BR112017024573B1 - Método de identificação de uma molécula única em uma amostra - Google Patents

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Abstract

método de determinação da sequência de um ácido nucleico nuclear usando luminescência resolvida no tempo. a presente invenção refere-se a métodos de sequenciamento de moléculas com base em tempos de vida e/ou intensidades de luminescência. em alguns aspectos, métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos envolvem determinação dos tempos de vida de luminescência e, opcionalmente, intensidades de luminescência, de uma série de nucleotídeos luminescentemente marcados incorporados durante uma reação de sequenciamento de ácido nucleico.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente Pedido de Patente reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido de Patente Provisório U.S. N°.62/164.482, intitulado "METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING", depositado em 20 de maio de 2015, Pedido de Patente Provisório U.S. N°. 62/164.506, intitulado "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS", depositado em 20 de maio de 2015, Pedido de Patente Provisório U.S. N°. 62/164.464, intitulado "INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING, DETECTING, AND ANALYSING MOLECULES", depositado em 20 de maio de 2015, e Pedido de Patente Provisório U.S. N°. 62/164.485, intitulado "PULSED LASER", depositado em 20 de maio de 2015, cada um deles é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[002] O presente Pedido de Patente reivindica prioridade sob 35 U.S.C. §120 para o Pedido de Patente U.S. N°. 14/821.688, intitulado "INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING, DETECTING, AND ANALYSING MOLECULES", depositado em 07 de agosto de 2015, que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
CAMPO DA APLICAÇÃO
[003] O presente pedido de patente refere-se em geral a métodos, composições e dispositivos para realização de análise quantitativa rápida, massivamente paralela, de amostras biológicas e/ou químicas e métodos de fabricação dos ditos dispositivos.
ANTECEDENTES
[004] A detecção e análise de amostras biológicas podem ser realizadas usando ensaios biológicos ("bioensaios"). Os bioensaios envolvem convencionalmente equipamentos de laboratório grandes e dispendiosos, que requerem pesquisadores treinados para operar o equipamento e realizar os bioensaios. Além disso, os bioensaios são convencionalmente realizados em grande proporção, de modo que uma grande quantidade de um determinado tipo de amostra é necessária para a detecção e quantificação.
[005] Alguns bioensaios são realizados por marcação de amostras com marcadores luminescentes que emitem luz de um determinado comprimento de onda. Os marcadores são iluminados com uma fonte de luz para causar luminescência, e a luz luminescente é detectada com um fotodetector para quantificar a quantidade de luz luminescente emitida pelos marcadores. Os bioensaios que usam marcadores luminescentes envolvem convencionalmente fontes de luz laser caras para iluminar as amostras e ópticas de detecção luminescentes complicadas e dispositivos eletrônicos para coletar a luminescência das amostras iluminadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] De acordo com um aspecto do presente pedido de patente, uma molécula única pode ser identificada (por exemplo, distinguida de outras moléculas possíveis em uma amostra de reação) com base em uma ou mais propriedades de uma série de fótons que são emitidos a partir da molécula quando exposta a uma pluralidade de pulsos de luz separados. Em algumas modalidades, os fótons emitidos podem ser usados para identificar/distinguir a molécula com base em um tempo de vida luminescente diferente. Em algumas modalidades, o tempo de vida luminescente pode ser calculado. Em algumas modalidades, o tempo de vida real não precisa ser calculado. Por exemplo, pode-se usar uma ou mais propriedades sugestivas do tempo de vida luminescente (por exemplo, hora local de emissão, distribuição horária de emissões detectadas). Em algumas modalidades, os fótons emitidos podem ser usados para determinar a intensidade luminescente da molécula e a intensidade luminescente pode ser usada para identificar a molécula. Em algumas modalidades, os fótons emitidos podem ser usados para determinar o tempo de vida e a intensidade luminescente da molécula, e o tempo de vida ou a intensidade luminescente pode ser usado para identificar a molécula. Em algumas modalidades, a identidade da molécula pode basear-se em uma combinação de tempo de vida e intensidade luminescente.
[007] Em algumas modalidades, uma molécula pode ser marcada com um marcador luminescente. Em algumas modalidades, o marcador luminescente é um fluoróforo. Em algumas modalidades, o marcador luminescente pode ser identificado ou distinguido com base em uma propriedade do marcador luminescente. As propriedades de um marcador luminescente (por exemplo, um fluoróforo) incluem, mas não estão limitadas a tempos de vida luminescente, espectros de absorção, espectros de emissão, rendimento quântico luminescente e intensidade luminescente. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base no tempo de vida luminescente. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base na intensidade luminescente. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base no comprimento de onda da energia de excitação administrada necessária para observar um fóton emitido. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base no comprimento de onda de um fóton emitido. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base no tempo de vida luminescente e no comprimento de onda da energia de excitação administrada necessária para observar um fóton emitido. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base tanto na intensidade luminescente quanto no comprimento de onda da energia de excitação transmitida necessária para observar um fóton emitido. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base no tempo de vida luminescente, intensidade luminescente e o comprimento de onda da energia de excitação transmitida necessária para observar um fóton emitido. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base no tempo de vida luminescente e no comprimento de onda de um fóton emitido. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base tanto na intensidade luminescente quanto no comprimento de onda de um fóton emitido. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes são identificados ou distinguidos com base no tempo de vida luminescente, na intensidade luminescente e no comprimento de onda de um fóton emitido.
[008] Em determinadas modalidades, diferentes tipos de moléculas em uma mistura reacional ou experiência são marcados com diferentes marcadores luminescentes. Em algumas modalidades, os diferentes marcadores têm diferentes propriedades luminescentes que podem ser distinguidas. Em algumas modalidades, os diferentes marcadores são distinguidos por terem diferentes tempos de vida luminescente, diferentes intensidades luminescentes, diferentes comprimentos de onda de fótons emitidos ou uma combinação destes. A presença de uma pluralidade de tipos de moléculas com diferentes marcadores luminescentes pode permitir que diferentes etapas de uma reação complexa sejam monitoradas, ou que diferentes componentes de um produto de reação complexo sejam identificados. Em algumas modalidades, a ordem na qual os diferentes tipos de moléculas reagem ou interagem pode ser determinada.
[009] Em algumas modalidades, diferentes nucleotídeos podem ser marcados luminescentemente com um número diferente da mesma molécula luminescente (por exemplo, um ou mais do mesmo corante fluorescente). Em algumas modalidades, a alteração do número de moléculas luminescentes em um marcador luminescente pode permitir que diferentes nucleotídeos sejam distinguidos com base em diferentes intensidades. Em algumas modalidades, diferentes nucleotídeos podem ser marcados com um tipo diferente de molécula luminescente e/ou um número diferente de cada molécula luminescente. Em algumas modalidades, diferentes tipos de moléculas luminescentes permitem que diferentes nucleotídeos sejam distinguidos com base em diferentes intensidades e/ou tempos de vida diferentes.
[0010] Em determinadas modalidades, as propriedades luminescentes de uma pluralidade de tipos de moléculas com diferentes marcadores luminescentes são usadas para identificar a sequência de uma biomolécula, tal como um ácido nucleico ou uma proteína. Em algumas modalidades, as propriedades luminescentes de uma pluralidade de tipos de moléculas com diferentes marcadores luminescentes são usadas para identificar moléculas únicas, uma vez que elas são incorporadas durante a síntese de uma biomolécula. Em algumas modalidades, as propriedades luminescentes de uma pluralidade de tipos de nucleotídeos com marcadores luminescentes diferentes são usadas para identificar nucleotídeos únicos, uma vez que eles são incorporados durante uma reação de sequenciamento. Isto pode permitir a determinação da sequência de um modelo de ácido nucleico. Em algumas modalidades, os nucleotídeos luminescentemente marcados são incorporados em um filamento de ácido nucleico complementar ao modelo de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o filamento complementar compreende um iniciador.
[0011] Em certas modalidades, a pluralidade de tipos de nucleotídeos com marcadores luminescentes diferentes compreende quatro tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados. Em algumas modalidades, os quatro nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem e/ou emitem fótons dentro de uma faixa espectral. Em algumas modalidades, três dos nucleotídeos luminescentemente marcados emitem dentro de uma primeira faixa espectral e um quarto nucleotídeo luminescentemente marcado absorve e/ou emite fótons dentro de uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, dois dos nucleotídeos luminescentemente marcados emitem dentro de uma primeira faixa espectral, e um terceiro e quarto nucleotídeos luminescentemente marcados emitem luminescência dentro de uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, dois dos nucleotídeos luminescentemente marcados emitem dentro de uma primeira faixa espectral, um terceiro nucleotídeo absorve e/ou emite fótons dentro de uma segunda faixa espectral e um quarto nucleotídeo absorve e/ou emite fótons dentro de uma terceira faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dos quatro nucleotídeos luminescentemente marcados absorve e/ou emite fótons dentro de uma faixa espectral diferente. Em algumas modalidades, cada tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado que absorve e/ou emite fótons dentro da mesma faixa espectral tem um tempo de vida ou intensidade luminescente diferente, ou ambos.
[0012] Em algumas modalidades, quatro tipos diferentes de nucleotídeos (por exemplo, adenina, guanina, citosina, timina/uracila) em uma mistura de reação podem ser rotulados com uma ou mais moléculas luminescentes. Em algumas modalidades, cada tipo de nucleotídeo pode ser ligado a mais de uma da mesma molécula luminescente (por exemplo, dois ou mais do mesmo corante fluorescente ligado a um nucleotídeo). Em algumas modalidades, cada molécula luminescente pode ser conectada a mais de um nucleotídeo (por exemplo, dois ou mais do mesmo nucleotídeo). Em algumas modalidades, mais de um nucleotídeo pode ser conectado a mais de uma molécula luminescente. Em algumas modalidades, uma molécula protetora serve como uma âncora para ligar um ou mais nucleotídeos (por exemplo, do mesmo tipo) e uma ou mais moléculas luminescentes (por exemplo, do mesmo tipo). Em algumas modalidades, os quatro nucleotídeos são marcados com moléculas luminescentes que absorvem e emitem dentro da mesma faixa espectral (por exemplo, 520-570 nm).
[0013] Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes entre um conjunto de quatro nucleotídeos podem ser selecionados a partir de corantes compreendendo um composto aromático ou heteroaromático e pode ser um pireno, antraceno, naftaleno, acridina, estilbeno, indol, benzindol, oxazol, carbazol, tiazol, benzotiazol, fenantridina, fenoxazina, porfirina, quinolina, etídio, benzamida, cianina, carbocianina, salicilato, antranilato, cumarina, fluoresceína, rodamina ou outro composto similar. Corantes exemplificativos incluem corantes de xanteno, tais como corantes de fluoresceína ou de rodamina, corantes de naftaleno, corantes de cumarina, corantes de acridina, corantes de cianina, corantes de benzoxazol, corantes de estilbeno, corantes de pireno, corantes de ftalocianina, corantes de ficobiliproteína, corantes de esquaraína e semelhantes.
[0014] Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes entre um conjunto de quatro nucleotídeos compreendem Alexa Fluor® 546, Cy®3B, Alexa Fluor® 555 e Alexa Fluor® 555 e o par FRET Alexa Fluor® 555 e Cy®3.5. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes entre um conjunto de quatro nucleotídeos compreendem Alexa Fluor® 555, Cy®3.5, Alexa Fluor® 546 e DyLight® 554-R1. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes entre um conjunto de quatro nucleotídeos compreendem Alexa Fluor® 555, Cy®3.5, ATTO Rho6G e DyLight® 554-R1. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes entre um conjunto de quatro nucleotídeos compreendem Alexa Fluor® 555, Cy®3B, ATTO Rho6G e DyLight® 554-R1. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes entre um conjunto de quatro nucleotídeos compreendem Alexa Fluor® 555, Cy®3B, ATTO 542 e DyLight® 554- R1. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes entre um conjunto de quatro nucleotídeos compreendem Alexa Fluor® 555, Cy®3B, ATTO 542 e Alexa Fluor® 546. Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes entre um conjunto de quatro nucleotídeos compreendem Cy®3.5, Cy®3B, ATTO Rho6G e DyLight® 554-R1.
[0015] Em certas modalidades, pelo menos um tipo, pelo menos dois tipos, pelo menos três tipos ou pelo menos quatro dos tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados compreendem um corante luminescente selecionado do grupo que consiste em 6-TAMRA, 5/6- Carboxyrhodamine 6G, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 647, Aberrior Star 635, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 647N, ATTO Rho14, Chromis 630, Chromis 654A, Chromeo® 642, CF®514, CF®532, CF®543, CF®546, CF®546, CF®555, CF®568, CF®633, CF®640R, CF®660C, CF®660R, CF®680R, Cy®3, Cy®3B, Cy®3.5, Cy®5, Cy®5.5, Dyomics-530, Dyomics-547P1, Dyomics-549P1, Dyomics-550, Dyomics-554, Dyomics-555, Dyomics-556, Dyomics-560, Dyomics-650, Dyomics- 680, DyLight® 554-R1, DyLight® 530-R2, DyLight® 594, DyLight® 635- B2, DyLight® 650, DyLight® 655-B4, DyLight® 675-B2, DyLight® 675- B4, DyLight® 680, HiLyte® Fluor 532, HiLyte® Fluor 555, HiLyte® Fluor 594, LightCycler® 640R, Seta® 555, Seta® 670, Seta®700, Seta®u 647 e Seta®u 665 ou são de fórmulas (Corante 101), (Corante 102), (Corante 103), (Corante 104), (Corante 105) ou (Corante 106), tal como aqui descrito.
[0016] Em algumas modalidades, pelo menos um tipo, pelo menos dois tipos, pelo menos três tipos ou pelo menos quatro dos tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados compreendem, cada um, um corante luminescente selecionado do grupo que consiste em Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Cy®3B, Cy®3.5, DyLight® 554-R1, Alexa Fluor® 546, ATTO Rho6G, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO Rho6G e ATTO 542.
[0017] Em algumas modalidades, um primeiro tipo de nucleotide luminescentemente marcado compreende Alexa Fluor® 546, um segundo tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Cy®3B, um terceiro tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende dois Alexa Fluor® 555 e um quarto tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Alexa Fluor® 555 e Cy®3.5.
[0018] Em algumas modalidades, um primeiro tipo de nucleotide luminescentemente marcado compreende Alexa Fluor® 555, um segundo tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Cy®3.5, um terceiro tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Alexa Fluor® 546 e um quarto tipo de nucleotide luminescentemente marcado compre DyLight® 554-R1.
[0019] Em algumas modalidades, um primeiro tipo de nucleotide luminescentemente marcado compreende Alexa Fluor® 555, um segundo tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Cy®3.5, um terceiro tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende ATTO Rho6G e um quarto tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende DyLight® 554-R1.
[0020] Em algumas modalidades, um primeiro tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Alexa Fluor® 555, um segundo tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Cy®3B, um terceiro tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende ATTO Rho6G e um quarto tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende DyLight® 554-R1.
[0021] Em algumas modalidades, um primeiro tipo de nucleotide luminescentemente marcado compreende Alexa Fluor® 555, um segundo tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Cy®3B, um terceiro tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende ATTO 542 e um quarto tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende DyLight® 554-R1.
[0022] Em algumas modalidades, um primeiro tipo de nucleotide luminescentemente marcado compreende Alexa Fluor® 555, um segundo tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Cy®3B, um terceiro tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende ATTO 542 e um quarto tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Alexa Fluor® 546.
[0023] Em algumas modalidades, um primeiro tipo de nucleotide marcado luminescentemente compreende Cy®3.5, um segundo tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende Cy®3B, um terceiro tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende ATTO Rho6G e um quarto tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado compreende DyLight® 554-R1.
[0024] Em algumas modalidades, pelo menos um tipo, pelo menos dois tipos, pelo menos três tipos ou pelo menos quatro dos tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados compreendem um corante luminescente selecionado a partir do grupo que consiste em Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, CF® 532, CF® 543, CF® 555, CF® 594, Cy®3, DyLight® 530-R2, DyLight® 554-R1, DyLight® 590-R2, DyLight® 594, DyLight® 610-B1 ou são de fórmulas (Corante 101), (Corante 102), (Corante 103), (Corante 104), (Corante 105) ou (Corante 106).
[0025] Em algumas modalidades, um primeiro e segundo tipo de nucleotídeo marcado luminescentemente compreendem um corante luminescente selecionado a partir do grupo que consiste em Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, CF®532, CF®543, CF®555, Cy®3, DyLight® 530-R2, DyLight® 554-R1 e um terceiro e quarto tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados compreendem um corante luminescente selecionado a partir do grupo que consiste em Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, CF®594, DyLight® 590-R2, DyLight® 594, DyLight® 610-B1, ou são das fórmulas (Corante 101), (Corante 102), (Corante 103), (Corante 104), (Corante 105) ou (Corante 106).
[0026] Em determinadas modalidades, pelo menos um tipo, pelo menos dois tipos, pelo menos três tipos ou pelo menos quatro dos tipos de moléculas de nucleotídeos luminescentemente marcados compreendem uma proteína luminescente selecionada a partir do grupo que consiste em TagBFP, mTagBFP2, Azurite, EBFP2, mKalama1, Sirius, Sapphire, T-Sapphire, ECFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, Midoriishi-Cyan monomérica, TagCFP, mTFP1, EGFP, Emerald, Superfolder GFP, Azami Green monomérica, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover, mNeonGreen, EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, TagYFP, Kusabira-Orange monomérica, mKOK, mKO2, mOrange, mOrange2, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby, mRuby2, mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune, NirFP, TagRFP657, IFP1.4, iRFP, mKeima Red, LSS-mKate1, LSS-mKate2, mBeRFP, PA-GFP, PAmCherry1, PATagRFP, Kaede (verde), Kaede (vermelho), KikGR1 (verde), KikGR1 (vermelho), PS-CFP2, mEos2 (verde), mEos2 (vermelho), PSmOrange ou Dronpa.
[0027] Aspectos do presente pedido de patente proveem métodos e sistemas e dispositivos úteis para esses métodos, para administrar uma energia de excitação a uma molécula a ser identificada e detectar fótons emitidos após a excitação. Em certas modalidades, a detecção compreende registrar para cada luminescência detectada, o tempo de duração entre a luminescência e o pulso prévio da energia de excitação. Em certas modalidades, a detecção compreende registrar para cada uma dentre uma pluralidade de luminescências detectadas, a duração de tempo entre a luminescência e o pulso prévio da energia de excitação. Em certas modalidades, é administrada uma pluralidade de pulsos de energia de excitação. O marcador luminescente da molécula a ser identificada pode ser excitado por cada pulso ou uma porção dos pulsos. Em certas modalidades, uma pluralidade de luminescências é detectada por um ou mais sensores. O marcador luminescente da molécula a ser identificada pode emitir luminescência após cada excitação ou uma parte das excitações. A fração de eventos de excitação que resulta em uma luminescência baseia-se no rendimento quântico luminescente do marcador. Em algumas modalidades, o aumento do número de moléculas luminescentes que compõem um marcador luminescente pode aumentar o rendimento quântico (por exemplo, aumentar o número de emissões luminescentes). Além disso, nem todas as luminescências emitidas por um marcador serão detectadas, por exemplo, algumas luminescências serão direcionadas para longe dos sensores. Em certas modalidades, a energia ou energias de excitação são selecionadas com base nas propriedades luminescentes dos marcadores luminescentes, incluindo os espectros de absorção e os comprimentos de onda em que um marcador emite fótons após a excitação em uma determinada faixa espectral.
[0028] Em certas modalidades, a frequência das energias de excitação pulsada é selecionada com base nas propriedades da luminescência (por exemplo, tempo de vida luminescente) da molécula luminescentemente marcada a ser detectada. Em algumas modalidades, o intervalo entre os pulsos é mais longo do que o tempo de vida luminescente de uma ou mais moléculas marcadas luminescentemente que estão sendo excitadas. Em algumas modalidades, o intervalo é entre aproximadamente duas vezes e cerca de dez vezes, entre cerca de dez vezes e cerca de 100 vezes, ou entre cerca de 100 vezes e cerca de 1000 vezes mais longo do que o tempo de vida luminescente de uma ou mais moléculas marcadas luminescentemente que estão sendo excitadas. Em algumas modalidades, o intervalo é cerca de 10 vezes mais longo do que o tempo de vida luminescente de uma ou mais moléculas marcadas luminescentemente que estão sendo excitadas.
[0029] Em certas modalidades, a frequência de energias de excitação pulsada é selecionada com base no processo químico que está sendo monitorado. Para uma reação de sequenciamento, o número de pulsos administrado ao volume alvo, enquanto um nucleotídeo luminescentemente marcado está sendo incorporado, determinará, em parte, o número de fótons emitidos detectados. Em algumas modalidades, a frequência é selecionada para permitir que um número suficiente de fótons seja detectado durante a incorporação de um nucleotídeo luminescentemente marcado, em que um número suficiente é o número de fótons necessários para distinguir o nucleotídeo luminescentemente marcado entre uma pluralidade de tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados. Em algumas modalidades, o nucleotídeo luminescentemente marcado é distinguido com base no comprimento de onda dos fótons emitidos. Em algumas modalidades, o nucleotídeo luminescentemente marcado é distinguido com base no tempo de vida da emissão luminescente, por exemplo, o tempo entre a excitação do pulso e detecção da emissão. Em algumas modalidades, o nucleotídeo marcado luminescentemente é distinguido com base no comprimento de onda e no tempo de vida da emissão luminescente dos fótons emitidos. Em algumas modalidades, o nucleotídeo luminescentemente marcado é distinguido com base na intensidade luminescente do sinal de emissão (por exemplo, com base na frequência de emissão ou no número total de eventos de emissão dentro de um período de tempo). Em algumas modalidades, o nucleotídeo luminescentemente marcado é distinguido com base na intensidade luminescente do sinal de emissão e no tempo de vida luminescente. Em algumas modalidades, o nucleotídeo luminescentemente marcado é distinguido com base na intensidade e no comprimento de onda luminescente. Em algumas modalidades, o nucleotídeo luminescentemente marcado é distinguido com base na intensidade luminescente, no comprimento de onda e no tempo de vida luminescente.
[0030] De acordo com um aspecto do presente pedido, é provido um sistema que compreende um módulo de fonte de excitação e um dispositivo integrado. O módulo de fonte de excitação compreende uma fonte de excitação configurada para emitir um pulso de energia de excitação tendo uma primeira duração de tempo. O dispositivo integrado inclui um volume alvo configurado para receber uma molécula que, quando acoplada ao pulso de energia de excitação, emite luminescência, um primeiro percurso de energia, ao longo do qual o pulso da energia de excitação se move de um componente de acoplamento de fonte de energia para o volume alvo, um sensor que detecta a luminescência durante um segundo período de tempo, em que a segunda duração do tempo é maior do que a primeira duração de tempo; um segundo percurso de energia, ao longo do qual a luminescência se move do volume alvo para o sensor; e um terceiro percurso de energia ao longo do qual o pulso da energia de excitação se move da fonte de excitação para o componente de acoplamento da fonte de energia.
[0031] De acordo com outro aspecto do presente pedido de patente, é provido um dispositivo integrado que compreende um volume alvo e um sensor. O volume alvo é configurado para receber uma amostra marcada com um dentre uma pluralidade de marcadores luminescentes, cada um da pluralidade de marcadores luminescentes com um valor de tempo de vida diferente. O sensor é configurado para detectar a luminescência de um dentre a pluralidade de marcadores luminescentes ao longo de uma pluralidade de durações de tempo. A pluralidade de durações de tempo é selecionada para diferenciar entre a pluralidade de marcadores luminescentes.
[0032] De acordo com outro aspecto do presente pedido, é provido um dispositivo integrado que compreende um volume alvo e uma pluralidade de sensores. O volume alvo é configurado para receber uma amostra marcada com um dentre uma pluralidade de marcadores luminescentes. Cada um dentre a pluralidade de marcadores luminescentes emite luminescência dentro de uma pluralidade de faixas espectrais e uma porção dentre a pluralidade de marcadores luminescentes que emitem luminescência em uma dentre a pluralidade de faixas espectrais tem, cada um, diferentes tempos de vida luminescente. Cada sensor dentre a pluralidade de sensores é configurado para detectar uma dentre a pluralidade de faixas espectrais ao longo de uma pluralidade de durações de tempo e a pluralidade de durações de tempo é selecionada para diferenciar entre a porção da pluralidade de marcadores luminescentes.
[0033] De acordo com outro aspecto do presente pedido, é provido um sistema que compreende uma pluralidade de fontes de excitação e um dispositivo integrado. A pluralidade de fontes de excitação emite uma pluralidade de energias de excitação. Cada uma dentre a pluralidade de fontes de excitação emite pulsos de uma dentre a pluralidade de energias de excitação. O dispositivo integrado inclui um volume alvo configurado para receber uma amostra marcada com um dentre uma pluralidade de marcadores luminescentes e um sensor configurado para detectar a luminescência de um dentre a pluralidade de marcadores luminescentes durante uma pluralidade de durações de tempo após um pulso de uma dentre a pluralidade de energias de excitação. Uma porção da pluralidade de marcadores luminescentes que emitem luminescência depois de serem iluminados por uma dentre a pluralidade de energias de excitação tem, cada um, valores de tempo de vida diferentes. O acúmulo de uma pluralidade de dados que temporizam a duração entre um evento de pulso e uma emissão luminescente difere entre a pluralidade de marcadores luminescentes.
[0034] De acordo com outro aspecto do presente pedido, é provido um método de sequenciamento de um ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, o método de sequenciamento de um ácido nucleico alvo compreende etapas de: (i) prover uma mistura compreendendo (a) o dito ácido nucleico alvo, (b) um iniciador complementar ao dito ácido nucleico alvo, (c) uma polimerase de ácido nucleico e (d) nucleotídeos para incorporação em um filamento de ácido nucleico em formação complementar ao dito ácido nucleico alvo, onde os ditos nucleotídeos incluem diferentes tipos de nucleotídeos marcados luminescentemente, em que os ditos nucleotídeos luminescentemente marcados produzem sinais detectáveis durante a incorporação sequencial ao dito filamento de ácido nucleico em formação, cujos sinais detectáveis para os ditos diferentes tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados são diferenciáveis um do outro em um domínio do tempo (por exemplo, determinando a temporização e/ou a frequência dos sinais detectáveis); (ii) submeter a dita mistura de (i) a uma reação de polimerização sob condições que são suficientes para produzir o dito filamento de ácido nucleico em formação por extensão do dito iniciador; (iii) medir os ditos sinais detectáveis a partir dos ditos nucleotídeos luminescentemente marcados durante a incorporação sequencial ao dito filamento de ácido nucleico em formação; e (iv) determinar a temporização e/ou a frequência dos ditos sinais detectados medidos a partir dos ditos nucleotídeos luminescentemente marcados após incorporação sequencial ao dito filamento de ácido nucleico em formação para identificar uma sequência de tempo de incorporação dos ditos nucleotídeos luminescentemente marcados ao dito filamento de ácido nucleico em formação, assim determinando uma sequência do dito ácido nucleico alvo.
[0035] Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo ou a polimerase de ácido nucleico está ligada a um apoio. Em algumas modalidades, a sequência de tempo de incorporação é identificada subsequente à submissão da mistura de (i) à reação de polimerização. Em algumas modalidades, os sinais detectáveis são sinais ópticos. Em algumas modalidades, os sinais ópticos são sinais luminescentes. Em algumas modalidades, determinar a temporização e/ou a frequência dos sinais detectados medidos compreende (i) receber os ditos sinais detectáveis em um ou mais sensores; e (ii) direcionar seletivamente veículos de carga de uma pluralidade de veículos de carga produzidos em resposta aos ditos sinais detectáveis recebidos nos ditos um ou mais sensores para pelo menos uma região de armazenamento de veículo de carga com base nas vezes que os ditos veículos de carga são produzidos.
[0036] Em algumas modalidades, a temporização e/ou a frequência dos ditos sinais detectáveis medidos compreendem medições de tempos de vida de declínio. Em algumas modalidades, a temporização e/ou a frequência dos sinais detectáveis medidos compreendem medições dos tempos de chegada dos sinais detectáveis em um ou mais sensores que detectam os sinais detectáveis. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a segregação de veículos de carga produzidos pelos sinais detectáveis em agrupamentos associados com um ou mais sensores com base nos tempos de chegada dos sinais detectáveis. Em algumas modalidades, a temporização e/ou a frequência dos sinais detectáveis medidos são medições não espectrais.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0037] O especialista compreenderá que as figuras, aqui descritas, são apenas para fins ilustrativos. Deve ser entendido que, em alguns casos, vários aspectos da invenção podem ser mostrados exagerados ou ampliados para facilitar a compreensão da invenção. Nos desenhos, caracteres de referência iguais geralmente se referem a características similares, elementos funcionalmente similares e/ou estruturalmente similares ao longo das várias figuras. Os desenhos não são necessariamente dimensionados, concentrando-se, em vez disso, em ilustrar os princípios dos ensinamentos. Os desenhos não se destinam a limitar o alcance dos ensinamentos atuais de qualquer maneira.
[0038] As características e vantagens da presente invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada apresentada abaixo, quando tomada em conjunto com os desenhos.
[0039] Ao descrever modalidades em referência aos desenhos, as referências de direção ("acima", "abaixo", "superior", "inferior", "esquerda", "direita", "horizontal", "vertical", etc.) podem ser usadas. Tais referências destinam-se apenas a um auxílio ao leitor que vê os desenhos em uma orientação normal. Essas referências direcionais não pretendem descrever uma orientação preferida ou única de um dispositivo incorporado. Um dispositivo pode ser incorporado em outras orientações.
[0040] Como é evidente a partir da descrição detalhada, os exemplos representados nas figuras (por exemplo, Figuras 1-37) e descritos adicionalmente para fins de ilustração ao longo do pedido de patente descrevem modalidades não limitantes e, em alguns casos, podem simplificar certos processos ou omitir recursos ou etapas com o objetivo de uma ilustração mais clara.
[0041] A Figura 1 mostra um esquema não limitante de uma cavidade de amostra (por exemplo, uma cavidade de amostra) contendo vários componentes para o sequenciamento de ácido nucleico.
[0042] A Figura 2 mostra uma experiência não limitante e exemplificativa de sequenciamento de ácido nucleico para quatro estágios; (A) antes da incorporação de um nucleotídeo marcado luminescentemente; (B) um primeiro evento de incorporação; (C) um período entre o primeiro e o segundo eventos de incorporação; e (D) um segundo evento de incorporação; juntamente com exemplos correspondentes de dados originais e processados durante os estágios (A) - (D).
[0043] A Figura 3 representa um sinal não limitante versus tempo de emissão para quatro moléculas luminescentes com tempos de vida luminescentes diferentes e função de distribuição cumulativa normalizada para a probabilidade de declínio.
[0044] A Figura 4 mostra um gráfico não limitante de tempos de vida luminescentes e um gráfico para intensidades luminescentes para nucleotídeos exemplificativos luminescentemente marcados.
[0045] A Figura 5 representa uma experiência de sequenciamento não limitante com quatro nucleotídeos luminescentemente marcados: (A) sinais de luminescências detectadas de pulsos verdes e vermelhos; (B) redução de dados de pulsos verdes com base o tempo de vida e intensidade luminescentes de cada incorporação de nucleotídeos; e (C) alinhamento da sequência determinada experimentalmente com a sequência modelo.
[0046] A Figura 6 representa uma experiência de sequenciamento não limitante com quatro nucleotídeos luminescentemente marcados: (A) sinal de luminescências detectadas de pulsos verdes; (B) redução de dados de pulsos verdes com base no tempo de vida e intensidade luminescentes de cada incorporação de nucleotídeos; e (C) alinhamento da sequência determinada experimentalmente com a sequência modelo.
[0047] A Figura 7 mostra um processo não limitante e exemplificativo para a preparação da superfície, incluindo as etapas de (a) deposição, (b) passivação, (c) sinalização, (d) carregamento do complexo e (e) iniciação da reação de sequenciamento.
[0048] A Figura 8 mostra dois métodos não limitantes para a passivação de superfícies de óxido de metal com grupos fosfonato- PEG.
[0049] A Figura 9 mostra dois métodos não limitantes para a funcionalização do vidro com as misturas de silano-PEG-biotina e silano-PEG.
[0050] A Figura 10 representa exemplos não limitantes de uma ou mais moléculas luminescentes e um ou mais nucleotídeos conectados através de uma molécula de proteção.
[0051] A Figura 11 representa exemplos não limitantes de configurações envolvendo um ou mais nucleotídeos e uma ou mais moléculas luminescentes ligadas através de ligantes de divisão a uma molécula de proteção.
[0052] A Figura 12 representa uma modalidade não limitante de configurações de moléculas de nucleotídeos luminescentemente marcados que podem ser utilizadas em uma reação de sequenciamento e uma experiência de sequenciamento exemplificativa, em que as propriedades luminescentes de um nucleotídeo luminescentemente marcado são usadas para identificar a base sendo incorporada à reação de sequenciamento.
[0053] A Figura 13 representa um exemplo não limitante de engenharia de sítios de ligação não funcionais em uma molécula de proteção para unir moléculas e nucleotídeos luminescentes em sítios selecionados.
[0054] A Figura 14 representa um exemplo não limitante, no qual uma molécula e um nucleotídeo luminescentes são ligados através de uma molécula de proteção, em que os ligantes que ligam a molécula luminescente e o nucleotídeo à molécula de proteção compreendem oligonucleotídeos.
[0055] A Figura 15 representa um exemplo não limitante no qual uma molécula luminescente é ligada a uma molécula de proteção através de oligonucleotídeos complementares recozidos, em que cada cadeia de oligonucleotídeo contém um ligante de ligação não covalente compatível com um sítio de ligação na molécula de proteção.
[0056] A Figura 16 representa um exemplo não limitante do uso de tags codificados geneticamente para unir uma molécula luminescente e um nucleotídeo em sítios independentes de uma molécula de proteção.
[0057] A Figura 17 representa um exemplo não limitante do uso de grupos reativos nos grupos terminais de uma proteína para ligar uma molécula luminescente e um nucleotídeo em sítios independentes de uma molécula de proteção.
[0058] A Figura 18 representa um exemplo não limitante de uso de aminoácidos não naturais para fixar uma molécula luminescente e um nucleotídeo em sítios independentes de uma molécula de proteção.
[0059] A Figura 19A e Figura 19B representam exemplos não limitantes de uma molécula luminescente e um nucleotídeo separados por uma molécula de proteção não proteica.
[0060] A Figura 20 representa uma modalidade não limitante de uma molécula de proteção composta por um par de ligações proteína- proteína.
[0061] A Figura 21 representa exemplos não limitantes de configurações do ligante.
[0062] A Figura 22 representa um esquema de reação não limitante para a síntese de ligantes de nucleotídeo e estruturas exemplificativas.
[0063] A Figura 23A é uma representação em diagrama em blocos de um aparelho que pode ser usado para análise rápida e móvel de espécimes biológicos e químicos, de acordo com algumas modalidades.
[0064] A Figura 23B é um diagrama em blocos de um dispositivo e um instrumento integrados, de acordo com algumas modalidades.
[0065] A Figura 24A representa uma fileira de pixels de um dispositivo integrado, de acordo com algumas modalidades.
[0066] A Figura 24B representa o acoplamento de energia de excitação a cavidades de amostras em uma fileira de pixels e energia de emissão de cada cavidade de amostra direcionado aos sensores, de acordo com algumas modalidades.
[0067] A Figura 25 representa um dispositivo integrado e uma fonte de excitação, de acordo com algumas modalidades.
[0068] A Figura 26 representa um dispositivo integrado e uma fonte de excitação, de acordo com algumas modalidades.
[0069] A Figura 27A representa uma cavidade de amostra formada em uma região de pixel de um dispositivo integrado, de acordo com uma modalidade.
[0070] A Figura 27B representa energia de excitação incidente sobre uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[0071] A Figura 27C representa uma cavidade de amostra que inclui um divot (cavidade), que aumenta a energia de excitação em uma região de excitação associada à cavidade da amostra em algumas modalidades.
[0072] A Figura 28 representa uma cavidade de amostra e divot, de acordo com algumas modalidades.
[0073] As FIGs. 29A e 29B representam um sensor com agrupamentos de tempo, de acordo com algumas modalidades.
[0074] A Figura 30A representa um sistema exemplificativo para fornecer pulsos de luz, de acordo com algumas modalidades.
[0075] A Figura 30B representa um gráfico da intensidade da luz em função do tempo.
[0076] A Figura 31A representa um esquema para realizer medições, de acordo com algumas modalidades.
[0077] A Figura 31B representa um gráfico de sinal de luz em função do tempo, de acordo com algumas modalidades.
[0078] A Figura 31C representa um perfil de sinal para marcadores através de agrupamentos de tempo, de acordo com algumas modalidades.
[0079] A Figura 32A representa um gráfico de sinal de luz em função do tempo, de acordo com algumas modalidades.
[0080] A Figura 32B representa um perfil de sinal para marcadores através de agrupamentos de tempo, de acordo com algumas modalidades.
[0081] A Figura 33A representa um esquema para realizer medições, de acordo com algumas modalidades.
[0082] A Figura 33B representa um gráfico do tempo de vida em função do comprimento de onda de emissão, de acordo com algumas modalidades.
[0083] A Figura 34A representa um gráfico de sinal de luz em função do comprimento de onda, de acordo com algumas modalidades.
[0084] A Figura 34B representa um gráfico de sinal de luz em função do tempo, de acordo com algumas modalidades.
[0085] A Figura 35A representa um perfil de sinal para marcadores através de agrupamentos de tempo para múltiplos sensores, de acordo com algumas modalidades.
[0086] A Figura 35B representa um gráfico de sinal de luz em função do tempo, de acordo com algumas modalidades.
[0087] A Figura 35C representa um perfil de sinal para um marcador através de agrupamentos de tempo para múltiplos sensores, de acordo com algumas modalidades.
[0088] A Figura 36A representa um esquema para realizer medições, de acordo com algumas modalidades.
[0089] A Figura 36B representa um gráfico de sinal de luz em função do comprimento de onda, de acordo com algumas modalidades.
[0090] A Figura 37A representa um gráfico de sinal de luz em função do tempo, de acordo com algumas modalidades.
[0091] A Figura 37B representa um perfil de sinal para um marcador através de agrupamentos de tempo para múltiplos sensores, de acordo com algumas modalidades.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0092] Os inventores desenvolveram novos métodos, composições e dispositivos para identificar moléculas únicas com base em uma ou mais propriedades luminescentes dessas moléculas. Em algumas modalidades, uma molécula é identificada com base em seu tempo de vida luminescente, espectros de absorção, espectros de emissão, rendimento quântico luminescente, intensidade luminescente ou uma combinação de dois ou mais desses. Identificar pode significar atribuir a identidade molecular exata de uma molécula ou pode significar distinguir ou diferenciar a molécula particular de um conjunto de moléculas possíveis. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas únicas pode ser distinguida uma da outra com base em diferentes tempos de vida luminescentes, espectros de absorção, espectros de emissão, rendimentos quânticos luminescentes, intensidades luminescentes ou combinações de dois ou mais desses. Em algumas modalidades, uma única molécula é identificada (por exemplo, distinta de outras moléculas), expondo a molécula a uma série de pulsos de luz separados e avaliando o tempo ou outras propriedades de cada fóton que é emitido a partir da molécula. Em algumas modalidades, a informação para uma pluralidade de fótons emitidos sequencialmente a partir de uma única molécula é agregada e avaliada para identificar a molécula. Em algumas modalidades, um tempo de vida luminescente de uma molécula é determinado a partir de uma pluralidade de fótons que são emitidos sequencialmente a partir da molécula, e o tempo de vida útil luminescente pode ser usado para identificar a molécula. Em algumas modalidades, a intensidade luminescente de uma molécula é determinada a partir de uma pluralidade de fótons que são emitidos sequencialmente a partir da molécula, e a intensidade luminescente pode ser usada para identificar a molécula. Em algumas modalidades, um tempo de vida e intensidade luminescentes de uma molécula são determinados a partir de uma pluralidade de fótons que são emitidos sequencialmente a partir da molécula, e o tempo de vida e a intensidade luminescentes podem ser usados para identificar a molécula.
[0093] Aspectos da do presente pedido são úteis para detector e/ou identificar uma ou mais moléculas biológicas ou químicas. Em algumas modalidades, as reações químicas ou biológicas podem ser avaliadas determinando a presença ou ausência de um ou mais reagentes ou produtos em um ou mais pontos de tempo.
[0094] Aspectos do presente pedido interrogam uma molécula expondo a molécula à luz e determinando uma ou mais propriedades de um ou mais fótons emitidos a partir da molécula. Em certas modalidades, a molécula é interrogada expondo a molécula a um pulso de luz e determinando uma ou mais propriedades de um fóton emitido a partir da molécula. Em algumas modalidades, a molécula é exposta a uma pluralidade de eventos de pulso de luz separados e uma ou mais propriedades de fótons separados emitidos após serem determinados eventos de pulso de luz separados. Em algumas modalidades, a molécula não emite um fóton em resposta a cada pulso de luz. No entanto, uma pluralidade de fótons emitidos pode ser avaliada expondo a molécula a uma série de eventos de pulsos de luz separados e avaliando fótons separados que são emitidos após um subconjunto dos eventos de pulso de luz (por exemplo, fótons emitidos após cerca de 10% dos eventos de pulso ou fótons emitidos após cerca de 1% dos eventos de pulso).
[0095] Aspectos do presente pedido são úteis para monitorar uma reação química ou biológica determinando a presença ou ausência de um ou mais reagentes, intermediários e/ou produtos da reação em um ou mais pontos de tempo. Em algumas modalidades, a progressão de uma reação ao longo do tempo pode ser analisada expondo uma amostra de reação a uma série de pulsos de luz separados e analisando qualquer fóton emitido que seja detectado após cada pulso de luz.
[0096] Consequentemente, em alguns aspectos do pedido, uma amostra da reação é exposta a uma pluralidade de pulsos de luz separados e uma série de fótons emitidos é detectada e analisada. Em algumas modalidades, a série de fótons emitidos fornece informações sobre uma única molécula que está presente e que não muda na amostra de reação ao longo do tempo da experiência. No entanto, em algumas modalidades, a série de fótons emitidos fornece informações sobre uma série de moléculas diferentes que estão presentes em diferentes tempos na amostra de reação (por exemplo, à medida que uma reação ou processo avança).
[0097] Em algumas modalidades, aspectos do presente pedido podem ser utilizados para ensaiar amostras biológicas, por exemplo, para determinar a sequência de um ou mais ácidos nucleicos ou polipeptídeos na amostra e/ou para determinar a presença ou ausência de um ou mais ácidos nucleicos ou variantes polipeptídicas (por exemplo, uma ou mais mutações em um gene de interesse) na amostra. Em algumas modalidades, testes podem ser realizados em amostras de pacientes (por exemplo, amostras de pacientes humanos) para fornecer informação de sequência de ácido nucleico ou para determinar a presença ou ausência de um ou mais ácidos nucleicos de interesse para fins de diagnóstico, prognóstico e/ou terapêuticos. Em alguns exemplos, testes de diagnóstico podem incluir o sequenciamento de uma molécula de ácido nucleico em uma amostra biológica de um indivíduo, por exemplo, sequenciamento de moléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA) livres de células e/ou produtos de expressão (por exemplo, ácido ribonucleico (RNA)) em uma amostra biológica do indivíduo.
