KR20180008779A - 시간 분해된 발광을 사용하여 핵산의 서열을 결정하는 방법 - Google Patents

시간 분해된 발광을 사용하여 핵산의 서열을 결정하는 방법 Download PDF

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제레미 랙키
브라이언 리드
싱후아 시
하이동 황
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Abstract

발광 수명 및/또는 강도에 기초하여 분자를 서열분석하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 핵산을 서열분석하는 방법은 핵산 서열분석 반응 동안 혼입된 일련의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 수명, 및 임의로 발광 강도를 결정하는 것을 수반한다.

Description

시간 분해된 발광을 사용하여 핵산의 서열을 결정하는 방법
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2015년 5월 20일에 출원된 표제 "METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING"의 미국 특허 가출원 번호 62/164,482, 2015년 5월 20일에 출원된 표제 "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS"의 미국 특허 가출원 번호 62/164,506, 2015년 5월 20일에 출원된 표제 "INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING, DETECTING, AND ANALYZING MOLECULES"의 미국 특허 가출원 번호 62/164,464, 및 2015년 5월 20일에 출원된 표제 "PULSED LASER"의 미국 특허 가출원 번호 62/164,485에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은 35 U.S.C. §120 하에 2015년 8월 7일에 출원된 표제 "INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING, DETECTING, AND ANALYZING MOLECULES"의 미국 특허 출원 번호 14/821,688에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 출원의 분야
본 출원은 일반적으로, 생물학적 및/또는 화학적 샘플의 신속한, 대규모 병렬, 정량 분석을 수행하기 위한 방법, 조성물, 및 디바이스, 및 상기 디바이스를 제작하는 방법에 관한 것이다.
생물학적 샘플의 검출 및 분석은 생물학적 검정 ("생물검정")을 사용하여 수행될 수 있다. 생물검정은 통상적으로 크고 값비싼 실험실 장비를 수반하고, 그 장비를 작동시키고 생물검정을 수행하도록 훈련받은 연구 과학자를 필요로 한다. 또한, 생물검정은 통상적으로 대량으로 수행되므로 검출 및 정량화를 위해 다량의 특정한 유형의 샘플이 필요하다.
일부 생물검정은 샘플을 특정한 파장의 광을 방출하는 발광 마커로 태그부착하는 것에 의해 수행된다. 마커는 발광을 유발하는 광원으로 조명되고, 발광 광은 광검출기에 의해 검출되어 마커에 의해 방출된 발광 광의 양이 정량화된다. 발광 마커를 사용하는 생물검정은 통상적으로 샘플을 조명하기 위한 값비싼 레이저 광원과, 조명된 샘플로부터의 발광을 수집하기 위한 복잡한 발광 검출 광학기기 및 전자기기를 수반한다.
본 출원의 측면에 따르면, 단일 분자는 그것이 복수의 개별 광 펄스에 노출된 경우에 분자로부터 방출된 일련의 광자의 하나 이상의 특성에 기초하여 식별될 수 있다 (예를 들어, 반응 샘플 내 다른 가능한 분자와 구별될 수 있다). 일부 실시양태에서, 방출된 광자는 상이한 발광 수명에 기초하여 분자를 식별/구별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 수명은 계산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실제 수명은 계산될 필요가 없다. 예를 들어, 발광 수명을 시사하는 하나 이상의 특성이 사용될 수 있다 (예를 들어, 방출의 로컬 시간, 검출된 방출의 시간 분포). 일부 실시양태에서, 방출된 광자는 분자의 발광 강도를 결정하는데 사용될 수 있고, 발광 강도는 분자를 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방출된 광자는 분자의 발광 수명 및 발광 강도를 결정하는데 사용될 수 있고, 발광 수명 또는 발광 강도는 분자를 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자의 아이덴티티는 발광 수명 및 발광 강도 둘 다의 조합에 기초할 수 있다.
일부 실시양태에서, 분자는 발광 표지에 의해 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 형광단이다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 표지의 특성에 기초하여 식별 또는 구별될 수 있다. 발광 표지 (예를 들어, 형광단)의 특성은 발광 수명, 흡수 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 발광 양자 수율, 및 발광 강도를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 수명에 기초하여 식별 또는 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 강도에 기초하여 식별 또는 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 방출된 광자를 관측하는데 필요한 전달된 여기 에너지의 파장에 기초하여 식별 또는 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 방출된 광자의 파장에 기초하여 식별 또는 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 수명, 및 방출된 광자를 관측하는데 필요한 전달된 여기 에너지의 파장 둘 다에 기초하여 식별 또는 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 강도, 및 방출된 광자를 관측하는데 필요한 전달된 여기 에너지의 파장 둘 다에 기초하여 식별 또는 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 수명, 발광 강도, 및 방출된 광자를 관측하는데 필요한 전달된 여기 에너지의 파장에 기초하여 식별 또는 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 수명 및 방출된 광자의 파장 둘 다에 기초하여 식별 또는 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 강도 및 방출된 광자의 파장 둘 다에 기초하여 식별 또는 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 수명, 발광 강도, 및 방출된 광자의 파장에 기초하여 식별 또는 구별된다.
특정 실시양태에서, 반응 혼합물 또는 실험에서 상이한 유형의 분자는 상이한 발광 마커로 표지된다. 일부 실시양태에서, 상이한 마커는 구별될 수 있는 상이한 발광 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상이한 마커는 상이한 발광 수명, 상이한 발광 강도, 방출된 광자의 상이한 파장, 또는 그의 조합을 가짐으로써 구별된다. 상이한 발광 마커를 갖는 복수의 유형의 분자의 존재는 복잡한 반응의 상이한 단계가 모니터링되게 할 수 있거나, 복잡한 반응 생성물의 상이한 컴포넌트가 식별되게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 유형의 분자가 반응하거나 상호작용하는 순서가 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상이한 뉴클레오티드는 상이한 수의 동일한 발광 분자 (예를 들어, 동일한 형광 염료 중 하나 이상)에 의해 발광 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 표지 내 발광 분자의 수를 변화시키는 것은 상이한 강도에 기초하여 상이한 뉴클레오티드가 구별되게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 뉴클레오티드는 각각 상이한 유형의 발광 분자 및/또는 상이한 수의 각각의 발광 분자에 의해 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 유형의 발광 분자는 상이한 강도 및/또는 상이한 수명에 기초하여 상이한 뉴클레오티드가 구별되게 한다.
특정 실시양태에서, 상이한 발광 마커를 갖는 복수의 유형의 분자의 발광 특성은 핵산 또는 단백질과 같은 생체분자의 서열을 식별하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 상이한 발광 마커를 갖는 복수의 유형의 분자의 발광 특성은 단일 분자가 생체분자의 합성 동안 혼입됨에 따라 그를 식별하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 상이한 발광 마커를 갖는 복수의 유형의 뉴클레오티드의 발광 특성은 단일 뉴클레오티드가 서열분석 반응 동안 혼입됨에 따라 그를 식별하는데 사용된다. 이는 핵산 주형의 서열의 결정을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 핵산 주형에 상보적인 핵산 가닥에 혼입된다. 일부 실시양태에서, 상보적 가닥은 프라이머를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상이한 발광 마커를 갖는 복수의 유형의 뉴클레오티드는 4종의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 하나의 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 3종은 제1 스펙트럼 범위 내에서 방출하고, 제4 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 2종은 제1 스펙트럼 범위 내에서 방출하고, 제3 및 제4 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출한다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 2종은 제1 스펙트럼 범위 내에서 방출하고, 제3 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출하고, 제4 뉴클레오티드는 제3 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 상이한 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 동일한 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출하는 발광 표지된 뉴클레오티드의 각각의 유형은 상이한 발광 수명 또는 발광 강도, 또는 둘 다를 갖는다.
일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중 4개의 상이한 유형의 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민/우라실)는 각각 1개 이상의 발광 분자로 표지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 유형의 뉴클레오티드는 1개 초과의 동일한 발광 분자에 연결될 수 있다 (예를 들어, 2개 이상의 동일한 형광 염료가 뉴클레오티드에 연결된다). 일부 실시양태에서, 각각의 발광 분자는 1개 초과의 뉴클레오티드 (예를 들어, 2개 이상의 동일한 뉴클레오티드)에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 초과의 뉴클레오티드는 1개 초과의 발광 분자에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보호 분자는 1개 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 동일한 유형) 및 1개 이상의 발광 분자 (예를 들어, 동일한 유형)를 부착시키기 위한 앵커의 역할을 한다. 일부 실시양태에서, 모든 4개의 뉴클레오티드는 동일한 스펙트럼 범위 (예를 들어, 520-570 nm) 내에서 흡수 및 방출하는 발광 분자로 표지된다.
일부 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드 세트 중 발광 표지는 방향족 또는 헤테로방향족 화합물을 포함하는 염료로부터 선택될 수 있고, 피렌, 안트라센, 나프탈렌, 아크리딘, 스틸벤, 인돌, 벤즈인돌, 옥사졸, 카르바졸, 티아졸, 벤조티아졸, 페난트리딘, 페녹사진, 포르피린, 퀴놀린, 에티듐, 벤즈아미드, 시아닌, 카르보시아닌, 살리실레이트, 안트라닐레이트, 쿠마린, 플루오로세인, 로다민, 또는 다른 유사 화합물일 수 있다. 예시적인 염료는 크산텐 염료, 예컨대 플루오레세인 또는 로다민 염료, 나프탈렌 염료, 쿠마린 염료, 아크리딘 염료, 시아닌 염료, 벤족사졸 염료, 스틸벤 염료, 피렌 염료, 프탈로시아닌 염료, 피코빌리단백질 염료, 스쿠아레인 염료 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드 세트 중 발광 표지는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 546, Cy®3B, 알렉사 플루오르® 555 및 알렉사 플루오르® 555, 및 FRET 쌍 알렉사 플루오르® 555 및 Cy®3.5를 포함한다. 일부 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드 세트 중 발광 표지는 알렉사 플루오르® 555, Cy®3.5, 알렉사 플루오르® 546, 및 딜라이트(DyLight)® 554-R1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드 세트 중 발광 표지는 알렉사 플루오르® 555, Cy®3.5, ATTO Rho6G, 및 딜라이트® 554-R1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드 세트 중 발광 표지는 알렉사 플루오르® 555, Cy®3B, ATTO Rho6G, 및 딜라이트® 554-R1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드 세트 중 발광 표지는 알렉사 플루오르® 555, Cy®3B, ATTO 542, 및 딜라이트® 554-R1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드 세트 중 발광 표지는 알렉사 플루오르® 555, Cy®3B, ATTO 542, 및 알렉사 플루오르® 546을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드 세트 중 발광 표지는 Cy®3.5, Cy®3B, ATTO Rho6G, 및 딜라이트® 554-R1을 포함한다.
특정 실시양태에서, 적어도 1종의 유형, 적어도 2종의 유형, 적어도 3종의 유형, 또는 적어도 4종의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 6-TAMRA, 5/6-카르복시로다민 6G, 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, 알렉사 플루오르® 568, 알렉사 플루오르® 610, 알렉사 플루오르® 647, 아베리어 스타(Aberrior Star) 635, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 647N, ATTO Rho14, 크로미스(Chromis) 630, 크로미스 654A, 크로메오(Chromeo)™ 642, CF™514, CF™532, CF™543, CF™546, CF™546, CF™555, CF™568, CF™633, CF™640R, CF™660C, CF™660R, CF™680R, Cy®3, Cy®3B, Cy®3.5, Cy®5, Cy®5.5, 디오믹스(Dyomics)-530, 디오믹스-547P1, 디오믹스-549P1, 디오믹스-550, 디오믹스-554, 디오믹스-555, 디오믹스-556, 디오믹스-560, 디오믹스-650, 디오믹스-680, 딜라이트® 554-R1, 딜라이트® 530-R2, 딜라이트® 594, 딜라이트® 635-B2, 딜라이트® 650, 딜라이트® 655-B4, 딜라이트® 675-B2, 딜라이트® 675-B4, 딜라이트® 680, 하이라이트(HiLyte)™ 플루오르 532, 하이라이트™ 플루오르 555, 하이라이트™ 플루오르 594, 라이트사이클러(LightCycler)® 640R, 세타(Seta)™ 555, 세타™ 670, 세타™700, 세타™u 647, 및 세타™u 665로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 염료를 포함하거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 화학식 (염료 101), (염료 102), (염료 103), (염료 104), (염료 105), 또는 (염료 106)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 유형, 적어도 2종의 유형, 적어도 3종의 유형, 또는 적어도 4종의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, Cy®3B, Cy®3.5, 딜라이트® 554-R1, 알렉사 플루오르® 546, ATTO Rho6G, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO Rho6G, 및 ATTO 542로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 염료를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 546을 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 2개의 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 555 및 Cy®3.5를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 Cy®3.5를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 546을 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 딜라이트® 554-R1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 Cy®3.5를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 ATTO Rho6G를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 딜라이트® 554-R1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 ATTO Rho6G를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 딜라이트® 554-R1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 ATTO 542를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 딜라이트® 554-R1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 ATTO 542를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 546을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 Cy®3.5를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 ATTO Rho6G를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 딜라이트® 554-R1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 유형, 적어도 2종의 유형, 적어도 3종의 유형, 또는 적어도 4종의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 532, 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, 알렉사 플루오르® 594, 알렉사 플루오르® 610, CF™532, CF™543, CF™555, CF™594, Cy®3, 딜라이트® 530-R2, 딜라이트® 554-R1, 딜라이트® 590-R2, 딜라이트® 594, 딜라이트® 610-B1로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 염료를 포함하거나, 화학식 (염료 101), (염료 102), (염료 103), (염료 104), (염료 105), 또는 (염료 106)을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 532, 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, CF™532, CF™543, CF™555, Cy®3, 딜라이트® 530-R2, 딜라이트® 554-R1로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 염료를 포함하고, 제3 및 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 알렉사 플루오르® 594, 알렉사 플루오르® 610, CF™594, 딜라이트® 590-R2, 딜라이트® 594, 딜라이트® 610-B1로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 염료를 포함하거나, 또는 화학식 (염료 101), (염료 102), (염료 103), (염료 104), (염료 105), 또는 (염료 106)을 갖는다.
특정 실시양태에서, 적어도 1종의 유형, 적어도 2종의 유형, 적어도 3종의 유형, 또는 적어도 4종의 유형의 발광-표지된 뉴클레오티드 분자는 TagBFP, mTagBFP2, 아주라이트(Azurite), EBFP2, 엠칼라마1(mKalama1), 시리우스(Sirius), 사파이어(Sapphire), T-사파이어, ECFP, 세루레안(Cerulean), SCFP3A, 엠터쿼이즈(mTurquoise), 엠터쿼이즈2, 단량체 미도리이시-시안(Midoriishi-Cyan), TagCFP, mTFP1, EGFP, 에메랄드(Emerald), 슈퍼폴더(Superfolder) GFP, 단량체 아자미 그린(Azami Green), TagGFP2, mUKG, 엠와사비(mWasabi), 클로버(Clover), 엠네온그린(mNeonGreen), EYFP, 시트린(Citrine), 베누스(Venus), SYFP2, TagYFP, 단량체 쿠사비라-오렌지(Kusabira-Orange), mKOK, mKO2, 엠오렌지(mOrange), 엠오렌지2, 엠라즈베리(mRaspberry), 엠체리(mCherry), 엠스트로베리(mStrawberry), 엠탄제린(mTangerine), 티디토마토(tdTomato), TagRFP, TagRFP-T, 엠애플(mApple), 엠루비(mRuby), 엠루비2, 엠플럼(mPlum), 에이치씨레드-탠덤(HcRed-Tandem), 엠케이트2(mKate2), 엠넵툰(mNeptune), NirFP, TagRFP657, IFP1.4, iRFP, 엠케이마 레드(mKeima Red), LSS-엠케이트1, LSS-엠케이트2, mBeRFP, PA-GFP, PA엠체리1, PATagRFP, 카에데(Kaede) (녹색), 카에데 (적색), KikGR1 (녹색), KikGR1 (적색), PS-CFP2, 엠에오스2(mEos2) (녹색), 엠에오스2 (적색), PS엠오렌지, 또는 드론파(Dronpa)로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 단백질을 포함한다.
본 출원의 측면은 식별하고자 하는 분자에 여기 에너지를 전달하고, 여기 후에 방출된 광자를 검출하기 위한 방법, 및 이러한 방법에 유용한 시스템 및 디바이스를 제공한다. 특정 실시양태에서, 검출하는 것은 각각의 검출된 발광에 대해 발광과 여기 에너지의 이전 펄스 사이의 시간 기간을 기록하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 검출하는 것은 복수의 검출된 발광 각각에 대해 발광과 여기 에너지의 이전 펄스 사이의 시간 기간을 기록하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 여기 에너지의 복수의 펄스가 전달된다. 식별하고자 하는 분자의 발광 마커는 각각의 펄스 또는 일부의 펄스에 의해 여기될 수 있다. 특정 실시양태에서, 복수의 발광은 1개 이상의 센서에 의해 검출된다. 식별하고자 하는 분자의 발광 마커는 각각의 여기 또는 일부의 여기 후에 발광을 방출할 수 있다. 발광을 발생시키는 여기 이벤트의 분율은 마커의 발광 양자 수율에 기초한다. 일부 실시양태에서, 발광 마커를 포함하는 발광 분자의 수를 증가시키는 것은 양자 수율을 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 발광 방출의 수를 증가시킬 수 있다). 추가적으로 마커에 의해 방출된 모든 발광이 검출되지는 않을 것이고, 예를 들어 일부 발광은 센서에서 벗어나게 될 것이다. 특정 실시양태에서, 여기 에너지 또는 에너지들은 흡수 스펙트럼 및 마커가 주어진 스펙트럼 범위에서의 여기 후에 광자를 방출하는 파장을 포함한, 발광 마커의 발광 특성에 기초하여 선택된다.
특정 실시양태에서, 펄스 여기 에너지의 주파수는 검출하고자 하는 발광 표지된 분자의 발광 특성 (예를 들어, 발광 수명)에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 펄스 사이의 갭은 여기되는 1개 이상의 발광 표지된 분자의 발광 수명보다 길다. 일부 실시양태에서, 갭은 여기되는 1개 이상의 발광 표지된 분자의 발광 수명보다 약 2배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 100배, 또는 약 100배 내지 약 1000배 더 길다. 일부 실시양태에서, 갭은 여기되는 1개 이상의 발광 표지된 분자의 발광 수명보다 약 10배 더 길다.
특정 실시양태에서, 펄스 여기 에너지의 주파수는 모니터링되는 화학적 공정에 기초하여 선택된다. 서열분석 반응의 경우에, 발광 표지된 뉴클레오티드가 혼입되는 동안 표적 체적에 전달되는 펄스의 수는 부분적으로, 검출되는 방출된 광자의 수를 결정할 것이다. 일부 실시양태에서, 주파수는 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입 동안 충분한 수의 광자가 검출되도록 선택되고, 여기서 충분한 수는 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 발광 표지된 뉴클레오티드를 구별하는데 필요한 광자의 수이다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 방출된 광자의 파장에 기초하여 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 발광 방출 수명, 예를 들어, 펄스 여기 및 방출 검출 사이의 시간에 기초하여 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 방출된 광자의 파장 및 발광 방출 수명에 기초하여 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 방출 신호의 발광 강도에 기초하여 (예를 들어, 방출의 주파수 또는 시간 기간 내에서의 방출 이벤트의 총 수에 기초하여) 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 방출 신호의 발광 강도 및 발광 수명에 기초하여 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 발광 강도 및 파장에 기초하여 구별된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 발광 강도, 파장, 및 발광 수명에 기초하여 구별된다.
본 출원의 측면에 따르면, 여기 소스 모듈 및 통합 디바이스를 포함하는 시스템이 제공된다. 여기 소스 모듈은 제1 지속 기간을 갖는 여기 에너지의 펄스를 방출하도록 구성된 여기 소스를 포함한다. 통합 디바이스는 여기 에너지의 펄스에 커플링될 때 발광을 방출하는 분자를 수용하도록 구성된 표적 체적, 여기 에너지의 펄스가 에너지 소스 커플링 컴포넌트로부터 표적 체적으로 이동하는 제1 에너지 경로, 제2 지속 기간에 걸쳐 발광을 검출하는 센서 (여기서 제2 지속 기간은 제1 지속 기간보다 더 큼), 발광이 표적 체적으로부터 센서로 이동하는 제2 에너지 경로, 및 여기 에너지의 펄스가 여기 소스로부터 에너지 소스 커플링 컴포넌트로 이동하는 제3 에너지 경로를 포함한다.
본 출원의 또 다른 측면에 따르면, 표적 체적 및 센서를 포함하는 통합 디바이스가 제공된다. 표적 체적은 복수의 발광 마커 중 하나로 표지된 샘플을 수용하도록 구성되고, 복수의 발광 마커 각각은 상이한 수명 값을 갖는다. 센서는 복수의 발광 마커 중 하나로부터의 발광을 복수의 시간 기간에 걸쳐 검출하도록 구성된다. 복수의 시간 기간은 복수의 발광 마커를 차별화하도록 선택된다.
본 출원의 또 다른 측면에 따르면, 표적 체적 및 복수의 센서를 포함하는 통합 디바이스가 제공된다. 표적 체적은 복수의 발광 마커 중 하나로 표지된 샘플을 수용하도록 구성된다. 복수의 발광 마커 각각은 복수의 스펙트럼 범위 중 하나의 범위 내에서 발광을 방출하고, 복수의 스펙트럼 범위 중 하나의 범위에서 발광을 방출하는 복수의 발광 마커 중 일부는 각각 상이한 발광 수명을 갖는다. 복수의 센서 중 각각의 센서는 복수의 시간 기간에 걸쳐 복수의 스펙트럼 범위 중 하나를 검출하도록 구성되고, 복수의 시간 기간은 복수의 발광 마커 중 일부를 차별화하도록 선택된다.
본 출원의 또 다른 측면에 따르면, 복수의 여기 소스 및 통합 디바이스를 포함하는 시스템이 제공된다. 복수의 여기 소스는 복수의 여기 에너지를 방출한다. 복수의 여기 소스 각각은 복수의 여기 에너지 중 하나의 펄스를 방출한다. 통합 디바이스는 복수의 발광 마커 중 하나로 표지된 샘플을 수용하도록 구성된 표적 체적, 및 복수의 여기 에너지 중 하나의 펄스 후에 복수의 시간 기간에 걸쳐 복수의 발광 마커 중 하나로부터의 발광을 검출하도록 구성된 센서를 포함한다. 복수의 여기 에너지 중 하나에 의해 조명된 후 발광을 방출하는 복수의 발광 마커 중 일부는 각각 상이한 수명 값을 갖는다. 펄스 이벤트와 발광 방출 사이의 기간을 잰 복수의 데이터의 축적은 복수의 발광 마커를 차별화한다.
본 출원의 또 다른 측면에 따르면, 표적 핵산을 서열분석하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산을 서열분석하는 방법은 (i) (a) 상기 표적 핵산, (b) 상기 표적 핵산에 상보적인 프라이머, (c) 핵산 폴리머라제, 및 (d) 상기 표적 핵산에 상보적인 신장 핵산 가닥에의 혼입을 위한 뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계이며, 여기서 상기 뉴클레오티드는 상이한 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 발광 표지된 뉴클레오티드는 상기 신장 핵산 가닥에의 순차적인 혼입 동안 검출가능한 신호를 생성하고, 상기 상이한 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드에 대한 검출가능한 신호는 (예를 들어, 검출가능한 신호의 타이밍 및/또는 주파수를 결정함으로써) 시간 도메인 내에서 서로를 차별화가능하게 하는 것인 단계; (ii) 상기 (i)의 혼합물을 상기 프라이머의 연장에 의해 상기 신장 핵산 가닥을 생성하는데 충분한 조건 하에 중합 반응에 적용하는 단계; (iii) 상기 신장 핵산 가닥에의 순차적 혼입 동안 상기 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 상기 검출가능한 신호를 측정하는 단계; 및 (iv) 상기 신장 핵산 가닥에의 순차적 혼입 시 상기 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 상기 측정된 검출가능한 신호의 타이밍 및/또는 주파수를 결정하여 상기 신장 핵산 가닥에의 상기 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입의 시간 순서를 식별함으로써, 상기 표적 핵산의 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산 또는 핵산 폴리머라제는 지지체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 혼입의 시간 순서는 (i)의 혼합물을 중합 반응에 적용하는 단계에 후속하여 식별된다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 신호는 광학 신호이다. 일부 실시양태에서, 광학 신호는 발광 신호이다. 일부 실시양태에서, 측정된 검출가능한 신호의 타이밍 및/또는 주파수를 결정하는 단계는 (i) 1개 이상의 센서에서 상기 검출가능한 신호를 수신하는 것; 및 (ii) 상기 1개 이상의 센서에 수신된 상기 검출가능한 신호에 반응하여 생성된 복수의 전하 캐리어의 전하 캐리어를, 상기 전하 캐리어가 생성된 시간에 기초하여 적어도 하나의 전하 캐리어 저장 영역으로 선택적으로 향하게 하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 측정된 검출가능한 신호의 타이밍 및/또는 주파수는 붕괴 수명의 측정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 측정된 검출가능한 신호의 타이밍 및/또는 주파수는 검출가능한 신호를 검출하는 1개 이상의 센서에서의 검출가능한 신호의 도달 시간의 측정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 검출가능한 신호에 의해 생성된 전하 캐리어를 검출가능한 신호의 도달 시간에 기초하여 1개 이상 센서와 연관된 빈으로 분리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 측정된 검출가능한 신호의 타이밍 및/또는 주파수는 비-스펙트럼 측정이다.
통상의 기술자는 본원에 기재된 도면이 예시 목적만을 위한 것임을 이해할 것이다. 일부 경우에 본 발명의 다양한 측면이 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 과장되어 또는 확대되어 제시될 수 있다는 것이 이해된다. 도면에서, 유사 참조 문자가 다양한 도면 전체에서 유사 특색, 기능적으로 유사한 및/또는 구조적으로 유사한 요소를 일반적으로 지칭한다. 도면은 반드시 척도화된 것은 아니고, 대신 본 교시의 원리를 예시하는데 강조를 두었다. 도면은 어떠한 방식으로도 본 발명의 교시의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 특색 및 이점은 도면과 함께 이해할 때, 하기에 제시된 상세한 설명으로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도면을 참조하여 실시양태를 기재할 때, 방향 언급 ("위", "아래", "상부", "저부", "좌측", "우측", "수평", "수직" 등)이 사용될 수 있다. 이러한 언급은 단지 통상의 배향으로 도면을 보는 독자를 돕기 위한 것이다. 이들 방향 언급은 구현된 디바이스의 바람직한 또는 유일한 배향을 기재하는 것으로 의도되지 않는다. 디바이스는 다른 배향으로 구현될 수 있다.
상세한 설명으로부터 명백한 바와 같이, 도면 (예를 들어, 도 1-37)에 도시되고 출원 전반에 걸쳐 예시의 목적으로 추가로 기재된 예는 비제한적 실시양태를 기재하고, 일부 경우에 보다 분명한 예시의 목적으로 특정 공정을 단순화하거나 특색 또는 단계를 생략할 수 있다.
도 1은 핵산 서열분석을 위한 다양한 컴포넌트를 함유하는 샘플 웰 (예를 들어, 샘플 웰)의 비제한적 개략도를 보여준다.
도 2는 4개의 스테이지; (A) 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입 전; (B) 제1 혼입 이벤트; (C) 제1 및 제2 혼입 이벤트 사이의 기간; 및 (D) 제2 혼입 이벤트 동안의 핵산 서열분석의 비제한적, 예시적인 실험을 스테이지 (A)-(D) 동안의 원시 및 처리된 데이터의 상응하는 예와 함께 보여준다.
도 3은 상이한 발광 수명을 갖는 4종의 발광 분자에 대한 비제한적 신호 vs. 방출 시간 및 붕괴 확률에 대한 정규화된 누적 분포 함수를 도시한다.
도 4는 예시적인 발광 표지된 뉴클레오티드에 대한 발광 수명의 비제한적 차트 및 발광 강도의 차트를 보여준다.
도 5는 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드를 사용한 비제한적 서열분석 실험을 도시한다: (A) 녹색 및 적색 펄스로부터 검출된 발광의 트레이스; (B) 각각의 뉴클레오티드 혼입의 발광 수명 및 강도에 기초한 녹색 펄스로부터의 데이터의 감소; 및 (C) 실험적으로 결정된 서열과 주형 서열의 정렬.
도 6은 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드를 사용한 비제한적 서열분석 실험을 도시한다: (A) 녹색 펄스로부터 검출된 발광의 트레이스; (B) 각각의 뉴클레오티드 혼입의 발광 수명 및 강도에 기초한 녹색 펄스로부터의 데이터의 감소; 및 (C) 실험적으로 결정된 서열과 주형 서열의 정렬.
도 7은 (a) 증착, (b) 패시베이션, (c) 실란화, (d) 복합체 로딩, 및 (e) 서열분석 반응 개시 단계를 포함한, 표면 제조를 위한 비제한적, 예시적인 공정을 보여준다.
도 8은 포스포네이트-PEG 기에 의한 금속 산화물 표면의 패시베이션을 위한 2가지 비제한적 방법을 보여준다.
도 9는 실란-PEG-비오틴 및 실란-PEG 혼합물에 의한 유리의 관능화를 위한 2가지 비제한적 방법을 보여준다.
도 10은 보호 분자를 통해 연결된 1개 이상의 발광 분자 및 1개 이상의 뉴클레오티드의 비제한적 예를 도시한다.
도 11은 스플릿 링커를 통해 보호 분자에 부착된 1개 이상의 뉴클레오티드 및 1개 이상의 발광 분자를 수반하는 구성의 비제한적 예를 도시한다.
도 12는 서열분석 반응 및 예시적인 서열분석 실험에 사용될 수 있는 발광-표지된 뉴클레오티드 분자의 구성의 비제한적 실시양태를 도시하며, 여기서 발광-표지된 뉴클레오티드의 발광 특성은 서열분석 반응에 혼입되는 염기를 식별하는데 사용된다.
도 13은 선택된 부위에 발광 분자 및 뉴클레오티드를 부착시키기 위해 보호 분자에서 비-기능적 결합 부위를 조작하는 비제한적 예를 도시한다.
도 14는 발광 분자 및 뉴클레오티드가 보호 분자를 통해 연결된 비제한적 예를 도시하며, 여기서 보호 분자에 발광 분자 및 뉴클레오티드를 부착시키는 링커는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
도 15는 발광 분자가 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티드를 통해 보호 분자에 부착되는 비제한적 예를 도시하며, 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드 가닥은 보호 분자 상의 결합 부위와 상용성인 1개의 비-공유 결합 리간드를 함유한다.
도 16은 보호 분자의 독립적 부위에 발광 분자 및 뉴클레오티드를 부착시키기 위해 유전자 코딩된 태그를 사용하는 비제한적 예를 도시한다.
도 17은 보호 분자의 독립적 부위에 발광 분자 및 뉴클레오티드를 부착시키기 위해 단백질의 말단 기의 반응성 기를 사용하는 비제한적 예를 도시한다.
도 18은 보호 분자의 독립적 부위에 발광 분자 및 뉴클레오티드를 부착시키기 위해 비천연 아미노산을 사용하는 비제한적 예를 도시한다.
도 19a 및 도 19b는 비-단백질 보호 분자에 의해 분리된 발광 분자 및 뉴클레오티드의 비제한적 예를 도시한다.
도 20은 단백질-단백질 결합 쌍으로 구성된 보호 분자의 비제한적 실시양태를 도시한다.
도 21은 링커 구성의 비제한적 예를 도시한다.
도 22는 뉴클레오티드 링커 합성 및 예시적인 구조에 대한 비제한적 반응식을 도시한다.
