的烷基；且
L1及L2中的每一者独立地是氢、任选的经取代的烷基，或L1及L2连接形成任选的经取代的芳香族或非芳香族、单环或多环碳环。
在某些实施例中，发光标记是罗丹明染料或其类似物。在一些实施例中，罗丹明染料具有下式：
或其盐、立体异构体或互变异构体，其中：
A1及A2中的每一者独立地是氢、任选的经取代的烷基、任选的经取代的芳香族或非芳香族杂环基、任选的经取代的芳香族或非芳香族碳环基或任选的经取代的羰基，或A1及A2连接形成任选的经取代的芳香族或非芳香族、单环或多环杂环；
B1及B2中的每一者独立地是氢、任选的经取代的烷基、任选的经取代的芳香族或非芳香族杂环基、任选的经取代的芳香族或非芳香族碳环基或任选的经取代的羰基，或B1及B2连接形成任选的经取代的芳香族或非芳香族、单环或多环杂环；
R2及R3中的每一者独立地是氢、任选的经取代的烷基、任选的经取代的芳基或任选的经取代的酰基；且
R4是氢、任选的经取代的烷基、任选的经取代的芳基、任选的经取代的芳香族或非芳香族杂环基、任选的经取代的芳香族或非芳香族碳环基或任选的经取代的羰基。
在一些实施例中，R4是任选的经取代的苯基。在一些实施例中，R4是任选的经取代的苯基，其中至少一种取代基是任选的经取代的羰基。在一些实施例中，R4是任选的经取代的苯基，其中至少一种取代基是任选的经取代的磺酰基。
通常，发光标记包括芳香族或杂芳香族化合物且可为芘、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚、苯并吲哚、噁唑、咔唑、噻唑、苯并噻唑、啡啶、吩噁嗪、卟啉、喹啉、乙锭、苯甲酰胺、青色素、羰花青素、水杨酸盐、邻氨基苯甲酸酯、香豆素、荧光素、罗丹明或其他类似化合物。示例性染料包含呫吨染料，例如荧光素或罗丹明染料，包含5-羧基荧光素(FAM)、2′7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、四氯荧光素(TET)、6-羧基罗丹明(R6G)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)。示例性染料还包含在α或β位置中具有氨基的萘胺染料。举例而言，萘基氨基化合物包含1-二甲基氨基萘基-5-磺酸酯、1-苯氨基-8-萘磺酸酯及2-对-甲苯氨基-6-萘磺酸酯、5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。其他示例性染料包含香豆素，例如3-苯基-7-异氰酸基香豆素；吖啶，例如9-异硫氰基吖啶及吖啶橙；N-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺；青色素，例如吲哚二羰花青素3(Cy3)、(2Z)-2-[(E)-3-[3-(5-羧基戊基)-1，1-二甲基-6，8-二磺基苯并[e]吲哚-3-鎓-2-基]丙-2-亚烯基]-3-乙基-1，1-二甲基-8-(三氧烷基硫基)苯并[e]吲哚-6-磺酸酯2-{2-[(2，5-二氧吡咯啶-1-基)氧基]-2-氧乙基}-16，16，18，18-四甲基-6，7，7a，8a，9，10，16，18-八氢苯并[2″，3″]吲嗪并[8″，7″：5′，6′]吡喃并[3′，2′：3，4]吡啶并[1，2-a]吲哚-5-鎓-14-磺酸酯吲哚二羰花青素5吲哚二羰花青素5.53-(-羧基-戊基)-3′-乙基-5，5′-二甲基氧杂羰花青素(CyA)；1H，5H，11H，15H-呫吨并[2，3，4-ij：5，6，7-i′j′]二喹啉-18-鎓、9-[2(或4)-[[[6-[2，5-二侧氧基-1-吡咯啶基)氧基]-6-侧氧基己基]氨基]磺酰基]-4(或2)-磺基苯基]-2，3，6，7，12，13，16，17-八氢-内盐(TR或Texas)；染料；苯并噁唑；二苯乙烯；芘；及诸如此类。
对于核苷酸测序而言，经发光标记的核苷酸的某些组合可以是优选的。在一些实施例中，经发光标记的核苷酸中的至少一者包括青色素染料或其类似物。在一些实施例中，至少一种经发光标记的核苷酸包括罗丹明染料或其类似物。在一些实施例中，至少两种经发光标记的核苷酸各自包括青色素染料或其类似物。在一些实施例中，至少两种经发光标记的核苷酸各自包括罗丹明染料或其类似物。在一些实施例中，至少三种经发光标记的核苷酸各自包括青色素染料或其类似物。在一些实施例中，至少三种经发光标记的核苷酸各自包括罗丹明染料或其类似物。在一些实施例中，至少4种经发光标记的核苷酸各自包括青色素染料或其类似物。在一些实施例中，至少4种经发光标记的核苷酸各自包括罗丹明染料或其类似物。在一些实施例中，三种经发光标记的核苷酸包括青色素染料或其类似物，且第四经发光标记的核苷酸包括罗丹明染料或其类似物。在一些实施例中，两种经发光标记的核苷酸包括青色素染料或其类似物，且第三及任选的第四经发光标记的核苷酸包括罗丹明染料或其类似物。在一些实施例中，三种经发光标记的核苷酸包括罗丹明染料或其类似物，且第三及任选的第四经发光标记的核苷酸包括青色素染料或其类似物。
在一些实施例中，至少一种经标记核苷酸连接至两种或更多种染料(例如两个或更多个拷贝的相同染料和/或两种或更多种不同染料)。
在一些实施例中，至少两种经发光标记的核苷酸吸收第一激发能，其中经发光标记的核苷酸中的至少一者包括青色素染料或其类似物，且经发光标记的核苷酸中的至少一者包括罗丹明染料或其类似物。在一些实施例中，至少两种经发光标记的核苷酸吸收第二激发能，其中经发光标记的核苷酸中的至少一者包括青色素染料或其类似物，且经发光标记的核苷酸中的至少一者包括罗丹明染料或其类似物。在一些实施例中，至少两种经发光标记的核苷酸吸收第一激发能，其中经发光标记的核苷酸中的至少一者包括青色素染料或其类似物，且经发光标记的核苷酸中的至少一者包括罗丹明染料或其类似物，且至少两种额外经发光标记的核苷酸吸收第二激发能，其中经发光标记的核苷酸中的至少一者包括青色素染料或其类似物，且经发光标记的核苷酸中的至少一者包括罗丹明染料或其类似物。
在一些实施例中，至少两种经发光标记的核苷酸吸收第一激发能，其中经发光标记的核苷酸中的至少一者具有小于约1ns的发光寿命，且经发光标记的核苷酸中的至少一者具有大于1ns的发光寿命。在一些实施例中，至少两种经发光标记的核苷酸吸收第二激发能，其中经发光标记的核苷酸中的至少一者具有小于约1ns的发光寿命，且经发光标记的核苷酸中的至少一者具有大于1ns的发光寿命。在一些实施例中，至少两种经发光标记的核苷酸吸收第一激发能，其中经发光标记的核苷酸中的至少一者具有小于约1ns的发光寿命，且经发光标记的核苷酸中的至少一者具有大于1ns的发光寿命，且至少两种其他经发光标记的核苷酸吸收第二激发能，其中经发光标记的核苷酸中的至少一者具有小于约1ns的发光寿命，且经发光标记的核苷酸中的至少一者具有大于1ns的发光寿命。
在某些实施例中，发光标记是选自表1的染料。表1中所列示的染料是非限制性，且本申请案的发光标记可包含未列示于表1中的染料。在某些实施例中，一或多种经发光标记的核苷酸的发光标记是选自表1。在某些实施例中，4种或更多种经发光标记的核苷酸的发光标记选自表1。
表1.示例性荧光团
亦可基于最大吸收或所发射发光的波长来对染料进行分类。表2提供根据最大吸收的近似波长分组成行的示例性荧光团。表2中所列示的染料是非限制性，且本申请案的发光标记可包含未列示于表2中的染料。确切的最大吸收或发射波长可能并不对应于所指示光谱范围。在某些实施例中，一或多种经发光标记的核苷酸的发光标记选自表2中所列示的“红色”组。在某些实施例中，一或多种经发光标记的核苷酸的发光标记选自表2中所列示的“绿色”组。在某些实施例中，一或多种经发光标记的核苷酸的发光标记选自表2中所列示的“黄色/橙色”组。在某些实施例中，选择4种核苷酸的发光标记，从而其皆选自表2中所列示的“红色”、“黄色/橙色”或“绿色”组中的一者。在某些实施例中，选择4种核苷酸的发光标记，从而三种是选自表2中所列示的“红色”、“黄色/橙色”及“绿色”组的第一组，且第四种是选自表2中所列示的“红色”、“黄色/橙色”及“绿色”组的第二组。在某些实施例中，选择4种核苷酸的发光标记，从而两种系选自表2中所列示的“红色”、“黄色/橙色”及“绿色”组的第一组，且第三种及第四种系选自表2中所列示的“红色”、“黄色/橙色”及“绿色”组的第二组。在某些实施例中，选择4种核苷酸的发光标记，从而两种系选自表2中所列示的“红色”、“黄色/橙色”及“绿色”组的第一组，且第三种系选自表2中所列示的“红色”、“黄色/橙色”及“绿色”组的第二组，且第四种系选自表2中所列示的“红色”、“黄色/橙色”及“绿色”组的第三组。
表2.根据光谱范围分组的示例性荧光团。
在某些实施例中，发光标记可为下式的(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)(呈NHS酯形式)或其类似物：
在一些实施例中，每一磺酸酯或羧酸酯独立地是任选的经质子化。在一些实施例中，上述染料藉由在指示附接点处形成酰胺键来附接至连接子或核苷酸。
在某些实施例中，发光标记可包括第一发色团及第二发色团。在一些实施例中，第一发色团的激发态能够经由能量转移至第二发色团来松弛。在一些实施例中，能量转移是福斯特共振能量转移(F6rster resonance energy transfer，FRET)。这种FRET对可用于提供具有使得标记较易于从多个发光标记中区别开来的性质的发光标记。在某些实施例中，FRET对可吸收第一光谱范围中的激发能且在第二光谱范围中发光。
对于经发光标记的分子(例如经发光标记的核苷酸)的组而言，经发光标记的FRET对的性质可容许选择多个可区分分子(例如核苷酸)。在一些实施例中，FRET对的第二发色团具有不同于多个其他经发光标记的分子的发光寿命。在一些实施例中，FRET对的第二发色团具有不同于多个其他经发光标记的分子的发光强度。在一些实施例中，FRET对的第二发色团具有不同于多个其他经发光标记的分子的发光寿命和发光强度。在一些实施例中，FRET对的第二发色团发射不同于多个其他经发光标记的分子的光谱范围中的光子。在一些实施例中，FRET对的第一发色团具有不同于多个经发光标记的分子的发光寿命。在某些实施例中，FRET对可吸收不同于多个其他经发光标记的分子的光谱范围中的激发能。在某些实施例中，FRET对可吸收与多个其他经发光标记的分子中的一或多者相同的光谱范围中的激发能。
在一些实施例中，两种或更多种核苷酸可连接至发光标记，其中该核苷酸连接至发光标记上的不同位置。非限制性实例可包含含有两个与核苷酸类似物上的反应性部分兼容的独立反应性化学部分(例如叠氮基、乙炔基团、羧基、氨基)的发光分子。在此种实施例中，发光标记可经由独立连接连接至两个核苷酸分子。在一些实施例中，发光标记可包括两个或更多个至两种或更多种核苷酸的独立连接。
在一些实施例中，两种或更多种核苷酸可经由连接子(例如具支链连接子或两个或更多个可附接核苷酸和/或染料的反应性位点的连接子)连接至发光染料。因此，在一些实施例中，两种或更多种核苷酸(例如相同类型)可连接至两种或更多种染料(例如相同类型)。
在一些实施例中，发光标记可包括具有发光性质的量子点。在一些实施例中，一或多种核苷酸连接至量子点。在一些实施例中，一或多种核苷酸经由与蛋白质不同位点的连接连接至量子点。在一些实施例中，使用核苷酸分子涂覆量子点的表面。在某些实施例中，量子点以共价方式连接至一或多种核苷酸(例如经由每一组份上的反应性部分)。在某些实施例中，量子点以非共价方式连接至一或多种核苷酸(例如经由每一组份上的兼容非共价结合配偶体)。在一些实施例中，量子点的表面包括一或多个以非共价方式结合至一或多种生物素化核苷酸的链霉亲合素分子。
在一些实施例中，发光标记可包括具有发光性质的蛋白质。在一些实施例中，一或多种核苷酸连接至发光蛋白。在一些实施例中，一或多种核苷酸经由至蛋白质不同位点的连接连接至发光蛋白。在某些实施例中，选择4种核苷酸的发光标记，从而一种核苷酸经荧光蛋白标记，而剩余三种核苷酸经荧光染料(例如表1及2中的非限制性实例)标记。在某些实施例中，选择4种核苷酸的发光标记，从而两种核苷酸经荧光蛋白标记，而剩余两种核苷酸经荧光染料(例如表1及2中的非限制性实例)标记。在某些实施例中，选择4种核苷酸的发光标记，从而三种核苷酸经荧光蛋白标记，而剩余核苷酸经荧光染料(例如表1及2中的非限制性实例)标记。在一些实施例中，选择4种核苷酸的发光标记，从而所有4种核苷酸皆经荧光蛋白标记。
根据本申请案的一些方面，发光标记(例如染料，例如荧光团)可损害曝光于激发光的测序反应中的聚合酶。在一些方面中，此损害发生于纳入经发光标记的核苷酸期间，此时发光分子与聚合酶保持紧密靠近。损害反应的非限制性实例包含在聚合酶与发光分子之间形成共价键以及自发光分子向酶发射辐射或非辐射衰减。此可缩短聚合酶的有效性且减小测序运行的长度。
在一些实施例中，核苷酸及发光标记由相对较长的连接子或连接子构形连接以保持发光标记在纳入经标记核苷酸期间远离聚合酶。术语“连接子构形”在本文中用于指连接发光分子与核苷酸的整个结构且并不涵盖发光分子或核苷酸。
在一些实施例中，单个连接子连接发光分子与核苷酸。在一些实施例中，连接子含有一或多个分歧点，从而两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)核苷酸连接至每一发光分子，两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)发光分子连接至每一核苷酸，或两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)核苷酸连接至两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)发光分子。
在一些实施例中，连接子构形决定了发光标记与核苷酸之间的距离。在一些实施例中，该距离为约1nm或2nm至约20nm。举例而言，大于2nm、大于5nm、5-10nm、大于10nm、10-15nm、大于15nm、15-20nm、大于20nm。然而，发光标记与核苷酸之间的距离不能过长，此乃因发光标记需要位于照射容积内以在核苷酸保持于酶的活性位点内时得以激发。因此，在一些实施例中，整体连接子长度为小于30nm、小于25nm、约20nm或小于20nm。
在一些实施例中，在连接子构形内包含保护分子。保护分子可为蛋白质、蛋白质同二聚体、蛋白质异二聚体、蛋白质寡聚物、聚合物或可防止聚合酶损害可发生于酶与发光标记之间的反应的其他分子。保护分子的非限制性实例包含蛋白质(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、特拉普唯丁(Traptavidin)、奈特拉唯丁(NeutrAvidin)、泛蛋白)、蛋白质复合物(例如胰蛋白酶：BPTI、芽孢杆菌rna酶：芽胞杆菌、大肠菌素E9核酸酶：Im9免疫蛋白)、核酸(例如脱氧核糖核酸、核糖核酸)、多糖、脂质及碳纳米管。
在一些实施例中，保护分子是寡核苷酸(例如DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或其变体)。在一些实施例中，寡核苷酸是单链。在一些实施例中，发光标记直接或间接附接至单链寡核苷酸的一端(例如5’端或3’端)且一或多种核苷酸直接或间接附接至单链寡核苷酸的另一端(例如3’端或5’端)。举例而言，单链寡核苷酸可包括附接至寡核苷酸的5’端的发光标记以及一或多种附接至寡核苷酸的3’端的核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸是双链(举例而言，寡核苷酸包括两条复性、互补寡核苷酸链)。在一些实施例中，发光标记直接或间接附接至双链寡核苷酸的一端且一或多种核苷酸直接或间接附接至双链核苷酸的另一端。在一些实施例中，发光标记直接或间接附接至双链寡核苷酸的一条链且一或多种核苷酸直接或间接附接至双链核苷酸的另一条链。举例而言，双链寡核苷酸可包括附接至寡核苷酸一条链的5’端的发光标记以及一或多种附接至另一条链的5’端的核苷酸。
在一些实施例中，保护分子连接至一或多个发光分子以及一或多个核苷酸分子。在一些实施例中，发光分子并不毗邻核苷酸。举例而言，一或多个发光分子可连接于保护分子的第一侧上且一或多种核苷酸可连接至保护分子的第二侧，其中保护分子的第一侧及第二侧彼此远离。在一些实施例中，其大致位于保护分子的相对侧上。
保护分子与发光标记的连接点和保护分子与核苷酸的连接点间的距离可为空间中的线性量测值或保护分子表面上的非线性量测值。可藉由对保护分子的三维结构进行建模来测量保护分子上的发光标记及核苷酸连接点之间的距离。在一些实施例中，此距离可为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20nm或更大。或者，可藉由将保护分子的结构处理为二次曲面(例如椭球面、椭圆柱面)来阐述保护分子上的发光标记及核苷酸的相对位置。在一些实施例中，发光标记及核苷酸的间隔距离至少为代表保护分子的椭圆形形状的周长的八分之一。在一些实施例中，发光标记及核苷酸的间隔距离至少为代表保护分子的椭圆形形状的周长的四分之一。在一些实施例中，发光标记及核苷酸的间隔距离至少为代表保护分子的椭圆形形状的周长的三分之一。在一些实施例中，发光标记及核苷酸的间隔距离为代表保护分子的椭圆形形状的周长的一半。
图10阐释发光分子(200)与核苷酸(250)由保护分子(100)分隔的非限制性实例10-1。发光分子(200)经由连接子(300)连接至保护分子(100)，其中连接子(300)附接至保护分子(100)。核苷酸(250)经由连接子(350)连接至保护分子(100)，其中连接子(350)附接至保护分子(100)。保护分子可用于提供防止发光标记靠近聚合酶的空间障壁。保护分子可用于吸收由发光分子发射的辐射及非辐射衰减，或使聚合酶免于该辐射及非辐射衰减。保护分子可用于在发光标记与聚合酶之间提供空间障壁及衰减障壁。
保护分子的大小应使得在核苷酸保持于酶的活性位点内时发光标记不能或不可能直接接触聚合酶。保护分子的大小亦应使得在核苷酸保持于酶的活性位点内时所附接发光标记位于拟激发的照射容积内。应考虑经选择以连接发光标记与保护分子的连接子以及经选择以连接核苷酸与保护分子的连接子，来选择保护分子的大小。保护分子及用于连接发光标记和核苷酸(例如多磷酸核苷)的连接子包括连接子构形，其中连接子构形的大小应使得在核苷酸保持于酶的活性位点内时发光标记不能直接接触聚合酶。
保护分子(和/或包括保护分子的连接子构形)优选为水溶性。在一些实施例中，优选保护分子(和/或包括保护分子的连接子构形)具有净负电荷。
在一些实施例中，因一或多个连接标记与核苷酸的非共价连接，标记(例如发光分子)并不以共价方式连接至核苷酸。在一些实施例中，一或多个连接子以非共价方式附接至保护分子和/或发光分子。在一些实施例中，一或多个连接子以非共价方式附接至保护分子和/或核苷酸。在一些实施例中，发光标记以共价方式附接至连接子，其中连接子以非共价方式附接至保护分子(例如经由一或多个结合配偶体)。在一些实施例中，核苷酸以共价方式附接至连接子，其中连接子以非共价方式附接至保护分子(例如经由一或多个结合配偶体)。
图10-15图解说明经由保护分子连接的一或多个发光分子及一或多个核苷酸的非限制性实例，其中一或多个发光分子及一或多个核苷酸以非共价方式附接至保护分子。
图10图解说明包括10-1的要素的非限制性实例10-2，其中连接子包括以非共价方式将发光分子附接至保护分子(阴影形状)的非共价结合位点(110)的非共价结合配体(400)，且第二连接子包括以非共价方式将核苷酸附接至保护分子的第二非共价结合位点(120)的非共价结合配体(450)。
图10图解说明包括10-2的要素的非限制性实例10-3，其中保护分子(阴影形状)包括4个独立非共价结合位点。第二独立发光分子可经由非共价结合配体(401)以非共价方式附接至保护分子的非共价结合位点(111)。第二独立核苷酸分子可经由非共价结合配体(451)以非共价方式附接至保护分子的非共价结合位点(121)。在绘示两个独立发光分子及两个独立核苷酸以非共价方式结合于保护分子的4个独立非共价结合位点处的此实施例中，任意选择发光分子及核苷酸的数量。在一些实施例中，保护分子的4个独立非共价结合位点在一个位点处包括一个发光分子且在剩余三个位点中的每一者处包括一个核苷酸。在一些实施例中，保护分子的4个独立非共价结合位点在一个位点处包括一个核苷酸且在剩余三个位点中的每一者处包括一个发光分子。