[0098] Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas que estão sendo analisadas (por exemplo, interrogadas e/ou identificadas) usando tempo de vida e/ou intensidade luminescentes podem ser moléculas marcadas (por exemplo, moléculas que foram marcadas com um ou mais marcadores luminescentes). Em algumas modalidades, subunidades individuais de biomoléculas podem ser identificadas usando marcadores. Em alguns exemplos, marcadores luminescentes são usados para identificar subunidades individuais de biomoléculas. Algumas modalidades utilizam marcadores luminescentes (também aqui ditos como "marcadores"), que podem ser marcadores exógenos ou endógenos. Os marcadores exógenos podem ser marcadores luminescentes externos usados como repórter e/ou tagpara marcação luminescente. Exemplos de marcadores exógenos podem incluir, mas não estão limitados a, moléculas fluorescentes, fluoróforos, corantes fluorescentes, manchas fluorescentes, corantes orgânicos, proteínas fluorescentes, espécies que participam da transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), enzimas e/ou pontos quânticos. Outros marcadores exógenos são conhecidos na técnica. Tais marcadores exógenos podem ser conjugados a uma sonda ou grupo funcional (por exemplo, molécula, íon e/ou ligante) que se liga especificamente a um alvo ou componente particular. Ligar um tag ou repórter exógeno a uma sonda permite a identificação do alvo através da detecção da presença do tag ou repórter exógeno Exemplos de sondas podem incluir proteínas, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA), lipídios e sondas de anticorpos. A combinação de um marcador exógeno e um grupo funcional pode formar quaisquer sondas, tags e/ou labels adequados para detecção, incluindo sondas moleculares, sondas marcadas, sondas de hibridação, sondas de anticorpos, sondas de proteínas (por exemplo, sondas de ligação à biotina), labels enzimáticos, sondas fluorescentes, tags fluorescentes e/ou enzimas repórteres.
[0099] Embora a presente invenção faça referência a marcadores luminescentes, outros tipos de marcadores podem ser usados com dispositivos, sistemas e métodos aqui fornecidos. Tais marcadores podem ser tags de massa, tags eletrostáticos, labels eletroquímicos ou qualquer combinação destes.
[00100] Enquanto os marcadores exógenos podem ser adicionados a uma amostra, os marcadores endógenos podem já ser parte da amostra. Os marcadores endógenos podem incluir qualquer marcador luminescente presente que possa luminescer ou "autofluorescer" na presença de energia de excitação. A autofluorescência de fluoróforos endógenos pode fornecer marcação isenta de marcadores e não invasiva, sem requerer a introdução de fluoróforos exógenos. Exemplos de tais fluoróforos endógenos podem incluir ligações cruzadas de hemoglobina, oxiemoglobina, lipídios, colágeno e elastina, dinucleotídeo de nicotinamida adenina reduzido (NADH), flavinas oxidadas (FAD e FMN), lipofuscina, queratina e/ou porfirinas, a título de exemplo e não limitação.
[00101] Tendo reconhecido a necessidade de aparelhos simples e menos complexos para realizar a detecção de moléculas únicas e/ou sequenciamento de ácido nucleico, os inventores conceberam técnicas para a detecção de moléculas únicas usando conjuntos de tags luminescentes (por exemplo, marcadores luminescentes, labels luminescentes) para marcar moléculas diferentes. Essas moléculas únicas podem ser nucleotídeos ou aminoácidos tendo tags. Os tags podem ser detectados enquanto ligados a moléculas únicas, depois de liberados das moléculas únicas, ou enquanto ligados e depois de liberados das moléculas únicas. Em alguns exemplos, os tags são tags luminescentes. Cada tag luminescente em um conjunto selecionado está associado a uma respectiva molécula. Por exemplo, um conjunto de quatro tags pode ser usado para "marcar" as nucleobases presentes no DNA - cada tag do conjunto sendo associado a uma nucleobase diferente, por exemplo, um primeiro tagr sendo associado à adenina (A), um segundo tag sendo associado à citosina (C), um terceiro tag sendo associado à guanina (G) e um quarto tag sendo associado à timina (T). Além disso, cada um dos tags luminescentes no conjunto de tags tem propriedades diferentes que podem ser usadas para distinguir um primeiro tag do conjunto dos outros tags no conjunto. Desta forma, cada tags é identificável de forma exclusiva usando uma ou mais dessas características distintivas. A título de exemplo e não de limitação, as características dos tags que podem ser utilizadas para distinguir um tag de outro podem incluir a energia de emissão e/ou o comprimento de onda da luz que é emitida pelo tag em resposta à energia de excitação, o comprimento de onda da luz de excitação que é absorvida por um tag particular para colocar o tag em estado excitado e/ou o tempo de vida de emissão do tag.
Sequenciamento
[00102] Alguns aspectos do pedido são úteis para sequenciar polímeros biológicos, tais como ácidos nucleicos e proteínas. Em algumas modalidades, os métodos, composições e dispositivos descritos no pedido de patente podem ser utilizados para identificar uma série de monômeros de nucleotídeos ou aminoácidos que são incorporados em um ácido nucleico ou proteína (por exemplo, detectando um período de tempo de incorporação de uma série de monômeros de nucleotídeos ou aminoácidos marcados). Em algumas modalidades, os métodos, composições e dispositivos descritos no pedido de patente podem ser utilizados para identificar uma série de nucleotídeos que são incorporados em um produto de reação de sequenciamento de ácido nucleico dependente do modelo, sintetizado por uma enzima polimerase.
[00103] Em certas modalidades, o produto de sequenciamento de ácido nucleico dependente do modelo é realizado por polimerases de ácido nucleico que ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, a polimerase é uma variante mutante ou modificada de uma polimerase de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o produto de sequência de ácido nucleico dependente do modelo compreenderá um ou mais segmentos de nucleotídeos complementares ao filamento de ácido nucleico modelo. Em um aspecto, o pedido de patente provê um método para determinar a sequência de uma cadeia de um ácido nucleico modelo (ou alvo) determinando a sequência de seu filamento de ácido nucleico complementar.
[00104] Em outro aspecto, o pedido de patente provê métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos alvo, através de sequenciamento de uma pluralidade de fragmentos de ácido nucleico, em que o ácido nucleico alvo compreende os fragmentos. Em certas modalidades, o método compreende a combinação de uma pluralidade de sequências de fragmentos para prover uma sequência ou sequência parcial para o ácido nucleico alvo original. Em algumas modalidades, a etapa de combinação é realizada por hardware e software. Os métodos aqui descritos podem permitir um conjunto de ácidos nucleicos alvo relacionados, tal como um cromossomo ou genoma inteiro a ser sequenciado.
[00105] Durante o sequenciamento, uma enzima de polimerização pode acoplar-se (por exemplo, ligar-se) a um local de iniciação de uma molécula de ácido nucleico alvo. O local de iniciação pode ser um iniciador que é complementar a uma parte da molécula de ácido nucleico alvo. Como alternativa, o local de iniciação é um intervalo ou ruptura que é fornecido dentro de um segmento de filamento duplo da molécula de ácido nucleico alvo. Um intervalo ou ruptura pode ser de 0 a pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 ou 40 nucleotídeos de comprimento. Uma ruptura pode prover uma quebra em um filamento de uma sequência de duplo filamento, que pode prover um local de iniciação para uma enzima de polimerização, tal como, por exemplo, uma enzima de polimerase de deslocamento de filamento.
[00106] Em alguns casos, um iniciador de sequenciamento pode ser anelado para uma molécula alvo de ácido nucleico que pode ou não ser imobilizada em um apoio sólido. Um apoio sólido pode compreender, por exemplo, uma cavidade de amostra (por exemplo, uma nanoabertura, uma câmara de reação) em um chip utilizado para o sequenciamento de ácido nucleico. Em algumas modalidades, um iniciador de sequenciamento pode ser imobilizado em um apoio sólido e a hibridação da molécula de ácido nucleico alvo também imobiliza a molécula de ácido nucleico alvo para o apoio sólido. Em algumas modalidades, uma polimerase é imobilizada em um apoio sólido e iniciador solúvel e ácido nucleico alvo são colocados em contato com a polimerase. Contudo, em algumas modalidades, um complexo que compreende uma polimerase, um ácido nucleico alvo e um iniciador é formado em solução e o complexo é imobilizado em um apoio sólido (por exemplo, por imobilização da polimerase, iniciador e/ou ácido nucleico alvo). Em algumas modalidades, nenhum dos componentes em uma cavidade de amostra (por exemplo, uma nanoabertura, uma câmara de reação) é imobilizado em um apoio sólido. Por exemplo, em algumas modalidades, um complexo compreendendo uma polimerase, um ácido nucleico alvo e um iniciador é formado em solução e o complexo não é imobilizado em um apoio sólido.
[00107] Em condições apropriadas, uma enzima polimerase que é colocada em contato com um iniciador anelado/ácido nucleico alvo pode adicionar ou incorporar um ou mais nucleotídeos ao iniciador, e os nucleotídeos podem ser adicionados ao iniciador em um 5' a 3', de uma forma dependente do modelo. Essa incorporação de nucleotídeos em um iniciador (por exemplo, através da ação de uma polimerase) pode geralmente ser referida como uma reação de extensão de iniciador. Cada nucleotídeo pode ser associado a um tag detectável que pode ser detectado e identificado (por exemplo, com base em seu tempo de vida luminescente e/ou outras características) durante a reação de extensão de ácido nucleico e usado para determinar cada nucleotídeo incorporado ao iniciador prolongado e, assim, uma sequência da molécula de ácido nucleico recém-sintetizada. Através da complementaridade da sequência da molécula de ácido nucleico recém-sintetizada, a sequência da molécula de ácido nucleico alvo também pode ser determinada. Em alguns casos, o anelamento de um iniciador de sequenciamento para uma molécula de ácido nucleico alvo e a incorporação de nucleotídeos ao iniciador de sequenciamento podem ocorrer em condições de reação semelhantes (por exemplo, a mesma temperatura de reação ou diferente) ou em diferentes condições de reação (por exemplo, diferentes temperaturas de reação). Em algumas modalidades, o sequenciamento através de métodos de síntese pode incluir a presença de uma população de moléculas de ácido nucleico alvo (por exemplo, cópias de um ácido nucleico alvo) e/ou uma etapa de amplificação do ácido nucleico alvo para alcançar uma população de ácidos nucleicos alvo. No entanto, em algumas modalidades, o sequenciamento por síntese é usado para determinar a sequência de uma única molécula em cada reação que está sendo avaliada (e a amplificação de ácido nucleico não é necessária para preparar o modelo alvo para sequenciamento). Em algumas modalidades, uma pluralidade de reações de sequenciamento de moléculas únicas é realizada em paralelo (por exemplo, em um único chip), de acordo com os aspectos da presente pedido de patente. Por exemplo, em algumas modalidades, uma pluralidade de reações de sequenciamento de moléculas únicas é realizada em câmaras de reação separadas (por exemplo, nanoaberturas, cavidades de amostra) em um único chip.
[00108] As modalidades são capazes de sequenciar moléculas de ácido nucleico únicas com alta precisão e longos comprimentos de leitura, tal como uma precisão de pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99%, 99,999% ou 99,9999% e/ou comprimentos de leitura maiores ou iguais a cerca de 10 pares de bases (pb), 50 pb, 100 pb, 200 pb 300 pb, 400 pb, 500 pb, 1000 pb, 10.000 pb, 20.000 pb, 30.000 pb, 40.000 pb, 50.000 pb ou 100.000 pb. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico alvo utilizada no sequenciamento de molécula única é um ácido nucleico alvo com um filamento único (por exemplo, ácido desoxirribonucleico (DNA), derivados de DNA, ácido ribonucleico (RNA), derivados de RNA) que é adicionado ou imobilizado em uma cavidade de amostra (por exemplo, nanoabertura) contendo pelo menos um componente adicional de uma reação de sequenciamento (por exemplo, uma polimerase tal como uma polimerase de DNA, um iniciador de sequenciamento) imobilizado ou ligado a um apoio sólido, tal como as paredes de fundo ou laterais da cavidade de amostra. A molécula de ácido nucleico alvo ou a polimerase pode ser ligada a uma parede de amostra, tal como nas paredes de fundo ou laterais da cavidade de amostra diretamente ou através de um ligante. A cavidade de amostra (por exemplo, nanoabertura) também pode conter quaisquer outros reagentes necessários para a síntese de ácido nucleico através de uma reação de extensão de iniciador, como, por exemplo, tampões adequados, cofatores, enzimas (por exemplo, uma polimerase) e polifosfatos de desoxirribonucleosídeo, tais como, por exemplo, trifosfatos de desoxirribonucleosídeo, incluindo trifosfato de desoxiadenosina (dATP), desoxicitidina trifosfato (dCTP), desoxiguanosina trifosfato (dGTP), trifosfato de desoxiuridina (dUTP) e trifosfato de desoxitimidina (dTTP) dNTPs, que incluem tags luminescentes, tais como fluoróforos. Em algumas modalidades, cada classe de dNTPs (por exemplo, dNTPs contendo adenina (por exemplo, dATP), dNTPs contendo citosina (por exemplo, dCTP), dNTPs contendo guanina (por exemplo, dGTP), dNTPs contendo uracila (por exemplo, dUTPs) e dNTPs contendo timina (por exemplo, dTTP)) é conjugada a um tag luminescente distinto, de tal modo que a detecção de luz emitida a partir do tag indica a identidade do dNTP que foi incorporado ao ácido nucleico recém-sintetizado. A luz emitida do tag luminescente pode ser detectada e atribuída a seu tags luminescente apropriado (e, portanto, dNTP associado) através de qualquer dispositivo e/ou método apropriado, incluindo tais dispositivos e métodos para detecção descritos em outro lugar aqui. O tag luminescente pode ser conjugado ao dNTP em qualquer posição, de modo que a presença do tag luminescente não inibe a incorporação do dNTP ao filamento de ácido nucleico recém-sintetizado ou a atividade da polimerase. Em algumas modalidades, o tag luminescente é conjugado ao fosfato terminal (por exemplo, o fosfato gama) do dNTP.
[00109] Em algumas modalidades, o modelo de ácido nucleico alvo de filamento único pode ser colocado em contato com um iniciador de sequenciamento, dNTPs, polimerase e outros reagentes necessários para a síntese de ácido nucleico. Em algumas modalidades, todos os dNTP adequados podem ser colocados em contato simultaneamente com o modelo de ácido nucleico alvo de filamento único (por exemplo, todos os dNTPs estão simultaneamente presentes), de modo que a incorporação de dNTP pode ocorrer continuamente. Em outras modalidades, os dNTP podem ser colocados em contato com o modelo de ácido nucleico alvo de filamento único sequencialmente, onde o modelo de ácido nucleico alvo de filamento único é colocado em contato com cada dNTP apropriado separadamente, com etapas de lavagem entre o contato do modelo de ácido nucleico alvo de filamento único com diferentes dNTPs. Um ciclo semelhante de contato do modelo de ácido nucleico alvo de filamento único com cada dNTP separadamente, seguido por lavagem, pode ser repetido para cada posição de base sucessiva do modelo de ácido nucleico alvo de filamento único a ser identificado.
[00110] Em algumas modalidades, o iniciador de sequenciamento anela o modelo de ácido nucleico alvo de filamento único, e a polimerase incorpora consecutivamente os dNTP (ou outro polifosfato de desoxirribonucleosídeo) ao iniciador com base no modelo de ácido nucleico alvo de filamento único. O tag luminescente único associado a cada dNTP incorporado pode ser excitado com a luz de excitação apropriada durante ou após a incorporação do dNTP ao iniciador, e sua emissão pode ser posteriormente detectada usando qualquer dispositivo(s) apropriado(s) e/ou método(s), incluindo dispositivos e métodos de detecção descritos aqui. A detecção de uma determinada emissão de luz (por exemplo, com um tempo de vida, intensidade, espectro específicos e/ou combinação destes) pode ser atribuída a um dNTP particular incorporado. A sequência obtida a partir da coleta de tags luminescentes detectados pode então ser utilizada para determinar a sequência do modelo de ácido nucleico alvo de filamento único através da complementaridade da sequência.
[00111] Embora a presente descrição faça referência a dNTPs, os dispositivos, sistemas e métodos aqui providos podem ser utilizados com vários tipos de nucleotídeos, tais como ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos (por exemplo, polifosfatos de desoxirribonucleosídeo com pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 grupos fosfato). Tais ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos podem incluir vários tipos de tags (ou marcadores) e ligantes.
Exemplo do Sequenciamento de Ácidos Nucleicos
[00112] O exemplo a seguir pretende ilustrar alguns dos métodos, composições e dispositivos aqui descritos. Todos os aspectos do exemplo não são limitantes. A Figura 1 ilustra esquematicamente a configuração de um método de sequenciamento de ácido nucleico de molécula única. 1-110 é uma cavidade de amostra (por exemplo, nanoabertura, câmara de reação) configurada para conter um único complexo compreendendo uma polimerase de ácido nucleico 1-101, um ácido nucleico alvo 1-102 a ser sequenciado e um iniciador 1-104. Neste exemplo, uma região inferior da cavidade de amostra 1-110 é representada como um volume alvo (por exemplo, a região de excitação) 1-120.
[00113] Conforme descrito neste relatório descritivo, o volume alvo é um volume para o qual a energia de excitação é direcionada. Em algumas modalidades, o volume é uma propriedade tanto do volume da cavidade de amostra quanto do acoplamento da energia de excitação à cavidade de amostra. O volume alvo pode ser configurado para limitar o número de moléculas ou complexos confinados no volume alvo. Em algumas modalidades, o volume alvo é configurado para confinar uma única molécula ou complexo. Em algumas modalidades, o volume alvo é configurado para confinar um único complexo de polimerase. Na Figura 1, o complexo que compreende a polimerase 1-101 é confinado no volume alvo 1-120. O complexo pode opcionalmente ser imobilizado por ligação a uma superfície da cavidade de amostra. Processos exemplificativos para preparação e funcionalização da superfície da cavidade de amostra são representados nas FIGs. 7-9, discutidas em detalhes adicionais neste relatório. Neste exemplo, o complexo é imobilizado por um ligante 1103 compreendendo uma ou mais biomoléculas (por exemplo, biotina) adequadas para ligar o ligante à polimerase 1-101.
[00114] O volume da abertura também contém uma mistura de reação com solvente, tampões e outros aditivos adequados necessários para o complexo de polimerase sintetizar um filamento de ácido nucleico. A mistura de reação também contém uma pluralidade de tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados. Cada tipo de nucleotídeo é representado pelos símbolos *-A, @-T, $-G, #-C, em que A, T, G e C representam a base nucleotídica e os símbolos *, @, $ e # representam um marcador luminescente único associado a cada nucleotídeo, através do ligante -. Na Figura 1, um nucleotídeo #-C está sendo incorporado atualmente ao filamento complementar 1-102. O nucleotídeo incorporado está dentro do volume alvo 1-120.
[00115] A Figura 1 também indica com setas o conceito de uma energia de excitação sendo administrada a uma vizinhança do volume alvo, e uma luminescência sendo emitida em direção a um detector. As setas são esquemáticas e não se destinam a indicar a orientação particular de administração da energia de excitação ou luminescência. Em algumas modalidades, a energia de excitação é um pulso de luz de uma fonte de luz. A energia de excitação pode percorrer através de um ou mais componentes do dispositivo, como guias de onda ou filtros, entre a fonte de luz e a vizinhança do volume alvo. A energia de emissão também pode percorrer um ou mais componentes do dispositivo, tais como guias de onda ou filtros, entre a molécula luminescente e o detector. Algumas luminescências podem ser emitidas em um vetor que não é direcionado ao detector (por exemplo, em direção à parede lateral da cavidade de amostra) e podem não ser detectadas.
[00116] A Figura 2 ilustra esquematicamente um processo de sequenciamento em uma única cavidade de amostra (por exemplo, uma nanoabertura) ao longo do tempo. Os estágios A a D representam uma cavidade de amostra com um complexo de polimerase como na Figura 1. O estágio A mostra o estado inicial antes de qualquer nucleotídeo ter sido adicionado ao iniciador. O estágio B mostra o evento de incorporação de um nucleotídeo marcado luminescentemente (#-C). O estágio C mostra o período entre os eventos de incorporação. Neste exemplo, o nucleotídeo C foi adicionado ao iniciador, e o marcador e o ligante anteriormente acoplados ao nucleotídeo luminescentemente marcado (#-C) foram clivados. O estágio D retrata um segundo evento de incorporação de um nucleotídeo luminescentemente marcado (*-A). O filamento complementar após o estágio D consiste no iniciador, um nucleotídeo C e um nucleotídeo A.
[00117] Os estágios A e C representam os períodos anterior ou entre os eventos de incorporação, que são indicados neste exemplo com duração de cerca de 10 milissegundos. Nos estágios A e C, porque não há nenhum nucleotídeo sendo incorporado, não há nucleotídeo marcado luminescentemente no volume alvo (não desenhado na Figura 2), embora possa ser detectada a luminescência de fundo ou luminescência espúria do nucleotídeo marcado luminescentemente que não está sendo incorporado. Os estágios B e D mostram eventos de incorporação de diferentes nucleotídeos (# -C e *-A, respectivamente). Neste exemplo, esses eventos também são indicados com duração de cerca de 10 milissegundos.
[00118] A linha identificada "Dados brutos de agrupamento" mostra os dados gerados durante cada estágio. Ao longo da experiência exemplificativa, uma pluralidade de pulsos de luz é administrada à vizinhança do volume alvo. Para cada pulso, um detector é configurado para registrar qualquer fóton emitido recebido pelo detector. Quando um fóton emitido é recebido pelo detector, ele é separado em uma de uma pluralidade de agrupamentos de tempo, dos quais existem 3 neste exemplo. Em algumas modalidades, o detector é configurado com entre 2 e 16 agrupamentos de tempo. Os "dados brutos de agrupamento" registram um valor de 1 (barras mais curtas), 2 (barras médias) ou 3 (barras mais longas), correspondentes aos agrupamentos mais curtos, médios e mais longos, respectivamente. Cada barra indica a detecção de um fóton emitido.
[00119] Uma vez que não existe um nucleotídeo luminescentemente marcado no volume alvo para o Estágio A ou C, não há fótons detectados. Para cada um dos Estágios B e D, uma pluralidade de eventos de emissão de fótons (eventos luminescentes ou "luminescências", tal como aqui utilizado) é detectada durante o evento de incorporação. O marcador luminescente # possui um tempo de vida luminescente mais curto do que o marcador luminescente*. Os dados do Estágio B são, assim, descritos como tendo valores de agrupamento médios mais baixos do que o Estágio D, onde os valores do agrupamento são mais altos.
[00120] A linha identificada "Dados Processados" ilustra dados brutos que foram processados para indicar o número (contagens) de fótons emitidos em tempo relativos a cada pulso. Uma vez que cada barra corresponde à contagem de fótons de um agrupamento de tempo particular, as curvas exemplificativas que representam os dados processados correspondem a dados brutos de agrupamento compreendendo mais agrupamentos de tempo do que os três agrupamentos de tempo descritos na figura. Neste exemplo, os dados são processados apenas para determinar o tempo de vida luminescente, mas os dados também podem ser avaliados quanto a outras propriedades luminescentes, como a intensidade luminescente ou o comprimento de onda dos fótons absorvidos ou emitidos. Os dados processados exemplificativos se aproximam de uma curva de declínio exponencial característica para o tempo de vida luminescente do marcador luminescente no volume alvo. Como o marcador luminescente # tem um tempo de vida luminescente mais curto do que o marcador luminescente *, os dados processados para o Estágio B têm menos contagens em durações de tempo mais longas, enquanto os dados processados para o Estágio D têm relativamente mais contagens em durações de tempo mais longas.
[00121] A experiência exemplificativa da Figura 2 identificaria os dois primeiros nucleotídeos adicionados ao filamento complementar como CA. Para o DNA, a sequência do filamento alvo imediatamente após a região recozida ao iniciador seria então identificada como GT. Neste exemplo, os nucleotídeos C e A podem ser distinguidos entre a pluralidade de C, G, T e A, com base apenas na vida útil luminescente. Em algumas modalidades, outras propriedades, tal como a intensidade luminescente ou o comprimento de onda dos fótons absorvidos ou emitidos, podem ser necessárias para distinguir um ou mais nucleotídeos particulares.
[00122] Os sinais emitidos após a incorporação de nucleotídeos podem ser armazenados na memória e processados em um tempo posterior para determinar a sequência do modelo de ácido nucleico alvo. Isso pode incluir a comparação dos sinais aos sinais de referência para determinar as identidades dos nucleotídeos incorporados em função do tempo. Alternativamente ou em adição, o sinal emitido após a incorporação de nucleotídeo pode ser recolhido e processado em tempo real (por exemplo, após a incorporação de nucleotídeos) para determinar a sequência do modelo de ácido nucleico alvo em tempo real.
[00123] O termo "ácido nucleico", tal como aqui utilizado, refere-se em geral a uma molécula compreendendo uma ou mais subunidades de ácido nucleico. Um ácido nucleico pode incluir uma ou mais subunidades selecionadas dentre adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) e uracila (U), ou suas variantes. Em alguns exemplos, um ácido nucleico é ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), ou seus derivados. Um ácido nucleico pode ser de filamento único ou de filamento duplo. Um ácido nucleico pode ser circular.
[00124] O termo "nucleotídeo", tal como aqui utilizado, refere-se em geral a uma subunidade de ácido nucleico, que pode incluir A, C, G, T ou U, ou variantes ou análogos destes. Um nucleotídeo pode incluir qualquer subunidade que possa ser incorporada em um filamento de ácido nucleico em formação. Essa subunidade pode ser uma A, C, G, T ou U, ou qualquer outra subunidade específica para uma ou mais A, C, G, T ou U complementares, ou complementares a uma purina (por exemplo, A ou G, ou suas variante ou análogos) ou uma pirimidina (por exemplo, C, T ou U, ou suas variante ou análogos). Uma subunidade pode permitir a resolução de bases ou grupos de bases de ácidos nucleicos individuais (por exemplo, AA, TA, AT, GC, CG, CT, TC, GT, TG, AC, CA ou suas contrapartes da uracila).
[00125] Um nucleotídeo geralmente inclui um nucleosídeo e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais grupos fosfato (PO3). Um nucleotídeo pode incluir uma nucleobase, um açúcar de cinco carbonos (ou ribose ou desoxirribose) e um ou mais grupos fosfato. Os ribonucleotídeos são nucleotídeos em que o açúcar é a ribose. Os desoxirribonucleotídeos são nucleotídeos em que o açúcar é a desoxirribose. Um nucleotídeo pode ser um nucleosídeo monofosfato ou um polifosfato de nucleosídeo. Um nucleotídeo pode ser um polifosfato de desoxirribonucleosídeo, tal como, por exemplo, um trifosfato de desoxirribonucleotídeo, que pode ser selecionado a partir de trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), trifosfato de desoxiuridina (dUTP) e trifosfato de desoxitimidina (dTTP) dNTPs, que incluem tags detectáveis, tais como tags ou tags luminescentes (por exemplo, fluoróforos).
[00126] Um polifosfato de nucleosídeo pode ter ‘n' grupos fosfato, em que 'n' é um número maior ou igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Exemplos de polifosfatos de nucleosídeo incluem difosfato de nucleosídeo e trifosfato de nucleosídeo. Um nucleotídeo pode ser um nucleosídeo marcado com fosfato terminal, tal como um nucleosídeo fosfato marcado com fosfato terminal. Esse marcador pode ser um marcador luminescente (por exemplo, fluorescente ou quimioluminescente), um marcador fluorgênico, um marcador colorido, um marcador cromogênico, um tag de massa, um marcador eletrostático ou um marcador eletroquímico. Um label (ou marcador) pode ser acoplado a um fosfato terminal através de um ligante. O ligante pode incluir, por exemplo, pelo menos um ou vários grupos hidroxila, grupos sulfidrila, grupos amino ou haloalquila, que podem ser adequados para formar, por exemplo, uma ligação fosfato éster, um tioéster, um fosforamidato ou um alquil fosfonato no fosfato terminal de um nucleotídeo natural ou modificado. Um ligante pode ser clivável de modo a separar um marcador do fosfato terminal, tal como com a ajuda de uma enzima de polimerização. Exemplos de nucleotídeos e ligantes são fornecidos na Patente U.S N°. 7.041.812, que é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
[00127] Um nucleotídeo (por exemplo, um polifosfato de nucleotídeo) pode compreender uma nucleobase metilada. Por exemplo, um nucleotídeo metilado pode ser um nucleotídeo que compreende um ou mais grupos metila ligados à nucleobase (por exemplo, ligados diretamente a um anel da nucleobase, ligados a um substituinte de um anel da nucleobase). As nucleobases metiladas exemplares incluem 1-metiltimina, 1-metiluracila, 3-metiluracila, 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, 1-metiladenina, 2-metiladenina, 7- metiladenina, N6-metiladenina, N6,N6-dimetiladenina, 1-metilguanina, 7-metilguanina, N2-metilguanina e N2,N2-dimetilguanina.
[00128] O termo "iniciador", tal como aqui utilizado, refere-se em geral a uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um oligonucleotídeo), que pode incluir uma sequência compreendendo A, C, G, T e/ou U ou suas variantes ou análogos. Um iniciador pode ser um oligonucleotídeo sintético que compreende ADN, RNA, PNA ou suas variantes ou análogos. Um iniciador pode ser concebido de tal modo que a sua sequência de nucleotídeos seja complementar a um filamento alvo ou o iniciador pode compreender uma sequência de nucleotídeos aleatória. Em algumas modalidades, um iniciador pode compreender uma cauda (por exemplo, uma cauda poli-A, um adaptador de índice, um código de barras molecular, etc.). Em algumas modalidades, um iniciador pode compreender 5 a 15 bases, 10 a 20 bases, 15 a 25 bases, 20 a 30 bases, 25 a 35 bases, 30 a 40 bases, 35 a 45 bases, 40 a 50 bases, 45 a 55 bases, 50 a 60 bases, 55 a 65 bases, 60 a 70 bases, 65 a 75 bases, 70 a 80 bases, 75 a 85 bases, 80 a 90 bases, 85 a 95 bases, 90 a 100 bases, 95 a 105 bases, 100 a 150 bases, 125 a 175 bases, 150 a 200 bases, ou mais de 200 bases.
Propriedades Luminescentes
[00129] Conforme aqui descrito, uma molécula luminescente é uma molécula que absorve um ou mais fótons e subsequentemente emite um ou mais fótons após uma ou mais durações de tempo. A luminescência da molécula é descrita por vários parâmetros, incluindo, mas não limitado a, tempo de vida, espectros de absorção, espectros de emissão, rendimento quântico luminescente e intensidade luminescente. Os termos absorção e excitação são utilizados de forma intercomutável ao longo do pedido de patente. Uma molécula luminescente típica pode absorver, ou sofrer excitação por, luz em vários comprimentos de onda. A excitação em determinados comprimentos de onda ou dentro de certas faixas espectrais pode diminuir em um evento de emissão luminescente, enquanto a excitação em certos outros comprimentos de onda ou faixas espectrais pode não diminuir em um evento de emissão luminescente. Em algumas modalidades, uma molécula luminescente só é devidamente excitada para luminescência em um único comprimento de onda ou dentro de uma única faixa espectral. Em algumas modalidades, uma molécula luminescente é convenientemente excitada para luminescência em dois ou mais comprimentos de onda ou dentro de duas ou mais faixas espectrais. Em algumas modalidades, uma molécula é identificada medindo o comprimento de onda do fóton de excitação ou o espectro de absorção.
[00130] O fóton emitido a partir de um evento de emissão luminescente irá emitir em um comprimento de onda dentro de uma faixa espectral de possíveis comprimentos de onda. Normalmente, o fóton emitido tem um comprimento de onda maior (por exemplo, tem menos energia ou é alterado para vermelho) em comparação ao comprimento de onda do fóton de excitação. Em certas modalidades, uma molécula é identificada medindo o comprimento de onda de um fóton emitido. Em certas modalidades, uma molécula é identificada medindo o comprimento de onda de uma pluralidade de fótons emitidos. Em certas modalidades, uma molécula é identificada medindo o espectro de emissão.
[00131] O tempo de vida luminescente refere-se à duração do tempo entre um evento de excitação e um evento de emissão. Em algumas modalidades, o tempo de vida luminescente é expresso como a constante em uma equação de declínio exponencial. Em algumas modalidades, em que há um ou mais eventos de pulso administrando energia de excitação, a duração de tempo é o tempo entre o pulso e o evento de emissão subsequente.
[00132] A "determinação de um tempo de vida luminescente" de uma molécula pode ser realizada usando qualquer método adequado (por exemplo, medindo o tempo de vida usando uma técnica adequada ou determinando características de emissão dependentes do tempo). Em algumas modalidades, a determinação do tempo de vida luminescente de uma molécula compreende a determinação do tempo de vida em relação a uma ou mais moléculas (por exemplo, nucleotídeos diferentes marcados luminescentemente em uma reação de sequenciamento). Em algumas modalidades, a determinação do tempo de vida luminescente de uma molécula compreende a determinação do tempo de vida em relação a uma referência. Em algumas modalidades, a determinação do tempo de vida luminescente de uma molécula compreende medir o tempo de vida (por exemplo, tempo de vida fluorescente). Em algumas modalidades, a determinação do tempo de vida luminescente de uma molécula compreende a determinação de uma ou mais características temporais que são indicativas do tempo de vida. Em algumas modalidades, o tempo de vida luminescente de uma molécula pode ser determinado com base em uma distribuição de uma pluralidade de eventos de emissão (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais eventos de emissão) ocorrendo em uma ou mais janelas fechadas por tempo em relação a um pulso de excitação. Por exemplo, um tempo de vida luminescente de uma única molécula pode ser distinguido de uma pluralidade de moléculas com diferentes tempos de vida luminescentes com base na distribuição de tempos de chegada de fótons medidos em relação a um pulso de excitação.
[00133] Deve ser compreendido que um tempo de vida luminescente de uma única molécula é indicativo do tempo de fótons emitidos depois que a única molécula chega a um estado excitado e a única molécula pode ser distinguida por informações indicativas do tempo dos fótons. Algumas modalidades podem incluir distinguir uma molécula de uma pluralidade de moléculas com base no tempo de vida luminescente da molécula, medindo tempos associados aos fótons emitidos pela molécula. A distribuição dos tempos pode fornecer uma indicação da vida útil luminescente que pode ser determinada a partir da distribuição. Em algumas modalidades, a molécula única é distinguível da pluralidade de moléculas com base na distribuição dos tempos, como se comparando a distribuição dos tempos com uma distribuição de referência correspondente a uma molécula conhecida. Em algumas modalidades, um valor para o tempo de vida luminescente é determinado a partir da distribuição dos tempos.
[00134] O rendimento quântico luminescente refere-se à fração de eventos de excitação em um dado comprimento de onda ou dentro de uma determinada faixa espectral que leva a um evento de emissão, e geralmente é inferior a 1. Em algumas modalidades, o rendimento quântico luminescente de uma molécula aqui descrita está entre 0 e cerca de 0,001; entre cerca de 0,001 e cerca de 0,01; entre cerca de 0,01 e cerca de 0,1; entre cerca de 0,1 e cerca de 0,5; entre cerca de 0,5 e 0,9; ou entre cerca de 0,9 e 1. Em algumas modalidades, uma molécula é identificada determinando ou estimando o rendimento quântico luminescente.
[00135] Tal como aqui utilizado para moléculas únicas, a intensidade luminescente refere-se ao número de fótons emitidos por unidade de tempo que são emitidos por uma molécula que está sendo excitada pela administração de uma energia de excitação pulsada. Em algumas modalidades, a intensidade luminescente refere-se ao número detectado de fótons emitidos por unidade de tempo que são emitidos por uma molécula que está sendo excitada pela administração de uma energia de excitação pulsada, e são detectados por um sensor particular ou conjunto de sensores.
[00136] O tempo de vida luminescente, o rendimento quântico luminescente e a intensidade luminescente podem variar para uma dada molécula sob diferentes condições. Em algumas modalidades, uma única molécula terá um tempo de vida luminescente, rendimento quântico luminescente ou intensidade luminescente observada diferente para um conjunto das moléculas. Em algumas modalidades, uma molécula confinada em uma cavidade de amostra (por exemplo, uma nanoabertura) terá um tempo de vida luminescente, rendimento quântico luminescente ou intensidade luminescente observado diferente de moléculas não confinadas em uma cavidade de amostra. Em algumas modalidades, um marcador luminescente ou molécula luminescente ligado à outra molécula terá um tempo de vida luminescente, rendimento quântico luminescente ou intensidade luminescente diferente do marcador luminescente ou molécula luminescente não ligado a outra molécula. Em algumas modalidades, uma molécula que interage com um complexo macromolecular (por exemplo, complexo de proteína (por exemplo, polimerase de ácido nucleico) terá um tempo de vida luminescente, rendimento quântico luminescente ou intensidade luminescente diferente de uma molécula que não interage com um complexo macromolecular.
[00137] Em certas modalidades, uma molécula luminescente descrita no pedido de patente absorve um fóton e emite um fóton após uma duração de tempo. Em algumas modalidades, o tempo de vida luminescente de uma molécula pode ser determinado ou estimado medindo o tempo de vida. Em algumas modalidades, o tempo de vida luminescente de uma molécula pode ser determinado ou estimado medindo uma pluralidade de durações de tempo para múltiplos eventos de pulso e eventos de emissão. Em algumas modalidades, o tempo de vida luminescente de uma molécula pode ser diferenciado entre os tempos de vida luminescentes de uma pluralidade de tipos de moléculas, medindo-se a duração do tempo. Em algumas modalidades, o tempo de vida luminescente de uma molécula pode ser diferenciado entre os tempos de vidas luminescentes de uma pluralidade de tipos de moléculas medindo uma pluralidade de durações de tempo para múltiplos eventos de pulso e eventos de emissão. Em certas modalidades, uma molécula é identificada ou diferenciada entre uma pluralidade de tipos de moléculas determinando ou estimando o tempo de vida luminescente da molécula. Em certas modalidades, uma molécula é identificada ou diferenciada entre uma pluralidade de tipos de moléculas diferenciando o tempo de vida luminescente da molécula entre uma pluralidade de tempos de vida luminescente de uma pluralidade de tipos de moléculas.
[00138] Em certas modalidades, o evento de emissão luminescente é uma fluorescência. Em certas modalidades, o evento de emissão luminescente é uma fosforescência. Tal como aqui utilizado, o termo luminescência engloba todos os eventos luminescentes incluindo tanto fluorescência quanto fosforescência.
[00139] Em um aspecto, o pedido de patente provê um método para determinar o tempo de vida luminescente de uma única molécula luminescente compreendendo: prover a molécula luminescente em um volume alvo; administrar uma pluralidade de pulsos de uma energia de excitação para uma vizinhança do volume alvo; e detectar uma pluralidade de luminescências da molécula luminescente. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a avaliação da distribuição da pluralidade de durações de tempo entre cada par de pulsos e luminescências. Em algumas modalidades, o método compreende ainda imobilizar a molécula luminescente única no volume alvo.
[00140] Em outro aspecto, o pedido de patente provê um método para determinar o tempo de vida luminescente de uma pluralidade de moléculas compreendendo: prover uma pluralidade de moléculas luminescentes em um volume alvo; administrar uma pluralidade de pulsos de uma energia de excitaçãoa uma vizinhança do volume alvo; e detectar uma pluralidade de luminescências das moléculas luminescentes. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a avaliação da distribuição da pluralidade de durações de tempo entre cada par de pulsos e luminescências. Em algumas modalidades, o método compreende ainda imobilizar as moléculas luminescentes no volume alvo. Em algumas modalidades, a pluralidade consiste em entre 2 e cerca de 10 moléculas, entre cerca de 10 e cerca de 100 moléculas, ou entre cerca de 100 e cerca de 1000 moléculas. Em algumas modalidades, a pluralidade consiste entre cerca de 1000 e cerca de 106 moléculas, entre cerca de 106 e cerca de 109 moléculas, entre cerca de 109 e cerca de 1012 moléculas, entre cerca de 1012 e cerca de 1015 moléculas, ou entre cerca de 1015 e cerca de 1018 moléculas. Em algumas modalidades, todas as moléculas da pluralidade são o mesmo tipo de molécula.
[00141] A Figura 3 mostra o perfil de declínio exemplificativo 3-1 para quatro moléculas luminescentes com diferentes tempos de vida luminescente (do mais longo ao mais curto, de cima para baixo). A amplitude pode referir-se à intensidade da luminescência a partir de uma amostra compreendendo muitas moléculas, que diminui exponencialmente ao longo do tempo após a excitação inicial com base no tempo de vida útil luminescente. A amplitude pode alternativamente referir-se a um número ou contagem de emissões detectadas após uma duração de tempo após uma pluralidade de pulsos de energia de excitação, por exemplo, para uma única molécula. A função de distribuição cumulativa normalizada 3-2 corresponde a 3-1, para quatro moléculas luminescentes com diferentes tempos de vida luminescentes (do menor ao mais longo, de cima para baixo). CDF pode representar a probabilidade normalizada de amplitude de luminescência atingir zero (por exemplo, a probabilidade cumulativa de todas as moléculas excitadas terem luminescido) ao longo do tempo após a excitação inicial com base no tempo de vida luminescente. CDF pode, alternativamente, representar a probabilidade normalizada de uma única molécula emitir luminescência em um determinado período de tempo após um único pulso ou após cada um dentre uma pluralidade de pulsos de energia de excitação.
[00142] Em um aspecto, o pedido de patente provê um método para determinar a intensidade luminescente de uma única molécula luminescente compreendendo: prover a molécula luminescente em um volume alvo; administrar uma pluralidade de pulsos de uma energia de excitação a uma vizinhança do volume alvo; e detectar uma pluralidade de luminescências da molécula luminescente. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a determinação do número da pluralidade de luminescência detectada por unidade de tempo. Em algumas modalidades, o método compreende ainda imobilizar a molécula luminescente única no volume alvo.
[00143] Em outro aspecto, o pedido de patente provê um método para determinar a intensidade luminescente de uma pluralidade de moléculas compreendendo: prover uma pluralidade de moléculas luminescentes em um volume alvo; administrar uma pluralidade de pulsos de uma energia de excitação a uma vizinhança do volume alvo; e detectar uma pluralidade de luminescências das moléculas luminescentes. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a determinação do número da pluralidade de luminescência detectada por unidade de tempo. Em algumas modalidades, o método compreende ainda imobilizar as moléculas luminescentes no volume alvo. Em algumas modalidades, a pluralidade consiste entre 2 e cerca de 10 moléculas, entre cerca de 10 e cerca de 100 moléculas, ou entre cerca de 100 e cerca de 1000 moléculas. Em algumas modalidades, a pluralidade consiste entre cerca de 1000 e cerca de 106 moléculas, entre cerca de 106 e cerca de 109 moléculas, entre cerca de 109 e cerca de 1012 moléculas, entre cerca de 1012 e cerca de 1015 moléculas, ou entre cerca de 1015 e cerca de 1018 moléculas. Em algumas modalidades, todas as moléculas da pluralidade são o mesmo tipo de molécula.