도 23a는 일부 실시양태에 따른, 생물학적 및 화학적 시편의 신속한, 모바일 분석에 사용될 수 있는 장치의 블록 다이어그램 표현이다.
도 23b는 일부 실시양태에 따른, 통합 디바이스 및 기기의 블록 다이어그램이다.
도 24a는 일부 실시양태에 따른, 통합 디바이스의 픽셀의 행을 도시한다.
도 24b는 일부 실시양태에 따른, 픽셀의 행 내의 샘플 웰에 커플링된 여기 에너지 및 센서를 향하는 각각의 샘플 웰로부터의 방출 에너지를 도시한다.
도 25는 일부 실시양태에 따른, 통합 디바이스 및 여기 소스를 도시한다.
도 26은 일부 실시양태에 따른, 통합 디바이스 및 여기 소스를 도시한다.
도 27a는 한 실시양태에 따른, 통합 디바이스의 픽셀 영역 내에 형성된 샘플 웰을 도시한다.
도 27b는 일부 실시양태에 따른, 샘플 웰에 입사되는 여기 에너지를 도시한다.
도 27c는 일부 실시양태에서 샘플 웰과 연관된 여기 영역에서 여기 에너지를 증가시키는 디봇을 포함하는 샘플 웰을 도시한다.
도 28은 일부 실시양태에 따른, 샘플 웰 및 디봇을 도시한다.
도 29a 및 29b는 일부 실시양태에 따른, 시간 빈을 갖는 센서를 도시한다.
도 30a는 일부 실시양태에 따른, 광 펄스를 제공하기 위한 예시적인 시스템을 도시한다.
도 30b는 시간의 함수로서의 광 강도의 플롯을 도시한다.
도 31a는 일부 실시양태에 따른, 측정을 수행하기 위한 개략도를 도시한다.
도 31b는 일부 실시양태에 따른, 시간의 함수로서의 광 신호의 플롯을 도시한다.
도 31c는 일부 실시양태에 따른, 시간 빈에 걸친 마커에 대한 신호 프로파일을 도시한다.
도 32a는 일부 실시양태에 따른, 시간의 함수로서의 광 신호의 플롯을 도시한다.
도 32b는 일부 실시양태에 따른, 시간 빈에 걸친 마커에 대한 신호 프로파일을 도시한다.
도 33a는 일부 실시양태에 따른, 측정을 수행하기 위한 개략도를 도시한다.
도 33b는 일부 실시양태에 따른, 방출 파장의 함수로서의 수명의 플롯을 도시한다.
도 34a는 일부 실시양태에 따른, 파장의 함수로서의 광 신호의 플롯을 도시한다.
도 34b는 일부 실시양태에 따른, 시간의 함수로서의 광 신호의 플롯을 도시한다.
도 35a는 일부 실시양태에 따른, 다수의 센서에 대한 시간 빈에 걸친 마커에 대한 신호 프로파일을 도시한다.
도 35b는 일부 실시양태에 따른, 시간의 함수로서의 광 신호의 플롯을 도시한다.
도 35c는 일부 실시양태에 따른, 다수의 센서에 대한 시간 빈에 걸친 마커에 대한 신호 프로파일을 도시한다.
도 36a는 일부 실시양태에 따른, 측정을 수행하기 위한 개략도를 도시한다.
도 36b는 일부 실시양태에 따른, 파장의 함수로서의 광 신호의 플롯을 도시한다.
도 37a는 일부 실시양태에 따른, 시간의 함수로서의 광 신호의 플롯을 도시한다.
도 37b는 일부 실시양태에 따른, 다수의 센서에 대한 시간 빈에 걸친 마커에 대한 신호 프로파일을 도시한다.
본 발명자들은 분자의 1종 이상의 발광 특성에 기초하여 단일 분자를 식별하기 위한 신규 방법, 조성물, 및 디바이스를 개발하였다. 일부 실시양태에서, 분자는 그의 발광 수명, 흡수 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 발광 양자 수율, 발광 강도, 또는 그의 2 이상의 조합에 기초하여 식별된다. 식별하는 것은 분자의 정확한 분자 아이덴티티를 할당하는 것을 의미할 수 있거나, 또는 가능한 분자의 세트로부터 특정한 분자를 구별 또는 차별화하는 것을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 단일 분자는 상이한 발광 수명, 흡수 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 발광 양자 수율, 발광 강도, 또는 그의 2 이상의 조합에 기초하여 서로 구별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 분자는 분자를 일련의 분리된 광 펄스에 노출시키고 분자로부터 방출된 각각의 광자의 타이밍 또는 다른 특성을 평가함으로써 식별된다 (예를 들어, 다른 분자와 구별된다). 일부 실시양태에서, 단일 분자로부터 순차적으로 방출된 복수의 광자에 대한 정보는 분자를 식별하기 위해 모아서 평가된다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명은 분자로부터 순차적으로 방출된 복수의 광자로부터 결정되고, 발광 수명은 분자를 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 강도는 분자로부터 순차적으로 방출된 복수의 광자로부터 결정되고, 발광 강도는 분자를 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명 및 발광 강도는 분자로부터 순차적으로 방출된 복수의 광자로부터 결정되고, 발광 수명 및 발광 강도는 분자를 식별하는데 사용될 수 있다.
본 출원의 측면은 1종 이상의 생물학적 또는 화학적 분자를 검출하고/거나 식별하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 화학적 또는 생물학적 반응은 하나 이상의 시점에서 하나 이상의 시약 또는 생성물의 존재 또는 부재를 결정함으로써 평가될 수 있다.
본 출원의 측면은 분자를 광에 노출시키고 분자로부터 방출된 하나 이상의 광자의 하나 이상의 특성을 결정함으로써 분자를 조사한다. 특정 실시양태에서, 분자는 분자를 광의 펄스에 노출시키고 분자로부터 방출된 광자의 하나 이상의 특성을 결정함으로써 조사된다. 일부 실시양태에서, 분자는 복수의 분리된 광 펄스 이벤트에 노출되고, 분리된 광 펄스 이벤트 후에 방출된 분리된 광자의 하나 이상의 특성이 결정된다. 일부 실시양태에서, 분자는 각각의 광 펄스에 반응하여 광자를 방출하지 않는다. 그러나, 복수의 방출된 광자는 분자를 일련의 분리된 광 펄스에 노출시키고 광 펄스 이벤트의 하위세트 후에 방출된 분리된 광자 (예를 들어, 펄스 이벤트의 약 10% 후에 방출된 광자, 또는 펄스 이벤트의 약 1% 후에 방출된 광자)를 평가함으로써 평가될 수 있다.
본 출원의 측면은 하나 이상의 시점에 하나 이상의 시약, 중간체 및/또는 반응 생성물의 존재 또는 부재를 결정함으로써 화학적 또는 생물학적 반응을 모니터링하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 시간의 경과에 따른 반응의 진행은 반응 샘플을 일련의 분리된 광 펄스에 노출시키고 각각의 광 펄스 후에 검출된 임의의 방출된 광자를 분석함으로써 분석될 수 있다.
따라서, 본 출원의 일부 측면에서, 반응 샘플은 복수의 분리된 광 펄스에 노출되고, 일련의 방출된 광자는 검출되고 분석된다. 일부 실시양태에서, 일련의 방출된 광자는 실험 시간에 걸쳐 반응 샘플에 존재하고 변화되지 않은 단일 분자에 대한 정보를 제공한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 일련의 방출된 광자는 반응 샘플에서 (예를 들어, 반응 또는 공정 진행으로서) 상이한 시간에 존재하는 일련의 상이한 분자에 대한 정보를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 측면은 예를 들어 샘플에서 하나 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 서열을 결정하고/거나 샘플에서 하나 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 변이체 (예를 들어, 관심 유전자에서 하나 이상의 돌연변이)의 존재 또는 부재를 결정하기 위해, 생물학적 샘플을 검정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험은 진단, 예후 및/또는 치료 목적을 위해 핵산 서열 정보를 제공하거나, 또는 하나 이상의 관심 핵산의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 환자 샘플 (예를 들어, 인간 환자 샘플)에 대해 수행될 수 있다. 일부 예에서, 진단 시험은 예를 들어 대상체의 생물학적 샘플에서 세포 유리 데옥시리보핵산 (DNA) 분자 및/또는 발현 생성물 (예를 들어, 리보핵산 (RNA))을 서열분석하는 것에 의한, 대상체의 생물학적 샘플에서 핵산 분자를 서열분석하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 발광 수명 및/또는 강도를 사용하여 분석될 (예를 들어, 조사 및/또는 식별될) 하나 이상의 분자는 표지된 분자 (예를 들어, 1종 이상의 발광 마커로 표지된 분자)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체분자의 개별 서브유닛은 마커를 사용하여 식별될 수 있다. 일부 예에서, 발광 마커는 생체 분자의 개별 서브유닛을 식별하는데 사용된다. 일부 실시양태는 발광 마커 (본원에서 "마커"로도 언급됨)를 사용하며, 이는 외인성 또는 내인성 마커일 수 있다. 외인성 마커는 발광 표지를 위한 리포터 및/또는 태그로서 사용되는 외부의 발광 마커일 수 있다. 외인성 마커의 예는 형광 분자, 형광단, 형광 염료, 형광 염색, 유기 염료, 형광 단백질, 형광 공명 에너지 전달 (FRET)에 참여하는 종, 효소, 및/또는 양자점을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다른 외인성 마커가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 이러한 외인성 마커는 특정한 표적 또는 컴포넌트에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 관능기 (예를 들어, 분자, 이온, 및/또는 리간드)에 접합될 수 있다. 외인성 태그 또는 리포터를 프로브에 부착하는 것은 외인성 태그 또는 리포터의 존재의 검출을 통한 표적의 식별을 가능하게 한다. 프로브의 예는 단백질, 핵산 (예를 들어, DNA, RNA) 분자, 지질 및 항체 프로브를 포함할 수 있다. 외인성 마커와 관능기의 조합은, 분자 프로브, 표지된 프로브, 혼성화 프로브, 항체 프로브, 단백질 프로브 (예를 들어, 비오틴-결합 프로브), 효소 표지, 형광 프로브, 형광 태그, 및/또는 효소 리포터를 포함한, 검출에 사용되는 임의의 적합한 프로브, 태그, 및/또는 표지를 형성할 수 있다.
본 개시내용은 발광 마커에 대해 언급하지만, 다른 유형의 마커가 본원에 제공된 디바이스, 시스템 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 마커는 질량 태그, 정전기 태그, 전기화학적 표지, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다.
외인성 마커가 샘플에 첨가될 수 있고, 한편 내인성 마커는 이미 샘플의 일부일 수 있다. 내인성 마커는 여기 에너지의 존재 하에 발광 또는 "자가형광"할 수 있는 존재하는 임의의 발광 마커를 포함할 수 있다. 내인성 형광단의 자가형광은 외인성 형광단의 도입을 필요로 하지 않으면서 무표지 비침습적 표지를 제공할 수 있다. 이러한 내인성 형광단의 예는, 예로서 제한 없이, 헤모글로빈, 옥시헤모글로빈, 지질, 콜라겐 및 엘라스틴 가교, 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NADH), 산화 플라빈 (FAD 및 FMN), 리포푸신, 케라틴, 및/또는 포르피린을 포함할 수 있다.
단일 분자 검출 및/또는 핵산 서열분석을 수행하기 위한 단순한, 덜 복잡한 장치에 대한 필요를 인식하고, 본 발명자들은 상이한 분자를 표지하기 위해, 발광 태그 (예를 들어, 발광 마커, 발광 표지)의 세트를 사용하여 단일 분자를 검출하는 기술을 고안하였다. 이러한 단일 분자는 태그를 갖는 뉴클레오티드 또는 아미노산일 수 있다. 태그는, 단일 분자에 결합된 동안, 단일 분자로부터 방출 시, 또는 단일 분자에 결합된 동안 및 이로부터 방출 시 검출될 수 있다. 일부 예에서, 태그는 발광 태그이다. 선택된 세트 내의 각각의 발광 태그는 각각의 분자와 회합된다. 예를 들어, 4개의 태그의 세트가 DNA에 존재하는 핵염기를 "표지"하는데 사용될 수 있고 - 세트의 각각의 태그는 상이한 핵염기와 회합되며, 예를 들어, 제1 태그는 아데닌 (A)과 회합되고, 제2 태그는 시토신 (C)과 회합되고, 제3 태그는 구아닌 (G)과 회합되고, 제4 태그는 티민 (T)과 회합된다. 또한, 태그의 세트 내의 발광 태그 각각은 세트의 제1 태그를 세트 내의 다른 태그와 구별하기 위해 사용될 수 있는 상이한 특성을 갖는다. 이러한 방식으로, 각각의 태그는 이들 구별되는 특징 중 하나 이상을 사용하여 고유하게 식별가능하다. 예로서 제한 없이, 하나의 태그를 또 다른 것과 구별하기 위해 사용될 수 있는 태그의 특징은 여기 에너지에 반응하여 태그에 의해 방출되는 광의 방출 에너지 및/또는 파장, 특정한 태그를 여기 상태에 두기 위해 그 태그에 의해 흡수되는 여기 광의 파장, 및/또는 태그의 방출 수명을 포함할 수 있다.
서열분석
본 출원의 일부 측면은 생물학적 중합체, 예컨대 핵산 및 단백질을 서열분석하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 방법, 조성물, 및 디바이스는 (예를 들어, 일련의 표지된 뉴클레오티드 또는 아미노산 단량체의 혼입의 시간-경과를 검출하는 것에 의해) 핵산 또는 단백질에 혼입된 일련의 뉴클레오티드 또는 아미노산 단량체를 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 기재된 방법, 조성물 및 디바이스를 사용하여, 폴리머라제 효소에 의해 합성된 주형-의존 핵산 서열분석 반응 생성물에 혼입된 일련의 뉴클레오티드를 식별할 수 있다.
특정 실시양태에서, 주형-의존 핵산 서열분석 생성물은 자연 발생 핵산 폴리머라제에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 자연 발생 폴리머라제의 돌연변이체 또는 변형된 변이체이다. 일부 실시양태에서, 주형-의존 핵산 서열 생성물은 주형 핵산 가닥에 상보적인 하나 이상의 뉴클레오티드 절편을 포함할 것이다. 한 측면에서, 본 출원은 주형 (또는 표적) 핵산 가닥의 상보적 핵산 가닥의 서열을 결정함으로써 그의 서열을 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 복수의 핵산 단편을 서열분석함으로써 표적 핵산을 서열분석하는 방법을 제공하며, 여기서 표적 핵산은 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 모 표적 핵산에 대한 서열 또는 부분 서열을 제공하기 위해 복수의 단편 서열을 조합하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조합하는 단계는 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어에 의해 수행된다. 본원에 기재된 방법은 전체 염색체 또는 게놈과 같은 관련된 표적 핵산의 세트가 서열분석되게 할 수 있다.
서열분석 동안, 중합 효소는 표적 핵산 분자의 프라이밍 위치에 커플링 (예를 들어, 부착)할 수 있다. 프라이밍 위치는 표적 핵산 분자의 일부와 상보적인 프라이머일 수 있다. 대안으로서 프라이밍 위치는 표적 핵산 분자의 이중 가닥 절편 내에 제공되는 갭 또는 닉이다. 갭 또는 닉은 길이가 0 내지 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 또는 40개 뉴클레오티드일 수 있다. 닉은 이중 가닥 서열 중 하나의 가닥에 절단점을 제공할 수 있고, 이는 예를 들어 가닥 치환 폴리머라제 효소와 같은, 중합 효소에 대한 프라이밍 위치를 제공할 수 있다.
일부 경우에, 서열분석 프라이머는 표적 핵산 분자에 어닐링될 수 있고, 이는 고체 지지체에 고정될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 고체 지지체는, 예를 들어, 핵산 서열분석에 사용되는 칩 상의 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구, 반응 챔버)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 고체 지지체에 고정될 수 있고, 표적 핵산 분자의 혼성화는 또한 표적 핵산 분자를 고체 지지체에 고정한다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 고체 지지체에 고정되고, 가용성 프라이머 및 표적 핵산은 폴리머라제에 접촉된다. 그러나, 일부 실시양태에서, 폴리머라제, 표적 핵산 및 프라이머를 포함하는 복합체는 용액 중에 형성되고, 복합체는 (예를 들어, 폴리머라제, 프라이머 및/또는 표적 핵산의 고정을 통해) 고체 지지체에 고정된다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구, 반응 챔버) 내의 어떠한 컴포넌트도 고체 지지체에 고정되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리머라제, 표적 핵산, 및 프라이머를 포함하는 복합체는 용액 중에 형성되고, 복합체는 고체 지지체에 고정되지 않는다.
적절한 조건 하에서, 어닐링된 프라이머/표적 핵산에 접촉된 폴리머라제 효소는 프라이머에 하나 이상의 뉴클레오티드를 부가 또는 혼입시킬 수 있고, 뉴클레오티드는 프라이머에 5'에서 3' 주형-의존 방식으로 부가될 수 있다. (예를 들어, 폴리머라제의 작용을 통한) 프라이머에의 뉴클레오티드의 이러한 혼입은 일반적으로 프라이머 연장 반응으로 지칭될 수 있다. 각각의 뉴클레오티드는 핵산 연장 반응 동안 (예를 들어, 그의 발광 수명 및/또는 다른 특징에 기초하여) 검출 및 식별될 수 있는 검출가능한 태그와 회합될 수 있고, 연장되는 프라이머 내로 혼입된 각각의 뉴클레오티드, 및 그에 따라 새로이 합성된 핵산 분자의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 새로이 합성된 핵산 분자의 서열 상보성을 통해 표적 핵산 분자의 서열을 또한 결정할 수 있다. 일부 경우에, 서열분석 프라이머의 표적 핵산 분자에의 어닐링 및 서열분석 프라이머에의 뉴클레오티드의 혼입은 유사한 반응 조건 (예를 들어, 동일한 또는 유사한 반응 온도)에서 또는 상이한 반응 조건 (예를 들어, 상이한 반응 온도)에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 방법에 의한 서열분석은 표적 핵산 분자의 집단 (예를 들어, 표적 핵산의 카피)의 존재 및/또는 표적 핵산의 집단을 달성하기 위한 표적 핵산의 증폭 단계를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 합성에 의한 서열분석은 평가되는 각각의 반응에서 단일 분자의 서열을 결정하는데 사용된다 (및 핵산 증폭은 서열분석을 위한 표적 주형을 제조하는데 필요하지 않다). 일부 실시양태에서, 복수의 단일 분자 서열분석 반응은 본 출원의 측면에 따라 (예를 들어, 단일 칩 상에서) 병렬로 수행된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수의 단일 분자 서열분석 반응은 단일 칩 상의 분리된 반응 챔버 (예를 들어, 나노개구, 샘플 웰)에서 각각 수행된다.
실시양태는 높은 정확도 및 긴 판독 길이, 예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 또는 99.9999%의 정확도, 및/또는 약 10 염기 쌍 (bp), 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 1000 bp, 10,000 bp, 20,000 bp, 30,000 bp, 40,000 bp, 50,000 bp, 또는 100,000 bp 이상의 판독 길이로 단일 핵산 분자를 서열분석할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 분자 서열분석에 사용되는 표적 핵산 분자는, 샘플 웰의 저부 또는 측벽과 같은 고체 지지체에 고정되거나 부착된 서열분석 반응의 적어도 하나의 추가의 컴포넌트 (예를 들어, 폴리머라제, 예컨대 DNA 폴리머라제, 서열분석 프라이머)를 함유하는 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구)에 부가되거나 고정된 단일 가닥 표적 핵산 (예를 들어, 데옥시리보핵산 (DNA), DNA 유도체, 리보핵산 (RNA), RNA 유도체) 주형이다. 표적 핵산 분자 또는 폴리머라제는 샘플 벽, 예컨대 샘플 웰의 저부 또는 측벽에 직접 또는 링커를 통해 부착될 수 있다. 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구)은 또한 프라이머 연장 반응을 통한 핵산 합성에 필요한 임의의 다른 시약, 예컨대 예를 들어 적합한 완충제, 보조-인자, 효소 (예를 들어, 폴리머라제), 및 발광 태그, 예컨대 형광단을 포함하는 데옥시리보뉴클레오시드 폴리포스페이트, 예컨대, 예를 들어, 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP) 및 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) dNTP를 포함한 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 부류의 dNTP (예를 들어, 아데닌-함유 dNTP (예를 들어, dATP), 시토신-함유 dNTP (예를 들어, dCTP), 구아닌-함유 dNTP (예를 들어, dGTP), 우라실-함유 dNTP (예를 들어, dUTP) 및 티민-함유 dNTP (예를 들어, dTTP))는 태그로부터 방출된 광의 검출이 새로이 합성된 핵산에 혼입된 dNTP의 아이덴티티를 나타내도록 별개의 발광 태그에 접합된다. 발광 태그로부터 방출된 광은 본원의 다른 곳에 기재된 디바이스 및 검출 방법을 포함한 임의의 적합한 이러한 디바이스 및/또는 방법을 통해 검출될 수 있고, 그의 적절한 발광 태그 (및, 이에 따라 회합된 dNTP)에 기인할 수 있다. 발광 태그는 발광 태그의 존재가 새로이 합성되는 핵산 가닥으로의 dNTP의 혼입 또는 폴리머라제의 활성을 억제하지 않도록 하는 임의의 위치에서 dNTP에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 태그는 dNTP의 말단 포스페이트 (예를 들어, 감마 포스페이트)에 접합된다.
일부 실시양태에서, 단일-가닥 표적 핵산 주형을 서열분석 프라이머, dNTP, 폴리머라제 및 핵산 합성에 필요한 다른 시약과 접촉시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, dNTP의 혼입이 연속해서 발생할 수 있도록 모든 적절한 dNTP을 단일-가닥 표적 핵산 주형과 동시에 접촉시킬 수 있다 (예를 들어, 모든 dNTP이 동시에 존재한다). 다른 실시양태에서, dNTP는 단일-가닥 표적 핵산 주형과 순차적으로 접촉될 수 있고, 이 경우 단일-가닥 표적 핵산 주형은 각각의 적절한 dNTP와 개별적으로 접촉되고, 단일-가닥 표적 핵산 주형과 상이한 dNTP와의 접촉 사이에 세척 단계가 존재한다. 단일-가닥 표적 핵산 주형을 각각의 dNTP와 개별적으로 접촉시키고 이어서 세척하는 이러한 사이클은, 식별하고자 하는 단일-가닥 표적 핵산 주형의 각각의 연속적인 염기 위치에 대해 반복될 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열분석 프라이머는 단일-가닥 표적 핵산 주형에 어닐링되고, 폴리머라제는 단일-가닥 표적 핵산 주형에 기초하여 dNTP (또는 다른 데옥시리보뉴클레오시드 폴리포스페이트)를 프라이머에 연속적으로 혼입시킨다. 각각의 혼입된 dNTP와 회합된 고유의 발광 태그는 dNTP의 프라이머에의 혼입 동안 또는 그 후에 적절한 여기 광에 의해 여기될 수 있고, 후속해서 그의 방출은 본원의 다른 곳에 기재된 디바이스 및 검출 방법을 포함한 임의의 적합한 디바이스(들) 및/또는 방법(들)을 사용하여 검출될 수 있다. (예를 들어, 특정한 방출 수명, 강도, 스펙트럼 및/또는 그의 조합을 갖는) 광의 특정한 방출의 검출은 혼입된 특정한 dNTP에 기인할 수 있다. 이어서, 검출된 발광 태그의 수집으로부터 수득된 서열은 서열 상보성을 통해 단일-가닥 표적 핵산 주형의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 dNTP에 대해 언급하지만, 본원에 제공된 디바이스, 시스템 및 방법은 다양한 유형의 뉴클레오티드, 예컨대 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 (예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 포스페이트 기를 갖는 데옥시리보뉴클레오시드 폴리포스페이트)와 함께 사용될 수 있다. 이러한 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드는 다양한 유형의 태그 (또는 마커) 및 링커를 포함할 수 있다.
핵산 서열분석의 예
하기 예는 본원에 기재된 방법, 조성물 및 디바이스의 일부를 예시하기 위한 것으로 의도된다. 예의 모든 측면은 비제한적이다. 도 1은 단일 분자 핵산 서열분석 방법의 설정을 개략적으로 예시한다. 1-110은 핵산 폴리머라제(1-101), 서열분석하기 위한 표적 핵산(1-102), 및 프라이머(1-104)를 포함하는 단일 복합체를 함유하도록 구성된 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구, 반응 챔버)이다. 이러한 예에서, 샘플 웰(1-110)의 저부 영역은 표적 체적 (예를 들어, 여기 영역)(1-120)으로 도시된다.
본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 표적 체적은 여기 에너지가 향하는 체적이다. 일부 실시양태에서, 체적은 샘플 웰 체적, 및 샘플 웰에의 여기 에너지의 커플링 둘 다의 특성이다. 표적 체적은 표적 체적 내에 국한되는 분자 또는 복합체의 수를 제한하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 체적은 단일 분자 또는 복합체를 국한하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 표적 체적은 단일 폴리머라제 복합체를 국한하도록 구성된다. 도 1에서 폴리머라제(1-101)를 포함하는 복합체는 표적 체적(1-120) 내에 국한된다. 복합체는 샘플 웰의 표면에의 부착에 의해 임의로 고정될 수 있다. 샘플 웰 표면 제조 및 관능화를 위한 예시적인 공정이 도 7-9에 도시되어 있고, 본 출원의 다른 곳에서 추가로 상세하게 논의되어 있다. 이러한 예에서 복합체는 폴리머라제(1-101)에 링커를 부착시키는데 적합한 하나 이상의 생체분자 (예를 들어, 비오틴)를 포함하는 링커(1-103)에 의해 고정된다.
개구의 체적은 또한 적합한 용매, 완충제, 및 폴리머라제 복합체가 핵산 가닥을 합성하는데 필요한 다른 첨가제를 함유하는 반응 혼합물을 함유한다. 반응 혼합물은 또한 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드를 함유한다. 각각의 유형의 뉴클레오티드는 기호 *-A, @-T, $-G, #-C에 의해 나타내어지고, 여기서 A, T, G 및 C는 뉴클레오티드 염기를 나타내고, 기호 *, @, $, 및 #는 링커 -를 통해 각각의 뉴클레오티드에 부착된 고유의 발광 표지를 나타낸다. 도 1에서, #-C 뉴클레오티드는 상보적 가닥(1-102)에 현재 혼입되고 있는 것이다. 혼입된 뉴클레오티드는 표적 체적(1-120) 내에 있다.
도 1은 또한 표적 체적 부근으로 전달되는 여기 에너지, 및 검출기를 향해 방출되는 발광의 개념을 화살표로 나타낸다. 화살표는 개략적이고, 여기 에너지 전달 또는 발광의 특정한 배향을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 광원으로부터의 광의 펄스이다. 여기 에너지는 광원과 표적 체적 부근 사이를, 하나 이상의 디바이스 컴포넌트, 예컨대 도파관 또는 필터를 통해 이동할 수 있다. 방출 에너지는 또한 발광 분자와 검출기 사이를, 하나 이상의 디바이스 컴포넌트, 예컨대 도파관 또는 필터를 통해 이동할 수 있다. 일부 발광은 검출기로 향하지 않는 벡터 상에 (예를 들어, 샘플 웰의 측벽을 향해) 방출될 수 있고, 검출되지 않을 수 있다.
도 2는 단일 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구)에서의 서열분석 공정을 시간의 경과에 따라 개략적으로 예시한다. 스테이지 A 내지 D는 도 1에서와 같은 폴리머라제 복합체를 함유하는 샘플 웰을 도시한다. 스테이지 A는 임의의 뉴클레오티드가 프라이머에 첨가되기 전의 초기 상태를 도시한다. 스테이지 B는 발광 표지된 뉴클레오티드 (#-C)의 혼입 이벤트를 도시한다. 스테이지 C는 혼입 이벤트 사이의 기간을 도시한다. 이러한 예에서, 뉴클레오티드 C가 프라이머에 첨가되고, 발광 표지된 뉴클레오티드 (#-C)에 이전에 부착된 표지 및 링커가 절단된다. 스테이지 D는 발광 표지된 뉴클레오티드 (*-A)의 제2 혼입 이벤트를 도시한다. 스테이지 D 이후의 상보적 가닥은 프라이머, C 뉴클레오티드 및 A 뉴클레오티드로 이루어진다.
스테이지 A 및 C는 둘 다 혼입 이벤트 전 또는 그 사이의 기간을 도시하며, 이러한 예에서 약 10 밀리초 동안 지속되는 것으로 표시된다. 스테이지 A 및 C에서, 어떠한 뉴클레오티드도 혼입되지 않기 때문에 표적 체적 내에 어떠한 발광 표지된 뉴클레오티드도 존재하지 않지만 (도 2에 도시되지 않음), 혼입되지 않은 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 배경 발광 또는 허위 발광이 검출될 수 있다. 스테이지 B 및 D는 상이한 뉴클레오티드 (각각 #-C 및 *-A)의 혼입 이벤트를 보여준다. 이러한 예에서 이들 이벤트는 또한 약 10 밀리초 동안 지속되는 것으로 표시된다.
"원시 빈 데이터"로 라벨링된 행은 각각의 스테이지 동안 생성된 데이터를 도시한다. 예시적인 실험을 통해, 복수의 펄스의 광이 표적 체적 부근으로 전달된다. 각각의 펄스에 대해 검출기는 검출기에 의해 수신된 임의의 방출된 광자를 기록하기 위해 구성된다. 방출된 광자가 검출기에 의해 수신되었을 때 이는 복수의 시간 빈 중 하나로 분리되며, 이러한 예에서 이는 3개 존재한다. 일부 실시양태에서, 검출기는 2 내지 16개의 시간 빈으로 구성된다. "원시 빈 데이터"는 최단, 중간 및 최장 빈에 각각 상응하는 1 (최단 막대), 2 (중간 막대) 또는 3 (최장 막대)의 값을 기록한다. 각각의 막대는 방출된 광자의 검출을 나타낸다.
스테이지 A 또는 C의 경우에 표적 체적에 발광 표지된 뉴클레오티드가 존재하지 않기 때문에, 어떠한 광자도 검출되지 않는다. 각각의 스테이지 B 및 D의 경우에 복수의 광자 방출 이벤트 (본원에 사용된 발광 이벤트 또는 "발광")가 혼입 이벤트 동안 검출된다. 발광 표지 #는 발광 표지 *보다 더 짧은 발광 수명을 갖는다. 따라서, 스테이지 B 데이터는 빈 값이 더 높은 스테이지 D보다 더 낮은 평균 빈 값을 기록한 것으로 도시된다.
"처리된 데이터"로 라벨링된 행은 각각의 펄스와 관련된 시간에 방출된 광자의 수 (카운트)를 나타내기 위해 처리된 원시 데이터를 도시한다. 각각의 막대는 특정한 시간 빈의 광자 카운트에 상응하기 때문에, 처리된 데이터를 도시하는 예시적인 곡선은 도면에 기재된 3개의 시간 빈보다 더 많은 시간 빈을 포함하는 원시 빈 데이터에 상응한다. 이러한 예에서, 데이터는 단지 발광 수명을 결정하기 위해 처리되지만, 데이터는 또한 다른 발광 특성, 예컨대 발광 강도 또는 흡수되거나 방출된 광자의 파장에 대해 평가될 수 있다. 예시적인 처리된 데이터는 표적 체적 내의 발광 표지의 발광 수명에 특징적인 지수 붕쇠 곡선을 근사화한다. 발광 표지 #는 발광 표지 *보다 짧은 발광 수명을 갖기 때문에, 스테이지 B의 경우에 처리된 데이터는 더 긴 시간 기간에 더 적은 카운트를 갖는 반면, 스테이지 D의 경우에 처리된 데이터는 더 긴 시간 기간에 상대적으로 더 많은 카운트를 갖는다.