图10图解说明包括10-3的要素的非限制性实例10-4，其中连接子(301)包括两个经由保护分子(阴影形状)的两个独立非共价结合位点以非共价方式附接单个发光分子的独立非共价结合配体(400、401)，且连接子(351)包括两个经由保护分子的剩余两个独立非共价结合位点以非共价方式附接单个核苷酸的独立非共价结合配体(450、451)。
图11图解说明包括10-4的要素的非限制性实例11-1，其中连接子(301)包括允许附接两个发光分子的分歧点(302)。
图11图解说明包括11-1的要素的非限制性实例11-2，其中连接子(351)包括允许附接两个核苷酸的分歧点(352)。
图11图解说明包括11-2的要素的非限制性实例11-3，其中连接子(302)包括两个允许附接4个发光分子的额外分歧点(304)且连接子(352)包括两个允许附接4个核苷酸的额外分歧点(354)。
图11图解说明包括11-3的要素的非限制性实例11-4，其中(304)中所绘示的每一分歧点包括允许附接总共6个发光分子的额外发光分子的额外附接部分，且(354)中所绘示的每一分歧点包括允许附接总共6个核苷酸的额外核苷酸的额外附接部分。
图12图解说明可用于测序反应中的一组以下经标记核苷酸分子的非限制性实例：胸腺嘧啶12-1、腺嘌呤12-2、胞嘧啶12-3及鸟嘌呤12-4。在此实施例中，使用包括4个非共价结合位点的保护分子来将6个相同类型核苷酸连接至一或多个发光分子。在此实施例中，6个相同类型核苷酸经由两个单独连接子附接至保护分子，每一连接子包括以共价方式连接至三个相同类型核苷酸的独立非共价结合配体。如由12-1、12-2及12-3所绘示，单个发光分子经由包括两个以非共价方式附接至保护分子的两个独立结合位点的独立非共价结合配体的连接子以非共价方式附接至保护分子。如12-4中所绘示，发光连接子中的分歧点允许添加第二发光分子。
在包括4种示例性核苷酸的测序实验中，12-1、12-2及12-3的发光标记可包括三种独特发光分子(例如三种不同荧光团)。由于这些示例性分子各自仅含有单个荧光团，故若不使用独特荧光团，则用于区分胸腺嘧啶、腺嘌呤或胞嘧啶纳入的性质(例如发光寿命、发光强度、发射波长)将高度类似或不可区分。鸟嘌呤12-4连接至两个发光分子。在一些实施例中，12-4的发光标记可包括两种相同发光分子，其中所选分子不同于12-1、12-2及12-3中所使用的荧光团。在包括连接至4种独特荧光团的4种独特核苷酸的测序反应中，每一荧光团应具有一或多种容许自多种中区分每一者的独特发光性质(例如发光寿命、强度、发射波长或其两者或更多者的组合)。在一些实施例中，12-4的两种荧光团可包括两种相同荧光团，其中所选荧光团与12-1、12-2及12-3的荧光团中的一者相同。在包括连接至不同编号的相同发光分子的独特核苷酸的测序反应中，不同编号的荧光团应赋予容许自多种核苷酸区分一种核苷酸的独特性质(例如增加的发光强度)。或者，12-4的两种荧光团可包括FRET对。
图12另外图解说明测序实验及可使用何种独特发光性质区分多种经发光标记的核苷酸12-5的非限制性实例。连接至每一碱基(胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤)的经发光标记具有容许每一经标记核苷酸自多种经标记核苷酸区分的发光性质(例如发光寿命、发光强度和/或发射波长)。包含相同类型的多个核苷酸可用于在加速测序反应中的纳入速率。
利用经发光标记的核苷酸12-5的测序实验可实施于示例性反应器皿12-6中。该反应发生于波导上方的室中，波导用作用于激发能的导管，从而藉由来自波导的衰逝波将激发能递送至反应室底部的试样中。孔口阻断自波导辐射至本体试样的光及来自传感器的环境和/或杂散光，且提供用于反应室的制作路径。反应室是经蚀刻结构，其将试样置于底部且位于来自波导的衰逝波的高激发区内。使用选择性表面化学来提供反应室的具有不同组成的底部及侧壁，从而可将试样选择性局部化至反应室的底部。用于表面制备的示例性工作流程展示于图7中，其绘示尤其包括与实现选择性表面化学相关的制程的制程。举例而言，表面钝化(例如如图8中所展示的非限制性实施例中所绘示)可提供可用于表面官能化(例如如图9中所展示的非限制性实施例中所绘示)期间的选择性表面基材。
可在测序反应期间根据示例性工作流程12-7自4种经发光标记的核苷酸来区分所纳入的特定核苷酸。在整个实验过程中，存在两个不同时段：脉冲时段及检测时段。在持续20皮秒的脉冲时段期间，并未收集到发射光。在脉冲时段后是持续10纳秒的检测时段，其中4个时间仓捕获发生于检测时段中的发射事件(i)。脉冲时段及检测时段包含一个循环。将发射事件连续分仓且在100万个循环的过程上累积(ii)。跨时间仓的发射事件的整体分布代表发光寿命且可用于匹配特定数据组与已知寿命分布(iii)。在一些实施例中，发射事件的分布(例如发光寿命)并不区分一种经发光标记的碱基与多种其他经标记分子。除发射事件的分布外，可使用发射事件的量(例如发光强度)来鉴别单个分子与多种其他分子。
图13图解说明包括10-4的要素的非限制性实例13-1，其中保护分子的非共价结合位点经改造以作为非功能结合位点(461)。在一些实施例中，13-1的保护分子可包括链霉亲和素。在一些实施例中，结合位点是非功能性，此乃因其不能以非共价方式结合生物素分子。非限制性实施例13-1绘示经由两种独立非共价结合相互作用附接至保护分子的单个发光分子及经由单个非共价结合相互作用附接至保护分子的6个核苷酸。在一些实施例中，具有三个功能性非共价结合位点的保护分子可包括一或多个经由单个非共价相互作用附接的发光分子及一或多个经由两种独立非共价相互作用附接的核苷酸。在一些实施例中，具有三个功能性非共价结合位点的保护分子可包括一或多个经由两种独立非共价相互作用附接的发光分子及一或多个经由单个非共价相互作用附接的核苷酸。
图13图解说明包括10-3的要素的非限制性实例13-2，其中保护分子的两个非共价结合位点经改造以作为非功能结合位点(411、461)。在一些实施例中，13-2的保护分子可包括链霉亲和素。在一些实施例中，结合位点是非功能性，此乃因其不能以非共价方式结合生物素分子。非限制性实施例13-2绘示经由单个独立非共价结合相互作用附接至保护分子的单个发光分子及经由单个非共价结合相互作用附接至保护分子的6个核苷酸。在一些实施例中，具有两个功能性非共价结合位点的保护分子可包括一或多个经由单个非共价相互作用附接的发光分子及一或多个经由单个非共价相互作用附接的核苷酸。在一些实施例中，两个非功能非共价结合位点是顺式结合位点或反式结合位点，其中“顺式结合位点”定义为较“反式结合位点”更紧密地靠近。图13进一步绘示生成具有两个非功能反式结合位点的链霉亲和素分子的非限制性实例13-3。
在一些实施例中，连接子可包括核苷酸。图14图解说明发光分子及核苷酸经由保护分子连接的非限制性示例性反应图，其中将发光分子及核苷酸附接至保护分子的连接子包括经由二价连接子附接的寡核苷酸(例如包括DNA、RNA、PNA或其修饰形式的寡核苷酸)。包括寡核苷酸的二价连接子(360)以非共价方式结合至保护分子的两个独立非共价结合位点(a)。引入融合至与连接子(360)互补的寡核苷酸的发光分子(201)以生成经发光标记的保护分子(b)。引入包括寡核苷酸的第二二价连接子(361)以形成(c)。引入融合至与连接子(361)互补的寡核苷酸的核苷酸(251)以生成最终产物(d)。
图15图解说明发光分子经由复性互补寡核苷酸附接至保护分子的非限制性示例性反应图，其中每一寡核苷酸链含有一个与保护分子上的结合位点兼容的非共价结合配体。使融合至发光分子和非共价结合配体的第一寡核苷酸(362)复性(i)至融合至非共价结合配体的互补寡核苷酸(363)。使复性产物(364)结合至保护分子(ii)且纯化。使用本文所揭示的任一技术或构形使经发光标记的纯化保护分子与核苷酸结合(iii)。图15亦绘示使用经染料标记(使用类似于反应图中的非限制性实例的双链体DNA连接子)的核苷酸实施的示例性测序实验。
在一些实施例中，一或多个连接子以共价方式附接至保护分子和/或发光分子。在一些实施例中，一或多个连接子以共价方式附接至保护分子和/或核苷酸。
图16-20阐释经由保护分子连接的发光分子及核苷酸的非限制性实例，其中发光分子及核苷酸以共价方式附接至保护分子。
图16绘示用于生成一般保护分子(阴影形状)的反应图16-1，其中保护分子包括两个基因编码标签。基因编码标签(325)经设计以与融合至发光分子的特定反应性基团形成共价附接(i)且单独基因编码标签(375)经设计以与融合至核苷酸的特定反应性基团形成共价附接(ii)，从而形成最终产物(c)。图16进一步绘示用于经由基因编码标签(曲线)共价附接包括生物正交官能基(例如叠氮化物、醛或炔烃)的一般底物(星形)的反应图16-2的非限制性实施例，且绘示基因编码标签及动力学速率常数的非限制性实例16-3。
图17绘示用于生成一般保护分子(阴影形状)的反应图17-1的非限制性实例，其中保护分子是包括N-末端处的反应性基团及C-末端处的反应性基团的蛋白质。蛋白质第一末端处的第一反应性基团(326)经设计以与融合至发光分子的特定反应性基团形成共价附接。蛋白质的剩余末端处的第二反应性基团(376)经设计以与融合至核苷酸的特定反应性基团形成共价附接。进一步绘示了反应性N-末端基团及C-末端基团以及相应反应性基团的非限制性实例17-2。
图18绘示用于生成一般保护分子(阴影形状)的反应图18-1的非限制性实例，其中保护分子是在蛋白质的一部分处包括反应性非天然氨基酸且在蛋白质的另一部分处包括反应性非天然氨基酸的蛋白质。蛋白质的第一部分处的第一反应性非天然氨基酸(327)经设计以与融合至发光分子的特定反应性基团形成共价附接。蛋白质的第二部分的第二反应性非天然氨基酸(377)经设计以与融合至核苷酸的特定反应性基团形成共价附接。图18进一步绘示用于靶蛋白的化学标记的一般及非限制性反应图18-2。在此实例中，将具有独特生物正交官能基的非天然氨基酸(例如选自非限制性实例18-3的非天然氨基酸)经由基因密码子扩增位点特异性地引入蛋白质中且然后化学选择性地使用外部添加的探针进行标记。
图19A是由非蛋白质保护分子(101)分隔的发光分子及核苷酸的非限制性实例。非蛋白质保护分子的非限制性实例可包含核酸分子(脱氧核糖核酸、核糖核酸)、脂质及碳纳米管。如所展示，发光分子及核苷酸直接附接至非蛋白质保护分子(例如以共价方式附接)。在一些实施例中，发光分子及核苷酸直接附接至非蛋白质保护分子的邻接部分。举例而言，在一些实施例中，非蛋白质保护分子是核酸分子，且发光分子和/或核苷酸直接结合至核酸分子的核苷酸。在一些实施例中，发光分子和/或核苷酸经由并非非蛋白保护分子的邻接部分的连接子附接至非蛋白保护分子。举例而言，在一些实施例中，非蛋白质保护分子是核酸分子，且发光分子和/或核苷酸经由连接子附接至核酸。
在一些实施例中，发光分子及核苷酸可经由反应性部分附接至非蛋白保护分子，如图19B中所绘示。在此实例中，发光分子的反应性部分(550)经由非蛋白保护分子上的相应反应性部分(500)以共价方式附接至非蛋白保护分子。核苷酸上的反应性部分(551)经由非蛋白保护分子上的相应反应性部分(501)以共价方式附接至非蛋白保护分子(101)。在一些实施例中，反应性部分500和/或反应性部分501直接附接至非蛋白保护分子的邻接部分。在一些实施例中，反应性部分500和/或反应性部分501经由并非非蛋白保护分子的邻接部分的连接子附接至非蛋白保护分子。
在一些实施例中，保护分子包括蛋白质-蛋白质对。蛋白质-蛋白质对可包括任一组多肽结合配偶体(例如蛋白质-受体、酶-抑制剂、抗体-抗原)。图20绘示包括蛋白质-蛋白质结合对的保护分子的非限制性实施例。在此非限制性实例中，结合对的一个多肽(102)以正交方式经发光分子标记且第二多肽(103)以正交方式连接至核苷酸。蛋白质-蛋白质结合对的非限制性实例包含胰蛋白酶-BPTI、芽孢杆菌rna酶：芽胞杆菌及大肠菌素E9核酸酶-Im9免疫蛋白。
图21绘示包括一或多个附接至非共价结合配体的发光分子的连接子构形的非限制性实例。在实施例21-1中，包括非共价结合配体(410)、间隔连接子(310)及反应性部分(510)的第一连接子层附接至包括兼容反应性部分(211)的发光分子(210)。可使用第一连接子层的反应性部分经由兼容反应性部分直接附接至发光分子或核苷酸。可使用第一连接子层的反应性部分经由兼容反应性部分附接第二连接子层。在实施例21-2中，两个发光分子经由第二连接子层附接至第一连接子层，其中第二连接子层包括与第一层的反应性部分兼容的反应性部分(512)、包括分歧点的间隔连接子(312)以及与发光分子的反应性部分兼容的两个反应性部分(522)。可使用第二连接子层的两个反应性部分直接附接至发光分子或核苷酸分子。可使用第二连接子层的两个反应性部分附接第三连接子层以进一步增加包括连接子构形的发光分子或核苷酸的数量。在实施例21-3中，6个发光分子经由结合于每一反应性部分(522)处的第三连接子层附接至第二连接子层，其中每个第三连接子层包括兼容反应性部分(513)、三官能化间隔连接子(313)以及与发光分子的反应性部分兼容的三个反应性部分(523)。
因此，发光标记可直接(例如藉由键)附接至分子，或可经由连接子或连接子构形附接。在某些实施例中，连接子包括一或多种磷酸酯。在一些实施例中，核苷酸藉由包括一或多种磷酸酯的连接子连接至发光标记。阐述为具有一或多种磷酸酯的连接子系指包括一或多种存在于连接子结构内(并不直接附接至核苷酸的一或多种磷酸酯)的磷酸酯的连接子。在一些实施例中，核苷酸藉由包括三种或更多种磷酸酯的连接子连接至发光标记。在一些实施例中，核苷酸藉由包括4种或更多种磷酸酯的连接子连接至发光标记。
在某些实施例中，连接子包括脂肪族链。在一些实施例中，连接子包括-(CH2)n-，其中n是1至20的整数(包含此二者)。在一些实施例中，n是1至10的整数(包含此二者)。在某些实施例中，连接子包括杂脂肪族链。在一些实施例中，连接子包括聚乙二醇部分。在一些实施例中，连接子包括聚丙二醇部分。在一些实施例中，连接子包括-(CH2CH2O)n-，其中n是1至20的整数(包含此二者)。在一些实施例中，连接子包括-(CH2CH2O)n-，其中n是1至10的整数(包含此二者)。在某些实施例中，连接子包括-(CH2CH2O)4-。在某些实施例中，连接子包括一或多个亚芳基。在一些实施例中，连接子包括一或多个亚苯基(例如对-取代亚苯基)。在某些实施例中，连接子包括手性中心。在一些实施例中，连接子包括脯氨酸或其衍生物。在一些实施例中，连接子包括脯氨酸六聚体或其衍生物。在一些实施例中，连接子包括香豆素或其衍生物。在一些实施例中，连接子包括萘或其衍生物。在一些实施例中，连接子包括蒽或其衍生物。在一些实施例中，连接子包括聚苯基酰胺(polyphenylamide)或其衍生物。在一些实施例中，连接子包括苯并二氢吡喃或其衍生物。在一些实施例中，连接子包括4-氨基炔丙基-L-苯丙氨酸或其衍生物。在某些实施例中，连接子包括多肽。
在一些实施例中，连接子包括寡核苷酸。在一些实施例中，连接子包括两个复性寡核苷酸。在一些实施例中，一或多种寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或锁核糖核苷酸。
在某些实施例中，连接子包括光稳定剂。在一些实施例中，连接子具有下式：
其中PS是光稳定剂，标记为d的位置附接至发光标记，且标记为b的位置附接至核苷酸。在一些实施例中，标记为d的位置藉由如本文所阐述的连接子附接至发光标记。在一些实施例中，标记为b的位置藉由如本文所阐述的连接子附接至核苷酸。
在某些实施例中，连接子包括一或多种磷酸酯、脂肪族链、杂脂肪族链及一或多种酰胺(例如-C(＝O)NH-)。在某些实施例中，可经由图22中所绘示的示例性反应图22-1来合成包括一或多种磷酸酯和脂肪族链的连接子。示例性连接子结构进一步绘示于22-2及22-3中。在某些实施例中，连接子是选自表3中所绘示的连接子。表3中的某些示例性连接子结构展示为连接至核苷酸(例如六磷酸核苷)和/或染料。
表3.示例性连接子或连接子/染料组合。
在某些实施例中，连接子包括一或多种磷酸酯、脂肪族链、杂脂肪族链、一或多种酰胺(例如-C(＝O)NH-)及一或多种生物素部分。在某些实施例中，生物素化连接子含有一或多种可官能化的反应性部分(例如乙炔基团、叠氮基)。在某些实施例中，连接子是选自表4中所绘示的非限制性连接子。表4中的某些示例性连接子结构展示为连接至核苷酸(例如六磷酸核苷)。
表4.示例性生物素化连接子。
在一些实施例中，连接子是自包括第一层及任选的第二层和/或第三层的前体合成。在一些实施例中，“第一层”含有一或多种生物素部分。在某些实施例中，连接子的第一层含有单个生物素部分。在某些实施例中，连接子的第一层含有两种生物素部分。在一些实施例中，第一层含有一或多种反应性部分(例如叠氮基、乙炔基团、羧基、氨基)。在一些实施例中，连接子的第一层系选自表5中所绘示的结构。
表5.示例性第一连接子层。
在一些实施例中，可根据下列示例性反应图来合成连接子的第一层：
在其他实施例中，可根据下列示例性反应图来合成连接子的第一层：
在其他实施例中，可根据下列示例性反应图来合成连接子的第一层：
在一些实施例中，“第二层”含有一或多种反应性部分(例如叠氮基、乙炔基团、羧基、氨基)。在一些实施例中，第二层以共价方式附接至连接子的第一层。在一些实施例中，第二层以共价方式连接第一层与第三层。在一些实施例中，“第三层”含有一或多种反应性部分(例如叠氮基、乙炔基团、羧基、氨基)。在一些实施例中，第三层以共价方式附接至连接子的第一层。在一些实施例中，第三层经由第二层以共价方式连接至第一层。在一些实施例中，连接子包括第一层及第二层。在一些实施例中，连接子包括第一层及第三层。在一些实施例中，连接子包括第一层、第二层及第三层。在某些实施例中，第二和/或第三连接子层是选自表6中所绘示的结构。
表6.示例性第二及第三连接子层。
在一些实施例中，可根据下列示例性反应图来合成包括超出第一层的层(例如第二层和/或第三层)的连接子：
在一些实施例中，可根据下列示例性反应图来合成至少包括第二层和第三层的连接子：
具有生物素化连接子的示例性发光标记展示于表7中。应了解，不同发光标记可代替表7中所绘示的染料。
表7.具有生物素化连接子的示例性发光标记。
试样孔(例如纳米孔口)表面制备
在某些实施例中，使用限定于靶容积(例如反应容积)中的分子来实施检测一或多种经发光标记的分子的方法。在一些实施例中，靶容积是位于试样孔(例如纳米孔口)内的区域。试样孔(例如纳米孔口)及试样孔(例如纳米孔口)的制作的实例阐述于本文其他处。在某些实施例中，试样孔(例如纳米孔口)包括含有第一材料的底部表面以及由多个金属或金属氧化物层形成的侧壁。在一些实施例中，第一材料是透明材料或玻璃。在一些实施例中，底部表面是平坦的。在一些实施例中，底部表面是弯曲孔。在一些实施例中，底部表面包含侧壁中位于由多个金属或金属氧化物层形成的侧壁下方的一部分。在一些实施例中，第一材料是熔融硅石或二氧化硅。在一些实施例中，多个层各自包括金属(例如Al、Ti)或金属氧化物(例如Al2O3、TiO2、TiN)。
钝化
在一或多种分子或复合物固定于底部表面上的实施例中，可期望钝化侧壁以防止侧壁表面上的固定。在一些实施例中，藉由以下步骤来钝化侧壁：将金属或金属氧化物障壁层沉积于侧壁表面上；且向障壁层上施加涂层。在一些实施例中，金属氧化物障壁层包括氧化铝。在一些实施例中，沉积步骤包括将金属或金属氧化物障壁层沉积于侧壁表面及底部表面上。在一些实施例中，沉积步骤进一步包括自底部表面蚀刻掉金属或金属氧化物障壁层。
在一些实施例中，障壁层涂层包括磷酸酯基团。在一些实施例中，障壁层涂层包括具有烷基链的磷酸酯基团。在一些实施例中，烷基链包括具有1至20个碳原子的直链饱和烃基团。在一些实施例中，障壁层涂层包括己基磷酸(HPA)。在一些实施例中，障壁层涂层包括聚合磷酸酯。在一些实施例中，障壁层涂层包括聚乙烯基磷酸(PVPA)。在一些实施例中，障壁层涂层包括具有经取代烷基链的磷酸酯基团。在一些实施例中，烷基链包括一或多种酰胺。在一些实施例中，烷基链包括一或多个聚(乙二醇)链。在一些实施例中，涂层包括具有下式的磷酸酯基团：