Energia de Excitação
[00144] Em um aspecto dos métodos descritos aqui, uma ou mais energias de excitação são usadas para excitar os marcadores luminescentes das moléculas a serem identificadas ou distinguidas. Em algumas modalidades, uma energia de excitação está no espectro visível. Em algumas modalidades, uma energia de excitação está no espectro ultravioleta. Em algumas modalidades, uma energia de excitação está no espectro infravermelho. Em algumas modalidades, uma energia de excitação é usada para excitar as moléculas luminescentemente marcadas. Em algumas modalidades, duas energias de excitação são usadas para excitar as moléculas luminescentemente marcadas. Em algumas modalidades, três ou mais energias de excitação são usadas para excitar as moléculas luminescentemente marcadas. Em algumas modalidades, cada molécula luminescentemente marcada é excitada por apenas uma das energias de excitação administradas. Em algumas modalidades, uma molécula luminescentemente marcada é excitada por duas ou mais das energias de excitação administradas. Em certas modalidades, uma energia de excitação pode ser monocromática ou confinada a uma faixa espectral. Em algumas modalidades, uma faixa espectral tem um intervalo entre cerca de 0,1 nm e cerca de 1 nm, entre cerca de 1 nm e cerca de 2 nm, ou entre cerca de 2 nm e cerca de 5 nm. Em algumas modalidades, uma faixa espectral tem um intervalo entre cerca de 5 nm e cerca de 10 nm, entre cerca de 10 nm e cerca de 50 nm, ou entre cerca de 50 nm e cerca de 100 nm.
[00145] Em certas modalidades, a energia de excitação é administrada como um pulso de luz. Em certas modalidades, a energia de excitação é administrada como uma pluralidade de pulsos de luz. Em certas modalidades, duas ou mais energias de excitação são usadas para excitar as moléculas luminescentemente marcadas. Em algumas modalidades, cada energia de excitação é administrada ao mesmo tempo (por exemplo, em cada pulso). Em algumas modalidades, cada energia de excitação é administrada em tempos diferentes (por exemplo, em pulsos separados de cada energia). As diferentes energias de excitação podem ser administradas em qualquer padrão suficiente para permitir a detecção de luminescência a partir das moléculas alvo. Em algumas modalidades, duas energias de excitação são administradas em cada pulso. Em algumas modalidades, uma primeira energia de excitação e uma segunda energia de excitação são administradas em pulsos alternados. Em algumas modalidades, uma primeira energia de excitação é administrada em uma série de pulsos sequenciais, e uma segunda energia de excitação é administrada em uma série subsequente de pulsos sequenciais ou um padrão alternativo dessas séries.
[00146] Em certas modalidades, a frequência de pulsos de luz é selecionada com base nas propriedades luminescentes da molécula marcada luminescentemente. Em certas modalidades, a frequência de pulsos de luz é selecionada com base nas propriedades luminescentes de uma pluralidade de nucleotídeos luminescentemente marcados. Em certas modalidades, a frequência de pulsos de luz é selecionada com base no tempo de vida luminescente de uma pluralidade de nucleotídeos luminescentemente marcados. Em algumas modalidades, a frequência é selecionada de modo que o intervalo entre os pulsos seja mais longo do que os tempos de vida luminescentes de um ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados. Em algumas modalidades, a frequência é selecionada com base no tempo de vida luminescente mais longo da pluralidade de nucleotídeos luminescentemente marcados. Por exemplo, se os tempos de vidas luminescentes dos quatro nucleotídeos luminescentemente marcados são 0,25, 0,5, 1,0 e 1,5 ns, a frequência dos pulsos de luz pode ser selecionada de modo que o intervalo entre os pulsos exceda 1,5 ns. Em algumas modalidades, o intervalo é entre cerca de duas vezes e cerca de dez vezes, entre cerca de dez vezes e cerca de 100 vezes, ou entre cerca de 100 vezes e cerca de 1000 vezes maior do que o tempo de vida luminescente de uma ou mais moléculas marcadas luminescentemente que estão sendo excitadas. Em algumas modalidades, o espaço é cerca de 10 vezes mais longo do que o tempo de vida luminescente de uma ou mais moléculas luminescentemente marcadas que estão sendo excitadas. Em algumas modalidades, o intervalo está entre cerca de 0,01 ns e cerca de 0,1 ns; entre cerca de 1 ns e cerca de 5 ns; entre cerca de 5 ns e cerca de 15 ns; entre cerca de 15 ns e cerca de 25 ns; ou entre cerca de 25 ns e cerca de 50 ns. Em algumas modalidades, o intervalo é selecionado de modo que exista uma probabilidade de 50%, 75%, 90%, 95% ou 99% de que as moléculas excitadas pelo pulso terão declínio luminescente ou de que o estado excitado diminuirá por outro mecanismo.
[00147] Em certas modalidades, onde existem múltiplas energias de excitação, a frequência dos pulsos para cada energia de excitação é a mesma. Em certas modalidades, onde existem múltiplas energias de excitação, a frequência de pulsos para cada energia de excitação é diferente. Por exemplo, se um laser vermelho é usado para excitar moléculas luminescentes com tempo de vida de 0,2 e 0,5 ns, e um laser verde é usado para excitar moléculas luminescentes com tempos de vida de 5 ns e 7 ns, o intervalo após cada pulso de laser vermelho pode ser mais curto (por exemplo, 5 ns) do que o intervalo após cada pulso de laser verde (por exemplo, 20 ns).
[00148] Em certas modalidades, a frequência das energias de excitação pulsadas é selecionada com base no processo químico que está sendo monitorado. Para uma reação de sequenciamento, a frequência pode ser selecionada de modo que um número de pulsos suficiente seja administrado para permitir a detecção de um número suficiente de fótons emitidos a serem detectados. Um número suficiente, no contexto de fótons detectados, refere-se a uma série de fótons necessários para identificar ou distinguir o nucleotídeo marcado luminescentemente dentre a pluralidade de nucleotídeos luminescentemente marcados. Por exemplo, uma polimerase de DNA pode incorporar um nucleotídeo adicional uma vez a cada 20 milissegundos em média. O tempo que um nucleotídeo marcado luminescentemente interage com o complexo pode ser de cerca de 10 milissegundos, e o tempo entre o momento em que o marcador luminescente é clivado e o próximo nucleotídeo marcado luminescentemente começa a interagir pode ser de cerca de 10 milissegundos. A frequência da energia de excitação pulsada poderia então ser selecionada para administrar pulsos suficientes durante 10 milissegundos, de modo que um número suficiente de fótons emitidos seja detectado durante os 10 milissegundos quando o nucleotídeo luminescentemente marcado está sendo incorporado. Por exemplo, a uma frequência de 100 MHz, haverá 1 milhão de pulsos em 10 milissegundos (o comprimento aproximado do evento de incorporação). Se 0,1% desses pulsos conduzir a um fóton detectado, haverá 1.000 pontos de dados luminescentes que podem ser analisados para determinar a identidade do nucleotídeo marcado luminescentemente que está sendo incorporado. Nenhum dos valores acima não é limitante. Em algumas modalidades, os eventos de incorporação podem levar entre 1 ms e 20 ms, entre 20 ms e 100 ms ou entre 100 ms e 500 ms. Em algumas modalidades, em que energias de excitação múltiplas são administradas em pulsos temporizados separadamente, o nucleotídeo marcado luminescentemente só pode ser excitado por uma parte dos pulsos. Em algumas modalidades, a frequência e o padrão dos pulsos de múltiplas energias de excitação são selecionados de tal modo que o número de pulsos é suficiente para excitar qualquer um dentre a pluralidade de nucleotídeos luminescentemente marcados para permitir a detecção de um número suficiente de fótons emitidos.
[00149] Em algumas modalidades, a frequência de pulsos está entre cerca de 1 MHz e cerca de 10 MHz. Em algumas modalidades, a frequência de pulsos está entre cerca de 10 MHz e cerca de 100 MHz. Em algumas modalidades, a frequência de pulsos está entre cerca de 100 MHz e cerca de 1 GHz. Em algumas modalidades, a frequência de pulsos está entre cerca de 50 MHz e cerca de 200 MHz. Em algumas modalidades, a frequência de pulsos é de cerca de 100 MHz. Em algumas modalidades, a frequência é estocástica.
[00150] Em determinadas modalidades, a energia de excitação está entre cerca de 500 nm e cerca de 700 nm. Em algumas modalidades, a energia de excitação está entre cerca de 500 nm e cerca de 600 nm, ou cerca de 600 nm e cerca de 700 nm. Em algumas modalidades, a energia de excitação está entre cerca de 500 nm e cerca de 550 nm, entre cerca de 550 nm e cerca de 600 nm, entre cerca de 600 nm e cerca de 650 nm, ou entre cerca de 650 nm e cerca de 700 nm.
[00151] Em certas modalidades, um método aqui descrito compreende a administração de duas energias de excitação. Em algumas modalidades, as duas energias de excitação são separadas entre cerca de 5 nm e cerca de 20 nm, entre cerca de 20 nm e cerca de 40 nm, entre cerca de 40 nm e cerca de 60 nm, entre cerca de 60 nm e cerca de 80 nm, entre cerca de 80 nm e cerca de 100 nm, entre cerca de 100 nm e cerca de 150 nm, entre cerca de 150 nm e cerca de 200 nm, entre cerca de 200 nm e cerca de 400 nm, ou entre pelo menos cerca de 400 nm. Em algumas modalidades, as duas energias de excitação são separadas entre cerca de 20 nm e cerca de 80 nm, ou entre cerca de 80 nm e cerca de 160 nm.
[00152] Quando uma energia de excitação é dita como estando em um intervalo específico, a energia de excitação pode compreender um único comprimento de onda, de modo que o comprimento de onda esteja entre ou nos pontos extremos do intervalo, ou a energia de excitação pode compreender um espectro de comprimentos de onda com uma intensidade máxima, de modo que a intensidade máxima esteja entre ou nos pontos extremos do intervalo.
[00153] Em certas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 450 nm a 500 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 500 nm a 550 nm, 550 nm a 600 nm, 600 nm a 650 nm ou 650 nm a 700 nm. Em certas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 500 nm a 550 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 450 nm a 500 nm, 550 nm a 600 nm, 600 nm a 650 nm ou 650 nm a 700 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 550 nm a 600 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 450 nm a 500 nm, 500 nm a 550 nm, 600 nm a 650 nm ou 650 nm a 700 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 600 nm a 650 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 450 nm a 500 nm, 500 nm a 550 nm, 550 nm a 600 nm ou 650 nm a 700 nm. Em certas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 650 nm a 700 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 450 nm a 500 nm, 500 nm a 550 nm, 550 nm a 600 nm ou 600 nm a 650 nm.
[00154] Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 450 nm a 500 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 500 nm a 550 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 450 nm a 500 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 550 nm a 600 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 450 nm a 500 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 600 nm a 670 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 500 nm a 550 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 550 nm a 600 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 500 nm a 550 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 600 nm a 670 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 550 nm a 600 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 600 nm a 670 nm. Em certas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 470 nm a 510 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 510 nm a 550 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 470 nm a 510 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 550 nm a 580 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 470 nm a 510 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 580 nm a 620 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 470 nm a 510 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 620 nm a 670 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 510 nm a 550 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 550 nm a 580 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 510 nm a 550 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 580 nm a 620 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 510 nm a 550 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 620 nm a 670 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 550 nm a 580 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 580 nm a 620 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 550 nm a 580 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 620 nm a 670 nm. Em determinadas modalidades, a primeira energia de excitação está no intervalo de 580 nm a 620 nm e a segunda energia de excitação está no intervalo de 620 nm a 670 nm.
[00155] Determinadas modalidades de fontes de energia de excitação e dispositivos para a administração de pulsos de energia de excitação a um volume alvo são descritas neste documento.
Nucleotídeos Luminescentemente Marcados
[00156] Em um aspecto, os métodos e composições aqui descritos compreendem um ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados. Em determinadas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem nucleosídeos de desoxirribose. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos compreendem nucleosídeos de desoxirribose. Em determinadas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem nucleosídeos de ribose. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos compreendem nucleosídeos de ribose. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem um açúcar de ribose ou análogo de ribose modificado (por exemplo, um ácido nucleico bloqueado). Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem bases de ocorrência natural (por exemplo, citosina, guanina, adenina, timina, uracila). Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem derivados ou análogos de citosina, guanina, adenina, timina ou uracila.
[00157] Em determinadas modalidades, um método compreende a etapa de expor um complexo de polimerase a uma pluralidade de nucleotídeos luminescentemente marcados. Em determinadas modalidades, uma composição ou dispositivo compreende uma mistura de reação compreendendo uma pluralidade de nucleotídeos luminescentemente marcados. Em algumas modalidades, a pluralidade de nucleotídeos compreende quatro tipos de nucleotídeos. Em algumas modalidades, os quatro tipos de nucleotídeos compreendem, cada um, um dentre citosina, guanina, adenina e timina. Em algumas modalidades, os quatro tipos de nucleotídeos compreendem, cada um, um dentre citosina, guanina, adenina e uracila.
[00158] Em certas modalidades, a concentração de cada tipo de nucleotídeo marcado luminescentemente na mistura de reação está entre cerca de 50 nM e cerca de 200 nM, cerca de 200 nM e cerca de 500 nM, cerca de 500 nM e cerca de 1 μM, cerca de 1 μM e cerca de 50 μM, ou cerca de 50 μM e 250 μM. Em algumas modalidades, a concentração de cada tipo de nucleotídeo marcado luminescentemente na mistura de reação está entre cerca de 250 nM e cerca de 2 μM. Em algumas modalidades, a concentração de cada tipo de nucleotídeo marcado luminescentemente na mistura de reação é de cerca de 1 μM.
[00159] Em certas modalidades, a mistura de reação contém reagentes adicionais de uso para reações de sequenciamento. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende um tampão. Em algumas modalidades, um tampão compreende ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico (MOPS). Em algumas modalidades, um tampão está presente em uma concentração entre cerca de 1 mM e entre cerca de 100 mM. Em algumas modalidades, a concentração de MOPS é de cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende um ou mais sais. Em algumas modalidades, um sal compreende acetato de potássio. Em algumas modalidades, a concentração de acetato de potássio é de cerca de 140 mM. Em algumas modalidades, um sal está presente em uma concentração entre cerca de 1 mM e cerca de 200 mM. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende um sal de magnésio (por exemplo, acetato de magnésio). Em algumas modalidades, a concentração de acetato de magnésio é de cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, um sal de magnésio está presente em uma concentração entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende um agente de redução. Em algumas modalidades, um agente de redução é ditiotreitol (DTT). Em algumas modalidades, um agente de redução está presente em uma concentração entre cerca de 1 mM e cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a concentração de DTT é de cerca de 5 mM. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende um ou mais fotoestabilizadores. Em algumas modalidades, a mistura de reação compreende um antioxidante, um sequestrante de oxigênio ou um extintor de estado de tripleto P.38. Em algumas modalidades, um fotoestabilizador compreende ácido protocatecuico (PCA). Em algumas modalidades, um fotoestabilizador compreende álcool 4-nitrobenzílico (NBA). Em algumas modalidades, um fotoestabilizador está presente em uma concentração entre cerca de 0,1 mM e cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração de PCA é de cerca de 3 mM. Em algumas modalidades, a concentração de NBA é de cerca de 3 mM. Uma mistura com um fotoestabilizador (por exemplo, PCA) também pode compreender uma enzima para regenerar o fotoestabilizador (por exemplo, dioxigenase de ácido protocatecuico (PCD)). Em algumas modalidades, a concentração de PCD é de cerca de 0,3 mM.
[00160] O pedido de patente contempla diferentes métodos para diferenciar nucleotídeos entre uma pluralidade de nucleotídeos. Em certas modalidades, cada um dos nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente diferente. Em certas modalidades, dois ou mais dos nucleotídeos luminescentemente marcados têm os mesmos tempos de vida luminescente ou substancialmente os mesmos tempos de vida luminescente (por exemplo, tempos de vida que não podem ser distinguidos pelo método ou dispositivo).
[00161] Em certas modalidades, cada um dos nucleotídeos marcados luminescentemente absorve energia de excitação em uma faixa espectral diferente. Em certas modalidades, dois dos nucleotídeos marcados luminescentemente absorvem energia de excitação na mesma faixa espectral. Em certas modalidades, três dos nucleotídeos marcados luminescentemente absorvem energia de excitação na mesma faixa espectral. Em certas modalidades, quatro ou mais dos nucleotídeos marcados luminescentemente absorvem energia de excitação na mesma faixa espectral. Em certas modalidades, dois dos nucleotídeos marcados luminescentemente absorvem a energia de excitação em uma faixa espectral diferente. Em certas modalidades, três dos nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem a energia de excitação em uma faixa espectral diferente. Em certas modalidades, quatro ou mais dos nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem a energia de excitação em uma faixa espectral diferente.
[00162] Em certas modalidades, cada um dos nucleotídeos luminescentemente marcados emite fótons em uma faixa spectral diferente. Em certas modalidades, dois dos nucleotídeos luminescentemente marcados emitem fótons na mesma faixa espectral. Em certas modalidades, três dos nucleotídeos luminescentemente marcados emitem fótons na mesma faixa espectral. Em certas modalidades, quatro ou mais dos nucleotídeos marcados luminescentemente emitem fótons na mesma faixa espectral. Em certas modalidades, dois dos nucleotídeos marcados luminescentemente emitem fótons na faixa espectral diferente. Em certas modalidades, três dos nucleotídeos marcados luminescentemente emitem fótons na faixa espectral diferente. Em certas modalidades, quatro ou mais dos nucleotídeos marcados luminescentemente emitem fótons na faixa espectral diferente.
[00163] Em certas modalidades, cada um dentre quatro nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente diferente. Em certas modalidades, dois ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados têm diferentes tempos de vida luminescente e absorvem e/ou emitem fótons em uma primeira faixa espectral, e um ou mais nucleotídeos marcados luminescentemente absorvem e/ou emitem fótons em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre três nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente diferente e emite luminescência em uma primeira faixa espectral, e um quarto nucleotídeo luminescentemente marcado absorve e/ou emite fótons em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre dois nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente diferente e emite luminescência em uma primeira faixa espectral, e um terceiro e quarto nucleotídeos marcados luminescentemente têm, cada um, diferentes tempos de vida luminescente e emitem luminescência em uma segunda faixa espectral.
[00164] Em certas modalidades, cada um dentre quatro nucleotídeos luminescentemente marcados tem uma intensidade luminescente diferente. Em certas modalidades, dois ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados têm intensidade luminescente diferente e emitem luminescência em uma primeira faixa espectral, e um ou mais nucleotídeos marcados luminescentemente absorvem e/ou emitem fótons em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre três nucleotídeos luminescentemente marcados tem uma intensidade luminescente diferente e emite luminescência em uma primeira faixa espectral, e um quarto nucleotídeo luminescentemente marcado absorve e/ou emite fótons em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre dois nucleotídeos luminescentemente marcados tem uma intensidade luminescente diferente e emite luminescência em uma primeira faixa espectral, e um terceiro e quarto nucleotídeos luminescentemente marcados têm, cada um, uma intensidade luminescente diferente e emitem luminescência em uma segunda faixa espectral.
[00165] Em certas modalidades, cada um dentre quatro nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente ou intensidade luminescente diferente. Em certas modalidades, dois ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados têm tempo de vida luminescente ou intensidade luminescente diferente e emitem luminescência em uma primeira faixa espectral, e um ou mais nucleotídeos marcados luminescentemente absorvem e/ou emitem fótons em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre três nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente ou intensidade luminescente diferente e emite luminescência em uma primeira faixa espectral, e um quarto nucleotídeo luminescentemente marcado absorve e/ou emite fótons em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre dois nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente ou intensidade luminescente e diferente emite luminescência em uma primeira faixa espectral, e um terceiro e quarto nucleotídeos luminescentemente marcados têm, cada um, tempo de vida luminescente ou intensidade luminescente diferente e emitem luminescência em uma segunda faixa espectral.
[00166] Em certas modalidades, dois ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados têm diferentes tempos de vida luminescente e absorvem energia de excitação em uma primeira faixa espectral, e um ou mais nucleotídeos marcados luminescentemente absorvem energia de excitação em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre três nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente diferente e absorve energia de excitação em uma primeira faixa espectral, e um quarto nucleotídeo luminescentemente marcado absorve energia de excitação em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre dois nucleotídeos luminescentemente marcados tem uma duração de vida luminescente diferente e absorve energia de excitação em uma primeira faixa espectral, e um terceiro e quarto nucleotídeos luminescentemente marcados têm, cada um, diferentes tempos de vida luminescente e absorvem energia de excitação em uma segunda faixa espectral.
[00167] Em certas modalidades, dois ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados têm tempo de vida luminescente ou intensidade luminescente diferente e absorvem energia de excitação em uma primeira faixa espectral, e um ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem energia de excitação em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre três nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente ou intensidade luminescente diferente e absorve energia de excitação em uma primeira faixa espectral, e um quarto nucleotídeo luminescentemente marcado absorve energia de excitação em uma segunda faixa espectral. Em algumas modalidades, cada um dentre dois nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente ou intensidade luminescente diferente e absorve energia de excitação em uma primeira faixa espectral, e um terceiro e quarto nucleotídeos luminescentemente marcados têm, cada um, duração de vida luminescente ou intensidade luminescente diferente e absorvem energia de excitação em uma segunda faixa espectral.
[00168] Durante o sequenciamento, o método de identificação de um nucleotídeo pode variar entre vários pares de bases na sequência. Em certas modalidades, dois tipos de nucleotídeos podem ser marcados para absorver em uma primeira energia de excitação, e esses dois tipos de nucleotídeos (por exemplo, A, G) são distinguidos com base em intensidade luminescente diferente, enquanto dois tipos adicionais de nucleotídeos (por exemplo, C, T) podem ser marcados para absorver em uma segunda energia de excitação, e esses dois tipos adicionais de nucleotídeos são distinguidos com base em diferentes tempos de vida luminescente. Para tais modalidades, durante o sequenciamento, certos segmentos da sequência podem ser determinados apenas com base na intensidade luminescente (por exemplo, segmentos que incorporam apenas A e G), ao passo que outros segmentos da sequência podem ser determinados apenas com base no tempo de vida luminescente (por exemplo, segmentos que incorporam apenas C e T). Em algumas modalidades, entre 2 e 4 nucleotídeos luminescentemente marcados são diferenciados com base no tempo de vida luminescente. Em algumas modalidades, entre 2 e 4 nucleotídeos marcados luminescentemente são diferenciados com base na intensidade luminescente. Em algumas modalidades, entre 2 e 4 nucleotídeos luminescentemente marcados são diferenciados com base no tempo de vida luminescente e na intensidade luminescente.
[00169] A Figura 4 mostra o tempo de vida luminescente 4-1 de nucleotídeos luminescentemente marcados exemplificativos e a intensidade luminescente 4-2 para os mesmos nucleotídeos exemplificativos. Por exemplo, a quarta linha mostra dados para um nucleotídeo de hexafosfato de desoxitimidina (dT6P) ligado ao fluoróforo Alexa Fluor® 555 (AF555). Este nucleotídeoluminescentemente marcado tem um tempo de vida útil aproximadamente 0,25 ns e exibe uma intensidade luminescente de aproximadamente 20000 contagens/s. O tempo de vida luminescente e a intensidade luminescente observadas de qualquer nucleotídeo luminescentemente marcado podem, em geral, diferir para o nucleotídeo sob condições de incorporação (por exemplo, em um único complexo de moléculas, em uma nanoabertura) versus outras condições mais típicas, como aquelas para 4-1 e 4-2.
Detecção de Luminescência
[00170] Em um aspecto dos métodos aqui descritos, um fóton emitido (uma luminescência) ou uma pluralidade de fótons emitidos é detectado por um ou mais sensores. Para uma pluralidade de moléculas ou nucleotídeos luminescentemente marcados, cada uma das moléculas pode emitir fótons em uma única faixa espectral ou uma parte das moléculas pode emitir fótons em uma primeira faixa espectral e outra parte das moléculas pode emitir fótons em uma segunda faixa espectral. Em certas modalidades, os fótons emitidos são detectados por um único sensor. Em certas modalidades, os fótons emitidos são detectados por múltiplos sensores. Em algumas modalidades, os fótons emitidos em uma primeira faixa espectral são detectados por um primeiro sensor, e os fótons emitidos em uma segunda faixa espectral são detectados por um segundo sensor. Em algumas modalidades, os fótons emitidos em cada uma dentre uma pluralidade de faixas espectrais são detectados por um sensor diferente.
[00171] Em certas modalidades, cada sensor é configurado para atribuir um agrupamento de tempo a um fóton emitido com base na duração de tempo entre a energia de excitação e o fóton emitido. Em algumas modalidades, os fótons emitidos após um período de tempo mais curto serão atribuídos a um agrupamento de tempo anterior, e os fótons emitidos após uma duração mais longa receberão um agrupamento de tempo posterior.
[00172] Em algumas modalidades, uma pluralidade de pulsos de energia de excitação é administrada à vizinhança de um volume alvo e é detectada uma pluralidade de fótons, que pode incluir eventos de emissão de fótons. Em algumas modalidades, a pluralidade de luminescências (por exemplo, eventos de emissão de fótons) corresponde à incorporação de um nucleotídeo marcado luminescentemente em um produto de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a incorporação de um nucleotídeo marcado luminescentemente dura entre cerca de 1 ms e cerca de 5 ms, entre cerca de 5 ms e cerca de 20 ms, entre cerca de 20 ms e cerca de 100 ms, ou entre cerca de 100 ms e cerca de 500 ms. Em algumas modalidades, entre cerca de 10 e cerca de 100, entre cerca de 100 e cerca de 1000, cerca de 1000 e cerca de 10000, ou cerca de 10000 e cerca de 100000 luminescências são detectadas durante a incorporação de um nucleotídeo marcado luminescentemente.
[00173] Em certas modalidades, não há detecção de luminescências se um nucleotídeo luminescentemente marcado não estiver sendo incorporado. Em algumas modalidades, há um fundo de luminescência. Em algumas modalidades, fluorescências simuladas são detectadas quando nenhum nucleotídeo marcado luminescentemente está sendo incorporado. Tais luminescências simuladas podem ocorrer se um ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados estiverem no volume alvo (por exemplo, difunde no volume alvo ou interage com a polimerase, mas não é incorporado) durante um pulso de energia de excitação, mas não está sendo incorporado pela reação de sequenciamento. Em algumas modalidades, a pluralidade de luminescências detectadas a partir de um nucleotídeo luminescentemente marcado no volume alvo, mas não sendo incorporado, é menor (por exemplo, dez vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10000 vezes) do que a pluralidade de luminescências a partir de um nucleotídeo luminescentemente marcado.
[00174] Em algumas modalidades, para cada pluralidade de luminescências detectadas correspondentes à incorporação de um nucleotídeo luminescentemente marcado, as luminescências recebem um agrupamento de tempo com base na duração do tempo entre o pulso e o fóton emitido. Esta pluralidade para um evento de incorporação é aqui referida como uma "explosão". Em algumas modalidades, uma explosão refere-se a uma série de sinais (por exemplo, medições) acima de uma linha de base (por exemplo, valor limite de ruído), em que os sinais correspondem a uma pluralidade de eventos de emissão que ocorrem quando o nucleotídeo marcado luminescentemente está dentro da região de excitação. Em algumas modalidades, uma explosão é separada de uma explosão anterior e/ou subsequente por um intervalo de tempo de sinais representativos da linha de base. Em algumas modalidades, a explosão é analisada determinando-se o tempo de vida luminescente com base na pluralidade de durações de tempo. Em algumas modalidades, a explosão é analisada determinando-se a intensidade luminescente com base no número de luminescências detectadas por uma unidade de tempo. Em algumas modalidades, a explosão é analisada determinando-se a faixa espectral das luminescências detectadas. Em algumas modalidades, a análise dos dados da explosão permitirá a atribuição da identidade do nucleotídeo luminescentemente marcado incorporado, ou permitirá que um ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados sejam diferenciados dentre uma pluralidade de nucleotídeos luminescentemente marcados. A atribuição ou diferenciação pode confiar em qualquer um dentre tempo de vida luminescente, intensidade luminescente, faixa espectral dos fótons emitidos ou qualquer combinação destes.
[00175] FIG. 5 representa a sequenciamento de um ácido nucleico modelo exemplar. A experiência de sequenciamento foi realizada com 4 nucleotídeos luminescentemente marcados: desoxiadenosina ligada a Alexa Fluor® 647 (A-AF647), desoxitimidina ligada a Alexa Fluor 555 (T-AF555), desoxiguanidina ligada a DyLight® 554-R1 (G-D554R1) e desoxicitidina ligada a DyLight® 530-R2 (C-D530R2). O nucleotídeo A- AF647 é excitado por energia de excitação na faixa espectral vermelha e os nucleotídeos T, G e C são excitados por excitação na faixa espectral verde. O número de fótons detectados mais de ~200 s de uma reação de sequenciamento é mostrado em um sinal de intensidade 5-1. Cada pico corresponde a uma explosão de luminescências detectadas e é marcado com um ponto. Cada explosão pode corresponder à incorporação de um nucleotídeo luminescentemente marcado e compreende milhares de luminescências detectadas. Diferentes sinais coloridos podem ser utilizados para indicar diferentes pulsos de excitação. Por exemplo, um sinal roxo pode ser usado para pulsos de excitação verde, e um sinal azul pode ser usado para pulsos de excitação vermelhos. Explosões do sinal azul podem ser atribuídas à incorporação do nucleotídeo A- AF647 (o único nucleotídeo com molécula luminescente vermelha neste exemplo).
[00176] A Figura 5 mostra uma forma de reduzir os dados brutos para diferenciar explosões da mesma cor (por exemplo, explosões no sinal roxo entre T, G e C) usando uma um gráfico de intensidade versus gráfico tempo de vida 5-2. Cada círculo representa uma explosão a partir do sinal roxo. Cada explosão foi analisada para determinar o tempo de vida luminescente do nucleotídeo luminescentemente marcado com base na duração de tempo entre o pulso e a emissão de cada fóton detectado. Adicionalmente, cada explosão foi analisada para determinar a intensidade luminescente do nucleotídeo luminescentemente marcado com base no número de fótons detectados por segundo. Os eventos de incorporação são agrupados em três grupos que correspondem a cada um dos três nucleotídeos luminescentemente marcados. O agrupamento escuro na porção inferior do gráfico (área do gráfico abaixo da linha pontilhada) é atribuído a C-D530R2, o qual tem o tempo de vida luminescente mais longo e a menor intensidade luminescente. O agrupamento claro na porção inferior do gráfico (área do gráfico abaixo da linha pontilhada) é atribuído a G-D554R1, o qual tem o tempo de vida e intensidade intermediários. E o agrupamento claro na porção superior do gráfico (área do gráfico acima da linha pontilhada) é atribuído a T-AF555, que tem o tempo de vida mais curto e a intensidade maior. A Figura 5 mostra o alinhamento 5-3 entre a sequência determinada a partir dos dados e a sequência conhecida do ácido nucleico modelo. As barras verticais indicam uma compatibilidade entre a base experimentalmente determinada e a sequência alvo. Os pontilhados indicam uma posição da sequência determinada ou uma posição extra na sequência determinada que não corresponde a qualquer posição na sequência modelo.
[00177] A Figura 6 representa um segundo exemplo para o sequenciamento de um ácido nucleico modelo. O experimento de sequenciamento foi executado com 4 nucleotídeos luminescentemente marcados: desoxiadenosina ligada a Alexa Fluor® 647 (A-AF647), dexoitimidina ligada a Alex Fluor 555 (T-AF555), desoxiguanidina ligada a Alexa Fluor® 647 (G-AF647), e uma dexoicitidina ligada a Alexa Fluor® 546 (C-AF546). Os nucleotídeos A-AF647 e G-AF647 são excitados através da energia de excitação na faixa espectral vermelha e os nucleotídeos T e C são excitados através de excitação na faixa espectral verde. Neste experimento, A e G têm o mesmo marcador luminescente e não são discriminados. A Figura 6 mostra o número de fótons detectados em mais de ~300 s de uma reação de sequenciamento em um sinal de intensidade 6-1. Cada pico corresponde a uma explosão de luminescências detectadas e é marcado com um ponto. Cada explosão pode corresponder à incorporação de um nucleotídeo luminescentemente marcado e compreende milhares de luminescências detectadas. O sinal mostra luminescências detectadas para pulsos de excitação verde (correspondendo às bases T e C).
[00178] A Figura 6 mostra um modo de reduzir os dados brutos para diferenciar T e C usando um gráfico de intensidade versus gráfico de tempo de vida 6-2. Cada círculo representa uma explosão a partir do sinal de intensidade 6-1. Cada explosão foi analisada para determinar o tempo de vida luminescente do nucleotídeo luminescentemente marcado com base na duração de tempo entre o pulso e a emissão de cada fóton detectado. Adicionalmente, cada explosão foi analisada para determinar a intensidade luminescente do nucleotídeo luminescentemente marcado com base no número de fótons detectados por segundo. Os eventos de incorporação são agrupados em dois grupos correspondendo a cada um dos dois nucleotídeos luminescentemente marcados. O agrupamento escuro na porção direita do gráfico (área do gráfico à direita da linha pontilhada) é atribuído a C-AF546 que tem o tempo de vida luminescente mais longo e a menor intensidade luminescente. O agrupamento leve na porção direita do gráfico (área do gráfico à direita da linha pontilhada) é atribuído a T-AF555 que tem o tempo de vida mais curto e a maior intensidade. A Figura 6 mostra o alinhamento 6-3 entre a sequência determinada a partir dos dados e a sequência conhecida do ácido nucleico modelo. As barras verticais indicam uma compatibilidade entre a base experimentalmente determinada e a sequência alvo. Os pontilhados indicam uma posição na sequência modelo para a qual nenhum nucleotídeo foi atribuído na sequência determinada ou uma posição extra na sequência determinada que não corresponde a qualquer posição na sequência modelo.
[00179] Em algumas modalidades, um ou mais componentes de uma reação de sequenciamento podem ser preparados e usados em uma cavidade de amostra, conforme representado nas modalidades não limitantes mostradas nas Figuras. 7-9, por exemplo, para a análise de marcadores luminescentes no contexto de uma reação de sequenciamento.
Marcadores luminescentes
[00180] Os termos tag luminescente, label luminescente e marcador luminescente são usados de forma intercomutável em todo o pedido e se referem a moléculas compreendendo uma ou mais moléculas luminescentes. Em certas modalidades, a molécula incorporada é uma molécula luminescente, por exemplo, sem ligação de um marcador luminescente distinto. O nucleotídeo e ácidos nucleicos típicos não são luminescentes ou não luminescem dentro de faixas adequadas de excitação e energias de emissão. Em certas modalidades, a molécula incorporada compreende um marcador luminescente. Em certas modalidades, a molécula incorporada é um nucleotídeo luminescentemente marcado. Em certas modalidades, a molécula incorporada é um aminoácido luminescentemente marcado ou tRNA luminescentemente marcado. Em algumas modalidades, um nucleotídeo luminescentemente marcado compreende um nucleotídeo e um marcador luminescente. Em algumas modalidades, um nucleotídeo luminescentemente marcado compreende um nucleotídeo, um marcador luminescente e um ligante. Em algumas modalidades, o marcador luminescente é um fluoróforo.
[00181] Em certas modalidades, o marcador luminescente, e opcionalmente o ligante, permanecem ligados a uma molécula incorporada. Em certas modalidades, o marcador luminescente, e opcionalmente o ligante, são clivados a partir da molécula durante ou depois do processo de incorporação.
[00182] Em certas modalidades, o marcador luminescente é um corante cianina ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, o corante cianina é de fórmula: ou um sal, estereoisômero, ou tautômero do mesmo, em que: A1 e A2 são unidos para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, aromático ou não aromático, monocíclico ou policíclico; B1 e B2 são unidos para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, aromático ou não aromático, monocíclico ou policíclico; cada um de R1 e R2 é independentemente hidrogênio, alquila opcionalmente substituída; e cada um de L1 e L2 é independentemente hidrogênio, alquila opcionalmente substituída ou L1 e L2 são unidos para formar um anel carbocíclico opcionalmente substituído, aromático ou não aromático, monocíclico ou policíclico.
[00183] Em certas modalidades, o marcador luminescente é um corante rodamina ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, o corante rodamina é de fórmula: ou um sal, estereoisômero, ou tautômero do mesmo, em que: cada um de A1 e A2 é independentemente hidrogênio, alquila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, aromática ou não aromática, carbociclila opcionalmente substituída, aromática ou não aromática ou carbonila opcionalmente substituída ou A1 e A2 são unidos para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, aromático ou não aromático, monocíclico ou policíclico; cada um de B1 e B2 é independentemente hidrogênio, alquila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, aromática ou não aromática, carbociclila opcionalmente substituída, aromática ou não aromática ou carbonila opcionalmente substituída ou B1 e B2 são unidos para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, aromático ou não aromático, monocíclico ou policíclico; cada um de R2 e R3 é independentemente hidrogênio, alquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou acila opcionalmente substituída; e R4 é hidrogênio, alquila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmente substituída, aromática ou não aromática, carbociclila opcionalmente substituída, aromática ou não aromática ou carbonila opcionalmente substituída.
[00184] Em algumas modalidades, R4 é opcionalmente fenila substituída. Em algumas modalidades, R4 é opcionalmente fenila substituída, em que pelo menos um substituinte é carbonila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, R4 é fenila opcionalmente substituída, em que pelo menos um substituinte é sulfonila opcionalmente substituída.
[00185] Tipicamente, o marcador luminescente compreende um composto aromático ou heteroaromático e pode ser um pireno, antraceno, naftaleno, acridina, estilbeno, indol, benzindol, oxazol, carbazol, tiazol, benzotiazol, fenantridina, fenoxazina, porfirina, quinolina, etídio, benzamida, cianina, carbocianina, salicilato, antranilato, cumarina, fluorosceína, rodamina ou outro composto similar. Os corantes exemplares incluem corantes xanteno, tais como corantes fluoresceína ou rodamina, incluindo 5-carboxifluoresceína (FAM), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE),tetraclorofluoresceína (TET), 6-carboxirodamina (R6G), N,N,N',N'- tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX). Os corantes exemplares também incluem corantes naftilamina que têm um grupo amino na posição alfa ou beta. Por exemplo, os compostos naftilamino incluem 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8-naftaleno sulfonato e 2-p-toluidinil-6-naftaleno sulfonato, ácido 5-(2'- aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS). Outros corantes exemplares incluem cumarinas, tais como 3-fenil-7-isocianatocumarina; acridinas, tais como 9-isotiocianatoacridina e laranja acridina; N-(p-(2- benzoxazolil)fenil)maleimida; cianinas, tais como indodicarbocianina 3 (Cy®3), (2Z)-2-[(E)-3-[3-(5-carboxipentil)-1,1-dimetil-6,8- dissulfobenzo[e]indol-3-ium-2-il]prop-2-enilideno]-3-etil-1,1-dimetil-8- (trioxidanilsulfanil)benzo[e]indol-6-sulfonato (Cy®3.5), 2-{2-[(2,5- dioxopirrolidin-1-il)oxi]-2-oxoetil}-16,16,18,18-tetrametil- 6,7,7a,8a,9,10,16,18- octaidrobenzo[2'',3'']indolizino[8'',7'':5',6']pirano[3',2':3,4]pirido[1,2- a]indol-5-io-14-sulfonato (Cy®3B), indodicarbocianina 5 (Cy®5), indodicarbocianina 5.5 (Cy®5.5), 3-(-carbóxi-pentil)-3'-etil-5,5'- dimetiloxacarbocianina (CyA); 1H,5H,11H,15H-Xanteno[2,3,4-ij:5,6,7- i'j']diquinolizin-18-o, 9-[2(ou 4)-[[[6-[2,5-dioxo-1-pirrolidinil)óxi]-6- oxoexil]amino]sulfonil]-4 (ou sal interno de (2)-sulfofenil]- 2,3,6,7,12,13,16,17-octaidro (TR ou Texas Red®); corantes BODIPY®; benzoxazois; estilbenos; pirenos; e similares.
[00186] Para o sequenciamento nucleotídico, certas combinações de nucleotídeos luminescentemente marcados podem ser preferidas. Em algumas modalidades, pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante cianina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo luminescentemente marcado compreende um corante rodamina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos cada de dois nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante cianina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos cada de dois nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante rodamina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos cada de três nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante cianina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos cada de três nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante rodamina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos cada de quatro nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante cianina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos cada de quatro nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante rodamina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, três nucleotídeos luminescentemente marcados compreendem um corante cianina ou análogo do mesmo e um quarto nucleotídeo luminescentemente marcado compreende um corante rodamina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, dois nucleotídeos luminescentemente marcados compreendem um corante cianina, ou análogo do mesmo, e um terceiro, e opcionalmente um quarto, nucleotídeo luminescentemente marcado compreende um corante rodamina ou análogo do mesmo. Em algumas modalidades, três nucleotídeos luminescentemente marcados compreendem um corante rodamina, ou análogo do mesmo, e um terceiro, e opcionalmente um quarto, nucleotídeo luminescentemente marcado compreende um corante cianina ou análogo do mesmo.
[00187] Em algumas modalidades, pelo menos um dos nucleotídeos marcados está ligado a dois ou mais corantes (por exemplo, duas ou mais cópias do mesmo corante e/ou dois ou mais corantes diferentes).
[00188] Em algumas modalidades, pelo menos dois nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem uma primeira energia de excitação, em que pelo menos um dos nucleotídeosluminescentemente marcados compreende um corante cianina, ou análogo do mesmo, e pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante rodamina, ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos dois nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem uma segunda energia de excitação, em que pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante cianina, ou análogo do mesmo, e pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante rodamina, ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos dois nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem uma primeira energia de excitação, em que pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante cianina, ou análogo do mesmo, e pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante rodamina, ou um análogo do mesmo, e pelo menos dois nucleotídeos adicionais luminescentemente marcados absorvem uma segunda energia de excitação, em que pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante cianina, ou análogo do mesmo, e pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados compreende um corante rodamina, ou um análogo do mesmo.
[00189] Em algumas modalidades, pelo menos dois nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem uma primeira energia de excitação, em que pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente de menos do que cerca de 1 ns, e pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente de mais do que 1 ns. Em algumas modalidades, pelo menos dois nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem uma segunda energia de excitação, em que pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente de menos do que cerca de 1 ns, e pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente de mais do que 1 ns. Em algumas modalidades, pelo menos dois nucleotídeos luminescentemente marcados absorvem uma primeira energia de excitação, em que pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente de menos do que cerca de 1 ns, e pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente de mais do que 1 ns, e pelo menos dois nucleotídeos luminescentemente marcados adicionais absorvem uma segunda energia de excitação, em que pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente de menos do que cerca de 1 ns, e pelo menos um dos nucleotídeos luminescentemente marcados tem um tempo de vida luminescente de mais do que 1 ns.