도 2의 예시적인 실험은 상보적 가닥에 부가된 첫번째 2개의 뉴클레오티드를 CA로 식별할 것이다. DNA의 경우에, 프라이머에 어닐링된 영역 바로 다음의 표적 가닥의 서열은 따라서 GT로 식별될 것이다. 이러한 예에서 뉴클레오티드 C 및 A는 발광 수명에만 기초하여 복수의 C, G, T 및 A로부터 구별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 강도 또는 흡수되거나 방출된 광자의 파장과 같은 다른 특성이 하나 이상의 특정한 뉴클레오티드를 구별하는데 필요할 수 있다.
뉴클레오티드의 혼입 시 방출된 신호는 메모리에 저장되고 표적 핵산 주형의 서열을 결정하기 위해 나중의 시점에 처리될 수 있다. 이것은 신호를 참조 신호와 비교하여 혼입된 뉴클레오티드의 아이덴티티를 시간의 함수로서 결정하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 뉴클레오티드의 혼입 시 방출된 신호가 수집되고 (예를 들어, 뉴클레오티드 혼입 시) 실시간으로 처리되어, 표적 핵산 주형의 서열을 실시간으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 일반적으로 하나 이상의 핵산 서브유닛을 포함하는 분자를 지칭한다. 핵산은 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 및 우라실 (U), 또는 그의 변이체로부터 선택된 하나 이상의 서브유닛을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 또는 그의 유도체이다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 원형일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 일반적으로 A, C, G, T 또는 U, 또는 그의 변이체 또는 유사체를 포함할 수 있는 핵산 서브유닛을 지칭한다. 뉴클레오티드는 신장 핵산 가닥에 혼입될 수 있는 임의의 서브유닛을 포함할 수 있다. 이러한 서브유닛은 A, C, G, T 또는 U, 또는 하나 이상의 상보적 A, C, G, T 또는 U에 특이적이거나 퓨린 (예를 들어, A 또는 G, 또는 그의 변이체 또는 유사체) 또는 피리미딘 (예를 들어, C, T 또는 U, 또는 그의 변이체 또는 유사체)에 상보적인 임의의 다른 서브유닛일 수 있다. 서브유닛은 개별 핵산 염기 또는 염기의 군 (예를 들어, AA, TA, AT, GC, CG, CT, TC, GT, TG, AC, CA, 또는 그의 우라실-대응물)이 해석될 수 있게 한다.
뉴클레오티드는 일반적으로 뉴클레오시드 및 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 포스페이트 (PO3) 기를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵염기, 5-탄당 (리보스 또는 데옥시리보스) 및 하나 이상의 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 리보뉴클레오티드는 당이 리보스인 뉴클레오티드이다. 데옥시리보뉴클레오티드는 당이 데옥시리보스인 뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 모노포스페이트 또는 뉴클레오시드 폴리포스페이트일 수 있다. 뉴클레오티드는 검출가능한 태그, 예컨대 발광 태그 또는 마커 (예를 들어, 형광단)를 포함하는 데옥시리보뉴클레오시드 폴리포스페이트, 예컨대 예를 들어, 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP) 및 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) dNTP로부터 선택될 수 있는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트일 수 있다.
뉴클레오시드 폴리포스페이트는 'n'개의 포스페이트 기를 가질 수 있고, 여기서 'n'은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상의 수이다. 뉴클레오시드 폴리포스페이트의 예는 뉴클레오시드 디포스페이트 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다. 뉴클레오티드는 말단 포스페이트 표지된 뉴클레오시드, 예컨대 말단 포스페이트 표지된 뉴클레오시드 폴리포스페이트일 수 있다. 이러한 표지는 발광 (예를 들어, 형광 또는 화학발광) 표지, 형광원성 표지, 착색 표지, 발색 표지, 질량 태그, 정전기적 표지 또는 전기화학적 표지일 수 있다. 표지 (또는 마커)는 링커를 통해 말단 포스페이트에 커플링될 수 있다. 링커는 천연 또는 변형된 뉴클레오티드의 말단 포스페이트에서 예를 들어 포스페이트 에스테르, 티오에스테르, 포스포르아미데이트 또는 알킬 포스포네이트 연결을 형성하는데 적합할 수 있는, 예를 들어 적어도 하나의 또는 복수의 히드록실 기, 술프히드릴 기, 아미노 기 또는 할로알킬 기를 포함할 수 있다. 링커는, 예컨대 중합 효소의 도움에 의해 말단 포스페이트로부터 표지를 분리하도록 절단가능할 수 있다. 뉴클레오티드 및 링커의 예는 미국 특허 번호 7,041,812에 제공되고, 이는 전체가 본원에 참조로 포함된다.
뉴클레오티드 (예를 들어, 뉴클레오티드 폴리포스페이트)는 메틸화 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 메틸화 뉴클레오티드는 핵염기에 부착된 (예를 들어, 핵염기의 고리에 직접 부착된, 핵염기의 고리의 치환기에 부착된) 1개 이상의 메틸 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다. 예시적인 메틸화 핵염기는 1-메틸티민, 1-메틸우라실, 3-메틸우라실, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, 7-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6,N6-디메틸아데닌, 1-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, N2-메틸구아닌, 및 N2,N2-디메틸구아닌을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "프라이머"는, 일반적으로 A, C, G, T 및/또는 U, 또는 그의 변이체 또는 유사체를 포함하는 서열을 포함할 수 있는 핵산 분자 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 지칭한다. 프라이머는 DNA, RNA, PNA 또는 그의 변이체 또는 유사체를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머는 그의 뉴클레오티드 서열이 표적 가닥에 상보적이도록 설계될 수 있거나, 또는 프라이머는 무작위 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 꼬리 (예를 들어, 폴리-A 꼬리, 인덱스 어댑터, 분자 바코드 등)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 5 내지 15개의 염기, 10 내지 20개의 염기, 15 내지 25개의 염기, 20 내지 30개의 염기, 25 내지 35개의 염기, 30 내지 40개의 염기, 35 내지 45개의 염기, 40 내지 50개의 염기, 45 내지 55개의 염기, 50 내지 60개의 염기, 55 내지 65개의 염기, 60 내지 70개의 염기, 65 내지 75개의 염기, 70 내지 80개의 염기, 75 내지 85개의 염기, 80 내지 90개의 염기, 85 내지 95개의 염기, 90 내지 100개의 염기, 95 내지 105개의 염기, 100 내지 150개의 염기, 125 내지 175개의 염기, 150 내지 200개의 염기, 또는 200개 초과의 염기를 포함할 수 있다.
발광 특성
본원에 기재된 바와 같이, 발광 분자는 하나 이상의 광자를 흡수하고, 후속해서 하나 이상의 시간 기간 후에 하나 이상의 광자를 방출할 수 있는 분자이다. 분자의 발광은 발광 수명, 흡수 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 발광 양자 수율 및 발광 강도를 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 파라미터에 의해 기재된다. 용어 흡수 및 여기는 본 출원 전반에서 상호교환가능하게 사용된다. 전형적 발광 분자는 다수의 파장의 광을 흡수할 수 있거나, 또는 그에 의해 여기를 겪을 수 있다. 특정 파장에서의 또는 특정 스펙트럼 범위 내에서의 여기가 발광 방출 이벤트에 의해 이완될 수 있는 한편, 특정의 다른 파장 또는 스펙트럼 범위에서의 여기는 발광 방출 이벤트에 의해 이완되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 분자는 단일 파장에서의 또는 단일 스펙트럼 범위 내에서의 발광의 경우에만 적합하게 여기된다. 일부 실시양태에서, 발광 분자는 2 이상의 파장에서의 또는 2 이상의 스펙트럼 범위 내에서의 발광의 경우에 적합하게 여기된다. 일부 실시양태에서, 분자는 여기 광자 또는 흡수 스펙트럼의 파장을 측정함으로써 식별된다.
발광 방출 이벤트로부터 방출되는 광자는 가능한 파장의 스펙트럼 범위 내에서의 파장에서 방출될 것이다. 전형적으로, 방출된 광자는 여기 광자의 파장과 비교하여 더 긴 파장을 갖는다 (예를 들어, 더 낮은 에너지를 갖거나 적색-시프트된다). 특정 실시양태에서, 분자는 방출된 광자의 파장을 측정함으로써 식별된다. 특정 실시양태에서, 분자는 복수의 방출된 광자의 파장을 측정함으로써 식별된다. 특정 실시양태에서, 분자는 방출 스펙트럼을 측정함으로써 식별된다.
발광 수명은 여기 이벤트와 방출 이벤트 사이의 시간 기간을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 발광 수명은 지수 붕괴 방정식의 상수로서 표현된다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지를 전달하는 하나 이상의 펄스 이벤트가 존재하는 경우에, 시간 기간은 펄스와 후속 방출 이벤트 사이의 시간이다.
분자의 "발광 수명을 결정하는 것"은 임의의 적합한 방법을 사용하여 (예를 들어, 적합한 기술을 사용하여 수명을 측정하는 것에 의해 또는 방출의 시간-의존성 특징을 결정하는 것에 의해) 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명을 결정하는 것은 하나 이상의 분자 (예를 들어, 서열분석 반응에서의 상이한 발광 표지된 뉴클레오티드)와 관련하여 수명을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명을 결정하는 것은 참조물과 관련하여 수명을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명을 결정하는 것은 수명 (예를 들어, 형광 수명)을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명을 결정하는 것은 수명을 나타내는 하나 이상의 시간적 특징을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명은 여기 펄스와 관련하여 하나 이상의 시간-게이팅 윈도우를 가로질러 발생한 복수의 방출 이벤트 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 그 초과의 방출 이벤트)의 분포에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 단일 분자의 발광 수명은 여기 펄스와 관련하여 측정된 광자 도달 시간의 분포에 기초하여 상이한 발광 수명을 갖는 복수의 분자와 구별될 수 있다.
단일 분자의 발광 수명은 단일 분자가 여기 상태에 도달한 후에 방출된 광자의 타이밍을 나타내고, 단일 분자는 광자의 타이밍을 나타내는 정보에 의해 구별될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 일부 실시양태는 분자에 의해 방출된 광자와 연관된 시간을 측정함으로써 분자의 발광 수명에 기초하여 복수의 분자로부터 분자를 구별하는 것을 포함할 수 있다. 시간의 분포는 분포로부터 결정될 수 있는 발광 수명의 지표를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 분자는 시간의 분포에 기초하여, 예컨대 시간의 분포를 공지된 분자에 상응하는 참조 분포와 비교함으로써 복수의 분자로부터 구별가능하다. 일부 실시양태에서, 발광 수명에 대한 값은 시간의 분포로부터 결정된다.
발광 양자 수율은 방출 이벤트로 이어지는 주어진 파장에서의 또는 주어진 스펙트럼 범위 내에서의 여기 이벤트의 분율을 지칭하며, 전형적으로 1 미만이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 분자의 발광 양자 수율은 0 내지 약 0.001, 약 0.001 내지 약 0.01, 약 0.01 내지 약 0.1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 0.9, 또는 약 0.9 내지 1이다. 일부 실시양태에서, 발광 양자 수율을 결정 또는 추정함으로써 분자가 식별된다.
단일 분자에 대해 본원에 사용된 바와 같이, 발광 강도는 펄스 여기 에너지의 전달에 의해 여기되는 분자에 의해 방출된, 단위 시간당 방출된 광자의 수를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 발광 강도는 펄스 여기 에너지의 전달에 의해 여기되는 분자에 의해 방출되고 특정한 센서 또는 센서의 세트에 의해 검출된, 단위 시간당 방출된 광자의 검출된 수를 지칭한다.
발광 수명, 발광 양자 수율, 및 발광 강도는 상이한 조건 하에서 주어진 분자에 대해 각각 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 분자는 분자 집단과 상이한 관측 발광 수명, 발광 양자 수율, 또는 발광 강도를 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구) 내에 국한된 분자는 샘플 웰에 국한되지 않은 분자와 상이한 관측 발광 수명, 발광 양자 수율 또는 발광 강도를 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 또 다른 분자에 부착된 발광 표지 또는 발광 분자는 또 다른 분자에 부착되지 않은 발광 표지 또는 발광 분자와 상이한 발광 수명, 발광 양자 수율, 또는 발광 강도를 가질 것이다. 일부 실시양태에서, 거대분자 복합체 (예를 들어, 단백질 복합체 (예를 들어, 핵산 폴리머라제))와 상호작용하는 분자는 거대분자 복합체와 상호작용하지 않는 분자와 상이한 발광 수명, 발광 양자 수율, 또는 발광 강도를 가질 것이다.
특정 실시양태에서, 본 출원에 기재된 발광 분자는 하나의 광자를 흡수하고, 시간 기간 후에 하나의 광자를 방출한다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명은 시간 기간을 측정함으로써 결정 또는 추정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명은 다수의 펄스 이벤트 및 방출 이벤트에 대해 복수의 시간 기간을 측정함으로써 결정 또는 추정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명은 시간 기간을 측정함으로써 복수의 유형의 분자의 발광 수명과 차별화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자의 발광 수명은 다수의 펄스 이벤트 및 방출 이벤트에 대해 복수의 시간 기간을 측정함으로써 복수의 유형의 분자의 발광 수명과 차별화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분자는 분자의 발광 수명을 결정 또는 추정함으로써 복수의 유형의 분자에서 식별 또는 차별화된다. 특정 실시양태에서, 분자는 분자의 발광 수명을 복수의 유형의 분자의 복수의 발광 수명과 차별화함으로써 복수의 유형의 분자에서 식별 또는 차별화된다.
특정 실시양태에서, 발광 방출 이벤트는 형광이다. 특정 실시양태에서, 발광 방출 이벤트는 인광이다. 본원에 사용된 용어 발광은 형광 및 인광 둘 다를 포함한 모든 발광 이벤트를 포괄한다.
한 측면에서, 본 출원은 표적 체적에 발광 분자를 제공하는 것; 여기 에너지의 복수의 펄스를 표적 체적 부근으로 전달하는 것; 및 발광 분자로부터 복수의 발광을 검출하는 것을 포함하는, 단일 발광 분자의 발광 수명을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 각각의 쌍의 펄스와 발광 사이에서 복수의 시간 기간의 분포를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 표적 체적에 단일 발광 분자를 고정하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 표적 체적에 복수의 발광 분자를 제공하는 것; 여기 에너지의 복수의 펄스를 표적 체적 부근으로 전달하는 것; 및 발광 분자로부터 복수의 발광을 검출하는 것을 포함하는, 복수의 분자의 발광 수명을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 각각의 쌍의 펄스와 발광 사이에서 복수의 시간 기간의 분포를 평가하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 표적 체적에 발광 분자를 고정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 2 내지 약 10개의 분자, 약 10 내지 약 100개의 분자, 또는 약 100 내지 약 1000개의 분자로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 1000 내지 약 106개의 분자, 약 106 내지 약 109개의 분자, 약 109 내지 약 1012개의 분자, 약 1012 내지 약 1015개의 분자, 또는 약 1015 내지 약 1018개의 분자로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 복수의 모든 분자는 동일한 유형의 분자이다.
도 3은 상이한 발광 수명을 갖는 (최장에서 최단, 상부에서 저부) 4종의 발광 분자에 대한 예시적인 붕괴 프로파일 3-1을 보여준다. 진폭은 많은 분자를 포함하는 샘플로부터의 발광의 강도를 지칭할 수 있고, 이는 발광 수명에 기초하여 초기 여기 후 시간의 경과에 따라 지수적으로 감소한다. 진폭은 대안적으로 예를 들어 단일 분자에 대한, 여기 에너지의 복수의 펄스 후 시간 기간 후에 검출된 방출의 수 또는 카운트를 지칭할 수 있다. 정규화된 누적 분포 함수 3-2는 상이한 발광 수명을 갖는 (최단에서 최장, 상부에서 저부) 4종의 발광 분자에 대한 3-1에 상응한다. CDF는 발광 수명에 기초하여 초기 여기 후 시간의 경과에 따라 0에 도달할 발광 진폭의 정규화된 확률 (예를 들어, 발광된 모든 여기 분자의 누적 확률)을 나타낼 수 있다. CDF는 대안적으로 단일 펄스 후 또는 여기 에너지의 복수의 펄스의 각각 후 특정 시간 기간에 발광을 방출하는 단일 분자의 정규화된 확룔을 나타낼 수 있다.
한 측면에서, 본 출원은 표적 체적에 발광 분자를 제공하는 것; 여기 에너지의 복수의 펄스를 표적 체적 부근으로 전달하는 것; 및 발광 분자로부터 복수의 발광을 검출하는 것을 포함하는, 단일 발광 분자의 발광 강도를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 단위 시간당 복수의 검출된 발광의 수를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 표적 체적에 단일 발광 분자를 고정하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 표적 체적에 복수의 발광 분자를 제공하는 것; 여기 에너지의 복수의 펄스를 표적 체적 부근으로 전달하는 것; 및 발광 분자로부터 복수의 발광을 검출하는 것을 포함하는, 복수의 분자의 발광 강도를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 단위 시간당 복수의 검출된 발광의 수를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 표적 체적에 발광 분자를 고정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 2 내지 약 10개의 분자, 약 10 내지 약 100개의 분자, 또는 약 100 내지 약 1000개의 분자로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 1000 내지 약 106개의 분자, 약 106 내지 약 109개의 분자, 약 109 내지 약 1012개의 분자, 약 1012 내지 약 1015개의 분자, 또는 약 1015 내지 약 1018개의 분자로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 복수의 모든 분자는 동일한 유형의 분자이다.
여기 에너지
본원에 기재된 방법의 한 측면에서, 식별 또는 구별하고자 하는 분자의 발광 표지를 여기시키기 위해 하나 이상의 여기 에너지가 사용된다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 가시 스펙트럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 자외선 스펙트럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 적외선 스펙트럼 내에 있다. 일부 실시양태에서, 1종의 여기 에너지가 발광 표지된 분자를 여기시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 2종의 여기 에너지가 발광 표지된 분자를 여기시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 3종 이상의 여기 에너지가 발광 표지된 분자를 여기시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 각각의 발광 표지된 분자는 전달된 여기 에너지 중 오직 1종에 의해서만 여기된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 분자는 전달된 여기 에너지 중 2종 이상에 의해 여기된다. 특정 실시양태에서, 여기 에너지는 단색일 수 있거나, 또는 스펙트럼 범위에 국한될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스펙트럼 범위는 약 0.1 nm 내지 약 1 nm, 약 1 nm 내지 약 2 nm, 또는 약 2 nm 내지 약 5 nm의 범위를 갖는다. 일부 실시양태에서 스펙트럼 범위는 약 5 nm 내지 약 10 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm의 범위를 갖는다.
특정 실시양태에서, 여기 에너지는 광의 펄스로서 전달된다. 특정 실시양태에서, 여기 에너지는 광의 복수의 펄스로서 전달된다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 여기 에너지가 발광 표지된 분자를 여기시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 각각의 여기 에너지는 동시에 (예를 들어, 각각의 펄스로) 전달된다. 일부 실시양태에서, 각각의 여기 에너지는 상이한 시간에 (예를 들어, 각각의 에너지의 분리된 펄스로) 전달된다. 상이한 여기 에너지는 표적 분자로부터 발광의 검출을 가능하게 하는데 충분한 임의의 패턴으로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종의 여기 에너지는 각각의 펄스로 전달된다. 일부 실시양태에서, 제1 여기 에너지 및 제2 여기 에너지는 교대 펄스로 전달된다. 일부 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 일련의 순차적 펄스로 전달되고, 제2 여기 에너지는 순차적 펄스의 후속 시리즈로, 또는 이러한 시리즈의 교대 패턴으로 전달된다.
특정 실시양태에서, 광의 펄스의 주파수는 발광 표지된 분자의 발광 특성에 기초하여 선택된다. 특정 실시양태에서, 광의 펄스의 주파수는 복수의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 특성에 기초하여 선택된다. 특정 실시양태에서, 광의 펄스의 주파수는 복수의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 수명에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, 주파수는 펄스 사이의 갭이 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 수명보다 더 길도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 주파수는 복수의 발광 표지된 뉴클레오티드의 최장 발광 수명에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 수명이 0.25, 0.5, 1.0, 및 1.5 ns인 경우에, 광의 펄스의 주파수는 펄스 사이의 갭이 1.5 ns를 초과하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 갭은 여기되는 1종 이상의 발광 표지된 분자의 발광 수명보다 약 2배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 100배, 또는 약 100배 내지 약 1000배 더 길다. 일부 실시양태에서, 갭은 여기되는 1종 이상의 발광 표지된 분자의 발광 수명보다 약 10배 더 길다. 일부 실시양태에서, 갭은 약 0.01 ns 내지 약 0.1 ns, 약 1 ns 내지 약 5 ns, 약 5 ns 내지 약 15 ns, 약 15 ns 내지 약 25 ns, 또는 약 25 ns 내지 약 50 ns이다. 일부 실시양태에서, 갭은 펄스에 의해 여기된 분자가 발광 붕괴될, 또는 여기 상태가 또 다른 메카니즘에 의해 완화될 확률이 50%, 75%, 90%, 95%, 또는 99% 존재하도록 선택된다.
특정 실시양태에서, 다수의 여기 에너지가 존재하는 경우에, 각각의 여기 에너지에 대한 펄스의 주파수는 동일하다. 특정 실시양태에서, 다수의 여기 에너지가 존재하는 경우에, 각각의 여기 에너지에 대한 펄스의 주파수는 상이하다. 예를 들어, 적색 레이저가 0.2 및 0.5 ns의 수명으로 발광 분자를 여기시키는데 사용되고 녹색 레이저가 5 ns 및 7 ns의 수명으로 발광 분자를 여기시키는데 사용되는 경우에, 각각의 적색 레이저 펄스 후의 갭은 각각의 녹색 레이저 펄스 후의 갭 (예를 들어, 20 ns)보다 더 짧을 수 있다 (예를 들어, 5 ns).
특정 실시양태에서, 펄스 여기 에너지의 주파수는 모니터링할 화학적 공정에 기초하여 선택된다. 서열분석 반응의 경우에 주파수는 펄스의 수가 검출하고자 하는 방출된 광자의 충분한 수의 검출을 가능하게 하는데 충분히 전달되도록 선택될 수 있다. 검출된 광자와 관련하여 충분한 수는 복수의 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 발광 표지된 뉴클레오티드를 식별 또는 구별하는데 필요한 광자의 수를 지칭한다. 예를 들어, DNA 폴리머라제는 평균 20 밀리초마다 1회, 추가의 뉴클레오티드를 혼입할 수 있다. 발광 표지된 뉴클레오티드가 복합체와 상호작용하는 시간은 약 10 밀리초일 수 있고, 발광 마커가 절단된 때와 다음 발광 표지된 뉴클레오티드가 상호작용하기 시작하는 사이의 시간은 약 10 밀리초일 수 있다. 이어서 펄스 여기 에너지의 주파수는 발광 표지된 뉴클레오티드가 혼입될 때 10 밀리초 동안 충분한 수의 방출된 광자가 검출되도록 10 밀리초 내내 충분한 펄스를 전달하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 100 MHz의 주파수에서, 10 밀리초 (혼입 이벤트의 대략적인 길이) 내에 1백만개의 펄스가 존재할 것이다. 이들 펄스 중 0.1%가 검출된 광자로 이어지면, 혼입된 발광 표지된 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정하기 위해 분석될 수 있는 1,000개의 발광 데이터 지점이 존재할 것이다. 임의의 상기 값은 비-제한적이다. 일부 실시양태에서 혼입 이벤트는 1 ms 내지 20 ms, 20 ms 내지 100 ms, 또는 100 ms 내지 500 ms 걸릴 수 있다. 다수의 여기 에너지가 개별 시한성 펄스로 전달되는 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 단지 일부의 펄스에 의해서만 여기될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 여기 에너지의 펄스의 주파수 및 패턴은 펄스의 수가 복수의 발광 표지된 뉴클레오티드 중 어느 하나를 여기시켜 충분한 수의 방출된 광자가 검출되도록 하기에 충분하게 선택된다.
일부 실시양태에서, 펄스의 주파수는 약 1 MHz 내지 약 10 MHz이다. 일부 실시양태에서, 펄스의 주파수는 약 10 MHz 내지 약 100 MHz이다. 일부 실시양태에서, 펄스의 주파수는 약 100 MHz 내지 약 1 GHz이다. 일부 실시양태에서, 펄스의 주파수는 약 50 MHz 내지 약 200 MHz이다. 일부 실시양태에서, 펄스의 주파수는 약 100 MHz이다. 일부 실시양태에서, 주파수는 확률론적이다.
특정 실시양태에서, 여기 에너지는 약 500 nm 내지 약 700 nm이다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 약 500 nm 내지 약 600 nm, 또는 약 600 nm 내지 약 700 nm이다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 약 500 nm 내지 약 550 nm, 약 550 nm 내지 약 600 nm, 약 600 nm 내지 약 650 nm, 또는 약 650 nm 내지 약 700 nm이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 2개의 여기 에너지의 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 여기 에너지는 약 5 nm 내지 약 20 nm, 약 20 nm 내지 약 40 nm, 약 40 nm 내지 약 60 nm, 약 60 nm 내지 약 80 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 100 nm 내지 약 150 nm, 약 150 nm 내지 약 200 nm, 약 200 nm 내지 약 400 nm, 또는 적어도 약 400 nm 분리된다. 일부 실시양태에서, 2개의 여기 에너지는 약 20 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 80 nm 내지 약 160 nm 분리된다.
여기 에너지가 특정 범위 내에 있는 것으로 지칭되는 경우에, 여기 에너지는 파장이 범위의 종점 사이 또는 범위의 종점에 있는 단일 파장을 포함할 수 있거나, 또는 여기 에너지는 최대 강도가 범위의 종점 사이 또는 범위의 종점에 있는 최대 강도를 갖는 파장의 스펙트럼을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 450 nm 내지 500 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 500 nm 내지 550 nm, 550 nm 내지 600 nm, 600 nm 내지 650 nm, 또는 650 nm 내지 700 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 500 nm 내지 550 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 450 nm 내지 500 nm, 550 nm 내지 600 nm, 600 nm 내지 650 nm, 또는 650 nm 내지 700 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 550 nm 내지 600 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 450 nm 내지 500 nm, 500 nm 내지 550 nm, 600 nm 내지 650 nm, 또는 650 nm 내지 700 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 600 nm 내지 650 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 450 nm 내지 500 nm, 500 nm 내지 550 nm, 550 nm 내지 600 nm, 또는 650 nm 내지 700 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 650 nm 내지 700 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 450 nm 내지 500 nm, 500 nm 내지 550 nm, 550 nm 내지 600 nm, 또는 600 nm 내지 650 nm의 범위 내이다.
특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 450 nm 내지 500 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 500 nm 내지 550 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 450 nm 내지 500 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 550 nm 내지 600 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 450 nm 내지 500 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 600 nm 내지 670 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 500 nm 내지 550 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 550 nm 내지 600 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 500 nm 내지 550 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 600 nm 내지 670 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 550 nm 내지 600 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 600 nm 내지 670 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 470 nm 내지 510 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 510 nm 내지 550 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 470 nm 내지 510 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 550 nm 내지 580 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 470 nm 내지 510 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 580 nm 내지 620 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 470 nm 내지 510 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 620 nm 내지 670 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 510 nm 내지 550 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 550 nm 내지 580 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 510 nm 내지 550 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 580 nm 내지 620 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 510 nm 내지 550 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 620 nm 내지 670 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 550 nm 내지 580 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 580 nm 내지 620 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 550 nm 내지 580 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 620 nm 내지 670 nm의 범위 내이다. 특정 실시양태에서, 제1 여기 에너지는 580 nm 내지 620 nm의 범위 내이고, 제2 여기 에너지는 620 nm 내지 670 nm의 범위 내이다.
표적 체적에 여기 에너지 펄스를 전달하기 위한 여기 에너지원 및 디바이스의 특정 실시양태는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
발광 표지된 뉴클레오티드
한 측면에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 하나 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 데옥시리보스 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 모든 뉴클레오티드는 데옥시리보스 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 리보스 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 모든 뉴클레오티드는 리보스 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 리보스 당 또는 리보스 유사체 (예를 들어, 잠금 핵산)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 자연 발생 염기 (예를 들어, 시토신, 구아닌, 아데닌, 티민, 우라실)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 시토신, 구아닌, 아데닌, 티민 또는 우라실의 유도체 또는 유사체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 방법은 폴리머라제 복합체를 복수의 발광 표지된 뉴클레오티드에 노출시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물 또는 디바이스는 복수의 발광 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 뉴클레오티드는 4종의 유형의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 4종의 유형의 뉴클레오티드 각각은 시토신, 구아닌, 아데닌 및 티민 중 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 4종의 유형의 뉴클레오티드 각각은 시토신, 구아닌, 아데닌 및 우라실 중 하나를 포함한다.
특정 실시양태에서, 반응 혼합물 중 각각의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드의 농도는 약 50 nM 내지 약 200 nM, 약 200 nM 내지 약 500 nM, 약 500 nM 내지 약 1 μM, 약 1μM 내지 약 50 μM, 또는 약 50 μM 내지 250 μM이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중 각각의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드의 농도는 약 250 nM 내지 약 2 μM이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물 중 각각의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드의 농도는 약 1 μM이다.
특정 실시양태에서, 반응 혼합물은 서열분석 반응에 유용한 추가의 시약을 함유한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 1 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, MOPS의 농도는 약 50 mM이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 하나 이상의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염은 아세트산칼륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아세트산칼륨의 농도는 약 140 mM이다. 일부 실시양태에서, 염은 약 1 mM 내지 약 200 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 마그네슘 염 (예를 들면, 마그네슘 아세테이트)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 마그네슘 아세테이트의 농도는 약 20 mM이다. 일부 실시양태에서, 마그네슘 염은 약 1 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 환원제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT)이다. 일부 실시양태에서, 환원제는 약 1 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT의 농도는 약 5 mM이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 하나 이상의 광안정화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 항산화제, 산소 스캐빈저 또는 삼중항 상태 켄처를 포함한다. 일부 실시양태에서, 광안정화제는 프로토카테큐산 (PCA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 광안정화제는 4-니트로벤질 알콜 (NBA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 광안정화제는 약 0.1 mM 내지 약 20 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, PCA의 농도는 약 3 mM이다. 일부 실시양태에서, NBA의 농도는 약 3 mM이다. 광안정화제 (예를 들어, PCA)를 함유하는 혼합물은 또한, 광안정화제를 재생하기 위한 효소 (예를 들어, 프로토카테큐산 디옥시게나제 (PCD))를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PCD의 농도는 약 0.3 mM이다.
본 출원은 복수의 뉴클레오티드 중에서 뉴클레오티드를 차별화하기 위한 상이한 방법을 고려한다. 특정 실시양태에서, 각각의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명을 갖는다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 2종 이상은 동일한 발광 수명 또는 실질적으로 동일한 발광 수명 (예를 들어, 방법 또는 디바이스에 의해 구별될 수 없는 수명)을 갖는다.
특정 실시양태에서, 각각의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 2종은 동일한 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 3종은 동일한 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 4종 이상은 동일한 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 2종은 상이한 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 3종은 상이한 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 4종 이상은 상이한 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다.
특정 실시양태에서, 각각의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 2종은 동일한 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 3종은 동일한 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 4종 이상은 동일한 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 2종은 상이한 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 3종은 상이한 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출한다. 특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 4종 이상은 상이한 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출한다.
특정 실시양태에서, 각각의 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명을 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출하고, 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 각각의 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명을 갖고 제1 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출하고, 제4 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명을 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출하고, 제3 및 제4 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 상이한 발광 수명을 갖고, 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출한다.
특정 실시양태에서, 각각의 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 강도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 강도를 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출하고, 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 각각의 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 강도를 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출하고, 제4 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 강도를 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출하고, 제3 및 제4 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 상이한 발광 강도를 갖고, 제2 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출한다.
특정 실시양태에서, 각각의 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 2종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출하고, 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 각각의 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출하고, 제4 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 흡수 및/또는 방출한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출하고, 제3 및 제4 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖고, 제2 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출한다.