其中n是介于0与100之间的整数(包含此二者)，且是氢或向表面的附接点。在一些实施例中，n是介于3与20之间的整数(包含此二者)。在一些实施例中，障壁层涂层包括不同类型的磷酸酯基团的混合物。在一些实施例中，障壁层涂层包括具有不同PEG重量的聚(乙二醇)链的磷酸酯基团的混合物。
在某些实施例中，障壁层包括nitrodopa基团。在某些实施例中，障壁层涂层包括下式的基团：
其中RN是任选的经取代的烷基链且是氢或至表面的附接点。在一些实施例中，RN包括聚合物。在一些实施例中，RN包括聚(赖氨酸)或聚(乙二醇)。在一些实施例中，障壁层包括含有赖氨酸单体的聚(赖氨酸)的共聚物，其中赖氨酸单体独立地包括PEG、nitrodopa基团、磷酸酯基团或一级胺。在某些实施例中，障壁层包括式(P)的聚合物：
在一些实施例中，X是-OMe、生物素基团、磷酸酯或硅烷。在一些实施例中，i、j、k及l中的每一者独立地是介于0与100之间的整数(包含此二者)。
图8绘示钝化金属氧化物表面的两种方法。在8-1中，使用(2-氨基乙基)磷酸处理金属氧化物表面，从而提供经(2-氨基乙基)磷酸酯基团涂覆的表面。在第二钝化步骤中，使用聚(乙二醇)NHS酯处理表面。NHS酯与表面磷酸酯基团的氨基团反应形成酰胺键以形成经PEG官能化磷酸酯基团涂覆的表面。在8-2中，使用PEG官能化磷酸处理金属氧化物表面以在一个步骤中提供经PEG官能化磷酸酯基团涂覆的表面。示例性实施例8-2进一步绘示添加第二PEG官能化磷酸，以提供经两类PEG官能化磷酸酯基团涂覆的表面。在此实例中，第一PEG磷酸具有550的平均分子量，且第二PEG磷酸具有180的平均分子量。如所绘示，较短PEG链磷酸可帮助填充表面涂层中在使用具有较长PEG链的初始PEG磷酸处理之后保留的间隙。
聚合酶固定
在一或多种分子或复合物固定于底部表面上的实施例中，可期望对底部表面实施官能化以容许附接一或多种分子或复合物。在某些实施例中，底部表面包括透明玻璃。在某些实施例中，底部表面包括熔融硅石或二氧化硅。在一些实施例中，底部表面用硅烷官能化。在一些实施例中，底部表面用离子带电聚合物官能化。在一些实施例中，离子带电聚合物包括聚(赖氨酸)。在一些实施例中，底部表面用聚(赖氨酸)-接枝-聚(乙二醇)官能化。在一些实施例中，底部表面经生物素化牛血清白蛋白(BSA)官能化。
在某些实施例中，底部表面经包括nitrodopa基团的涂层官能化。在某些实施例中，涂层包括下式的基团：
其中RN是任选的经取代的烷基链且是氢或至表面的附接点。在一些实施例中，RN包括聚合物。在一些实施例中，RN包括聚(赖氨酸)或聚(乙二醇)。在一些实施例中，RN包括生物素化聚(乙二醇)。在一些实施例中，涂层包括具有赖氨酸单体的聚(赖氨酸)的共聚物，其中赖氨酸单体独立地包括PEG、生物素化PEG、nitrodopa基团、磷酸酯基团或硅烷。在某些实施例中，涂层包括具有式(P)的聚合物：
在一些实施例中，X是-OMe、生物素基团、磷酸酯或硅烷。在一些实施例中，i、j、k及l中的每一者独立地是介于0与100之间的整数(包含此二者)。
在一些实施例中，底部表面经包括烷基链的硅烷官能化。在一些实施例中，底部表面经包括任选取代的烷基链的硅烷官能化。在一些实施例中，底部表面经包括聚(乙二醇)链的硅烷官能化。在一些实施例中，底部表面经包括偶合基团的硅烷官能化。举例而言，偶合基团可包括化学部分，例如氨基团、羧基、羟基、硫氢基、金属、螯合剂及诸如此类。或者，其可包含特异性结合要素，例如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、奈特拉唯丁、凝集素、SNAP-tagsTM或其底物、缔合或结合肽或蛋白质、抗体或抗体片段、核酸或核酸类似物或诸如此类。另外或或者，偶合基团可用于偶合用于偶合或结合所关注分子的额外基团，所关注分子可在一些情形下包含化学官能基及特异性结合要素。举例而言，可将偶合基团(例如生物素)沉积于底物表面上且在给定区域中选择性活化。然后可使中间体结合剂(例如链霉亲和素)偶合至第一偶合基团。所关注分子(其在此特定实例中经生物素化)然后偶合至链霉亲和素。
在一些实施例中，底部表面经包括生物素或其类似物的硅烷官能化。在一些实施例中，底部表面经包括聚(乙)二醇链的硅烷官能化，其中聚(乙二醇)链包括生物素。在某些实施例中，底部表面经硅烷混合物官能化，其中至少一类硅烷包括生物素且至少一类硅烷并不包括生物素。在一些实施例中，混合物包括比并不包括生物素的硅烷小约10倍、小约25倍、小约50倍、小约100倍、小约250倍、小约500倍或小约1000倍的生物素化硅烷。
图9绘示生成官能化玻璃底部表面的两种示例性途径。在上方的途径中，将玻璃表面暴露于PEG-硅烷及生物素化-PEG-硅烷的250∶1比率的混合物中。在下方的途径中，将玻璃表面首先暴露于异氰酸基-丙基-三乙氧基硅烷(IPTES)。异氰酸酯基团与PEG-胺及生物素化-PEG-胺的混合物的反应形成尿素键，且得到PEG及生物素化-PEG链经由硅烷基团附接至表面的表面。
图7绘示自所制作芯片制备试样孔表面以引发测序反应的非限制性示例性制程。试样孔绘示为具有底部表面(非阴影矩形)及侧壁(阴影垂直矩形)。侧壁可包括多个层(例如Al、Al2O3、Ti、TiO2、TiN)。在步骤(a)中，使用Al2O3障壁层沉积侧壁。然后在步骤(b)中(例如)藉由使用一或多种PEG-磷酸处理表面来使用PEG磷酸酯基团涂覆Al2O3障壁层。在步骤(c)中，使用(例如)PEG-硅烷及生物素化-PEG-硅烷的混合物对底部表面实施官能化。卵形代表可提供用于附接单个分子或复合物(例如聚合酶复合物)的位点的个别生物素基团。在步骤(d)中，将聚合酶复合物附接至底部表面上的生物素基团上。聚合酶可藉助结合剂(例如链霉亲和素)及聚合酶复合物上的生物素标签进行附接。聚合酶复合物可进一步包括模板核酸及引物(未展示)。步骤(e)绘示藉由将经固定聚合酶复合物暴露于经发光标记的核苷酸来引发测序反应。
可藉由将复合物暴露于结合混合物中的官能化表面上来将聚合酶复合物固定于表面上。在一些实施例中，结合混合物包括一或多种盐。在一些实施例中，盐包括乙酸钾。在一些实施例中，盐包括氯化钙。在一些实施例中，盐以介于约1mM与约10mM之间的浓度存在。在一些实施例中，盐以介于约10mM与约50mM之间的浓度存在。在一些实施例中，盐以介于约50mM与约100mM之间的浓度存在。在一些实施例中，盐以介于约100mM与约250mM之间的浓度存在。在一些实施例中，乙酸钾的浓度约为75mM。在一些实施例中，氯化钙的浓度约为10mM。在一些实施例中，结合混合物包括还原剂。在一些实施例中，还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施例中，还原剂以介于约1mM与约20mM之间的浓度存在。在一些实施例中，二硫苏糖醇的浓度约为5mM。在一些实施例中，结合混合物包括缓冲剂。在一些实施例中，缓冲剂包括MOPS。在一些实施例中，缓冲剂以介于约10mM与约100mM之间的浓度存在。在一些实施例中，MOPS的浓度约为50mM。在一些实施例中，缓冲剂以介于约5.5与约6.5之间的pH存在。在一些实施例中，缓冲剂以介于约6.5与约7.5之间的pH存在。在一些实施例中，缓冲剂以介于约7.5与约8.5之间的pH存在。在一些实施例中，结合混合物包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)。在一些实施例中，三磷酸脱氧核苷酸系以介于250nM与10μM之间的浓度存在。在一些实施例中，dNTP的浓度约为2μM。在一些实施例中，结合混合物包括表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂是Tween表面活性剂(例如Tween 20)。在一些实施例中，表面活性剂以介于约0.01％与约0.1％之间的容积百分比存在。在一些实施例中，Tween的容积百分比约为0.03％。
聚合酶
本文所用的术语“聚合酶”通常指任一能够催化聚合反应的酶(或聚合酶)。聚合酶的实例包含(但不限于)核酸聚合酶、转录酶或连接酶。聚合酶可为聚合作用酶。
关于单个分子核酸延伸(例如关于核酸测序)的实施例可使用任一能够合成与靶核酸分子互补的核酸的聚合酶。在一些实施例中，聚合酶可为DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和/或其一或多者的突变体或改变形式。
聚合酶的实例包含(但不限于)DNA聚合酶、RNA聚合酶、热稳定聚合酶、野生型聚合酶、经修饰聚合酶、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、噬菌体T4 DNA聚合酶DNA聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶、聚合酶、Deep VentTM聚合酶、EX-TaqTM聚合酶、LA-TaqTM聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tca聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tth聚合酶、聚合酶、PyrobestTM聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段、具有3’-5’外核酸酶活性的聚合酶及其变体、修饰产物及衍生物。在一些实施例中，聚合酶是单个亚单位聚合酶。DNA聚合酶及其性质的非限制性实例尤其详细阐述于DNA Replication第2版，Kornberg及Baker，W.H.Freeman，New York，N.Y.(1991)。
在靶核酸的核碱基与互补dNTP之间发生碱基配对后，聚合酶藉由在新近合成链的3’羟基端与dNTP的α磷酸酯之间形成磷酸二酯键来将dNTP纳入新近合成的核酸链中。在偶联至dNTP的发光标签是荧光团的实例中，藉由激发来针对其存在产生信号且在纳入步骤期间或之后检测发射脉冲。对于检测接合至dNTP的末端(γ)磷酸酯的标记，将dNTP纳入新近合成链中会释放β和γ磷酸酯以及检测标记，检测标记自由扩散至试样孔中，从而使得自荧光团检测的发射有所降低。
在一些实施例中，聚合酶是具有高合成力(processivity)的聚合酶。然而，在一些实施例中，聚合酶是具有减小的合成力的聚合酶。聚合酶合成力通常指聚合酶连续将dNTP纳入核酸模板中而不释放核酸模板的能力。
在一些实施例中，聚合酶系具有低5′-3′外核酸酶活性和/或3′-5′外核酸酶活性的聚合酶。在一些实施例中，对聚合酶进行修饰(例如藉由氨基酸取代)以相对于相应野生型聚合酶具有减小的5′-3′外核酸酶活性和/或3′-5′活性。DNA聚合酶的其他非限制性实例包含9°NmTM DNA聚合酶(New England Biolabs)及Klenow外-聚合酶的P680G突变体(Tuske等人(2000)JBC 275(31)：23759-23768)。在一些实施例中，具有减小的合成力的聚合酶会增加对含有一或多个核苷酸重复片段(例如相同类型的两个或更多个连续碱基)的模板进行测序的准确度。
在一些实施例中，聚合酶是较非标记核酸对经标记核苷酸具有较高亲和力的聚合酶。
关于单个分子RNA延伸(例如关于RNA测序)的实施例可使用任一能够自RNA模板合成互补DNA(cDNA)的逆转录酶。在该类实施例中，逆转录酶可以类似于聚合酶的方式发挥作用，其中可通过将dNTP纳入复性至RNA模板的逆转录引物中，自RNA模板来合成cDNA。cDNA然后可参与测序反应且如上文及本文其他处所阐述来测定其序列。然后可使用cDNA的所确定序列经由序列互补性来确定原始RNA模板的序列。逆转录酶的实例包含莫罗尼鼠类白血病病毒逆转录酶(Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase，M-MLV)、禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、人类免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1)及端粒酶逆转录酶。
本领域技术人员可藉由相对于相应野生型聚合酶的突变或其他修饰来增加或降低不同类型核酸的合成力、外核酸酶活性、相对亲和力或核酸聚合酶的其他性质。
模板
本发明提供用于检测生物分子或其亚单位(例如核酸分子)的设备、系统及方法。该检测可包含测序。可自获得自个体(例如人类或其他个体)的生物试样提取生物分子。在一些实施例中，个体可为患者。在一些实施例中，可检测靶核酸和/或测序以用于诊断、预后和/或治疗目的。在一些实施例中，用于测序测定法的信息可用于辅助疾病或病状的诊断、预后和/或治疗。在一些实施例中，个体可怀疑患有健康病状，例如疾病(例如癌症)。在一些实施例中，个体可经历疾病治疗。
在一些实施例中，可自个体的体液或组织(例如呼吸、唾液、尿液、血液(例如全血或血浆)、粪便或其他体液或生检试样)来提取生物试样。在一些实例中，自个体的体液或组织提取一或多种核酸分子。可自获得自个体(例如个体组织的一部分)或获得自个体的无细胞体液(例如全血)的一或多种细胞来提取所述一或多种核酸。
可在制备中处理生物试样以用于检测(例如测序)。该处理可包含自生物试样分离和/或纯化生物分子(例如核酸分子)和生成生物分子的更多拷贝。在一些实例中，自个体的体液或组织分离且纯化一或多种核酸分子，且经由核酸扩增(例如聚合酶链式反应(PCR))进行扩增。然后，可(例如)经由测序来鉴别一或多种核酸分子或其亚单位。然而，在一些实施例中，可如本申请案中所阐述无需扩增即评估(例如测序)核酸试样。
如本申请案中所阐述，测序可包含藉由以下方式来测定模板生物分子(例如核酸分子)的个体亚单位：合成与模板互补或类似的另一生物分子(例如藉由合成与模板核酸分子互补的核酸分子)且鉴别随时间的核苷酸纳入(例如藉由合成进行测序)。或者，测序可包含直接鉴别生物分子的个体亚单位。
在测序期间，可将指示生物分子的个体亚单位的信号收集于内存中且实时或在稍后时间点处理以测定生物分子的序列。该处理可包含对比该信号与参考信号以使得能够鉴别个体亚单位，此在一些情形下将产生读数。所述读数可为具有足够长度(例如至少约30、50、100个碱基对(bp)或更多)的序列，其可用于鉴别较大序列或区域，例如其可比对至染色体或基因组区域或基因上的位置。
可使用序列读数来重构个体基因组的较长区域(例如藉由比对)。可使用读数来重构染色体区、全染色体或全基因组。可使用序列读数或自该读数生成的较大序列来分析个体基因组(例如鉴别变体或多态性)。变体的实例包含(但不限于)单核苷酸多态性(SNP)(包含串联SNP)、小规模多碱基缺失或插入(亦称为indel或缺失插入多态性(DIP))、多核苷酸多态性(MNP)、短串联重复(STR)、缺失(包含微缺失)、插入(包含微插入)、结构变体(包含复制、倒转、易位、倍增、复合多位点变体、拷贝数变体(CNV))。基因组序列可包括变体组合。举例而言，基因组序列可涵盖一或多种SNP及一或多种CNV的组合。
术语“基因体”通常指生物体的遗传性信息的整体。基因组可编码于DNA或RNA中。基因组可包括编码蛋白质的编码区以及非编码区。基因组可包含生物体中所有染色体一起的序列。举例而言，人类基因体具有总共46条染色体。所有这些染色体的序列一起构成人类基因组。在一些实施例中，测定整个基因组的序列。然而，在一些实施例中，用于基因组亚组(例如一个或数个染色体或其区域)或用于一个或数个基因(或其片段)的序列信息足以用于诊断、预后和/或治疗应用。
可完成多个单链靶核酸模板的核酸测序，其中可使用多个试样孔(例如纳米孔口)，如本文其他处所阐述设备中的情形。每一试样孔可提供有单链靶核酸模板且可在每一试样孔中完成测序反应。可使每一试样孔在引物延伸反应期间与核酸合成所需的适当试剂(例如dNTP、测序引物、聚合酶、辅因子、适当缓冲剂等)接触且可在每一试样孔中进行测序反应。在一些实施例中，使多个试样孔同时与所有适当dNTP接触。在其他实施例中，使多个试样孔与每一适当dNTP单独接触且在与不同dNTP接触之间各自进行洗涤。可在每一试样孔中检测所纳入dNTP且如本文其他处所阐述测定每一试样孔中的单链靶核酸的序列。
尽管一些实施例可涉及藉由检测样品中的单个分子进行诊断测试，但发明者亦已认识到，可使用本发明的单个分子检测能力来实施(例如)基因的一或多种核酸区段的多肽(例如蛋白质)测序或核酸(例如DNA、RNA)测序。
装置的概述
发明人已进一步认识到且了解，用于检测及定量单个分子或颗粒的小型高速装置可减小对生物和/或化学试样进行复合定量量测的成本，且快速推进了生物化学技术发现的速率。此外，易于运输的高性价比设备不仅可转变在发达国家实施生物分析的方式，也首次为发展中国家的人民提供了可大幅改善其健康及生存状况的基本诊断测试。举例而言，本文所阐述的实施例可用于血液、尿液和/或唾液的诊断测试中，该类诊断测试可在发展中国家由个体在其家中使用，或由医生在偏远诊疗所中使用。
具有大量像素(例如数百、数千、数百万或更多)的像素化传感器设备使得可平行检测多种单体分子或颗粒。该等分子可为(举例而言且并不加以限制)蛋白质和/或DNA。此外，可以大于100个讯框/秒获取数据的高速设备使得可检测且分析随时间发生于所分析试样内的动态过程或变化。
发明人已认识到且了解，妨碍生物分析设备变得更为小型的一个阻碍是需要过滤激发光以防止在传感器处引起不期望的检测事件。用于透射期望信号光(发光)且足以阻断激发光的光学滤光片可是厚的、巨大、昂贵且不能承受光入射角度的变化，从而妨碍了小型化。然而，发明人认识到且了解，使用脉冲激发源可减小该滤光需要或在一些情形下完全去除该等滤光片的需要。藉由使用能够测定相对于激发光脉冲检测到光子的时间的传感器，可基于接收光子的时间而非所接收光的光谱来分离信号光与激发光。因此，对于巨大光学滤光片的需要在一些实施例中有所减小和/或得以去除。
发明人已认识到且了解，亦可使用发光寿命量测来鉴别存在于试样中的分子。能够在检测到光子时进行检测的光学传感器能够使用自许多事件搜集的统计值来测量由激发光激发的分子的发光寿命。在一些实施例中，除进行发光的光谱量测外亦进行发光寿命量测。或者，可在鉴别试样分子时完全省略发光的光谱量测。可使用脉冲激发源进行发光寿命量测。另外，可使用包含传感器的集成设备或光源位于与集成设备分开的系统中的设备进行发光寿命量测。
发明者亦认识到且了解，将试样孔(例如纳米孔口)及传感器集成于能够量测自生物试样发射的发光的单个集成设备中会减小产生这一设备的成本，从而可形成抛弃式生物分析芯片。与基础仪器介接的抛弃式、一次性集成设备可用于世界上的任何地方，且并无需要用于试样分析的高成本生物实验室的限制。因此，可为先前不能实施生物试样的定量分析的地区带来自动化生物分析。举例而言，可藉由以下方式来实施婴儿的血样测试：将血样置于抛弃式集成设备上，将抛弃式集成设备置于较小可携式基础仪器中用于分析，且藉由计算机处理结果以用于使用者进行直接审核。数据亦可经数据网络传输至远程位置以进行分析，和/或归档以用于后续临床分析。
发明人亦认识到且了解，可藉由在芯片上不包含光源来使抛弃式、一次性设备更加简单且成本更低。相应地，光源可为纳入与抛弃式芯片介接以分析试样的系统中的可再用组件。
发明人亦认识到且了解，在使用多种不同类型发光标记物对试样加注标签时，可使用发光标记物的任一适宜特性来鉴别存在于芯片的特定像素中的标记物的类型。举例而言，可使用由标记物发射的发光的特征和/或激发吸收的特征来鉴别标记物。在一些实施例中，可使用发光的发射能(其与光波长直接相关)来区分第一类型标记物与第二类型标记物。另外或或者，亦可使用发光寿命量测来鉴别存在于特定像素处的标记物的类型。在一些实施例中，可利用脉冲激发源使用能够以足够分辨率区分检测光子时的时间的传感器进行发光寿命量测以获得寿命信息。另外或或者，可使用由不同类型标记物吸收的激发光的能量来鉴别存在于特定像素处的标记物的类型。举例而言，第一标记物可吸收第一波长的光，但并不等效吸收第二波长的光，而第二标记物可吸收第二波长的光，但并不等效吸收第一波长的光。以此方式，在可使用一种以上激发光源(各自具有不同激发能)以交错方式照射试样时，可使用标记物的吸收能量鉴别存在于试样中的标记物类型。不同标记物亦可具有不同发光强度。因此，亦可使用所检测发光强度来鉴别存在于特定像素下的标记物的类型。