[00190] Em certas modalidades, o marcador luminescente é um corante selecionado da Tabela 1. Os corantes listados na Tabela 1 são não limitantes e os marcadores luminescentes do pedido podem incluir corantes não listados na Tabela 1. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de um ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados são selecionados da Tabela 1. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de quatro ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados são selecionados da Tabela 1.Tabela 1. Fluoróforos exemplares
[00191] Os corantes também podem ser classificados com base no comprimento de onda de absorbância máxima ou luminescência emitida. A Tabela 2 provê fluoróforos exemplares agrupados em colunas de acordo com o comprimento de onda aproximado de absorbância máxima. Os corantes listados na Tabela 2 são não limitantes e os marcadores luminescentes do pedido podem incluir corantes não listados na Tabela 2. A absorbância máxima exata ou o comprimento de onda de emissão podem não corresponder às faixas espectrais indicadas. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de um ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados são selecionados do grupo "Vermelho" listado na Tabela 2. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de um ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados são selecionados do grupo "Verde" listado na Tabela 2. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de um ou mais nucleotídeos luminescentemente marcados são selecionados do grupo "Amarelo/Laranja" listado na Tabela 2. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes dos quatro nucleotídeos são selecionados de forma que todos sejam selecionados de um dos grupos "Vermelho", "Amarelo/Laranja" ou "Verde" listados na Tabela 2. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes dos quatro nucleotídeos são selecionados de forma que três sejam selecionados de um primeiro grupo dos grupos "Vermelho", "Amarelo/Laranja" e "Verde" listados na Tabela 2, e o quarto seja selecionado de um segundo grupo dos grupos "Vermelho", "Amarelo/Laranja" e "Verde" listados na Tabela 2. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes dos quatro nucleotídeos são selecionados de forma que dois sejam selecionados de um primeiro dos grupos "Vermelho", "Amarelo/Laranja" e "Verde" listados na Tabela 2, e o terceiro e quarto sejam selecionados de um segundo grupo dos grupos "Vermelho", "Amarelo/Laranja" e "Verde" listados na Tabela 2. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes dos quatro nucleotídeos são selecionados de forma que dois sejam selecionados de um primeiro dos grupos "Vermelho", "Amarelo/Laranja" e "Verde" listados na Tabela 2 e um terceiro seja selecionado de um segundo grupo dos grupos "Vermelho", "Amarelo/Laranja" e "Verde" listados na Tabela 2 e um quarto seja selecionado de um terceiro grupo dos grupos "Vermelho", "Amarelo/Laranja" e "Verde" listados na Tabela 2.Tabela 2. Fluoróforos exemplares por faixa spectral
[00192] Em certas modalidades, o marcador luminescente pode ser (Corante 101), (Corante 102), (Corante 103), (Corante 104), (Corante 105) ou (Corante 106), de fórmulas (em forma de éster de NHS):
[00193] ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, cada sulfonato ou carboxilato é independentemente opcionalmente protonado. Em algumas modalidades, os corantes acima são ligados ao ligante ou nucleotídeo através de formação de uma ligação amida no ponto de ligação indicado.
[00194] Em certas modalidades, o marcador luminescente pode compreender um primeiro e um segundo cromóforo. Em algumas modalidades, um estado excitado do primeiro cromóforo é capaz de relaxamento através de uma transferência de energia para o segundo cromóforo. Em algumas modalidades, a transferência de energia é uma transferência de energia por ressonância Forster (FRET). Tal par de FRET pode ser útil para prover um marcador luminescente com propriedades que tornam o marcador mais fácil de diferenciar dentre uma pluralidade de marcadores luminescentes. Em certas modalidades, o par de FRET pode absorver energia de excitação em uma primeira faixa espectral e emitir luminescência em uma segunda faixa espectral.
[00195] Para um conjunto de moléculas luminescentemente marcadas (por exemplo, nucleotídeos luminescentemente marcados), as propriedades de um par de FRET luminescentemente marcado pode permitir a seleção de uma pluralidade de moléculas distinguíveis (por exemplo, nucleotídeos). Em algumas modalidades, o segundo cromóforo de um par FRET tem um tempo de vida luminescente distinto de uma pluralidade de outras moléculas luminescentemente marcadas. Em algumas modalidades, o segundo cromóforo de um par de FRET tem uma intensidade luminescente distinta de uma pluralidade de outras moléculas luminescentemente marcadas. Em algumas modalidades, o segundo cromóforo de um par de FRET tem tempo de vida luminescente e intensidade luminescente distintas de uma pluralidade de outras moléculas luminescentemente marcadas.Em algumas modalidades, o segundo cromóforo de um par de FRET emite fótons em uma faixa espectral distinta de uma pluralidade de outras moléculas luminescentemente marcadas. Em algumas modalidades, o primeiro cromóforo de um par de FRET tem um tempo de vida luminescente distinto de uma pluralidade de moléculas luminescentemente marcadas. Em certas modalidades, o par de FRET pode absorver energia de excitação em uma faixa espectral distinta de uma pluralidade de outras moléculas luminescentemente marcadas. Em certas modalidades, o par de FRET pode absorver energia de excitação na mesma faixa espectral que uma ou mais de uma pluralidade de outras moléculas luminescentemente marcadas.
[00196] Em algumas modalidades, dois ou mais nucleotídeos podem ser conectados a um marcador luminescente, em que os nucleotídeos são conectados a locais distintos no marcador luminescente. Um exemplo não limitante poderia incluir uma molécula luminescente que contém duas porções químicas reativas independentes (por exemplo, grupo azido, grupo acetileno, grupo carboxila, grupo amino) que são compatíveis com uma porção reativa em um análogo de nucleotídeo. Em uma modalidade do tipo, um marcador luminescente poderia ser conectado a duas moléculas nucleotídicas através de ligações independentes. Em algumas modalidades, um marcador luminescente pode compreender duas ou mais conexões independentes a dois ou mais nucleotídeos.
[00197] Em algumas modalidades, dois ou mais nucleotídeos podem ser conectados a um corante luminescente através de um ligante (por exemplo, um ligante ramificado ou um ligante com dois ou mais sítios reativos nos quais nucleotídeos e/ou corantes podem ser ligados). Consequentemente, em algumas modalidades, dois ou mais nucleotídeos (por exemplo, do mesmo tipo) podem ser ligados a dois ou mais corantes (por exemplo, do mesmo tipo).
[00198] Em algumas modalidades, um marcador luminescente pode compreender um ponto quântico com propriedades luminescentes. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos são conectados a um ponto quântico. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos são conectados a um ponto quântico através de conexões a sítios distintos da proteína. Em algumas modalidades, a superfície de um ponto quântico é revestida com moléculas nucleotídicas. Em certas modalidades, um ponto quântico é covalentemente conectado a um ou mais nucleotídeos (por exemplo, através de porções reativas em cada componente). Em certas modalidades, um ponto quântico é não covalentemente conectado a um ou mais nucleotídeos (por exemplo, através de contrapartes de ligação não covalentes compatíveis em cada componente). Em algumas modalidades, a superfície de um ponto quântico compreende uma ou mais moléculas de estreptavidina que são não covalentemente ligadas a um ou mais nucleotídeos biotinilados.
[00199] Em algumas modalidades, um marcador luminescente pode compreender uma proteína com propriedades luminescentes. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos são conectados a uma proteína luminescente. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos são conectados a uma proteína luminescente através de conexões a sítios distintos da proteína. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de quatro nucleotídeos são selecionados de forma que um nucleotídeo seja marcado com uma proteína fluorescente enquanto os três nucleotídeos restantes são marcados com corantes fluorescentes (por exemplo, os exemplos não limitantes nas Tabelas 1 e 2). Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de quatro nucleotídeos são selecionados de forma que dois nucleotídeos sejam marcados com proteínas fluorescentes enquanto os dois nucleotídeos restantes são marcados com corantes fluorescentes (por exemplo, os exemplos não limitantes nas Tabelas 1 e 2). Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de quatro nucleotídeos são selecionados de forma que três nucleotídeos sejam marcados com proteínas fluorescentes enquanto que o nucleotídeo restante é marcado com um corante fluorescente (por exemplo, os exemplos não limitantes nas Tabelas 1 e 2). Em algumas modalidades, os marcadores luminescentes de quatro nucleotídeos são selecionados de forma que todos os quatro nucleotídeos sejam marcados com proteínas fluorescentes.
[00200] De acordo com alguns aspectos do pedido, os marcadores luminescentes (por exemplo, corantes, por exemplo fluoróforos) podem danificar polimerases em uma reação de sequenciamento que é exposta à luz de excitação. Em alguns aspectos, este dano ocorre durante a incorporação de um nucleotídeo luminescentemente marcado, quando a molécula luminescente é mantida em grande proximidade com a enzima polimerase. Os exemplos não limitantes de reações danificadoras incluem a formação de uma ligação covalente entre a polimerase e a molécula luminescente e emissão de desintegração radioativa ou não radioativa a partir da molécula luminescente para a enzima. Isto pode encurtar a eficácia da polimerase e reduzir o comprimento de um sequenciamento.
[00201] Em algumas modalidades, um nucleotídeo e um marcador luminescente são conectados por um ligante relativamente longo ou configuração ligante para manter o marcador luminescente longe da polimerase durante a incorporação do nucleotídeo marcado. O termo "configuração ligante" é usado no presente documento para se referir à estrutura inteira conectando a(s) molécula(s) luminescente(s) ao(s) nucleotídeo(s) e não abrange a(s) molécula(s) luminescente(s) ou o(s) nucleotídeo(s).
[00202] Em algumas modalidades, um ligante único conecta uma molécula luminescente a um nucleotídeo. Em algumas modalidades, um ligante contém um ou mais pontos de divergência de modo que dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) nucleotídeos são conectados a cada molécula luminescente, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais) moléculas luminescentes são conectadas a cada nucleotídeo ou dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais) nucleotídeos são conectados a duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais) moléculas luminescentes.
[00203] Em algumas modalidades, a configuração do ligante determina a distância entre o marcador luminescente e o nucleotídeo. Em algumas modalidades, a distância é de cerca de 1 nm ou 2 nm a cerca de 20 nm. Por exemplo, mais do que 2 nm, mais do que 5 nm, 510 nm, mais do que 10 nm, 10-15 nm, mais do que 15 nm, 15-20 nm, mais do que 20 nm. No entanto, a distância entre o marcador luminescente e o nucleotídeo não pode ser muito longa já que o marcador luminescente precisa estar dentro do volume de iluminação a ser excitado quando o nucleotídeo é mantido dentro do sítio ativo da enzima. Consequentemente, em algumas modalidades, o comprimento ligante total é de menos do que 30 nm, menos do que 25 nm, em torno de 20 nm, ou menos do que 20 nm.
[00204] Em algumas modalidades, uma molécula protetora está incluída dentro de uma configuração de ligante. Uma molécula protetora pode ser uma proteína, homodímero de proteína,heterodímero de proteína, oligômero de proteína, um polímero ou outra molécula que possa proteger a polimerase das reações danificadoras que podem ocorrer entre a enzima e o marcador luminescente. Os exemplos não limitantes de moléculas protetoras incluem proteínas (por exemplo, avidina, estreptavidina, Traptavidina, NeutrAvidina, ubiquitina), complexos de proteína (por exemplo, Trypsin:BPTI, barnase:barstar, colicin E9 nuclease: proteína de imunidade Im9), ácidos nucleicos (por exemplo, ácido desoxirribonucleico, ácido ribonucleico), polissacarídeos, lipídios e nanotubos de carbono.
[00205] Em algumas modalidades, a molécula protetora é um oligonucleotídeo (por exemplo, um oligonucleotídeo de DNA, um oligonucleotídeo de RNA ou uma variante do mesmo). Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é de filamento único. Em algumas modalidades, um marcador luminescente está ligado diretamente ou indiretamente a uma extremidade do oligonucleotídeo de filamento único (por exemplo, a extremidade 5' ou a extremidade 3') e um ou mais nucleotídeos são ligados diretamente ou indiretamente a outra extremidade do oligonucleotídeo de filamento único (por exemplo, a extremidade 3' ou a extremidade 5'). Por exemplo, o oligonucleotídeo de filamento único pode compreender um marcador luminescente ligado à extremidade 5' do oligonucleotídeo e um ou mais nucleotídeos ligados à extremidade 3' do oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo é de filamento duplo (por exemplo, o oligonucleotídeo compreende dois filamentos de oligonucleotídeo complementares anelados). Em algumas modalidades, um marcador luminescente está ligado diretamente ou indiretamente a uma extremidade do oligonucleotídeo de filamento duplo e um ou mais nucleotídeos são ligados diretamente ou indiretamente a outra extremidade do nucleotídeo de filamento duplo. Em algumas modalidades, um marcador luminescente está ligado diretamente ou indiretamente a um filamento do oligonucleotídeo de filamento duplo e um ou mais nucleotídeos são ligados diretamente ou indiretamente ao outro filamento do nucleotídeo de filamento duplo. Por exemplo, o oligonucleotídeo de filamento duplo pode compreender um marcador luminescente ligado à extremidade 5' de um filamento do oligonucleotídeo e um ou mais nucleotídeos ligados à extremidade 5' do outro filamento.
[00206] Em algumas modalidades, uma molécula protetora é conectada a uma ou mais moléculas luminescentes e a uma ou mais moléculas nucleotídicas. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) luminescente(s) não estão adjacentes ao(s) nucleotídeo(s). Por exemplo, uma ou mais moléculas luminescentes podem ser conectadas em um primeiro lado de uma molécula protetora e um ou mais nucleotídeos podem ser conectados a um segundo lado de uma molécula protetora, em que o primeiro e o segundo lado de uma molécula protetora estão distantes um do outro. Em algumas modalidades, eles estão em lados aproximadamente opostos de uma molécula protetora.
[00207] A distância entre o ponto no qual uma molécula protetora está conectada a um marcador luminescente e o ponto no qual uma molécula protetora é conectada a um nucleotídeo pode ser uma medição linear através do espaço ou uma medição não linear ao longo da superfície de uma molécula protetora. A distância entre o marcador luminescente e pontos de conexão de nucleotídeo em uma molécula protetora pode ser medida através da modelagem da estrutura tridimensional de uma molécula protetora. Em algumas modalidades, esta distância pode ser de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 nm ou mais. Alternadamente, as posições relativas do marcador luminescente e nucleotídeo em uma molécula protetora podem ser descritas através do tratamento da estrutura de uma molécula protetora como uma superfície quadrática (por exemplo, elipsoide, cilindro elíptico). Em algumas modalidades, o marcador luminescente e o nucleotídeo são separados por uma distância que é pelo menos um oitavo da distância em torno de um formato elipsoidal representando uma molécula protetora. Em algumas modalidades, o marcador luminescente e o nucleotídeo são separados por uma distância que é pelo menos um quarto da distância em torno de um formato elipsoidal representando uma molécula protetora. Em algumas modalidades, o marcador luminescente e o nucleotídeo são separados por uma distância que é pelo menos um terço da distância em torno de um formato elipsoidal representando uma molécula protetora. Em algumas modalidades, o marcador luminescente e o nucleotídeo são separados por uma distância que é metade da distância em torno de um formato elipsoidal representando uma a molécula protetora.
[00208] A Figura 10 ilustra um exemplo não limitante 10-1 da molécula luminescente (200) separada de um nucleotídeo (250) por uma molécula protetora (100). A molécula luminescente (200) é conectada a uma molécula protetora (100) através de um ligante (300), em que o ligante (300) está ligado a uma molécula protetora (100). O nucleotídeo (250) está conectado a uma molécula protetora (100) através de um ligante (350), em que o ligante (350) está ligado a uma molécula protetora (100). As moléculas protetoras podem ser úteis para prover uma barreira estérica que previne que um marcador luminescente chegue próximo à polimerase. As moléculas protetoras podem ser úteis para absorver ou proteger a polimerase da desintegração radiativa e não radiativa emitida pela molécula luminescente. As moléculas protetoras podem ser úteis para prover tanto uma barreira estérica quanto uma barreira de desintegração entre o marcador luminescente e a polimerase.
[00209] O tamanho de uma molécula protetora deve ser tal que um marcador luminescente seja incapaz ou improvável em contatar diretamente a polimerase quando um nucleotídeo é mantido dentro do sítio ativo da enzima. O tamanho de uma molécula protetora também deve ser tal que um marcador luminescente ligado esteja dentro do volume de iluminação a ser excitado quando um nucleotídeo é mantido dentro do sítio ativo da enzima. O tamanho de uma molécula protetora deve ser escolhido com consideração ao ligante que é selecionado para conectar um marcador luminescente a uma molécula protetora e o ligante que é selecionado para conectar um nucleotídeo a uma molécula protetora. A molécula protetora e os ligantes usados para conectar o marcador luminescente e o nucleotídeo (por exemplo, polifosfato de nucleosídeo) compreendem a configuração do ligante, em que o tamanho da configuração do ligante deve ser tal que o marcador luminescente seja incapaz de contatar diretamente a polimerase quando o nucleotídeo é mantido dentro do sítio ativo da enzima.
[00210] A molécula protetora (e/ou a configuração do ligante compreendendo a molécula protetora) é preferivelmente hidrossolúvel. Em algumas modalidades, é preferível que a molécula protetora (e/ou a configuração do ligante compreendendo a molécula protetora) tenha uma carga negativa concreta.
[00211] Em algumas modalidades, o label (por exemplo, a molécula luminescente) não é covalentemente ligado ao nucleotídeo devido a uma ou mais ligações não covalentes conectando o marcador ao nucleotídeo. Em algumas modalidades, um ou mais ligantes são não covalentemente ligados a uma molécula protetora e/ou à(s) molécula(s) luminescente(s). Em algumas modalidades, um ou mais ligantes são não covalentemente ligados a uma molécula protetora e/ou aos nucleotídeos. Em algumas modalidades, um marcador luminescente é covalentemente ligado a um ligante, em que o ligante é não covalentemente ligado a uma molécula protetora (por exemplo, através de um ou mais parceiros de ligação). Em algumas modalidades, um nucleotídeo é covalentemente ligado a um ligante, em que o ligante é não covalentemente ligado a uma molécula protetora (por exemplo, através de um ou mais parceiros de ligação).
[00212] As Figuras 10-15 ilustram exemplos não limitantes de uma ou mais moléculas luminescentes e um ou mais nucleotídeos conectados através de uma molécula protetora, em que uma ou mais moléculas luminescentes e um ou mais nucleotídeos são não covalentemente ligados a uma molécula protetora.
[00213] A Figura 10 ilustra um exemplo não limitante 10-2 que compreende os elementos de 10-1, em que um ligante compreende um ligante de ligação não covalente (400) que liga não covalentemente a molécula luminescente a um sítio de ligação não covalente (110) de uma molécula protetora (formato sombreado) e um segundo ligante compreende um ligante de ligação não covalente (450) que liga não covalentemente um nucleotídeo a um segundo sítio de ligação não covalente (120) da molécula protetora.
[00214] A Figura 10 ilustra um exemplo não limitante 10-3 que compreende os elementos de 10-2, em que uma molécula protetora (formato sombreado) compreende quatro sítios de ligação não covalentes independentes. Uma segunda molécula luminescente independente pode ser não covalentemente ligada a um sítio de ligação não covalente (111) da molécula protetora através de um ligante de ligação não covalente (401). Uma segunda molécula nucleotídica independente pode ser não covalentemente ligada a um sítio de ligação não covalente (121) da molécula protetora através de um ligante de ligação não covalente (451). Nesta modalidade, representar duas moléculas luminescentes independentes e dois nucleotídeos independentes não covalentemente ligados em quatro sítios de ligação não covalentes independentes de uma molécula protetora, o número de moléculas luminescentes e nucleotídeos foram arbitrariamente escolhidos. Em algumas modalidades, os quatro sítios de ligação não covalentes independentes de uma molécula protetora compreendem uma molécula luminescente em um sítio e um nucleotídeo em cada um dos três sítios restantes. Em algumas modalidades, os quatro sítios de ligação não covalentes independentes de uma molécula protetora compreendem um nucleotídeo em um sítio e uma molécula luminescente em cada um dos três sítios restantes.
[00215] A Figura 10 ilustra um exemplo não limitante 10-4 que compreende os elementos de 10-3, em que um ligante (301) compreende dois ligantes de ligação não covalente independentes (400, 401) que ligam não covalentemente uma molécula luminescente única através de dois sítios de ligação não covalentes independentes de uma molécula protetora (formato sombreado) e um ligante (351) compreende dois ligantes de ligação não covalente independentes (450, 451) que ligam não covalentemente um nucleotídeo único através dos dois sítios de ligação não covalentes independentes restantes da molécula protetora.
[00216] A Figura 11 ilustra um exemplo não limitante 11-1 que compreende os elementos de 10-4, em que o ligante (301) compreende um ponto de divergência (302) que permite a ligação de duas moléculas luminescentes.
[00217] A Figura 11 ilustra um exemplo não limitante 11-2 que compreende os elementos de 11-1, em que o ligante (351) compreende um ponto de divergência (352) que permite a ligação de dois nucleotídeos.
[00218] A Figura 11 ilustra um exemplo não limitante 11-3 que compreende os elementos de 11-2, em que o ligante (302) compreende dois pontos de divergência adicionais (304) que permitem a ligação de quatro moléculas luminescentes e o ligante (352) compreende dois pontos de divergência adicionais (354) que permitem a ligação de quatro nucleotídeos.
[00219] A Figura 11 ilustra a exemplo não limitante 11-4 que compreende os elementos de 11-3, em que cada ponto de divergência representado em (304) compreende uma porção de ligação adicional que permite a ligação de uma molécula luminescente adicional para um total de seis moléculas luminescentes e cada ponto de divergência representado em (354) compreende uma porção de ligação adicional que permite a ligação de um nucleotídeo adicional para um total de seis nucleotídeos.
[00220] A Figura 12 ilustra um exemplo não limitante de um conjunto de moléculas nucleotídicas marcadas que podem ser usadas na reação de sequenciamento: timina 12-1, adenina 12-2, citosina 123, e guanina 12-4. Nesta modalidade, uma molécula protetora compreendendo quatro sítios de ligação não covalentes é usada para conectar seis do mesmo tipo de nucleotídeo a uma ou mais moléculas luminescentes. Nesta modalidade, seis do mesmo tipo de nucleotídeo são ligados a uma molécula protetora através de dois ligantes separados, cada ligante compreendendo um ligante de ligação não covalente independente que é covalentemente ligado a três do mesmo tipo de nucleotídeo. Conforme representado por 12-1, 12-2 e 12-3, uma molécula luminescente única é não covalentemente ligada a uma molécula protetora através de um ligante compreendendo dois ligantes de ligação não covalentes independentes que não covalentemente se ligam a dois sítios de ligação independentes da molécula protetora. Conforme representado em 12-4, um ponto de divergência no ligante luminescente permite a adição de uma segunda molécula luminescente.
[00221] Em um experimento de sequenciamento compreendendo os quatro nucleotídeos exemplares, os marcadores luminescentes de 12-1, 12-2 e 12-3 podem compreender três moléculas luminescentes únicas (por exemplo, três fluoróforos diferentes). Já que essas moléculas exemplificadoras contêm cada uma um único fluoróforo, as propriedades (por exemplo, tempo de vida luminescente, intensidade luminescente, comprimento de onda da emissão) usadas para se distinguir dentre a incorporação de timina, adenina ou citosina deveriam ser altamente similares ou indistinguíveis caso fluoróforos únicos não sejam usados. A Guanina 12-4 é conectada a duas moléculas luminescentes. Em algumas modalidades, o marcador luminescente de 12-4 pode compreender duas da mesma molécula luminescente, em que a molécula selecionada é diferente dos fluoróforos usados em 12-1, 12-2 e 12-3. Em uma reação de sequenciamento compreendendo quatro nucleotídeos únicos conectados a quatro fluoróforos únicos, cada fluoróforo deve ter uma ou mais propriedades luminescentes únicas (por exemplo, tempo de vida luminescente, intensidade, comprimento de onda de emissão, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos) que permitem que cada um seja distinguido dentre a pluralidade. Em algumas modalidades, os dois fluoróforos de 12-4 podem compreender dois do mesmo fluoróforo, em que o fluoróforo selecionado é idêntico a um dos fluoróforos de 12-1, 12-2 e 12-3. Na reação de sequenciamento compreendendo nucleotídeos únicos conectados a um número diferente da mesma molécula luminescente, o número diferente de fluoróforos deve conferir propriedades únicas (por exemplo, intensidade luminescente aumentada) para permitir que um nucleotídeo seja distinguido dentre a pluralidade. Os dois fluoróforos de 12-4 podem alternadamente compreender um par FRET.
[00222] A Figura 12 ilustra ainda um exemplo não limitante de um experimento sequenciador e como propriedades luminescentes únicas podem ser usadas para distinguir dentre uma pluralidade de nucleotídeos luminescentemente marcados 12-5. O marcador luminescente conectado a cada base (timina, adenina, citosina, guanina) tem propriedades luminescentes (por exemplo, tempo de vida luminescente, intensidade luminescente, e/ou comprimento de onda de emissão) que permitem que cada nucleotídeo marcado seja distinguido a partir da pluralidade de nucleotídeos marcados. A inclusão de múltiplos nucleotídeos do mesmo tipo funciona para acelerar as taxas de incorporação na reação de sequenciamento.
[00223] Um experimento de sequenciamento utilizando os nucleotídeos luminescentemente marcados 12-5 pode ser conduzido em recipiente de reação exemplar 12-6. A reação acontece em uma câmara acima do guia de onda, que serve como um condutor para energia de excitação, transmitindo a energia de excitação para amostra no fundo da câmara de reação através da onda evanescente a partir da guia de onda. A abertura bloqueia a luz irradiando do guia de onda para a amostra de volume e ambiente e/ou luz dispersa a partir do sensor, assim como provendo um curso de fabricação para a câmara de reação. A câmara de reação é uma estrutura gravada que coloca a amostra no fundo e dentro de uma região de alta excitação a partir da onda evanescente da guia de onda. Química de superfície seletiva é usada para prover o fundo e a parede lateral da câmara de reação com composição diferente, de modo que a amostra possa ser seletivamente localizada no fundo da câmara de reação. Um fluxo de trabalho exemplar para a preparação da superfície é mostrado na Figura 7, o qual representa um processo compreendendo, inter alia, processos relacionados a alcançar química de superfície seletiva. Por exemplo, a passivação de superfícies (por exemplo, conforme representado na modalidade não limitante mostrada na Figura 8) pode prover um substrato de superfície seletiva que será útil durante a funcionalização da superfície (por exemplo, conforme representado na modalidade não limitante mostrada na Figura 9).
[00224] A incorporação de um nucleotídeo específico pode ser distinguida dentre quatro nucleotídeos luminescentemente marcados durante a reação de sequenciamento pelo fluxo de trabalho exemplar 12-7. Ao longo do curso de um experimento, existem dois períodos distintos: um período de pulso e um período de detecção. Durante o período de pulso, que dura 20 picossegundos, nenhuma luz de emissão é coletada. Em seguida ao período de pulso acontece o período de detecção, que dura 10 nanossegundos, em que quatro eventos de emissão de agrupamento de tempo que ocorrem durante o período de detecção (i). Um período de pulso e um período de detecção compreendem um ciclo. Os eventos de emissão são continuamente agrupados e acumulados durante o curso de 1 milhão de ciclos (ii). A distribuição total de eventos de emissão ao longo dos agrupamentos é representativa de tempo de vida luminescente e pode ser usada para combinar um conjunto específico de dados em uma distribuição de tempo de vida conhecida (iii). Em algumas modalidades, a distribuição de eventos de emissão (por exemplo, tempo de vida luminescente) não distingue uma base luminescentemente marcada de uma pluralidade de outras moléculas marcadas. Além da distribuição dos eventos de emissão, a quantidade de eventos de emissão (por exemplo, intensidade luminescente) pode ser usada para identificar uma molécula única a partir de uma pluralidade de outras.
[00225] A Figura 13 ilustra um exemplo não limitante 13-1 que compreende os elementos de 10-4, em que um sítio de ligação não covalente da molécula protetora é engenheirado para ser um sítio de ligação não operante (461). Em algumas modalidades, a molécula protetora de 13-1 pode compreender estreptavidina. Em algumas modalidades, o sítio de ligação é não funcional devido a uma incapacidade em ligar não covalentemente uma molécula de biotina. A modalidade não limitante 13-1 representa uma molécula luminescente única ligada a uma molécula protetora através de duas interações de ligação independentes não covalentes e seis nucleotídeos ligados a uma molécula protetora através de uma interação de ligação não covalente única. Em algumas modalidades, uma molécula protetora com três sítios de ligação funcionais não covalentes pode compreender uma ou mais moléculas luminescentes ligadas através de uma interação não covalente única e um ou mais nucleotídeos ligados através de duas interações independentes não covalentes. Em algumas modalidades, uma molécula protetora com três sítios de ligação funcionais não covalentes pode compreender uma ou mais moléculas luminescentes ligadas através de duas interações independentes não covalentes e um ou mais nucleotídeos ligados através de uma interação não covalente única.
[00226] A Figura 13 ilustra um exemplo não limitante 13-2 que compreende os elementos de 10-3, em que dois sítios de ligação não covalentes da molécula protetora são engenheirados para serem sítios de ligação não operantes (411, 461). Em algumas modalidades, a molécula protetora de 13-2 pode compreender estreptavidina. Em algumas modalidades, os sítios de ligação são não funcionais devido a uma incapacidade a se ligar não covalentemente a uma molécula de biotina. A modalidade não limitante 13-2 representa uma molécula luminescente única ligada a uma molécula protetora através de uma única interação de ligação independente não covalente e seis nucleotídeos ligados a uma molécula protetora através de uma interação de ligação não covalente única. Em algumas modalidades, uma molécula protetora com dois sítios de ligação funcionais não covalentes pode compreender uma ou mais moléculas luminescentes ligadas através de uma interação não covalente única e um ou mais nucleotídeos ligados através de uma interação não covalente única. Em algumas modalidades, os dois sítios de ligação não covalentes não funcionais são sítios de ligação cis ou sítios de ligação trans, em que os "sítios de ligação cis" são definidos como em maior proximidade do que os "sítios de ligação trans". A Figura 13 também representa um exemplo não limitante 13-3 da geração de uma molécula de estreptavidina com dois sítios de ligação trans não funcionais.
[00227] Em algumas modalidades, um ligante pode ser compreendido de nucleotídeos. A Figura 14 ilustra um esquema de reação exemplar não limitante no qual uma molécula luminescente e um nucleotídeo estão conectados através de uma molécula protetora, em que os ligantes ligando a molécula luminescente e o nucleotídeo a uma molécula protetora compreendem oligonucleotídeos (por exemplo, oligonucleotídeos compreendendo DNA, RNA, PNA ou formas modificadas dos mesmos) ligados através de ligantes divalentes. Um ligante divalente (360) que é compreendido de um oligonucleotídeo é não covalentemente ligado a dois sítios de ligação não covalentes independentes de uma molécula protetora (a). A molécula luminescente (201) fundida a um oligonucleotídeo complementar ao ligante (360) é introduzida para gerar uma molécula protetora luminescentemente marcada (b). Um segundo ligante divalente (361) que é compreendido de um oligonucleotídeo é introduzido para formar (c). Um nucleotídeo (251) fundido a um oligonucleotídeo complementar ao ligante (361) é introduzido para gerar o produto final (d).
[00228] A Figura 15 ilustra um esquema de reação exemplar não limitante no qual a molécula luminescente está ligada a uma molécula protetora através de oligonucleotídeos anelados complementares, em que cada filamento de oligonucleotídeo contém um ligante de ligação não covalente compatível com um sítio de ligação em uma molécula protetora. Um primeiro oligonucleotídeo (362) que é fundido a uma molécula luminescente e ligante de ligação não covalente é anelado (i) a um oligonucleotídeo complementar (363) que é fundido a um ligante de ligação não covalente. O produto anelado (364) é ligado a uma molécula protetora (ii) e purificado. A molécula protetora purificada luminescentemente marcada é ligada com nucleotídeos (iii) usando quaisquer técnicas ou configurações reveladas no presente documento. A Figura 15 também representa um experimento sequenciador exemplar realizado usando um nucleotídeo que foi marcado com um corante Cy®3 usando um ligante de DNA duplex análogo ao exemplo não limitante no esquema de reação.
[00229] Em algumas modalidades, um ou mais ligantes são covalentemente ligados a uma molécula protetora e/ou a molécula(s) luminescente(s). Em algumas modalidades, um ou mais ligantes são covalentemente ligados a uma molécula protetora e/ou o(s) nucleotídeo(s).
[00230] As Figuras. 16-20 ilustram exemplos não limitantes de uma molécula luminescente e um nucleotídeo conectado através de uma molécula protetora, em que a molécula luminescente e o nucleotídeo são covalentemente ligados a uma molécula protetora.
[00231] A Figura 16 representa um esquema de reação 16-1 para gerar uma molécula protetora genérica (formato sombreado), em que a molécula protetora compreende dois tags geneticamente codificados. Um tag geneticamente codificado (325) é projetado para formar uma ligação covalente a um grupo reativo específico fundido a uma molécula luminescente (i) e um tag geneticamente codificado separado (375) é projetado para formar uma ligação covalente a um grupo reativo específico fundido a um nucleotídeo (ii) para formar o produto final (c). A Figura 16 ainda representa uma modalidade não limitante de um esquema 16-2 para a ligação covalente de um substrato genérico compreendendo um grupo funcional bioortogonal (formato de estrela) tal como uma azida, aldeído, ou alcina, através de um tag geneticamente codificado (linha curvada), junto com os exemplos não limitantes 16-3 de tags geneticamente codificados e constantes de taxa cinética.
[00232] A Figura 17 representa um exemplo não limitante de um esquema de reação 17-1 para gerar a molécula protetora genérica (formato sombreado), em que a molécula protetora é uma proteína que compreende um grupo reativo no N-terminal e um grupo reativo no C- terminal. Um primeiro grupo reativo em um primeiro terminal da proteína (326) é projetado para formar uma ligação covalente a um grupo reativo específico fundido a uma molécula luminescente. Um segundo grupo reativo do terminal da proteína restante (376) é projetado para formar uma ligação covalente a um grupo reativo específico fundido a um nucleotídeo. Os exemplos não limitantes 17-2 de grupos N-terminal e C-terminal reativos e os grupos reativos correspondentes também são representados.
[00233] A Figura 18 representa um exemplo não limitante de um esquema de reação 18-1 para gerar a molécula protetora genérica (formato sombreado), em que a molécula protetora é uma proteína que compreende um aminoácido reativo não natural em uma parte da proteína e um aminoácido reativo não natural em uma outra parte da proteína. Um primeiro aminoácido reativo não natural em uma primeira parte da proteína (327) é protejato para formar uma ligação covalente a um grupo reativo específico fundido a uma molécula luminescente. Um segundo aminoácido reativo não natural em uma segunda parte da proteína (377) é projetado para formar uma ligação covalente a um grupo reativo específico fundido a um nucleotídeo. A Figura 18 ainda representa um esquema genérico e não limitante 182 para a marcação química de uma proteína alvo. Neste exemplo, um aminoácido não natural (por exemplo, um aminoácido não natural selecionado a partir de exemplos não limitantes 18-3) carregando uma funcionalidade única biortogonal é introduzido especificamente no sítio em uma proteína através da expansão do código genético e depois quimiosseletivamente marcado com uma sonda externamente adicionada.
[00234] A Figura 19A é um exemplo não limitante de uma molécula luminescente e um nucleotídeo separado por uma molécula protetora não proteína (101). Os exemplos não limitantes da molécula protetora não proteínas podem incluir moléculas de ácido nucleico (ácido desoxirribonucleico, ácido ribonucleico), lipídios e nanotubos de carbono. Conforme mostrado, a molécula luminescente e o nucleotídeo são ligados diretamente à molécula protetora não proteína (por exemplo, covalentemente ligados). Em algumas modalidades, a molécula luminescente e o nucleotídeo são ligados diretamente a uma parte contígua da molécula protetora não proteína. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula protetora não proteína é uma molécula de ácido nucleico, e a molécula luminescente e/ou nucleotídeo são ligados diretamente a um nucleotídeo da molécula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a molécula luminescente e/ou nucleotídeo são ligados à molécula protetora não proteína através de um ligante que não é uma parte contígua da molécula protetora não proteína. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula protetora não proteína é uma molécula de ácido nucleico, e a molécula luminescente e/ou nucleotídeo são ligados ao ácido nucleico através de um ligante.
[00235] Em algumas modalidades, a molécula luminescente e o nucleotídeo podem ser ligados à molécula protetora não proteína através de porções reativas, conforme representado na Figura 19B. Neste exemplo, a porção reativa 550 na molécula luminescente é covalentemente ligada à molécula protetora não proteína através de uma porção reativa correspondente 500 na molécula protetora não proteína. A porção reativa 551 no nucleotídeo é covalentemente ligada à molécula protetora não proteína 101 através de uma porção reativa correspondente 501 na molécula protetora não proteína. Em algumas modalidades, a porção reativa 500 e/ou a porção reativa 501 são ligadas diretamente a uma parte contígua da molécula protetora não proteína. Em algumas modalidades, a porção reativa 500 e/ou a porção reativa 501 são ligadas à molécula protetora não proteína através de um ligante que não é uma parte contígua da molécula protetora não proteína.
[00236] Em algumas modalidades, uma molécula protetora é compreendida de um par proteína-proteína. Um par proteína-proteína pode compreender qualquer conjunto de contrapartes de ligação de polipeptídeo (por exemplo, receptor de proteína, inibidor de enzima, anticorpo-antígeno). A Figura 20 representa uma modalidade não limitante de uma molécula protetora compreendida de um par de ligação proteína-proteína. Neste exemplo não limitante, um polipeptídeo 102 do par de ligação é ortogonalmente marcado com moléculas luminescentes e um segundo polipeptídeo 103 é ortogonalmente ligado a um nucleotídeo. Os exemplos não limitantes de pares de ligação proteína-proteína incluem Tripsin-BPTI, barnase- barstar, e proteína de imunidade colicina E9 nuclease-Im9.
[00237] A Figura 21 representa exemplos não limitantes de configurações ligantes compreendendo uma ou mais moléculas luminescentes ligadas a um ligante de ligação não covalente. Em uma modalidade 21-1, a primeira camada ligante compreendendo um ligante de ligação não covalente 410, ligante espaçador 310 e porção reativa 510 está ligada a uma molécula luminescente 210 compreendendo uma porção reativa compatível 211. A porção reativa da primeira camada ligante pode ser usada para ligar diretamente a uma molécula luminescente ou nucleotídeo através de uma porção reativa compatível. A porção reativa da primeira camada ligante pode ser usada para ligar uma segunda camada ligante através de uma porção reativa compatível. Em uma modalidade 21-2, duas moléculas luminescentes são ligadas à primeira camada ligante através de uma segunda camada ligante, em que a segunda camada ligante compreende a porção reativa compatível com a porção reativa da primeira camada, um ligante espaçador compreendendo um ponto de divergência 312, e duas porções reativas 522 compatíveis com a porção reativa da molécula luminescente. As duas porções reativas da segunda camada ligante podem ser usadas para ligar diretamente a moléculas luminescentes ou nucleotídicas. As duas porções reativas da segunda camada ligante podem ser usadas para ligar uma terceira camada ligante a ainda aumentar o número de moléculas luminescentes ou nucleotídeos compreendendo uma configuração ligante. Em uma modalidade 21-3, seis moléculas luminescentes são ligadas à segunda camada ligante através de uma terceira camada ligante ligada em cada porção reativa 522, em que cada terceira camada ligante compreende uma porção reativa compatível 513, um ligante espaçador que é trifuncionalizado 313, e três moléculas reativas 523 compatíveis com as porções reativas das moléculas luminescentes.
[00238] Consequentemente, um marcador luminescente pode ser ligado à molécula diretamente, por exemplo, através de uma ligação, ou pode ser ligado através de um ligante ou uma configuração ligante. Em certas modalidades, o ligante compreende um ou mais fosfatos. Em algumas modalidades, um nucleotídeo é conectado a um marcador luminescente por um ligante compreendendo um ou mais fosfatos. Conforme usado no presente documento, um ligante descrito como tendo um ou mais fosfatos se refere a um ligante que compreende um ou mais fosfatos presentes dentro da estrutura do ligante e não diretamente ligado a um ou mais fosfatos de um nucleotídeo. Em algumas modalidades, um nucleotídeo é conectado a um marcador luminescente por um ligante compreendendo três ou mais fosfatos. Em algumas modalidades, um nucleotídeo é conectado a um marcador luminescente por um ligante compreendendo quatro ou mais fosfatos.
[00239] Em certas modalidades, um ligante compreende uma cadeia alifática. Em algumas modalidades um ligante compreende -(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 20, inclusive. Em algumas modalidades, n é um número inteiro de 1 a 10, inclusive. Em certas modalidades, um ligante compreende uma cadeia heteroalifática. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma porção polietileno glicol. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma porção polipropileno glicol. Em algumas modalidades, um ligante compreende -(CH2CH2O)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 20, inclusive. Em algumas modalidades, um ligante compreende -(CH2CH2O)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 10, inclusive. Em certas modalidades, um ligante compreende -(CH2CH2O)4-. Em certas modalidades, um ligante compreende um ou mais arilenos. Em algumas modalidades, um ligante compreende um ou mais fenilenos (por exemplo, fenileno para-substituído). Em certas modalidades, um ligante compreende um centro quiral. Em algumas modalidades, um ligante compreende prolina, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, um ligante compreende um hexâmero de prolina, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, um ligante compreende cumarina, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, um ligante compreende naftaleno, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, um ligante compreende antraceno, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma polifenilamida, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, um ligante compreende cromanona, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, um ligante compreende 4-aminopropargil-L-fenilalanina, ou um derivado do mesmo. Em certas modalidades, um ligante compreende um polipeptídeo.
[00240] Em algumas modalidades, um ligante compreende um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um ligante compreende dois oligonucleotídeos anelados. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ou oligonucleotídeos compreendem desoxirribose nucleotídeos, ribose nucleotídeo, ou ribose nucleotídeos presos.
[00241] Em certas modalidades, um ligante compreende um fotoestabilizador. Em algumas modalidades, o ligante é de fórmula:em que PS é um fotoestabilizador, a posição marcada d está ligada a um marcador luminescente e a posição marcada b está ligada a um nucleotídeo. Em algumas modalidades, a posição marcada d está ligada a um marcador luminescente por um ligante conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a posição marcada b está ligada a um nucleotídeo por um ligante conforme descrito no presente documento.