특정 실시양태에서, 2종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명을 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수하고, 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 일부 실시양태에서, 각각의 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명을 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수하고, 제4 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명을 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수하고, 제3 및 제4 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 상이한 발광 수명을 갖고, 제2 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다.
특정 실시양태에서, 2종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수하고, 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 일부 실시양태에서, 각각의 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수하고, 제4 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖고, 제1 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수하고, 제3 및 제4 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖고, 제2 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수한다.
서열분석 동안 뉴클레오티드를 식별하는 방법은 서열 내의 다양한 염기 쌍 사이에서 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, 2종의 유형의 뉴클레오티드는 제1 여기 에너지에서 흡수하도록 표지될 수 있고, 그러한 2종의 유형의 뉴클레오티드 (예를 들어, A, G)는 상이한 발광 강도에 기초하여 구별되는 반면에, 2종의 추가의 유형의 뉴클레오티드 (예를 들어, C, T)는 제2 여기 에너지에서 흡수하도록 표지될 수 있고, 그러한 2종의 추가의 유형의 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명에 기초하여 구별된다. 이러한 실시양태의 경우에, 서열분석 동안 서열의 특정 절편은 오직 발광 강도에 기초해서만 결정될 수 있는 반면에 (예를 들어, 오직 A 및 G만이 혼입된 절편), 서열의 다른 절편은 오직 발광 수명에 기초해서만 결정될 수 있다 (예를 들어, 오직 C 및 T만이 혼입된 절편). 일부 실시양태에서, 2 내지 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 발광 수명에 기초하여 차별화된다. 일부 실시양태에서, 2 내지 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 발광 강도에 기초하여 차별화된다. 일부 실시양태에서, 2 내지 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 발광 수명 및 발광 강도에 기초하여 차별화된다.
도 4는 예시적인 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 수명 4-1 및 동일한 예시적인 뉴클레오티드에 대한 발광 강도 4-2를 제시한다. 예를 들어, 제4 행은 형광단 알렉사 플루오르® 555 (AF555)에 연결된 데옥시티미딘 헥사포스페이트 (dT6P) 뉴클레오티드에 대한 데이터를 제시한다. 이러한 발광 표지된 뉴클레오티드는 수명이 대략 0.25 ns이고, 대략 20000 카운트/s의 발광 강도를 나타낸다. 임의의 발광 표지된 뉴클레오티드의 관측된 발광 수명 및 발광 강도는, 일반적으로 4-1 및 4-2에 대한 것에서와 같이, 혼입 조건 (예를 들어, 단일 분자 복합체에서, 나노개구에서) 대 다른 보다 전형적인 조건 하에서 뉴클레오티드에 대해 상이할 수 있다.
발광 검출
본원에 기재된 방법의 한 측면에서, 방출된 광자 (발광) 또는 복수의 방출된 광자는 1개 이상의 센서에 의해 검출된다. 복수의 발광 표지된 분자 또는 뉴클레오티드의 경우에, 각각의 분자는 단일 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출할 수 있거나, 또는 일부의 분자는 제1 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출할 수 있고 또 다른 일부의 분자는 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방출된 광자는 단일 센서에 의해 검출된다. 특정 실시양태에서, 방출된 광자는 다수의 센서에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 제1 스펙트럼 범위 내에서 방출된 광자는 제1 센서에 의해 검출되고, 제2 스펙트럼 범위 내에서 방출된 광자는 제2 센서에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 복수의 스펙트럼 범위 각각에서 방출된 광자는 상이한 센서에 의해 검출된다.
특정 실시양태에서, 각각의 센서는 여기 에너지와 방출된 광자 사이의 시간 기간에 기초하여 방출된 광자에게 시간 빈을 할당하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 보다 짧은 시간 기간 후에 방출된 광자는 보다 이른 시간 빈에 할당될 것이고, 보다 긴 기간 후에 방출된 광자는 보다 늦은 시간 빈에 할당될 것이다.
일부 실시양태에서, 여기 에너지의 복수의 펄스가 표적 체적 부근으로 전달되고, 광자 방출 이벤트를 포함할 수 있는 복수의 광자가 검출된다. 일부 실시양태에서, 복수의 발광 (예를 들어, 광자 방출 이벤트)은 핵산 생성물 내로의 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입에 상응한다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입은 약 1 ms 내지 약 5 ms, 약 5 ms 내지 약 20 ms, 약 20 ms 내지 약 100 ms, 또는 약 100 ms 내지 약 500 ms 동안 지속된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입 동안 약 10 내지 약 100, 약 100 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 10000, 또는 약 10000 내지 약 100000개의 발광이 검출된다.
특정 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드가 혼입되지 않은 경우에 어떠한 발광도 검출되지 않는다. 일부 실시양태에서, 발광 배경이 존재한다. 일부 실시양태에서, 어떠한 발광 표지된 뉴클레오티드도 혼입되지 않고 있을 때 허위 발광이 검출된다. 이러한 허위 발광은 여기 에너지의 펄스 동안 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드가 표적 체적 내에 있지만 (예를 들어, 표적 체적 내로 확산되거나, 또는 폴리머라제와 상호작용하되 혼입되지 않음), 서열분석 반응에 의해 혼입되지 않고 있는 경우에 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 체적 내의 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 검출되지만 혼입되고 있지 않는 복수의 발광은 발광 표지된 뉴클레오티드로부터의 복수의 발광보다 (예를 들어, 10배, 100배, 1000배, 10000배) 더 적다.
일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입에 상응하는 복수의 검출된 발광 각각에 대해, 발광은 펄스와 방출된 광자 사이의 시간 기간에 기초하여 시간 빈에 할당된다. 이러한 복수의 혼입 이벤트를 본원에서 "버스트"라고 지칭한다. 일부 실시양태에서, 버스트는 기준선 (예를 들어, 잡음 임계 값) 초과의 일련의 신호 (예를 들어, 측정치)를 지칭하며, 여기서 신호는 발광 표지된 뉴클레오티드가 여기 영역 내에 있는 경우에 발생한 복수의 방출 이벤트에 상응한다. 일부 실시양태에서, 버스트는 기준선을 나타내는 신호의 시간 간격에 의해 선행 및/또는 후속 버스트와 분리된다. 일부 실시양태에서, 버스트는 복수의 시간 기간에 기초하여 발광 수명을 결정함으로써 분석된다. 일부 실시양태에서, 버스트는 시간 단위당 검출된 발광의 수에 기초하여 발광 강도를 결정함으로써 분석된다. 일부 실시양태에서, 버스트는 검출된 발광의 스펙트럼 범위를 결정함으로써 분석된다. 일부 실시양태에서, 버스트 데이터를 분석하는 것은 혼입된 발광 표지된 뉴클레오티드의 아이덴티티의 할당을 가능하게 하거나, 또는 복수의 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드의 차별화를 가능하게 할 것이다. 할당 또는 차별화는 발광 수명, 발광 강도, 방출된 광자의 스펙트럼 범위, 또는 그의 임의의 조합 중 어느 하나에 의존할 수 있다.
도 5는 예시적인 주형 핵산의 서열분석을 도시한다. 서열분석 실험을 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 실행하였다: 알렉사 플루오르® 647에 연결된 데옥시아데노신 (A-AF647), 알렉사 플루오르 555에 연결된 데옥시티미딘 (T-AF555), 딜라이트® 554-R1에 연결된 데옥시구아니딘 (G-D554R1), 및 딜라이트® 530-R2에 연결된 데옥시시티딘 (C-D530R2). 뉴클레오티드 A-AF647은 적색 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지에 의해 여기되고, T, G, 및 C 뉴클레오티드는 녹색 스펙트럼 범위 내의 여기에 의해 여기된다. ~200 s의 서열분석 반응에 걸쳐 검출된 광자의 수를 강도 트레이스 5-1에 제시한다. 각각의 스파이크는 검출된 발광의 버스트에 상응하고, 도트로 표시된다. 각각의 버스트는 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입에 상응할 수 있고, 수천개의 검출된 발광을 포함한다. 상이한 여기 펄스를 나타내기 위해 상이한 색상의 트레이스가 사용될 수 있다. 예를 들어, 녹색 여기 펄스에 대해 자주색 트레이스가 사용될 수 있고, 적색 여기 펄스에 대해 청색 트레이스가 사용될 수 있다. 청색 트레이스로부터의 버스트는 뉴클레오티드 A-AF647의 혼입에 할당될 수 있다 (이러한 예에서 적색 발광 분자를 갖는 유일한 뉴클레오티드).
도 5는 강도 대 수명 플롯 5-2를 사용하여 동일한 색상의 버스트 (예를 들어, T, G, 및 C 사이의 자주색 트레이스 내의 버스트)를 차별화하기 위해 원시 데이터를 감소시키는 하나의 방법을 제시한다. 각각의 원형은 자주색 트레이스로부터의 버스트를 나타낸다. 각각의 버스트는 펄스와 각각의 검출된 광자의 방출 사이의 시간 기간에 기초하여 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 수명을 결정하기 위해 분석된다. 추가적으로, 각각의 버스트는 초당 검출된 광자의 수에 기초하여 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 강도를 결정하기 위해 분석된다. 혼입 이벤트는 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각에 상응하는 3개의 그룹으로 클러스터링된다. 플롯의 하부 (파선 아래 플롯 영역)의 어두운 클러스터는 최장 발광 수명 및 최저 발광 강도를 갖는 C-D530R2에 할당된다. 플롯의 하부 (파선 아래 플롯 영역)의 밝은 클러스터는 중간 정도의 수명 및 강도를 갖는 G-D554R1에 할당된다. 그리고 플롯의 상부 (파선 위 플롯 영역)의 밝은 클러스터는 최단 수명 및 최고 강도를 갖는 T-AF555에 할당된다. 도 5는 주형 핵산의 데이터로부터 결정된 서열과 공지된 서열 사이의 정렬 5-3을 제시한다. 수직 막대는 실험적으로 결정된 염기와 표적 서열 사이의 매칭을 나타낸다. 대시는 결정된 서열에서 어떠한 뉴클레오티드도 할당되지 않은 주형 서열에서의 위치, 또는 주형 서열 내 어떠한 위치에도 상응하지 않는 결정된 서열에서의 여분 위치를 나타낸다.
도 6은 주형 핵산의 서열분석을 위한 제2 예를 도시한다. 서열분석 실험을 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 실행하였다: 알렉사 플루오르® 647에 연결된 데옥시아데노신 (A-AF647), 알렉사 플루오르 555에 연결된 데옥시티미딘 (T-AF555), 알렉사 플루오르® 647에 연결된 데옥시구아니딘 (G-AF647), 및 알렉사 플루오르® 546에 연결된 데옥시시티딘 (C-AF546). 뉴클레오티드 A-AF647 및 G-AF647은 적색 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지에 의해 여기되고, T 및 C 뉴클레오티드는 녹색 스펙트럼 범위 내의 여기에 의해 여기된다. 이러한 실험에서, A 및 G는 동일한 발광 마커를 갖고, 구별되지 않는다. 도 6은 강도 트레이스 6-1에서 ~300 s의 서열분석 반응에 걸쳐 검출된 광자의 수를 제시한다. 각각의 스파이크는 검출된 발광의 버스트에 상응하고, 도트로 표시된다. 각각의 버스트는 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입에 상응할 수 있고, 수천개의 검출된 발광을 포함한다. 트레이스는 녹색 여기 펄스에 대해 검출된 발광을 제시한다 (염기 T 및 C에 상응한다).
도 6은 강도 대 수명 플롯 6-2를 사용하여 T 및 C를 차별화하기 위해 원시 데이터를 감소시키는 하나의 방법을 제시한다. 각각의 원형은 강도 트레이스 6-1로부터의 버스트를 나타낸다. 각각의 버스트는 펄스와 각각의 검출된 광자의 방출 사이의 시간 기간에 기초하여 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 수명을 결정하기 위해 분석된다. 추가적으로, 각각의 버스트는 초당 검출된 광자의 수에 기초하여 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 강도를 결정하기 위해 분석된다. 혼입 이벤트는 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각에 상응하는 2개의 그룹으로 클러스터링된다. 플롯의 오른쪽 부분 (파선의 오른쪽 플롯 영역)의 어두운 클러스터는 최장 발광 수명 및 최저 발광 강도를 갖는 C-AF546에 할당된다. 플롯의 오른쪽 부분 (파선의 오른쪽 플롯 영역)의 밝은 클러스터는 최단 수명 및 최고 강도를 갖는 T-AF555에 할당된다. 도 6은 주형 핵산의 데이터로부터 결정된 서열과 공지된 서열 사이의 정렬 6-3을 제시한다. 수직 막대는 실험적으로 결정된 염기와 표적 서열 사이의 매칭을 나타낸다. 대시는 결정된 서열에서 어떠한 뉴클레오티드도 할당되지 않은 주형 서열에서의 위치, 또는 주형 서열 내 어떠한 위치에도 상응하지 않는 결정된 서열에서의 여분 위치를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 서열분석 반응과 관련하여 발광 표지의 분석을 위해, 도 7-9에 제시된 비-제한적 실시양태에 도시된 바와 같이, 서열분석 반응의 1개 이상의 컴포넌트를 제조하여 샘플 웰에서 사용할 수 있다.
발광 표지
용어 발광 태그, 발광 표지 및 발광 마커는 전체에 걸쳐 상호교환가능하게 사용되고, 1개 이상의 발광 분자를 포함하는 분자에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 혼입된 분자는 예를 들어 별개의 발광 표지의 부착이 없는 발광 분자이다. 전형적인 뉴클레오티드 및 아미노산은 발광성이 아니거나, 여기 및 방출 에너지의 적합한 범위 내에서 발광하지 않는다. 특정 실시양태에서, 혼입된 분자는 발광 표지를 포함한다. 특정 실시양태에서, 혼입된 분자는 발광 표지된 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 혼입된 분자는 발광 표지된 아미노산 또는 발광 표지된 tRNA이다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 및 발광 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드, 발광 표지 및 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 형광단이다.
특정 실시양태에서, 발광 표지, 및 임의로 링커는 혼입된 분자에 부착된 채로 남아있다. 특정 실시양태에서, 발광 표지, 및 임의로 링커는 혼입 과정 동안 또는 그 후에 분자로부터 절단된다.
특정 실시양태에서, 발광 표지는 시아닌 염료 또는 그의 유사체이다. 일부 실시양태에서, 시아닌 염료는 하기 화학식을 갖거나:
Figure pct00001
또는 그의 염, 입체이성질체 또는 호변이성질체이고, 여기서
A1 및 A2는 연결되어 임의로 치환된, 방향족 또는 비-방향족, 모노시클릭 또는 폴리시클릭, 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
B1 및 B2는 연결되어 임의로 치환된, 방향족 또는 비-방향족, 모노시클릭 또는 폴리시클릭, 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
각각의 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬이고;
각각의 L1 및 L2는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 L1 및 L2는 연결되어 임의로 치환된, 방향족 또는 비-방향족, 모노시클릭 또는 폴리시클릭, 카르보시클릭 고리를 형성한다.
특정 실시양태에서, 발광 표지는 로다민 염료 또는 그의 유사체이다. 일부 실시양태에서, 로다민 염료는 하기 화학식을 갖거나:
Figure pct00002
또는 그의 염, 입체이성질체 또는 호변이성질체이고, 여기서
각각의 A1 및 A2는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 방향족 또는 비-방향족 헤테로시클릴, 임의로 치환된 방향족 또는 비-방향족 카르보시클릴, 또는 임의로 치환된 카르보닐이거나, 또는 A1 및 A2는 연결되어 임의로 치환된, 방향족 또는 비-방향족, 모노시클릭 또는 폴리시클릭, 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
각각의 B1 및 B2는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된, 방향족 또는 비-방향족 헤테로시클릴, 임의로 치환된, 방향족 또는 비-방향족 카르보시클릴, 또는 임의로 치환된 카르보닐이거나, 또는 B1 및 B2는 연결되어 임의로 치환된, 방향족 또는 비-방향족, 모노시클릭 또는 폴리시클릭, 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
각각의 R2 및 R3은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 아실이고;
R4는 수소, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된, 임의로 치환된 방향족 또는 비-방향족 헤테로시클릴, 임의로 치환된 방향족 또는 비-방향족 카르보시클릴, 또는 임의로 치환된 카르보닐이다.
일부 실시양태에서, R4는 임의로 치환된 페닐이다. 일부 실시양태에서, R4는 임의로 치환된 페닐이며, 여기서 적어도 1개의 치환기는 임의로 치환된 카르보닐이다. 일부 실시양태에서, R4는 임의로 치환된 페닐이며, 여기서 적어도 1개의 치환기는 임의로 치환된 술포닐이다.
전형적으로, 발광 표지는 방향족 또는 헤테로방향족 화합물을 포함하고, 피렌, 안트라센, 나프탈렌, 아크리딘, 스틸벤, 인돌, 벤즈인돌, 옥사졸, 카르바졸, 티아졸, 벤조티아졸, 페난트리딘, 페녹사진, 포르피린, 퀴놀린, 에티듐, 벤즈아미드, 시아닌, 카르보시아닌, 살리실레이트, 안트라닐레이트, 쿠마린, 플루오로세인, 로다민 또는 다른 유사 화합물일 수 있다. 예시적인 염료는 5-카르복시플루오레세인 (FAM), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (JOE), 테트라클로로플루오레세인 (TET), 6-카르복시로다민 (R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA), 6-카르복시-X-로다민 (ROX)을 포함한 크산텐 염료, 예컨대 플루오레세인 또는 로다민 염료를 포함한다. 예시적인 염료는 또한 알파 또는 베타 위치에서 아미노 기를 갖는 나프틸아민 염료를 포함한다. 예를 들어, 나프틸아미노 화합물은 1-디메틸아미노나프틸-5-술포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 술포네이트 및 2-p-톨루이디닐-6-나프탈렌 술포네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산 (EDANS)을 포함한다. 다른 예시적인 염료는 쿠마린, 예컨대 3-페닐-7-이소시아네이토쿠마린; 아크리딘, 예컨대 9-이소티오시아네이토아크리딘 및 아크리딘 오렌지; N-(p-(2-벤족사졸릴)페닐)말레이미드; 시아닌, 예컨대 인도디카르보시아닌 3 (Cy®3), (2Z)-2-[(E)-3-[3-(5-카르복시펜틸)-1,1-디메틸-6,8-디술포벤조[e]인돌-3-윰-2-일]프로프-2-에닐리덴]-3-에틸-1,1-디메틸-8-(트리옥시다닐술파닐)벤조[e]인돌-6-술포네이트 (Cy®3.5), 2-{2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에틸}-16,16,18,18-테트라메틸-6,7,7a,8a,9,10,16,18-옥타히드로벤조[2",3"]인돌리지노[8",7":5"]피라노[3',2':3,4]피리도[1,2-a]인돌-5-윰-14-술포네이트 (Cy®3B), 인도디카르보시아닌 5 (Cy®5), 인도디카르보시아닌 5.5 (Cy®5.5), 3-(-카르복시-펜틸)-3'-에틸-5,5'-디메틸옥사카르보시아닌 (CyA); 1H,5H,11H,15H-크산테노[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']디퀴놀리진-18-윰, 9-[2(또는 4)-[[[6-[2,5-디옥소-1-피롤리디닐)옥시]-6-옥소헥실]아미노]술포닐]-4(또는 2)-술포페닐]-2,3,6,7,12,13,16,17-옥타히드로-내부 염 (TR 또는 텍사스 레드(Texas Red)®); 바디피(BODIPY)® 염료; 벤족사졸; 스틸벤; 피렌; 등을 포함한다.
뉴클레오티드 서열분석을 위해, 발광 표지된 뉴클레오티드의 특정 조합이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각은 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함하고, 제4 발광 표지된 뉴클레오티드는 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함하고, 제3, 및 임의로 제4, 발광 표지된 뉴클레오티드는 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함하고, 제3, 및 임의로 제4, 발광 표지된 뉴클레오티드는 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종의 표지된 뉴클레오티드는 2종 이상의 염료 (예를 들어, 동일한 염료의 2개 이상의 카피 및/또는 2종 이상의 상이한 염료)에 연결된다.
일부 실시양태에서, 적어도 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제1 여기 에너지를 흡수하며, 여기서 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함하고, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 여기 에너지를 흡수하며, 여기서 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함하고, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제1 여기 에너지를 흡수하며, 여기서 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함하고, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함하고, 적어도 2종의 추가의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 여기 에너지를 흡수하며, 여기서 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 시아닌 염료 또는 그의 유사체를 포함하고, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 로다민 염료 또는 그의 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제1 여기 에너지를 흡수하며, 여기서 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 약 1 ns 미만의 발광 수명을 갖고, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 1 ns 초과의 발광 수명을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 여기 에너지를 흡수하며, 여기서 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 약 1 ns 미만의 발광 수명을 갖고, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 1 ns 초과의 발광 수명을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제1 여기 에너지를 흡수하며, 여기서 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 약 1 ns 미만의 발광 수명을 갖고, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 1 ns 초과의 발광 수명을 갖고, 적어도 추가의 2종의 발광 표지된 뉴클레오티드는 제2 여기 에너지를 흡수하며, 여기서 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 약 1 ns 미만의 발광 수명을 갖고, 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 1종은 1 ns 초과의 발광 수명을 갖는다.
특정 실시양태에서, 발광 표지는 표 1로부터 선택된 염료이다. 표 1에 열거된 염료는 비-제한적이고, 본 출원의 발광 표지는 표 1에 열거되지 않은 염료를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 표지는 표 1로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 4종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 표지는 표 1로부터 선택된다.
표 1. 예시적인 형광단.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
염료는 또한 최대 흡광도의 파장 또는 방출된 발광에 기초하여 분류될 수 있다. 표 2는 최대 흡광도의 대략적인 파장에 따라 열로 그룹화한 예시적인 형광단을 제공한다. 표 2에 열거된 염료는 비-제한적이고, 본 출원의 발광 표지는 표 2에 열거되지 않은 염료를 포함할 수 있다. 정확한 최대 흡광도 또는 방출 파장은 표시된 스펙트럼 범위에 상응하지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 표지는 표 2에 열거된 "적색" 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 표지는 표 2에 열거된 "녹색" 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 발광 표지된 뉴클레오티드의 발광 표지는 표 2에 열거된 "황색/오렌지색" 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드의 발광 표지는 모두 표 2에 열거된 "적색", "황색/오렌지색", 또는 "녹색" 그룹 중 하나로부터 선택되도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드의 발광 표지는 3종이 표 2에 열거된 "적색", "황색/오렌지색", 및 "녹색" 그룹의 제1 그룹으로부터 선택되고, 제4가 표 2에 열거된 "적색", "황색/오렌지색", 및 "녹색" 그룹의 제2 그룹으로부터 선택되도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드의 발광 표지는 2종이 표 2에 열거된 "적색", "황색/오렌지색", 및 "녹색" 그룹의 제1로부터 선택되고, 제3 및 제4가 표 2에 열거된 "적색", "황색/오렌지색", 및 "녹색" 그룹의 제2 그룹으로부터 선택되도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 4종의 뉴클레오티드의 발광 표지는 2종이 표 2에 열거된 "적색", "황색/오렌지색", 및 "녹색" 그룹의 제1로부터 선택되고, 제3이 표 2에 열거된 "적색", "황색/오렌지색", 및 "녹색" 그룹의 제2 그룹으로부터 선택되고, 제4가 표 2에 열거된 "적색", "황색/오렌지색", 및 "녹색" 그룹의 제3 그룹으로부터 선택되도록 선택된다.
표 2. 스펙트럼 범위에 의한 예시적인 형광단.
Figure pct00007
Figure pct00008
특정 실시양태에서, 발광 표지는 하기 화학식 (NHS 에스테르 형태)의 (염료 101), (염료 102), (염료 103), (염료 104), (염료 105), 또는 (염료 106) 또는 그의 유사체일 수 있다:
Figure pct00009
Figure pct00010
일부 실시양태에서, 각각의 술포네이트 또는 카르복실레이트는 독립적으로 임의로 양성자화된다. 일부 실시양태에서, 상기 염료는 표시된 부착 지점에서 아미드 결합의 형성에 의해 링커 또는 뉴클레오티드에 부착된다.
특정 실시양태에서, 발광 표지는 제1 및 제2 발색단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 발색단의 여기 상태는 에너지 전달을 통해 제2 발색단으로 완화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 에너지 전달은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)이다. 이러한 FRET 쌍은 표지가 복수의 발광 표지로부터 보다 용이하게 차별화되게 하는 특성을 갖는 발광 표지를 제공하는데 유용할 수 있다. 특정 실시양태에서, FRET 쌍은 제1 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수할 수 있고, 제2 스펙트럼 범위 내에서 발광을 방출할 수 있다.
발광 표지된 분자 (예를 들어, 발광 표지된 뉴클레오티드)의 세트의 경우에, 발광 표지된 FRET 쌍의 특성은 복수의 구별가능한 분자 (예를 들어, 뉴클레오티드)의 선택을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍의 제2 발색단은 복수의 다른 발광 표지된 분자와 별개의 발광 수명을 갖는다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍의 제2 발색단은 복수의 다른 발광 표지된 분자와 별개의 발광 강도를 갖는다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍의 제2 발색단은 복수의 다른 발광 표지된 분자와 별개의 발광 수명 및 발광 강도를 갖는다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍의 제2 발색단은 복수의 다른 발광 표지된 분자와 별개의 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출한다. 일부 실시양태에서, FRET 쌍의 제1 발색단은 복수의 발광 표지된 분자와 별개의 발광 수명을 갖는다. 특정 실시양태에서, FRET 쌍은 복수의 다른 발광 표지된 분자와 별개의 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수할 수 있다. 특정 실시양태에서, FRET 쌍은 복수의 다른 발광 표지된 분자 중 1종 이상과 동일한 스펙트럼 범위 내의 여기 에너지를 흡수할 수 있다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 뉴클레오티드는 발광 표지에 연결될 수 있고, 여기서 뉴클레오티드는 발광 표지 상의 별개의 위치에 연결된다. 비제한적 예는 뉴클레오티드 유사체 상의 반응성 모이어티와 상용성인 2종의 독립적인 반응성 화학적 모이어티 (예를 들어, 아지도 기, 아세틸렌 기, 카르복실 기, 아미노 기)를 함유하는 발광 분자를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 발광 표지는 독립적 연결을 통해 2종의 뉴클레오티드 분자에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 2개 이상의 뉴클레오티드에 대해 2개 이상의 독립적 연결을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 뉴클레오티드는 링커 (예를 들어, 분지형 링커 또는 뉴클레오티드 및/또는 염료가 부착될 수 있는 2개 이상의 반응성 부위를 갖는 링커)를 통해 발광 염료에 연결될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 2개 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 동일한 유형)는 2개 이상의 염료 (예를 들어, 동일한 유형)에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 특성을 갖는 양자점을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 뉴클레오티드는 양자점에 연결된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 뉴클레오티드는 단백질의 별개의 부위에의 연결을 통해 양자점에 연결된다. 일부 실시양태에서, 양자점의 표면은 뉴클레오티드 분자로 코팅된다. 특정 실시양태에서, 양자점은 (예를 들어, 각각의 컴포넌트 상의 반응성 모이어티를 통해) 1개 이상의 뉴클레오티드에 공유 연결된다. 특정 실시양태에서, 양자점은 (예를 들어, 각각의 컴포넌트 상의 상용성 비-공유 결합 파트너를 통해) 1개 이상의 뉴클레오티드에 비-공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 양자점의 표면은 1개 이상의 비오티닐화된 뉴클레오티드와 비-공유 결합된 1개 이상의 스트렙타비딘 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 특성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 뉴클레오티드는 발광 단백질에 연결된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 뉴클레오티드는 단백질의 별개의 부위에의 연결을 통해 발광 단백질에 연결된다. 특정 실시양태에서, 4개의 뉴클레오티드의 발광 표지는 1개의 뉴클레오티드가 형광 단백질로 표지되고 나머지 3개의 뉴클레오티드가 형광 염료 (예를 들어, 표 1 및 2에서의 비제한적 예)로 표지되도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 4개의 뉴클레오티드의 발광 표지는 2개의 뉴클레오티드가 형광 단백질로 표지되고 나머지 2개의 뉴클레오티드가 형광 염료 (예를 들어, 표 1 및 2에서의 비제한적 예)로 표지되도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 4개의 뉴클레오티드의 발광 표지는 3개의 뉴클레오티드가 형광 단백질로 표지되고 나머지 뉴클레오티드가 형광 염료 (예를 들어, 표 1 및 2에서의 비제한적 예)로 표지되도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 4개의 뉴클레오티드의 발광 표지는 모든 4개의 뉴클레오티드가 형광 단백질로 표지되도록 선택된다.
본 출원의 일부 측면에 따르면, 발광 표지 (예를 들어 염료, 예를 들어 형광단)는 여기 광에 노출되는 서열분석 반응에서 폴리머라제를 손상시킬 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 손상은 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입 동안, 발광 분자가 폴리머라제 효소에 매우 근접하여 유지될 때 발생한다. 손상 반응의 비제한적 예는 폴리머라제와 발광 분자 사이의 공유 결합의 형성 및 발광 분자로부터 효소로의 방사성 또는 비-방사성 붕괴의 방출을 포함한다. 이는 폴리머라제의 유효성을 단축시키고 서열분석 실행의 길이를 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 및 발광 표지는 표지된 뉴클레오티드의 혼입 동안 폴리머라제로부터 발광 표지가 떨어져 있게 하는 상대적으로 긴 링커 또는 링커 구성에 의해 연결된다. 용어 "링커 구성"은 발광 분자(들)를 뉴클레오티드(들)에 연결시키는 전체 구조를 지칭하는 것으로 본원에 사용되고, 발광 분자(들) 또는 뉴클레오티드(들)를 포괄하지 않는다.
일부 실시양태에서, 단일 링커는 발광 분자를 뉴클레오티드에 연결한다. 일부 실시양태에서, 링커는 2개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과)의 뉴클레오티드가 각각의 발광 분자에 연결되거나, 2개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과)의 발광 분자가 각각의 뉴클레오티드에 연결되거나, 또는 2개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과)의 뉴클레오티드가 2개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과)의 발광 분자에 연결되도록 1개 이상의 분기점을 함유한다.
일부 실시양태에서, 링커 구성은 발광 표지와 뉴클레오티드 사이의 거리를 결정한다. 일부 실시양태에서, 거리는 약 1 nm 또는 2 nm 내지 약 20 nm이다. 예를 들어, 2 nm 초과, 5 nm 초과, 5-10 nm, 10 nm 초과, 10-15 nm, 15 nm 초과, 15-20 nm, 20 nm 초과. 그러나, 뉴클레오티드가 효소의 활성 부위 내에서 유지될 때 발광 표지는 여기될 조명 체적 내에 있을 것이 필요하기 때문에 발광 표지와 뉴클레오티드 사이의 거리는 너무 길 수 없다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전체적 링커 길이는 30 nm 미만, 25 nm 미만, 약 20 nm, 또는 20 nm 미만이다.
일부 실시양태에서, 링커 구성 내에 보호 분자가 포함된다. 보호 분자는 효소와 발광 표지 사이에 발생할 수 있는 손상 반응으로부터 폴리머라제를 보호할 수 있는 단백질, 단백질 동종이량체, 단백질 이종이량체, 단백질 올리고머, 중합체 또는 다른 분자일 수 있다. 보호 분자의 비제한적 예는 단백질 (예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 트랩타비딘, 뉴트라비딘, 유비퀴틴), 단백질 복합체 (예를 들어, 트립신:BPTI, 바르나제:바르스타, 콜리신 E9 뉴클레아제:Im9 면역 단백질), 핵산 (예를 들어, 데옥시리보핵산, 리보핵산), 폴리사카라이드, 지질, 및 탄소 나노튜브를 포함한다.