I.系统的概述
该系统包含集成设备及经构形以与集成设备介接的仪器。集成设备包含像素数组，其中像素包含试样孔和至少一个传感器。集成设备的表面具有多个试样孔，其中试样孔经构形以自置于集成设备表面上的样品接收试样。样品可含有多种试样且在一些实施例中含有不同类型的试样。多个试样孔可具有适宜大小及形状，从而至少一部分试样孔接收来自样品的一种试样。在一些实施例中，试样孔内的诸多试样可分布于试样孔中，从而一些试样孔含有一种试样且其他试样孔含有零种、两种或更多种试样。
在一些实施例中，样品可含有多个单链DNA模板，且集成设备的表面上的个体试样孔可经定大小及定形状以接收单链DNA模板。单链DNA模板可分布于集成设备的试样孔中，从而集成设备的至少一部分试样孔含有单链DNA模板。样品亦可含有加注标签的dNTP，其然后进入试样孔中且可容许在将核苷酸纳入与试样孔中的单链DNA模板互补的DNA链中时鉴别核苷酸。在此一实例中，“试样”可指单链DNA及通常藉由聚合酶纳入的加注标签的dNTP。在一些实施例中，样品可含有单链DNA模板且可随后随着将核苷酸纳入试样孔内的DNA互补链中来将加注标签的dNTP引入试样孔中。以此方式，可藉由将加注标签的dNTP引入集成设备的试样孔中的时间来控制纳入核苷酸的时序。
自与集成设备的像素数组分隔的激发源来提供激发能。至少部分地藉由集成设备的组件将激发能引向一或多个像素中以照射试样孔内的照射区。在位于照射区内时且响应于激发能对其的照射，标记物或标签然后可发射发射能。在一些实施例中，一或多个激发源是系统仪器的一部分，其中仪器组件及集成设备经构形以将激发能引向一或多个像素。
然后可藉由集成设备的像素内的一或多个传感器来检测由试样发射的发射能。所检测发射能的特性可提供用于鉴别与发射能有关的标记物的指示。该等特性可包含任一适宜类型的特性，包含由传感器检测的光子的到达时间、随时间变化由传感器累积的光子量和/或光子在两个或更多个传感器中的分布。在一些实施例中，传感器可具有容许检测一或多种与试样发射能有关的时序特征(例如荧光寿命)的构形。传感器可检测在激发能脉冲传播穿过集成设备之后光子到达时间的分布，且到达时间的分布可指示试样发射能的时序特性(例如荧光寿命的指标)。在一些实施例中，一或多个传感器会指示由标记物或标签发射的发射能的机率(例如荧光强度)。在一些实施例中，多个传感器可经定大小及配置以捕获发射能的空间分布。然后可使用来自一或多个传感器的输出信号自多种标记物区分某一标记物，其中可使用多种标记物来鉴别样品内的试样。在一些实施例中，试样可由多种激发能激发，且发射能和/或因应于多种激发能由试样发射的发射能的时序特性可自多种标记物区分某一标记物。
系统23-100的示意图概略图图解说明于图23A及23B中。该系统包括与仪器23-104介接的集成设备23-102。在一些实施例中，仪器23-104可包含一或多个集成为仪器23-104的一部分的激发源23-106。在一些实施例中，激发源可位于仪器23-104及集成设备23-102两者的外部，且仪器23-104可经构形以接收来自激发源的激发能且将其引导至集成设备中。集成设备可使用任一适宜插孔与仪器介接，用于接收集成设备且保持其与激发源精确光学对准。激发源23-106可经构形以向集成设备23-102提供激发能。如图23B中所示意性图解说明，集成设备23-102具有多个像素，其中至少一部分像素23-112可实施试样的独立分析。该等像素23-112可称为“被动式源像素”，此乃因像素接收了自与像素分隔的源23-106的激发能，其中该源激发多个像素。像素23-112具有试样孔23-108(其经构形以接收试样)及传感器23-110(其用于检测因响应于使用由激发源23-106提供的激发能照射试样而由试样发射的发射能)。试样孔23-108可使试样保持靠近集成设备23-102的表面以便于将激发能递送至试样且检测来自试样的发射能。
用于将激发能引导且耦合至试样孔23-108的光学组件位于集成设备23-102及仪器23-104上。此类源-至-孔组件可包括一或多个位于集成设备23-102上的光栅耦合器(用于将激发能耦合至集成设备)及波导(用于将来自仪器23-104的激发能递送至像素23-112中的试样孔)。在一些实施例中，位于集成设备上的组件可用于将来自试样孔的发射能引向传感器。试样孔23-108、激发源-至-孔光学装置的一部分及试样孔-至-传感器光学装置位于集成设备23-102上。激发源23-106及源-至-孔组件的一部分位于仪器23-104中。在一些实施例中，单个组件可用于将激发能耦合至试样孔23-108且将来自试样孔23-108的发射能递送至传感器23-110。包含于集成设备中的用于将激发能耦合至试样孔和/或将发射能引导至传感器的适宜组件的实例阐述于标题为“INTEGRATED DEVICE FOR PROBING，DETECTING AND ANALYZING MOLECULES”的美国专利申请案14/821,688及标题为“INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING，DETECTING，ANDANALYZING MOLECULES”的美国专利申请案14/543,865中，该等专利申请案的全部内容皆以引用方式并入本文中。
如图23B中所图解说明，集成设备包括多个像素，其中像素23-112与其自身个体试样孔23-108及至少一个传感器23-110相关联。多个像素可配置成数组，且数组中可存在任一适宜数量的像素。集成设备23-102中的像素数可在大约10,000个像素至1,000,000个像素范围内或为该范围内的任一值或值范围。在一些实施例中，像素可配置成512个像素×512个像素的数组。集成设备23-102及仪器23-104可包含用于处置与大像素数组(例如大于10,000个像素)有关的数据的多信道、高速通信连接。
仪器23-104与经由集成设备界面23-114与集成设备23-102介接。集成设备界面23-114可包含用以将集成设备23-102定位和/或对准至仪器23-104以改良来自激发源23-106的激发能耦合至集成设备23-102的组件。激发源23-106可为任一经配置以将激发能递送至至少一个试样孔的适宜光源。适宜激发源的实例阐述于标题为“INTEGRATED DEVICEFOR PROBING，DETECTING AND ANALYZING MOLECULES”的美国专利申请案14/821688中，该专利申请案的全部内容以引用方式并入本文中。在一些实施例中，激发源23-106包含多个经组合以将激发能递送至集成设备23-102的激发源。所述多个激发源可经构形以产生多种激发能或波长。集成设备界面23-114可接收来自位于集成设备上的像素中的传感器的读出信号。集成设备界面23-114可经设计以便藉由将集成设备固定至集成设备界面23-114上来将集成设备附接至仪器上。
仪器23-104包含用于控制仪器23-104的操作的使用者界面23-116。使用者界面23-116经构形以容许用户将信息输入仪器中(例如用于控制仪器的运作的命令和/或设置)。在一些实施例中，使用者界面23-116可包含按钮、开关、拨号盘(dials)及用于语音命令的麦克风。另外，使用者界面23-116可容许用户接收关于仪器和/或集成设备的性能的反馈(例如正确对准和/或藉由来自集成设备上的传感器的读出信号获得的信息)。在一些实施例中，使用者界面23-116可使用扬声器提供反馈以提供听觉反馈，且使用指示灯和/或显示屏幕来提供视觉反馈。在一些实施例中，仪器23-104包含用于与计算设备23-120连接的计算机界面23-118。可使用任一适宜计算机界面23-118及计算设备23-120。举例而言，计算机界面23-118可为USB界面或FireWire界面。计算设备23-120可为任一通用计算机，例如膝上型计算机或桌面计算机。计算机界面23-118促进了信息在仪器23-104与计算设备23-120之间的通信。可经由连接至仪器的计算机界面23-118的计算设备23-120来提供用于控制和/或构形仪器23-104的输入信息。计算设备23-120可经由计算机界面23-118接收输出信息。该输出信息可包含关于仪器23-104和/或集成设备23-112的性能的反馈及来自传感器23-110的读出信号的信息。仪器23-104亦可包含用于分析自传感器23-110接收的数据和/或将控制信号发送至激发源23-106的处理设备23-122。在一些实施例中，处理设备23-122可包括通用处理器、专用处理器(例如中央处理单元(CPU)(例如一或多个微处理器或微控制器核心)、场可程序化门阵列(FPGA)、特定应用集成电路(ASIC)、定制集成电路、数字信号处理器(DSP)或其组合)。在一些实施例中，可藉由处理设备23-122及外部计算设备23-120来处理来自传感器23-110的数据。在其他实施例中，可省略计算设备23-120且可仅由处理设备23-122来处理来自传感器23-110的数据。
图解说明像素列的集成设备24-102的横截面示意图展示于图24A中。每一像素24-112包含试样孔24-108及传感器24-110。可使传感器24-110与试样孔24-112对准且加以定位，从而传感器24-110接收由试样孔24-112内的试样发射的发射能。适宜传感器的实例阐述于标题为“INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS”的美国专利申请案14/821,656中，该专利申请案的全部内容以引用方式并入本文中。
耦合至集成设备的激发源可向集成设备24-102的一或多个像素提供激发能。图24B图解说明了使激发源24-106耦合至集成设备24-102以向集成设备24-102提供激发能24-130(以虚线展示)的示意图。图24B图解说明激发能自激发能来源24-106至像素24-112中的试样孔24-108的路径。可使用位于集成设备之外的组件来定位激发源24-106且对准至集成设备。此类组件可包含光学组件，包含透镜、镜子、棱镜、孔口、衰减器和/或光学纤维。可在仪器中包含其他机械组件以容许控制一或多个对准组件。该等机械组件可包含致动器、步进电动机和/或旋钮。
集成设备包含将激发能24-130引向集成设备中的像素的组件。在每一像素24-112内，激发能耦合至与像素有关的试样孔24-108。尽管图24B图解说明激发能耦合至像素列中的每一试样孔，但在一些实施例中，激发能可能并不耦合至列中的所有像素。在一些实施例中，激发能可耦合至集成设备的像素列中的一部分像素或试样孔。激发能可照射位于试样孔内的试样。试样可因响应于激发能照射而达到激发态。在试样处于激发态时，试样可发射发射能且发射能可由传感器检测。图24B示意性图解说明自试样孔24-108至像素24-112的传感器24-110的发射能24-140的路径(展示为实线)。像素24-112中的传感器24-110可经构形及定位以检测来自试样孔24-108的发射能。在一些实施例中，传感器24-110可包含多个子传感器。
可将拟分析试样引入像素24-112的试样孔24-108中。试样可为生物试样或任一其他适宜试样(例如化学试样)。试样可包含多种分子且试样孔可经构形以分离单个分子。在一些情况下，试样孔的尺寸可用于将单个分子限定于试样孔内，从而容许对单个分子实施量测。激发源24-106可经构形以将激发能递送至试样孔24-108中以激发试样或至少一种附接至试样或以其他方式与试样缔合的发光标记物(在其位于试样孔24-108内的照射区内时)。
在激发源将激发能递送至试样孔时，孔内的至少一种试样可发光，且可藉由传感器检测所得发射。如本文中所使用，词组“试样可发光”或“试样可发射辐射”或“来自试样的发射”意指，发光标签、标记物或报告子、试样本身或与试样有关的反应产物可产生发射的辐射。
集成设备的一或多个组件可将发射能引向传感器。一或多种发射能可由传感器检测且转化成至少一种电信号。电信号可沿经由集成设备界面(例如图23B中所展示的仪器23-104的集成设备界面23-114)连接至仪器的集成设备的电路中的导线传输。可随后处理和/或分析电信号。电信号的处理或分析可发生于位于仪器23-104上或仪器外的适宜计算设备(例如图23B中所展示的计算设备23-120)上。
在操作中，藉由使用激发源激发孔内的试样且使用传感器检测来自试样发射的信号，来平行分析试样孔内的试样。可藉由相应传感器检测来自试样的发射能且转化成至少一种电信号。在一些实施例中，可在集成设备上处理所得一个信号或多个信号，或传输至仪器中用于由处理设备和/或计算设备进行处理。可独立于与其他像素有关的信号来接收来自试样孔的信号并加以处理。
在一些实施例中，可使用一或多种标记物标记试样，且可藉由仪器分辨与标记物有关的发射。举例而言，传感器可经构形以将来自发射能的光子转化成电子以形成电信号，可使用该电信号来分辨取决于特定标记物的发射能的寿命。藉由使用具有不同寿命的标记物标记试样，可基于传感器检测的所得电信号来鉴别特定试样。
试样可含有多个类型的分子且不同发光标记物可独特地与某一类型分子进行缔合。在激发期间或之后，发光标记物可发射发射能。可使用发射能的一或多种性质来鉴别试样中的一或多个类型的分子。用于区分分子类型的发射能性质可包含荧光寿命值、强度和/或发射波长。传感器可检测光子(包含发射能的光子)，且提供指示该等性质中的一或多者的电信号。在一些实施例中，来自传感器的电信号可提供关于在一或多个时间间隔中的光子到达时间分布的信息。光子到达时间分布可对应于在藉由激发源发射激发能脉冲之后检测到光子的时间。时间间隔值可对应于在该时间间隔期间检测的光子数。多个时间间隔中的相对值可指示发射能的时间特性(例如寿命)。试样分析可包含通过比较分布内两个或更多个不同时间间隔的值来区分标记物。在一些实施例中，可藉由测定分布中所有时间仓中的光子数来提供强度指示。
II.集成设备
集成设备可经构形以接收来自外部激发能来源的激发能。在一些实施例中，可使用设备的某一区域耦合至位于集成设备之外的激发能来源。集成设备的组件可将激发能自激发源耦合区引导至至少一个像素中。在一些实施例中，至少一个波导可经构形以将激发能递送至至少一个具有试样孔的像素。位于试样孔内的试样可响应于激发能照射而发射发射能。位于像素内的一或多个传感器经构形以接收发射能。
根据一些实施例展示于图25中的集成设备25-200的组件和/或层包含集成至一个设备中的试样孔25-203、波导25-220及传感器25-275。试样孔25-203可形成于集成设备25-200的试样孔层25-201中。在一些实施例中，试样孔层25-201可为金属。试样孔25-203可具有尺寸Dtv，其可指示试样孔的横截面尺寸。试样孔25-203可用作纳米孔口且具有一或多个产生场增强效应的亚波长尺寸，该场增强效应增加了试样孔25-203中的试样的激发强度。波导25-220经构形以将来自激发源25-230(位于设备25-200之外)的激发能递送至试样孔25-203。波导25-220可形成于试样孔层25-201与传感器25-275之间的层中。集成设备25-200的设计使得传感器25-275可收集自试样孔25-203中的试样发射的发光。至少有时，试样吸收激发能且发射能量小于激发能的光子(称为发射能或发光)。
使试样孔25-203及传感器25-275位于集成设备25-200上可减小光自试样孔25-203行进至传感器25-215的光学距离。集成设备25-200或设备内组件的尺寸可针对某些光学距离进行构形。设备中组件和/或一或多个层的材料的光学性质可决定试样孔与传感器之间的光学距离。在一些实施例中，一或多个层的厚度可决定像素中试样孔与传感器之间的光学距离。另外或或者，形成集成设备25-200的一或多个层的材料的折射率可决定像素中试样孔25-203与传感器25-275之间的光学距离。像素中试样孔与传感器之间的此一光学距离可小于1mm、小于100微米、小于25微米和/或小于10微米。可在试样孔层25-201与波导层25-220之间存在一或多个层以改良来自波导25-220的激发能耦合至试样孔25-203。尽管图25中所展示的集成设备25-200仅图解说明单个层25-210，但可在试样孔25-203与波导25-220之间形成多个层。可形成具有光学性质以改良来自波导25-220的激发能至试样孔25-203的耦合的层25-210。层25-210可经构形以减小激发能的散射和/或吸收和/或增加来自试样孔25-203中的试样的发光。根据一些实施例，层25-210可光学透明，从而光可在较小衰减下在试样孔25-203中来回行进。在一些实施例中，可使用介电材料形成层25-210。在一些实施例中，可在层25-210内和/或在层25-210与试样孔层25-201之间的界面处提供激发能耦合组件，以改良来自波导25-220的激发能至试样孔25-203的耦合。作为一实例，形成于试样孔层25-201与层25-210之间的界面处的能量收集组件25-215可经构形以改良来自波导25-220的激发能至试样孔25-203的耦合。能量收集组件25-215是任选的，且在一些实施例中，波导25-220及试样孔25-203的构形可使得在不存在激发能收集组件25-215下获得适当耦合激发能。
自试样孔25-203中的试样发射的发光或能量可以各种方式传输至传感器25-275中，一些实例详细阐述于下文中。一些实施例可使用光学组件来增加将特定波长光引导至传感器25-275中专用于检测特定波长光的区域或部分中的可能性。传感器25-275可包含多个用于同时检测可对应于不同发光标记物的发射的不同波长光的部分。
试样孔25-203与传感器25-275之间可存在一或多个层，其可经构形以改良自试样孔25-203至传感器25-275发光的收集。发光引导组件可位于试样孔层25-201与层25-210之间的界面处。能量收集组件25-215可将发射能朝向传感器25-275聚集，且可另外或替代地在空间上分离具有不同特征能量或波长的发射能。该等能量收集组件25-215可包含用于将发光引向传感器25-275的光栅结构。在一些实施例中，光栅结构可为一系列同心环或“圆心”光栅结构构形。同心圆形光栅可自试样孔层25-201的底部表面突出。圆形光栅可用作可用于降低信号光传播且将信号光引向有关传感器25-275的电浆组件。此圆心光栅可将发光更有效地引向传感器25-275。
层25-225可毗邻波导形成。可选择层25-225的光学性质以改良自试样孔至传感器25-275的发光收集。在一些实施例中，层25-225可为介电材料。可在试样孔层25-201与传感器25-275之间形成挡板。挡板25-240可经构形以便传感器25-275接收对应于试样孔25-203的发光且减少发光，并反射/散射来自其他试样孔的激发。可定位及构形滤光组件25-260以减少到达传感器25-275的激发能。在一些实施例中，滤光组件25-260可包含选择性透射一或多种用于标记试样的标记物的发射能的滤光片。在具有试样孔数组及传感器数组(其中每一试样孔具有相应传感器)的实施例中，可形成对应于每一试样孔的挡板以减少来自其他试样孔的发光且反射和/或散射由对应于试样孔的传感器收集的激发光。
可在波导25-220与传感器25-275之间形成一或多个层以减小激发能至传感器的透射。在一些实施例中，可在波导25-220与传感器25-275之间形成滤光组件。该等滤光组件可经构形以减小激发能至传感器25-275的透射，同时使得来自试样孔的发光由传感器25-275收集。
可藉由传感器25-275检测一或多种发射能且转化成至少一种电信号。可将一或多种电信号沿一或多列或行导线(未展示)传输至基板25-200上的集成电子电路中以用于后续信号处理。
图25的上述阐述是一些实施例的装置的一些组件的概述。在一些实施例中，图25的一或多个组件可不存在或位于不同位置。集成设备25-200及激发源25-230的组件更详细阐述于下文中。
A.激发源耦合区
集成设备可具有激发源耦合区，其经构形以与外部激发能来源耦合且将激发导向集成设备的像素区中的至少一个像素中。激发源耦合区可包含一或多个经构形以将光耦合至至少一个波导中的结构。可使用任何用于将激发能耦合至波导中的适宜机制。