[00242] Em certas modalidades, um ligante compreende um ou mais fosfatos, uma cadeia alifática, uma cadeia heteroalifática, e uma ou mais amidas (por exemplo, -C(=O)NH-). Em certas modalidades, um ligante compreendendo um ou mais fosfatos e uma cadeia alifática podem ser sintetizados através do esquema de reação exemplificadora 22-1 representado na Figura 22. As estruturas ligantes exemplificadoras são ainda representadas em 22-2 e 22-3. Em certas modalidades, um ligante é selecionado a partir de ligantes representados na Tabela 3. Certas estruturas ligantes exemplificadoras na Tabela 3 são mostradas ligadas a nucleotídeos (por exemplo, hexafosfato de nucleosídeo) e/ou corantes.Tabela 3. Ligantes exemplares ou combinação de ligante/corante
[00243] Em certas modalidades, um ligante compreende um ou mais fosfatos, uma cadeia alifática, uma cadeia heteroalifática, uma ou mais amidas (por exemplo, -C(=O)NH-) e uma ou mais porções de biotina. Em certas modalidades, um ligante biotinilado contém uma ou mais porções reativas, funcionalizáveis (por exemplo, grupo acetileno, grupo azido). Em certas modalidades, um ligante é selecionado a partir dos ligantes não limitantes representados na Tabela 4. Certas estruturas ligantes exemplificadoras na Tabela 4 são mostradas ligadas a nucleotídeos (por exemplo, hexafosfato de nucleosídeo).Tabela 4. Ligantes biotinilados exemplars
[00244] Em algumas modalidades, um ligante é sintetizado a partir de precursores compreendendo uma primeira camada e opcionalmente uma segunda e/ou terceira camada. Em algumas modalidades, uma "primeira camada" contém uma ou mais porções de biotina. Em certas modalidades, a primeira camada de um ligante contém uma única porção de biotina. Em certas modalidades, a primeira camada de um ligante contém duas porções de biotina. Em algumas modalidades, uma primeira camada contém uma ou mais porções reativas (por exemplo, grupo azido, grupo acetileno, grupo carboxila, grupo amino). Em algumas modalidades, a primeira camada de um ligante é selecionada das estruturas representadas na Tabela 5. Tabela 5. Primeiras camadas ligantes exemplars
[00245] Em algumas modalidades, a primeira camada de um ligante pode ser sintetizada de acordo com o esquema de reação exemplar que segue:
[00246] Em modalidades adicionais, a primeira camada de um ligante pode ser sintetizada de acordo com o esquema de reação exemplar que segue:
[00247] Em ainda outras modalidades adicionais, a primeira camada de um ligante pode ser sintetizada de acordo com o esquema de reação exemplar que segue:
[00248] Em algumas modalidades, a "segunda camada" contém uma ou mais porções reativas (por exemplo, grupo azido, grupo acetileno, grupo carboxila, grupo amino). Em algumas modalidades, uma segunda camada é covalentemente ligada a uma primeira camada de um ligante. Em algumas modalidades, uma segunda camada covalentemente conecta uma primeira camada a uma terceira camada. Em algumas modalidades, a "terceira camada" contém uma ou mais porções reativas (por exemplo, grupo azido, grupo acetileno, grupo carboxila, grupo amino). Em algumas modalidades, a terceira camada é covalentemente ligada a uma primeira camada de um ligante. Em algumas modalidades, a terceira camada é covalentemente conectada a uma primeira camada através de uma segunda camada. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma primeira e segunda camada. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma primeira e terceira camada. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma primeira, segunda e terceira camada. Em certas modalidades, uma segunda e/ou terceira camada ligante é selecionada a partir das estruturas representadas na Tabela 6.Tabela 6. Segunda e terceira camadas ligantes exemplars
[00249] Em algumas modalidades, um ligante compreendendo mais do que uma primeira camada (por exemplo, uma segunda camada e/ou uma terceira camada) pode ser sintetizado de acordo com o esquema de reação exemplar que segue:
[00250] Em algumas modalidades, um ligante compreendendo pelo menos uma segunda e uma terceira camada pode ser sintetizado de acordo com o esquema de reação exemplar que segue:
[00251] Os marcadores luminescentes exemplares com ligantes biotinilados são mostrados na Tabela 7. Deve-se compreender que os marcadores luminescentes diferentes podem ser substituídos no lugar dos corantes representados na Tabela 7.Tabela 7. Marcadores luminescentes exemplares com ligantes biotinilados
Preparação da Superfície de Cavidade de Amostra (por exemplo, nanoabertura)
[00252] Em certas modalidades, um método de detecção de uma ou mais moléculas luminescentemente marcadas é realizado com as moléculas confinadas em um volume alvo (por exemplo, um volume de reação). Em algumas modalidades, o volume alvo é a região dentro de uma cavidade de amostra (por exemplo, uma nanoabertura). As modalidades das cavidades de amostra (por exemplo, nanoaberturas) e a fabricação de cavidades de amostra (por exemplo, nanoaberturas) são descritos em algum local no presente documento. Em certas modalidades, a cavidade de amostra (por exemplo, nanoabertura) compreende uma superfície inferior compreendendo um primeiro material e paredes laterais formadas por uma pluralidade de camadas metálicas ou de óxido metálico. Em algumas modalidades, o primeiro material é um material transparente ou vidro. Em algumas modalidades, a superfície inferior é plana. Em algumas modalidades, a superfície inferior é uma cavidade curvada. Em algumas modalidades, a superfície inferior inclui uma porção das paredes laterais abaixo das paredes laterais formadas por uma pluralidade de camadas metálicas ou de óxido metálico. Em algumas modalidades, o primeiro material é sílica fundida ou dióxido de silício. Em algumas modalidades, a pluralidade de camadas compreende cada uma um metal (por exemplo, Al, Ti) ou óxido metálico (por exemplo, Al2O3, TiO2, TiN).
Passivação
[00253] Em modalidades quando uma ou mais moléculas ou complexos são imobilizados na superfície inferior, pode ser desejável passivar as paredes laterais para prevenir a imobilização nas superfícies da parede lateral. Em algumas modalidades, as paredes laterais são passivadas pelas etapas de: depositar uma camada de barreira metálica ou de óxido metálico nas superfícies da parede lateral; e aplicar um revestimento à camada de barreira. Em algumas modalidades, a camada de barreira de óxido metálico compreende óxido de alumínio. Em algumas modalidades, a etapa de depósito compreende depositar a camada de barreira metálica ou óxido metálico nas superfícies da parede lateral e a superfície inferior. Em algumas modalidades, a etapa de depósito ainda compreende decapar a camada de barreira metálica ou de óxido metálico de uma superfície inferior.
[00254] Em algumas modalidades, o revestimento da camada de barreira compreende grupos fosfonato. Em algumas modalidades, o revestimento da camada de barreira compreende grupos fosfonato com uma cadeia alquila. Em algumas modalidades, a cadeia alquila compreende um grupo hidrocarboneto saturado de cadeia reta tendo 1 a 20 átomos de carbono. Em algumas modalidades, o revestimento da camada de barreira compreende ácido hexilfosfônico (HPA). Em algumas modalidades, o revestimento da camada de barreira compreende um fosfonato polimérico. Em algumas modalidades, o revestimento da camada de barreira compreende ácido polivinilfosfônico (PVPA). Em algumas modalidades, o revestimento da camada de barreira compreende grupos fosfonato com uma cadeia alquila substituída. Em algumas modalidades, a cadeia alquila compreende uma ou mais amidas. Em algumas modalidades, a cadeia alquila compreende uma ou mais cadeias de poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, o revestimento compreende grupos fosfonato de fórmula:em que n é um número inteiro entre 0 e 100, inclusive, e •~wé hidrogênio ou um ponto de ligação à superfície. Em algumas modalidades, n é um número inteiro entre 3 e 20, inclusive. Em algumas modalidades, o revestimento da camada de barreira compreende uma mistura de diferentes tipos de grupos fosfonato. Em algumas modalidades, o revestimento da camada de barreira compreende uma mistura de grupos fosfonato compreendendo cadeias de poli(etileno glicol) de peso de PEG diferente.
[00255] Em certas modalidades, a camada de barreira compreende grupos nitrodopa. Em certas modalidades, o revestimento da camada de barreira compreende grupos de fórmula: em que RN é uma cadeia alquila opcionalmente substituída e —é hidrogênio ou um ponto de ligação à superfície. Em algumas modalidades, RN compreende um polímero. Em algumas modalidades, RN compreende uma poli(lisina) ou um poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, a camada de barreira compreende um copolímero de poli(lisina) compreendendo monômeros de lisina, em que os monômeros de lisina independentemente compreendem PEG, grupos nitrodopa, grupos fosfonato ou aminas primárias. Em certas modalidades, a camada de barreira compreende um polímero de fórmula (P):
[00256] Em algumas modalidades, X é -OMe, um grupo biotina, fosfonato ou silano. Em algumas modalidades, cada um de i, j, k e l é independentemente um número inteiro entre 0 e 100, inclusive.
[00257] A Figura 8 representa dois métodos de passivação de uma superfície de óxido metálico. Em 8-1, uma superfície de óxido metálico é tratada com ácido (2-aminoetil)fosfônico, provendo uma superfície revestida com grupos (2-aminoetil)fosfonato. Em uma segunda etapa de passivação, a superfície é tratada com um éster de NHS poli(etileno glicol). A reação dos ésteres NHS com os grupos amina dos grupos fosfonato forma ligações amida para formar uma superfície revestida com grupos fosfonato funcionalizados com PEG. Em 8-2, a superfície de óxido metálico é tratada com um ácido fosfônico funcionalizado com PEG, para prover em uma etapa uma superfície revestida com grupos fosfonato funcionalizados com PEG. A modalidade exemplificadora 8-2 ainda representa a adição de um segundo ácido fosfônico funcionalizado com PEG para prover uma superfície revestida com dois tipos de grupos fosfonato funcionalizados com PEG. Neste exemplo, o primeiro ácido PEG fosfônico com um peso molecular médio de 550, e o segundo ácido PEG fosfônico com um peso molecular médio de 180. Conforme representado, os ácidos fosfônicos de cadeia PEG mais curta podem ajudar a preencher as lacunas no revestimento da superfície que permanece depois do tratamento com o ácido PEG fosfônico inicial com cadeias PEG mais longas.
Imobilização de Polimerase
[00258] Em modalidades quando uma ou mais moléculas ou complexos são imobilizados em uma superfície inferior, pode ser desejável funcionalizar a superfície inferior para permitir a ligação de uma ou mais moléculas ou complexos. Em certas modalidades, a superfície inferior compreende um vidro transparente. Em certas modalidades, a superfície inferior compreende sílica fundida ou dióxido de silício. Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com um silano. Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com um polímero ionicamente carregado. Em algumas modalidades, o polímero ionicamente carregado compreende poli(lisina). Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com poli(lisina)-enxerto-poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com albumina do soro bovino biotinilada (BSA).
[00259] Em certas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com um revestimento compreendendo grupos nitrodopa. Em certas modalidades, o revestimento compreende grupos de fórmula:em que RN é uma cadeia alquila opcionalmente substituída e -vé hidrogênio ou um ponto de ligação à superfície. Em algumas modalidades, RN compreende um polímero. Em algumas modalidades, RN compreende uma poli(lisina) ou um poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, RN compreende um poli(etileno glicol) biotinilado. Em algumas modalidades, o revestimento compreende um copolímero de poli(lisina) compreendendo monômeros de lisina, em que os monômeros de lisina independentemente compreendem PEG, PEG biotinilado, grupos nitrodopa, grupos fosfonato ou silanos. Em certas modalidades, o revestimento compreende um polímero de fórmula (P):
[00260] Em algumas modalidades, X é -OMe, um grupo biotina, fosfonato ou silano. Em algumas modalidades, cada um de i, j, k e l é independentemente um número inteiro entre 0 e 100, inclusive.
[00261] Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada coma silano compreendendo uma cadeia alquila. Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com um silano compreendendo uma cadeia alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com um silano compreendendo uma cadeia de poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com um silano compreendendo um grupo de revestimento. Por exemplo, o grupo de revestimento pode compreender porções químicas, tais como grupos amina, grupos carboxila, grupos hidroxila, grupos sulfidrila, metais, queladores e similares. Alternativamente, eles podem incluir elementos de ligação específicos, tais como biotina, avidina, estreptavidina, neutravidina, lectinas, SNAP-tags® ou substratos dos mesmos, peptídeos ou proteínas associativas ou de ligação, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos ou análogos de ácido nucleico ou similares. Adicionalmente, ou alternadamente, o grupo de acoplamento pode ser usado para acoplar um grupo adicional que é usado para acoplar ou ligar com a molécula de interesse, que pode, em alguns casos incluir ambos os grupos funcionais químicos e elementos de ligação específicos. A título de exemplo, um grupo de acoplamento, por exemplo, biotina, pode ser depositado em uma superfície de substrato e seletivamente ativado em uma dada área. Um agente de ligação intermediário, por exemplo, estreptavidina, pode ser então acoplado ao primeiro grupo de acoplamento. A molécula de interesse, que neste exemplo específico seria biotinilada, é então acoplada à estreptavidina.
[00262] Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com um silano compreendendo biotina ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com um silano compreendendo uma cadeia de poli(etileno) glicol, em que a cadeia de poli(etileno glicol) compreende biotina. Em certas modalidades, a superfície inferior é funcionalizada com uma mistura de silanos, em que pelo menos um tipo de silano compreende biotina e pelo menos um tipo de silano não compreende biotina. Em algumas modalidades, a mistura compreende cerca de 10 vezes menos, cerca de 25 vezes menos, cerca de 50 vezes menos, cerca de 100 vezes menos, cerca de 250 vezes menos, cerca de 500 vezes menos ou cerca de 1000 vezes menos do silano biotinilado do que o silano não compreendendo biotina.
[00263] A Figura 9 representa duas vias exemplares para gerar uma superfície inferior de vidro funcionalizada. Na via superior, a superfície de vidro é exposta a uma mistura de um PEG-silano e um PEG biotinilado-silano em uma razão de 250:1. Na via inferior, a superfície de vidro é primeiro exposta ao isocianato-propil- trietoxissilano (IPTES). A reação dos grupos isocianato com uma mistura de uma PEG-amina e PEG-amina biotinilada forma ligações ureia e rende uma superfície com cadeias de PEG e cadeias de PEG biotinilado ligadas à superfície através de grupos silano.
[00264] A Figura 7 representa um processo exemplar não limitante para preparar a superfície da cavidade de amostra a partir do chip fabricado até a iniciação de uma reação de sequenciamento. A cavidade de amostra é representada com uma superfície inferior (retângulo não sombreado) e paredes laterais (retângulos verticais sombreados). As paredes laterais podem ser compreendidas de múltiplas camadas (por exemplo, Al, Al2O3, Ti, TiO2, TiN). Na etapa (a), as paredes laterais são depositadas com uma camada de barreira de Al2O3. A camada de barreira de Al2O3 é então revestida, na etapa (b), com grupos PEG fosfonato, por exemplo, através de tratamento com um ou mais ácidos PEG-fosfônicos. Na etapa (c), a superfície inferior é funcionalizada, por exemplo, com uma mistura de PEG-silano e PEG biotinilado-silano. Os ovais representam grupos biotina individuais que podem prover sítios para uma ligação de uma molécula ou complexo único, tal como um complexo de polimerase. Na etapa (d), um complexo de polimerase está ligado a um grupo biotina na superfície inferior. A polimerase pode ser ligada por meio de um agente de ligação, tal como estreptavidina e um tag de biotina no complexo de polimerase. O complexo de polimerase pode ainda compreender um ácido nucleico e iniciador modelo (não mostrado). A etapa (e) representa a iniciação da reação de sequenciamento através da exposição do complexo de polimerase imobilizado nos nucleotídeos luminescentemente marcados.
[00265] O complexo de polimerase pode ser imobilizado na superfície através da exposição do complexo à superfície funcionalizada em uma mistura de ligação. Em algumas modalidades, a mistura de ligação compreende um ou mais sais. Em algumas modalidades, um sal compreende acetato de potássio. Em algumas modalidades, um sal compreende cloreto de cálcio. Em algumas modalidades, um sal está presente em uma concentração dentre cerca de 1 mM e cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, um sal está presente em uma concentração dentre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, um sal está presente em uma concentração dentre cerca de 50 mM e cerca de 100 mM. Em algumas modalidades, um sal está presente em uma concentração dentre cerca de 100 mM e cerca de 250 mM. Em algumas modalidades, a concentração de acetato de potássio é de cerca de 75 mM. Em algumas modalidades, a concentração de cloreto de cálcio é de cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a mistura de ligação compreende um agente redutor. Em algumas modalidades, um agente redutor compreende ditiotreitol (DTT). Em algumas modalidades, o agente redutor está presente em uma concentração dentre cerca de 1 mM e cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração de ditiotreitol é de cerca de 5 mM. Em algumas modalidades, a mistura de ligação compreende um tampão. Em algumas modalidades, um tampão compreende MOPS. Em algumas modalidades, um tampão está presente em uma concentração dentre cerca de 10 mM e cerca de 100 mM. Em algumas modalidades, a concentração de MOPS é de cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, um tampão está presente em um pH dentre cerca de 5,5 e cerca de 6,5. Em algumas modalidades, um tampão está presente em um pH dentre cerca de 6,5. e cerca de 7,5. Em algumas modalidades, um tampão está presente em um pH dentre cerca de 7,5. e cerca de 8,5. Em algumas modalidades, a mistura de ligação compreende desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs). Em algumas modalidades, os desoxinucleotídeo trifosfatos estão presentes em uma concentração dentre 250 nM e 10 μM. Em algumas modalidades, a concentração de dNTPs é de cerca de 2 μM. Em algumas modalidades, a mistura de ligação compreende um tensoativo. Em algumas modalidades, o tensoativo é um tensoativo Tween (por exemplo, Tween 20). Em algumas modalidades, o tensoativo está presente em um percentual de volume dentre cerca de 0,01% e cerca de 0,1%. Em algumas modalidades, o percentual de volume de Tween é de cerca de 0.03%.
Polimerases
[00266] O termo "polimerase," conforme usado no presente documento, geralmente refere-se a qualquer enzima (ou enzima de polimerização) capaz de catalisar uma reação de polimerização. Os exemplos de polimerases incluem, sem limitação, um ácido nucleico polimerase, uma transcriptase ou uma ligase. A polimerase pode ser uma enzima de polimerização.
[00267] As modalidades direcionadas à extensão do ácido nucleico de molécula única (por exemplo, para o sequenciamento de ácido nucleico) podem usar qualquer polimerase que é capaz de sintetizar um ácido nucleico complementar a uma molécula alvo de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a polimerase pode ser uma polimerase de DNA, uma polimerase de RNA, uma transcriptase reversa e/ou um mutante ou forma alterada de um ou mais dos mesmos.
[00268] Os exemplos de polimerases incluem, porém não se limitam a, uma polimerase de DNA, uma polimerase de RNA, uma polimerase termoestável, uma polimerase do tipo selvagem, uma polimerase modificada, polimerase I de DNA E. coli, polimerase DNA T7, A polimerase de T4DN de bacteriófago polimerase de DNA Φ29 (psi29), polimerase de Taq, polimerase de Tth, polimerase de Tli, polimerase de Pfu, polimerase de Pwo, polimerase Vent®, polimerase Deep Vent®, olimeraseEx Taq® p, polimerase LA Taq®, polimerase Sso, polimerase Poc, polimerase Pab, polimerase Mth, polymerase ES4, polimerase Tru, polimerase Tac, polimerase Tne, polymerase Tma, polimerase Tca, polimerase Tih, polimerase Tfi, polimerases Platinum® Taq, polimerase Tbr, polimerase Tfl, polimerase Tth, polimerase Pfuturbo®, polimerase Pyrobest®, polimerase Pwo, polimerase KOD, polimerase Bst, polimerase Sac, fragmento Klenow, polimerase com a atividade de exonuclease em 3' a 5' e variantes, produtos modificados e derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, a polimerase é uma polimerase de subunidade única. Os exemplos não limitantes de polimerases de DNA e as suas propriedades são descritos em detalhes em, dentre outros locais, DNA Replication 2nd edition, Kornberg and Baker, W. H. Freeman, New York, N.Y. (1991).
[00269] Mediante o pareamento de base entre uma nucleobase de um ácido nucleico alvo e o dNTP complementar, a polimerase incorpora o dNTP no filamento de ácido nucleico recém-sintetizado através da formação de uma ligação de fosfodiéster entre a extremidade 3' hidroxila do filamento recém-sintetizado e o alfa fosfato do dNTP. Em exemplos em que o tag luminescente conjugado ao dNTP é um fluoróforo, a sua presença é assinalada pela excitação e um pulso de emissão é detectado durante ou depois da etapa de incorporação. Para os marcadores de detecção que são conjugados ao fosfato terminal (gama) do dNTP, a incorporação do dNTP no filamento recém-sintetizado resulta na liberação de beta e gama fosfatos e o marcador de detecção, que é livre para se difundir na cavidade de amostra, resultando em um decréscimo na emissão detectada a partir do fluoróforo.
[00270] Em algumas modalidades, a polimerase é uma polimerase com alta capacidade de processamento. No entanto, em algumas modalidades, a polimerase é uma polimerase com capacidade de processamento reduzida. A capacidade de processamento da polimerase geralmente se refere à capacidade da polimerase em incorporar de forma consecutiva dNTPs em um modelo de ácido nucleico sem liberar o modelo de ácido nucleico.
[00271] Em algumas modalidades, a polimerase é uma polimerase com baixa atividade 5‘-3‘ exonuclease e/ou 3‘-5‘ exonuclease. Em algumas modalidades, a polimerase é modificada (por exemplo, pela substituição de aminoácido) para ter a atividade 5‘-3‘ exonuclease e/ou 3‘-5‘ reduzida a uma polimerase do tipo selvagem correspondente. Os exemplos adicionais não limitantes de DNA polimerases incluem 9°Nm™ DNA polimerase (New England Biolabs) e um mutante P680G do Klenow exo-polimerase (Tuske e outros, (2000) JBC 275(31):23759-23768). Em algumas modalidades, uma polimerase que tem capacidade de processamento reduzida provê precisão aumentada para sequenciamento de modelos contendo um ou mais intervalos de repetições de nucleotídeo (por exemplo, duas ou mais bases sequenciais do mesmo tipo).
[00272] Em algumas modalidades, a polimerase é uma polimerase que tem uma maior afinidade com um nucleotídeo marcado do que com um ácido nucleico não marcado.
[00273] As modalidades direcionadas à extensão de RNA de molécula única (por exemplo, para o sequenciamento de RNA) podem usar qualquer transcriptase reversa que é capaz de sintetizar DNA complementar (cDNA) a partir de um modelo de RNA. Nas ditas modalidades, uma transcriptase reversa pode funcionar de um modo similar à polimerase pelo fato que o cDNA pode ser sintetizado a partir de um modelo de RNA através da incorporação de dNTPs a um iniciador de transcrição reversa anelado a um modelo de RNA. O cDNA pode então participar em uma reação de sequenciamento e a sua sequência determinada conforme descrito acima e em algum outro local no presente documento. A sequência determinada do cDNA pode ser então usada, através da complementariedade da sequência, para determinar a sequência do modelo de RNA original. Os exemplos de transcriptases reversas incluem transcriptase reversa do vírus da Leucemia de Murino Moloney (M-MLV), transcriptase reversa do vírus de mieloblastose aviária (AMV), transcriptase reversa do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) e transcriptase reversa da telomerase.
[00274] A capacidade de processamento, atividade da exonuclease, afinidade relativa por diferentes tipos de ácido nucleico ou outra propriedade de uma polimerase de ácido nucleico podem ser aumentadas ou diminuídas por um versado na técnica através de mutação ou outra modificação relativa a uma polimerase do tipo selvagem correspondente.
Modelos
[00275] A presente invenção provê dispositivos, sistemas e métodos para detectar biomoléculas ou subunidades das mesmas, tais como moléculas de ácido nucleico. A dita detecção pode incluir sequenciamento. Uma biomolécula pode ser extraída a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo (por exemplo, um humano ou outro indivíduo). Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um paciente. Em algumas modalidades, um ácido nucleico alvo pode ser detectado e/ou sequenciado para as finalidades de diagnóstico, prognóstico e/ou finalidades terapêuticas. Em algumas modalidades, a informação para um ensaio de sequenciamento pode ser útil para auxiliar no diagnóstico, prognóstico e/ou tratamento de uma doença ou condição. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser suspeito de ter uma condição, tal como uma doença (por exemplo, câncer). Em algumas modalidades, o indivíduo pode estar se submetendo a tratamento para uma doença.
[00276] Em algumas modalidades, uma amostra biológica pode ser extraída de um fluido corporal ou tecido de um indivíduo, tal como hálito, saliva, urina, sangue (por exemplo, sangue total ou plasma), fezes ou outro fluido corporal ou amostra para biopsia. Em alguns exemplos, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são extraídas a partir do fluido corporal ou tecido do indivíduo. Um ou mais ácidos nucleicos podem ser extraídos de uma ou mais células obtidas a partir do indivíduo, tal como parte de um tecido do indivíduo, ou obtidas de um fluido corporal livre de células do indivíduo, tal como sangue total.
[00277] Uma amostra biológica pode ser processada em preparação para a detecção (por exemplo, sequenciamento). O referido processamento pode incluir o isolamento e/ou purificação da biomolécula (por exemplo, molécula de ácido nucleico) a partir da amostra biológica, e a geração de mais cópias da biomolécula. Em alguns exemplos, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são isoladas e purificadas a partir de um fluido corporal ou tecido do indivíduo, e amplificadas através de amplificação de ácido nucleico, tal como reação em cadeia polimerase (PCR). Depois, uma ou mais moléculas de ácido nucleico ou subunidades das mesmas podem ser identificadas, tal como através de sequenciamento. No entanto, em algumas modalidades, as amostras de ácido nucleico podem ser avaliadas (por exemplo, sequenciadas) conforme descrito neste pedido sem requerer amplificação.
[00278] Conforme descrito neste pedido, o sequenciamento pode incluir a determinação de subunidades individuais de uma biomolécula modelo (por exemplo, molécula de ácido nucleico) através da sintetização de uma outra biomolécula que é complementar ou análoga ao modelo, tal como através de sintetização de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma molécula de ácido nucleico modelo e identificação da incorporação de nucleotídeos com o tempo (por exemplo, sequenciamento por síntese). Como uma alternativa, o sequenciamento pode incluir a identificação direta de subunidades individuais da biomolécula.
[00279] Durante o sequenciamento, os sinais indicativos de subunidades individuais de uma biomolécula podem ser coletados em memória e processados em tempo real ou em um momento posterior para determinar uma sequência da biomolécula. O dito processamento pode incluir uma comparação dos sinais em sinais de referência que permitem a identificação das subunidades individuais, as quais em alguns casos rendem leituras. As leituras podem ser sequências de comprimento suficiente (por exemplo, pelo menos cerca de 30, 50, 100 pares de base (bp) ou mais) que podem ser usadas para identificar uma sequência ou região maior, por exemplo, que podem ser alinhadas em uma localização em um cromossomo ou região genômica ou gene.
[00280] As leituras da sequência podem ser usadas para reconstruir uma região mais longa de um genoma de um indivíduo (por exemplo, através de alinhamento). As leituras podem ser usadas para reconstruir regiões cromossômicas, cromossomos totais ou o genoma completo. As leituras de sequência ou uma sequência maior gerada a partir das ditas leituras podem ser usadas para analisar um genoma de um indivíduo, tal como para identificar variantes ou polimorfismos. Os exemplos de variantes incluem, mas não se limitam a, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) incluindo SNPs em tandem, deleções ou inserções multibase em pequena escala, também referidas como indels ou polimorfismos de deleção inserção (DIPs), Polimorfismos de Multi-Nucleotídeo (MNPs), Repetições Curtas em Tandem (STRs), deleções, incluindo microdeleções, inserções, incluindo microinserções, variações estruturais, incluindo duplicações, inversões, translocações, multiplicações, variantes complexas de múltiplos sítios, variações do número de cópias (CNV). As sequências genômicas podem compreender combinações de variantes. Por exemplo, as sequências genômicas podem abranger a combinação de um ou mais SNPs e um ou mais CNVs.
[00281] O termo "genoma" se refere em geral a uma totalidade da informação hereditária de um indivíduo. Um genoma pode ser codificado ou em DNA ou em RNA. Um genoma pode compreender regiões de codificação que codificam proteínas bem como regiões de não codificação. Um genoma pode incluir a sequência de todos os cromossomos juntas em um organismo. Por exemplo, o genoma humano tem um total de 46 cromossomos. A sequência de todos esses juntos constitui o genoma humano. Em algumas modalidades, a sequência de um genoma inteiro é determinada. No entanto, em algumas modalidades, informação de sequência para um subconjunto de um genoma (por exemplo, um ou alguns cromossomos, ou regiões dos mesmos) ou para um ou alguns genes (ou fragmentos dos mesmos) é suficiente para diagnóstico, prognóstico e/ou aplicações terapêuticas.
[00282] Sequenciamento de ácido nucleico de uma pluralidade de modelos de ácido nucleico alvo de filamento único pode ser completado onde cavidades de amostra múltiplas (por exemplo, nanoaberturas) estão disponíveis, como é o caso em dispositivos descritos em outro ponto aqui. Cada cavidade de amostra pode ser provida com um modelo de ácido nucleico alvo padrão e uma reação de sequência pode ser completada em cada cavidade de amostra. Cada uma das cavidades de amostra pode ser contatada com os reagentes apropriados (por exemplo, dNTPS, iniciadores de sequenciamento, polimerase, co-fatores, tampões apropriados, etc), necessários para síntese de ácido nucleico durante uma reação de extensão de iniciador e a reação de sequenciamento pode ser prosseguida em cada cavidade de amostra. Em algumas modalidades, as cavidades de amostra múltiplas são contatadas com dNTPs apropriados simultaneamente. Em outras modalidades, as cavidades de amostra múltiplas são contatadas com cada dNTP apropriado separadamente e cada uma lavada em contato com dNTPs diferentes. dNTPs incorporados podem ser detectados em cada cavidade de amostra e uma sequência determinada para ácido nucleico alvo de filamento único em cada cavidade de amostra como é descrito em outro ponto aqui.
[00283] Embora algumas modalidades possam ser direcionadas para teste de diagnóstico através da detecção de moléculas únicas em um espécime, os inventores também reconheceram que as capacidades de detecção de molécula única da presente invenção podem ser usadas para realizar sequenciamento de polipeptídeo (por exemplo, proteína) ou sequenciamento de ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA) de um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, genes.
[00284] Em alguns aspectos, os métodos descritos aqui podem ser realizados usando um ou mais dispositivos ou aparelhos descritos em mais detalhes abaixo.
Visão Geral do Aparelho
[00285] Os inventores reconheceram ainda e compreenderam que um aparelho de alta velocidade, compacto, para realização de detecção e quantificação de moléculas ou partículas únicas poderia reduzir o custo de realização de medições quantitativas complexas de amostras biológicas e/ou químicas e rapidamente avançaram a taxa de constatações bioquímicas tecnológicas. Além disso, um dispositivo de custo eficaz que é prontamente transportável poderia transformar não apenas o modo que bioensaios são realizados no mundo desenvolvido, mas dariam às pessoas em regiões em desenvolvimento, pela primeira vez, acesso a testes de diagnóstico essenciais que poderiam melhorar drasticamente sua saúde e bem estar. Por exemplo, as modalidades descritas aqui podem ser usadas para teste de diagnóstico de sangue, urina e/ou saliva que poderia ser usado por indivíduos em suas casas ou por um médico em uma clínica remonta em um país em desenvolvimento.
[00286] Um dispositivo sensor pixelado com um número grande de pixels (por exemplo, centenas, milhares, milhões ou mais) permite a detecção de uma pluralidade de moléculas ou partículas individuais em paralelo. As moléculas podem ser, a título de exemplo e não limitação, proteínas e/ou DNA. Além disso, um dispositivo de alta velocidade que pode adquirir dados em mais de cem quadros por segundo permite a detecção e análise de processos dinâmicos ou mudanças que ocorrem com o tempo dentro da amostra sendo analisada.
[00287] Os inventores reconheceram e compreenderam que um obstáculo que evita que equipamento de bioensaio seja tornado mais compacto foi a necessidade de filtrar a luz de excitação de causar eventos de detecção indesejáveis no sensor. Filtros ópticos usados para transmitir a luz de sinal desejada (a luminescência) e bloquear suficientemente a luz de excitação podem ser espessos, volumosos, caros e intolerantes às variações no ângulo de luz de incidência, impedindo a miniaturização. Os inventores, no entanto, reconheceram e compreenderam que uso de uma fonte de excitação pulsada pode reduzir a necessidade de tal filtragem ou, em alguns casos, remover a necessidade de tais filtros no geral. Ao usar sensores capazes de determinar o momento que um fóton é detectado em relação ao pulso de luz de excitação, a luz de sinal pode ser separada da luz de excitação com base no momento que o fóton é recebido, ao invés do espectro da luz recebida. Desta maneira, a necessidade de um filtro óptico volumoso é reduzida e/ou removida em algumas modalidades.
[00288] Os inventores reconheceram e compreenderam que medições do tempo de vida de luminescência podem ser também usadas para identificar as moléculas presentes em uma amostra. Um sensor óptico capaz de detectar quando um fóton é detectado é capaz de medir, usando as estatísticas reunidas de muitos eventos, o tempo de vida de luminescência da molécula sendo excitada pela luz de excitação. Em algumas modalidades, a medição do tempo de vida de luminescência pode ser feita em adição a uma medição espectral da luminescência. Alternativamente, uma medição espectral da luminescência pode ser completamente omitida na identificação da molécula da amostra. Medições de tempo de vida de luminescência podem ser feitas com uma fonte de excitação pulsada. Ainda, medições de tempo de vida de luminescência podem ser feitas usando um dispositivo integrado que inclui o sensor ou um dispositivo onde a fonte de luz está localizada em um sistema separado do dispositivo integrado.
[00289] Os inventores também reconheceram e compreenderam que integração da cavidade de uma amostra (por exemplo, uma nanoaberturas) e um sensor em um dispositivo integrado único capaz de medição de luz de luminescência emitida a partir de amostras biológicas reduz o custo de produção de tal dispositivo de maneira que chips bioanalíticos descartáveis podem ser formados. Dispositivos integrados de uso único, descartáveis, que fazem interface com um instrumento de base podem ser usados em qualquer lugar no mundo, sem a limitação de requerer laboratórios de custo biológico alto para análises de amostra. Desta maneira, bioanalítica automática pode ser levada para regiões do mundo que não poderiam antes realizar análise quantitativa de amostras biológicas. Por exemplo, testes de sangue para bebês podem ser realizados pondo uma amostra de sangue em um dispositivo integrado descartável, pondo o dispositivo integrado descartável em um instrumento de base portátil, pequeno, para análise, e processando os resultados por um computador para revisão imediata por um usuário. Os dados também podem ser transmitidos em uma rede de dados para uma localização remota para serem analisados e/ou arquivados para análises clínicas subsequentes.
[00290] Os inventores reconheceram e compreenderam que um dispositivo de uso único, descartável, pode ser feito mais simples e com custo menor ao não incluir a fonte de luz no chip. Ao contrário, a fonte de luz pode ser componentes reutilizáveis incorporados a um sistema que faz interface com o chip descartável para analisar uma amostra.
[00291] Os inventores também reconheceram a compreenderam que, quando uma amostra é marcada com uma pluralidade de tipos diferentes de marcadores luminescentes, qualquer característica adequada dos marcadores luminescentes pode ser usada para identificar o tipo de marcador que está presente em um pixel particular do chip. Por exemplo, características da luminescência emitida pelos marcadores e/ou características da absorção de excitação podem ser usadas para identificar os marcadores. Em algumas modalidades, a energia de emissão da luminescência (que é diretamente relacionada ao comprimento de onda da luz) pode ser usada para distinguir um primeiro tipo de marcador de um segundo tipo de marcador. Ainda, ou alternativamente, medições de tempo de vida de luminescência podem ser também usadas para identificar o tipo de marcador presente em um pixel particular. Em algumas modalidades, medições de tempo de vida de luminescência podem ser feitas com uma fonte de excitação pulsada usando um sensor capaz de distinguir um momento quando um fóton é detectado com uma resolução suficiente para obter informação de tempo de vida. Ainda, ou alternativamente, a energia da luz de excitação absorvida pelos tipos diferentes de marcadores pode ser usada para identificar o tipo de marcador presente em um pixel particular. Por exemplo, um primeiro marcador pode absorver luz de um primeiro comprimento de onda, mas não absorve igualmente luz de um segundo comprimento de onda, enquanto um segundo marcador pode absorver luz do segundo comprimento de onda, mas não absorve igualmente luz do primeiro comprimento de onda. Desta maneira, quando mais de uma fonte de luz de excitação, cada uma com uma energia de excitação diferente, pode ser usada para iluminar a amostra de uma maneira alternada, a energia de absorção dos marcadores pode ser usada para identificar qual tipo de marcador está presente em uma amostra. Marcadores diferentes podem ter também intensidades de luminescência diferentes. Desta maneira, a intensidade detectada da luminescência pode ser também usada para identificar o tipo de marcador presente em um pixel particular.
Visão Geral do Sistema
[00292] O sistema inclui um dispositivo integrado e um instrumento configurado para fazer interface com o dispositivo integrado. O dispositivo integrado inclui um arranjo de pixels, onde um pixel inclui uma cavidade de amostra e pelo menos um sensor. Uma superfície do dispositivo integrado tem uma pluralidade de cavidades de amostra, onde uma cavidade de amostra é configurada para receber uma amostra de um espécime posto na superfície do dispositivo integrado. Um espécime pode conter amostras múltiplas e, em algumas modalidades, tipos diferentes de amostras. A pluralidade de cavidades de amostra pode ter tamanho e formato adequados de maneira que pelo menos uma porção das cavidades da amostra recebe uma amostra de um espécime. Em algumas modalidades, o número de amostras dentro de uma cavidade de amostra pode ser distribuído dentre as cavidades de amostra de maneira que algumas cavidades de amostra contêm uma amostra com outras contendo zero, duas ou mais amostras.
[00293] Em algumas modalidades, um espécime pode conter múltiplos modelos de DNA de filamento único, e cavidades de amostra individuais sobre uma superfície de um dispositivo integrado podem ser dimensionadas e modeladas para receber um modelo de DNA de filamento único. Modelos de DNA de filamento único podem ser distúrbios dentre cavidades de amostra do dispositivo integrado de maneira que pelo menos uma porção das cavidades de amostra do dispositivo integrado contém um modelo de DNA de filamento único. O espécime também pode conter dNTPs marcados que então entram na cavidade da amostra e podem permitir identificação de um nucleotideo conforme ele é incorporado a um filamento de DNA complementar ao modelo de DNA de filamento único na cavidade da amostra. Em tal exemplo, a "amostra" pode se referir a ambos o DNA de filamento único e o dNTP marcado sendo atualmente incorporado por uma polimerase. Em algumas modalidades, o espécime pode conter modelos de DNA de filamento único e dNTPs marcados podem ser subsequentemente introduzidos em uma cavidade da amostra uma vez os nucleotídeos estando incorporados a um filamento complementar de DNA dentro da cavidade da amostra. Desta maneira, momento de incorporação de nucleotídeos pode ser controlado por quando dNTPs marcados são introduzidos nas cavidades da amostra de um dispositivo integrado.
[00294] Energia de excitação é provida a partir de uma fonte de excitação localizada separado do arranjo de pixel do dispositivo integrado. A energia de excitação é direcionada pelo menos em parte por elementos do dispositivo integrado em direção a um ou mais pixels para iluminar uma região de iluminação dentro da cavidade de uma amostra. Um marcador ou tag pode então emitir energia de emissão quando localizado dentro da região de iluminação e em resposta a ser iluminado por energia de excitação. Em algumas modalidades, uma ou mais fontes de excitação são parte do instrumento do sistema onde componentes do instrumento e o dispositivo integrado são configurados para direcionar a energia de excitação em direção a um ou mais pixels.
[00295] Energia de emissão emitida por uma amostra pode então ser detectada por um ou mais sensores dentro de um pixel do dispositivo integrado. Características da energia de emissão detectada podem prover uma indicação para identificação do marcador associado com a energia de emissão. Tais características podem incluir qualquer tipo adequado de característica, incluindo um momento de chegada de fótons detectados por um sensor, uma quantidade de fótons acumulados com o tempo por um sensor e/ou distribuição de fótons através de dois ou mais sensores. Em algumas modalidades, um sensor pode ter uma configuração que permite detecção de uma ou mais características de tempo associadas com a energia de emissão de uma amostra (por exemplo, tempo de vida de fluorescência). O sensor pode detectar uma distribuição de momentos de chegada de fóton após um pulso de energia de excitação se propagar através do dispositivo integrado, e a distribuição de momentos de chegada pode prover uma indicação de um momento característico da energia de emissão da amostra (por exemplo, um proxy para tempo de vida de fluorescência). Em algumas modalidades, o um ou mais sensores proveem uma indicação da probabilidade de energia de emissão emitida pelo marcador ou tag (por exemplo, intensidade de fluorescência). Em algumas modalidades, uma pluralidade de sensores pode ser dimensionada e arranjada para capturar uma distribuição espacial da energia de emissão. Sinais de saída a partir de um ou mais sensores podem então ser usados para distinguir um marcador de uma pluralidade de marcadores, onde a pluralidade de marcadores pode ser usada para identificar uma amostra dentro do espécime. Em algumas modalidades, uma amostra pode ser excitada por energias de excitação múltiplas, e energia de emissão e/ou características de momento da energia de emissão emitida pela amostra em resposta às energias de excitação múltiplas pode distinguir um marcador de uma pluralidade de marcadores.
[00296] Uma visão geral esquemática do sistema 23-100 é ilustrada nas FIGs. 23A e 23B. O sistema compreende ambos um dispositivo integrado 23-102 que faz interface com um instrumento 23-104. Em algumas modalidades, o instrumento 23-104 pode incluir uma ou mais fontes de excitação 23-106 integradas como parte do instrumento 23104. Em algumas modalidades, uma fonte de excitação pode ser externa para ambos os instrumentos 23-104 e dispositivo integrado 23102 e o instrumento 23-104 pode ser configurado para receber energia de excitação da fonte de excitação e direcioná-la para o dispositivo integrado. O dispositivo integrado pode fazer interface com o instrumento usando qualquer soquete adequado para recebimento do dispositivo integrado e mantê-lo em alinhamento óptico preciso com a fonte de excitação. A fonte de excitação 23-106 pode ser configurada para prover energia de excitação para o dispositivo integrado 23-102. Como esquematicamente ilustrado na Figura 23B, o dispositivo integrado 23-102 tem pixels múltiplos, onde pelo menos uma porção de pixels 23-112 pode realizar análise independente de uma amostra. Tais pixels 23-112 podem ser referidos como "pixels de fonte passivos" uma vez que os pixels recebem energia de excitação de uma fonte 23106 separada do pixel, onde a fonte excita uma pluralidade de pixels. Um pixel 23-112 tem uma cavidade de amostra 23-108 configurada para receber uma amostra e um sensor 23-110 para detecção de energia de emissão emitida pela amostra em resposta à iluminação da amostra com energia de excitação provida pela fonte de excitação 23106. A cavidade da amostra 23-108 pode reter a amostra em proximidade com uma superfície de dispositivo integrado 23-102 para prover facilidade em transmissão de energia de excitação para a amostra e detecção de energia de emissão a partir da amostra.
[00297] Elementos ópticos para guia e acoplamento de energia de excitação para a cavidade de amostra 23-108 estão localizados ambos no dispositivo integrado 23-102 e no instrumento 23-104. Tais elementos de fonte-para-cavidade podem compreender um ou mais acopladores de rede localizados no dispositivo integrado 23-102 para acoplar energia de excitação ao dispositivo integrado e guias de onda para transmitir energia de excitação a partir do instrumento 23-104 para as cavidades de amostra em pixels 23-112. Em algumas modalidades, elementos localizados no dispositivo integrado podem agir para direcionar energia de emissão a partir da cavidade da amostra em direção ao sensor. A cavidade de amostra 23-108, uma porção da óptica de fonte de excitação-para-cavidade e a óptica de cavidade de amostra-para-sensor estão localizadas no dispositivo integrado 23-102. A fonte de excitação 23-106 e uma porção dos componentes de fonte-para-cavidade estão localizados no instrumento 23-104. Em algumas modalidades, um componente único pode desempenhar um papel em ambos acoplamento de energia de excitação à cavidade de amostra 23-108 e a transmissão de energia de emissão a partir da cavidade de amostra 23-108 para o sensor 23110. Exemplos de componentes adequados, para acoplamento de energia de excitação a uma cavidade de amostra e/ou direcionamento de energia de emissão para um sensor, para incluir em um dispositivo integrado são descritos no Pedido de Patente U.S. 14/821.688 intitulado "INTEGRATED DEVICE FOR PROBING, DETECTING AND ANALYZING MOLECULES," e Pedido de Patente U.S. 14/543,865 intitulado "INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING, DETECTING, AND ANALYZING MOLECULES", ambos aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
[00298] Como ilustrado na Figura 23B, o dispositivo integrado compreende uma pluralidade de pixels onde um pixel 23-112 está associado com sua própria cavidade de amostra individual 23-108 e pelo menos um sensor 23-110. A pluralidade de pixels pode ser arranjada em um arranjo, e pode haver qualquer número adequado de pixels no arranjo. O número de pixels em dispositivo integrado 23-102 pode estar na faixa de aproximadamente 10.000 pixels a 1.000.000 pixels ou qualquer valor ou faixa de valores dentro desta faixa. Em algumas modalidades, os pixels podem estar arranjados em um arranjo de 512 pixels por 512 pixels. O dispositivo integrado 23-102 e o instrumento 23-104 podem incluir links de comunicação de alta velocidade, multicanais, para manuseamento dos dados associados com arranjos de pixel grandes (por exemplo, mais do que 10.000 pixels).