일부 실시양태에서, 보호 분자는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 올리고뉴클레오티드, RNA 올리고뉴클레오티드, 또는 그의 변이체)이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥이다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 한 말단 (예를 들어, 5' 말단 또는 3' 말단)에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되고, 1개 이상의 뉴클레오티드는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 다른 말단 (예를 들어, 3' 말단 또는 5' 말단)에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 예를 들어, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 부착된 발광 표지 및 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 부착된 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 이중-가닥이다 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 2개의 어닐링된, 상보적 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함한다). 일부 실시양태에서, 발광 표지는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 한 말단에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되고, 1개 이상의 뉴클레오티드는 이중-가닥 뉴클레오티드의 다른 말단에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 한 가닥에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되고, 1개 이상의 뉴클레오티드는 이중-가닥 뉴클레오티드의 다른 가닥에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 예를 들어, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 하나의 가닥의 5' 말단에 부착된 발광 표지 및 다른 가닥의 5' 말단에 부착된 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 보호 분자는 1개 이상의 발광 분자 및 1개 이상의 뉴클레오티드 분자에 연결된다. 일부 실시양태에서, 발광 분자(들)는 뉴클레오티드(들)에 인접하지 않는다. 예를 들어, 1개 이상의 발광 분자는 보호 분자의 제1 측면에 연결될 수 있고, 1개 이상의 뉴클레오티드는 보호 분자의 제2 측면에 연결될 수 있으며, 여기서 보호 분자의 제1 및 제2 측면은 서로 떨어져 있다. 일부 실시양태에서, 이들은 보호 분자의 대략 반대 측면에 존재한다.
보호 분자가 발광 표지에 연결된 지점 및 보호 분자가 뉴클레오티드에 연결된 지점 사이의 거리는 공간을 통한 선형 측정치 또는 보호 분자의 표면을 가로지른 비-선형 측정치일 수 있다. 보호 분자 상의 발광 표지 및 뉴클레오티드 연결 지점 사이의 거리는 보호 분자의 3차원 구조를 모델링함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 거리는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 nm 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로, 보호 분자 상의 발광 표지 및 뉴클레오티드의 상대적 위치는 보호 분자의 구조를 2차 표면 (예를 들어, 타원체, 타원형 원주)으로 취급함으로써 기재될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 표지 및 뉴클레오티드는 보호 분자를 나타내는 타원 형상 둘레의 거리의 적어도 1/8인 거리만큼 분리된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지 및 뉴클레오티드는 보호 분자를 나타내는 타원 형상 둘레의 거리의 적어도 1/4인 거리만큼 분리된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지 및 뉴클레오티드는 보호 분자를 나타내는 타원 형상 둘레의 거리의 적어도 1/3인 거리만큼 분리된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지 및 뉴클레오티드는 보호 분자를 나타내는 타원 형상 둘레의 거리의 1/2인 거리만큼 분리된다.
도 10은 보호 분자(100)에 의해 뉴클레오티드(250)로부터 분리된 발광 분자(200)의 비제한적 예 10-1을 예시한다. 발광 분자(200)는 링커(300)를 통해 보호 분자(100)에 연결되며, 여기서 링커(300)는 보호 분자(100)에 부착된다. 뉴클레오티드(250)는 링커(350)를 통해 보호 분자(100)에 연결되며, 여기서 링커(350)는 보호 분자(100)에 부착된다. 보호 분자는 발광 표지가 폴리머라제에 점점 가까워지는 것을 방지하는 입체 장벽을 제공하는데 유용할 수 있다. 보호 분자는 발광 분자에 의해 방출되는 방사성 및 비-방사성 붕괴를 흡수하거나, 또는 그로부터 폴리머라제를 보호하는데 유용할 수 있다. 보호 분자는 발광 표지와 폴리머라제 사이에 입체 장벽 및 붕괴 장벽 둘 다를 제공하는데 유용할 수 있다.
보호 분자의 크기는 뉴클레오티드가 효소의 활성 부위 내에서 유지될 때 발광 표지가 폴리머라제와 직접적으로 접촉할 수 없거나 그러할 가능성이 없도록 하는 크기이어야 한다. 보호 분자의 크기는 또한 뉴클레오티드가 효소의 활성 부위 내에서 유지될 때 부착된 발광 표지가 여기될 조명 체적 내에 있도록 하는 크기이어야 한다. 보호 분자의 크기는 발광 표지를 보호 분자에 연결하기 위해 선택된 링커 및 뉴클레오티드를 보호 분자에 연결하기 위해 선택된 링커를 고려하여 선택되어야 한다. 발광 표지 및 뉴클레오티드 (예를 들어, 뉴클레오시드 폴리포스페이트)를 연결하는데 사용되는 보호 분자 및 링커는 링커 구성을 포함하며, 여기서 링커 구성의 크기는 뉴클레오티드가 효소의 활성 부위 내에서 유지될 때 발광 표지가 폴리머라제와 직접적으로 접촉할 수 없도록 하는 크기이어야 한다.
보호 분자 (및/또는 보호 분자를 포함하는 링커 구성)는 바람직하게는 수용성이다. 일부 실시양태에서, 보호 분자 (및/또는 보호 분자를 포함하는 링커 구성)는 알짜 음전하를 갖는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 표지 (예를 들어, 발광 분자)는 표지를 뉴클레오티드에 연결하는 1개 이상의 비-공유 연결로 인해 뉴클레오티드에 공유 연결되지 않는다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 링커는 보호 분자 및/또는 발광 분자(들)에 비-공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 링커는 보호 분자 및/또는 뉴클레오티드에 비-공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 링커에 공유 부착되며, 여기서 링커는 (예를 들어, 1개 이상의 결합 파트너를 통해) 보호 분자에 비-공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 링커에 공유 부착되며, 여기서 링커는 (예를 들어, 1개 이상의 결합 파트너를 통해) 보호 분자에 비-공유 부착된다.
도 10-15는 보호 분자를 통해 연결된 1개 이상의 발광 분자 및 1개 이상의 뉴클레오티드의 비제한적 예를 예시하며, 여기서 1개 이상의 발광 분자 및 1개 이상의 뉴클레오티드는 보호 분자에 비-공유 부착된다.
도 10은 10-1의 요소를 포함하는 비제한적 예 10-2를 예시하며, 여기서 링커는 발광 분자를 보호 분자의 비-공유 결합 부위(110) (음영 형상)에 비-공유 부착시키는 비-공유 결합 리간드(400)를 포함하고, 제2 링커는 뉴클레오티드를 보호 분자의 제2 비-공유 결합 부위(120)에 비-공유 부착시키는 비-공유 결합 리간드(450)를 포함한다.
도 10은 10-2의 요소를 포함하는 비제한적 예 10-3을 예시하며, 여기서 보호 분자는 4개의 독립적인 비-공유 결합 부위 (음영 형상)를 포함한다. 제2 독립적 발광 분자는 비-공유 결합 리간드(401)를 통해 보호 분자의 비-공유 결합 부위(111)에 비-공유 부착될 수 있다. 제2 독립적 뉴클레오티드 분자는 비-공유 결합 리간드(451)를 통해 보호 분자의 비-공유 결합 부위(121)에 비-공유 부착될 수 있다. 보호 분자의 4개의 독립적인 비-공유 결합 부위에 비-공유 결합된 2개의 독립적인 발광 분자 및 2개의 독립적인 뉴클레오티드를 도시한 이러한 실시양태에서, 발광 분자 및 뉴클레오티드의 수는 임의적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 보호 분자의 4개의 독립적인 비-공유 결합 부위는 1개의 부위에 1개의 발광 분자 및 나머지 3개의 부위의 각각에 1개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보호 분자의 4개의 독립적인 비-공유 결합 부위는 1개의 부위에 1개의 뉴클레오티드 및 나머지 3개의 부위의 각각에 1개의 발광 분자를 포함한다.
도 10은 10-3의 요소를 포함하는 비제한적 예 10-4를 예시하며, 여기서 링커(301)는 보호 분자의 2개의 독립적인 비-공유 결합 부위 (음영 형상)를 통해 단일 발광 분자를 비-공유 부착시키는 2개의 독립적인 비-공유 결합 리간드(400, 401)를 포함하고, 링커(351)는 보호 분자의 나머지 2개의 독립적인 비-공유 결합 부위를 통해 단일 뉴클레오티드를 비-공유 부착시키는 2개의 독립적인 비-공유 결합 리간드(450, 451)를 포함한다.
도 11은 10-4의 요소를 포함하는 비제한적 예 11-1을 예시하며, 여기서 링커(301)는 2개의 발광 분자의 부착을 허용하는 분기점(302)을 포함한다.
도 11은 11-1의 요소를 포함하는 비제한적 예 11-2를 예시하며, 여기서 링커(351)는 2개의 뉴클레오티드의 부착을 허용하는 분기점(352)을 포함한다.
도 11은 11-2의 요소를 포함하는 비제한적 예 11-3을 예시하며, 여기서 링커(302)는 4개의 발광 분자의 부착을 허용하는 2개의 추가의 분기점(304)을 포함하고, 링커(352)는 4개의 뉴클레오티드의 부착을 허용하는 2개의 추가의 분기점(354)을 포함한다.
도 11은 11-3의 요소를 포함하는 비제한적 예 11-4를 예시하며, 여기서 (304)에 도시된 각각의 분기점은 총 6개의 발광 분자를 위한 추가의 발광 분자의 부착을 허용하는 추가의 부착 모이어티를 포함하고, (354)에 도시된 각각의 분기점은 총 6개의 뉴클레오티드를 위한 추가의 뉴클레오티드의 부착을 허용하는 추가의 부착 모이어티를 포함한다.
도 12는 서열분석 반응에 사용될 수 있는 표지된 뉴클레오티드 분자의 세트의 비제한적 예를 예시한다: 티민 12-1, 아데닌 12-2, 시토신 12-3, 및 구아닌 12-4. 이러한 실시양태에서, 4개의 비-공유 결합 부위를 포함하는 보호 분자는 6개의 동일한 유형의 뉴클레오티드를 1개 이상의 발광 분자에 연결시키는데 사용된다. 이러한 실시양태에서, 6개의 동일한 유형의 뉴클레오티드는 2개의 개별 링커를 통해 보호 분자에 부착되고, 각각의 링커는 3개의 동일한 유형의 뉴클레오티드에 공유 연결된 독립적인 비-공유 결합 리간드를 포함한다. 12-1, 12-2, 및 12-3에 도시된 바와 같이, 단일 발광 분자는 보호 분자의 2개의 독립적인 결합 부위에 비-공유 부착된 2개의 독립적인 비-공유 결합 리간드를 포함하는 링커를 통해 보호 분자에 비-공유 부착된다. 12-4에 도시된 바와 같이, 발광 링커 내 분기점은 제2 발광 분자의 부가를 허용한다.
4종의 예시적인 뉴클레오티드를 포함하는 서열분석 실험에서, 12-1, 12-2, 및 12-3의 발광 표지는 3개의 고유한 발광 분자 (예를 들어, 3개의 상이한 형광단)를 포함할 수 있다. 이들 예시적인 분자 각각은 오직 단일 형광단만을 함유하기 때문에, 티민, 아데닌, 또는 시토신 혼입을 구별하는데 사용되는 특성 (예를 들어, 발광 수명, 발광 강도, 방출 파장)은 고유한 형광단을 사용하지 않을 경우에 매우 유사하거나 구별불가능할 것이다. 구아닌 12-4는 2개의 발광 분자에 연결된다. 일부 실시양태에서, 12-4의 발광 표지는 2개의 동일한 발광 분자를 포함할 수 있으며, 여기서 선택된 분자는 12-1, 12-2, 및 12-3에 사용된 형광단과 상이하다. 4개의 고유한 형광단에 연결된 4개의 고유한 뉴클레오티드를 포함하는 서열분석 반응에서, 각각의 형광단은 각 하나를 복수의 것과 구별가능하게 하는 하나 이상의 고유한 발광 특성 (예를 들어, 발광 수명, 강도, 방출 파장, 또는 그의 2 이상의 조합)을 가져야 한다. 일부 실시양태에서, 12-4의 2개의 형광단은 2개의 동일한 형광단을 포함할 수 있으며, 여기서 선택된 형광단은 12-1, 12-2, 및 12-3의 형광단 중 1개와 동일하다. 상이한 수의 동일한 발광 분자에 연결된 고유한 뉴클레오티드를 포함하는 서열분석 반응에서, 상이한 수의 형광단은 하나의 뉴클레오티드를 복수의 것과 구별가능하게 하는 고유한 특성 (예를 들어, 증가된 발광 강도)을 부여하여야 한다. 12-4의 2개의 형광단은 대안적으로 FRET 쌍을 포함할 수 있다.
도 12는 서열분석 실험의 비제한적 예 및 고유한 발광 특성이 복수의 발광 표지된 뉴클레오티드를 구별하는데 어떻게 사용될 수 있는지 추가로 예시한다 12-5. 각각의 염기 (티민, 아데닌, 시토신, 구아닌)에 연결된 발광 표지는 각각의 표지된 뉴클레오티드가 복수의 표지된 뉴클레오티드와 구별가능하게 하는 발광 특성 (예를 들어, 발광 수명, 발광 강도, 및/또는 방출 파장)을 갖는다. 동일한 유형의 다수의 뉴클레오티드를 포함시키는 것은 서열분석 반응에서 혼입 속도를 가속시키는 기능을 한다.
발광 표지된 뉴클레오티드를 사용한 서열분석 실험 12-5는 예시적인 반응 용기 12-6에서 수행될 수 있다. 반응은 도파관 상부의 챔버에서 일어나고, 도파관은 여기 에너지에 대한 도관으로서 역할하여, 도파관으로부터 에바네센트 파에 의해 반응 챔버의 저부 내의 샘플로 여기 에너지를 전달한다. 개구는 도파관으로부터 벌크 샘플로 방사되는 광 및 주변광 및/또는 미광을 센서로부터 차단할 뿐만 아니라, 반응 챔버에 대한 제작 경로를 제공한다. 반응 챔버는 샘플을 저부 위 및 도파관의 에바네센트 파로부터 높은 여기 영역 내에 두는 에칭 구조이다. 선택적 표면 화학은 샘플이 반응 챔버의 저부에 선택적으로 국재화될 수 있도록 상이한 조성을 갖는 반응 챔버의 저부 및 측벽을 제공하기 위해 사용된다. 표면 제조를 위한 예시적인 작업흐름이 도 7에 제시되며, 이는 특히, 선택적 표면 화학을 달성하는 것과 관련된 공정을 포함하는 공정을 도시한다. 예를 들어, 표면의 패시베이션 (예를 들어, 도 8에 제시된 비제한적 실시양태에 도시된 바와 같음)은 표면의 관능화 (예를 들어, 도 9에 제시된 비제한적 실시양태에 도시된 바와 같음) 동안 유용할 선택적 표면 기판을 제공할 수 있다.
특정 뉴클레오티드의 혼입은 예시적인 작업흐름당 서열분석 반응 동안 4종의 발광 표지된 뉴클레오티드 사이에서 구별될 수 있다 12-7. 실험 과정 전반에, 2개의 별개의 기간: 펄스 기간 및 검출 기간이 존재한다. 20 피코초 동안 지속되는 펄스 기간 동안, 어떠한 방출 광도 수집되지 않는다. 펄스 기간 다음은 10 나노초 동안 지속되는 검출 기간이고, 여기서 4개의 시간 빈은 검출 기간의 경과에 따라 발생하는 방출 이벤트를 포획한다 (i). 펄스 및 검출 기간은 1개의 사이클을 구성한다. 방출 이벤트는 연속적으로 비닝되고, 1백만개의 사이클 과정의 경과에 따라 축적된다 (ii). 시간 빈에 걸친 방출 이벤트의 전반적 분포는 발광 수명을 나타내고, 이는 특정한 세트의 데이터를 공지된 수명 분포와 매칭시키는데 사용될 수 있다 (iii). 일부 실시양태에서, 방출 이벤트의 분포 (예를 들어, 발광 수명)는 1종의 발광 표지된 염기를 복수의 다른 표지된 분자와 구별하지 못한다. 방출 이벤트의 분포에 더하여, 방출 이벤트의 양 (예를 들어, 발광 강도)이 단일 분자를 복수의 다른 것들로부터 식별하는데 사용될 수 있다.
도 13은 10-4의 요소를 포함하는 비제한적 예 13-1을 예시하며, 여기서 보호 분자의 비-공유 결합 부위는 비-기능적 결합 부위(461)로 조작된다. 일부 실시양태에서, 13-1의 보호 분자는 스트렙타비딘을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 부위는 비오틴 분자에 비-공유 결합하지 못함으로 인해 비-기능성이다. 비제한적 실시양태 13-1은 2개의 독립적인 비-공유 결합 상호작용을 통해 보호 분자에 부착된 단일 발광 분자 및 단일의 비-공유 결합 상호작용을 통해 보호 분자에 부착된 6개의 뉴클레오티드를 도시한다. 일부 실시양태에서, 3개의 기능적 비-공유 결합 부위를 갖는 보호 분자는 단일의 비-공유 상호작용을 통해 부착된 하나 이상의 발광 분자 및 2개의 독립적인 비-공유 상호작용을 통해 부착된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 3개의 기능적 비-공유 결합 부위를 갖는 보호 분자는 2개의 독립적인 비-공유 상호작용을 통해 부착된 하나 이상의 발광 분자 및 단일의 비-공유 상호작용을 통해 부착된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
도 13은 10-3의 요소를 포함하는 비제한적 예 13-2를 예시하며, 여기서 보호 분자의 2개의 비-공유 결합 부위는 비-기능적 결합 부위(411, 461)로 조작된다. 일부 실시양태에서, 13-2의 보호 분자는 스트렙타비딘을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 부위는 비오틴 분자에 비-공유 결합하지 못함으로 인해 비-기능성이다. 비제한적 실시양태 13-2는 단일의 독립적인 비-공유 결합 상호작용을 통해 보호 분자에 부착된 단일 발광 분자 및 단일의 비-공유 결합 상호작용을 통해 보호 분자에 부착된 6개의 뉴클레오티드를 도시한다. 일부 실시양태에서, 2개의 기능적 비-공유 결합 부위를 갖는 보호 분자는 단일의 비-공유 상호작용을 통해 부착된 하나 이상의 발광 분자 및 단일의 비-공유 상호작용을 통해 부착된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 비-기능적 비-공유 결합 부위는 시스 결합 부위 또는 트랜스 결합 부위이고, 여기서 "시스 결합 부위"는 "트랜스 결합 부위"보다 더 가까이 근접해서 존재하는 것으로 정의된다. 도 13은 2개의 비-기능적 트랜스 결합 부위를 갖는 스트렙타비딘 분자의 생성의 비제한적 예 13-3을 추가로 도시한다.
일부 실시양태에서, 링커는 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 도 14는 발광 분자 및 뉴클레오티드가 보호 분자를 통해 연결된 비제한적인 예시적 반응식을 예시하며, 여기서 보호 분자에 발광 분자 및 뉴클레오티드를 부착시키는 링커는 2가 링커를 통해 부착된 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, DNA, RNA, PNA 또는 그의 변형된 형태를 포함하는 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드로 구성된 2가 링커(360)는 보호 분자의 2개의 독립적인 비-공유 결합 부위에 비-공유 결합된다 (a). 링커(360)에 상보적인 올리고뉴클레오티드에 융합된 발광 분자(201)를 도입하여 발광 표지된 보호 분자를 생성한다 (b). 올리고뉴클레오티드로 구성된 제2 2가 링커(361)를 도입하여 (c)를 형성한다. 링커(361)에 상보적인 올리고뉴클레오티드에 융합된 뉴클레오티드(251)를 도입하여 최종 생성물을 생성한다 (d).
도 15는 발광 분자가 어닐링된 상보적 올리고뉴클레오티드를 통해 보호 분자에 부착된 비제한적인 예시적 반응식을 예시하며, 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드 가닥은 보호 분자 상의 결합 부위와 상용성인 하나의 비-공유 결합 리간드를 함유한다. 발광 분자에 융합된 제1 올리고뉴클레오티드(362) 및 비-공유 결합 리간드는 비-공유 결합 리간드에 융합된 상보적 올리고뉴클레오티드(363)로 어닐링된다 (i). 어닐링된 생성물(364)은 보호 분자에 결합되고 (ii) 정제된다. 정제된 발광 표지된 보호 분자를 본원에 개시된 임의의 기술 또는 구성을 사용하여 뉴클레오티드와 결합시킨다 (iii). 도 15는 또한 반응식의 비제한적 예와 유사한 듀플렉스 DNA 링커를 사용하여 Cy®3 염료로 표지된 뉴클레오티드를 사용하여 수행된 예시적인 서열분석 실험을 도시한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 보호 분자 및/또는 발광 분자(들)에 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 보호 분자 및/또는 뉴클레오티드(들)에 공유 부착된다.
도 16-20은 보호 분자를 통해 연결된 발광 분자 및 뉴클레오티드의 비제한적 예를 예시하며, 여기서 발광 분자 및 뉴클레오티드는 보호 분자에 공유 부착된다.
도 16은 일반적 보호 분자 (음영 형상)를 생성하기 위한 반응식 16-1을 도시하며, 여기서 보호 분자는 2개의 유전자-코딩된 태그를 포함한다. 유전자-코딩된 태그(325)는 발광 분자에 융합된 특정 반응성 기에 공유 부착을 형성하기 위해 설계되고 (i), 분리된 유전자-코딩된 태그(375)는 뉴클레오티드에 융합된 특정 반응성 기에 공유 부착을 형성하여 (ii) 최종 생성물 (c)을 형성하기 위해 설계된다. 도 16은 유전자-코딩된 태그 (곡선)를 통한 생물직교 관능기 (별 형상) 예컨대 아지드, 알데히드 또는 알킨을 포함하는 일반적 기질의 공유 부착에 대한 반응식 16-2의 비제한적 실시양태를, 유전자-코딩된 태그 및 동역학적 속도 상수의 비제한적 예 16-3과 함께 추가로 도시한다.
도 17은 일반적 보호 분자 (음영 형상)를 생성하기 위한 반응식 17-1의 비제한적 예를 도시하며, 여기서 보호 분자는 N-말단에 반응성 기 및 C-말단에 반응성 기를 포함하는 단백질이다. 단백질(326)의 제1 말단에서의 제1 반응성 기는 발광 분자에 융합된 특정 반응성 기에 공유 부착을 형성하기 위해 설계된다. 단백질(376)의 나머지 말단의 제2 반응성 기는 뉴클레오티드에 융합된 특정 반응성 기에 공유 부착을 형성하기 위해 설계된다. 반응성 N-말단 및 C-말단 기 및 상응하는 반응성 기의 비제한적 예 17-2가 추가로 도시된다.
도 18은 일반적 보호 분자 (음영 형상)를 생성하기 위한 반응식 18-1의 비제한적 예를 도시하며, 여기서 보호 분자는 단백질의 한 부분에 반응성 비천연 아미노산 및 단백질의 또 다른 부분에 반응성 비천연 아미노산을 포함하는 단백질이다. 단백질(327)의 제1 부분에서의 제1 반응성 비천연 아미노산은 발광 분자에 융합된 특정 반응성 기에 공유 부착을 형성하기 위해 설계된다. 단백질(377)의 제2 부분에서의 제2 반응성 비천연 아미노산은 뉴클레오티드에 융합된 특정 반응성 기에 공유 부착을 형성하기 위해 설계된다. 도 18은 표적 단백질의 화학적 표지를 위한 일반적 및 비제한적 반응식 18-2를 추가로 도시한다. 이러한 예에서, 고유한 생물직교 관능기를 보유하는 비천연 아미노산 (예를 들어, 비제한적 예 18-3으로부터 선택된 비천연 아미노산)은 유전자 코드 연장을 통해 단백질에 부위-특이적으로 도입되고, 이어서 외부적으로 부가된 프로브에 의해 화학선택적으로 표지된다.
도 19a는 비-단백질 보호 분자(101)에 의해 분리된 발광 분자 및 뉴클레오티드의 비제한적 예이다. 비-단백질 보호 분자의 비제한적 예는 핵산 분자 (데옥시리보핵산, 리보핵산), 지질, 및 탄소 나노튜브를 포함할 수 있다. 제시된 바와 같이, 발광 분자 및 뉴클레오티드는 비-단백질 보호 분자에 직접 부착된다 (예를 들어, 공유 부착된다). 일부 실시양태에서, 발광 분자 및 뉴클레오티드는 비-단백질 보호 분자의 인접 부분에 직접 부착된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 비-단백질 보호 분자는 핵산 분자이고, 발광 분자 및/또는 뉴클레오티드는 핵산 분자의 뉴클레오티드에 직접 결합한다. 일부 실시양태에서, 발광 분자 및/또는 뉴클레오티드는 비-단백질 보호 분자의 인접 부분이 아닌, 링커를 통해 비-단백질 보호 분자에 부착된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 비-단백질 보호 분자는 핵산 분자이고, 발광 분자 및/또는 뉴클레오티드는 링커를 통해 핵산에 부착된다.
일부 실시양태에서, 도 19b에 도시된 바와 같이, 발광 분자 및 뉴클레오티드는 반응성 모이어티를 통해 비-단백질 보호 분자에 부착될 수 있다. 이러한 예에서, 발광 분자 상의 반응성 모이어티(550)는 비-단백질 보호 분자 상의 상응하는 반응성 모이어티(500)를 통해 비-단백질 보호 분자에 공유 부착된다. 뉴클레오티드 상의 반응성 모이어티(551)는 비-단백질 보호 분자 상의 상응하는 반응성 모이어티(501)를 통해 비-단백질 보호 분자(101)에 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 반응성 모이어티(500) 및/또는 반응성 모이어티(501)는 비-단백질 보호 분자의 인접 부분에 직접 부착된다. 일부 실시양태에서, 반응성 모이어티(500) 및/또는 반응성 모이어티(501)는 비-단백질 보호 분자의 인접 부분이 아닌, 링커를 통해 비-단백질 보호 분자에 부착된다.
일부 실시양태에서, 보호 분자는 단백질-단백질 쌍으로 구성된다. 단백질-단백질 쌍은 임의의 세트의 폴리펩티드 결합 파트너 (예를 들어, 단백질-수용체, 효소-억제제, 항체-항원)를 포함할 수 있다. 도 20은 단백질-단백질 결합 쌍으로 구성된 보호 분자의 비제한적 실시양태를 도시한다. 이러한 비제한적 예에서, 결합 쌍의 하나의 폴리펩티드(102)는 발광 분자에 의해 직교 표지되고, 제2 폴리펩티드(103)는 뉴클레오티드에 직교 연결된다. 단백질-단백질 결합 쌍의 비제한적 예는 트립신-BPTI, 바르나제-바르스타, 및 콜리신 E9 뉴클레아제-Im9 면역 단백질을 포함한다.
도 21은 비-공유 결합 리간드에 부착된 하나 이상의 발광 분자를 포함하는 링커 구성의 비제한적 예를 도시한다. 한 실시양태 21-1에서, 비-공유 결합 리간드(410), 스페이서 링커(310), 및 반응성 모이어티(510)를 포함하는 제1 링커 층은 상용성 반응성 모이어티(211)를 포함하는 발광 분자(210)에 부착된다. 제1 링커 층의 반응성 모이어티는 상용성 반응성 모이어티를 통해 발광 분자 또는 뉴클레오티드에 직접 부착시키는데 사용될 수 있다. 제1 링커 층의 반응성 모이어티는 상용성 반응성 모이어티를 통해 제2 링커 층에 부착시키는데 사용될 수 있다. 한 실시양태 21-2에서, 2개의 발광 분자는 제2 링커 층을 통해 제1 링커 층에 부착되며, 여기서 제2 링커 층은 제1 층의 반응성 모이어티와 상용성인 반응성 모이어티, 분기점(312)을 포함하는 스페이서 링커, 및 발광 분자의 반응성 모이어티와 상용성인 2개의 반응성 모이어티(522)를 포함한다. 제2 링커 층의 2개의 반응성 모이어티는 발광 또는 뉴클레오티드 분자에 직접 부착시키는데 사용될 수 있다. 제2 링커 층의 2개의 반응성 모이어티는 링커 구성을 이루는 발광 분자 또는 뉴클레오티드의 수를 추가로 증가시키기 위해 제3 링커 층에 부착시키는데 사용될 수 있다. 한 실시양태 21-3에서, 각각의 반응성 모이어티(522)에 결합된 제3 링커 층을 통해 6개의 발광 분자가 제2 링커 층에 부착되며, 여기서 각각의 제3 링커 층은 상용성 반응성 모이어티(513), 삼-관능화된 스페이서 링커(313), 및 발광 분자의 반응성 모이어티와 상용성인 3개의 반응성 모이어티(523)를 포함한다.
따라서, 발광 표지는 분자에 직접적으로, 예를 들어 결합에 의해 부착될 수 있거나, 링커 또는 링커 구성을 통해 부착될 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 포스페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 하나 이상의 포스페이트를 포함하는 링커에 의해 발광 표지에 연결된다. 본원에 사용된 바와 같은, 하나 이상의 포스페이트를 갖는 것으로 기재된 링커는 링커 구조 내에 존재하는 하나 이상의 포스페이트를 포함하고 뉴클레오티드의 하나 이상의 포스페이트에 직접 부착된 것은 아닌 링커를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 3개 이상의 포스페이트를 포함하는 링커에 의해 발광 표지에 연결된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 4개 이상의 포스페이트를 포함하는 링커에 의해 발광 표지에 연결된다.
특정 실시양태에서, 링커는 지방족 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 -(CH2)n-을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 20의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 10의 정수이다. 특정 실시양태에서, 링커는 헤테로지방족 쇄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리프로필렌 글리콜 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 -(CH2CH2O)n-을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 20의 정수이다. 일부 실시양태에서, 링커는 -(CH2CH2O)n-을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이다. 특정 실시양태에서, 링커는 -(CH2CH2O)4-을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 아릴렌을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 페닐렌 (예를 들어, 파라-치환된 페닐렌)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 키랄 중심을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 프롤린 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 프롤린 헥사머 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 쿠마린 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 나프탈렌 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 안트라센 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리페닐아미드 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 크로마논 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 4-아미노프로파르길-L-페닐알라닌 또는 그의 유도체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 2개의 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들은 데옥시리보스 뉴클레오티드, 리보스 뉴클레오티드 또는 잠금 리보스 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 링커는 광안정화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00011
여기서 PS는 광안정화제이고, d로 표지된 위치는 발광 표지에 부착되고, b로 표지된 위치는 뉴클레오티드에 부착된다. 일부 실시양태에서, d로 표지된 위치는 본원에 기재된 바와 같은 링커에 의해 발광 표지에 부착된다. 일부 실시양태에서, b로 표지된 위치는 본원에 기재된 바와 같은 링커에 의해 뉴클레오티드에 부착된다.
특정 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 포스페이트, 지방족 쇄, 헤테로지방족 쇄, 및 하나 이상의 아미드 (예를 들어, -C(=O)NH-)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 포스페이트 및 지방족 쇄를 포함하는 링커는 도 22에 도시된 예시적인 반응식 22-1을 통해 합성될 수 있다. 예시적인 링커 구조는 22-2 및 22-3에 추가로 도시된다. 특정 실시양태에서, 링커는 표 3에 도시된 링커로부터 선택된다. 표 3의 특정의 예시적인 링커 구조는 뉴클레오티드 (예를 들어, 뉴클레오시드 헥사포스페이트) 및/또는 염료에 연결되어 제시된다.
표 3. 예시적인 링커 또는 링커/염료 조합.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
특정 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 포스페이트, 지방족 쇄, 헤테로지방족 쇄, 하나 이상의 아미드 (예를 들어, -C(=O)NH-) 및 하나 이상의 비오틴 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에서, 비오티닐화된 링커는 하나 이상의 관능화가능한 반응성 모이어티 (예를 들어, 아세틸렌 기, 아지도 기)를 함유한다. 특정 실시양태에서, 링커는 표 4에 도시된 비제한적 링커로부터 선택된다. 표 4의 특정의 예시적인 링커 구조는 뉴클레오티드 (예를 들어, 뉴클레오시드 헥사포스페이트)에 연결되어 제시된다.