集成设备的激发源耦合区可包含经构形以与外部激发源耦合的结构组件。集成设备可包含光栅耦合器，其经构形以与邻近集成设备表面定位的外部激发源耦合，且将光引向集成设备的至少一个波导中。可形成光栅耦合器的特征(例如大小、形状和/或光栅构形)以改良来自激发源的激发能至波导的耦合。光栅耦合器可包含一或多个结构组件，其中该结构组件之间的间隔可用于传播光。光栅耦合器的一或多个尺寸可提供具有某一特征波长的光的期望耦合。
集成设备亦可包含在波导一端具有锥形区的波导。波导的垂直于波导中的光传播方向的一或多个尺寸可在波导一端较大，从而形成波导的锥形区。在一些实施例中，波导锥的形区具有可如下尺寸：其垂直于光传播且平行于集成设备表面，在波导一端较大且沿波导的长度变得较小。在包含光栅耦合器的实施例中，锥形区可邻近光栅耦合器定位，从而锥形区的较大端位于最靠近光栅耦合器处。可对锥形区进行定大小及定型，以通过将一或多个波导尺寸扩展至容许改良波导与光栅耦合器的重叠模式而来改良光在光栅耦合器与波导之间的耦合。以此方式，邻近集成设备的表面定位的激发源可经由光栅耦合器将光耦合至波导中。光栅耦合器及波导锥形体的此一组合可容许激发源针对集成设备的对准及定位具有较大容差。
光栅耦合器可定位于集成设备中位于集成设备的像素外部的区域中。在集成设备的表面上，像素的试样孔可占据与激发源耦合区分隔的表面区域。邻近激发源耦合区的表面定位的激发源可与光栅耦合器耦合。试样孔可与激发源耦合区分隔定位以减小来自激发源的光对像素性能的干扰。集成设备的光栅耦合器可形成于集成设备中包含波导的一或多个层内。以此方式，集成设备的激发源耦合区可包含与波导位于集成设备的同一平面内的光栅耦合器。可针对特定组的光束参数(包含光束宽度、入射角和/或入射激发能的偏振)对光栅耦合器构形。
集成设备26-200的剖面图展示于图26中。集成设备26-200包含至少一个形成于集成设备26-200的层26-223中的试样孔26-222。集成设备26-200包含实质上形成于集成设备26-200的同一平面中的光栅耦合器26-216及波导26-220。在一些实施例中，光栅耦合器26-216及波导26-220形成自集成设备26-200的同一层且可包含相同材料。集成设备26-200的激发源耦合区26-201包含光栅耦合器26-216。如图26中所展示，试样孔26-222定位于集成设备26-200中位于激发源耦合区26-201外部的表面上。相对于集成设备26-200定位的激发源26-214可提供入射于集成设备26-200中位于激发源耦合区26-201内的表面26-215上的激发能。藉由将光栅耦合器26-216定位于激发源耦合区26-201内，光栅耦合器26-216可与来自激发源26-214的激发能耦合使激发能耦合至波导26-220。波导26-220经构形以将激发能传播至一或多个试样孔26-222附近。
可自一或多种材料形成光栅耦合器。在一些实施例中，光栅耦合器可沿平行于波导中的光传播的方向包含不同材料的交替区。如图26中所展示，光栅耦合器26-216包含由材料26-224环绕的结构。形成光栅耦合器的一或多种材料可具有一或多种适于耦合和传播光的折射率。在一些实施例中，光栅耦合器可包含自由具有较大折射率的材料环绕的一种材料形成的结构。作为一实例，光栅耦合器可包含由氮化硅形成且由二氧化硅环绕的结构。
可使用任一适宜尺寸和/或光栅间间隔来形成光栅耦合器。光栅耦合器26-216垂直于穿过波导的光传播(例如沿如图26中所展示的y-方向)的尺寸可为大约50nm、大约100nm、大约150nm或大约200nm。光栅耦合器中沿平行于波导中光传播的方向(例如沿如图26中所展示的z-方向)的结构之间的间隔可具有任一适宜距离。间隔间光栅可为大约300nm、大约350nm、大约400nm、大约420nm、大约450nm或大约500nm。在一些实施例中，光栅间间隔可在光栅耦合器内有所变化。光栅耦合器26-216可具有一或多个实质上平行于集成设备26-200的表面26-215且提供用于与外部激发源26-214耦合的适宜区域的尺寸。光栅耦合器26-216的该区域可与来自激发源26-214的光束的一或多个尺寸一致，从而光束与光栅耦合器26-215重叠。光栅耦合器可具有构形以用于大约10微米、大约20微米、大约30微米或大约40微米的光束直径的区域。
集成设备可包含形成于光栅耦合器中与激发源相反的一侧且经构形以反射光的层。该层可反射通过光栅耦合器朝向光栅耦合器的激发能。藉由在集成设备中包含该层，激发能至波导的耦合效率可得以改良。反射层的一实例是图26中所展示的集成设备26-200的层26-218。层26-218定位于集成设备26-200的激发源耦合区26-201内且经构形以反射朝向光栅耦合器26-216的光。层26-218在邻近光栅耦合器26-216中与来自激发源26-214的入射激发能相反的一侧形成。将层26-218定位于集成设备26-200的像素外部可减小层26-218对像素的性能能力的干扰。层26-218可包含任一适宜材料。层26-218可实质上反射一或多种激发能。在一些实施例中，此层可包含Al、AlCu和/或TiN。
B.波导
集成设备可包含一或多个经配置以将期望量的激发能递送至集成设备的一或多个试样孔中的波导。将波导定位于一或多个试样孔附近，从而随着激发能沿波导进行传播，一部分激发能耦合至一或多个试样孔。波导可使激发能耦合至多个像素且用作总线波导。举例而言，单个波导可将激发能递送至集成设备的像素列或行中。在一些实施例中，波导可经构形以传播具有多个特征波长的激发能。集成设备的像素可包含经构形以将激发能自波导引向试样孔附近的其他结构(例如微腔)。在一些实施例中，波导可携载具有经构形以延伸至试样孔内和/或试样孔附近区域中的渐逝尾部的光学模式。位于试样孔附近的其他能量耦合结构可使来自渐逝尾部的能量耦合至试样孔中。
集成设备的波导的一或多个尺寸可提供激发能沿波导和/或至一或多个试样孔中的期望传播。波导可具有垂直于光传播且平行于波导平面的尺寸，其可视为横截面宽度。波导的横截面宽度可为大约0.4微米、大约0.5微米、大约0.6微米、大约0.65微米、大约0.8微米、大约1微米或大约1.2微米。波导可具有垂直于光传播且垂直于波导平面的尺寸，其可视为横截面高度。波导的横截面高度可为大约0.05微米、大约0.1微米、大约0.15微米、大约0.16微米、大约0.17微米、大约0.2微米或大约0.3微米。在一些实施例中，波导的横截面宽度大于横截面高度。波导可定位于距离集成设备内的一或多个试样孔某一距离处，例如图26中所展示试样孔26-222与波导26-220之间的距离D，其为大约0.3微米、0.5微米或大约0.7微米。
在一示例性实施例中，波导可具有大约0.5μm的横截面宽度及大约0.1μm的横截面高度，且定位于试样孔层下方大约0.5μm。在另一示例性实施例中，波导可具有大约1μm的横截面宽度及0.18μm的横截面高度，且定位于试样孔层下方0.3μm。
波导可经定尺寸以支持单个横向辐射模式或可经定尺寸以支持多横向辐射模式。在一些实施例中，波导的一或多个尺寸可用于使得波导仅支持单个横向模式且可选择性传播TE或TM偏振模式。在一些实施方案中，波导可具有形成于其末端的高度反射区段，从而其支持波导内的纵向驻波模式。藉由支持一种模式，波导可具有减小的来自具有不同传播常数的模式的交叉耦合的模态干扰效应。在一些实施例中，高度反射区段包括单个高度反射表面。在其他实施例中，高度反射区段包括多个整体产生高反射率的反射结构。波导可经构形以使用波导光束分裂器来分裂来自具有较高输出强度的单个激发源的激发能，以自单个激发源产生多个激发能光束。该等光束分裂器可包含渐逝耦合机制。另外或或者，可将光子晶体用于波导结构中以改良激发能的传播和/或用于环绕波导的材料中以减小激发能的散射。
波导相对于集成设备的像素中的其他组件的位置及配置可经构形以改良激发能朝向试样孔的耦合，改良传感器对于发射能的收集，和/或减小由激发能引入的信号噪声。可相对于试样孔对波导进行定大小和/或定位以减小在波导中传播的激发能对自试样孔发射的发射能的干扰。波导在集成设备中的定位及配置可依赖于波导及环绕波导的材料的折射率。举例而言，可增加波导中垂直于沿波导的光传播方向且在波导平面内的尺寸，从而在激发能传播至像素的传感器时大量的来自试样孔的发射能通过波导。在一些实施方案中，可选择试样孔与波导之间的距离和/或波导厚度以减少自波导与环绕材料之间的一或多个界面的反射。根据一些实施例，波导对发射能的反射可减小至在一些实施例中小于约5％、在一些实施例中小于约2％及在一些实施例中小于约1％。
波导传播激发能的能力可取决于用于波导的材料及环绕波导的材料。以此方式，波导结构可包含核心材料(例如波导26-220)及包覆材料(例如如图26中所图解说明的区域26-224)。用于波导及环绕材料的材料可容许具有特征波长的激发能传播穿过波导。可针对特定折射率或折射率组合来选择用于波导或环绕材料的材料。波导材料可具有低于波导环绕材料的折射率。示例性波导材料包含氮化硅(SixNy)、氧氮化硅、碳化硅、氧化钽(TaO2)、二氧化铝。示例性波导环绕材料包含二氧化硅(SiO2)及氧化硅。波导和/或环绕材料可包含一或多种材料。在一些情况下，可藉由形成包含一种以上材料的波导和/或环绕材料来获得用于波导和/或环绕材料的期望折射率。在一些实施例中，波导包括氮化硅且环绕材料包括二氧化硅。
将来自单个波导的波导分裂成多个波导可容许激发能到达集成设备的试样孔的多个列或行。可使激发源耦合至输入波导且可将输入波导分裂成多个输出波导，其中每一输出波导将激发能递送至试样孔的列或行。可使用用于分裂和/或组合波导的任一适宜技术。该等波导分裂和/或组合技术可包含星形分裂器或耦合器、Y分裂器和/或渐逝耦合器。另外或或者，可使用多模式干扰分裂器(MMI)来分裂和/或组合波导。可使用该些波导分裂和/或组合技术中的一或多者将激发能引导至试样孔中。
C.试样孔
根据一些实施例，试样孔27-210可形成于集成设备的一或多个像素处。试样孔可包括形成于基板27-105的表面处的小的容积或区且经配置以便试样27-101可自沉积于基板表面上的样品扩散进入及离开试样孔，如图27A及图27B中所绘示，该等图图解说明集成设备的单个像素27-100。在各个实施例中，试样孔27-210可经配置以接收来自波导27-240的激发能。扩散至试样孔中的试样27-101可由黏着剂27-211暂时或永久保留于试样孔的激发区27-215内。在激发区中，试样可由激发能(例如激发辐射27-247)激发，且随后发射可观察且评估以表征试样的辐射。
进一步详述操作，可将至少一种拟分析试样27-101(例如)自含有试样的流体悬浮液的样品(未展示)引入试样孔27-210中。来自波导27-240的激发能可激发试样或至少一种附接至试样或包含于与试样缔合的标签中的标记物(在其处于试样孔内的激发区27-215内时)。根据一些实施例，标记物可为发光分子(例如荧光团)或量子点。在一些实施方案中，可存在一种以上用于分析试样的标记物(例如用于单分子基因测序的不同标记物及标签，如“Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules”，J.Eid等人，Science323，第133页(2009)中所阐述，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。在激发期间和/或之后，试样或标记物可发射发射能。在使用多种标记物时，其可以不同特征能量发射和/或以不同时间特性(包含不同寿命)发射。来自试样孔的发射能可辐射或以其他方式行进至传感器27-260，其中检测发射能且转化成可用于表征试样的电信号。
根据一些实施例，试样孔27-210可为部分包封结构，如图27B中所绘示。在一些实施方案中，试样孔27-210包括形成于材料27-230的至少一个层中的亚微米大小孔或孔口(藉由至少一个横向尺寸Dsw进行表征)。在一些情形下，孔可称为“纳米孔口”。根据一些实施例，试样孔的横向尺寸可介于大约20纳米与大约1微米之间，但可在一些实施方案中使用较大及较小尺寸。在一些实施方案中，试样孔27-210的容积可介于约10-21升与约10-15升之间。试样孔可形成为可支持或可不支持传播模式的波导。试样孔可形成为可支持或可不支持传播模式的波导。在一些实施例中，试样孔可形成为具有拥有直径(或最大横向尺寸)Dsw的圆柱形形状(或类似形状)的零模式波导(ZMW)。ZMW可以并不支持穿过孔的传播光学模式的纳米级孔形式形成于单个金属层中。
因试样孔27-210具有小容积，但可检测每一像素下的单试样事件(例如单分子事件)，即使试样可以类似于其发现于天然环境中的浓度的浓度浓缩于检验样品中。举例而言，微摩尔浓度的试样可存在于经放置与集成设备接触的样品中，但在像素水平下，仅约一种试样(或单分子事件)可在任一给定时间下位于试样孔内。在统计学上，一些试样孔可不含试样且一些可含有一种以上试样。然而，可观数量的试样孔可含有单个试样(例如在一些实施例中至少30％)，从而可针对大量像素平行实施单分子分析。因可在每一像素下分析单分子或单试样事件，故集成设备使得可检测可原本在总体均值中注意不到的稀有事件。
试样孔的横向尺寸Dsw可在一些实施例中介于约500纳米(nm)与约一微米之间，在一些实施例中介于约250nm与约500nm之间，在一些实施例中介于约100nm与约250nm之间，且在一些实施例中介于约20nm与约100nm之间。根据一些实施方案，试样孔的横向尺寸介于大约80nm与大约180nm之间，或大约为激发波长或发射波长的八分之一至四分之一。根据其他实施方案，试样孔的横向尺寸介于大约120nm与大约170nm之间。在一些实施例中，试样孔27-210的深度或高度可介于约50nm与约500nm之间。在一些实施方案中，试样孔27-210的深度或高度可介于约80nm与约250nm之间。
具有亚波长横向尺寸的试样孔27-210可以至少两种方式改良集成设备的像素27-100的操作。举例而言，自样品的相反侧入射于试样孔上的激发能可以指数式降低的功率耦合至激发区27-215中，且并不传播穿过试样孔达到样品。因此，激发能在其激发所关注试样的激发区中有所增加，且在激发有助于背景噪声的其他试样的样品中有所减小。同样，优选将来自保留于孔基底处(例如较靠近传感器27-260)的试样的发射引向传感器，此乃因向上传播穿过试样孔的发射得以高度阻抑。该些效应皆可改良像素下的信号噪声比。发明人已识别可经改良以进一步增强像素下的信号噪声比的试样孔的若干方面。这些方面涉及试样孔形状及结构，且亦系关于有助于使激发能耦合至试样孔及来自试样孔的所发射辐射的毗邻光学及电浆结构(阐述于下文中)。
根据一些实施例，试样孔27-210可形成为经构形以并不支持用于所关注特定波长的传播模式的纳米孔口。在一些情况下，对纳米孔口实施构形，其中所有模式皆低于临限波长且孔口可为亚截断纳米孔口(SCN)。举例而言，试样孔27-210可在导电层中包括圆柱形孔或镗孔。试样孔的横截面无需为圆形，且在一些实施例中可为椭圆形、正方形、矩形或多边形。激发能27-247(例如可见或近红外辐射)可经由入口孔口27-212进入试样孔中，入口孔口可由试样孔的壁27-214界定于孔的第一端处，如图27B中所绘示。在形成为SCN时，激发能可沿纳米孔口的长度(例如在样品方向上)以指数方式衰减。在一些实施方案中，波导可包括用于来自试样的发射辐射的SCN，但可不为用于激发能的SCN。举例而言，藉由试样孔形成的孔口及波导可足够大以支持用于激发能的传播模式，此乃因其波长可短于发射辐射。较长波长下的发射可超过用于波导中的传播模式的截断波长。根据一些实施例，试样孔27-210可包括用于激发能的SCN，从而将最大强度的激发能局部化至试样孔27-210的入口处的试样孔的激发区27-215中(例如局部化至层27-235与层27-230之间的界面附近，如该图中所绘示)。激发能的该局部化可改良来自试样的发射能的局部化，且限制来自单个试样(例如单个分子)的发射的所观察发射。
根据一些实施例，像素27-100可包含其他结构。举例而言，像素27-100可包含一或多个激发耦合结构27-220，其会影响激发能耦合至试样孔内的试样。像素亦可包含发射引导结构27-250，其用于将来自试样孔内的试样的发射能引导至传感器27-260中。
为改良局部化于试样孔处的激发能的强度，发明人研发且研究其他试样孔结构。图27C绘示在试样孔的激发端包含空腔或凹槽27-216的试样孔的实施例。根据一些实施例，向试样孔中增加凹槽27-216会容许试样移动至具有较高激发强度的区域中。在一些实施方案中，凹槽的形状及结构改变了局部激发场(例如因层27-235与试样孔中的流体之间的折射率差)，且可进一步增加凹槽中的激发能强度。凹槽27-216可形成于层27-235内，从而一部分占据试样孔27-214及凹槽27-216的试样容积由形成层27-216的材料环绕。
凹槽(divot)可具有任一适宜形状。凹槽可具有实质上等效于试样孔的横向形状的横向形状，例如圆形、椭圆形、正方形、矩形、多边形等。在一些实施例中，凹槽的侧壁可实质上平直且垂直(如同试样孔的壁)。在一些实施方案中，凹槽侧壁可倾斜和/或弯曲，如图中所绘示。凹槽的横向尺寸在一些实施例中可与试样孔的横向尺寸大致具有相同大小，在一些实施例中可小于试样孔的横向尺寸，或在一些实施例中可大于试样孔的横向尺寸。凹槽27-216可延伸至超出试样孔层27-230大约10nm至大约200nm。在一些实施方案中，凹槽可延伸至超出试样孔层27-230大约50nm至大约150nm。在一些实施例中，凹槽可延伸至超出试样孔层27-230大约150nm至大约250nm。藉由形成凹槽，激发区27-215可延伸至试样孔外侧，如图27C中所绘示。
一些实施例涉及具有拥有邻近波导定位的凹槽的试样孔的集成设备。图28展示具有形成于层28-630及层28-636中的试样孔28-632的集成设备。层28-630可为金属层且包含一或多种金属(例如Al)。层28-636可用作介电层且包含一或多种介电材料(例如二氧化硅)。试样孔28-632可在平行于层28-630和/或层28-636的方向上具有可变尺寸。试样孔28-632可至少在集成设备的层28-630内沿z-方向具有尺寸D2，且在一些实施例中，尺寸D2可视为试样孔28-632的直径。试样孔28-632的尺寸D2可为大约700nm、大约800nm、大约900nm、大约1微米或大约1.1微米。试样孔28-632可在集成设备的层28-636内沿z-方向具有尺寸D1，且在一些实施例中可视为试样孔28-632的表面处的直径。尺寸D1可为大约100nm、大约150nm、大约200nm或大约250nm。试样孔28-632的具有尺寸D1的表面定位于沿x-方向距波导28-634为尺寸d1处。邻近波导28-634以距离d1来定位试样孔28-632可容许改良来自波导28-634的激发能至试样孔28-632的耦合。尺寸d1可为大约50nm、大约100nm、大约150nm、大约200nm或大约250nm。
D.激发能至试样孔的耦合
可经由一或多种技术使激发能耦合至集成设备的一或多个试样孔。如先前所论述，在一些实施例中，波导经定位以与激发源一起耦合至一或多个试样孔。随着激发能沿波导传播，一部分激发能可经由各种光耦合技术耦合至一或多个试样孔。举例而言，波导可实质上在一个方向上引导激发能，且衰逝波或尾部可垂直于这一方向形成且在一些情况下位于波导结构外侧。此一渐逝尾部可将一部分激发能引向一或多个试样孔中。在一些实施例中，试样孔层可经设计及经构形以将激发能引导至试样孔的局部区域内。试样孔可经构形以将试样保留于试样孔的局部区域内，从而将激发能引向试样。
另外，一或多个组件可形成于集成设备中以改良或增强激发能至试样孔的耦合。这些其他组件可形成于像素中且提供来自波导的激发能至像素并朝向试样孔的耦合。位于像素中的一或多个组件可用于将一部分来自波导的激发能接入像素中。该类组件可包含光学结构，例如光栅结构散、射结构、微腔和/或纳米天线。可选择这些组件中的一或多者的特征或构形以将某一量的激发能耦合至试样孔的列或行内的每一试样孔。经构形以向像素列提供激发能的波导可耦合至每一像素区中的组件以将一部分激发能提供至像素列中的每一像素。在波导经构形以将来自激发源的激发能引向一或多个像素时，波导可称为总线波导。