[00299] O instrumento 23-104 faz interface com o dispositivo integrado 23-102 através da interface do dispositivo integrado 23-114. A interface do dispositivo integrado 23-114 pode incluir componentes para posicionar e/ou alinhar o dispositivo integrado 23-102 com o instrumento 23-104 para melhorar acoplamento de energia de excitação a partir da fonte de excitação 23-106 para o dispositivo integrado 23-102. A fonte de excitação 23-106 pode ser qualquer fonte de luz adequada que esteja arranjada para transmitir energia de excitação a pelo menos uma cavidade de amostra. Exemplos de fontes de excitação adequadas são descritos no Pedido de Patente U.S. 14/821688 intitulado "INTEGRATED DEVICE FOR PROBING, DETECTING AND ANALYZING MOLECULES", que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a fonte de excitação 23-106 inclui fontes de excitação múltiplas que são combinadas para transmitir energia de excitação para o dispositivo integrado 23-102. As fontes de energia de excitação múltiplas podem ser configuradas para produzir energias de excitação ou comprimentos de onda múltiplos. A interface do dispositivo integrado 23-114 pode receber sinais de leitura a partir dos sensores nos pixels localizados no dispositivo integrado. A interface do dispositivo integrado 23-114 pode ser projetada de maneira que o dispositivo integrado se fixe ao instrumento prendendo o dispositivo integrado à interface do dispositivo integrado 23-114.
[00300] O instrumento 23-104 inclui uma interface de usuário 23116 para controle da operação de instrumento 23-104. A interface do usuário 23-116 é configurada para permitir que o usuário insira informação no instrumento, tal como comandos e/ou ajustes usados para controlar o funcionamento do instrumento. Em algumas modalidades, a interface do usuário 23-116 pode incluir botões, interruptores, mostradores e um microfone para comandos de voz. Ainda, a interface do usuário 23-116 pode permitir que um usuário receba feedback sobre o desempenho do instrumento e/ou dispositivo integrado, tal como alinhamento apropriado e/ou informação obtida pela leitura de sinais a partir dos sensores do dispositivo integrado. Em algumas modalidades, a interface do usuário 23-116 pode prover feedback usando um autofalante para prover feedback audível, e luzes indicadoras e/ou monitor para provisão de feedback visual. Em algumas modalidades, o instrumento 23-104 inclui uma interface de computador 23-118 usada para conectar com um dispositivo de computação 23-120. Qualquer interface de computador 23-118 e dispositivo de computação adequado pode ser usado. Por exemplo, a interface de computador 23-118 pode ser uma interface de USB ou uma interface FireWire. O dispositivo de computação 23-120 pode ser qualquer computador de propósito geral, tal como um computador laptop ou desktop. A interface do computador 23-118 facilita comunicação de informação entre o instrumento 23-104 e o dispositivo de computação 23-120. Informação de entrada para controle e/ou configuração do instrumento 23-104 pode ser provida através do dispositivo de computação 23-120 conectado à interface de computador 23-118 do instrumento. Informação de saída pode ser recebida pelo dispositivo de computação 23-120 através da interface de computador 23-118. Tal informação de saída pode incluir feedback sobre o desempenho do instrumento 23-104 e/ou dispositivo integrado 23-112 e informação a partir dos sinais de leitura do sensor 23-110. O instrumento 23-104 pode também incluir um dispositivo de processamento 23-112 para análise de dados recebidos a partir do sensor 23-110 e/ou envio de sinais de controle para a fonte de excitação 23-106. Em algumas modalidades, o dispositivo de processamento 23-122 pode compreender um processador para propósito geral, um processador especialmente adaptado (por exemplo, uma unidade de processamento central (CPU) tal como um ou mais núcleos microprocessadores ou microcontroladores, um arranjo de porta programável no campo (FPGA), um circuito integrado específico de aplicação (ASIC), um circuito integrado personalizado, um processador de sinal digital (DSP) ou uma combinação dos mesmos). Em algumas modalidades, o processamento de dados a partir do sensor 23-110 pode ser realizado por ambos o dispositivo de processamento 23-122 e o dispositivo de computação externo 23-120. Em outras modalidades, o dispositivo de computação 23-120 pode ser omitido e processamento de dados a partir do sensor 23-110 pode ser realizado apenas pelo dispositivo de processamento 23-122.
[00301] Um esquema em seção transversal do dispositivo integrado 24-102 ilustrando uma fileira de pixels é mostrado na Figura 24A. Cada pixel 24-112 inclui uma cavidade de amostra 24-108 e um sensor 24-110. O sensor 24-110 pode estar alinhado e posicionado para a cavidade de amostra 24-112 de maneira que o sensor 24-110 receba energia de emissão emitida por uma amostra dentro da cavidade de amostra 24-112. Exemplos de sensores adequados são descritos no Pedido de Patente U.S. 14/821.656 intitulado "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS", que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[00302] Uma fonte de excitação acoplada ao dispositivo integrado pode prover energia de excitação a um ou mais pixels de dispositivo integrado 24-102. A Figura 24B é um esquema ilustrando acoplamento de fonte de excitação 24-106 ao dispositivo integrado 24-102 para prover energia de excitação 24-130 (mostrada em linhas pontilhadas) ao dispositivo integrado 24-102. A Figura 24B ilustra o curso de energia de excitação a partir da fonte de energia de excitação 24-106 para uma cavidade de amostra 24-108 no pixel 24-112. Componentes localizados fora do dispositivo integrado podem ser usados para posicionar e alinhar a fonte de excitação 24-106 com o dispositivo integrado. Tais componentes podem incluir componentes ópticos incluindo lentes, espelhos, prismas, aberturas, atenuadores e/ou fibras ópticas. Componentes mecânicos adicionais podem ser incluídos no instrumento para permitir controle de um ou mais componentes de alinhamento. Tais componentes mecânicos podem incluir atuadores, motores passo-a-passo e/ou botões.
[00303] O dispositivo integrado inclui componentes que direcionam a energia de excitação 24-130 em direção a pixels no dispositivo integrado. Dentro de cada pixel 24-112, a energia de excitação é acoplada à cavidade da amostra 24-108 associada com o pixel. Embora a Figura 24B ilustre acoplamento de energia de excitação a cada cavidade de amostra em uma fileira de pixels, em algumas modalidades, energia de excitação pode não acoplar a todos os pixels em uma fileira. Em algumas modalidades, energia de excitação pode acoplar a uma porção de pixels ou cavidades de amostra em uma fileira de pixels do dispositivo integrado. Energia de excitação pode iluminar uma amostra localizada dentro de uma cavidade de amostra. A amostra pode atingir um estado excitado em resposta a ser iluminada pela energia de excitação. Quando uma amostra está em um estado excitado, a amostra pode emitir energia de emissão e a energia de emissão pode ser detectada por um sensor. A Figura 24B ilustra esquematicamente o curso de energia de emissão 24-140 (mostrada em linhas sólidas) a partir da cavidade de amostra 24-108 para o sensor 24-110 do pixel 24-112. O sensor 24-110 no pixel 24- 112 pode ser configurado e posicionado para detectar energia de emissão a partir da cavidade de amostra 24-108. Em algumas modalidades, o sensor 24-110 pode incluir subsensores múltiplos.
[00304] Uma amostra a ser analisada pode ser introduzida na cavidade de amostra 24-108 de pixel 24-112. A amostra pode ser uma amostra biológica ou qualquer outra amostra adequada, tal como uma amostra química. A amostra pode incluir moléculas múltiplas e a cavidade de amostra pode ser configurada para isolar uma molécula única. Em alguns casos, as dimensões da cavidade de amostra podem agir para confinar uma molécula única dentro da cavidade da amostra, permitindo que medições sejam realizadas na molecula única. Uma fonte de excitação 24-106 pode ser configurada para transmitir energia de excitação para a cavidade de amostra 24-108, de maneira a excitar a amostra ou pelo menos um marcador de luminescência preso à amostra ou de outra maneira associado com a amostra enquanto ela está dentro de uma área de iluminação dentro da cavidade de amostra 24-108.
[00305] Quando uma fonte de excitação transmite energia de excitação para uma cavidade de amostra, pelo menos uma amostra dentro da cavidade pode luminescer, e a emissão resultante pode ser detectada por um sensor. Como aqui usado, a expressão "uma amostra pode luminescer" ou "uma amostra pode emitir radiação" ou "emissão a partir de uma amostra" significa que um tag, marcador ou repórter luminescente, a própria amostra ou um produto de reação associado com a amostra pode produzir a radiação emitida.
[00306] Um ou mais componentes de um dispositivo integrado podem direcionar energia de emissão em direção a um sensor. A energia ou energias de emissão podem ser detectadas pelo sensor e convertidas em pelo menos um sinal elétrico. Os sinais elétricos podem ser transmitidos ao longo de linhas de condução no circuito do dispositivo integrado conectado ao instrumento através da interface do dispositivo integrado, tal como uma interface de dispositivo integrado 23-114 de instrumento 23-104 mostrado na Figura 23B. Os sinais elétricos podem ser subsequentemente processados e/ou analisados. Processamento ou análise de sinais elétricos pode ocorrer em um dispositivo de computação adequado ou localizado no instrumento 23104 ou fora do instrumento, tal como dispositivo de computação 23120 mostrado na Figura 23B.
[00307] Em operação, análises paralelas de amostras dentro das cavidades de amostra são realizadas pela excitação das amostras dentro das cavidades usando a fonte de excitação e detectando sinais a partir da emissão de amostra com os sensores. Energia de emissão a partir da amostra pode ser detectada pelo sensor correspondente e convertida em pelo menos um sinal elétrico. O sinal, ou sinais, resultante pode ser processado no dispositivo integrado em algumas modalidades ou transmitido para o instrumento para processamento pelo dispositivo de processamento e/ou dispositivo de computação. Sinais a partir de uma cavidade de amostra podem ser recebidos e processados independentemente de sinais associados com os outros pixels.
[00308] Em algumas modalidades, uma amostra pode ser marcada com um ou mais marcadores e emissão associada com os marcadores é discernível pelo instrumento. Por exemplo, o sensor pode ser configurado para converter fótons da energia de emissão em elétrons para formar um sinal elétrico que pode ser usado para discernir um tempo de vida que é dependente da energia de emissão de um marcador específico. Ao usar marcadores com tempos de vida diferentes para marcar amostras, amostras específicas podem ser identificadas com base no sinal elétrico resultante detectado pelo sensor.
[00309] Uma amostra pode conter tipos múltiplos de moléculas e marcadores luminescentes diferentes pode se associar unicamente com um tipo de molecula. Durante ou após excitação, o marcador luminescente pode emitir energia de emissão. Uma ou mais propriedades da energia de emissão podem ser usadas para identificar um ou mais tipos de moléculas na amostra. Propriedades da energia de emissão usada para distinguir dentre tipos de moléculas podem incluir um valor de tempo de vida de fluorescência, intensidade e/ou comprimento de onda de emissão. Um sensor pode detectar fótons, incluindo fótons de energia de emissão, e provê sinais elétricos indicativos de uma ou mais dessas propriedades. Em algumas modalidades, sinais elétricos de um sensor podem prover informação sobre uma distribuição de tempos de chegada de fóton em um ou mais intervalos de tempo. A distribuição de tempos de chegada de fóton pode corresponder a quando um fóton é detectado após um pulso de energia de excitação ser emitido por uma fonte de excitação. Um valor para um intervalo de tempo pode corresponder a um número de fótons detectado durante o intervalo de tempo. Valores relativos em intervalos de tempo múltiplos podem prover uma indicação de uma característica temporal da energia de emissão (por exemplo, tempo de vida). Análise de uma amostra pode incluir distinção dentre marcadores através da comparação de valores para dois ou mais intervalos de tempo diferentes dentro de uma distribuição. Em algumas modalidades, uma indicação da intensidade pode ser provida pela determinação do número de fótons em todos os agrupamentos de tempo em uma distribuição.
II. Dispositivo Integrado
[00310] O dispositivo integrado pode ser configurado para receber energia de excitação a partir de uma fonte de energia de excitação externa. Em algumas modalidades, uma região do dispositivo pode ser usada para acoplar uma fonte de energia de excitação localizada fora do dispositivo integrado. Componentes do dispositivo integrado podem guiar energia de excitação a partir da região de acoplamento de fonte de excitação para pelo menos um pixel. Em algumas modalidades, pelo menos um guia de onda pode ser configurado para transmitir energia de excitação para pelo menos um pixel tendo uma cavidade de amostra. Uma amostra localizada dentre da cavidade de amostra pode emitir energia de emissão em resposta a ser iluminada com energia de excitação. Um ou mais sensores localizados dentro do pixel são configurados para receber a energia de emissão.
[00311] Componentes e/ou camadas de dispositivo integrado 25200 de acordo com algumas modalidades mostradas na Figura 25 incluem uma cavidade de amostra 25-303, guia de onda 25-220 e sensor 25-275 integrados a um dispositivo. Cavidade de amostra 25203 pode ser formada em uma camada de cavidade de amostra 25201 de dispositivo integrado 25-200. Em algumas modalidades, uma camada de cavidade de amostra 25-201 pode ser metal. A cavidade de amostra 25-203 pode ter uma dimensão Dtv que pode indicar uma dimensão em seção transversal da cavidade da amostra. A cavidade de amostra 25-203 pode agir como uma nanoabertura e ter uma ou mais dimensões de subcomprimento de onda que criam um efeito de aumento de campo que aumenta a intensidade da excitação da amostra em cavidade de amostra 25-203. Guia de onda 25-220 é configurado para transmitir energia de excitação a partir da fonte de excitação 25-230 localizada fora do dispositivo 25-200 para a cavidade de amostra 25-203. O guia de onda 25-220 pode ser formado em uma camada entre a camada de cavidade de amostra 25-201 e sensor 25275. O projeto de dispositivo integrado 25-200 permite que o sensor 25-275 colete luminescência emitida de uma amostra em cavidade de amostra 25-203. Pelo menos um pouco do tempo, a amostra absorve energia de excitação e emite um fóton com uma energia menor do que aquela da energia de excitação, referida como energia de emissão ou luminescência.
[00312] Ter cavidade de amostra 25-203 e sensor 25-275 no dispositivo integrado 25-200 pode reduzir a distância óptica que a luz viaja a partir da cavidade de amostra 25-203 para o sensor 25-215. Dimensões de dispositivo integrado 25-200 ou componente dentro do dispositivo podem ser configuradas para uma certa distância óptica. Propriedades ópticas dos materiais de componentes e/ou uma ou mais camadas do dispositivo podem determinar uma distância óptica entre uma cavidade de amostra e um sensor. Em algumas modalidades, a espessura de uma ou mais camadas pode determinar a distância óptica entre a cavidade da amostra e sensor em um pixel. Adicionalmente ou alternativamente, o índice de refração de materiais que formam uma ou mais camadas de dispositivo integrado 25-200 pode determinar a distância óptica entre a cavidade de amostra 25203 e sensor 25-275 em um pixel. Tal distância óptica entre a cavidade de amostra e sensor em um pixel pode ser menos do que 1 mm, menos do que 100 mícrons, menos do que 25 mícrons e/ou menos do que 10 mícrons. Uma ou mais camadas pode estar presentes entre a camada de cavidade de amostra 25-201 e camada de guia de onda 25-220 para melhorar o acoplamento de energia de excitação a partir do guia de onda 25-220 para a cavidade de amostra 25-203. Embora o dispositivo integrado 25-200 mostrado na Figura 25 ilustre apenas uma camada única 25-210, camadas múltiplas podem ser formadas entre a cavidade de amostra 25-203 e guia de onda 25220. A camada 25-210 pode ser formada com propriedades ópticas para melhorar o acoplamento de energia de excitação a partir do guia de onda 25-220 para a cavidade de amostra 25-203. A camada 25-210 pode ser configurada para reduzir a difração e/ou absorção de energia de excitação e/ou aumentar luminescência a partir de uma amostra em uma cavidade de amostra 25-203. A camada 25-210 pode ser opticamente transparente, de acordo com algumas modalidades, de maneira que a luz viaja para e a partir da cavidade de amostra 25-203 com pouca atenuação. Em algumas modalidades, materiais dielétricos podem ser usados para formar a camada 25-210. Em algumas modalidades, componentes de acoplamento de energia de excitação dentro da camada 25-210 e/ou na interface entre a camada 25-210 e camada de cavidade de amostra 25-201 podem ser providos para aperfeiçoar acoplamento de energia de excitação a partir do guia de onda 25-220 para a cavidade de amostra 25-203. Como um exemplo, componentes de coleta de energia 25-215 formados na interface entre camada de cavidade de amostra 25-201 e camada 25-210 podem ser configurados para aperfeiçoar o acoplamento de energia de excitação a partir do guia de onda 25-220 para a cavidade de amostra 25-203. Componentes de coleta de energia 25-215 são opcionais e, em algumas modalidades, a configuração de guia de onda 25-220 e cavidade de amostra 25-203 pode permitir energia de excitação de acoplamento adequada sem a presença de componentes de coleta de energia de excitação 25-215.
[00313] Luz ou energia luminescente emitida a partir de uma amostra na cavidade de amostra 25-203 pode ser transmitida para o sensor 25-275 de uma variedade de maneiras, alguns exemplos delas são descritos em detalhes abaixo. Algumas modalidades podem usar componentes ópticos para aumentar a probabilidade de que luz de um comprimento de onda particular seja direcionada a uma área ou porção do sensor 25-275 que é dedicada à detecção de luz deste comprimento de onda particular. O sensor 25-275 pode incluir porções múltiplas para detectar simultaneamente luz de comprimentos de onda diferentes que podem corresponder a emissões de marcadores luminescentes diferentes.
[00314] Uma ou mais camadas podem estar presentes entre a cavidade de amostra 25-203 e sensor 25-275 que podem ser configurados para aperfeiçoar a coleta de luminescência a partir da cavidade de amostra 25-203 para o sensor 25-275. Componentes de direcionamento de luminescência podem estar localizados na interface entre a camada de cavidade de amostra 25-201 e camada 25-210. Os componentes de coleta de energia 25-215 podem focar a energia de emissão em direção ao sensor 25-275 e podem adicionalmente ou alternativamente separar espacialmente energias de emissão que têm energias ou comprimentos de onda característicos diferentes. Tais componentes de coleta de energia 25-215 podem incluir uma estrutura de rede para direcionamento de luminescência em direção ao sensor 25-275. Em algumas modalidades, a estrutura de rede pode ser uma série de anéis concêntricos ou configuração de estrutura de rede "bullseye". As redes circulares concêntricas podem protrudir de uma superfície interior da camada de cavidade da amostra 25-201. As redes circulares pode agir como elementos plasmônicos que podem ser usados para diminuir o espalhamento da luz de sinal e direcionar a luz de sinal em direção ao sensor associado 25-275. Tal rede bullseye pode direcionar a luminescência mais eficientemente em direção ao sensor 25-275.
[00315] A camada 25-225 pode ser formada adjacente ao guia de onda. As propriedades ópticas da camada 2-225 podem ser selecionadas para aperfeiçoar a coleta de luminescência a partir da cavidade de amostra para o sensor 25-275. Em algumas modalidades, a camada 2-225 pode ser um material dielétrico. Um defletor pode ser formado entre a camada de cavidade de amostra 25-201 e sensor 25275. Um defletor 25-240 pode ser configurado de tal maneira que o sensor 25-275 receba luminescência correspondendo à cavidade de amostra 25-203 e reduza luminescência e excitação refletida/dispersa de outras cavidades de amostra. Elementos de filtragem 25-260 podem ser posicionados e configurados para reduzir energia de excitação a partir de sensor de alcance 25-275. Em algumas modalidades, os elementos de filtragem 25-260 podem incluir um filtro que transmite seletivamente energia de emissão de um ou mais marcadores usados para marcar uma amostra. Em modalidades com um arranjo de cavidades de amostra e um arranjo de sensores onde cada cavidade de amostra tem um sensor correspondente, um defletor correspondendo a cada cavidade de amostra pode ser formado para reduzir luminescência de outras cavidades de amostra e luz de excitação refletida e/ou dispersa de ser coletada por um sensor correspondendo à cavidade de amostra.
[00316] Uma ou mais camadas podem ser formadas entre o guia de onda 25-220 e sensor 25-272 para reduzir transmissão de energia de excitação para o sensor. Em algumas modalidades, elementos de filtragem podem ser formados entre o guia de onda 25-220 e sensor 25-275. Tais elementos de filtragem podem ser configurados para reduzir transmissão de energia de excitação para o sensor 25-275 enquanto permitindo que luminescência da cavidade de amostra seja coletada pelo sensor 25-275.
[00317] A energia ou energias de emissão podem ser detectadas pelo sensor 25-275 e convertidas em pelo menos um sinal elétrico. O sinal ou sinais elétricos podem ser transmitidos junto com uma ou mais linhas de condução em fileira ou coluna (não mostrado) para o circuito eletrônico integrado no substrato 25-200 para processamento de sinal subsequente.
[00318] A descrição acima da Figura 25 é uma vista geral de alguns dos componentes do aparelho de acordo com algumas modalidades. Em algumas modalidades, um ou mais elementos da Figura 25 podem estar ausentes ou em um local diferente. Os componentes do dispositivo integrado 25-200 e fonte de excitação 25-230 são descritos em mais detalhes abaixo.
Região de Acoplamento de Fonte de Excitação
[00319] O dispositivo integrado pode ter uma região de acoplamento de fonte de excitação para acoplar com uma fonte de energia de excitação externa e guiar a excitação em direção a pelo menos um pixel em uma área de pixel do dispositivo integrado. A região de acoplamento de fonte de excitação pode incluir uma ou mais estruturas configuradas para acoplar luz em pelo menos um guia de onda. Qualquer mecanismo adequado para acoplamento de energia de excitação em um guia de onda pode ser usado.
[00320] A região de acoplamento de fonte de excitação de um dispositivo integrado pode incluir componentes estruturais configurados para acoplar com uma fonte de excitação externa. Um dispositivo integrado pode incluir um acoplador de rede configurado para acoplar com uma fonte de excitação externa posicionada próximo a uma superfície do dispositivo integrado e direcionar luz em direção a pelo menos um guia de onda do dispositivo integrado. Características do acoplador de rede, tais como o tamanho, formato e/ou configurações de rede podem ser formadas para aperfeiçoar acoplamento da energia de excitação da fonte de excitação para o guia de onda. O acoplador de rede pode incluir um ou mais componentes estruturais onde o espaçamento entre os componentes estruturais pode agir para propagar luz. Uma ou mais dimensões do acoplador de rede podem prover acoplamento desejável de luz tendo um certo comprimento de onda característico.
[00321] Um dispositivo integrado pode também incluir um guia de onda tendo uma região afunilada em uma extremidade do guia de onda. Uma ou mais dimensões do guia de onda perpendiculares a uma direção de propagação de luz no guia de onda podem ser maiores em uma extremidade do guia de onda, formando uma região afunilada do guia de onda. Em algumas modalidades, a região afunilada de um guia de onda pode ter uma dimensão perpendicular à propagação de luz e paralela a uma superfície do dispositivo integrado que é maior do que uma extremidade do guia de onda e se torna menor ao longo do comprimento do guia de onda. Em modalidades que incluem um acoplador de rede, a região afunilada pode ser posicionada próximo do acoplador de rede de maneira que a extremidade mais larga da região afunilada está localizada mais próximo do acoplador de rede. A região afunilada pode ser dimensionada e modelada para aperfeiçoar acoplamento de luz entre o acoplador de rede e o guia de onda através da expansão de uma ou mais dimensões do guia de onda para permitir sobreposição de modo aperfeiçoada do guia de onda com o acoplador de rede. Desta maneira, uma fonte de excitação posicionada próximo da superfície de um dispositivo integrado pode acoplar luz ao guia de onda através do acoplador de rede. Tal combinação de acoplador de rede e afunilamento de guia de onda pode permitir maior tolerância no alinhamento e posicionamento da fonte de excitação com o dispositivo integrado.
[00322] Um acoplador de rede pode ser posicionado em uma região do dispositivo integrado externo aos pixels do dispositivo integrado. Sobre uma superfície do dispositivo integrado, as cavidades de amostra dos pixels podem ocupar uma região da superfície separada da região de acoplamento de fonte de excitação. Uma fonte de excitação posicionada próximo à superfície da região de acoplamento de fonte de excitação pode acoplar com o acoplador de rede. As cavidades de amostra podem ser posicionadas separadas da região de acoplamento de fonte de excitação para reduzir interferência de luz da fonte de excitação sobre desempenho dos pixels. Um acoplador de rede de um dispositivo integrado pode ser formado dentro de uma ou mais camadas do dispositivo integrado que incluem um guia de onda. Desta maneira, uma região de acoplamento de fonte de excitação de um dispositivo integrado pode incluir um acoplador de rede dentro do mesmo plano do dispositivo integrado que um guia de onda. O acoplador de rede pode ser configurado para um conjunto particular de parâmetros de feixe, incluindo largura de feixe, ângulo de incidência e/ou polarização da energia de excitação incidente.
[00323] Uma vista em seção transversal do dispositivo integrado 26-200 é mostrada na Figura 26. O dispositivo integrado 26-200 inclui pelo menos uma cavidade de amostra 26-222 formada na camada 26223 de dispositivo integrado 26-200. O dispositivo integrado 26-200 inclui acoplador de rede 26-216 e guia de onda 26-220 formado substancialmente no mesmo plano de dispositivo integrado 26-200. Em algumas modalidades, o acoplador de rede 26-216 e guia de onda 26-220 são formados da mesma camada de dispositivo integrado 26200 e podem incluir o mesmo material. A região de acoplamento de fonte de excitação 26-201 de dispositivo integrado 26-200 inclui acoplador de rede 26-216. Como mostrado na Figura 26, a cavidade de amostra 26-222 é posicionada sobre uma superfície de dispositivo integrado 26-200 externo à região de acoplamento de fonte de excitação 26-201. A fonte de excitação 26-214 posicionada em relação ao dispositivo integrado 26-200 pode prover energia de excitação incidente sobre a superfície 26-215 do dispositivo integrado 26-200 dentro da região de acoplamento de fonte de excitação 26-201. Ao posicionar o acoplador de rede 26-216 dentro da região de acoplamento de fonte de excitação 26-201, o acoplador de rede 26216 pode acoplar com a energia de excitação de fonte de excitação 26-214 e acoplar a energia de excitação ao guia de onda 26-220. O guia de onda 26-220 é configurado para propagar energia de excitação para a proximidade de uma ou mais cavidades de amostra 26-222.
[00324] Um acoplador de rede pode ser formado a partir de um ou mais materiais. Em algumas modalidades, um acoplador de rede pode incluir regiões de alternação de materiais diferentes ao longo de uma direção paralela à propagação de luz no guia de onda. Como mostrado na Figura 26, acoplador de rede 26-216 inclui estruturas que são circundadas pelo material 26-224. O um ou mais materiais que formam um acoplador de rede podem ter um ou mais índices de refração adequados para acoplamento e propagação de luz. Em algumas modalidades, um acoplador de rede pode incluir estruturas formadas de um material circundado por um material tendo um índice de refração maior. Como um exemplo, um acoplador de rede pode incluir estruturas formadas de nitrida de silício e circundadas por dióxido de silício.
[00325] Quaisquer dimensões e/ou espaçamento inter-rede adequados podem ser usados para formar um acoplador de rede. O acoplador de rede 26-216 pode ter uma dimensão perpendicular à propagação de luz através do guia de onda, tal como ao longo da direção y como mostrado na Figura 26, de aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm ou aproximadamente 200 nm. Espaçamento entre as estruturas do acoplador de rede ao longo de uma direção paralela à propagação de luz no guia de onda, tal como ao longo da direção z como mostrado na Figura 26, pode ter qualquer distância adequada. A rede de interespaçamento pode ser de aproximadamente 300 nm, aproximadamente 350 nm, aproximadamente 400 nm, aproximadamente 420 nm, aproximadamente 450 nm ou aproximadamente 500 nm. Em algumas modalidades, o espaçamento inter-rede pode ser variável dentro de um acoplador de rede. O acoplador de rede 26-216 pode ter uma ou mais dimensões substancialmente paralelas à superfície 26-215 de dispositivo integrado 26-200 que provê uma área adequada para acoplamento com fonte de excitação externa 26-214. A área de acoplador de rede 26-216 pode coincidir com uma ou mais dimensões de um feixe de luz da fonte de excitação 26-214 de maneira que o feixe sobrepõe com o acoplador de rede 26-215. Um acoplador de rede pode ter uma área configurada para um diâmetro de feixe de aproximadamente 10 mícrons, aproximadamente 20 mícrons, aproximadamente 30 mícrons ou aproximadamente 40 mícrons.
[00326] Um dispositivo integrado pode incluir uma camada formada em um lado de um acoplador de rede oposto à fonte de excitação configurada para refletir luz. A camada pode refletir energia de excitação que passa pelo acoplador de rede em direção ao acoplador de rede. Ao incluir a camada em um dispositivo integrado, eficiência de acoplamento da energia de excitação com o guia de onda pode ser aperfeiçoada. Um exemplo de uma camada refletiva é a camada 26218 de dispositivo integrado 26-200 mostrado na Figura 26. A camada 26-218 é posicionada dentro da região de acoplamento de fonte de excitação 26-201 de dispositivo integrado 26-200 e é configurada para refletir luz em direção ao acoplador de rede 26-216. A camada 26-218 é formada próximo do lado do acoplador de rede 26-216 oposto à energia de excitação incidente da fonte de excitação 26-214. Posicionamento da camada 26-218 externa aos pixels de dispositivo integrado 26-200 pode reduzir a interferência da camada 26-218 sobre as capacidades de desempenho dos pixels. A camada 26-218 pode incluir qualquer material adequado. A camada 26-218 pode ser substancialmente refletiva para uma ou mais energias de excitação. Em algumas modalidades, esta camada pode incluir Al, AlCu e/ou TiN. B. Guia de onda
[00327] Um dispositivo integrado pode incluir um ou mais guias de onda arranjados para transmitir uma quantidade desejada de energia de excitação para uma ou mais cavidades de amostra do dispositivo integrado. Um guia de onda posicionado na vizinhança de uma ou mais cavidades de amostra de maneira que conforme a energia de excitação propaga ao longo da guia de onda uma porção de energia de excitação acopla com a uma ou mais cavidades de amostra. Um guia de onda pode acoplar energia de excitação com uma pluralidade de pixels e age como um guia de onda de barramento. Por exemplo, um guia de onda único pode transmitir energia de excitação para uma fileira ou coluna de pixels de um dispositivo integrado. Em algumas modalidades, um guia de onda pode ser configurado para propagar energia de excitação tendo uma pluralidade de comprimentos de onda característicos. Um pixel de um dispositivo integrado pode incluir estruturas adicionais (por exemplo, microcavidade) configuradas para direcionar energia de excitação do guia de onda em direção à vizinhança da cavidade de amostra. Em algumas modalidades, um guia de onda pode carregar um modo óptico tendo uma cauda evanescente configurada para se estender para uma cavidade de amostra e/ou em uma região na vizinhança da cavidade de amostra. Estruturas de acoplamento de energia adicionais localizadas próximo da cavidade da amostra podem acoplar energia da cauda evanescente para a cavidade de amostra.
[00328] Uma ou mais dimensões de um guia de onda de um dispositivo integrado podem prover propagação desejada de energia de excitação ao longo do guia de onda e/ou para uma ou mais cavidades de amostra. Um guia de onda pode ter uma dimensão perpendicular à propagação de luz e paralela a um plano do guia de onda, que pode ser considerada uma largura de seção transversal. Um guia de onda pode ter uma largura de seção transversal de aproximadamente 0,4 mícron, aproximadamente 0,5 mícron, aproximadamente 0,6 mícron, aproximadamente 0,65 mícron,aproximadamente 0,8 mícron, aproximadamente 1 mícron ou aproximadamente 1,2 mícron. Um guia de onda pode ter uma dimensão perpendicular à propagação de luz e perpendicular a um plano do guia de onda, que pode ser considerada uma altura de seção transversal. Um guia de onda pode ter uma altura de seção transversal de aproximadamente 0,05 mícron, aproximadamente 0,1 mícron, aproximadamente 0,15 mícron, aproximadamente 0,16 mícron, aproximadamente 0,17 mícron, aproximadamente 0,2 mícron ou aproximadamente 0,3 mícron. Em algumas modalidades, um guia de onda tem uma largura de seção transversal maior do que a altura da seção transversal. Um guia de onda pode ser posicionado uma certa distância da uma ou mais cavidades de amostra dentro de um dispositivo integrado, tal como distância D mostrada na Figura 26 entre a cavidade de amostra 26-222 e guia de onda 26-220, que é aproximadamente 0,3 mícron, 0,5 mícron ou aproximadamente 0,7 mícron.
[00329] Em uma modalidade exemplar, um guia de onda pode ter uma largura de secção transversal de aproximadamente 0,5 μm e uma altura de seção transversal de aproximadamente 0,1 μm e ser posicionado aproximadamente 0,5 μm abaixo da camada de cavidade de amostra. Em uma outra modalidade exemplar, um guia de onda pode ter uma largura de seção transversal de aproximadamente 1 μm e uma altura de seção transversal de 0,18 μm e ser posicionado 0,3 μm abaixo da camada de cavidade de amostra.
[00330] Um guia de onda pode ser dimensionado para apoiar um modo de radiação transversal único ou pode ser dimensionado para apoiar modos de radiação multitransversal. Em algumas modalidades, uma ou mais dimensões de um guia de onda podem agir de maneira que o guia de onda sustenta apenas um modo transversal único e pode seletivamente propagar modos de polarização TE ou TM. Em algumas implementações, um guia de onda pode ter seções altamente refletivas formadas em suas extremidades, de maneira que ele apoia um modo constante longitudinal dentro do guia de onda. Ao apoiar um modo, o guia de onda pode ter efeitos de interferência modal reduzidos a partir do acoplamento cruzado de modos tendo constantes de propagação diferentes. Em algumas modalidades, as seções altamente refletivas compreendem uma superfície altamente refletiva, única. Em outras modalidades, as seções altamente refletivas compreendem estruturas refletivas múltiplas que, em agregado, resultam em alta refletância. Guias de onda podem ser configurados para dividir energia de excitação de uma fonte de excitação única tendo uma intensidade de saída maior usando divisores de feixe de guia de onda para criar uma pluralidade de feixes de energia de excitação a partir de uma fonte de excitação única. Tais divisores de feixe podem incluir mecanismos de acoplamento evanescentes. Adicionalmente ou alternativamente, cristais fotônicos podem ser usados na estrutura de comprimento de onda para aperfeiçoar propagação de energia de excitação e/ou no material circundando o guia de onda para reduzir difração de energia de excitação.
[00331] A posição e arranjo do guia de onda com relação as outros componentes em um pixel dos dispositivos integrados podem ser configurados para aperfeiçoar acoplamento de energia de excitação em direção a uma cavidade de amostra, melhorar coleta de energia de emissão pelo sensor e/ou reduzir ruído de sinal introduzido por energia de excitação. Um guia de onda pode ser dimensionado e/ou posicionado em relação a uma cavidade de amostra de maneira a reduzir interferência de energia de excitação propagando no guia de onda com energia de emissão emitida da cavidade de amostra. Posicionamento e arranjo de um guia de onda em um dispositivo integrado podem depender dos índices de refração do guia de onda e materiais circundando o guia de onda. Por exemplo, uma dimensão do guia de onda perpendicular a uma direção de propagação de luz ao longo do guia de onda e dentro de um plano do guia de onda pode ser aumentada de maneira que uma quantidade substancial de energia de emissão a partir de uma cavidade de amostra passa pelo guia de onda conforme ele propaga para o sensor do pixel. Em algumas implementações, uma distância entre uma cavidade de amostra e guia de onda e/ou espessura de guia de onda pode ser selecionada para reduzir reflexos a partir de uma ou mais interfaces entre o guia de onda e um material circundante. De acordo com algumas modalidades, reflexo de energia de emissão por um guia de onda pode ser reduzido para menos do que cerca de 5% em algumas modalidades, menos do que cerca de 2% em algumas modalidades e ainda menos do que cerca de 1% em algumas modalidades.
[00332] A capacidade de um comprimento de onda em propagar energia de excitação pode depender ambos do material para o comprimento e onda e material circundando o guia de onda. Desta maneira, a estrutura do guia de onda pode incluir um material de núcleo, tal como guia de onda 26-220, e um material de revestimento, tal como região 26-224 como ilustrado na Figura 26. O material de ambos o guia de onda e material circundante pode permitir a propagação de energia de excitação tendo um comprimento de onda característico através do guia de onda. Material ou para o guia de onda ou para o material circundante pode ser selecionado para índices particulares de refração ou combinação de índices de refração. O material de guia de onda pode ter um índice refrativo menor do que o material circundante de guia de onda. Exemplo de materiais de guia de onda incluem nitrida de silício (SixNy), oxinitrida de silício, carbida de silício, óxido de tântalo (TaO2), dióxido de alumínio. Materiais circundantes de guia de onde exemplares incluem dióxido de silício (SiO2) e óxido de silício. O guia de onda e/ou o material circundante podem incluir um ou mais materiais. Em alguns casos, um índice refrativo desejado para um guia de onda e/ou material circundante pode ser obtido através da formação do guia de onda e/ou material circundante para incluir mais de um material. Em algumas modalidades, um guia de onda compreende nitrida de silício e um material circundante compreende dióxido de silício.
[00333] Divisão de guias de onda de um guia de onda único em guias de onda múltiplos pode permitir que energia de excitação atinja fileiras ou colunas múltiplas de cavidades de amostra de um dispositivo integrado. Uma fonte de excitação pode ser acoplada a um guia de onda de entrada e o guia de onda de entrada pode se separar em múltiplos guias de onda de saída, onde cada guia de onda de saída transmite energia de excitação para uma fileira ou coluna de cavidades de amostra. Quaisquer técnicas adequadas para divisão e/ou combinação de guias de onda podem ser usadas. Tais técnicas de divisão e/ou combinação de guia de onda podem incluir um divisor ou acoplador em estrela, um divisor em Y e/ou um acoplador evanescente. Adicionalmente ou alternativamente, um divisor de interferência multimodal (MMI) pode ser usado para divisão e/ou combinação de guias de onda. Uma ou mais dessas técnicas de divisão e/ou combinação de guia de onda podem ser usadas para direcionamento de energia de excitação a uma cavidade de amostra.
C. Cavidade de Amostra
[00334] De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra 27-210 pode ser formada em um ou mais pixels de um dispositivo integrado. Uma cavidade de amostra pode compreender um volume ou região pequeno formado em uma superfície de um substrato 27-105 e arranjado de maneira que as amostras 27-101 podem difundir para dentro e fora da cavidade de amostra de um espécime depositado sobre a superfície do substrato, como mostrado na Figura 27A e Figura 27B, que ilustram um pixel único 27-100 de um dispositivo integrado. Em várias modalidades, uma cavidade de amostra 27-210 pode ser arranjada para receber energia de excitação de um guia de onda 27-240. As amostras 27-101 que difundem para a cavidade de amostra podem ser retidas, temporariamente ou permanentemente, dentro de uma região de excitação 27-215 da cavidade de amostra por uma aderente 27-211. Na região de excitação, uma amostra pode ser excitada por energia de excitação (por exemplo, radiação de excitação 27-247) e subsequentemente emitir radiação que pode ser observada e avaliada para caracterizar a amostra.
[00335] Em detalhe de operação adicional, pelo menos uma amostra 27-101 a ser analisada pode ser introduzida em uma cavidade de amostra 27-210, por exemplo, de um espécime (não mostrado) contendo uma suspensão fluida de amostras. Energia de excitação de um guia de onda 27-240 pode excitar a amostra ou pelo menos um marcador ligado à amostra ou incluído em um tag associado com a amostra enquanto ela está dentro de uma região de excitação 27-215 dentro da cavidade de amostra. De acordo com algumas modalidades, um marcador pode ser uma molécula luminescente (por exemplo, fluoróforo) ou ponto quântico. Em algumas implementações, pode haver mais de um marcador que é usado para analisar uma amostra (por exemplo, marcadores e tags distintos que são usados para sequenciamento genético de molécula única como descrito em "RealTime DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules," de J. Eid e outros, Science 323, p. 133 (2009), que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). Durante e/ou após excitação, a amostra ou marcador pode emitir energia de emissão. Quando marcadores múltiplos são usados, eles podem emitir em energias características diferentes e/ou emitir com características temporais diferentes incluindo tempos de vida diferentes. A energia de emissão da cavidade de amostra pode irradiar ou de outro modo viajar para um sensor 27260 onde a energia de emissão é detectada e convertida em sinais elétricos que podem ser usados para caracterizar a amostra.
[00336] De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra 27-210 pode ser uma estrutura parcialmente encerrada, como mostrado na Figura 27B. Em algumas implementações, uma cavidade de amostra 27-210 compreende um orifício ou abertura dimensionado em submícron (caracterizado por pelo menos uma dimensão transversal Dsw) formado em pelo menos uma camada de material 27230. Em alguns casos, o orifício pode ser referido como uma "nanoabertura". A dimensão transversal da cavidade de amostra pode estar entre aproximadamente 20 nanometros e aproximadamente 1 mícron, de acordo com algumas modalidades, embora tamanhos maiores e menores possam ser usados em algumas implementações. Um volume da cavidade de amostra 27-210 pode estar entre cerca de 10-21 litros e cerca de 10-15 litros, em algumas implementações. Uma cavidade de amostra pode ser formada como um guia de onda que pode, ou não, apoiar um modo de propagação. Uma cavidade de amostra pode ser formada como um guia de onda que pode, ou não, apoiar um modo de propagação. Em algumas modalidades, uma cavidade de amostra pode ser formada como um guia de onda de modo zero (ZMW) tendo um formato cilíndrico (ou formado similar) com um diâmetro (ou dimensão transversal maior) Dsw. Um ZMW pode ser formado em uma camada de metal única como um orifício em nanoescala que não apoia um modo óptico de propagação através do orifício.
[00337] Devido ao fato da cavidade de amostra 27-210 ter um volume pequeno, detecção de eventos de amostra única (por exemplo, eventos de molécula única) em cada pixel podem ser possíveis embora amostras possam ser concentradas em um espécime examinado em concentrações que são similares àquelas encontradas em ambientes naturais. Por exemplo, concentrações micromolares da amostra podem estar presentes em um espécime que é posto em contato com o dispositivo integrado, mas no nível de pixel apenas cerca de uma amostra (ou evento de molécula única) pode estar dentro de uma cavidade de amostra em qualquer dado tempo. Estatisticamente, algumas cavidades de amostra não podem conter quaisquer amostras e algumas podem conter mais de uma amostra. No entanto, um número apreciável de cavidades de amostra pode conter uma amostra única (por exemplo, pelo menos 30% em algumas modalidades), de maneira que análise de molécula única pode ser realizada em paralelo para um número grande de pixels. Devido ao fato que eventos de molécula única e amostra única podem ser analisados em cada pixel, o dispositivo integrado torna possível detectar eventos raros que podem de outro modo passar despercebidos em médias em conjunto.