표 4. 예시적인 비오티닐화된 링커.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
일부 실시양태에서, 링커는 제1 층, 및 임의로 제2 및/또는 제3 층을 포함하는 전구체로부터 합성된다. 일부 실시양태에서, "제1 층"은 하나 이상의 비오틴 모이어티를 함유한다. 특정 실시양태에서, 링커의 제1 층은 단일 비오틴 모이어티를 함유한다. 특정 실시양태에서, 링커의 제1 층은 2개의 비오틴 모이어티를 함유한다. 일부 실시양태에서, 제1 층은 1개 이상의 반응성 모이어티 (예를 들어, 아지도 기, 아세틸렌 기, 카르복실 기, 아미노 기)를 함유한다. 일부 실시양태에서, 링커의 제1 층은 표 5에 도시된 구조로부터 선택된다.
표 5. 예시적인 제1 링커 층.
Figure pct00020
Figure pct00021
일부 실시양태에서, 링커의 제1 층은 하기 예시적인 반응식에 따라 합성될 수 있다:
Figure pct00022
추가 실시양태에서, 링커의 제1 층은 하기 예시적인 반응식에 따라 합성될 수 있다:
Figure pct00023
추가 실시양태에서, 링커의 제1 층은 하기 예시적인 반응식에 따라 합성될 수 있다:
Figure pct00024
일부 실시양태에서, "제2 층"은 1개 이상의 반응성 모이어티 (예를 들어, 아지도 기, 아세틸렌 기, 카르복실 기, 아미노 기)를 함유한다. 일부 실시양태에서, 제2 층은 링커의 제1 층에 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 제2 층은 제1 층을 제3 층에 공유 연결한다. 일부 실시양태에서, "제3 층"은 1개 이상의 반응성 모이어티 (예를 들어, 아지도 기, 아세틸렌 기, 카르복실 기, 아미노 기)를 함유한다. 일부 실시양태에서, 제3 층은 링커의 제1 층에 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 제3 층은 제2 층을 통해 제1 층에 공유 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 제1 및 제2 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 제1 및 제3 층을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 제1, 제2, 및 제3 층을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 및/또는 제3 링커 층은 표 6에 도시된 구조로부터 선택된다.
표 6. 예시적인 제2 및 제3 링커 층.
Figure pct00025
일부 실시양태에서, 제1 층을 초과하여 (예를 들어, 제2 층 및/또는 제3 층) 포함하는 링커는 하기 예시적인 반응식에 따라 합성될 수 있다:
Figure pct00026
일부 실시양태에서, 적어도 제2 및 제3 층을 포함하는 링커는 하기 예시적인 반응식에 따라 합성될 수 있다:
Figure pct00027
비오티닐화된 링커를 갖는 예시적인 발광 표지가 표 7에 제시된다. 표 7에 도시된 염료 대신 상이한 발광 표지가 치환될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
표 7. 비오티닐화된 링커를 갖는 예시적인 발광 표지.
Figure pct00028
샘플 웰 (예를 들어, 나노개구) 표면 제조
특정 실시양태에서, 1개 이상의 발광 표지된 분자를 검출하는 방법은 표적 체적 (예를 들어, 반응 체적) 내에 국한된 분자에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 표적 체적은 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구) 내의 영역이다. 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구) 및 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구)의 제작의 실시양태는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구)은 제1 재료로 구성된 저부 표면 및 복수의 금속 또는 금속 산화물 층에 의해 형성된 측벽을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 재료는 투명 재료 또는 유리이다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 편평하다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 곡면 웰이다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 복수의 금속 또는 금속 산화물 층에 의해 형성된 측벽 아래의 측벽의 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 재료는 용융 실리카 또는 이산화규소이다. 일부 실시양태에서, 복수의 층은 각각 금속 (예를 들어, Al, Ti) 또는 금속 산화물 (예를 들어, Al2O3, TiO2, TiN)을 포함한다.
패시베이션
실시양태에서 1개 이상의 분자 또는 복합체가 저부 표면에 고정되어 있는 경우에, 측벽 표면에의 고정화를 방지하기 위해 측벽을 패시베이션하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 측벽은 측벽 표면에 금속 또는 금속 산화물 장벽 층을 증착하는 단계; 및 장벽 층에 코팅을 도포하는 단계에 의해 패시베이션된다. 일부 실시양태에서, 금속 산화물 장벽 층은 산화알루미늄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증착하는 단계는 금속 또는 금속 산화물 장벽 층을 측벽 표면 및 저부 표면에 증착하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증착하는 단계는 저부 표면에서 금속 또는 금속 산화물 장벽 층을 에칭하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 장벽 층 코팅은 포스포네이트 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장벽 층 코팅은 알킬 쇄를 갖는 포스포네이트 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 알킬 쇄는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 포화 탄화수소 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장벽 층 코팅은 헥실포스폰산 (HPA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장벽 층 코팅은 중합체 포스포네이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 장벽 층 코팅은 폴리비닐포스폰산 (PVPA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장벽 층 코팅은 치환된 알킬 쇄를 갖는 포스포네이트 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 알킬 쇄는 하나 이상의 아미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 알킬 쇄는 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅은 하기 화학식의 포스포네이트 기를 포함한다:
Figure pct00029
여기서, n은 0 내지 100의 정수이고,
Figure pct00030
수소 또는 표면에의 부착 지점이다. 일부 실시양태에서, n은 3 내지 20의 정수이다. 일부 실시양태에서, 장벽 층 코팅은 상이한 유형의 포스포네이트 기의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장벽 층 코팅은 상이한 PEG 중량의 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄를 포함하는 포스포네이트 기의 혼합물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 장벽 층은 니트로도파 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 장벽 층 코팅은 하기 화학식의 기를 포함한다:
Figure pct00031
여기서 RN은 임의로 치환된 알킬 쇄이고,
Figure pct00032
는 수소 또는 표면에의 부착 지점이다. 일부 실시양태에서, RN은 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RN은 폴리(리신) 또는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장벽 층은 리신 단량체를 포함하는 폴리(리신)의 공-중합체를 포함하며, 여기서 리신 단량체는 독립적으로 PEG, 니트로도파 기, 포스포네이트 기 또는 1급 아민을 포함한다. 특정 실시양태에서, 장벽 층은 하기 화학식 (P)의 중합체를 포함한다:
Figure pct00033
일부 실시양태에서, X는 -OMe, 비오틴 기, 포스포네이트 또는 실란이다. 일부 실시양태에서, 각각의 i, j, k 및 l은 독립적으로 0 내지 100의 정수이다.
도 8은 금속 산화물 표면을 패시베이션하는 2가지 방법을 도시한다. 8-1에서 금속 산화물 표면은 (2-아미노에틸)포스폰산으로 처리되어 (2-아미노에틸)포스포네이트 기로 코팅된 표면이 제공된다. 제2 패시베이션 단계에서, 표면은 폴리(에틸렌 글리콜) NHS 에스테르로 처리된다. 표면 포스포네이트 기의 아민 기와 NHS 에스테르의 반응은 아미드 결합을 형성하여 PEG 관능화된 포스포네이트 기로 코팅된 표면을 형성한다. 8-2에서 금속 산화물 표면은 PEG 관능화된 포스폰산으로 처리되어, PEG 관능화된 포스포네이트 기로 코팅된 표면이 하나의 단계에서 제공된다. 예시적인 실시양태 8-2는 2가지 유형의 PEG 관능화된 포스포네이트 기로 코팅된 표면을 제공하기 위해, 제2 PEG 관능화된 포스폰산의 첨가를 추가로 도시한다. 이러한 예에서, 제1 PEG 포스폰산은 평균 분자량이 550이고, 제2 PEG 포스폰산은 평균 분자량이 180이다. 도시된 바와 같이, 보다 짧은 PEG 쇄 포스폰산이, 보다 긴 PEG 쇄를 갖는 초기 PEG 포스폰산에 의한 처리 후에 남아있는 표면 코팅에서 갭을 채우는데 도움이 될 수 있다.
폴리머라제 고정화
실시양태에서 1개 이상의 분자 또는 복합체가 저부 표면에 고정되어 있는 경우에, 1개 이상의 분자 또는 복합체의 부착을 가능하게 하기 위해 저부 표면을 관능화하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 저부 표면은 투명 유리를 포함한다. 특정 실시양태에서, 저부 표면은 용융 실리카 또는 이산화규소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 실란에 의해 관능화된다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 이온으로 하전된 중합체에 의해 관능화된다. 일부 실시양태에서, 이온으로 하전된 중합체는 폴리(리신)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 폴리(리신)-그라프트-폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 관능화된다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 비오티닐화된 소 혈청 알부민 (BSA)에 의해 관능화된다.
특정 실시양태에서, 저부 표면은 니트로도파 기를 포함하는 코팅에 의해 관능화된다. 특정 실시양태에서, 코팅은 하기 화학식의 기를 포함한다:
Figure pct00034
여기서 RN은 임의로 치환된 알킬 쇄이고,
Figure pct00035
는 수소 또는 표면에의 부착 지점이다. 일부 실시양태에서, RN은 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RN은 폴리(리신) 또는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RN은 비오티닐화된 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코팅은 리신 단량체를 포함하는 폴리(리신)의 공-중합체를 포함하고, 여기서 리신 단량체는 독립적으로 PEG, 비오티닐화된 PEG, 니트로도파 기, 포스포네이트 기 또는 실란을 포함한다. 특정 실시양태에서, 코팅은 하기 화학식 (P)의 중합체를 포함한다:
Figure pct00036
일부 실시양태에서, X는 -OMe, 비오틴 기, 포스포네이트 또는 실란이다. 일부 실시양태에서, 각각의 i, j, k 및 l은 독립적으로 0 내지 100의 정수이다.
일부 실시양태에서, 저부 표면은 알킬 쇄를 포함하는 실란에 의해 관능화된다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 임의로 치환된 알킬 쇄를 포함하는 실란에 의해 관능화된다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄를 포함하는 실란에 의해 관능화된다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 커플링 기를 포함하는 실란에 의해 관능화된다. 예를 들어 커플링 기는 화학적 모이어티, 예컨대 아민 기, 카르복실 기, 히드록실 기, 술프히드릴 기, 금속, 킬레이트화제 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들은 특정 결합 요소, 예컨대 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 렉틴, SNAP-태그™ 또는 그에 대한 기질, 회합 또는 결합 펩티드 또는 단백질, 항체 또는 항체 단편, 핵산 또는 핵산 유사체 등을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 관심 분자와 커플링시키거나 결합시키는데 사용되는 추가의 기를 커플링시키기 위해 커플링 기가 사용될 수 있고, 이는 일부 경우에 화학적 관능기 및 특정 결합 요소 둘 다를 포함할 수 있다. 예로서, 커플링 기, 예를 들어, 비오틴은 기판 표면 상에 증착될 수 있고, 주어진 영역에서 선택적으로 활성화될 수 있다. 이어서 중간 결합제, 예를 들어, 스트렙타비딘이 제1 커플링 기에 커플링될 수 있다. 이러한 특정한 예에서 비오티닐화될 관심 분자는 이어서 스트렙타비딘에 커플링된다.
일부 실시양태에서, 저부 표면은 비오틴을 포함하는 실란 또는 그의 유사체에 의해 관능화된다. 일부 실시양태에서, 저부 표면은 폴리(에틸렌) 글리콜 쇄를 포함하는 실란에 의해 관능화되며, 여기서 폴리(에틸렌 글리콜) 쇄는 비오틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저부 표면은 실란의 혼합물에 의해 관능화되며, 여기서 적어도 하나의 유형의 실란은 비오틴을 포함하고 적어도 하나의 유형의 실란은 비오틴을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 비오틴을 포함하지 않는 실란보다 비오티닐화된 실란을 약 10배 덜, 약 25배 덜, 약 50배 덜, 약 100배 덜, 약 250배 덜, 약 500배 덜, 또는 약 1000배 덜 포함한다.
도 9는 관능화된 유리 저부 표면을 생성하기 위한 2가지 예시적인 경로를 도시한다. 상부 경로에서 유리 표면은 PEG-실란 및 비오티닐화된-PEG-실란의 250:1의 비의 혼합물에 노출된다. 저부 경로에서, 유리 표면은 먼저 이소시아네이토-프로필-트리에톡시실란 (IPTES)에 노출된다. 이소시아네이트 기와 PEG-아민 및 비오티닐화된-PEG-아민의 혼합물과의 반응은 우레아 결합을 형성하고, 실란 기를 통해 표면에 부착된 PEG 및 비오티닐화된-PEG 쇄를 갖는 표면을 생성한다.
도 7은 제작된 칩으로부터 서열분석 반응의 개시까지 샘플 웰 표면을 제조하는 비제한적인 예시적 공정을 도시한다. 샘플 웰은 저부 표면 (비음영 직사각형) 및 측벽 (음영 수직 직사각형)으로 도시된다. 측벽은 다수의 층 (예를 들어, Al, Al2O3, Ti, TiO2, TiN)으로 구성될 수 있다. 단계 (a)에서, 측벽은 Al2O3의 장벽 층으로 증착된다. 이어서 Al2O3 장벽 층은 단계 (b)에서, 예를 들어 표면을 하나 이상의 PEG-포스폰산으로 처리하는 것에 의해 PEG 포스포네이트 기로 코팅된다. 단계 (c)에서, 저부 표면은, 예를 들어 PEG-실란 및 비오티닐화된-PEG-실란의 혼합물에 의해 관능화된다. 타원은 단일 분자 또는 복합체, 예컨대 폴리머라제 복합체의 부착을 위한 부위를 제공할 수 있는 개별 비오틴 기를 나타낸다. 단계 (d)에서, 폴리머라제 복합체는 저부 표면 상의 비오틴 기에 부착된다. 폴리머라제는 결합제, 예컨대 스트렙타비딘, 및 폴리머라제 복합체 상의 비오틴 태그에 의해 부착될 수 있다. 폴리머라제 복합체는 주형 핵산 및 프라이머를 추가로 포함할 수 있다 (제시되지 않음). 단계 (e)는 고정된 폴리머라제 복합체를 발광 표지된 뉴클레오티드에 노출시키는 것에 의한 서열분석 반응의 개시를 도시한다.
폴리머라제 복합체는 복합체를 결합 혼합물 중 관능화된 표면에 노출시키는 것에 의해 표면에 고정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 혼합물은 하나 이상의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염은 아세트산칼륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염은 염화칼슘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염은 약 1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 염은 약 10 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 염은 약 50 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 염은 약 100 mM 내지 약 250 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 아세트산칼륨의 농도는 약 75 mM이다. 일부 실시양태에서, 염화칼슘의 농도는 약 10 mM이다. 일부 실시양태에서, 결합 혼합물은 환원제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환원제는 약 1 mM 내지 약 20 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 디티오트레이톨의 농도는 약 5 mM이다. 일부 실시양태에서, 결합 혼합물은 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 MOPS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, MOPS의 농도는 약 50 mM이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 5.5 내지 약 6.5의 pH로 존재한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH로 존재한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 7.5 내지 약 8.5의 pH로 존재한다. 일부 실시양태에서, 결합 혼합물은 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트는 250 nM 내지 10 μM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, dNTP의 농도는 약 2 μM이다. 일부 실시양태에서, 결합 혼합물은 계면활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 트윈(Tween) 계면활성제 (예를 들어, 트윈 20)이다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.1%의 부피 퍼센트로 존재한다. 일부 실시양태에서, 트윈의 부피 퍼센트는 약 0.03%이다.
폴리머라제
본원에 사용된 용어 "폴리머라제"는 일반적으로 중합 반응을 촉매할 수 있는 임의의 효소 (또는 중합 효소)를 지칭한다. 폴리머라제의 예는, 비제한적으로, 핵산 폴리머라제, 트랜스크립타제 또는 리가제를 포함한다. 폴리머라제는 중합 효소일 수 있다.
단일 분자 핵산 연장 (예를 들어, 핵산 서열분석의 경우)에 대한 실시양태는 표적 핵산 분자에 상보적인 핵산을 합성할 수 있는 임의의 폴리머라제를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 리버스 트랜스크립타제, 및/또는 이들 중 하나 이상의 돌연변이체 또는 변경된 형태일 수 있다.
폴리머라제의 예는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 열안정성 폴리머라제, 야생형 폴리머라제, 변형된 폴리머라제, 이. 콜라이(E. coli) DNA 폴리머라제 I, T7 DNA 폴리머라제, 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제 φ29 (psi29) DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Tth 폴리머라제, Tli 폴리머라제, Pfu 폴리머라제, Pwo 폴리머라제, 벤트(Vent)® 폴리머라제, 딥 벤트(Deep Vent)™ 폴리머라제, Ex Taq™ 폴리머라제, LA Taq™ 폴리머라제, Sso 폴리머라제, Poc 폴리머라제, Pab 폴리머라제, Mth 폴리머라제, ES4 폴리머라제, Tru 폴리머라제, Tac 폴리머라제, Tne 폴리머라제, Tma 폴리머라제, Tca 폴리머라제, Tih 폴리머라제, Tfi 폴리머라제, 플래티늄(Platinum)® Taq 폴리머라제, Tbr 폴리머라제, Tfl 폴리머라제, Tth 폴리머라제, 푸투르보(Pfuturbo)® 폴리머라제, 피로베스트(Pyrobest)™ 폴리머라제, Pwo 폴리머라제, KOD 폴리머라제, Bst 폴리머라제, Sac 폴리머라제, 클레나우 단편, 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제, 및 그의 변이체, 변형된 생성물 및 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 단일 서브유닛 폴리머라제이다. DNA 폴리머라제의 비제한적 예 및 그의 특성은 특히 문헌 [DNA Replication 2nd edition, Kornberg and Baker, W. H. Freeman, New York, N.Y. (1991)]에 상세하게 기재되어 있다.
표적 핵산의 핵염기와 상보적 dNTP 사이의 염기 쌍형성 시, 폴리머라제는 새로이 합성되는 가닥의 3' 히드록실 말단과 dNTP의 알파 포스페이트 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 새로이 합성되는 가닥으로 dNTP를 혼입시킨다. dNTP에 접합된 발광 태그가 형광단인 예에서, 그의 존재는 여기에 의해 신호전달되고 방출의 펄스는 혼입 단계 동안 또는 그 후에 검출된다. dNTP의 말단 (감마) 포스페이트에 접합된 검출 표지의 경우에, 새로이 합성되는 가닥에의 dNTP의 혼입은 베타 및 감마 포스페이트와 샘플 웰에서 자유롭게 확산되는 검출 표지의 방출을 발생시켜, 형광단으로부터 검출되는 방출의 감소를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 높은 진행성을 갖는 폴리머라제이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 감소된 진행성을 갖는 폴리머라제이다. 폴리머라제 진행성은 일반적으로 핵산 주형을 방출하지 않으면서 핵산 내로 dNTP를 연속적으로 혼입시킬 수 있는 폴리머라제의 능력을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 낮은 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및/또는 3'-5' 엑소뉴클레아제를 갖는 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 폴리머라제는 상응하는 야생형 폴리머라제에 비해 감소된 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성 및/또는 3'-5' 활성을 갖도록 (예를 들어, 아미노산 치환에 의해) 변형된다. DNA 폴리머라제의 추가의 비제한적 예는 9°Nm™ DNA 폴리머라제 (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), 및 클레나우 엑소- 폴리머라제의 P680G 변이체 (Tuske et al. (2000) JBC 275(31):23759-23768)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 감소된 진행성을 갖는 폴리머라제는 뉴클레오티드 반복부 (예를 들어, 동일한 유형의 2개 이상의 순차적 염기)의 하나 이상의 스트레치를 함유하는 서열분석 주형에 대해 증가된 정확도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 폴리머라제는 비-표지된 핵산보다 표지된 뉴클레오티드에 대해 더 높은 친화도를 갖는 폴리머라제이다.
단일 분자 RNA 연장 (예를 들어, RNA 서열분석의 경우)에 대한 실시양태는 RNA 주형으로부터 상보적 DNA (cDNA)를 합성할 수 있는 임의의 리버스 트랜스크립타제를 사용할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 리버스 트랜스크립타제는 폴리머라제와 유사한 방식으로 기능할 수 있고, cDNA는 RNA 주형에 어닐링된 역전사 프라이머로의 dNTP의 혼입을 통해 RNA 주형으로부터 합성될 수 있다. 이어서, cDNA는 서열분석 반응에 참여할 수 있고, 그의 서열은 상기 및 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 이어서 cDNA의 결정된 서열은 서열 상보성을 통해 원래 RNA 주형의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 리버스 트랜스크립타제의 예는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 리버스 트랜스크립타제 (M-MLV), 조류 골수모구증 바이러스 (AMV) 리버스 트랜스크립타제, 인간 면역결핍 바이러스 리버스 트랜스크립타제 (HIV-1) 및 텔로머라제 리버스 트랜스크립타제를 포함한다.
핵산 폴리머라제의 진행성, 엑소뉴클레아제 활성, 상이한 유형의 핵산에 대한 상대적 친화성, 또는 다른 특성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 상응하는 야생형 폴리머라제에 대한 돌연변이 또는 다른 변형에 의해 증가 또는 감소될 수 있다.
주형
본 개시내용은 생체분자 또는 그의 서브유닛, 예컨대 핵산 분자를 검출하기 위한 디바이스, 시스템 및 방법을 제공한다. 이러한 검출은 서열분석을 포함할 수 있다. 생체분자는 대상체 (예를 들어, 인간 또는 다른 대상체)로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 추출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 진단, 예후 및/또는 치료 목적을 위해 검출 및/또는 서열분석될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열분석 검정에 대한 정보는 질환 또는 상태의 진단, 예후 및/또는 치료를 보조하는데 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 건강 상태, 예컨대 질환 (예를 들어, 암)을 갖는 것으로 의심될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환에 대한 치료를 받고 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 대상체의 체액 또는 조직, 예컨대 호흡, 타액, 소변, 혈액 (예를 들어, 전혈 또는 혈장), 대변 또는 다른 체액 또는 생검 샘플로부터 추출될 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 핵산 분자는 대상체의 체액 또는 조직으로부터 추출된다. 하나 이상의 핵산은 대상체, 예컨대 대상체의 조직의 일부로부터 수득된, 또는 대상체의 무세포 체액, 예컨대 전혈로부터 수득된 하나 이상의 세포로부터 추출될 수 있다.
생물학적 샘플은 검출 (예를 들어, 서열분석)에 대비하여 처리될 수 있다. 이러한 처리는 생물학적 샘플로부터 생체분자 (예를 들어, 핵산 분자)의 단리 및/또는 정제, 및 생체분자의 더 많은 카피의 생성을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 핵산 분자가 대상체의 체액 또는 조직으로부터 단리 및 정제되고, 핵산 증폭, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭된다. 이어서, 하나 이상의 핵산 분자 또는 그의 서브유닛은, 예컨대 서열분석을 통해 식별될 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 핵산 샘플은 증폭될 필요 없이 본 출원에 기재된 바와 같이 평가 (예를 들어, 서열분석)될 수 있다.
본 출원에 기재된 바와 같이, 서열분석은 주형 생체분자 (예를 들어, 핵산 분자)에 상보적이거나 유사한 또 다른 생체 분자를 합성하고, 예컨대 주형 핵산 분자에 상보적인 핵산 분자를 합성하고, 시간에 따라 뉴클레오티드의 혼입을 식별함으로써 (예를 들어, 합성에 의한 서열분석) 주형의 개별 서브유닛을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 대안으로서, 서열분석은 생체분자의 개별 서브유닛의 직접 식별을 포함할 수 있다.
서열분석 동안, 생체분자의 개별 서브유닛을 나타내는 신호가 메모리에 수집되고 실시간으로 또는 이후의 시점에 처리되어, 생체분자의 서열이 결정될 수 있다. 이러한 처리는 개별 서브유닛의 식별을 가능하게 하는 참조 신호에 대한 신호의 비교를 포함할 수 있고, 이는 일부 경우에 판독물을 산출한다. 판독물은 더 큰 서열 또는 영역을 식별하기 위해 사용될 수 있는, 예를 들어 염색체 또는 게놈 영역 또는 유전자 상의 위치에 정렬될 수 있는, 충분한 길이 (예를 들어, 적어도 약 30, 50, 100 염기 쌍 (bp) 또는 그 초과)의 서열일 수 있다.
서열 판독물은 (예를 들어, 정렬에 의해) 대상체의 게놈의 보다 긴 영역을 재구축하기 위해 사용될 수 있다. 판독물은 염색체 영역, 전체 염색체, 또는 전체 게놈을 재구축하기 위해 사용될 수 있다. 서열 판독물 또는 이러한 판독물로부터 생성된 더 큰 서열은 대상체의 게놈을 분석하기 위해, 예컨대 변이체 또는 다형성을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 변이체의 예는 탠덤 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함한 SNP, 인델(indel) 또는 결실 삽입 다형성 (DIP)으로도 언급되는 소규모 다중-염기 결실 또는 삽입, 다중-뉴클레오티드 다형성 (MNP), 짧은 탠덤 반복부 (STR), 마이크로결실을 포함한 결실, 마이크로삽입을 포함한 삽입, 중복, 역위, 전위, 증폭, 복합적 다중-부위 변이체, 카피수 변이 (CNV)를 포함한 구조적 변이를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 게놈 서열은 변이체의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 게놈 서열은 하나 이상의 SNP 및 하나 이상의 CNV의 조합을 포괄할 수 있다.
용어 "게놈"은 일반적으로 유기체의 유전 정보 전체를 지칭한다. 게놈은 DNA 또는 RNA에 코딩될 수 있다. 게놈은 단백질을 코딩하는 코딩 영역 뿐만 아니라 비-코딩 영역도 포함할 수 있다. 게놈은 유기체 내 모든 염색체의 서열을 함께 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈은 총 46개의 염색체를 갖는다. 이들 모두의 서열은 함께 인간 게놈을 구성한다. 일부 실시양태에서, 전체 게놈의 서열이 결정된다. 그러나, 일부 실시양태에서, 게놈의 하위세트 (예를 들어, 하나 또는 소수의 염색체 또는 그의 영역) 또는 하나 또는 소수의 유전자 (또는 그의 단편)에 대한 서열 정보는 진단, 예후 및/또는 치료 용도에 충분하다.
본원의 다른 곳에 기재된 디바이스에서와 같이, 다수의 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구)이 이용가능한 경우에 복수의 단일-가닥 표적 핵산 주형의 핵산 서열분석이 완료될 수 있다. 각각의 샘플 웰에 단일-가닥 표적 핵산 주형이 제공될 수 있고 각각의 샘플 웰에서 서열분석 반응이 완료될 수 있다. 샘플 웰 각각은 프라이머 연장 반응 동안 핵산 합성에 필요한 적절한 시약 (예를 들어, dNTP, 서열분석 프라이머, 폴리머라제, 보조-인자, 적절한 완충제 등)과 접촉될 수 있고, 각각의 샘플 웰에서 서열분석 반응이 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 샘플 웰은 모든 적절한 dNTP와 동시에 접촉된다. 다른 실시양태에서, 다수의 샘플 웰을 각각의 적절한 dNTP와 개별적으로 접촉되고, 상이한 dNTP와의 접촉 사이에 각각 세척된다. 혼입된 dNTP는 각각의 샘플 웰에서 검출될 수 있고, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 각각의 샘플 웰에서 단일-가닥 표적 핵산에 대한 서열이 결정될 수 있다.
일부 실시양태가 시편에서 단일 분자를 검출하는 것에 의한 진단 시험에 관한 것일 수 있지만, 본 발명자들은 또한 본 개시내용의 단일 분자 검출 능력이 폴리펩티드 (예를 들어, 단백질) 서열분석 또는, 예를 들어 유전자의 하나 이상의 핵산 절편의 핵산 (예를 들어, DNA, RNA) 서열분석을 수행하는데 사용될 수 있다는 점을 인식하였다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 방법은 하기에 보다 상세하게 기재된 하나 이상의 디바이스 또는 장치를 사용하여 수행될 수 있다.
장치의 개관
본 발명자들은 단일 분자 또는 입자의 검출 및 정량화를 수행하기 위한 콤팩트한 고속 장치가 생물학적 및/또는 화학적 샘플의 복합적인 정량적 측정을 수행하는 비용을 감소시키고 생화학적 기술 발견의 속도를 빠르게 진전시킬 수 있다는 것을 추가로 인식하고 인지하였다. 또한, 용이하게 운반가능한 비용-효과적인 디바이스는 선진국에서 생물검정이 수행되는 방식을 변형시킬 수 있을 뿐만 아니라, 개발도상 지역의 사람들에게, 처음으로, 그의 건강과 복지를 극적으로 개선시킬 수 있는 필수적인 진단 시험에의 접근을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 실시양태는 가정에서 개인에 의해 또는 개발도상국에서 원격 클리닉의 의사에 의해 사용될 수 있는 혈액, 소변 및/또는 타액의 진단 시험에 사용될 수 있다.
다수의 픽셀 (예를 들어, 수백, 수천, 수백만 또는 그 초과)을 갖는 픽셀화된 센서 디바이스는 복수의 개별 분자 또는 입자를 병렬로 검출할 수 있게 한다. 분자는 예로서 제한 없이, 단백질 및/또는 DNA일 수 있다. 또한, 초당 100개 초과의 프레임으로 데이터를 획득할 수 있는 고속 디바이스는 분석 중인 샘플 내에서 시간의 경과에 따라 발생하는 동적 공정 또는 변화를 검출하고 분석하는 것을 가능하게 한다.
본 발명자들은 생물검정 장비가 더 콤팩트화되는 것을 막는 하나의 장애물은 센서에서 바람직하지 않은 검출 이벤트를 유발하는 것으로부터 여기 광을 필터링해야 하는 필요라는 것을 인식하고 인지하였다. 목적하는 신호 광 (발광)을 전송하고 여기 광을 충분히 차단하는데 사용되는 광학 필터는 두껍고, 크고, 비싸고, 광의 입사각에서의 변이를 허용하지 않을 수 있어서, 소형화를 막을 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 펄스 여기 소스를 사용하는 것이 이러한 필터링의 필요를 감소시키거나, 일부 경우에 이러한 필터의 필요를 완전히 제거할 수 있다는 것을 인식하고 인지하였다. 여기 광 펄스에 대해 광자가 검출되는 시간을 결정할 수 있는 센서를 사용함으로써, 신호 광은 수신된 광의 스펙트럼보다 광자가 수신되는 시간에 기초하여 여기 광으로부터 분리될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서 큰 광학 필터에 대한 필요가 감소 및/또는 제거된다.
본 발명자들은 발광 수명 측정이 또한 샘플에 존재하는 분자를 식별하는데 사용될 수 있다는 것을 인식하고 인지하였다. 광자가 검출되는 때를 검출할 수 있는 광학 센서는 많은 이벤트로부터 수집된 통계를 사용하여 여기 광에 의해 여기되는 분자의 발광 수명을 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 수명 측정은 발광의 스펙트럼 측정에 더하여 이루어질 수 있다. 대안적으로, 발광의 스펙트럼 측정은 샘플 분자를 식별하는데 있어서 완전히 생략될 수 있다. 발광 수명 측정은 펄스 여기 소스를 사용하여 이루어질 수 있다. 추가적으로, 발광 수명 측정은 센서를 포함하는 통합 디바이스, 또는 광원이 통합 디바이스로부터 분리된 시스템에 위치하는 디바이스를 사용하여 이루어질 수 있다.