毗邻试样孔定位的组件可改良来自波导的激发能至试样孔的耦合。该类组件可称为分接头(tap)和/或微腔。微腔可使一部分来自波导的激发能偏转，从而激发能到达试样孔。可使用一或多个微腔使激发能耦合至试样孔。一或多个微腔可减小来自波导的激发能的损失，包含金属损失。一或多个微腔可用作将激发能聚焦至试样孔的透镜。在一些实施例中，一或多个微腔可改良来自试样孔中标记物的发光朝向传感器的引导。微腔可具有圆柱形、凸状、凹状、矩形、球形或椭圆形构形或任一其他适宜形状。可自任一适宜材料形成微腔。在一些实施例中，微腔可包含氮化硅。
在自存在试样孔的集成设备的顶部观看时，一或多个微腔可与至少一部分波导重叠以将激发能引向试样孔。波导厚度可经构形以减小激发能的损失且改良激发能至一或多个微腔的耦合。在一些实施例中，沿试样孔列的微腔可改变波导与每一试样孔之间的耦合强度。微腔可增加沿激发能传播方向的耦合，以在引导激发能离开波导到达每一试样孔时适应波导中减小的功率。在一些实施例中，一或多个微腔毗邻试样孔。可在试样孔的中心位置与微腔中心之间存在偏移距离。在其他实施例中，一个微腔位于试样孔下方，从而在自存在试样孔的集成设备的顶部观看时，至少一部分试样孔与一部分微腔重叠。
集成设备的波导的一或多个尺寸可沿波导长度在光传播穿过波导的方向上有所变化。沿波导改变一或多个尺寸可改良耦合效率以及由波导提供至多个试样孔的激发能的量的实质均匀性。在一些实施例中，波导的横截面宽度可沿像素的列或行有所变化。波导可包含锥形体，从而波导的横截面宽度沿激发能传播穿过波导的方向有所降低。在一些实施例中，锥形波导可经构形以针对像素列达成类似耦合效率，其中列中的像素包含微腔及试样孔。组合改变锥形波导和/或微腔的一或多个尺寸可适应在激发能耦合至列中的每一试样孔时激发能沿波导长度的功率减小。
在一些实施例中，波导可藉由渐逝场耦合至试样孔。在一些实施例中，具有邻近试样孔定位的同心光栅环的圆心光栅结构可改良来自波导的激发能至试样孔的耦合。在一些实施例中，波导可在试样孔附近包含具有减小的横截面宽度的区域，从而来自在波导中传播的激发能的渐逝场耦合至试样孔。对于像素列而言，波导可沿波导长度包含多个具有减小的横截面宽度的区域以改良列中试样孔中的耦合均匀性及效率。以此方式，波导可视为在沿波导的某些位置处具有狭缩区段(pinched section)。
集成设备中具有一或多个试样孔的层可干扰光穿过波导的传播。在一些实施例中，试样孔层由金属(例如铝)形成。可期望将试样孔层定位于距波导某一距离处以减小损失且改良设备性能。这些技术可使得藉由以下方式来达成期望性能：将试样孔层定位于距波导某一距离处，同时容许该层中的试样孔接收足够量的激发能。
E.发射能至传感器的引导
集成设备可包含一或多个定位于像素的试样孔与传感器之间的组件，从而改良传感器对于来自试样孔中的试样的发光的收集。该类组件可改良发光信号对背景信号的信号噪声比以改良发光标记物的检测。一些组件可将来自试样孔的发光引导至像素中的相应传感器中。在一些实施例中，组件可提供激发能至试样孔的适宜耦合及离开试样孔的发光的耦合。其他组件(例如滤光片)可减小激发能及其他并不与试样和/或标记物有关的造成由传感器获取的信号的光。
圆心(bullseye)光栅可自试样孔周围的同心光栅环形成。圆心光栅可与试样孔耦合以改良离开试样孔的发光的传播。圆心光栅结构可将发光引向具有试样孔的像素中的传感器。在一些实施例中，由圆心光栅引导的发光的有效直径大约为5微米。
在一些实施例中，一或多个经提供用于耦合波导及试样孔以容许激发能传播至试样孔的微腔亦可将来自试样孔的发光引导至传感器。
具有定中心于传感器上的开口的挡板可形成于试样孔与传感器之间。如图26中所展示，挡板层26-226定位于试样孔26-22与传感器层26-230之间。像素的挡板可经设计以阻抑除像素发光外的能量的收集。与试样孔及传感器有关的挡板可容许来自试样孔的发光到达传感器，同时减少来自相邻像素的发光、激发能及其他并不与来自与传感器有关的试样孔的发光有关的能量。挡板开口的尺寸可经构形以容许发光由同一像素上的圆心引导。如图26中所展示，挡板26-226沿z-方向具有开口以容许发光通过定位于层26-230中的传感器。可选择挡板材料以达成某些光学性质，例如减少某些光波长或能量在某些入射角下的透射。在一些实施例中，可藉由多个具有不同折射率的材料层形成挡板。挡板可包含硅、氮化硅(Si3N4)、硅、氮化钛(TiN)及铝(Al)的一或多个层。经构形以形成挡板的层可具有大约20nm、大约20nm、大约50nm、大约60nm、大约70nm、大约80nm或大约90nm的横截面高度。
滤光组件可形成于波导与传感器之间以减少传感器对激发能的收集。可提供用于过滤激发能的任一适宜方式。用于过滤激发能的技术可包含基于一或多种光特性进行过滤。该类特性可包含波长和/或偏振。滤光组件可选择性阻抑散射激发能，同时容许发光通过传感器。图26中所展示的层26-228可包含本文所阐述的一或多种过滤组件。
集成设备可包含经构形以反射一或多个特征波长的光且容许透射具有不同特征波长的光的波长滤光片。在一些实施例中，由波长滤光片反射的光的特征波长可短于由波长滤光片透射的光。此一波长滤光片可反射激发能且容许透射发光，此乃因用于激发标记物的激发能的特征波长通常短于用于藉由激发能达到激发态由标记物发射的发光。
F.传感器
任一能够获取时间仓信息的适宜传感器皆可用于量测以检测发光标记物的寿命。举例而言，标题为“INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS”的美国专利申请案14/821,656阐述能够测定光子的到达时间的传感器，且其全部内容以引用方式并入本文中。将传感器对准，从而每一试样孔具有至少一个传感器区域以检测来自试样孔的发光。在一些实施例中，集成设备可包含盖革(Geiger)模式崩溃光二极管数组和/或单光子崩溃二极管数组(SPAD)。
本文阐述一种集成光检测器，其可精确量测或“时间分仓”入射光子的到达时序且可用于各种应用(例如核酸测序(例如DNA测序)中)。在一些实施例中，集成光检测器可以纳秒或皮秒分辨率来量测光子的到达，此可促进入射光子的到达的时域分析。
一些实施例涉及具有光检测器的集成电路，其因响应于入射光子产生电荷载子且能够辨别藉由入射光子的到达生成的电荷载子相对于参考时间(例如触发事件)的时序。在一些实施例中，电荷载子分离结构分离在不同时间生成的电荷载子且将电荷载子引导至一或多个电荷载子储存区(称为“仓”，其聚集在不同时间段内产生的电荷载子)中。每一仓储存在所选时间间隔内产生的电荷载子。读出储存于每一仓中的电荷可提供关于在每一时间间隔内到达的光子数的信息。此类集成电路可用于各种应用中的任一者中，例如本文所阐述的那些。
阐述具有光检测区及电荷载子分离结构的集成电路的一实例。在一些实施例中，集成电路可包含像素数组，且每一像素可包含一或多个光检测区及一或多个电荷载子分离结构，如下文所论述。
图29A展示一些实施例的像素29-900的图。像素29-900包含光子吸收/载子生成区29-902(亦称为光检测区)、载子行进/捕获区29-906、具有一或多个电荷载子储存区的载子储存区29-908(在本文中亦称为“电荷载子储存仓”或简称为“仓”)及用于读出来自电荷载子储存仓的信号的读出电路29-910。
光子吸收/载子生成区29-902可为半导体材料(例如硅)的区域，其可将入射光子转化成光生成电荷载子。光子吸收/载子生成区29-902可曝光，且可接收入射光子。在光子由光子吸收/载子生成区29-902吸收时，其可生成光生成电荷载子(例如电子/电洞对)。光生成电荷载子在本文中亦简称为“电荷载子”。
可在光子吸收/载子生成区29-902中确立电场。在一些实施例中，电场可为“静态”，如与载子行进/捕获区29-906中的变化电场相区分。光子吸收/载子生成区29-902中的电场可包含侧向分量、垂直分量或侧向分量及垂直分量。电场的侧向分量可位于图29A的向下方向上，如由箭头所指示，其对光生成电荷载子诱导了驱使其朝向载子行进/捕获区106的力。电场可以各种方式形成。
在一些实施例中，可在光子吸收/载子生成区29-902中形成一或多个电极。可向电极施加电压以在光子吸收/载子生成区29-902中确立电场。此电极可称为“光闸极”。在一些实施例中，光子吸收/载子生成区29-902可为完全空乏电荷载子的硅区域。
在一些实施例中，可藉由接合(例如PN接合)确立光子吸收/载子生成区29-902中的电场。可掺杂光子吸收/载子生成区29-902的半导体材料，以形成具有产生电场的定向和/或形状的PN接合，该电场对光生成电荷载子诱导了驱使其朝向载子行进/捕获区29-906的力。在一些实施例中，PN接合二极管的P末端可连接至设定其电压的末端。此二极管可称为“钉扎”光二极管。钉扎光二极管因设定其电压且吸引载子的末端而可促进表面处的载子重组，此可减小暗电流。期望捕获的光生成电荷载子可通过表面的重组区下方。在一些实施例中，可使用半导体材料中的递级掺杂浓度来确立侧向电场。
如图29A中所图解说明，可捕获光子且可在时间t1处产生电荷载子29-901A(例如电子)。在一些实施例中，可沿光子吸收/载子生成区29-902及载子行进/捕获区29-906确立电势梯度，其使得电荷载子29-901A在图29A的向下方向(如由图29A中所展示的箭头所图解说明)上行进。响应于电势梯度，电荷载子29-901A可自时间t1的其位置移动至时间t2的第二位置、时间t3的第三位置、时间t4的第四位置及时间t5的第五位置。电荷载子29-901A由此因响应于电势梯度移动至载子行进/捕获区29-906中。
载子行进/捕获区29-906可为半导体区。在一些实施例中，载子行进/捕获区29-906可为与光子吸收/载子生成区29-902具有相同材料(例如硅)的半导体区，只是载子行进/捕获区29-906可与入射光隔开(例如藉由上覆不透明材料，例如金属层)。
在一些实施例中，且如下文进一步所论述，可在光子吸收/载子生成区29-902及载子行进/捕获区29-906中藉由定位于这些区域上方的电极来确立电势梯度。然而，本文所阐述的技术并不限于用于产生电势梯度的电极的特定位置。本文所阐述的技术亦并不限于使用电极来确立电势梯度。在一些实施例中，可使用空间递级掺杂谱图确立电势梯度。可使用任一适宜技术确立使得电荷载子沿光子吸收/载子生成区29-902及载子行进/捕获区29-906行进的电势梯度。
可在像素中形成电荷载子分离结构以使得能够分离在不同时间下产生的电荷载子。在一些实施例中，至少一部分电荷载子分离结构可形成于载子行进/捕获区29-906上方。如下文所阐述，电荷载子分离结构可包含一或多个形成于载子行进/捕获区29-906上方的电极，可藉由控制电路控制其电压以改变载子行进/捕获区29-906中的电势。
可改变载子行进/捕获区29-906中的电势以使得能够捕获电荷载子。可藉由改变上覆于载子行进/捕获区29-906上的一或多个电极上的电压来改变电势梯度，以产生可将载子限定于预定空间区内的电势障壁。举例而言，可在时间t5下改变上覆于图29A中载子行进/捕获区29-906中的虚线的电极上的电压，以升高沿图29A中载子行进/捕获区29-906中的虚线的电势障壁，由此捕获电荷载子29-901A。如图29A中所展示，可将在时间t5下捕获的载子转移至载子储存区29-908的仓“仓0”中。可藉由改变载子行进/捕获区29-906和/或载子储存区29-908中的电势(例如藉由改变上覆于这些区域上的电极的电压)以使得载子行进至电荷载子储存仓中，从而将载子转移至电荷载子储存仓中。
在载子行进/捕获区29-906的预定空间区内改变某一时间点的电势可使得能够陷获藉由发生于特定时间间隔内的光子吸收生成的载子。藉由陷获不同时间和/或位置下的光生成电荷载子，可辨别藉由光子吸收生成电荷载子的时间。在此意义上，可藉由在发生触发事件的后陷获某一时间点和/或空间点的电荷载子来将电荷载子进行“时间分仓”。将电荷载子时间分仓于特定仓内提供了关于藉由吸收入射光子生成光生成电荷载子的时间的信息，且由此亦相对于触发事件将产生光生成电荷载子的入射光子的到达“时间分仓”。
图29B图解说明在不同时间及空间点下捕获电荷载子。如图29B中所展示，可在时间t9下改变上覆于载子行进/捕获区29-906中的虚线的电极上的电压，以升高沿图29B中载子行进/捕获区106中的虚线的电势障壁，由此捕获载子29-901B。如图29B中所展示，可将在时间t9下捕获的载子转移至载子储存区29-908的仓“仓1”中。因电荷载子29-901B被陷获于时间t9下，故其代表发生不同于载子29-901A(其捕获于时间t5下)的光子吸收事件(亦即在t1下)的时间(亦即时间t6)下的光子吸收事件。
基于捕获电荷载子的时间来实施多个量测且将电荷载子聚集于载子储存区29-908的电荷载子储存仓中可提供关于在光子吸收/载子生成区29-902中捕获光子的时间的信息。该信息可用于各种应用中，如上文所论述。
在一些实施例中，在激发脉冲之后每一时间仓捕获的持续时间可有所变化。举例而言，可使用较短时间仓检测在激发脉冲之后即刻的发光，而较长时间仓可用于较远离激发脉冲的时间。藉由改变时间仓间隔，可改良给定传感器中与每一时间仓有关的电信号量测的信号噪声比。因光子发射事件的机率在激发脉冲之后即刻较高，故在此时间内的时间仓可具有较短时间间隔以补偿检测较多光子的可能。在较长时间下，光子发射的机率可较小且在此时间内的时间仓检测可较长以补偿较少光子数的可能。在一些实施例中，可使用具有显著较长持续时间的时间仓来区分多个寿命。举例而言，大部分时间仓可捕获在大约0.1-0.5ns范围内的时间间隔，而有时间仓可捕获在大约2-5ns范围内的时间间隔。时间仓数和/或每一仓的时间间隔可取决于用于检测自试样物体发射的光子的传感器。测定每一仓的时间间隔可包含鉴别由传感器提供的时间仓数所需的时间间隔以区分用于分析试样的发光标记物。可在类似条件及时间仓下对所记录直方图的分布与已知标记物直方图进行比较以鉴别试样孔中的标记物类型。本申请案的不同实施例可量测标记物的寿命，但用于激发标记物的激发能、每一像素中的传感器区数和/或藉由传感器检测的波长有所变化。
III.激发源
根据一些实施例，一或多个激发源可位于集成设备外部，且可经配置以将光脉冲递送至具有试样孔的集成设备中。举例而言，标题为“PULSED LASER”且在2015年5月20日提出申请的美国临时专利申请案62/164,485及标题为“PULSED LASER”且在2016年3月18日提出申请的美国临时专利申请案62/310,398阐述可用作激发源的脉冲激光源的实例，该临时专利申请案中的每一者的全部内容以引用方式并入本文中。举例而言，光脉冲可耦合至多个试样孔且用于激发该等孔内的一或多种标记物。根据一些实施方案，一或多个激发源可递送一或多个特征波长下的光脉冲。在一些情形下，激发源可包装为安装于基础仪器(其中可载有集成设备)中或耦合至基础仪器的可替换模块。可将来自激发源的能量以辐射方式或非辐射方式递送至至少一个试样孔或至少一个试样孔中的至少一种试样中。在一些实施方案中，具有可控强度的激发源可经配置以将激发能递送至集成设备的多个像素中。像素可配置成线性数组(例如列或行)或2D数组(例如像素数组的子区域或完整像素数组)。
任一适宜光源皆可用于激发源。一些实施例可使用非相干光源且其他实施例可使用相干光源。藉助非限制性实例，根据一些实施例，非相干光源可包含不同类型的发光二极管(LED)，例如有机LED(OLED)、量子点(QLED)、纳米线LED及(无机)有机半导体LED。藉助非限制性实例，根据一些实施例，相干光源可包含不同类型的激光，例如半导体激光(例如垂直腔表面发射激光(VCSEL)、边缘发射激光及分布-反馈(DFB)激光二极管)。另外或或者，可使用板条式耦合光学波导雷射(SCOWL)或其他不对称单个模型波导结构。在一些实施方案中，相干光源可包括有机激光、量子点激光及固态激光(例如由激光二极管或闪光灯激发的Nd：YAG或ND：玻璃激光)。在一些实施例中，可使用激光-二极管激发式纤维激光。可将相干光源进行被动锁模以产生超短脉冲。可存在一种以上类型的用于集成设备上的像素数组的激发源。在一些实施例中，可组合不同类型的激发源。可根据用于制作所选类型的激发源的常规技术来制作激发源。
以介绍方式且并不限制本发明，相干光源的示例性配置绘示于图30A中。该图图解说明可包含超短脉冲激光激发源30-110作为激发源的分析型仪器30-100。超短脉冲激光30-110可包括增益介质(gain medium)30-105(其在一些实施例中可为固态材料)、用于激发增益介质的泵浦源(未展示)及至少两个空腔反射镜(cavity mirror)30-102、30-104(其界定光学激光空腔的末端)。在一些实施例中，可在激光腔中存在一或多个其他光学组件以用于光束成型、波长选择和/或脉冲形成。在操作时，脉冲激光激发源30-110可产生超短光学脉冲30-120，其在空腔末端反射镜30-102、30-104之间的激光空腔中来回循环且穿过增益介质30-105。空腔反射镜30-104中的一者可部分地透射一部分循环脉冲，从而一系列光学脉冲30-122自脉冲激光30-110发射至后续组件30-160(例如光学组件及集成设备)。所发射脉冲可扫过特征在于光束腰w的光束(由虚线指示)。
发射脉冲30-122的所量测时间强度谱图可表现为如图30B中所绘示。在一些实施例中，发射脉冲的峰强度值可大致相等，且该谱图可具有高斯型时间谱图(Gaussiantemporal profile)，但可能为其他谱图(例如双曲正割谱图)。在一些情形下，脉冲可并不具有对称时间谱图且可具有其他时间形状。在一些实施例中，增益和/或损失动力学可产生具有不对称谱图的脉冲。可藉由半高全宽(FWHM)值来表征每一脉冲的持续时间，如图30B中所指示。超短光学脉冲可具有小于100皮秒的FWHM值。
自激光激发源发射的脉冲可相隔规则间隔T。在一些实施例中，可藉由激光中的主动增益和/或损失调节速率来测定T。对于锁模激光而言，可藉由空腔末端反射镜30-102、30-104之间的来回行进时间来测定T。根据一些实施例，脉冲间隔时间T可介于约1ns与约100ns之间。在一些情形下，脉冲间隔时间T可介于约0.1ns与约1ns之间。在一些实施方案中，脉冲间隔时间T可介于约100ns与约2μs之间。
在一些实施例中，光学系统30-140可针对来自雷射激发源30-110的脉冲30-122的光束进行操作。举例而言，光学系统可包含一或多个透镜以重新整形光束和/或改变光束的发散。重新整形光束可包含增加或降低光束腰值和/或改变光束的横截面形状(例如自椭圆形至圆形、自圆形至椭圆形等)。改变光束的发散可包括汇聚或发散光束通量。在一些实施方案中，光学系统30-140可包含衰减器或放大器以改变光束能量的量。在一些情形下，光学系统可包含波长过滤组件。在一些实施方案中，光学系统可包含脉冲成型组件，例如脉冲延伸器和/或脉冲压缩器。在一些实施例中，光学系统可包含一或多个非线性光学组件，例如用于减小脉冲长度的可饱和吸收器。根据一些实施例，光学系统30-140可包含一或多个改变来自激光激发源30-110的脉冲的偏振的组件。
在一些实施方案中，光学系统30-140可包含非线性晶体，其用于经由频率加倍将来自激发源30-110的输出波长转化成较短波长或经由参数放大转化成较长波长。举例而言，雷射输出可在非线性晶体(例如在周期极化铌酸锂(PPLN))或其他非极化非线性晶体中频率加倍。此一频率加倍过程可使得获得更有效激光以生成更适于激发所选荧光团的波长。
词组“特征波长”或“波长”可指由激发源产生的辐射的有限带宽内的中心或主要波长。在一些情形下，其可指由激发源产生的辐射的带宽内的峰波长。举例而言，可基于生物分析设备中所使用发光标记物或探针的选择来选择激发源的特征波长。在一些实施方案中，选择激发能来源的特征波长以直接激发(例如单光子激发)所选荧光团。在一些实施方案中，选择激发源的特征波长以用于间接激发(例如多光子激发或谐波转化成提供直接激发的波长)。在一些实施例中，可藉由经构形以生成在应用于试样孔的特定波长下的激发能的光源来生成激发辐射。在一些实施例中，激发源的特征波长可小于来自试样的相应发射的特征波长。举例而言，激发源可发射特征波长介于500nm与700nm之间(例如515nm、532nm、563nm、594nm、612nm、632nm、647nm)的辐射。在一些实施例中，激发源可提供定中心于两个不同波长(例如532nm及593nm)下的激发能。