[00338] Uma dimensão transversal Dsw de uma cavidade de amostra pode estar entre cerca de 500 nanometros (nm) e cerca de um mícron em algumas modalidades, entre cerca de 250 nm e cerca de 500 nm em algumas modalidades, entre cerca de 100 nm e cerca de 250 nm em algumas modalidades e ainda entre cerca de 20 nm e cerca de 100 nm em algumas modalidades. De acordo com algumas implementações, uma dimensão transversa de uma cavidade de amostra está entre aproximadamente 80 nm e aproximadamente 180 nm ou entre aproximadamente um quarto e um oitavo do comprimento de onda de excitação ou comprimento de onda de emissão. De acordo com outras implementações, uma dimensão transversal de uma cavidade de amostra está entre aproximadamente 120 nm e aproximadamente 170 nm. Em algumas modalidades, a profundidade ou altura da cavidade da amostra 27-210 pode ser entre cerca de 50 nm e cerca de 500 nm. Em algumas implementações, a profundidade ou altura da cavidade de amostra 27-210 pode estar entre cerca de 80 nm e cerca de 250 nm.
[00339] Uma cavidade de amostra 27-210 tendo um subcomprimento, a dimensão transversal pode melhorar a operação de um pixel 27-100 de um dispositivo integrado pelo menos de duas maneiras. Por exemplo, energia de excitação incidente na cavidade da amostra a partir de um lado oposto do espécime pode acoplar em uma região de excitação 27-215 com uma potência diminuindo exponencialmente, e não propagar através da cavidade da amostra para o espécime. Como resultado, energia de excitação é aumentada na região de excitação onde ela excita uma amostra de interesse, e é reduzida no espécime onde ela excitaria outras amostras que contribuiriam para ruído de base. Também, emissão a partir de uma amostra retida em uma base da cavidade (por exemplo, mais próximo do sensor 27-260) é preferivelmente direcionada para sensor, uma vez que emissão propagando através da cavidade de amostra é altamente suprimida. Ambos esses efeitos podem aperfeiçoar a razão de sinal- para-ruído no pixel. Os inventores reconheceram vários aspectos da cavidade de amostra que podem ser aperfeiçoados para reforçar mais níveis de sinal-para-ruído no pixel. Esses aspectos se referem ao formato e estrutura da cavidade da amostra e também a estruturas ópticas e plasmônicas adjacentes (descritas abaixo) que auxiliam no acoplamento da energia de excitação à cavidade da amostra e radiação emitida a partir da cavidade da amostra.
[00340] De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra 27-210 pode ser formada como uma nanoabertura configurada para não apoiar um modo de propagação para comprimentos de onda particulares de interesse. Em alguns casos, a nanoabertura é configurada onde todos os modos estão abaixo de um comprimento de onda limiar e a abertura pode ser uma nanoabertura de subcorte (SCN). Por exemplo, a cavidade da amostra 27-210 pode compreender um orifício ou furo em formato esférico em uma camada condutora. A seção transversal de uma cavidade de amostra não precisa ser redonda e pode ser elíptica, quadrada, retangular ou poligonal em algumas modalidades. A energia de excitação 27-247 (por exemplo, radiação visível ou próximo do infravermelho) pode entrar na cavidade de amostra através de uma abertura de entrada 27212 que pode ser definida por paredes 27-214 da cavidade de amostra em uma primeira extremidade da cavidade, como mostrado na Figura 27B. Quando formada como um SNC, a energia de excitação pode decair exponencialmente ao longo de um comprimento da nanoabertura (por exemplo, na direção do espécime). Em algumas implementações, o guia de onda pode compreender um SCN para radiação emitida a partir da amostra, mas pode não ser um SCn para energia de excitação. Por exemplo, a abertura e o guia de onda formados pela cavidade de amostra podem ser grandes o suficiente para apoiar um modo de propagação para a energia de excitação, uma vez que ela pode ter um comprimento de onda mais curto do que a radiação emitida. A emissão, em um comprimento de onda mais longo, pode estar além de um comprimento de onda de corte para um modo de propagação no guia de onda. De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra 27-210 pode compreender um SCN para a energia de excitação, de maneira que a intensidade maior de energia de excitação está localizada para uma região de excitação 27-215 da cavidade de amostra em uma entrada para a cavidade de amostra 27-210 (por exemplo, localizada próximo da interface entre a cavidade 27-235 e a camada 27-230 como mostrado no desenho). Tal localização da energia de excitação pode aperfeiçoar a localização de energia de emissão a partir da amostra, e limitar a emissão observada que emitiu de uma amostra única (por exemplo, uma molécula única).
[00341] De acordo com algumas modalidades, um pixel 27-100 pode incluir estruturas adicionais. Por exemplo, um pixel 27-100 pode incluir uma ou mais estruturas de acoplamento de excitação 27-220 que afeta acoplamento de energia de excitação a uma amostra dentro da cavidade de amostra. Um pixel pode também incluir uma estrutura de direcionamento de emissão 27-250 que afeta direcionamento da energia de emissão a partir de uma amostra dentro da cavidade da amostra para o sensor 27-260.
[00342] Para aperfeiçoar a intensidade de energia de excitação que está localizada na cavidade da amostra, outras estruturas de cavidade de amostra foram desenvolvidas e estudadas pelos inventores. A Figura 27C mostra uma modalidade de uma cavidade de amostra que inclui uma cavidade ou divot 27-216 em uma extremidade de excitação da cavidade de amostra. Adição de um divot 27-216 à cavidade de amostra permite que uma amostra se mova para uma região de intensidade de excitação maior, de acordo com algumas modalidades. Em algumas implementações, o formato e a estrutura do divot alteram o campo de excitação local (por exemplo, devido a uma diferença em índice de refração entre a camada 27-235 e fluido na cavidade de amostra), e pode aumentar mais a intensidade da energia de excitação do divot. O divot 27-216 pode ser formado dentro da camada 27-235 de maneira que uma porção do volume de amostra que ocupa a cavidade de amostra 27-214 e divot 27-216 é circundada pelo material que forma a camada 27-216.
[00343] O divot pode ter qualquer formato adequado. O divot pode ter um formato transversal que é substancialmente equivalente a um formato transversal da cavidade de amostra, por exemplo, redondo, elíptico, quadrado, retangular, poligonal, etc. Em algumas modalidades, as paredes laterais do divot podem ser substancialmente retas e verticais, igual às paredes da cavidade de amostra. Em algumas implementações, as paredes laterais do divot podem ser inclinadas e/ou curvadas, como mostrado no desenho. A dimensão transversal do divot pode ser aproximadamente do mesmo tamanho que a dimensão transversal da cavidade da amostra em algumas modalidades, pode ser menor do que a dimensão transversal da cavidade da amostra em algumas modalidades ou pode ser maior do que a dimensão transversal da cavidade de amostra em algumas modalidades. O divot 27-216 pode se estender entre aproximadamente 10 nm e aproximadamente 200 nm além da camada de cavidade de amostra 27-230. Em algumas implementações, o divot pode se estender entre aproximadamente 50 nm e aproximadamente 250 nm além da camada de cavidade de amostra 27-230. Em algumas modalidades, o divot pode se estender entre aproximadamente 150 nm e aproximadamente 250 nm além da camada de cavidade de amostra 27-230. Ao formar o divot, a região de excitação 27-215 pode se estender para fora da cavidade de amostra, como mostrado na Figura 27C.
[00344] Algumas modalidades se referem a um dispositivo integrado tendo uma cavidade de amostra com um divot posicionado próximo a um guia de onda. A Figura 28 mostra um dispositivo integrado tendo cavidade de amostra 27-632 formada na camada 28630 e camada 28-636. A camada 28-630 pode ser uma camada de metal e inclui um ou mais metais (por exemplo, Al). A camada 28-636 pode agir como uma camada dielétrica e incluir um ou mais materiais dielétricos (por exemplo, dióxido de silício). A cavidade de amostra 28- 632 pode ter uma dimensão variável em uma direção paralela à camada 28-630 e/ou camada 28-636. A cavidade de amostra 28-632 pode ter uma dimensão D2 ao longo da direção z pelo menos dentro da camada 28-630 do dispositivo integrado e em algumas modalidades, a dimensão D2 pode ser considerada um diâmetro de cavidade de amostra 28-632. A dimensão D2 de cavidade de amostra 28-632 pode ser aproximadamente 700 nm, aproximadamente 800 nm, aproximadamente 900 nm, aproximadamente 1 mícron ou aproximadamente 1,1 mícron. A cavidade de amostra 28-632 pode ter uma dimensão D1 ao longo da direção z dentro da camada 28-636 do dispositivo integrado e, em algumas modalidades, pode ser considerado um diâmetro em uma superfície de cavidade de amostra 28-632. A dimensão D1 pode ser aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 200 nm ou aproximadamente 250 nm. A superfície da cavidade de amostra 28632 tendo dimensão D1 é posicionada uma dimensão d1 ao longo da direção x do guia de onda 28-634. Posicionamento da cavidade de amostra 28-632 próximo ao guia de onda 28-634 uma distância d1 pode permitir acoplamento aperfeiçoado de energia de excitação do guia de onda 28-634 à cavidade de amostra 28-632. A dimensão d1 pode ser aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 200 nm ou aproximadamente 250 nm.
D. Energia de Excitação de Acoplamento para Cavidade de Amostra
[00345] Acoplamento de energia de excitação a uma ou mais cavidades de amostra do dispositivo integrado pode ocorrer através de uma ou mais técnicas. Como discutido anteriormente, em algumas modalidades, um guia de onda é posicionado para acoplar uma fonte de excitação para uma ou mais cavidades de amostra. Uma energia de excitação propaga ao longo do guia de onda, uma porção da energia de excitação pode acoplar com uma ou mais cavidades de amostra através de uma variedade de técnicas de acoplamento de luz. Por exemplo, o guia de onda pode guiar energia de excitação substancialmente em uma direção, e uma onda ou cauda evanescente pode se formar perpendicular a esta uma direção e, em alguns casos, estar localizada fora da estrutura de guia de onda. Tal cauda evanescente pode direcionar uma porção de energia de excitação em direção a uma ou mais cavidades de amostra. Em algumas modalidades, a camada de cavidade de amostra pode ser projetada e configurada para direcionar energia de excitação para uma região localizada dentro da cavidade de amostra. A cavidade de amostra pode ser configurada para reter uma amostra dentro da região localizada da cavidade de amostra de maneira que energia de excitação é direcionada para a amostra.
[00346] Ainda, um ou mais componentes podem ser formados em um dispositivo integrado para aperfeiçoar ou aumentar acoplamento de energia de excitação a uma cavidade de amostra. Esses componentes adicionais podem ser formados em um pixel e prover acoplamento de energia de excitação a partir de um guia de onda para o pixel e em direção à cavidade da amostra. Um ou mais componentes localizados em um pixel podem agir para afunilar uma porção da energia de excitação de um guia de onda para o pixel. Tais componentes podem incluir estruturas ópticas tais como estruturas de rede, estruturas de difração, microcavidades e/ou nanoantenas. Características ou configurações de um ou mais desses componentes podem ser selecionadas para acoplamento de uma certa quantidade de energia de excitação a cada cavidade de amostra dentro de uma fileira ou coluna de cavidades de amostra. Um guia de onda configurado para prover energia de excitação a uma fileira de pixels pode acoplar a um componente em cada região de pixel para prover uma porção da energia de excitação a cada pixel na fileira de pixels. Quando um guia de onda é configurado para direcionar energia de excitação a partir de uma fonte de excitação para um ou mais pixels, o guia de onda pode ser referido como um guia de onda de barramento.
[00347] Componentes posicionados adjacentes a uma cavidade de amostra podem aperfeiçoar acoplamento de energia de excitação a partir de guia de onda para cavidade de amostra. Tais componentes podem ser chamados taps e/ou microcavidades. Uma microcavidade pode defletir uma porção da energia de excitação do guia de onda de maneira que energia de excitação atinge a cavidade de amostra. Uma ou mais microcavidades podem ser usadas para acoplar energia de excitação a uma cavidade de amostra. As uma ou mais microcavidades podem reduzir perda de energia de excitação a partir do guia de onda, incluindo perda metálica. Uma ou mais microcavidades podem agir como uma lente para focar energia de excitação para cavidade de amostra. Em algumas modalidades, uma ou mais microcavidades podem aperfeiçoar direcionamento de luminescência a partir de um marcador na cavidade de amostra em direção ao sensor. As microcavidades podem ter uma configuração cilíndrica, convexa, côncava, retangular, esférica ou elíptica ou qualquer outro formato adequado. Uma microcavidade pode ser formada de qualquer material adequado. Em algumas modalidades, uma microcavidade pode incluir nitrida de silício.
[00348] Uma ou mais microcavidades podem se sobrepor a pelo menos uma porção de um guia de onda para direcionar energia de excitação em direção à cavidade da amostra quando vista a partir de cima do dispositivo integrado onde as cavidades da amostra estão presentes. A espessura de um guia de onda pode ser configurada para reduzir energia de excitação e aperfeiçoar acoplamento de energia de excitação a uma ou mais microcavidades. Em algumas modalidades, microcavidades ao longo de uma fileira de cavidades de amostra podem variar em resistência de acoplamento entre o guia de onda para cada cavidade de amostra. As microcavidades podem aumentar acoplamento ao longo da direção de propagação da energia de excitação a fim de acomodar uma potência reduzida no guia de onda conforme energia de excitação é direcionada para fora do guia de onda para cada cavidade de amostra. Em algumas modalidades, uma ou mais microcavidades são adjacentes à cavidade de amostra. Pode haver uma distância de deslocamento entre a localização do centro de uma cavidade de amostra e o centro de uma microcavidade. Em outras modalidades, uma microcavidade está localizada abaixo de uma cavidade de amostra de maneira que pelo menos uma porção da cavidade de amostra e uma porção da microcavidade se sobrepõem quando vistas a partir de cima do dispositivo integrado onde as cavidades de amostra estão presentes.
[00349] Uma ou mais dimensões de um guia de onda de um dispositivo integrado podem variar ao longo do comprimento do guia de onda na direção de propagação de luz através do guia de onda. Variação de uma ou mais dimensões ao longo do guia de onda pode prover eficiência de acoplamento e uniformidade substancial na quantidade de energia de excitação provida pelo guia de onda para uma pluralidade de cavidades de amostra. Em algumas modalidades, a largura da seção transversal de um guia de onda pode variar ao longo de uma fileira ou coluna de pixels. O guia de onda pode incluir um afunilador de maneira que a largura da seção transversal do guia de onda diminui ao longo da direção de propagação de energia de excitação através do guia de onda. Em algumas modalidades, um guia de onda afunilado pode ser configurado para uma eficiência de acoplamento similar para uma fileira de pixels onde pixels na fileira incluem uma microcavidade e uma cavidade de amostra. Uma combinação de variação de uma ou mais dimensões do guia de onda afunilado e/ou da microcavidade pode acomodar redução em potência de energia de excitação ao longo do comprimento de um guia de onda conforme energia de excitação é acoplada a cada cavidade de amostra na fileira.
[00350] Em algumas modalidades, um guia de onda pode acoplar a uma cavidade de amostra através de um campo evanescente. Em algumas modalidades, uma estrutura de rede bullseye tendo anéis de rede concêntricos posicionados próximo a uma cavidade de amostra pode aperfeiçoar acoplamento de energia de excitação a partir do guia de onda para a cavidade de amostra. Em algumas modalidades, o guia de onda pode incluir uma região tendo uma largura de seção transversal reduzida na vizinhança de uma cavidade de amostra de maneira que um campo evanescente a partir da energia de excitação propagando no guia de onda acopla com a cavidade de amostra. Para uma fileira de pixels, um guia de onda pode incluir regiões múltiplas tendo uma largura de seção transversal reduzida ao longo do comprimento do guia de onda para aperfeiçoar uniformidade e eficiência de acoplamento dentre cavidades de amostra na fileira. Desta maneira, o guia de onda pode ser considerado ter seções comprimidos em certos locais ao longo do guia de onda.
[00351] A camada de um dispositivo integrado tendo uma ou mais cavidades de amostra pode interferir com propagação de luz através de um guia de onda. Em algumas modalidades, a camada de cavidade de amostra é formada de um metal (por exemplo, alumínio). Pode ser desejável posicionar a camada de cavidade de amostra a uma certa distância do guia de onda para reduzir perda e aperfeiçoar o desempenho do dispositivo. Essas técnicas podem permitir um desempenho desejado atingido pelo posicionamento da camada de cavidade de amostra a uma certa distância do guia de onda enquanto permitindo que uma cavidade de amostra na camada receba uma quantidade suficiente de energia de excitação.
E. Direcionamento de Energia de Emissão para o Sensor
[00352] Um dispositivo integrado pode incluir um ou mais componentes posicionados entre uma cavidade de amostra e um sensor de um pixel para aperfeiçoar coleta de luminescência pelo sensor a partir de uma amostra na cavidade de amostra. Tais componentes podem aperfeiçoar a razão de sinal-para-ruído do sinal de luminescência para um sinal de base para prover detecção aperfeicoada de um marcador luminescente. Alguns componentes pode direcionar luminescência a partir de uma cavidade de amostra para um sensor correspondente em um pixel. Em algumas modalidades, um componente pode prover ambos acoplamento adequado de energia de excitação para uma cavidade de amostra e acoplamento de luminescência fora da cavidade de amostra. Outros componentes (por exemplo, filtros) podem reduzir energia de excitação e outra luz não associada com a amostra e/ou marcador de contribuir para um sinal adquirido pelo sensor.
[00353] Uma rede bullseye pode ser formada a partir de anéis de rede concêntricos ao redor de uma cavidade de amostra. Uma rede bullseye pode acoplar com uma cavidade de amostra para aperfeiçoar propagação de luminescência fora da cavidade de amostra. A estrutura de rede bullseye pode direcionar luminescência em direção a um sensor em um pixel tendo a cavidade de amostra. Em algumas modalidades, um diâmetro eficaz da luminescência direcionada por uma rede de bullseye é aproximadamente 5 mícrons. Em algumas modalidades, uma ou mais microcavidades providas para acoplamento de um guia de onda e uma cavidade de amostra para permitir propagação de energia de excitação para a cavidade de amostra podem também direcionar luminescência a partir de uma cavidade de amostra para um sensor.
[00354] Um defletor tendo uma abertura centrada em um sensor pode ser formada entre uma cavidade de amostra e o sensor. Como mostrado na Figura 26, a camada de defletor 2-226 é posicionada entre cavidade de amostra 26-22 e camada de sensor 26-230. Um defletor em um pixel pode ser projetado para suprimir coleta de energia além de luminescência para pixel. Um defletor associado com uma cavidade de amostra e um sensor pode permitir que luminescência da cavidade de amostra atinja o sensor enquanto reduzindo luminescência de pixels vizinhos, energia de excitação e outra energia não associada com a luminescência da cavidade de amostra associada com o sensor. Uma dimensão da abertura do defletor pode ser configurada para permitir luminescência direcionada por um bullseye no mesmo pixel. Como mostrado na Figura 26, o defletor 26-226 tem aberturas ao longo da direção z para permitir que luminescência passe através para sensores posicionados na camada 26-230. O material de um defletor pode ser selecionado por certas propriedades ópticas, tal como redução de transmissão de certos comprimentos de onda de luz ou energias em certos ângulos incidentes. Em algumas modalidades, um defletor pode ser formado por múltiplas camadas de materiais tendo índices refrativos diferentes. Um defletor pode incluir uma ou mais camadas de silício, nitrida de silício (Si3N4), silício, nitrato de titânio (TiN) e alumínio (Al). Uma camada configurada para formar um defletor pode ter uma altura de seção transversal de aproximadamente 20 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 60 nm, aproximadamente 70 nm, aproximadamente 80 nm ou aproximadamente 90 nm.
[00355] Componentes de filtragem podem ser formados entre um guia de onda e um sensor para redução da coleta de energia de excitação pelo sensor. Qualquer maneira adequada para filtragem de energia de excitação pode ser provida. Técnicas para filtragem da energia de excitação podem incluir filtragem com base em uma ou mais características de luz. Tais características podem incluir comprimento de onda e/ou polarização. Componentes de filtragem podem seletivamente suprimir energia de excitação dispersa enquanto permitindo que luminescência passe pelo sensor. A camada 26-228 mostrada na Figura 26 pode incluir um ou mais componentes de filtragem descritos aqui.
[00356] Um dispositivo integrado pode incluir um filtro de comprimento de onda configurado para refletir luz de um ou mais comprimentos de onda característicos e permitir transmissão de luz tendo um comprimento de onda característicos diferente. Em algumas modalidades, luz refletida por um filtro de comprimento de onda pode ter um comprimento de onda característico mais curto do que a luz transmitida pelo filtro de comprimento de onda. Tal filtro de comprimento de onda pode refletir energia de excitação e permitir transmissão de luminescência uma vez que energia de excitação usada para excitar um marcador tem tipicamente um comprimento de onda característico mais curto do que luminescência emitida pelo marcador em resposta atingindo um estado de excitação pela energia de excitação.
F. Sensor
[00357] Qualquer sensor adequado capaz de adquirir informação de agrupamento de tempo pode ser usado para medições para detectar tempos de vida de marcadores luminescentes. Por exemplo, o Pedido de Patente U.S. 14/821.565 intitulado "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS" descreve um sensor capaz de determinação de um tempo de chegada de um fóton e é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Os sensores são alinhados de maneira que cada cavidade de amostra tem pelo menos uma região de sensor para detectar luminescência a partir da cavidade da amostra. Em algumas modalidades, o dispositivo integrado pode incluir arranjos de fotodiodo de avalanche de modo Geiger e/ou arranjos de diodo de avalanche de fóton único (SPADs).
[00358] É descrito aqui um fotodetector integrado que pode medir com precisão, ou "agrupamento de tempo", o momento de chegada de fótons incidentes, e que pode ser usado em uma variedade de aplicações, tais como sequenciamento de ácidos nucleicos (por exemplo, sequenciamento de DNA), por exemplo. Em algumas modalidades, o fotodetector integrado pode medir a chegada de fótons com resolução de nanossegundos ou picossegundo, o que pode facilitar análise de domínio de tempo da chegada de fótons incidentes.
[00359] Algumas modalidades se referem a um circuito integrado tendo um fotodetector que produz portadores de carga em resposta a fótons incidentes e que é capaz de discriminar o momento no qual os portadores de carga são gerados pela chegada de fótons incidentes com relação a um tempo de referência (por exemplo, um evento de disparo). Em algumas modalidades, uma estrutura de segregação de portador de carga segrega portadores de carga gerados em momentos diferentes e direciona os portadores de carga para uma ou mais regiões de armazenamento de portador de carga (chamados "agrupamentos") que agregam portadores de carga produzidos dentro de períodos de tempo diferentes. Cada agrupamento armazena portadores de carga produzidos dentro de um intervalo de tempo selecionado. Leitura da carga armazenada em cada agrupamento pode prover informação sobre o número de fótons que chegam dentro de cada intervalo de tempo. Tal circuito integrado pode ser usado em qualquer uma de uma variedade de aplicações, tais como aquelas descritas aqui.
[00360] Um exemplo de um circuito integrado tendo uma região de fotodetecção e uma estrutura de segregação de portador de carga será descrito. Em algumas modalidades, o circuito integrado pode incluir um arranjo de pixels, e cada pixel pode incluir uma ou mais regiões de fotodetecção e uma ou mais estruturas de segregação de portador de carga, como discutido abaixo. A Figura 29A mostra um diagrama de um pixel 29-900, de acordo com algumas modalidades. O pixel 29-900 inclui uma região de absorção de fóton/geração de portador 29-902 (também referida como uma região de fotodetecção), uma região de viagem/captura de portador 29-906, uma região de armazenamento de portador 29-908 tendo uma ou mais regiões de armazenamento de portador de carga, também referidas aqui como "agrupamentos de armazenamento de portador de carga" ou simplesmente "agrupamentos" e circuito de leitura 29-910 para leitura de sinais dos agrupamentos de armazenamento de portador de carga.
[00361] A região de absorção de fóton/geração de portador 29-902 pode ser uma região de material semicondutor (por exemplo, silício) que pode converter fótons incidentes em portadores de carga fotogerados. A região de absorção de fóton/geração de portador 29902 pode ser exposta à luz e pode receber fótons incidentes. Quando um fóton é absorvido pela região de absorção de fóton/geração de portador 29-902, ele pode gerar portadores de carga fotogerados, tal como um par de elétron/furos. Portadores de carga fotogerados são também referidos aqui como simplesmente "portadores de carga".
[00362] Um campo elétrico pode ser estabelecido na região de absorção de fóton/geração de portador 29-902. Em algumas modalidades, o campo elétrico pode ser "estático", conforme distinguido do campo elétrico que muda na região de viagem/captura de portador 29-906. O campo elétrico na região de absorção de fóton/geração de portador 29-902 pode incluir um componente lateral, um componente vertical ou ambos um componente lateral e um vertical. O componente lateral do campo elétrico pode estar na direção a jusante da Figura 29A, como indicado pelas setas, que induz uma força sobre portadores de carga fotogerados que os direciona para a região de viagem/captura de portador 106. O campo elétrico pode ser formado de uma variedade de maneiras.
[00363] Em algumas modalidades, um ou mais eletrodos podem ser formados na região de absorção de fóton/geração de portador 29-902. O(s) eletrodo(s) pode(m) ter tensões aplicadas ao(s) mesmo(s) para estabelecer um campo elétrico na região de absorção de fóton/geração de portador 29-902. Tal(is) eletrodo(s) pode(m) ser chamado(s) "fotoporta(s)". Em algumas modalidades, a região de absorção de fóton/geração de portador 29-902 pode ser uma região de silício que é totalmente depletada de portadores de carga.
[00364] Em algumas modalidades, o campo elétrico na região de absorção de fóton/geração de portador 29-902 pode ser estabelecido por uma junção, tal como uma junção PN. O material semicondutor da região de absorção de fóton/geração de portador 29-902 pode ser dopado para formar a junção PN com uma orientação e/ou formato que produz um campo elétrico que induz uma força nos portadores de carga fotogerados que os direciona para a região de absorção de fóton/geração de portador 29-902. Em algumas modalidades, o terminal P do diodo de junção PN pode conectar a um terminal que ajusta sua tensão. Tai diodo pode ser referido como um fotodiodo "fixo". Um fotodiodo fixo pode promover recombinação de portador na superfície, devido ao terminal que ajusta sua tensão e atrai portadores, o que pode reduzir a corrente escura. Portadores de carga fotogerados que são desejados ser capturados podem passar por baixo da área de recombinação na superfície. Em algumas modalidades, o campo elétrico lateral pode ser estabelecido usando uma concentração de dopagem graduada no material semicondutor.
[00365] Como ilustrado na Figura 29A, um fóton pode ser capturado e um portador de carga 29-901A (por exemplo, um elétron) pode ser produzido no tempo t1. Em algumas modalidades, um gradiente de potencial elétrico pode ser estabelecido ao longo da região de absorção de fóton/geração de portador 29-902 e da região de viagem/captura de portador 29-906 que faz com que o portador de carga 29-901A viaje na direção a jusante da Figura 29A (como ilustrado pelas setas mostradas na Figura 29A). Em resposta ao gradiente de potencial, o portador de carga 29-901a pode se mover de sua posição no tempo t1 para uma segunda posição no tempo t2, uma terceira posição no tempo t3, uma quarta posição no tempo t4 e uma quinta posição no tempo t5. O portador de carga 29-901A então se move para a região de viagem/captura de portador 29-906 em resposta ao gradiente de potencial.
[00366] A região de viagem/captura de portador 29-906 pode ser uma região semicondutora. Em algumas modalidades, a região de viagem/captura de portador 29-906 pode ser uma região semicondutora do mesmo material que uma região de absorção de fóton/geradora de portador 29-902 (por exemplo, silício) com a exceção que a região de viagem/captura 29-906 pode ser blindada de luz incidente (por exemplo, por um material opaco de sobreposição, tal como uma camada de metal).
[00367] Em algumas modalidades, e como discutido mais abaixo, um gradiente potencial pode ser estabelecido na região de absorção de fóton/geradora de portador 29-902 e a região de viagem/captura de portador 29-906 por eletrodos posicionados acima dessas regiões. No entanto, as técnicas descritas aqui não são limitadas quanto a posições particulares de eletrodos usados para produção de um gradiente de potencial elétrico. Nem são as técnicas descritas aqui limitadas para estabelecimento de um gradiente de potencial elétrico usando eletrodos. Em algumas modalidades, um gradiente de potencial elétrico pode ser estabelecido usando um perfil de dopagem espacialmente graduado. Qualquer técnica adequada pode ser usada para estabelecimento de um gradiente de potencial elétrico que faz com que portadores de carga viajem ao longo da região de absorção de fóton/geradora de portador 29-902 e região de viagem/captura de portador 29-906.
[00368] Uma estrutura de segregação de portador de carga pode ser formada no pixel para permitir segregação de portadores de carga produzidos em tempos diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da estrutura de segregação de portador de carga pode ser formada na região de viagem/captura de portador 29-906. Como será descrito abaixo, a estrutura de segregação de portador de carga pode incluir um ou mais eletrodos formados na região de viagem/captura de portador 29-906, cuja tensão pode ser controlada por circuito de controle para mudar o potencial elétrico na região de viagem/captura de portador 29-906.
[00369] O potencial elétrico na região de viagem/captura de portador 29-906 pode ser mudado para permitir captura de um portador de carga. O gradiente de potencial pode ser mudado mudando a tensão em um ou mais eletrodos cobrindo a região de viagem/captura de portador 29-906 para produzir uma barreira potencial que pode confinar um portador dentro de uma região espacial predeterminada. Por exemplo, a tensão em um eletrodo cobrindo a linha pontilhada na região de viagem/captura de eletrodo 29-906 da Figura 29A pode ser mudada no tempo t5 para aumentar uma barreira potencial ao longo da linha pontilhada na região de viagem/captura de portador 29-906 da Figura 29A, deste modo capturando o portador de carga 29-901A. Como mostrado na Figura 29A, o portador capturado no tempo t5 pode ser transferido como um agrupamento "agrupamenot0" de região de armazenamento de portador 29-908. A transferência do portador para o agrupamento de armazenamento de portador de carga pode ser realizada mudando o potencial na região de viagem/captura de portador 29-906 e/ou região de armazenamento de portador 29-908 (por exemplo, mudando a tensão de eletrodo(s) que cobrem essas regiões) para fazer com que o portador viaje para o agrupamento de armazenamento de portador de carga.
[00370] Mudança do potencial em um certo ponto no tempo dentro de uma região espacial predeterminada da região de viagem/captura de portador 29-906 pode permitir aprisionamento de um portador que foi gerado por absorção de fóton que ocorreu dentro de um intervalo de tempo específico. Ao aprisionar portadores de carga fotogerados em tempos e/ou locais diferentes, os tempos nos quais os portadores de carga foram gerados por absorção de fóton podem ser discriminados. Neste sentido, um portador de carga pode ser "agrupado em tempo" aprisionando o portador de carga em um certo ponto no tempo e/ou espaço após a ocorrência de um evento de gatilho. O agrupamento de tempo de um portador de carga dentro de um agrupamento particular provê informação sobre o tempo no qual o portador de carga fotogerado foi gerado por absorção de um fóton incidente, e então da mesma maneira "agrupamentos de tempo", com relação ao evento de gatilho, a chegada do fóton incidente que produziu o portador de carga fotogerado.
[00371] A Figura 29B ilustra captura de um portador de carga em um ponto diferente em tempo e espaço. Como mostrado na Figura 29B, a tensão de um eletrodo que cobre a linha pontilhada na região de viagem/captura de portador 29-906 pode ser mudada no tempo t9 para aumentar uma barreira potencial ao longo da linha pontilhada na região de viagem/captura de portador 206 da Figura 29B, desta maneira capturando o portador 29-901B. Como mostrado na Figura 29B, o portador capturado no tempo t9 pode ser transferido para um agrupamento "agrupamento1" de região de armazenamento de portador 29-908. Uma vez que o portador de carga 29-901B é aprisionado no tempo t9, ele representa um evento de absorção de fóton que ocorreu em um tempo diferente (isto é, tempo t6) do evento de absorção de fóton (isto é, em t1) para o portador 29-901A, que é capturado no tempo t5.
[00372] Realização de medições múltiplas e agregação de portadores de carga nos agrupamentos de armazenamento de portador da região de armazenamento de portador 29-908 com base nos tempos nos quais os portadores de carga são capturados pode prover informação sobre os tempos nos quais fótons são capturados na área de absorção de fóton/de geração de portador 29-902. Tal informação pode ser útil em uma variedade de aplicações, como discutido acima.
[00373] Em algumas modalidades, a duração de tempo que cada agrupamento de tempo captura após um pulso de excitação pode variar. Por exemplo, agrupamentos de tempo mais curtos podem ser usados para detectar luminescência logo após o pulso de excitação, enquanto agrupamentos de tempo mais longos podem ser usados em tempos adicionais a partir de um pulso de excitação. Ao variar os intervalos de agrupamento de tempo, a razão de sinal para ruído para medições do sinal elétrico associado com cada agrupamento de tempo pode ser aperfeiçoada para um dado sensor. Uma vez que a probabilidade de um evento de emissão de fóton é maior logo após um pulso de excitação, um agrupamento de tempo dentro deste tempo pode ter um intervalo de tempo mais curto para dar conta do potencial de mais fótons para detectar. Enquanto em tempos mais longos, a probabilidade de emissão de fóton pode ser menor e um agrupamento de tempo detectando dentro deste tempo pode ser mais longo para dar conta de um número menor de potencial de fótons. Em algumas modalidades, um agrupamento de tempo com uma duração de tempo significantemente mais longa pode ser usado para distinguir dentre tempos de vida múltiplos. Por exemplo, a maioria dos agrupamentos de tempo pode capturar um intervalo de tempo na faixa de aproximadamente 0,1-0,5 ns, enquanto um agrupamento de tempo pode capturar um intervalo de tempo na faixa de aproximadamente 2-5 ns. O número de agrupamentos de tempo e/ou o intervalo de tempo de cada agrupamento pode depender do sensor usado para detectar os fótons emitidos a partir do objeto de amostra. Determinação do intervalo de tempo para cada agrupamento pode incluir identificação dos intervalos de tempo necessários para o número de agrupamentos de tempo providos pelo sensor para distinguir dentre marcadores luminescentes usados para análise de uma amostra. A distribuição do histograma registrado pode ser comparada com histogramas conhecidos de marcadores sob condições e agrupamentos de tempo similares para identificar o tipo de marcador na cavidade de amostra. Modalidades diferentes do presente pedido podem medir tempos de vida de marcador, mas variam nas energias de excitação usadas para excitar um marcador, o número de regiões de sensor em cada pixel e/ou o comprimento de onda detectado pelos sensores.
Fonte de Excitação
[00374] De acordo com algumas modalidades, uma ou mais fontes de excitação podem estar localizados externo ao dispositivo integrado, e podem ser arranjadas para administrar pulsos de luz a um dispositivo integrado tendo cavidades de amostra. Por exemplo, o Pedido de Patente Provisório U.S. 62/164,485, intitulado "PULSED LASER," depositado em 20 de maio de 2015 e Pedido de Patente U.S. 62/310.398, intitulado "PULSED LASER," depositado em 18 de março de 2016 descrevem exemplos de fontes de laser pulsado que podem ser usadas como uma fonte de excitação, cada um deles é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Os pulsos de luz podem ser acoplados a uma pluralidade de cavidades de amostras e ser usados para excitar um ou mais marcadores dentro das cavidades, por exemplo. A uma ou mais fontes de excitação podem administrar pulsos de luz em um ou mais comprimentos de onda característicos, de acordo com algumas implementações. Em alguns casos, uma fonte de excitação pode ser empacotada como um módulo permutável que monta em ou acopla a um instrumento base, no qual o dispositivo integrado pode ser carregado. Energia de uma fonte de excitação pode ser transmitida radiativamente ou não radiativamente a pelo menos uma cavidade de amostra ou a pelo menos uma amostra em pelo menos uma cavidade de amostra. Em algumas implementações, uma fonte de excitação tendo uma intensidade controlável pode ser arranjada para transmitir energia de excitação para uma pluralidade de pixels de um dispositivo integrado. Os pixels podem ser arranjados em um arranjo linear (por exemplo, fileira ou coluna) ou em um arranjo 2D (por exemplo, uma subárea do arranjo de pixels ou do arranjo inteiro de pixels).
[00375] Qualquer fonte de luz adequada pode ser usada para uma fonte de excitação. Algumas modalidades podem ser fontes de luz incoerentes e outras modalidades podem ser fontes de luz coerentes. A título de exemplos não limitantes, fontes de luz incoerentes de acordo com algumas modalidades podem incluir tipos diferentes de diodos de emissão de luz (LEDs) tais como LEDs orgânicos (OLEDs), pontos quânticos (QLEDs), LEDs de nanofio e LEDs semicondutores (in)orgânicos. A título de exemplos não limitantes, fontes de luz coerentes de acordo com algumas modalidades podem incluir tipos diferentes de lasers tais como lasers semicondutores (por exemplo, lasers de emissão de superfície de cavidade vertical (VCSELs), lasers de emissão de borda e diodos de laser de feedback distribuído (DFV). Adicionalmente ou alternativamente, laser de guia de onda óptico acoplado à placa (SCOWLs) ou outras estruturas de guia de onda de modo único assimétricas podem ser usadas. Em algumas implementações, fontes de luz coerente podem compreender lasers orgânicos, lasers de ponto quântico e lasers de estado sólido (por exemplo, um laser de Nd:YAG ou ND:Vidro, bombeado por diodos de laser ou lâmpadas de flash). Em algumas modalidades, um laser de fibra bombeado por diodo de laser pode ser usado. Uma fonte de luz coerente pode ser de modo travado passivamente para produzir pulsos ultracurtos. Pode haver mais de um tipo de fonte de excitação para um arranjo de pixels em um dispositivo integrado. Em algumas modalidades, tipos diferentes de fontes de excitação podem ser combinados. Uma fonte de excitação pode ser fabricada de acordo com tecnologias convencionais que são usadas para fabricar um tipo selecionado de fonte de excitação.
[00376] Por meio de introdução e sem limitação da invenção, um arranjo exemplar de uma fonte de luz coerente é mostrado na Figura 30A. O desenho ilustra um instrumento analítico 30-100 que pode incluir uma fonte de excitação de laser pulsado ultracurto 30-110 como a fonte de excitação. O laser pulsado ultracurto 30-110 pode compreender um meio de ganho 30-105 (que pode ser um material em estado sólido em algumas modalidades), uma fonte de bombeamento para excitação do meio de ganho (não mostrado) e pelo menos dois espelhos de cavidade 30-102, 30-104 que definem extremidades de uma cavidade de laser óptico. Em algumas modalidades, pode haver um ou mais elementos ópticos adicionais na cavidade de laser para propósitos de modelagem de feixe, seleção de comprimento de onda e/ou formação de pulso. Quando operando a fonte de excitação de laser pulsado 30-110 pode produzir um pulso óptico ultracurto 30-120 que circula para a frente e para trás na cavidade de laser entre os espelhos de extremidade da cavidade 30-102, 30-104 e através do meio de ganho 30-105. Um dos espelhos de cavidade 30-104 pode transmitir parcialmente uma porção do pulso de circulação, de maneira que um trem de pulsos ópticos 30-122 é emitido a partir do laser pulsado 30-110 para componente subsequente 30-160, tal como um componente óptico e dispositivo integrado. Os pulsos emitidos podem varrer um feixe (indicado pelas linhas pontilhadas) que é caracterizado por uma cintura de feixe w.
[00377] Perfis de intensidade temporal medidos dos pulsos emitidos 30-122 podem aparecer como mostrado na Figura 30B. Em algumas modalidades, os valores de intensidade de pico dos pulsos emitidos podem ser aproximadamente iguais, e os perfis podem ter um perfil temporal Gaugassiano, embora outros perfis tal como perfil Sech sejam possíveis. Em alguns casos, os pulsos podem não ter perfis temporais simétricos e podem ter outros formatos temporais. Em algumas modalidades, dinâmica de ganho e/ou perda pode fornecer pulsos de rendimento tendo perfis assimétricos. A duração de cada pulso pode ser caracterizada por uma valor de largura à meia altura (FWHM), como indicado na Figura 30B. Pulsos ópticos ultracurtos podem ter valores de FWHM de menos do que 100 picossegundos.
[00378] Os pulsos emitindo de uma fonte de excitação de laser podem ser separados por intervalos regulares T. Em algumas modalidades, T pode ser determinado por taxas de modulação de ganho e/ou perda ativas no laser. Para lasers de modo bloqueado, T pode ser determinado por um tempo de viagem de ida e volta entre os espelhos de extremidade de cavidade 30-102, 30-104. De acordo com algumas modalidades, o tempo de separação de pulso T pode ser entre cerca de 1 ns e cerca de 100 ns. Em alguns casos, o tempo de separação de pulso T pode estar entre cerca de 0,1 ns e cerca de 1 ns. Em algumas implementações, o tempo de separação de pulso T pode estar entre cerca de 100 ns e cerca de 2 μs.
[00379] Em algumas modalidades, um sistema óptico 30-140 pode operar em um feixe de pulsos 30-122 de uma fonte de excitação de laser 30-110. Por exemplo, o sistema óptico pode incluir uma ou mais lentes para remodelar o feixe e/ou mudar a divergência do feixe. Remodelagem do feixe pode incluir aumento ou diminuição do valor da cintura do feixe e/ou mudança de um formato sem seção transversal do feixe (por exemplo, elíptico para circular, circular para elíptico, etc). Mudança da divergência do feixe pode compreender conversão ou divergência do fluxo de feixe. Em algumas implementações, o sistema ótico 30-140 pode incluir um atenuador ou amplificador para mudar a quantidade de energia de feixe. Em alguns casos, o sistema óptico pode incluir elementos de filtragem de comprimento de onda. Em algumas implementações, o sistema óptico pode incluir elementos de modelagem de pulso, por exemplo, um extensor de pulso e/ou compressor de pulso. Em algumas modalidades, o sistema óptico pode incluir um ou mais elementos ópticos não lineares, tal como um absorvedor saturável para redução do comprimento de um pulso. De acordo com algumas modalidades, o sistema óptico 30-140 pode incluir um ou mais elementos que alteram a polarização de pulsos a partir de uma fonte de excitação de laser 30-110.
[00380] Em algumas implementações, um sistema óptico 30-140 pode incluir um cristal não linear para conversão do comprimento de onda de saída de uma fonte de excitação 30-100 para um comprimento de onda mais curto através da duplicação da frequência ou para um comprimento de onda mais longo através de amplificação paramétrica. Por exemplo, uma saída do laser pode ser de frequência duplicada em um cristal não linear (por exemplo, em niobato de lítio periodicamente polido (PPLN)) ou outro cristal não linear não polido. Tal processo de duplicação de sequência pode permitir que lasers mais eficientes gerem comprimentos de onda mais adequados para excitação de fluoróforos selecionados.