본 발명자들은 또한 생물학적 샘플로부터 방출된 발광 광을 측정할 수 있는 단일 통합 디바이스에 샘플 웰 (예를 들어, 나노개구) 및 센서를 통합하는 것이 이러한 디바이스를 생성하는 비용을 감소시켜 일회용 생물분석 칩이 형성될 수 있도록 한다는 것을 인식하고 인지하였다. 베이스 기기와 인터페이스하는 일회용, 단일-사용 통합 디바이스는 샘플 분석을 위해 고가의 생물학 실험실을 필요로 하는 제약 없이 전세계 어느 곳에서나 사용될 수 있다. 따라서, 이전에는 생물학적 샘플의 정량 분석을 수행할 수 없었던 전세계의 지역들에 자동화된 생물분석학을 도입할 수 있다. 예를 들어, 일회용 통합 디바이스에 혈액 샘플을 넣고, 일회용 통합 디바이스를 분석을 위한 소형 휴대용 베이스 기기에 넣고, 결과를 컴퓨터로 처리하여 사용자가 즉시 검토함으로써, 영아에 대한 혈액 시험이 수행될 수 있다. 데이터는 또한 데이터 네트워크를 따라 원격 위치로 전송되어 분석될 수 있고/거나 후속 임상 분석을 위해 보관될 수 있다.
본 발명자들은 또한 일회용 단일-사용 디바이스가 칩 상에 광원을 포함하지 않음으로써 더 간단하고 저렴한 비용으로 제조될 수 있다는 것을 인식하고 인지하였다. 그 대신, 광원은 샘플을 분석하기 위해 일회용 칩과 인터페이스하는 시스템 내에 통합된 재사용가능한 컴포넌트일 수 있다.
본 발명자들은 또한 샘플이 복수의 상이한 유형의 발광 마커로 태그부착된 경우에, 발광 마커의 임의의 적합한 특징이 칩의 특정한 픽셀에 존재하는 마커의 유형을 식별하는데 사용될 수 있다는 것을 인지하고 인식하였다. 예를 들어, 마커에 의해 방출되는 발광의 특징 및/또는 여기 흡수의 특징이 마커를 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광의 방출 에너지 (광의 파장과 직접 관련됨)는 제1 유형의 마커를 제2 유형의 마커와 구별하는데 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 발광 수명 측정이 또한 특정한 픽셀에 존재하는 마커의 유형을 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광 수명 측정은 수명 정보를 수득하기에 충분한 해상도로 광자가 검출되는 시간을 구별할 수 있는 센서를 사용하여 펄스 여기 소스에 의해 이루어질 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상이한 유형의 마커에 의해 흡수된 여기 광의 에너지는 특정한 픽셀에 존재하는 마커의 유형을 식별하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 마커는 제1 파장의 광을 흡수할 수 있지만, 제2 파장의 광을 동등하게 흡수하지 않을 수 있고, 한편 제2 마커는 제2 파장의 광을 흡수할 수 있지만, 제1 파장의 광은 동등하게 흡수하지 않을 수 있다. 이러한 방식으로, 각각 상이한 여기 에너지를 갖는 하나 초과의 여기 광원이 인터리브 방식으로 샘플을 조명하는 데 사용될 수 있는 경우에, 마커의 흡수 에너지는 어떠한 유형의 마커가 샘플에 존재하는지 식별하는데 사용될 수 있다. 상이한 마커는 또한 상이한 발광 강도를 가질 수 있다. 따라서, 발광의 검출된 강도도 또한 특정한 픽셀에 존재하는 마커의 유형을 식별하는데 사용될 수 있다.
I. 시스템의 개관
시스템은 통합 디바이스 및 통합 디바이스와 인터페이스하도록 구성된 기기를 포함한다. 통합 디바이스는 픽셀의 어레이를 포함하고, 픽셀은 샘플 웰 및 적어도 하나의 센서를 포함한다. 통합 디바이스의 표면은 복수의 샘플 웰을 갖고, 샘플 웰은 통합 디바이스의 표면에 놓인 시편으로부터 샘플을 수용하도록 구성된다. 시편은 다수의 샘플을 함유할 수 있고, 일부 실시양태에서 상이한 유형의 샘플을 함유할 수 있다. 복수의 샘플 웰은 샘플 웰의 적어도 일부가 시편으로부터 하나의 샘플을 수용하도록 적합한 크기 및 형상을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 내의 다수의 샘플은 일부 샘플 웰이 하나의 샘플을 함유하고 다른 것은 0, 2 또는 그 초과의 샘플을 함유하도록 샘플 웰 사이에 분포될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시편은 다수의 단일-가닥 DNA 주형을 함유할 수 있고, 통합 디바이스의 표면 상의 개별 샘플 웰은 단일-가닥 DNA 주형을 수용하는 크기 및 형상일 수 있다. 단일-가닥 DNA 주형은 통합 디바이스의 샘플 웰의 적어도 일부가 단일-가닥 DNA 주형을 함유하도록 통합 디바이스의 샘플 웰 사이에 분포될 수 있다. 시편은 또한 태그부착된 dNTP를 함유할 수 있고, 이는 이어서 샘플 웰로 진입하여 그것이 샘플 웰 내의 단일-가닥 DNA 주형에 상보적인 DNA의 가닥 내로 혼입됨에 따라 뉴클레오티드의 식별을 가능하게 할 수 있다. 이러한 예에서, "샘플"은 단일-가닥 DNA 및 폴리머라제에 의해 현재 혼입되고 있는 태그부착된 dNTP 둘 다를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시편은 단일-가닥 DNA 주형을 함유할 수 있고, 태그부착된 dNTP는 뉴클레오티드가 샘플 웰 내의 DNA의 상보적 가닥으로 혼입됨에 따라 샘플 웰에 후속적으로 도입될 수 있다. 이러한 방식으로, 뉴클레오티드의 혼입 타이밍은 태그부착된 dNTP가 통합 디바이스의 샘플 웰로 도입되는 시기에 의해 제어될 수 있다.
여기 에너지는 통합 디바이스의 픽셀 어레이로부터 분리되어 위치한 여기 소스로부터 제공된다. 여기 에너지는 적어도 부분적으로, 샘플 웰 내의 조명 영역을 조명하기 위해 통합 디바이스의 요소에 의해 하나 이상의 픽셀로 향하게 된다. 이어서 마커 또는 태그는 조명 영역 내에 위치할 때 및 여기 에너지에 의한 조명에 반응하여 방출 에너지를 방출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 여기 소스는 시스템의 기기의 일부이며, 기기 및 통합 디바이스의 컴포넌트는 여기 에너지가 하나 이상의 픽셀을 향하도록 구성된다.
이어서 샘플에 의해 방출된 방출 에너지는 통합 디바이스의 픽셀 내의 1개 이상의 센서에 의해 검출될 수 있다. 검출된 방출 에너지의 특징은 방출 에너지와 연관된 마커를 식별하는 것에 대한 지표를 제공할 수 있다. 이러한 특징은 센서에 의해 검출된 광자의 도달 시간, 센서에 의해 시간의 경과에 따라 축적된 광자의 양, 및/또는 2개 이상의 센서에 걸친 광자의 분포를 포함한, 임의의 적합한 유형의 특징을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서는 샘플의 방출 에너지와 연관된 하나 이상의 타이밍 특징 (예를 들어, 형광 수명)의 검출을 가능하게 하는 구성을 가질 수 있다. 센서는 여기 에너지의 펄스가 통합 디바이스를 통해 전파된 후 광자 도달 시간의 분포를 검출할 수 있고, 도달 시간의 분포는 샘플의 방출 에너지의 타이밍 특징의 지표 (예를 들어, 형광 수명의 경우에 프록시)를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 센서는 마커 또는 태그에 의해 방출된 방출 에너지의 확률의 지표 (예를 들어, 형광 강도)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수의 센서는 방출 에너지의 공간 분포를 포획하는 크기일 수 있고 그를 위해 배열될 수 있다. 이어서 1개 이상의 센서로부터의 출력 신호는 복수의 마커 중에서 마커를 구별하는데 사용될 수 있고, 복수의 마커는 시편 내의 샘플을 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 다수의 여기 에너지에 의해 여기될 수 있고, 다수의 여기 에너지에 반응하여 샘플에 의해 방출된 방출 에너지 및/또는 방출 에너지의 타이밍 특징은 복수의 마커로부터 마커를 구별할 수 있다.
시스템(23-100)의 개략적 개관이 도 23a 및 23b에서 예시된다. 시스템은 기기(23-104)와 인터페이스하는 통합 디바이스(23-102) 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기기(23-104)는 기기(23-104)의 일부로서 통합된 1개 이상의 여기 소스(23-106)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 여기 소스는 기기(23-104) 및 통합 디바이스(23-102) 둘 다에 대해 외부일 수 있고, 기기(23-104)는 여기 소스로부터 여기 에너지를 수신하여 이것이 통합 디바이스로 향하게 하도록 구성될 수 있다. 통합 디바이스는 통합 디바이스를 수용하여 이를 여기 소스와 정확한 광학 정렬로 유지하기 위한 임의의 적합한 소켓을 사용하여 기기와 인터페이스할 수 있다. 여기 소스(23-106)는 여기 에너지를 통합 디바이스(23-102)에 제공하도록 구성될 수 있다. 도 23b에 개략적으로 예시된 바와 같이, 통합 디바이스(23-102)는 다수의 픽셀을 갖고, 여기서 픽셀(23-112) 중 적어도 일부는 샘플의 독립적 분석을 수행할 수 있다. 이러한 픽셀(23-112)은 복수의 픽셀을 여기하는, 픽셀로부터 분리된 소스(23-106)로부터 여기 에너지를 수신하기 때문에 "수동 소스 픽셀"로 지칭될 수 있다. 픽셀(23-112)은 샘플을 수용하도록 구성된 샘플 웰(23-108), 및 여기 소스(23-106)에 의해 제공된 여기 에너지로 샘플을 조명하는 것에 반응하여 샘플에 의해 방출된 방출 에너지를 검출하기 위한 센서(23-110)를 갖는다. 샘플 웰(23-108)은 샘플에의 여기 에너지의 전달 및 샘플로부터의 방출 에너지의 검출에 있어서 용이성을 제공하기 위해 샘플을 통합 디바이스(23-102)의 표면에 근접하여 보유할 수 있다.
여기 에너지를 샘플 웰(23-108)로 유도하고 커플링시키기 위한 광학 요소는 통합 디바이스(23-102) 및 기기(23-104) 둘 다에 위치한다. 이러한 소스-에서-웰 요소는 여기 에너지를 통합 디바이스에 커플링시키기 위한, 통합 디바이스(23-102) 상에 위치한 1개 이상의 격자 커플러, 및 여기 에너지를 기기(23-104)로부터 픽셀(23-112) 내의 샘플 웰로 전달하기 위한 도파관을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 통합 디바이스 상에 위치한 요소는 샘플 웰로부터의 방출 에너지를 센서로 향하게 하는 역할을 할 수 있다. 샘플 웰(23-108), 일부의 여기 소스-에서-웰 광학기기, 및 샘플 웰-에서-센서 광학기기는 통합 디바이스(23-102) 상에 위치한다. 여기 소스(23-106) 및 일부의 소스-에서-웰 컴포넌트는 기기(23-104) 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 단일 컴포넌트는 여기 에너지를 샘플 웰(23-108)에 커플링시키고 샘플 웰(23-108)로부터의 방출 에너지를 센서(23-110)로 전달하는 둘 다의 역할을 할 수 있다. 통합 디바이스에 포함시키기 위한, 여기 에너지를 샘플 웰에 커플링시키고/거나 방출 에너지를 센서로 향하게 하는데 적합한 컴포넌트의 예는 표제 "INTEGRATED DEVICE FOR PROBING, DETECTING AND ANALYZING MOLECULES"의 미국 특허 출원 14/821,688, 및 표제 "INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING, DETECTING, AND ANALYZING MOLECULES"의 미국 특허 출원 14/543,865에 기재되어 있고, 이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
도 23b에 예시된 바와 같이, 통합 디바이스는 복수의 픽셀을 포함하고, 여기서 픽셀(23-112)은 그 자신의 개별 샘플 웰(23-108) 및 적어도 1개의 센서(23-110)와 회합된다. 복수의 픽셀은 어레이 내에 배열될 수 있고, 어레이에 임의의 적합한 수의 픽셀이 존재할 수 있다. 통합 디바이스(23-102) 내의 픽셀의 수는 대략 10,000 픽셀 내지 1,000,000 픽셀의 범위 또는 그러한 범위 내의 임의의 값 또는 값의 범위 내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 픽셀은 512 픽셀 x 512 픽셀의 어레이 내에 배열될 수 있다. 통합 디바이스(23-102) 및 기기(23-104)는 대형 픽셀 어레이 (예를 들어, 10,000 픽셀 초과)와 연관된 데이터를 취급하기 위한 다중-채널, 고-속 통신 링크를 포함할 수 있다.
기기(23-104)는 통합 디바이스 인터페이스(23-114)를 통해 통합 디바이스(23-102)와 인터페이스한다. 통합 디바이스 인터페이스(23-114)는 여기 소스(23-106)로부터의 여기 에너지의 통합 디바이스(23-102)에의 커플링을 개선시키기 위해 통합 디바이스(23-102)를 기기(23-104)에 배치 및/또는 정렬하는 컴포넌트를 포함할 수 있다. 여기 소스(23-106)는 여기 에너지를 적어도 1개의 샘플 웰에 전달하기 위해 배열된 임의의 적합한 광원일 수 있다. 적합한 여기 소스의 예는 표제 "INTEGRATED DEVICE FOR PROBING, DETECTING AND ANALYZING MOLECULES"의 미국 특허 출원 14/821688에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 여기 소스(23-106)는 여기 에너지를 통합 디바이스(23-102)에 전달하기 위해 조합된 다수의 여기 소스를 포함한다. 다수의 여기 소스는 다수의 여기 에너지 또는 파장을 생성하도록 구성될 수 있다. 통합 디바이스 인터페이스(23-114)는 통합 디바이스 상에 위치한 픽셀 내의 센서로부터 판독 신호를 수신할 수 있다. 통합 디바이스 인터페이스(23-114)는 통합 디바이스를 통합 디바이스 인터페이스(23-114)에 고정함으로써 통합 디바이스가 기기에 부착되도록 설계될 수 있다.
기기(23-104)는 기기(23-104)의 작동을 제어하기 위한 사용자 인터페이스(23-116)를 포함한다. 사용자 인터페이스(23-116)는 사용자가 기기의 기능을 제어하는데 사용되는 명령 및/또는 설정과 같은 정보를 기기에 입력하는 것을 가능하게 하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스(23-116)는 버튼, 스위치, 다이얼, 및 음성 명령을 위한 마이크로폰을 포함할 수 있다. 추가적으로, 사용자 인터페이스(23-116)는 사용자가 기기 및/또는 통합 디바이스의 성능, 예컨대 적절한 정렬에 대한 피드백 및/또는 통합 디바이스 상의 센서로부터의 판독 신호에 의해 수득된 정보를 수신하는 것을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스(23-116)는 청각 피드백을 제공하기 위해 스피커를 사용하여 피드백을 제공할 수 있고, 시각 피드백을 제공하기 위해 표시등 및/또는 디스플레이 스크린을 사용하여 피드백을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기기(23-104)는 컴퓨팅 디바이스(23-120)와 연결하는데 사용되는 컴퓨터 인터페이스(23-118)를 포함한다. 임의의 적합한 컴퓨터 인터페이스(23-118) 및 컴퓨팅 디바이스(23-120)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 인터페이스(23-118)는 USB 인터페이스 또는 파이어와이어(FireWire) 인터페이스일 수 있다. 컴퓨팅 디바이스(23-120)는 랩톱 또는 데스크톱 컴퓨터와 같은 임의의 범용 컴퓨터일 수 있다. 컴퓨터 인터페이스(23-118)는 기기(23-104)와 컴퓨팅 디바이스(23-120) 사이의 정보의 통신을 용이하게 한다. 기기(23-104)를 제어 및/또는 구성하기 위한 입력 정보는 기기의 컴퓨터 인터페이스(23-118)에 연결된 컴퓨팅 디바이스(23-120)를 통해 제공될 수 있다. 출력 정보는 컴퓨터 인터페이스(23-118)를 통해 컴퓨팅 디바이스(23-120)에 의해 수신될 수 있다. 이러한 출력 정보는 기기(23-104) 및/또는 통합 디바이스(23-112)의 성능에 대한 피드백 및 센서(23-110)의 판독 신호로부터의 정보를 포함할 수 있다. 기기(23-104)는 또한 센서(23-110)로부터 수신된 데이터를 분석하고/거나 여기 소스(23-106)에 제어 신호를 전송하는 처리 디바이스(23-122)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 처리 디바이스(23-122)는 범용 프로세서, 특수-구성 프로세서 (예를 들어, 하나 이상의 마이크로프로세서 또는 마이크로컨트롤러 코어와 같은 중앙 처리 유닛 (CPU), 필드-프로그램가능 게이트 어레이 (FPGA), 주문형 집적 회로 (ASIC), 맞춤형 집적 회로, 디지털 신호 프로세서 (DSP), 또는 그의 조합)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서(23-110)로부터의 데이터의 처리는 처리 디바이스(23-122) 및 외부 컴퓨팅 디바이스(23-120) 둘 다에 의해 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 컴퓨팅 디바이스(23-120)는 생략될 수 있고, 센서(23-110)로부터의 데이터의 처리는 처리 디바이스(23-122)에 의해 단독으로 수행될 수 있다.
픽셀의 행을 예시한 통합 디바이스(24-102)의 단면 개략도가 도 24a에 제시된다. 각각의 픽셀(24-112)은 샘플 웰(24-108) 및 센서(24-110)를 포함한다. 센서(24-110)는 센서(24-110)가 샘플 웰(24-112) 내의 샘플에 의해 방출된 방출 에너지를 수신하도록 샘플 웰(24-112)에 정렬 및 배치될 수 있다. 적합한 센서의 예는 표제 "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS"의 미국 특허 출원 14/821,656에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
통합 디바이스에 커플링된 여기 소스는 통합 디바이스(24-102)의 하나 이상의 픽셀에 여기 에너지를 제공할 수 있다. 도 24b는 여기 에너지(24-130) (파선으로 표시됨)를 통합 디바이스(24-102)에 제공하기 위해 여기 소스(24-106)를 통합 디바이스(24-102)에 커플링시킨 것을 예시하는 개략도이다. 도 24b는 여기 에너지 소스(24-106)로부터의 여기 에너지의 픽셀(24-112) 내 샘플 웰(24-108)로의 경로를 예시한다. 통합 디바이스 외부에 위치한 컴포넌트를 사용하여 여기 소스(24-106)를 통합 디바이스에 배치시키고 정렬할 수 있다. 이러한 컴포넌트는 렌즈, 거울, 프리즘, 개구, 감쇠기 및/또는 광섬유를 포함한 광학 컴포넌트를 포함할 수 있다. 하나 이상의 정렬 컴포넌트의 제어가 가능하도록 추가의 기계 컴포넌트가 기기에 포함될 수 있다. 이러한 기계 컴포넌트는 작동기, 스테퍼 모터 및/또는 노브를 포함할 수 있다.
통합 디바이스는 여기 에너지(24-130)가 통합 디바이스 내의 픽셀로 향하게 하는 컴포넌트를 포함한다. 각각의 픽셀(24-112) 내에서, 여기 에너지는 픽셀과 회합된 샘플 웰(24-108)에 커플링된다. 도 24b는 픽셀의 행 내의 각각의 샘플 웰에 커플링된 여기 에너지를 예시하지만, 일부 실시양태에서 여기 에너지는 행 내의 모든 픽셀에 커플링되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 통합 디바이스의 픽셀의 행 내의 일부의 픽셀 또는 샘플 웰에 커플링될 수 있다. 여기 에너지는 샘플 웰 내에 위치한 샘플을 조명할 수 있다. 샘플은 여기 에너지에 의한 조명에 반응하여 여기 상태에 도달할 수 있다. 샘플이 여기 상태에 있을 때, 샘플은 방출 에너지를 방출할 수 있으며, 방출 에너지는 센서에 의해 검출될 수 있다. 도 24b는 샘플 웰(24-108)로부터의 방출 에너지(24-140) (실선으로 표시됨)의 픽셀(24-112)의 센서(24-110)로의 경로를 개략적으로 예시한다. 픽셀(24-112) 내의 센서(24-110)는 샘플 웰(24-108)로부터 방출 에너지를 검출하도록 구성 및 배치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서(24-110)는 다수의 서브-센서를 포함할 수 있다.
분석될 샘플은 픽셀(24-112)의 샘플 웰(24-108) 내로 도입될 수 있다. 샘플은 생물학적 샘플 또는 임의의 다른 적합한 샘플, 예컨대 화학적 샘플일 수 있다. 샘플은 다수의 분자를 포함할 수 있으며, 샘플 웰은 단일 분자를 격리하도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 샘플 웰의 치수는 샘플 웰 내에 단일 분자를 국한하도록 작용하여, 단일 분자에 대해 측정이 수행되게 할 수 있다. 여기 소스(24-106)는 샘플, 또는 샘플에 부착되거나 달리 샘플과 회합된 적어도 하나의 발광 마커를 그것이 샘플 웰(24-108) 내의 조명 영역 내에 있는 동안 여기하도록 샘플 웰(24-108) 내로 여기 에너지를 전달하도록 구성될 수 있다.
여기 소스가 샘플 웰에 여기 에너지를 전달할 때, 웰 내의 적어도 하나의 샘플이 발광할 수 있고, 생성된 방출은 센서에 의해 검출될 수 있다. 본원에 사용된 어구 "샘플은 발광할 수 있다" 또는 "샘플은 방사선을 방출할 수 있다" 또는 "샘플로부터의 방출"은 발광 태그, 마커 또는 리포터, 샘플 자체, 또는 샘플과 회합된 반응 생성물이 방출 방사선을 생성할 수 있다는 것을 의미한다.
통합 디바이스의 하나 이상의 컴포넌트는 방출 에너지가 센서로 향하게 할 수 있다. 방출 에너지 또는 에너지들은 센서에 의해 검출되어 적어도 하나의 전기 신호로 변환될 수 있다. 전기 신호는 도 23b에 제시된 기기(23-104)의 통합 디바이스 인터페이스(23-114)와 같은 통합 디바이스 인터페이스를 통해 기기에 연결된 통합 디바이스의 회로 내의 전도성 배선을 따라 전송될 수 있다. 전기 신호는 후속적으로 처리 및/또는 분석될 수 있다. 전기 신호의 처리 또는 분석은 도 23b에 제시된 컴퓨팅 디바이스(23-120)와 같이, 기기(23-104) 상에 또는 기기 밖에 위치하는 적합한 컴퓨팅 디바이스에서 이루어질 수 있다.
작동 시, 샘플 웰 내의 샘플의 병렬 분석은 여기 소스를 사용하여 웰 내의 샘플을 여기하고 샘플 방출로부터의 신호를 센서로 검출함으로써 수행된다. 샘플로부터의 방출 에너지는 상응하는 센서에 의해 검출되어 적어도 하나의 전기 신호로 변환될 수 있다. 생성된 신호 또는 신호들은 일부 실시양태에서 통합 디바이스에서 처리되거나, 또는 처리 디바이스 및/또는 컴퓨팅 디바이스에 의한 처리를 위해 기기로 전송될 수 있다. 샘플 웰로부터의 신호는 다른 픽셀과 연관된 신호와 독립적으로 수신되고 처리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플은 하나 이상의 마커로 표지될 수 있으며, 마커와 회합된 방출은 기기에 의해 확인가능하다. 예를 들어, 센서는 특정 마커로부터의 방출 에너지에 의존하여 수명을 확인하는데 사용될 수 있는 전기 신호를 형성하기 위해 방출 에너지로부터 광자를 전자로 변환하도록 구성될 수 있다. 샘플을 표지하기 위해 상이한 수명의 마커를 사용함으로써, 센서에 의해 검출된 생성된 전기 신호에 기초하여 특정 샘플을 식별할 수 있다.
샘플은 다수의 유형의 분자를 함유할 수 있고, 상이한 발광 마커는 분자 유형과 고유하게 회합될 수 있다. 여기 동안 또는 후에, 발광 마커는 방출 에너지를 방출할 수 있다. 방출 에너지의 하나 이상의 특성은 샘플 내의 하나 이상의 유형의 분자를 식별하는데 사용될 수 있다. 분자의 유형을 구별하는데 사용되는 방출 에너지의 특성은 형광 수명 값, 강도, 및/또는 방출 파장을 포함할 수 있다. 센서는 방출 에너지의 광자를 포함한 광자를 검출할 수 있고, 이들 특성 중 하나 이상을 나타내는 전기 신호를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서로부터의 전기 신호는 하나 이상의 시간 간격에 걸쳐 광자 도달 시간의 분포에 대한 정보를 제공할 수 있다. 광자 도달 시간의 분포는 여기 소스에 의해 여기 에너지의 펄스가 방출된 후 광자가 검출되었을 때에 상응할 수 있다. 시간 간격에 대한 값은 시간 간격 동안 검출된 광자의 수에 상응할 수 있다. 다수의 시간 간격에 걸친 상대 값은 방출 에너지의 시간적 특징 (예를 들어, 수명)의 지표를 제공할 수 있다. 샘플을 분석하는 것은 분포 내의 2 이상의 상이한 시간 간격에 대한 값을 비교함으로써 마커를 구별하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 강도의 지표는 분포 내의 모든 시간 빈에 걸쳐 광자의 수를 결정함으로써 제공될 수 있다.
II. 통합 디바이스
통합 디바이스는 외부 여기 에너지 소스로부터 여기 에너지를 수신하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 디바이스의 영역은 통합 디바이스에서 떨어져서 위치하는 여기 에너지 소스에 커플링시키는데 사용될 수 있다. 통합 디바이스의 컴포넌트는 여기 에너지를 여기 소스 커플링 영역으로부터 적어도 하나의 픽셀로 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 도파관은 여기 에너지를 샘플 웰을 갖는 적어도 하나의 픽셀로 전달하도록 구성될 수 있다. 샘플 웰 내에 위치한 샘플은 여기 에너지에 의한 조명에 반응하여 방출 에너지를 방출할 수 있다. 픽셀 내에 위치한 1개 이상의 센서는 방출 에너지를 수신하도록 구성된다.
도 25에 제시된 일부 실시양태에 따른 통합 디바이스(25-200)의 컴포넌트 및/또는 층은 하나의 디바이스 내에 통합된 샘플 웰(25-203), 도파관(25-220), 및 센서(25-275)를 포함한다. 샘플 웰(25-203)은 통합 디바이스(25-200)의 샘플 웰 층(25-201)에 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 층(25-201)은 금속일 수 있다. 샘플 웰(25-203)은 샘플 웰의 단면 치수를 나타낼 수 있는 치수 Dtv를 가질 수 있다. 샘플 웰(25-203)은 나노개구로 작용할 수 있으며, 샘플 웰(25-203) 내의 샘플의 여기 강도를 증가시키는 필드 증진 효과를 생성하는 하나 이상의 하위-파장 치수를 가질 수 있다. 도파관(25-220)은 디바이스(25-200)에서 떨어져서 위치하는 여기 소스(25-230)로부터의 여기 에너지를 샘플 웰(25-203)로 전달하도록 구성된다. 도파관(25-220)은 샘플 웰 층(25-201)과 센서(25-275) 사이의 층에 형성될 수 있다. 통합 디바이스(25-200)의 설계는 센서(25-275)가 샘플 웰(25-203) 내 샘플로부터 방출된 발광을 수집하는 것을 가능하게 한다. 적어도 일부의 시간에, 샘플은 여기 에너지를 흡수하고, 여기 에너지의 것 미만의 에너지를 갖는 광자를 방출하며, 이는 방출 에너지 또는 발광으로 지칭된다.
통합 디바이스(25-200) 상에 샘플 웰(25-203) 및 센서(25-275)를 갖는 것은 광이 샘플 웰(25-203)로부터 센서(25-215)로 이동하는 광학 거리를 감소시킬 수 있다. 통합 디바이스(25-200) 또는 디바이스 내의 컴포넌트의 치수는 특정 광학 거리를 위해 구성될 수 있다. 디바이스의 컴포넌트 및/또는 하나 이상의 층의 재료의 광학 특성은 샘플 웰과 센서 사이의 광학 거리를 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 층의 두께는 픽셀 내의 샘플 웰과 센서 사이의 광학 거리를 결정할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 통합 디바이스(25-200)의 하나 이상의 층을 형성하는 재료의 굴절률은 픽셀 내의 샘플 웰(25-203)과 센서(25-275) 사이의 광학 거리를 결정할 수 있다. 픽셀 내의 샘플 웰과 센서 사이의 이러한 광학 거리는 1 mm 미만, 100 마이크로미터 미만, 25 마이크로미터 미만 및/또는 10 마이크로미터 미만일 수 있다. 도파관(25-220)으로부터의 여기 에너지의 샘플 웰(25-203)에의 커플링을 개선시키기 위해 샘플 웰 층(25-201)과 도파관 층(25-220) 사이에 1개 이상의 층이 존재할 수 있다. 도 25에 제시된 통합 디바이스(25-200)는 단일 층(25-210)만을 예시하지만, 샘플 웰(25-203)과 도파관(25-220) 사이에 다수의 층이 형성될 수 있다. 도파관(25-220)으로부터의 여기 에너지의 샘플 웰(25-203)에의 커플링을 개선시키기 위해 광학 특성을 갖는 층(25-210)이 형성될 수 있다. 층(25-210)은 여기 에너지의 산란 및/또는 흡수를 감소시키고/거나 샘플 웰(25-203) 내 샘플로부터의 발광을 증가시키도록 구성될 수 있다. 층(25-210)은, 일부 실시양태에 따르면, 광이 거의 감쇠되지 않고 샘플 웰(25-203)을 왕복할 수 있도록 광학적으로 투명할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층(25-210)을 형성하는데 유전 물질이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관(25-220)으로부터의 여기 에너지의 샘플 웰(25-203)에의 커플링을 개선시키기 위해 층(25-210) 내 및/또는 층(25-210)과 샘플 웰 층(25-201) 사이의 인터페이스에 여기 에너지 커플링 컴포넌트가 제공될 수 있다. 예로서, 샘플 웰 층(25-201)과 층(25-210) 사이의 인터페이스에 형성된 에너지-수집 컴포넌트(25-215)는 도파관(25-220)으로부터의 여기 에너지의 샘플 웰(25-203)에의 커플링을 개선시키기 위해 구성될 수 있다. 에너지-수집 컴포넌트(25-215)는 임의적이고, 일부 실시양태에서, 도파관(25-220) 및 샘플 웰(25-203)의 구성은 여기 에너지 수집 컴포넌트(25-215)의 부재 하에 충분한 여기 에너지 커플링을 가능하게 할 수 있다.
샘플 웰(25-203) 내의 샘플로부터 방출된 발광 광 또는 에너지는 다양한 방식으로 센서(25-275)에 전송될 수 있으며, 그 일부 예는 하기에 상세히 기재된다. 일부 실시양태는 특정한 파장의 광이 그러한 특정한 파장의 광을 검출하는 것을 전담하는 센서(25-275)의 영역 또는 부분으로 향할 가능성을 증가시키기 위해 광학 컴포넌트를 사용할 수 있다. 센서(25-275)는 상이한 발광 마커로부터의 방출에 상응할 수 있는 상이한 파장의 광을 동시에 검출하기 위한 다수의 부분을 포함할 수 있다.
샘플 웰(25-203)로부터 센서(25-275)로의 발광의 수집을 개선시키기 위해 구성될 수 있는 하나 이상의 층이 샘플 웰(25-203)과 센서(25-275) 사이에 존재할 수 있다. 컴포넌트를 향하는 발광은 샘플 웰 층(25-201)과 층(25-210) 사이의 인터페이스에 위치할 수 있다. 에너지-수집 컴포넌트(25-215)는 방출 에너지를 센서(25-275)로 집속시킬 수 있고, 상이한 특징적 에너지 또는 파장을 갖는 방출 에너지를 추가적으로 또는 대안적으로 공간적으로 분리할 수 있다. 이러한 에너지-수집 컴포넌트(25-215)는 발광이 센서(25-275)로 향하게 하기 위한 격자 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 격자 구조는 일련의 동심 고리 또는 "불스아이(bullseye)" 격자 구조 구성일 수 있다. 동심 원형 격자는 샘플 웰 층(25-201)의 저부 표면으로부터 돌출될 수 있다. 원형 격자는 신호 광의 확산을 감소시키고 신호 광을 관련 센서(25-275)로 향하게 하는데 사용될 수 있는 플라즈몬 요소로서 작용할 수 있다. 이러한 불스아이 격자는 발광이 보다 효율적으로 센서(25-275)를 향하게 할 수 있다.