在一些实施例中，可使用脉冲激发源激发发光标记物以量测发光标记物的发射寿命。此可用于基于发射寿命而非发射颜色或波长来区分发光标记物。作为一实例，脉冲激发源可周期性激发发光标记物以生成及检测用于测定标记物的寿命的后续光子发射事件。在来自激发源的激发脉冲经小于发光标记物的寿命的持续时间自峰脉冲功率或强度转变至较低(例如接近消失)功率或强度时，可量测发光标记物的寿命。使激发脉冲迅速终止这可以是有益的，从而其并不在评估发光标记物的寿命时于激发后期期间再激发发光标记物。举例而言且并不加以限制，脉冲功率可在250皮秒之后降至小于峰功率大约20dB、大约40dB、大约80dB或大约120dB。在一些实施方案中，脉冲功率可在100皮秒之后降至小于峰功率大约20dB、大约40dB、大约80dB或大约120dB。
使用超短激发脉冲激发发光标记物的另一优点在于减小了标记物的光漂白。向标记物施加连续激发能可随时间变化漂白和/或损害发光标记物。尽管激发源的峰脉冲功率可远高于在连续暴露下快速损害标记物的水平，但使用超短脉冲可增加在标记物由激发能损害之前有用量测的时间及数量的量。
在使用脉冲激发源分辨发光标记物的寿命时，激发能脉冲之间的时间可与标记物的最长寿命一样长或更长，以观察及评估每一激发脉冲之后的发射事件。举例而言，激发脉冲之间的时间间隔T(参见图30B)可长于所检验荧光团的任一发射寿命。在此情形中，在来自先前脉冲的经激发荧光团具有适当量的时间发荧光之前，后续脉冲可能并未到达。在一些实施例中，间隔T需要足够长以测定激发荧光团的激发脉冲与在终止激发脉冲后且在下一激发脉冲前由荧光团发射的后续光子之间的时间。
尽管激发脉冲之间的间隔T应足够长以观察荧光团的衰减性质，但亦期望T足够短以容许在短时间段中进行许多量测。举例而言且并不加以限制，一些应用中所使用荧光团的发射寿命可在约100皮秒至约10纳秒范围内。因此，用于检测和/或分辨该类寿命的激发脉冲可具有介于约25皮秒至约2纳秒之间的持续时间(FWHM)，且可以介于约20MHz与约1GHz之间的脉冲重复率提供。
进一步详细而言，可使用用于调节激发能以产生用于寿命量测的脉冲激发源的任一适宜技术。激发源(例如雷射)的直接调节可包括调节激发源的电驱动信号，从而发射功率呈脉冲形式。可调节光源输入功率(包含光学抽吸功率)及一部分增益区中的激发态载子注入和/或载子去除以影响增益介质的增益，从而使得经由动态增益成型来形成激发能脉冲。另外，可藉由各种方式调节光学共振器的质量(Q)因子以使用Q切换技术形成脉冲。该Q切换技术可为主动式和/或被动式。可将激光的共振空腔的纵向模式锁相以经由锁模产生一系列发射光脉冲。该类锁模技术可为主动式和/或被动式。激光空腔可包含单独吸收部分以容许调节载子密度且控制该部分的吸收损失，由此提供用于使激发脉冲成型的其他机制。在一些实施例中，可使用光学调节器将连续波(CW)的光束光调节成激发能脉冲形式。在其他实施例中，可使用发送至耦合至激发源的声光调节器(AOM)的信号来改变输出光的偏转、强度、频率、相和/或偏振以产生脉冲激发能。AOM亦可用于连续波光束扫描、Q切换和/或锁模。尽管阐述了用于产生脉冲激发源的上述技术，但可使用产生脉冲激发源的任一适宜方式来量测发光标记物的寿命。
在一些实施例中，用于形成适用于寿命量测的脉冲激发源的技术可包含调节驱动光子发射的输入电信号。一些激发源(例如二极管激光及LED)将电信号(例如输入电流)转化成光信号。光信号的特性可取决于电信号的特性。在产生脉冲光信号时，电信号可随时间有所变化以产生可变光信号。调节电信号以具有特定波形可产生具有特定波形的光学信号。电信号可为具有某一频率的正弦曲线波形且所得光脉冲可出现于与频率相关的时间间隔内。举例而言，具有500MHz频率的电信号可产生每2纳秒具有脉冲的光信号。由不同脉冲激发源(不论彼此类似抑或不同)产生的组合光束可具有低于1mm的相对路径差。
在一些激发源(例如雷射二极管)中，电信号改变载子密度且经由重组电子及电洞对来产生光子。载子密度与光信号相关，从而在载子密度高于临限值时，经由受激发射生成大量相干光子。供应至激光二极管的电流可将电子或载子注入设备中，且由此增加载子密度。在载子密度高于临限值时，可以快于供应载子的电流的速率生成光子，且由此载子密度可降低至低于临限值且光子生成有所减小。随着光子生成的减小，因连续电流注入及光子吸收，载子密度再次开始增加，且最终增加至高于临限值。此循环使得载子密度围绕光子生成的临限值发生振荡，从而使得光信号产生振荡。这些动力学(称为松弛振荡)可因载子密度振荡而在光信号中产生假像。在最初将电流供应至激光器时，可在光信号达到稳定功率之前因载子密度振荡而产生振荡。在形成脉冲激发源时，载子密度振荡可在脉冲光信号中引入假像。来自该等松弛振荡的假像可增宽脉冲光信号和/或在光信号中产生尾部，从而限制了可藉由此脉冲光源检测的寿命，此乃因激发信号可与藉由发光标记物发射的光子重叠。
在一些实施例中，可使用用于缩短激发脉冲的持续时间的技术以减小检测发光标记物所需的激发能且由此减少或延迟漂白及其他对发光标记物的损害。可使用缩短激发脉冲的持续时间的技术来减小在激发脉冲的最大值或峰之后激发能的功率和/或强度，从而容许检测较短寿命。此类技术可电驱动激发源以减小在峰功率之后的激发功率。可调整电驱动信号以尽可能迅速地驱动激发能脉冲的强度在峰脉冲之后达到零。此一技术可包括在产生峰功率之后逆转电驱动信号的符号。可调整电信号以在光学信号的第一松弛振荡或第一振荡之后迅速减小载子密度。藉由减小第一振荡之后的载子密度，可仅生成第一振荡的光脉冲。电信号可经构形以生成藉由减小在信号峰之后发射的光子数来迅速关断光信号的短脉冲。根据一些实施例，可设计皮秒雷射二极管系统以发射光脉冲。在一些实施例中，可使用可饱和吸收器(包含半导体可饱和吸收器(SESAM))来阻抑光学尾部。在该等实施例中，使用可饱和吸收器可将光学尾部阻抑3-5dB或在一些情况下阻抑大于5dB。减小激发脉冲中的尾部的效应可减小和/或消除对于激发能的额外过滤的任何需要，增加可量测的寿命范围，和/或使得能够获得较快脉冲速率。增加激发脉冲速率可使得能够在给定时间中实施较多实验，此可降低获取足够统计学数据以鉴别标记试样物体的标记物的寿命所需的时间。
另外，可一起使用这些技术中的两者或更多者来生成脉冲激发能。举例而言，可使用光学调节技术进一步修饰自直接调节源发射的脉冲激发能。可以任一适宜方式组合用于调节激发脉冲及调整电脉冲驱动信号的技术，以优化用于实施寿命量测的脉冲激发能。可将经调整电驱动信号施加至来自直接调节源的脉冲激发能。
在一些实施例中，可使用具有某一数量的焊线的激光二极管作为脉冲激发源。具有较多焊线的激光二极管可减小激发源的电感。具有较低电感的激光二极管可使得激光中的电流能够以较高频率进行操作。选择包装方法以最小化电感可改良以较高频率供应至激发源的功率，使得能够获得较短激发脉冲，更快减小峰后光学功率，和/或增加用于检测发光标记物的脉冲重复速率。
在一些实施例中，可使用传输线与激发源的组合来生成光脉冲。传输线可与激光二极管的阻抗匹配以改良光脉冲的性能和/或质量。在一些实施例中，传输线阻抗可为50奥姆。在一些情况下，终端电阻可类似于线电阻以避免反射。或者或另外，终端阻抗可类似于线阻抗以避免反射。终端阻抗可小于线阻抗以反射负脉冲。在其他实施例中，终端阻抗可具有电容性或电感性组件以控制负反射脉冲的形状。在其他实施例中，传输线可容许较高脉冲频率。使用传输线可产生频率在40MHz至500MHz范围内的电脉冲。可组合使用传输线与上述经调整电信号以产生光脉冲具有某一持续时间及特定时间间隔的脉冲光源。
用于调整电信号以改良光脉冲产生的技术可包含将激发源连接至具有负偏压能力的电路。在一些实施例中，可在光脉冲发射之后将负偏压提供至激发源以减少光脉冲中的尾部发射。示例性电路可包含电流源、二极管激光、电阻器、电容器及开关，其可用于减少光脉冲中的尾部的存在。此一电路可产生在关闭开关时绕过二极管激光的恒定电流，或呈导电状态。在打开开关时，开关可具有高电阻且电流可流经二极管激光。可藉由打开及关闭开关以向二极管激光提供间歇电流来生成光脉冲。在一些情况下，电阻可足够高且电容足够小，使得在打开开关时在电容器两侧存在电压且二极管激光器发射光。在关闭开关时，电容器两侧的电压将反向偏置二极管激光。此一反向偏置可减小或消除光脉冲中的尾部的存在。在该等情况下，开关可经构形以在光脉冲峰之后关闭以在峰光脉冲之后立即减小雷射功率。可选择电路中的电阻值，从而电容器上的电荷在随后打开开关和/或藉由激光二极管生成后续光脉冲之前发生放电。
可提供其他电路组件以调整激光二极管的电信号，从而产生光脉冲。在一些实施例中，多个电容器、电阻器及电压可连接为网络电路以控制供应至激光二极管的电信号的波形。可藉由切换具有相应信号S1、S2、......、SN的诸多电压V1、V2、......、VN(在存在N个电容器子电路时)来产生受控波形。
在一些实施例中，用于生成光脉冲的电信号可使用具有离散组件(包含射频(RF)和/或微波组件)的电路。可包含于此电路中的离散组件有DC阻断器、适配器、逻辑闸、终接器、移相器、延迟器、衰减器、组合器和/或RF放大器。可使用此类组件产生具有某一幅值的正电信号，随后产生具有另一幅值的负电信号。正电信号与负电信号之间可存在延迟。在其他实施例中，电路可产生多个组合形成经构形以驱动激发源的电脉冲信号的电信号。此电路可产生可用于增加光脉冲功率的差分输出。藉由调节电路的离散组件，可调节电输出信号以产生适用于寿命量测的光脉冲。
在一些实施例中，可组合激发源以生成用于寿命量测的光脉冲。同步脉冲源可经某一距离耦合至电路或负载。在一些实施例中，激发源可平行耦合至电路。激发源可来自相同来源或来自多个来源。在具有多个来源的一些实施例中，多个来源可在激发源类型上有所变化。在组合来源时，可能重要的是，考虑电路阻抗及激发源以使足够功率供应至激发源。可藉由使用一或多种用于产生脉冲激发源的上述技术来组合来源。
激发源可包含电池组或任一经配置以向激发源提供动力的其他电源。举例而言，激发源可位于基础仪器中且可经由与其耦合的集成生物分析设备(例如经由导电引线)来接收其操作功率。激发源可独立控制或联合集成生物分析设备的控制一起控制。仅作为一实例，可以无线方式或经由有线互连(例如USB互连)使用个人计算机和/或集成生物分析设备来将激发源的控制信号提供至激发源。
在一些实施方案中，激发源可以时间门控方式和/或以与集成设备的一或多个传感器同步的方式来进行操作。举例而言，可打开激发源以激发发光标记物，且然后关断。在打开激发源的同时可关断传感器，且然后可在关断激发源之后打开保持采样间隔。在一些实施例中，可打开传感器保持采样间隔，同时打开激发源。
IV.使用集成设备及激发源的示例性量测
可使用本申请案中所阐述集成设备或集成设备及激发源的任一组合来获得用于检测、分析和/或探测试样中的分子的量测。激发源可为脉冲激发源或在一些情况下为连续波源。加注标签至特定试样的发光标记物可指示试样的存在。可藉由激发能、发光发射波长和/或由标记物发射的发射能的寿命来区分发光标记物。可藉由测定每一标记物的寿命来鉴别具有类似发光发射波长的标记物。另外，可藉由每一标记物的发光发射波长来鉴别具有类似寿命的标记物。藉由使用标记物(其中藉由所发射发光的时间和/或光谱性质的组合来鉴别标记物)，可实施标记物及有关试样的定量分析和/或鉴别。
可使用寿命量测来测定存在于试样孔中的标记物。可藉由实施多个实验来鉴别发光标记物的寿命，其中将发光标记物激发至激发态且然后量测发射光子时的时间。使激发源形成脉冲以产生激发能脉冲且引导至标记物处。量测激发脉冲与来自发光标记物的后续光子发射事件之间的时间。藉由使用多个激发脉冲重复该等实验，可测定在特定时间间隔内光子发射的情况数。此类结果可填充代表发生于一系列离散时间间隔或时间仓内的光子发射事件数量的直方图。可调节时间仓数和/或每一仓的时间间隔以鉴别特定组的寿命和/或标记物。
随后在一些实施例中阐述可进行以鉴别发光标记物的示例性量测。具体而言，论述使用仅发光寿命量测、联合光谱及发光寿命量测及仅发光寿命量测但使用两种不同激发能来区分发光标记物的实例。实施例并不限于下文所详述的实例。举例而言，一些实施例可仅使用光谱量测来鉴别发光标记物。
可使用任一适宜发光标记物。在一些实施例中，可使用市售荧光团。举例而言且并不加以限制，可使用下列荧光团：Atto Rho14(“ATRho14”)、650(“D650”)、SetaTMTau 647(“ST647”)、CFTM 633(“C633”)、CFTM 647(“C647”)、Alexa647(“AF647”)、630/650(“B630”)、CFTM 640R(“C640R”)和/或Atto 647N(“AT647N”)。
另外和/或任选的，可以任一适宜方式修饰发光标记物以增加试样分析方法的速度及准确度。举例而言，可使光稳定剂偶联至发光标记物。光稳定剂的实例包含但不限于除氧剂或三重态淬灭剂。使光稳定剂缀合至发光标记物可增加光子发射速率且亦可减少“闪烁”效应(其中发光标记物并不发射光子)。在一些实施例中，在生物事件以毫秒量级发生时，增加光子发射速率可增加检测到生物事件的机率。增加光子事件的速率可随后增加发光信号的信号噪声比且增加进行寿命量测的速率，从而使得试样分析更为迅速且更精确。
此外，可视需要调节集成设备的试样孔中的环境以改变标记物的寿命。可通过认识到藉由标记物状态的密度(此可使用环境进行调节)来实现标记物的寿命来达成。举例而言，标记物距试样孔的底部金属层愈远，则寿命愈长。因此，为增加标记物的寿命，试样孔(例如凹槽)的底部表面的深度可自金属层延伸某一距离。同样，用于形成试样孔的材料可影响标记物的寿命。尽管不同标记物通常在相同方向(例如较长或较短)上具有寿命位移，但对不同标记物的影响程度可有所不同。因此，可改造不能经由寿命量测在自由空间中区分的两种标记物，以可通过制作试样孔环境以调节各种标记物的寿命来予以区分。
A.寿命量测
可使用一种激发能波长激发试样孔中的标记物来实施寿命量测。选择具有不同寿命的标记物的组合以基于寿命量测来区分个体标记物。另外，在通过所用激发源照射时，标记物组合能够达到激发态。经构形以使用一种激发进行寿命量测的集成设备可包含多个沿列定位的像素，其中每一试样孔经构形以与同一波导耦合。像素包含试样孔及传感器。可使用一或多个微腔或圆心光栅将波导耦合至每一像素的试样孔。
脉冲激发源可为使用上述技术的脉冲激发源中的一者。在一些情况下，脉冲激发源可为经构形以经由激光二极管的直接调节电抽吸发射脉冲的半导体激光二极管。脉冲功率在峰之后大约250皮秒小于脉冲峰功率20dB。每一激发脉冲的时间间隔在20-200皮秒范围内。每一激发脉冲之间的持续时间在1-50纳秒范围内。可实施示例性量测的方式的示意图展示于图31A中。因使用一种激发能，故可在集成设备中形成适于减小激发能至传感器的透射的激发滤光片，例如上述波长激发滤光片。
用于每一像素的传感器在每一像素中具有至少一个光敏感区。在光子到达传感器时的时间间隔内检测光子。增加时间仓的数量可改良在一系列时间仓中所收集光子的所记录直方图的分辨率且改良不同发光标记物的区别。在传感器经构形以检测特定波长时，4种发光标记物可发射类似于特定波长的发光。或者，4种发光标记物可在不同波长下发光。
可基于寿命量测区分的4种发光标记物的示例性组是ATRho14、Cy5、AT647N及CFTM633，如由图31B中的绘图所展示。该4种标记物具有不同寿命且在使用至少4个时间仓时产生区分直方图。图31C概述这些标记物中的每一者在16个时间仓中的信号谱图。针对每一标记物将信号特征归一化。时间仓在时间间隔中有所变化以提供每一标记物的独特信号谱图。图32A及32B分别图解说明另一示例性组标记物ATTO Rho14、D650、ST647及CFTM633的连续及离散信号谱图，该等标记物可基于寿命量测进行区分。标记物的其他组包含ATTORho14、C647、ST647、CFTM633；Alexa647、B630、C640R、CFTM633；及ATTO Rho14、ATTO647N、AlexaFluor647、CFTM633。
B.光谱寿命量测
寿命量测可与一或多种发光标记物的光谱量测进行组合。光谱量测可取决于个体标记物的发光波长且在每一像素中使用至少两个传感器区捕获。集成设备的示例性结构包含各自具有拥有两个不同区域的传感器的像素，每一区域经构形以检测不同波长。可使用多波长滤光片来将不同波长的光选择性透射至每一传感器区。举例而言，一个传感器区及滤光片组合可经构形以检测红光，而另一传感器区及滤光片组合可经构形以检测绿光。
可使用一种激发能波长激发试样孔中的标记物来组合寿命量测与光谱量测。选择具有至少两种不同发光波长的标记物组合，其中选择以一定波长下发射且具有不同寿命的标记物来基于寿命及光谱量测区分个体标记物。另外，选择标记物组合以能够在通过所用激发源照射时达到激发态。
激发源是脉冲激发源，且可为使用上述技术的激发源中的一者。在一些情况下，脉冲激发源可为经构形以经由激光二极管的直接调节电抽吸发射脉冲的半导体激光二极管。脉冲功率在峰之后250皮秒小于峰功率20dB。每一激发脉冲的持续时间在20-200皮秒范围内。每一激发脉冲之间的时间间隔在1-50纳秒范围内。可实施示例性量测的方式的示意图展示于图33A中。因使用一种激发能，故可使用适于减小激发能至传感器的透射的激发滤光片。
用于每一像素的传感器在每一像素中具有至少两个光敏感区。在一些实施例中，在每一像素中存在两个光敏感区。在其他实施例中，在每一像素中存在四个光敏感区。每一光敏感区经构形以检测不同波长或波长范围。在光子到达传感器时的时间间隔内检测光子。增加时间仓的数量可改良在一系列时间仓中所收集光子的所记录直方图的分辨率且改良不同发光标记物的区别(根据其个体寿命)。在一些实施例中，在传感器的每一区域中存在两个时间仓。在其他实施例中，在传感器的每一区域中存在四个时间仓。
可基于寿命量测区分的4种发光标记物的示例性组是ATTO Rho14、AS635、Alexa647及ATTO 647N。该4种标记物中的两种以一个类似波长及另一类似波长发射。在类似波长下发射的每一对标记物内，标记物对具有不同寿命且在使用至少4个时间仓时产生区分直方图。在此实例中，ATTO Rho14及AS635发射类似发光波长且具有不同寿命。Alexa647及ATTO 647N发射不同于由ATTO Rho 14及AS635发射的波长的类似发光波长，且具有不同寿命。图33B展示此组标记物的寿命随发射波长而变化的绘图，其用以图解说明可如何基于寿命及发射波长的组合来区分这些标记物中的每一者。图34A展示ATT Rho14、Alexa647及ATT 647N的功率随波长而变化的绘图。图34B展示在存在于直径为135nmin的试样孔中时这些标记物中的一者的荧光信号随时间变化的绘图。图35A图解说明这些标记物在4个光敏感区且每一区捕获4个时间仓中的信号谱图。将信号特征归一化且用于根据对于4个时间仓中的每一者由光敏感区所捕获光子的相对数量来区分不同标记物。用于该等光谱-寿命量测的4种荧光团的其他组是ATRho14、D650、ST647、CFTM633；ATTORho14、C647、ST647、CFTM633；Alexa647、B630、C640R、CFTM633；及ATTO Rho 14、ATTO647N、Alexa647、CFTM633。图35B展示ATRho14、D650、ST647及C633的强度信号谱图随时间变化的绘图。图35C图解说明ATRho14的信号谱图。
C.寿命-激发能量测
可使用利用至少两种激发能波长组合的寿命量测来区分多个标记物。在使用一种激发波长且并不使用另一种时，一些标记物可激发。针对每一激发波长选择具有不同寿命的标记物的组合以基于寿命量测来区分个体标记物。在此实施例中，集成设备可经构形以使得每一像素具有拥有一个区域的传感器，且外部激发源可经构形以提供两种激发能波长，该两个波长可以是具有时间交错的电调节脉冲二极管激光。