[00381] A expressão "comprimento de onda característico" ou "comprimento de onda" pode se referir a um comprimento de onda central ou predominante dentro de uma largura de banda limitada de radiação produzida por uma fonte de excitação. Em alguns casos, ela pode se referir a um comprimento de onda de pico dentro de uma largura de faixa de radiação produzida por uma fonte de excitação. Um comprimento de onda característico de uma fonte de excitação pode ser selecionado com base em uma escolha de marcadores luminescentes ou sondas que são usados em um dispositivo de bioanálise, por exemplo. Em algumas implementações, o comprimento de onda característico de uma fonte de energia de excitação é selecionado para excitação direta (por exemplo, excitação de fóton único) de um fluoróforo escolhido. Em algumas implementações, o comprimento de onda característico de uma fonte de excitação é selecionado para excitação indireta (por exemplo, excitação de multifóton ou conversão harmônica para um comprimento de onda que proverá excitação direta). Em algumas modalidades, radiação de excitação pode ser gerada por uma fonte de luz que é configurada para gerar energia de excitação em um comprimento de onda particular para aplicação a uma cavidade de amostra. Em algumas modalidades, um comprimento de onda característico da fonte de excitação pode ser menos do que um comprimento de onda característico de emissão correspondente a partir da amostra. Por exemplo, uma fonte de excitação pode emitir radiação tendo um comprimento de onda característico entre 500 nm e 700 nm (por exemplo, 515 nm, 532 nm, 563 nm, 594 nm, 612 nm, 632 nm, 647 nm). Em algumas modalidades, uma fonte de excitação pode prover energia de excitação centrada em dois comprimentos de onda diferentes, tais como 532 nm e 593 nm, por exemplo.
[00382] Em algumas modalidades, uma fonte de excitação pulsada pode ser usada para excitar um marcador luminescente a fim de medir um tempo de vida de emissão do marcador luminescente. Isto pode ser útil para distinção de marcadores luminescentes com base em tempo de vida de emissão ao invés de cor ou comprimento de onda de emissão. Como um exemplo, uma fonte de excitação pulsada pode excitar periodicamente um marcador luminescente a fim de gerar e detectar eventos de emissão de fóton subsequentes que são usados para determinar um tempo de vida para o marcador. Medições de tempo de vida de marcadores luminescentes podem ser possíveis quando o pulso de excitação de uma fonte de excitação realiza transição de uma potência ou intensidade de pulso de pico para uma potência ou intensidade menor (por exemplo, quase extinto) por uma duração de tempo que é menos do que o tempo de vida do marcador luminescente. Pode ser benéfico se o pulso de excitação terminar rapidamente, de maneira que ele não excita novamente o marcador luminescente durante uma fase pós-excitação quando um tempo de vida do marcador luminescente está sendo avaliado. A título de exemplo e não limitação, a potência do pulso pode cair para aproximadamente 20 dB, aproximadamente 40 dB, aproximadamente 80 dB ou aproximadamente 120 dB menos do que a potência de pico após 250 picossegundos. Em algumas implementações, a potência de pulso pode cair para aproximadamente 20 dB, aproximadamente 40 dB, aproximadamente 80 dB ou aproximadamente 120 dB menos do que a potência de pico após 100 picossegundos.
[00383] Uma vantagem adicional do uso de pulsos de excitação ultracurtos para excitar marcadores luminescentes é reduzir fotoclareamento dos marcadores. Aplicação de energia de excitação contínua a um marcador pode clarear e/ou danificar um marcador luminescente com o tempo. Embora uma potência de pulso de pico da fonte de excitação possa ser consideravelmente maior do que um nível que danificaria rapidamente um marcador em exposição contínua, o uso de pulsos ultracurtos pode aumentar a quantidade de tempo e número de medições úteis antes do marcador ficar danificado pela energia de excitação.
[00384] Quando usando uma fonte de excitação pulsada para discernir tempos de vida de marcadores luminescentes, o tempo entre pulsos de energia de excitação pode ser tão longo quanto ou mais longo do que um tempo de vida mais longo dos marcadores a fim de observar e avaliar eventos de emissão após cada pulso de excitação. Por exemplo, o intervalo de tempo T (vide Figura 30B) entre pulsos de excitação pode ser mais longo do que qualquer tempo de vida de emissão dos fluoróforos examinados. Neste caso, um pulso subsequente pode não chegar antes de um fluoróforo excitado de um pulso anterior ter tido uma quantidade razoável de tempo para fluorescer. Em algumas modalidades, o intervalo T precisa ser longo o suficiente para determinar um tempo entre um pulso de excitação que excita um fluoróforo e um fóton subsequente emitido pelo fluoróforo após término de pulso de excitação e antes do próximo pulso de excitação.
[00385] Embora o intervalo entre pulsos de excitação T devam ser longos o suficiente para observar propriedades de declínio dos fluoróforos, é também desejável que o T seja curto o suficiente para permitir que muitas medições sejam feitas em um período de tempo curto. A título de exemplo e não limitação, tempos de vida de emissão de fluoróforos usados em algumas aplicações podem estar na faixa de cerca de 100 picossegundos a cerca de 10 nanossegundos. Desta maneira, pulsos de excitação usados para detectar e/ou discernir tais tempos de vida podem ter durações (FMHM) variando de a partir de cerca de 25 picossegundos a cerca de 2 nanossegundos e podem ser providos em taxas de repetição de pulso variando de a partir de cerca de 20 MHz a cerca de 1 GHz.
[00386] Em detalhes adicionais, quaisquer técnicas adequadas para modulação da energia de excitação para criar uma fonte de excitação pulsada para medições de tempo de vida podem ser usadas. Modulação direta de uma fonte de excitação, tal como um laser, pode envolver modulação do sinal de acionamento elétrico da fonte de excitação de maneira que a energia emitida está na forma de pulsos. A energia de alimentação para uma fonte de luz, incluindo a energia de bombeamento óptica, e injeção de portador de estado sólido e/ou remoção de portador de uma porção da região de ganho, pode ser modulada para realizar o ganho do meio de ganho, permitindo a formação de pulsos de energia de excitação através de modelagem de ganho dinâmico. Ainda, o fator de qualidade (Q) do ressonador óptico pode ser modulado por vários meios para formar pulsos usando técnicas de comutação Q. Tais técnicas de comutação Q pode ser ativas e/ou passivas. Os modos longitudinais de uma cavidade ressonante de um laser podem ser de fase bloqueada para produzir uma série de pulsos de luz emitida através de bloqueio de modo. Tais técnicas de bloqueio de modo podem ser ativas e/ou passivas. Uma cavidade de laser pode incluir uma seção de absorção separada para permitir modulação da densidade do portador e controle da perda de absorção desta seção, desta maneira provendo mecanismos adicionais para modelagem do pulso de excitação. Em algumas modalidades, um modulador óptico pode ser usado para modular um feixe de luz de onda continua (CW) para estar na forma de um pulso de energia de excitação. Em outras modalidades, um sinal enviado para um modulador óptico acústico (AOM) acoplado a uma fonte de excitação pode ser usado para mudar a deflexão, intensidade, frequência, fase e/ou polarização da luz de saída para produzir uma energia de excitação pulsada. AOMs podem ser também usados para varredura de feixe de onda contínuo, comutação Q e/ou modo de bloqueio. Embora as técnicas acima sejam descritas para criação de uma fonte de excitação pulsada, qualquer meio adequado para produzir uma fonte de excitação pulsada pode ser usado para medição de tempos de vida de marcadores luminescentes.
[00387] Em algumas modalidades, técnicas para formação de uma fonte de excitação pulsada adequada para medição de tempo de vida podem incluir modulação de um sinal elétrico de entrada que aciona emissão de fóton. Algumas fontes de excitação (por exemplo, lasers de diodo e LEDs) convertem um sinal elétrico, tal como uma corrente de alimentação, em um sinal de luz. As características do sinal de luz podem depender de características do sinal elétrico. Na produção de um sinal de luz pulsado, o sinal elétrico pode variar com o tempo a fim de produzir um sinal de luz variável. Modulação do sinal elétrico para ter uma forma de onda específica pode produzir um sinal óptico com uma forma de onda específica. O sinal elétrico pode ter uma forma de onda sinusoidal com uma certa frequência e os pulsos de luz resultantes podem ocorrer dentro de intervalos de tempo relacionados com a frequência. Por exemplo, um sinal elétrico com uma frequência de 500 MHz pode produzir um sinal de luz com pulsos a cada 2 nanosegundos. Feixes combinados produzidos por fontes de excitação pulsada distintas, sejam iguais ou diferentes uns dos outros, podem ter uma diferença de curso relativa abaixo de 1 mm.
[00388] Em algumas fontes de excitação, tais como diodos de laser, o sinal elétrico muda a densidade do portador e fótons são produzidos através da recombinação de elétron e pares de orifício. A densidade do portador é relacionada ao sinal de luz de maneira que quando a densidade do portador está acima de um limiar, um número substancial de fótons coerentes é gerado através de emissão estimulada. Corrente fornecida a um diodo de laser pode injetar elétrons ou carreadores no dispositivo e desta maneira aumentar a densidade do portador. Quando a densidade do portador está acima de um limiar, fótons podem ser gerados em uma taxa mais rápida do que o fornecimento atual dos portadores, e então a densidade do portador pode diminuir abaixo do limiar e geração de fótons reduz. Com a geração de fóton reduzida, a densidade do portador começa a aumentar novamente, devido à injeção de corrente continuada e a absorção de fótons, e eventualmente aumenta acima do limiar novamente. Este ciclo leva a oscilações da densidade do portador em torno do valor limiar para geração de fóton, resultando em um sinal de luz oscilante. Essa dinâmica, conhecida como oscilações de relaxamento, pode levar a artefatos no sinal de luz devido a oscilações da densidade do portador. Quando corrente é inicialmente fornecida a um laser, pode haver oscilações antes do sinal de luz atingir uma potência estável devido a oscilações na densidade do portador. Quando formando uma fonte de excitação pulsada, oscilações da densidade do portador podem introduzir artefatos para um sinal de luz pulsado. Artefatos de tais oscilações de relaxamento podem ampliar um sinal de luz pulsada e/ou produzir uma cauda no sinal de luz, limitando os tempos de vida que podem ser detectados por tal fonte de luz pulsada uma vez que o sinal de excitação pode sobrepor com fótons emitidos por um marcador luminescente.
[00389] Em algumas modalidades, técnicas para encurtamento da duração de tempo de um pulso de excitação podem ser usadas para reduzir a energia de excitação requerida para detectar marcadores luminescentes e desta maneira reduzir ou retardar clareamento e outro dano aos marcadores luminescentes. Técnicas para encurtamento da duração de tempo do pulso de excitação podem ser usadas para reduzir a potência e/ou intensidade da energia de excitação após um valor ou pico máximo do pulso de excitação, permitindo a detecção de tempos de vida mais curtos. Tais técnicas podem acionar eletricamente a fonte de excitação a fim de reduzir a potência de excitação após a potência de pico. Um sinal de acionamento elétrico pode ser ajustado especificamente para acionar a intensidade do pulso de energia de excitação para zero o máximo possível após o pulso de pico. Tal tecnica pode envolver reversão do sinal de um sinal de acionamento elétrico após a potência de pico ser produzida. O sinal elétrico pode ser ajustado especificamente para reduzir rapidamente a densidade do portador após a primeira oscilação de relaxamento ou primeira oscilação do sinal óptico. Ao reduzir a densidade do portador após a primeira oscilação, um pulso de luz apenas da primeira oscilação pode ser gerado. O sinal elétrico pode ser configurado para gerar um pulso curto que apaga o sinal de luz rapidamente através da redução do número de fótons emitidos após um pico no sinal. Um sistema de diodo de laser de picossegundo pode ser projetado para emitir pulsos de luz, de acordo com algumas modalidades. Em algumas modalidades, absorvedores saturáveis, incluindo absorvedores saturáveis semicondutores (SEAMs), podem ser usados para suprimir a cauda óptica. Em tais modalidades, uso dos absorvedores saturáveis pode suprimir a cauda óptica em 3-5 dB ou, em alguns casos, mais de 5 dB. Redução dos efeitos de uma cauda no pulso de excitação pode reduzir e/ou eliminar quaisquer exigências de filtragem adicional da energia de excitação, aumento da faixa de tempos de vida que podem ser medidos e/ou permitir taxas de pulso mais rápidas. Aumento da taxa de pulso de excitação pode permitir que mais experimentos sejam conduzidos em um dado tempo, o que pode diminuir o tempo necessário para adquirir estatística suficiente para identificar um tempo de vida para um marcador registrando um objeto de amostra.
[00390] Ainda, duas ou mais dessas técnicas podem ser usadas juntas para gerar energia de excitação pulsada. Por exemplo, energia de excitação pulsada emitida de uma fonte diretamente modulada pode ser modificada mais usando técnicas de modulação óptica. Técnicas para modulação do pulso de excitação e produção sob medida do sinal de acionamento de pulso elétrico podem ser combinadas de qualquer maneira adequada para otimizar uma energia de excitação pulsada para realização de medições de tempo de vida. Um sinal de acionamento elétrico produzido sob medida pode ser aplicado a uma energia de excitação pulsada a partir de uma fonte diretamente modulada.
[00391] Em tais modalidades, um diodo de laser tendo um certo número de ligações de fio pode ser usado como uma fonte de excitação pulsada. Diodos de laser com mais ligações de fio podem reduzir a indutância da fonte de excitação. Diodos de laser tendo uma indutância menor podem permitir que a corrente no laser opere em uma frequência maior. Seleção de um método de empacotamento para minimizar indutância pode aperfeiçoar a potência fornecida para a fonte de excitação em frequências maiores, permitindo pulsos de excitação mais curtos, reduções mais rápidas de potência óptica após o pico e/ou taxa de repetição de pulso aumentada para detecção de marcadores luminescentes.
[00392] Em algumas modalidades, uma linha de transmissão em combinação com uma fonte de excitação pode ser usada para geração de pulsos de luz. A linha de transmissão pode corresponder à impedância de um diodo de laser a fim de aperfeiçoar desempenho e/ou qualidade de pulsos de luz. Em algumas modalidades, a impedância da linha de transmissão pode ser de 50 ohms. Em alguns casos, a resistência de terminação pode ser similar à resistência da linha a fim de evitar reflexos. Alternativamente ou adicionalmente, a impedância de terminação pode ser similar à impedância da linha a fim de evitar reflexos. A impedância de terminação pode ser menos do que a impedância da linha a fim de refletir um pulso negativo. Em outras modalidades, a impedância de terminação pode ter um componente capacitivo ou indutivo a fim de controlar o formado o pulso de reflexo negativo. Em outras modalidades, a linha de transmissão pode permitir uma frequência de pulsos maior. Uso de uma linha de transmissão pode produzir pulsos elétricos tendo uma frequência dentro da faixa de 40 MHz a 500 MHz. Uma linha de transmissão pode ser usada em combinação com um sinal elétrico produzido sob medida descrito acima a fim de produzir uma fonte de luz pulsada com pulsos de luz tendo uma certa duração de tempo e um intervalo de tempo específico.
[00393] Técnicas para produção sob medida do sinal elétrico para aperfeiçoar a produção de pulsos de luz podem incluir conexão da fonte de excitação a um circuito com uma capacidade de polarização negativa. Em algumas modalidades, uma polarização negativa pode ser provida em uma fonte de excitação após um pulso de luz emitir para reduzir emissão de uma cauda no pulso de luz. Um circuito exemplar pode incluir uma fonte de corrente, laser de diodo, resistor, capacitor e comutador que podem ser implementados para reduzir a presença de uma cauda em um pulso de luz. Tal circuito pode criar uma corrente constante que ultrapassa o laser de diodo quando o comutador é fechado ou em um estado de condução. Quando o comutador é aberto, o comutador pode ter uma resistência alta e corrente pode fluir através do laser de diodo. Pulsos de luz podem ser gerados abrindo e fechando o comutador para prover corrente intermitente para o laser de diodo. Em alguns casos, o resistor pode ser suficientemente alto e o capacitor suficientemente pequeno de maneira que há uma tensão através do capacitor quando o capacitor é aberto e o laser de diodo emite luz. Quando um comutador é fechado, a tensão através do capacitor vai reverter a polarização do laser de diodo. Tal polarização reversa pode reduzir ou eliminar a presença de uma cauda no pulso de luz. Em tais casos, o comutador pode ser configurado para fechar após o pico do pulso de luz a fim de reduzir a potência do laser logo depois do pulso de luz de pico. O valor do resistor no circuito pode ser selecionado de maneira que a carga no capacitor descarregará antes do comutador ser subsequentemente aberto e/ou pulso de luz subsequente ser gerado pelo diodo de laser.
[00394] Componentes de circuito adicionais podem ser providos para produzir sob medida um sinal elétrico de um diodo de laser a fim de produzir pulsos de luz. Em algumas modalidades, capacitores, resistores e tensões múltiplas podem ser conectados a um circuito de rede para controlar a forma de onda de um sinal elétrico fornecido a um diodo de laser. Uma forma de onda controlada pode ser criada comutando várias tensões, V1, V2, ..., VN com sinais correspondentes S1, S2, ..., SN quando há subcircuitos de capacitor N.
[00395] Em algumas modalidades, um sinal elétrico para geração de pulsos de luz pode usar um circuito tendo componentes distintos, incluindo componentes de radiofrequência (RF) e/ou micro-ondas. Componentes distintos que podem ser incluídos em tal circuito são blocos de DC, adaptadores, portas lógicas, terminadores, defasadores, retardadores, atenuadores, combinadores e/ou amplificadores de RF. Tais componentes podem ser usados para criar um sinal elétrico positivo tendo uma certa amplitude seguido por um sinal elétrico negativo com uma outra amplitude. Pode haver um retardo entre os sinais elétricos positivo e negativo. Em outras modalidades, um circuito pode produzir sinais elétricos múltiplos combinados para formar um sinal de pulso elétrico configurado para acionar uma fonte de excitação. Tal circuito pode produzir uma saída diferencial que pode ser usada para aumentar a potência do pulso de luz. Ao ajustar os componentes distintos do circuito, o sinal de saída elétrico pode ser ajustado para produzir um pulso de luz adequado para medições de tempo de vida.
[00396] Em algumas modalidades, fontes de excitação podem ser combinadas para gerar pulsos de luz para medições de tempo de vida. Fontes pulsadas sincronizadas podem ser acopladas a um circuito ou carga em uma certa distância. Em algumas modalidades, fontes de excitação podem ser acopladas em paralelo a um circuito. As fontes de excitação podem ser da mesma fonte ou de fontes múltiplas. Em algumas modalidades com fontes múltiplas, as fontes múltiplas podem variar em tipo de fonte de excitação. Quando combinando fontes, pode ser importante considerar a impedância do circuito e das fontes de excitação a fim de ter potência suficiente fornecia às fontes de excitação. Combinação de fontes pode ser obtida usando uma ou mais das técnicas descritas acima para produção de uma fonte de excitação pulsada.
[00397] Uma fonte de excitação pode incluir uma bateria ou qualquer outra fonte de alimentação disposta para prover energia à fonte de excitação. Por exemplo, uma fonte de excitação pode estar localizada em um instrumento base e sua energia de operação pode ser recebida através de um dispositivo de bioanálise integrado ao qual ela é acoplada (por exemplo, através de cabos de força condutores). Uma fonte de excitação pode ser controlada independentemente de ou em colaboração com controle de um dispositivo de bioanálise integrado. Apenas como um exemplo, sinais de controle para uma fonte de excitação podem ser providos para a fonte de excitação sem fio ou através de uma interconexão com fio (por exemplo, uma interconexão USB) com um computador pessoal e/ou dispositivo de bioanálise integrado.
[00398] Em algumas implementações, uma fonte de excitação pode operar de uma maneira de porta de tempo (time-gated) e/ou sincronizada com um ou mais sensores de um dispositivo integrado. Por exemplo, uma fonte de excitação pode ser ligada para excitar um marcador luminescente e então desligada. O sensor pode ser desligado enquanto a fonte de excitação está ligada, e então pode ser ligado para um intervalo de amostragem após a fonte de excitação ser desligada. Em algumas modalidades, o sensor pode ser ligado para um intervalo de amostram enquanto a fonte de excitação é ligada.
IV. Medições Exemplares com o Dispositivo Integrado e Fonte de Excitação
[00399] Medições para detecção, análise e/ou exploração de moléculas em uma amostra podem ser obtidas usando qualquer combinação do dispositivo integrado ou dispositivo integrado e uma fonte de excitação descrita no presente pedido. A fonte de excitação pode ser uma fonte de excitação pulsada ou, em alguns casos, uma fonte de onda contínua. Um marcador luminescente marcado para uma amostra específica pode indicar a presença da amostra. Marcadores luminescentes podem ser distinguidos por uma energia de excitação, comprimento de onda de emissão luminescente e/ou o tempo de vida de energia de emissão emitida por um marcador. Marcadores com comprimento de onda de emissão de luminescência podem ser identificados através da determinação do tempo de vida para cada marcador. Adicionalmente, marcadores com tempos de vida similares podem ser identificados através do comprimento de emissão de luminescência para cada marcador. Ao usar marcadores, onde marcadores são identificados por uma combinação de propriedades temporais e/ou espectrais da luminescência emitida, uma análise quantitativa e/ou identificação de marcadores e amostras associadas pode ser realizada.
[00400] Medições de tempo de vida podem ser usadas para determinar que um marcador está presente em uma cavidade de amostra. O tempo de vida de um marcador luminescente pode ser identificado realizando experimentos múltiplos onde o marcador luminescente é excitado para um estado excitado e então o tempo quando um fóton emite é medido. A fonte de excitação é pulsada para produzir um pulso de energia de excitação e direcionado ao marcador. O tempo entre o pulso de excitação e um evento de emissão de fóton subsequente a partir de um marcador luminescente é medido. Ao repetir tais experimentos com uma pluralidade de pulsos de excitação, o número de casos que um fóton emite dentro de um intervalo de tempo particular pode ser determinado. Tais resultados podem popular um histograma representando o número de eventos de emissão de fóton que ocorrem dentro de uma série de intervalos de tempo distintos ou agrupamentos de tempo. O número de agrupamentos de tempo e/ou o intervalo de tempo de cada agrupamento pode ser ajustado para identificar um conjunto particular de tempos de vida e/ou marcadores.
[00401] O que segue é uma descrição de medições exemplares que podem ser feitas para identificar marcadores luminescentes em algumas modalidades. Especificamente, exemplos de marcadores luminescentes de distinção usando apenas uma medição de tempo de vida luminescente, uma medição espectral de junta e de tempo de vida luminescente e apenas uma medição de tempo de vida luminescente, mas usando duas energias de excitação diferentes, são discutidos. As modalidades não são limitadas aos exemplos detalhados abaixo. Por exemplo, algumas modalidades podem identificar os marcadores luminescentes usando apenas medições espectrais.
[00402] Quaisquer marcadores luminescentes podem ser usados.Em algumas modalidades, fluoróforos comercialmente disponíveis podem ser usados. A título de exemplo e não limitação, os fluoróforos que seguem podem ser usados: Atto Rho14 ("ATRho14"), DyLight® 650 ("D650"), Seta®Tau 647 ("ST647"), CF® 633 ("C633"), CF® 647 ("C647"), Alexa Fluor® 647 ("AF647"), BODIPY® 630/650 ("B630"), CF® 640R ("C640R") e/ou Atto 647N ("AT647N").
[00403] Adicionalmente e/ou opcionalmente, marcadores luminescentes podem ser modificados de qualquer maneira adequada para aumentar a velocidade e precisão do processo de análise de amostra. Por exemplo, um fotossensibilizador pode ser conjugado a um marcador luminescente. Exemplos de fotoestabilizadores incluem, mas não estão limitados a, sequestrantes de oxigênio ou extintores de estado tripleto. Conjugação de fotoestabilizadores ao marcador luminescente pode aumentar a taxa de fótons emitidos e pode também reduzir um efeito de "lampejo" onde o marcador luminescente não emite fótons. Em algumas modalidades, quando um evento biológico ocorre na escala de milissegundo, uma taxa aumentada de emissão de fóton pode aumentar a probabilidade de detecção do evento biológico. Taxas aumentadas de eventos de fóton podem subsequentemente aumentar a razão de sinal-para-ruído de sinal de luminescência e aumentar a taxa na qual medições de tempo de vida são feitas, levando a uma análise de amostra mais rápida e mais precisa.
[00404] Ainda, o ambiente em uma cavidade de amostra de um dispositivo integrado pode ser ajustado para engenheirar o tempo de vida dos marcadores conforme necessário. Isto pode ser obtido reconhecendo que o tempo de vida de um marcador é afetado pela densidade de estado do marcador, o que pode ser ajustado usando o ambiente. Por exemplo, quanto mais distante o marcador está da camada de metal inferior da camada de amostra, mais longo o tempo de vida. Desta maneira, para aumentar o tempo de vida de um marcador, a profundidade de uma superfície inferior de uma cavidade de amostra, tal como um divot, pode se estender uma certa distância a partir de uma camada de metal. Também, os materiais usados para formar a cavidade de amostra podem afetar o tempo de vida dos marcadores. Embora marcadores diferentes tenham tipicamente seus tempos de vida mudados na mesma direção (por exemplo, ou mais longos ou mais curtos), o efeito pode ser em graus diferentes para marcadores diferentes. Desta maneira, dois marcadores que não podem ser distinguidos através de medições de tempo de vida em espaço livre podem ser engenheirados para serem distinguíveis pela fabricação do ambiente de cavidade de amostra para ajustar os tempos de vida dos vários marcadores.
Medições de Tempo de Vida
[00405] Medições de tempo de vida podem ser realizadas usando um ou mais comprimento de energia de excitação para excitar um marcador em uma cavidade de amostra. Uma combinação de marcadores tendo tempos de vida distintos é selecionada para distinguir dentre marcadores individuais com base em medições de tempo de vida. Ainda, a combinação de marcadores é capaz de atingir um estado excitado quando iluminada pela fonte de excitação usada. Um dispositivo integrado configurado para medições de tempo de vida usando uma excitação pode incluir pixels múltiplos posicionados ao longo de uma fileira onde cada cavidade de amostra é configurada para acoplar com o mesmo guia de onda. Um pixel inclui uma cavidade de amostra e um sensor. Uma ou mais microcavidades ou uma rede de bullseye) podem ser usadas para acoplar o guia de onda à cavidade de amostra para cada pixel.
[00406] Uma fonte de excitação pulsada pode ser uma das fontes de excitação pulsada usando as técnicas descritas acima. Em alguns casos, a fonte de excitação pulsada pode ser um diodo de laser semicondutor configurado para emitir pulsos através de bombeamento elétrico modulado do diodo de laser. A potência dos pulsos é menos do que 20 dB da potência de pico de pulso em aproximadamente 250 picossegundos após o pico. O intervalo de tempo para cada pulso de excitação está na faixa de 20-200 picossegundos. A duração de tempo entre cada pulso de excitação está na faixa de 1-50 nanossegundos. Um esquema de como medições de exemplo podem ser realizadas é mostrado na Figura 31A. Uma vez que uma energia de excitação é usada, um filtro de excitação adequado para redução da transmissão da energia de excitação para o sensor pode ser formado no dispositivo integrado, tal como o filtro de excitação de comprimento de onda discutido acima.
[00407] O sensor para cada pixel tem pelo menos uma região fotossensível por um pixel. Fótons são detectados dentro de intervalos de tempo ou quando eles atingem o sensor. Aumento do número de agrupamentos de tempo pode aperfeiçoar a resolução dos histograma registrados de fótons coletados em uma série de agrupamentos de tempo e aperfeiçoam a diferenciação dentre marcadores luminescentes diferentes. Quando o sensor é configurado para detectar um comprimento de onda particular, os quatro marcadores luminescentes podem emitir luminescência similar para o comprimento de onda particular. Alternativamente, os quatro marcadores luminescentes pode emitir luminescência em comprimentos de onda diferentes.
[00408] Um conjunto exemplar de quatro marcadores luminescentes que são distinguidos com base em medições de tempo de vida são ATRho14, Cy®5, AT647N e CF®633 como mostrado pelo gráfico na Figura 31B. Esses quatro marcadores têm tempos de vida variáveis e produzem histogramas de distinção quando pelo menos quatro agrupamentos de tempo são usados. A Figura 31C mostra um perfil de sinal para cada um desses marcadores em 16 agrupamentos de tempo. O perfil de sinal é normalizado para cada marcador. Os agrupamentos de tempo variam em intervalo de tempo a fim de prover um perfil de sinal único para cada um dos marcadores. As Figuras. 32a e 32B ilustram perfis de sinal, ambos contínuos e distintos, respectivamente, de um outro conjunto exemplar de marcadores, ATTO Rho14, D650, ST647 e CF®633, que são distinguíveis com base em medições de tempo de vida. Outros conjuntos de marcadores incluem ATTO Rho14, C647, ST647, CF®633; Alexa Fluor® 647, B630, C640R, CF®633; e ATTO Rho14, ATTO 647N, AlexaFluor647, CF®633.
B. Medições Espectrais-de Tempo de Vida
[00409] Medições de tempo de vida podem ser combinadas com medições espectrais de um ou mais marcadores luminescentes. Medições espectrais podem depender do comprimento de onda de luminescência para marcadores individuais e são capturadas usando pelo menos duas regiões de sensor por pixel. Uma estrutura exemplar do dispositivo integrado inclui pixels que têm, cada um, um sensor com duas regiões distintas, cada região configurada para detectar um comprimento de onda diferente. Um filtro de comprimento de onda múltiplo pode ser usado para transmitir seletivamente luz de comprimento de onda diferente para cada região de sensor. Por exemplo, uma região de sensor e combinação de filtro podem ser configuradas para detectar luz vermelha enquanto uma outra região de sensor e combinação de filtro podem ser configurados para detectar luz verde.
[00410] Combinação de ambas medições de tempo de vida com medições espectrais pode ser realizada usando um comprimento de onda de energia de excitação para excitar um marcador em uma cavidade de amostra. Uma combinação de marcadores é selecionada tendo pelo menos dois comprimentos de onda de luminescência distintos onde os marcadores emitindo em um comprimento de onda que têm tempos de vida distintos são selecionados para distinguir dentre os marcadores individuais com base em medições de tempo de vida e espectrais. Ainda, a combinação de marcadores é selecionada para ser capaz de atingir um estado excitado quando iluminados pela fonte de excitação usada.
[00411] A fonte de excitação é uma fonte de excitação pulsada, e pode ser uma das fontes de excitação usando as técnicas descritas acima. Em alguns casos, a fonte de excitação pulsada pode ser um diodo de laser semicondutor configurado para emitir pulsos através de bombeamento elétrico modulado direto do diodo de laser. A potência dos pulsos é menos do que 20 dB a potência de pico após 250 picossegundos após o pico. A duração de tempo para cada pulso de excitação está na faixa de 20-200 picossegundos. O intervalo de tempo entre cada pulso de excitação está na faixa de 1-50 nanossegundos. Um esquema de como medições exemplares podem ser realizadas é mostrado na Figura 33A. Uma vez que uma energia de excitação é usada, um filtro de excitação adequado para redução de transmissão da energia de excitação para o sensor pode ser usado.
[00412] O sensor para cada pixel tem pelo menos duas regiões fotossensíveis por pixel. Em algumas modalidades há duas regiões fotossensíveis por um pixel. Em outras modalidades, há quatro regiões fotossensíveis por um pixel. Cada região fotossensível é configurada para detectar um comprimento de onda ou faixa diferente de comprimentos de onda. Fótons são detectados dentro de intervalos de tempo de quando eles atingem o sensor. Aumento do número de agrupamentos de tempo pode aperfeiçoar a resolução do histograma registrado de fótons coleados em uma série de agrupamentos de tempo e aperfeiçoar diferenciação dentre marcadores luminescentes diferentes através de seus tempos de vida individuais. Em algumas modalidades, há dois agrupamentos de tempo por uma região do sensor. Em outras modalidades, há quatro agrupamentos de tempo por uma região do sensor.
[00413] Um conjunto exemplar de quatro marcadores luminescentes que são distinguíveis com base em medições de tempo de vida são ATTO Rho14, AS635, Alexa Fluor® 647 e ATTO 647N. Esses quatro marcadores têm dois que emitem em um comprimento de onda similar e um outro comprimento de onda similar. Dentro de cada par de marcadores que emitem em um comprimento de onda similar, o par de marcadores tem tempos de vida diferentes e produzem histogramas de distinção quando pelo menos quatro agrupamentos de tempo são usados. Neste exemplo, ATTO Rho14 e AS635 emitem comprimentos de onda de luminescência similar e têm tempos de vida distintos. Alexa Fluor® 647 e ATTO 647N emitem comprimentos de onda de luminescência similares, diferente do comprimento de onda emitido por ATTO Rho14 e AS635, e têm tempos de vida distintos. A Figura 33B mostra um tempo de vida em gráfico como uma função de comprimento de onda de emissão para este conjunto de marcadores para ilustrar como cada um desses marcadores é distinguível com base em uma combinação de tempo de vida e comprimento de onda de emissão. A Figura 34A mostra um gráfico de energia como uma função de comprimento de onda para ATT Rho14, Alexa Fluor® 647 e ATT) 647N. A Figura 34B mostra gráficos de sinal de fluorescência com o tempo para cada um desses marcadores quando presentes em uma cavidade de amostra com um diâmetro de 235 nm. A Figura 35A ilustra o perfil de sinal para esses marcadores através de quatro regiões fotossensíveis e cada região captura quatro agrupamentos de tempo. Os perfis de sinal são normalizados e são usados para distinguir dentre marcadores diferentes pelo número relativo de fótons capturados por uma região fotossensível para cada um dos quatro agrupamentos de tempo. Outros conjuntos de quatro fluoróforos para tais medições espectrais- tempo de vida são ATRho14, D650, ST647, CF®633; ATTO Rho14, C647, ST647, CF®633; Alexa Fluor® 647, B630, C640R, CF®633; e ATTO Rho 14, ATTO 647N, Alexa Fluor® 647, CF®633. A Figura 35B mostra um gráfico do perfil de sinal de intensidade com o tempo para ATRho14, D650, ST647 e C633. A Figura 35C ilustra o perfil de sinal para ATRho14.
C. Medições de Tempo de Vida-Energia de Excitação
[00414] Medições de tempo de vida combinadas com uso de pelo menos dois comprimentos de onda de energia de excitação podem ser usadas para distinguir dentre marcadores múltiplos. Alguns marcadores podem excitar quando um comprimento de onda de excitação é usado e não um outro. Uma combinação de marcadores tendo tempos de vida distintos é selecionada para cada comprimento de onda de excitação para distinguir dentre os marcadores individuais com base nas medições de tempo de vida. Nesta modalidade, um dispositivo integrado pode ser configurado para ter cada pixel com um sensor tendo uma região e a fonte de excitação externa pode ser configurada para prover dois comprimentos de onda de energia de excitação que são lasers de diodo pulsado eletricamente modulados com intercalamento temporal.
[00415] A fonte de excitação é uma combinação de pelo menos duas energias de excitação. A fonte de excitação é uma fonte de excitação pulsada e pode ser uma ou mais das fontes de excitação usando as técnicas descritas acima. Em alguns casos, a fonte de excitação pulsada pode ser dois diodos de laser semicondutores configurados para emitir pulsos através de bombeamento elétrico modulado do diodo de laser. A potência dos pulsos é 20 dB menos do que a potência de pico de pulso em 250 picossegundos após o pico. O intervalo de tempo para cada pulso de excitação está na faixa de 20200 picossegundos. O intervalo de tempo entre cada pulso de excitação está na faia de 1-50 nanossegundos. Um comprimento de onda de excitação é emitido por um pulso e conhecendo o comprimento de onda de excitação um subconjunto de marcadores com tempos de vida distintos é unicamente identificado. Em algumas modalidades, pulsos de excitação alternam dentre os comprimentos de onda diferentes. Por exemplo, quando dois comprimentos de onda de excitação são usados pulsos subsequentes alternam entre um comprimento de onda e o outro comprimento de onda. Um esquema de como medições exemplares podem ser realizadas é mostrado na Figura 36A. Qualquer técnica adequada para combinação de fontes de excitação múltiplas e pulsos intercalados tendo comprimentos de onda diferentes pode ser usada. Exemplos de algumas técnicas para administração de pulsos de mais de um comprimento de onda de excitação a uma fileira de cavidades de amostra são descritos aqui. Em algumas modalidades, há um guia de onda único por fileira de cavidades de amostra e há duas fontes de excitação que são combinadas de maneira que pulsos de energia de excitação alternam entre os dois comprimentos de onda de excitação. Em algumas modalidades, há dois guias de onda por uma fileira de cavidades de amostra e cada guia de onda é configurado para transportar um dos dois comprimentos de onda de excitação. Em outras modalidades, há um guia de onda único por uma fileira de pixels e um comprimento de onda acopla com uma extremidade do guia de onda e um outro comprimento de onda acopla com a outra extremidade.
[00416] O sensor para cada pixel tem pelo menos uma região fotossensível por um pixel. A região fotossensível pode ter dimensões de 5 mícrons por 5 mícrons. Fótons são detectados dentro de intervalos de tempo de quando eles atingem o sensor. Aumento do número de agrupamentos de tempo pode aperfeiçoar a resolução do histograma registrado de fótons coletados em uma série de agrupamentos de tempo e aperfeiçoa a diferenciação dentre marcadores luminescentes diferentes. O sensor tem pelo menos dois agrupamentos de tempo.
[00417] Um conjunto exemplar de quatro marcadores luminescentes que são distinguíveis com base em medições de tempo de vida são Alexa Fluor® 546, Cy®3B, Alexa Fluor® 647 e ATTO 647N. Como mostrado na Figura 36B, Alexa Fluor® 546 e Cy®3B excitam em um comprimento de onda, tal como 532 nm, e têm tempos de vida distintos. Alexa Fluor® 647 e ATTO 647N excitam em um outro comprimento de onda, 640 nm, e têm tempos de vida distintos como mostrado na Figura 37A. Perfis de sinal normalizado distinguível em 16 agrupamentos de tempo para ATTO647N e CFM®633, que são ambos excitados a 640 nm, são mostrados na Figura 37B. Ao detectar um fóton após um comprimento de onda de excitação conhecido, um desse dois pares de marcadores pode ser determinado com base no comprimento de onda de excitação anterior e cada marcador para um par de é identificado com base em medições de tempo de vida.
EQUIVALENTES E ESCOPO
[00418] Vários aspectos do presente pedido podem ser usados sozinhos, em combinação ou em uma variedade de arranjos não especificamente discutidos nas modalidades descritas acima e desta maneira não são limitados em sua aplicação aos detalhes e arranjo de componentes mostrados na descrição acima ou ilustrado nos desenhos. Por exemplo, os aspectos descritos em uma modalidade podem ser combinados de qualquer maneira com aspectos descritos em outras modalidades.
[00419] Também, a invenção pode ser concretizada como um método, cujo pelo menos um exemplo foi provido. Os atos realizados como parte do método podem ser ordenados de qualquer maneira adequada. Desta maneira, modalidades podem ser construídas em que atos são realizados em uma ordem diferente daquela ilustrada, o que pode incluir realização de alguns atos simultaneamente, embora mostrado como atos sequenciais em modalidades ilustrativas.
[00420] Uso de termos comuns tais como "primeiro", "segundo", "terceiro", etc., nas reivindicações para modificar um elemento reivindicado não conota em si qualquer prioridade, precedência ou ordem de um elemento de reivindicação sobre o outro ou a ordem temporal em que atos de um método são realizados, mas são usados apenas como marcadores para distinguir um elemento de reivindicação tendo um certo nome de um outro elemento tendo um mesmo nome (mas para uso no termo comum) para distinguir os elementos de reivindicação.
[00421] Também, a fraseologia e a terminologia usadas aqui são para o propósito de descrição e não devem ser consideradas como limitantes. O uso de "incluindo", "compreendendo" ou "tendo", "contendo", "envolvendo", e suas variações, pretende compreender os itens listados abaixo e equivalentes dos mesmos bem como itens adicionais.

Claims (16)

1. Método de identificação de uma molécula única (200) em uma amostra pluralidade de tipos possíveis de moléculas marcadas, caracterizado pelo fato de que compreende (i) administração de uma séria de pulsos de uma ou mais energias de excitação à amostra; (ii) detecção de uma pluralidade de fótons emitidos a partir da amostra; (iii) registro para cada um de uma pluralidade de fótons emitidos a partir da amostra de uma duração de tempo entre detecção do fóton emitido e uma energia de excitação administrada anteriormente; (iv) determinação de um tempo de vida luminescente e uma intensidade luminescente da molécula única (200), em que tempo de vida luminescente é determinado com base na duração de tempo entre a detecção do fóton emitido e uma energia de excitação administrada anteriormente; e (v) identificar a molécula única (200) como um tipo da pluralidade de tipos possíveis de moléculas marcadas com base em uma combinação tanto do tempo de vida luminescente quanto da intensidade luminescente da molécula única (200).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de tipos possíveis de moléculas compreende quatro tipos de moléculas.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os quatro tipos de moléculas compreendem quatro tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os quatro tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados compreendem um primeiro nucleotídeo compreendendo adenina, um segundo nucleotídeo compreendendo guanina, um terceiro nucleotídeo compreendendo citosina e um quarto nucleotídeo compreendendo timina ou uracila.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a molécula única (200) é um nucleotídeo luminescentemente marcado (250) incorporado a um ácido nucleico.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o método é repetido para identificar uma série de moléculas únicas.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a série de moléculas únicas é uma série de nucleotídeos luminescentemente marcados sequencialmente incorporados a um ácido nucleico compreendendo um iniciador.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda determinação da sequência de um ácido nucleico modelo através da análise da sequência de nucleotídeos luminescentemente marcados incorporados sequencialmente ao ácido nucleico compreendendo o iniciador.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que cada um da pluralidade de pulsos compreende uma energia de excitação única.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que uma primeira porção da pluralidade de pulsos compreende uma primeira energia de excitação e uma segunda porção da pluralidade de pulsos compreende uma segunda energia de excitação.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a série de pulsos é administrada em uma frequência média entre cerca de 10 MHz e cerca de 100 MHz ou entre cerca de 100 MHz e cerca de 1 GHz.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a frequência está entre 50 MHz e cerca de 200 MHz.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que para cada molécula única (200) identificada, o número de fótons emitidos detectados está entre cerca de 10 e cerca de 100 ou entre cerca de 100 e cerca de 1.000.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que cada molécula única (200) identificada é imobilizada em um apoio sólido.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o apoio sólido compreende uma superfície inferior de uma cavidade de amostra.
16. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) expor um complexo em um volume alvo, o complexo compreendendo o ácido nucleico modelo, um iniciador e uma enzima de polimerização, a uma pluralidade de tipos de nucleotídeos luminescentemente marcados, em que cada tipo de nucleotídeo luminescentemente marcado tem um tempo de vida luminescente e/ou intensidade luminescente diferente; (ii) direcionar uma série de pulsos de uma ou mais energias de excitação em direção a uma vizinhança do volume alvo; (iii) detectar de uma pluralidade de fótons emitidos a partir de nucleotídeos luminescentemente marcados durante incorporação sequencial em um ácido nucleico compreendendo o iniciador; (iv) determinar o tempo e a frequência dos fotos emitidos; e (v) identificar a sequência de nucleotídeos incorporados com base tanto no tempo e na frequência dos fótons emitidos.
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