激发源是至少两种激发能的组合。激发源是脉冲激发源且可为使用上述技术的激发源中的一或多者。在一些情况下，脉冲激发源可为经构形以经由激光二极管的直接调节电抽吸发射脉冲的两个半导体激光二极管。脉冲功率在峰之后250皮秒小于脉冲峰功率20dB。每一激发脉冲的时间间隔在20-200皮秒范围内。每一激发脉冲之间的时间间隔在1-50纳秒范围内。每一脉冲发射一种激发波长，且藉由已知激发波长，具有不同寿命的标记物的子组得以独特鉴别。在一些实施例中，激发脉冲在不同波长中交替。举例而言，在使用两种激发波长时，后续脉冲在一种波长与另一其他波长之间交替。可实施示例性量测的方式的示意图展示于图36A中。可使用用于组合多个激发源及具有不同波长的交错脉冲的任一适宜技术。用于将一种以上激发波长的脉冲递送至一列试样孔的一些技术的实例阐释且阐述于本文中。在一些实施例中，在每列试样孔中存在单个波导且存在两个激发源，所述激发源经组合以便激发能脉冲在两种激发波长之间交替。在一些实施例中，在每列试样孔中存在两个波导且每一波导经构形以携载两种激发波长中的一者。在其他实施例中，在每列像素中存在单个波导且一种波长耦合至波导的一端且另一波长耦合至另一端。
用于每一像素的传感器在每一像素中具有至少一个光敏感区。光敏感区可具有5微米×5微米的尺寸。在光子到达传感器时的时间间隔内检测光子。增加时间仓的数量可改良在一系列时间仓中所收集光子的所记录直方图的分辨率且改良不同发光标记物的区别。传感器具有至少两个时间仓。
可基于寿命量测区分的4种发光标记物的示例性组是Alexa546、Alexa647及ATTO 647N。如图36B中所展示，Alexa546及在一种波长(例如532nm)下激发，且具有不同寿命。Alexa647及ATTO 647N在另一波长(640nm)下激发，且具有不同寿命，如图37A中所展示。ATTO647N及CFTM633(其皆系在640nm下激发)在16个时间仓中的可区分的归一化信号谱展示于图37B中。藉由检测在已知激发波长之后的光子，可基于先前激发波长来测定该等两对标记物中的一对且基于寿命量测来鉴别每一对中的每一标记物。
等效内容及范围
本申请案的各个方面可单独使用，组合使用，或以并未特定论述于前文所阐述实施例中的各种配置来使用，且由此并不将其应用限于先前说明中所陈述或图式中所图解说明的组件的细节及配置。举例而言，一实施例中所阐述的方面可以任一方式与其他实施例中所阐述的方面进行组合。
同样，本发明可体现为提供至少一种实例的方法。实施为方法部分的动作可以任一适宜方式测序。因此，可构筑以不同于所阐释顺序的顺序实施动作的实施例，此可包含同时实施一些动作(尽管在阐释性实施例中展示为依序动作)。
在申请专利范围中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数词术语来修饰申请专利范围要素本身并不提示一个申请专利范围要素比另一个申请专利范围要素具有任何优先级、居先或次序靠前或实施方法的动作的时间次序，而是仅用作用以区分具有某一名称的一个申请专利范围要素与具有同一名称(但使用序数词术语)的另一要素以区分申请专利范围要素。
同样，本文中所使用的措辞及术语是出于说明目的且不应视为具有限制性。本文使用“包含”、“包括”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式意欲涵盖其后所列示的项目及其等效物以及额外项目。

Claims (86)

1.一种鉴别试样中的单个分子的方法，所述方法包括测定所述单个分子的发光寿命及任选的发光强度。
2.如权利要求1的方法，其进一步包括测定所述单个分子的发光寿命和发光强度二者。
3.如前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括将一种或多种激发能的一系列脉冲递送至所述试样。
4.如前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括检测来自所述试样的多个发射光子。
5.如前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括针对多个来自所述试样的发射光子中的每一者，记录所述发射光子的检测与先前所递送激发能之间的持续时间。
6.如前述权利要求中任一项的方法，其中鉴别包括将所述单个分子鉴别为来自多个可能分子类型中的一种类型。
7.如权利要求6的方法，其中所述多个可能分子类型包括4种分子类型。
8.如权利要求7的方法，其中所述4个分子类型包括4种类型的经发光标记的核苷酸。
9.如权利要求8的方法，其中所述4种类型的经发光标记的核苷酸包括含有腺嘌呤的第一核苷酸、含有鸟嘌呤的第二核苷酸、含有胞嘧啶的第三核苷酸以及含有胸腺嘧啶或尿嘧啶的第四核苷酸。
10.如权利要求8或9的方法，其中所述单个分子是被纳入核酸中的经发光标记的核苷酸。
11.如前述权利要求中任一项的方法，其中重复所述方法以鉴别系列单个分子。
12.如权利要求11的方法，其中所述系列单个分子是系列被依序纳入包括引物的核酸中的经发光标记的核苷酸。
13.如权利要求12的方法，其进一步包括通过分析依序纳入包括引物的核酸中的经发光标记的核苷酸的序列，来测定模板核酸的序列。
14.如前述权利要求中任一项的方法，其中所述多个脉冲中的每一者均包括单个激发能。
15.如前述权利要求中任一项的方法，其中所述多个脉冲的第一部分包括第一激发能且所述多个脉冲的第二部分包括第二激发能。
16.如前述权利要求中任一项的方法，其中以介于约10MHz与约100MHz之间或介于约100MHz与约1GHz之间的平均频率递送所述系列脉冲。
17.如权利要求16的方法，其中所述频率介于约50MHz与约200MHz之间。
18.如前述权利要求中任一项的方法，其中对于所鉴别的每一单个分子，所检测发射光子数介于约10与约100之间或介于约100与约1,000之间。
19.如前述权利要求中任一项的方法，其中将所鉴别每一单个分子固定于固体支持物上。
20.如权利要求19的方法，其中所述固体支持物包括试样孔的底部表面。
21.一种测定模板核酸的序列的方法，其包括：
(i)将复合物在靶容积中暴露于多种类型的经发光标记的核苷酸，所述复合物包括所述模板核酸、引物及聚合酶，其中每一类型的经发光标记的核苷酸具有不同发光寿命和/或发光强度；
(ii)将一或多种激发能的系列脉冲引向靶容积附近；
(iii)在依序纳入包括所述引物的核酸中期间，检测来自经发光标记的核苷酸的多个发射光子；及
(iv)通过测定所述发射光子的时序及任选的频率，来鉴别所纳入核苷酸的序列。
22.如权利要求21的方法，其中检测进一步包括针对每一所检测发射光子，记录所述发射光子的检测与先前激发能脉冲之间的持续时间。
23.如权利要求21或22的方法，其中每一类型经发光标记的核苷酸在被单个激发能照射之后发射光子。
24.如权利要求23的方法，其中所述单个激发能在约470nm至约510nm、约510nm至约550nm、约550nm至约580nm、约580nm至约620nm或约620nm至约670nm的光谱范围内。
25.如权利要求21或22的方法，其中一或多类型的经发光标记的核苷酸在被第一激发能照射之后发射光子，且一或多种类型的经发光标记的核苷酸在被第二激发能照射之后发射光子。
26.如权利要求25的方法，其中所述第一激发能在约470nm至约510nm、约510nm至约550nm、约550nm至约580nm、约580nm至约620nm或约620nm至约670nm的光谱范围内，且所述第二激发能在约470nm至约510nm、约510nm至约550nm、约550nm至约580nm、约580nm至约620nm或约620nm至约670nm的光谱范围内。
27.如权利要求26的方法，其中所述第一激发能在约520nm至约550nm的光谱范围内，且所述第二激发能在约550nm至约580nm的光谱范围内。
28.如权利要求26的方法，其中所述第一激发能在约520nm至约550nm的光谱范围内，且所述第二激发能在约580nm至约620nm的光谱范围内。
29.如权利要求26的方法，其中所述第一激发能在约520nm至约550nm的光谱范围内，且所述第二激发能在约560nm至约670nm的光谱范围内。
30.如权利要求26的方法，其中所述第一激发能在约550nm至约580nm的光谱范围内，且所述第二激发能在约580nm至约620nm的光谱范围内。
31.如权利要求21至30中任一项的方法，其中每一类型的经发光标记的核苷酸发射单个光谱范围中的光子。
32.如权利要求21至30中任一项的方法，其中一或多种类型的经发光标记的核苷酸发射第一光谱范围中的光子，且一或多类经发光标记的核苷酸发射第二光谱范围中的光子。
33.如权利要求21至32中任一项的方法，其中至少一种类型、至少两种类型、至少三种类型或至少四种类型经发光标记的核苷酸各自包括选自由以下组成的组的发光标记：6-TAMRA、5/6-羧基罗丹明6G、Alex Fluor 546、 Aberrior Star 635、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO Rho6G、ATTO 542、ATTO 647N、ATTO Rho14、Chromis 630、Chromis 654A、ChromeoTM 642、CFTM514、CFTM532、CFTM543、CFTM546、CFTM546、CFTM555、CFTM568、CFTM633、CFTM640R、CFTM660C、CFTM660R、CFTM680R、Dyomics-530、Dyomics-547P1、Dyomics-549P1、Dyomics-550、Dyomics-554、Dyomics-555、Dyomics-556、Dyomics-560、Dyomics-650、Dyomics-680、 HiLyteTM Fluor 532、HiLyteTM Fluor 555、HiLyteTM Fluor 594、SetaTM 555、SetaTM670、SetaTM 700、SetaTMu 647及SetaTMu 665，或具有式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)：
其中每一磺酸酯或羧酸酯独立地是任选的经质子化的。
34.如权利要求33的方法，其中至少一种类型、至少两种类型、至少三种类型或至少四种类型经发光标记的核苷酸各自包括选自由以下组成的组的发光标记： CFTM532、CFTM543、CFTM555、CFTM594、 或具有式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。
35.如权利要求33的方法，其中至少一种类型、至少两种类型、至少三种类型或至少四种类型经发光标记的核苷酸各自包括选自由以下组成的组的发光染料： Atto Rho6G、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO Rho6G及ATTO 542。
36.如权利要求35的方法，其中第一类型经发光标记的核苷酸包括第二类型经发光标记的核苷酸包括第三类型经发光标记的核苷酸包括两种且第四类型经发光标记的核苷酸包括及
37.如权利要求35的方法，其中第一类型经发光标记的核苷酸包括第二类型经发光标记的核苷酸包括第三类型经发光标记的核苷酸包括且第四类型经发光标记的核苷 酸包括
38.如权利要求35的方法，其中第一类型经发光标记的核苷酸包括第二类型经发光标记的核苷酸包括第三类型经发光标记的核苷酸包括ATTORho6G，且第四类型经发光标记的核苷酸包括
39.如权利要求35的方法，其中第一类型经发光标记的核苷酸包括第二类型经发光标记的核苷酸包括第三类型经发光标记的核苷酸包括ATTORho6G，且第四类型经发光标记的核苷酸包括
40.如权利要求35的方法，其中第一类型经发光标记的核苷酸包括第二类型经发光标记的核苷酸包括第三类型经发光标记的核苷酸包括ATTO542，且第四类型经发光标记的核苷酸包括
41.如权利要求35的方法，其中第一类型经发光标记的核苷酸包括第二类型经发光标记的核苷酸包括第三类型经发光标记的核苷酸包括ATTO542，且第四类型经发光标记的核苷酸包括
42.如权利要求35的方法，其中第一类型经发光标记的核苷酸包括第二类型经发光标记的核苷酸包括第三类型经发光标记的核苷酸包括ATTO Rho6G，且第四类型经发光标记的核苷酸包括
43.如权利要求33的方法，其中第一及第二类型经发光标记的核苷酸各自包括选自由以下组成的组的发光标记： CFTM532、CFTM543、CFTM555、且第三及第四类经发光标记的核苷酸各自包括选自由以下组成的组的发光标记：CFTM594、 或具有式(染料101)、(染料102)、(染料103)、(染料104)、(染料105)或(染料106)。
44.如权利要求43的方法，其中所述第一类型核苷酸包括 且所述第二类型核苷酸包括Alex Fluor 555。
45.如权利要求43的方法，其中所述第一类型核苷酸包括 且所述第二类型核苷酸包括CFTM555。
46.如权利要求43的方法，其中所述第一类型核苷酸包括且所述第二类型核苷酸包括Alex Fluor 555。
47.如权利要求43的方法，其中所述第一类型核苷酸包括且所述第二类型核苷酸包括及CFTM555。
48.如权利要求43至47中任一项的方法，其中所述第三类型核苷酸包括且所述第四类型核苷酸包括 CFTM594或
49.如权利要求43至47中任一项的方法，其中所述第三类型核苷酸包括且所述第四类型核苷酸包括CFTM594或
50.如权利要求43至47中任一项的方法，其中所述第三类型核苷酸包括式(染料101)的核苷酸，且所述第四类型核苷酸包括 CFTM594或
51.如权利要求43至47中任一项的方法，其中所述第三类型核苷酸包括式(染料102)的核苷酸，且所述第四类型核苷酸包括 CFTM594或
52.如权利要求21至51中任一项的方法，其中以介于约10MHz与约100MHz之间或介于约100MHz与约1GHz之间的平均频率递送所述系列脉冲。
53.如权利要求52的方法，其中所述平均频率介于约50MHz与约200MHz之间。
54.如权利要求21至53中任一项的方法，其中对于每一所纳入经发光标记的核苷酸，所检测发射光子数介于约10与约100之间或介于约100与约1,000之间。
55.如权利要求21至54中任一项的方法，其中所述复合物包括DNA聚合酶。
56.如权利要求21至55中任一项的方法，其中将所述复合物固定于固体载支持物上。
57.如权利要求56的方法，其中使用包括生物素、链霉亲和素、聚(乙二醇)或其组合的附接剂固定所述复合物。
58.如权利要求57的方法，其中所述固体支持物是试样孔的底部表面。
59.如权利要求21至58中任一项的方法，其中将单个复合物限定于靶容积中。
60.如权利要求21至59中任一项的方法，其中所述多个类型的经发光标记的核苷酸包括含有腺嘌呤的第一核苷酸、含有鸟嘌呤的第二核苷酸、含有胞嘧啶的第三核苷酸及含有胸腺嘧啶或尿嘧啶的第四核苷酸。
61.如权利要求21至59中任一项的方法，其中所述多种类型的经发光标记的核苷酸包括含有脱氧腺苷的第一核苷酸、含有脱氧鸟苷的第二核苷酸、含有脱氧胞苷的第三核苷酸及含有脱氧胸苷的第四核苷酸。
62.如权利要求21至61中任一项的方法，其中如在介于约100nm与约200nm之间的试样孔中所量测，所述多种类型的经发光标记的核苷酸中的每一者具有介于约0.1ns与约2ns之间的发光寿命。
63.如权利要求21至62中任一项的方法，其中所述多种类型的经发光标记的核苷酸中的至少两者是通过测定所述核苷酸的发光寿命来鉴别。
64.如权利要求21至62中任一项的方法，其中所述多种类型的经发光标记的核苷酸中的至少三者是通过测定所述核苷酸的发光寿命来鉴别。
65.如权利要求21至62中任一项的方法，其中所述多种类型的经发光标记的核苷酸中的至少四者是通过测定所述核苷酸的发光寿命来鉴别。
66.如权利要求21至62中任一项的方法，其中所述多种类型的经发光标记的核苷酸中的至少两者是通过测定所述核苷酸的发光寿命及发光强度来鉴别。
67.如权利要求21至62中任一项的方法，其中所述多种类型的经发光标记的核苷酸中的至少三者是通过测定所述核苷酸的发光寿命及发光强度来鉴别。
68.如权利要求21至62中任一项的方法，其中所述多种类型的经发光标记的核苷酸中的至少四者是通过测定所述核苷酸的发光寿命及发光强度来鉴别。
69.如权利要求21至62中任一项的方法，其中所述多种类型的经发光标记的核苷酸各自包括通过连接子连接的发光标记及核苷酸。
70.如权利要求69的方法，其中所述连接子包括使所述发光标记与所述聚合酶之间的相互作用程度最小化的保护分子。
71.如权利要求70的方法，其中所述保护分子包括蛋白质。
72.如权利要求70的方法，其中所述保护分子包括核酸。
73.如权利要求49的方法，其进一步包括将一或多种激发能的系列脉冲递送至所述靶容积附近。
74.一种鉴别模板核酸的核苷酸的方法，其包括：
(i)将复合物在靶容积中暴露于多种类型的经发光标记的核苷酸，所述复合物包括所述模板核酸、引物及聚合酶，其中每一类型的经发光标记的核苷酸具有不同发光寿命或发光强度；
(ii)将一或多种激发能的系列脉冲引向所述靶容积附近；
(iii)检测来自纳入包括所述引物的核酸中的发光核苷酸的多个发射光子；
(iv)通过鉴别所纳入的经发光标记的核苷酸的发光寿命及任选的发光强度或二者，来鉴别所纳入的核苷酸。
75.如权利要求74的方法，其进一步包括将一或多种激发能的系列脉冲递送至所述靶容积附近。
76.一种用于核酸测序的系统，其包括：
多个纳米孔口，其中在使用期间，所述多个纳米孔口中的每一者的靶容积包括含有以下的反应混合物：(i)各自包括核酸、引物及聚合酶的多种复合物中的至少一种，及(ii)多个类型的经发光标记的核苷酸，其中每一类型的经发光标记的核苷酸具有不同发光寿命或发光强度；
一或多个激发源，其经构形以将一或多种激发能的脉冲提供至每一靶容积附近；
多个传感器，其经构形以检测来自所述多个纳米孔口中的每一者的发射光子；
及
一或多个计算机处理器，其以操作方式耦合至所述多个传感器，其中将所述一或多个计算机处理器个体地或共同地程序化以通过测定所述发射光子的时序及任选的频率来鉴别纳入所述核酸中的核苷酸的序列。
77.一种对靶核酸测序的方法，所述方法包括：
(i)提供包括以下的混合物：(a)所述靶核酸、(b)与所述靶核酸互补的引物、(c)聚合酶及(d)用于纳入至与所述靶核酸互补的生长核酸链中的核苷酸，其中所述核苷酸包含不同类型的经发光标记的核苷酸，其中所述经发光标记的核苷酸在依序纳入所述生长核酸链期间产生可检测信号，所述不同类型经发光标记的核苷酸的所述可检测信号可通过测定所述可检测信号的时序和/或频率来彼此区别；
(ii)在足以通过延伸所述引物来产生所述生长核酸链的条件下，对(i)的所述混合物实施聚合反应；
(iii)在依序纳入所述生长核酸链期间，量测来自所述经发光标记的核苷酸的所述可检测信号；及
(iv)在依序纳入所述生长核酸链中后，测定来自所述经发光标记的核苷酸的所量测可检测信号的时序和/或频率，以鉴别所述经发光标记的核苷酸纳入所述生长核酸链中的时间序列，由此测定所述靶核酸的序列。
78.如权利要求77的方法，其中所述靶核酸分子或所述聚合酶附接至支持物。
79.如权利要求77的方法，其中在对(i)的所述混合物实施所述聚合反应后，鉴别纳入的所述时间序列。
80.如权利要求77的方法，其中所述可检测信号是光学信号。
81.如权利要求80的方法，其中所述光学信号是发光信号。
82.如权利要求77的方法，其中测定所量测可检测信号的时序和/或频率包括：(i)在一或多个传感器处接收所述可检测信号，及(ii)将响应于在所述一或多个传感器处接收的所述可检测信号所产生的多个电荷载子中的电荷载子，基于产生所述电荷载子的时间，选择性引导至至少一个电荷载子储存区中。
83.如权利要求77的方法，其中所量测可检测信号的所述时序和/或频率包括衰减寿命的量测。
84.如权利要求77的方法，其中所量测可检测信号的所述时序和/或频率包括所述可检测信号在一或多个检测所述可检测信号的传感器处的到达时间的量测。
85.如权利要求82的方法，其进一步包括基于所述可检测信号的所述到达时间，将所述可检测信号产生的电荷载子分离至与所述一或多个传感器有关的仓中。
86.如权利要求77的方法，其中所量测可检测信号的所述时序和/或频率是非光谱量测。
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