층(25-225)은 도파관에 인접하여 형성될 수 있다. 층(25-225)의 광학 특성은 샘플 웰에서 센서(25-275)로의 발광의 수집을 개선시키기 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 층(25-225)은 유전 물질일 수 있다. 샘플 웰 층(25-201)과 센서(25-275) 사이에 배플이 형성될 수 있다. 배플(25-240)은 센서(25-275)가 샘플 웰(25-203)에 상응하는 발광을 수신하고 다른 샘플 웰로부터의 발광 및 반사된/산란된 여기를 감소시키도록 구성될 수 있다. 필터링 요소(25-260)는 여기 에너지가 센서(25-275)에 도달하는 것을 감소시키도록 배치되고 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 필터링 요소(25-260)는 샘플을 표지하는데 사용되는 하나 이상의 마커의 방출 에너지를 선택적으로 전송하는 필터를 포함할 수 있다. 각각의 샘플 웰이 상응하는 센서를 갖는 샘플 웰의 어레이 및 센서의 어레이의 실시양태에서, 다른 샘플 웰로부터의 발광 및 반사된 및/또는 산란된 여기 광이 샘플 웰에 상응하는 센서에 의해 수집되는 것을 감소시키기 위해 각각의 샘플 웰에 상응하는 배플이 형성될 수 있다.
센서에의 여기 에너지의 전송을 감소시키기 위해 도파관(25-220)과 센서(25-275) 사이에 하나 이상 층이 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관(25-220)과 센서(25-275) 사이에 필터링 요소가 형성될 수 있다. 이러한 필터링 요소는 샘플 웰로부터의 발광이 센서(25-275)에 의해 수집되도록 하면서 센서(25-275)로의 여기 에너지의 전송을 감소시키도록 구성될 수 있다. 방출 에너지 또는 에너지들은 센서(25-275)에 의해 검출되어 적어도 하나의 전기 신호로 변환될 수 있다. 전기 신호 또는 신호들은 후속 신호 처리를 위해 하나 이상의 행 또는 열 전도성 배선 (제시되지 않음)을 따라 기판 상의 통합 전자 회로(25-200)로 전송될 수 있다
상기 도 25의 설명은 일부 실시양태에 따른 장치의 컴포넌트의 일부의 개관이다. 일부 실시양태에서, 도 25의 하나 이상의 요소는 부재하거나 또는 상이한 위치에 존재할 수 있다. 통합 디바이스(25-200)의 컴포넌트 및 여기 소스(25-230)는 하기에서 보다 상세하게 기재된다.
A. 여기 소스 커플링 영역
통합 디바이스는 외부 여기 에너지 소스와 커플링되고 통합 디바이스의 픽셀 영역 내의 적어도 하나의 픽셀을 향해 여기를 유도하도록 구성된 여기 소스 커플링 영역을 가질 수 있다. 여기 소스 커플링 영역은 광이 적어도 하나의 도파관에 커플링되도록 구성된 하나 이상의 구조를 포함할 수 있다. 여기 에너지를 도파관에 커플링시키는 임의의 적합한 메카니즘이 사용될 수 있다.
통합 디바이스의 여기 소스 커플링 영역은 외부 여기 소스와 커플링되도록 구성된 구조적 컴포넌트를 포함할 수 있다. 통합 디바이스는 통합 디바이스의 표면에 근접 배치된 외부 여기 소스와 커플링되고 광이 통합 디바이스의 적어도 하나의 도파관을 향하도록 구성된 격자 커플러를 포함할 수 있다. 크기, 형상 및/또는 격자 구성과 같은 격자 커플러의 특색은 여기 소스로부터 도파관으로의 여기 에너지의 커플링을 개선시키기 위해 형성될 수 있다. 격자 커플러는 구조적 컴포넌트들 사이의 간격이 광을 전파시키도록 작용할 수 있는 하나 이상의 구조적 컴포넌트를 포함할 수 있다. 격자 커플러의 하나 이상의 치수는 특정한 특징의 파장을 갖는 광의 바람직한 커플링을 제공할 수 있다.
통합 디바이스는 또한 도파관의 말단에 테이퍼 영역을 갖는 도파관을 포함할 수 있다. 도파관에서의 광 전파 방향에 수직인 도파관의 하나 이상의 치수는 도파관의 말단에서 더 커서 도파관의 테이퍼 영역을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관의 테이퍼 영역은 광의 전파에 수직이고, 도파관의 말단에서 더 크고 도파관의 길이를 따라 더 작아지는 통합 디바이스의 표면에 평행한 치수를 가질 수 있다. 격자 커플러를 포함하는 실시양태에서, 테이퍼 영역은 격자 커플러에 근접 배치될 수 있어서, 테이퍼 영역의 보다 큰 말단은 격자 커플러에 가장 가까이 위치한다. 테이퍼 영역은 도파관과 격자 커플러의 개선된 모드 오버랩을 가능하게 하기 위해 도파관의 하나 이상의 치수를 연장시킴으로써 격자 커플러와 도파관 사이의 광의 커플링을 개선시키는 크기 및 형상일 수 있다. 이러한 방식으로, 통합 디바이스의 표면에 근접 배치된 여기 소스는 격자 커플러를 통해 광을 도파관에 커플링시킬 수 있다. 격자 커플러와 도파관 테이퍼의 이러한 조합은 통합 디바이스에 대한 여기 소스의 정렬 및 배치에 더 많은 허용오차를 허용할 수 있다.
격자 커플러는 통합 디바이스의 픽셀 외부의 통합 디바이스의 영역 내에 배치될 수 있다. 통합 디바이스의 표면 상에서, 픽셀의 샘플 웰은 여기 소스 커플링 영역으로부터 분리된 표면의 영역을 차지할 수 있다. 여기 소스 커플링 영역의 표면에 근접 배치된 여기 소스는 격자 커플러와 커플링될 수 있다. 샘플 웰은 여기 소스 커플링 영역으로부터 분리 배치되어 픽셀의 성능에 대한 여기 소스로부터의 광의 간섭을 감소시킬 수 있다. 통합 디바이스의 격자 커플러는 도파관을 포함하는 통합 디바이스의 하나 이상의 층 내에 형성될 수 있다. 이러한 방식으로, 통합 디바이스의 여기 소스 커플링 영역은 도파관과 동일한 평면의 통합 디바이스 내에 격자 커플러를 포함할 수 있다. 격자 커플러는 빔 폭, 입사각 및/또는 입사 여기 에너지의 편광을 포함한 특정한 세트의 빔 파라미터에 대해 구성될 수 있다.
통합 디바이스(26-200)의 단면도를 도 26에 제시한다. 통합 디바이스(26-200)는 통합 디바이스(26-200)의 층(26-223) 내에 형성된 적어도 하나의 샘플 웰(26-222)을 포함한다. 통합 디바이스(26-200)는 통합 디바이스(26-200)의 실질적으로 동일한 평면에 형성된 격자 커플러(26-216) 및 도파관(26-220)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 격자 커플러(26-216) 및 도파관(26-220)은 통합 디바이스(26-200)의 동일한 층으로 형성되고 동일한 재료를 포함할 수 있다. 통합 디바이스(26-200)의 여기 소스 커플링 영역(26-201)은 격자 커플러(26-216)를 포함한다. 도 26에 제시된 바와 같이, 샘플 웰(26-222)은 여기 소스 커플링 영역(26-201) 외부의 통합 디바이스(26-200)의 표면에 배치된다. 통합 디바이스(26-200)에 대해 배치된 여기 소스(26-214)는 여기 소스 커플링 영역(26-201) 내의 통합 디바이스(26-200)의 표면(26-215) 상에 입사하는 여기 에너지를 제공할 수 있다. 격자 커플러(26-216)를 여기 소스 커플링 영역(26-201) 내에 배치시킴으로써, 격자 커플러(26-216)는 여기 소스(26-214)로부터의 여기 에너지와 커플링되고 여기 에너지를 도파관(26-220)에 커플링시킬 수 있다. 도파관(26-220)은 여기 에너지를 하나 이상의 샘플 웰(26-222)에 근접하여 전파하도록 구성된다.
격자 커플러는 하나 이상의 재료로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 격자 커플러는 도파관에서의 광의 전파와 평행한 방향을 따라 상이한 재료의 교대 영역을 포함할 수 있다. 도 26에 제시된 바와 같이, 격자 커플러(26-216)는 재료(26-224)로 둘러싸인 구조를 포함한다. 격자 커플러를 형성하는 하나 이상의 재료는 광 커플링 및 전파에 적합한 하나 이상의 굴절률을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 격자 커플러는 보다 큰 굴절률을 갖는 재료로 둘러싸인 하나의 재료로 형성된 구조를 포함할 수 있다. 예로서, 격자 커플러는 질화규소로 형성되고 이산화규소로 둘러싸인 구조를 포함할 수 있다.
격자 커플러를 형성하기 위해 임의의 적합한 치수 및/또는 격자간 간격이 사용될 수 있다. 격자 커플러(26-216)는 도파관을 통한 광의 전파에 수직인, 예컨대 도 26에 제시된 바와 같은 y-방향을 따라 대략 50 nm, 대략 100 nm, 대략 150 nm, 또는 대략 200 nm의 치수를 가질 수 있다. 도파관에서의 광 전파에 평행한 방향을 따라, 예컨대 도 26에 제시된 바와 같은 z-방향을 따른 격자 커플러의 구조 사이의 간격은 임의의 적합한 거리를 가질 수 있다. 격자간 간격은 대략 300 nm, 대략, 350 nm, 대략, 400 nm, 대략 420 nm, 대략 450 nm, 또는 대략 500 nm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 격자간 간격은 격자 커플러 내에서 가변적일 수 있다. 격자 커플러(26-216)는 외부 여기 소스(26-214)와 커플링하기에 적합한 영역을 제공하는 통합 디바이스(26-200)의 표면(26-215)에 실질적으로 평행한 하나 이상의 치수를 가질 수 있다. 격자 커플러(26-216)의 영역은 빔이 격자 커플러(26-215)와 오버랩하도록 여기 소스(26-214)로부터의 광 빔의 하나 이상의 치수와 일치할 수 있다. 격자 커플러는 대략 10 마이크로미터, 대략 20 마이크로미터, 대략 30 마이크로미터 또는 대략 40 마이크로미터의 빔 직경을 위해 구성된 영역을 가질 수 있다.
통합 디바이스는 반사광으로 구성된 여기 소스에 대향하는 격자 커플러의 측면에 형성된 층을 포함할 수 있다. 층은 격자 커플러를 통과하는 여기 에너지를 격자 커플러를 향해 반사시킬 수 있다. 통합 디바이스에 층을 포함시킴으로써, 여기 에너지의 도파관에 대한 커플링 효율이 개선될 수 있다. 반사 층의 예는 도 26에 제시된 통합 디바이스(26-200)의 층(26-218)이다. 층(26-218)은 통합 디바이스(26-200)의 여기 소스 커플링 영역(26-201) 내에 배치되고, 격자 커플러(26-216)를 향하여 광을 반사시키도록 구성된다. 층(26-218)은 여기 소스(26-214)로부터의 입사 여기 에너지에 대향하는 격자 커플러(26-216)의 측면에 근접하여 형성된다. 통합 디바이스(26-200)의 픽셀 외부에 층(26-218)을 배치하는 것은 픽셀의 성능 능력에 대한 층(26-218)의 간섭을 감소시킬 수 있다. 층(26-218)은 임의의 적합한 물질을 포함할 수 있다. 층(26-218)은 하나 이상의 여기 에너지를 실질적으로 반사시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 층은 Al, AlCu, 및/또는 TiN을 포함할 수 있다.
B. 도파관
통합 디바이스는 목적하는 양의 여기 에너지를 통합 디바이스의 하나 이상의 샘플 웰로 전달하기 위해 배열된 하나 이상의 도파관을 포함할 수 있다. 여기 에너지가 도파관을 따라 전파됨에 따라 여기 에너지의 일부가 하나 이상의 샘플 웰에 커플링되도록 하나 이상의 샘플 웰 부근에 도파관이 배치된다. 도파관은 여기 에너지를 복수의 픽셀에 커플링시키고 버스 도파관으로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 단일 도파관은 통합 디바이스의 픽셀의 행 또는 열에 여기 에너지를 전달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관은 복수의 특징적 파장을 갖는 여기 에너지를 전파하도록 구성될 수 있다. 통합 디바이스의 픽셀은 도파관으로부터의 여기 에너지가 샘플 웰 부근을 향하게 하도록 구성된 추가의 구조 (예를 들어, 마이크로공동)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관은 샘플 웰로 및/또는 샘플 웰 부근의 영역으로 연장되도록 구성된 에바네센트 꼬리를 갖는 광학 모드를 가질 수 있다. 샘플 웰 근처에 위치한 추가의 에너지-커플링 구조는 에바네센트 꼬리로부터의 에너지를 샘플 웰에 커플링시킬 수 있다.
통합 디바이스의 도파관의 하나 이상의 치수는 도파관을 따라 및/또는 하나 이상의 샘플 웰로의 여기 에너지의 목적하는 전파를 제공할 수 있다. 도파관은 광의 전파에 수직이고 도파관의 평면에 평행한 치수를 가질 수 있고, 이는 단면 폭으로 간주될 수 있다. 도파관은 대략 0.4 마이크로미터, 대략 0.5 마이크로미터, 대략 0.6 마이크로미터, 대략 0.65 마이크로미터, 대략 0.8 마이크로미터, 대략 1 마이크로미터 또는 대략 1.2 마이크로미터의 단면 폭을 가질 수 있다. 도파관은 광의 전파에 수직이고 도파관의 평면에 수직인 치수를 가질 수 있고, 이는 단면 높이로 간주될 수 있다. 도파관은 대략 0.05 마이크로미터, 대략 0.1 마이크로미터, 대략 0.15 마이크로미터, 대략 0.16 마이크로미터, 대략 0.17 마이크로미터, 대략 0.2 마이크로미터, 또는 대략 0.3 마이크로미터의 단면 높이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관은 단면 높이보다 큰 단면 폭을 갖는다. 도파관은 통합 디바이스 내의 하나 이상의 샘플 웰로부터 특정 거리에, 예컨대 샘플 웰(26-222)과 도파관(26-220) 사이에 도 26에 제시된 거리 D에 배치될 수 있고, 이는 대략 0.3 마이크로미터, 0.5 마이크로미터, 또는 대략 0.7 마이크로미터이다.
예시적 실시양태에서, 도파관은 대략 0.5 μm의 단면 폭 및 대략 0.1 μm의 단면 높이를 가질 수 있고, 샘플 웰 층의 대략 0.5 μm 아래에 배치될 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 도파관은 대략 1 μm의 단면 폭 및 0.18 μm의 단면 높이를 가질 수 있고, 샘플 웰 층의 0.3 μm 아래에 배치될 수 있다.
도파관은 단일 가로 방사 모드를 지원하도록 치수가 정해질 수 있거나, 다중-가로 방사 모드를 지원하도록 치수가 정해질 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관의 하나 이상의 치수는 도파관이 단일 가로 모드만을 유지하고 TE 또는 TM 편광 모드를 선택적으로 전파할 수 있도록 작용할 수 있다. 일부 구현에서, 도파관은 그의 말단 상에 형성된 고도로 반사성인 섹션을 가질 수 있어서 도파관 내에서 세로 스탠딩 모드를 지지한다. 하나의 모드를 지지함으로써, 도파관은 상이한 전파 상수를 갖는 모드의 교차 커플링으로부터 감소된 모드 간섭 효과를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 고도로 반사성인 섹션은 단일의 고도로 반사성인 표면을 포함한다. 다른 실시양태에서, 고도로 반사성인 섹션은 집합적으로 높은 반사도를 발생시키는 다수의 반사 구조를 포함한다. 도파관은 단일 여기 소스로부터 복수의 여기 에너지 빔을 생성하기 위해 도파관 빔 스플리터를 사용하여 더 높은 출력 강도를 갖는 단일 여기 소스로부터의 여기 에너지를 스플릿하도록 구성될 수 있다. 이러한 빔 스플리터는 에바네센트 커플링 메카니즘을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 여기 에너지의 전파를 개선시키기 위해 도파관 구조에서 및/또는 여기 에너지의 산란을 감소시키기 위해 도파관을 둘러싸는 재료에서 광자 결정이 사용될 수 있다.
통합 디바이스의 픽셀 내의 다른 컴포넌트와 관련하여 도파관의 위치 및 배열은 샘플 웰로의 여기 에너지의 결합을 개선시키고/거나, 센서에 의한 방출 에너지의 수집을 개선시키고/거나, 여기 에너지에 의해 도입되는 신호 잡음을 감소시키도록 구성될 수 있다. 도파관은 샘플 웰로부터 방출된 방출 에너지에 의한 도파관 내에서 전파하는 여기 에너지의 간섭을 감소시키기 위한 크기일 수 있고/거나 샘플 웰에 대해 배치될 수 있다. 통합 디바이스 내의 도파관의 배치 및 배열은 도파관 및 도파관을 둘러싸는 재료의 굴절률에 의존할 수 있다. 예를 들어, 도파관을 따라 및 도파관의 평면 내에서 전파하는 광 방향에 수직인 도파관의 치수는, 샘플 웰로부터의 실질적인 양의 방출 에너지가 픽셀의 센서로 전파함에 따라 도파관을 통과하도록 증가될 수 있다. 일부 구현에서, 샘플 웰과 도파관 사이의 거리 및/또는 도파관 두께는 도파관과 둘러싸는 재료 사이의 하나 이상의 인터페이스로부터의 반사를 감소시키도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 도파관에 의한 방출 에너지의 반사는 일부 실시양태에서 약 5% 미만으로, 일부 실시양태에서 약 2% 미만으로, 일부 실시양태에서 약 1% 미만으로 감소될 수 있다.
여기 에너지를 전파하는 도파관의 능력은 도파관의 재료 및 도파관을 둘러싸는 재료 둘 다에 의존할 수 있다. 이러한 방식으로, 도파관 구조는 코어 물질, 예컨대 도파관(26-220), 및 클래딩 물질, 예컨대 도 26에 예시된 바와 같은 영역(26-224)을 포함할 수 있다. 도파관의 재료 및 둘러싸는 재료 둘 다는 특징적 파장을 갖는 여기 에너지의 도파관을 통한 전파를 가능하게 할 수 있다. 도파관 재료 또는 둘러싸는 재료는 특정한 굴절률 또는 굴절률의 조합을 위해 선택될 수 있다. 도파관 재료는 도파관을 둘러싸는 재료보다 낮은 굴절률을 가질 수 있다. 예시적인 도파관 재료는 질화규소 (SixNy), 산질화규소, 탄화규소, 산화탄탈럼 (TaO2), 이산화알루미늄을 포함한다. 예시적인 도파관을 둘러싸는 재료는 이산화규소 (SiO2) 및 산화규소를 포함한다. 도파관 및/또는 둘러싸는 재료는 하나 이상의 재료를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 도파관 및/또는 둘러싸는 재료에 대한 목적하는 굴절률은 도파관 및/또는 둘러싸는 재료가 하나 초과의 재료를 포함하도록 형성함으로써 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관은 질화규소를 포함하고, 둘러싸는 재료는 이산화규소를 포함한다.
단일 도파관에서 다수의 도파관으로 도파관을 스플릿하는 것은 여기 에너지가 통합 디바이스의 샘플 웰의 다수의 행 또는 열에 도달하는 것을 가능하게 할 수 있다. 여기 소스는 입력 도파관에 커플링될 수 있고, 입력 도파관은 다수의 출력 도파관으로 스플릿될 수 있으며, 각각의 출력 도파관은 여기 에너지를 샘플 웰의 행 또는 열에 전달한다. 도파관을 스플릿 및/또는 조합하기 위한 임의의 적절한 기술이 사용될 수 있다. 이러한 도파관 스플릿 및/또는 조합 기술은 스타 스플리터 또는 커플러, Y 스플리터 및/또는 에바네센트 커플러를 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다중-모드 간섭 스플리터 (MMI)가 도파관을 스플릿 및/또는 조합하는데 사용될 수 있다. 이들 도파관 스플릿 및/또는 조합 기술 중 하나 이상이 여기 에너지를 샘플 웰로 향하게 하는데 사용될 수 있다.
C. 샘플 웰
일부 실시양태에 따르면, 샘플 웰(27-210)은 통합 디바이스의 하나 이상의 픽셀에 형성될 수 있다. 샘플 웰은, 통합 디바이스의 단일 픽셀(27-100)을 예시한 도 27a 및 도 27b에 도시된 바와 같이, 기판(27-105)의 표면에 형성되고, 기판의 표면 상에 증착된 시편으로부터 샘플 웰의 안팎으로 샘플(27-101)이 확산할 수 있도록 배열된, 작은 체적 또는 영역을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 샘플 웰(27-210)은 도파관(27-240)으로부터 여기 에너지를 수신하도록 배열될 수 있다. 샘플 웰 안으로 확산하는 샘플(27-101)은 부착제(27-211)에 의해 샘플 웰의 여기 영역(27-215) 내에서 일시적으로 또는 영구적으로 유지될 수 있다. 여기 영역에서, 샘플은 여기 에너지 (예를 들어, 여기 방사(27-247))에 의해 여기되어 후속해서 방사를 방출할 수 있고, 이는 관측 및 평가되어 샘플을 특징화할 수 있다.
작동을 추가로 상세화하면, 분석될 적어도 하나의 샘플(27-101)은, 예를 들어 샘플의 유체 현탁액을 함유하는 시편 (제시되지 않음)으로부터 샘플 웰(27-210)로 도입될 수 있다. 도파관(27-240)으로부터의 여기 에너지는 샘플 또는 샘플에 부착되거나 샘플과 회합된 태그에 포함된 적어도 하나의 마커를, 그것이 샘플 웰 내의 여기 영역(27-215) 내에 있는 동안 여기시킬 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 마커는 발광 분자 (예를 들어, 형광단) 또는 양자점일 수 있다. 일부 구현에서, 샘플을 분석하는데 사용되는 하나 초과의 마커가 존재할 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 ["Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules," by J. Eid, et al., Science 323, p. 133 (2009)]에 기재된 바와 같은, 단일-분자 유전자 서열분석에 사용되는 별개의 마커 및 태그). 여기 동안 및/또는 후에, 샘플 또는 마커는 방출 에너지를 방출할 수 있다. 다수의 마커가 사용되는 경우에, 이는 상이한 특징의 에너지에서 방출할 수 있고/거나 상이한 수명을 포함한 상이한 시간 특징으로 방출할 수 있다. 샘플 웰로부터의 방출 에너지는 센서(27-260)로 방사 또는 달리 이동할 수 있으며, 방출 에너지는 검출되어, 샘플을 특징화하는데 사용될 수 있는 전기 신호로 변환된다.
일부 실시양태에 따르면, 샘플 웰(27-210)은, 도 27b에 도시된 바와 같이, 부분적으로 봉입된 구조일 수 있다. 일부 구현에서, 샘플 웰(27-210)은 적어도 하나의 재료층(27-230)에 형성된 마이크로미터-미만-크기의 홀 또는 틈 (적어도 하나의 가로 치수 Dsw를 특징으로 함)을 포함한다. 일부 경우에, 홀은 "나노개구"로 지칭될 수 있다. 샘플 웰의 가로 치수는 일부 실시양태에 따르면 대략 20 나노미터 내지 대략 1 마이크로미터일 수 있지만, 일부 구현에서 더 크고 더 작은 크기가 사용될 수 있다. 샘플 웰(27-210)의 체적은 일부 구현에서 약 10-21 리터 내지 약 10-15 리터일 수 있다. 샘플 웰은 전파 모드를 지지할 수 있는, 또는 지지할 수 없는 도파관으로 형성될 수 있다. 샘플 웰은 전파 모드를 지지할 수 있는, 또는 지지할 수 없는 도파관으로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 직경 (또는 최대 가로 치수)이 Dsw인 원통 형상 (또는 유사한 형상)을 갖는 제로-모드 도파관 (ZMW)으로 형성될 수 있다. ZMW는 홀을 통해 전파 광학 모드를 지지하지 않는 나노-규모 홀로서 단일 금속 층에 형성될 수 있다.
샘플 웰(27-210)은 작은 체적을 갖기 때문에, 샘플이 자연 환경에서 발견되는 것과 유사한 농도로 검사되는 시편에 농축될 수 있더라도, 각각의 픽셀에서 단일-샘플 이벤트 (예를 들어, 단일-분자 이벤트)의 검출이 가능할 수 있다. 예를 들어, 통합 디바이스와 접촉하여 놓인 시편에 마이크로몰 농도의 샘플이 존재할 수 있지만, 픽셀 수준에서는 단지 약 하나의 샘플 (또는 단일 분자 이벤트)만이 임의의 주어진 시간에 샘플 웰 내에 있을 수 있다. 통계적으로, 일부 샘플 웰은 어떠한 샘플도 함유하지 않을 수 있고, 일부는 하나 초과의 샘플을 함유할 수 있다. 그러나, 상당한 수의 샘플 웰은 단일 샘플을 함유할 수 있고 (예를 들어, 일부 실시양태에서 적어도 30%), 따라서 단일-분자 분석이 다수의 픽셀에 대해 병렬로 실시될 수 있다. 단일-분자 또는 단일-샘플 이벤트가 각각의 픽셀에서 분석될 수 있기 때문에, 통합 디바이스는 집단 평균에서 달리 간과될 수 있는 드문 이벤트의 검출을 가능하게 한다.
샘플 웰의 가로 치수 Dsw는 일부 실시양태에서 약 500 나노미터 (nm) 내지 약 1 마이크로미터, 일부 실시양태에서 약 250 nm 내지 약 500 nm, 일부 실시양태에서 약 100 nm 내지 약 250 nm, 및 일부 실시양태에서 약 20 nm 내지 약 100 nm일 수 있다. 일부 구현에 따르면, 샘플 웰의 가로 치수는 대략 80 nm 내지 대략 180 nm, 또는 여기 파장 또는 방출 파장의 대략 1/4 내지 1/8이다. 다른 구현에 따르면, 샘플 웰의 가로 치수는 대략 120 nm 내지 대략 170 nm이다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰(27-210)의 깊이 또는 높이는 약 50 nm 내지 약 500 nm일 수 있다. 일부 구현에서, 샘플 웰(27-210)의 깊이 또는 높이는 약 80 nm 내지 약 250 nm일 수 있다.
하위-파장, 가로 치수를 갖는 샘플 웰(27-210)은 통합 디바이스의 픽셀(27-100)의 작동을 적어도 2가지 방식으로 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 시편에 대향하는 측면으로부터 샘플 웰에 입사되는 여기 에너지는 지수적으로 감소하는 전력으로 여기 영역(27-215)에 커플링되고, 샘플 웰을 통해 시편에 전파되지 않을 수 있다. 그 결과, 여기 에너지는 여기 영역에서는 증가되어 관심 샘플을 여기시키고, 시편에서는 감소되어 배경 잡음의 원인이 될 다른 샘플을 여기시킬 것이다. 또한, 웰의 베이스 (예를 들어, 센서(27-260)에 더 가까운)에 보유된 샘플로부터의 방출은 바람직하게는 센서를 향하고, 이는 샘플 웰을 통해 위로 전파되는 방출이 고도로 억제되기 때문이다. 이들 효과 둘 다는 픽셀에서의 신호-대-잡음 비를 개선시킬 수 있다. 본 발명자들은 픽셀에서의 신호-대-잡음 수준을 추가로 부스팅시키기 위해 개선될 수 있는 샘플 웰의 여러 측면들을 인식하였다. 이들 측면은 샘플 웰 형상 및 구조에 관련되고, 또한 여기 에너지를 샘플 웰 및 샘플 웰로부터 방출된 방사에 커플링시키는 것을 보조하는 인접 광학 및 플라즈몬 구조 (하기 기재됨)에도 관련된다.
일부 실시양태에 따르면, 샘플 웰(27-210)은 특정한 관심 파장에 대한 전파 모드를 지지하지 않도록 구성된 나노개구로서 형성될 수 있다. 일부 경우에, 나노개구는 모든 모드가 임계 파장 미만이도록 구성되며, 개구는 서브-컷오프 나노개구 (SCN)일 수 있다. 예를 들어, 샘플 웰(27-210)은 전도성 층에 원통형-형상의 홀 또는 구멍을 포함할 수 있다. 샘플 웰의 단면이 원형일 필요는 없고, 일부 실시양태에서 타원형, 정사각형, 직사각형, 또는 다각형일 수 있다. 도 27b에 도시된 바와 같이, 여기 에너지(27-247) (예를 들어, 가시 또는 근적외선 방사)는 웰의 제1 말단에서 샘플 웰의 벽(27-214)에 의해 규정될 수 있는 진입 개구(27-212)를 통해 샘플 웰에 진입할 수 있다. SCN으로서 형성될 때, 여기 에너지는 나노개구의 길이을 따라 (예를 들어, 시편 방향으로) 지수적으로 붕괴할 수 있다. 일부 구현에서, 도파관은 샘플로부터의 방출된 방사에 대한 SCN을 포함할 수 있지만, 여기 에너지에 대한 SCN은 아닐 수 있다. 예를 들어, 샘플 웰에 의해 형성된 개구 및 도파관은 여기 에너지에 대한 전파 모드를 지지하기에 충분히 클 수 있는데, 이는 그것이 방출된 방사보다 더 짧은 파장을 가질 수 있기 때문이다. 더 긴 파장에서의 방출은 도파관에서의 전파 모드에 대한 컷-오프 파장을 넘어설 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 샘플 웰(27-210)은 여기 에너지에 대한 SCN을 포함할 수 있고, 따라서 여기 에너지의 최대 강도는 샘플 웰(27-210)로의 진입에서 샘플 웰의 여기 영역(27-215)으로 국재화된다 (예를 들어, 도면에 도시된 바와 같이 층(27-235)과 층(27-230) 사이의 인터페이스 근처에 국재화된다). 여기 에너지의 이러한 국재화는 샘플로부터의 방출 에너지 국재화를 개선시키고, 단일 샘플 (예를 들어, 단일 분자)로부터 방출된 관측된 방출을 제한할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 픽셀(27-100)은 추가의 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 픽셀(27-100)은 샘플 웰 내의 샘플에 대한 여기 에너지의 커플링에 영향을 미치는 하나 이상의 여기-커플링 구조(27-220)를 포함할 수 있다. 픽셀은 샘플 웰 내의 샘플로부터의 방출 에너지를 센서(27-260)로 향하게 하는데 영향을 미치는 방출-지향 구조(27-250)를 또한 포함할 수 있다.
샘플 웰에 국재화되는 여기 에너지의 강도를 개선시키기 위해, 본 발명자들에 의해 다른 샘플 웰 구조가 개발 및 연구되었다. 도 27c는 샘플 웰의 여기 말단에 공동 또는 디봇(27-216)을 포함하는 샘플 웰의 실시양태를 도시한다. 샘플 웰에 디봇(27-216)을 부가하는 것은, 일부 실시양태에 따르면, 샘플이 더 높은 여기 강도의 영역으로 이동하는 것을 가능하게 한다. 일부 구현에서, 디봇의 형상 및 구조는 로컬 여기장을 변경하고 (예를 들어, 층(27-235)과 샘플 웰 내 유체 사이의 굴절률의 차이 때문), 디봇에서 여기 에너지의 강도를 추가로 증가시킬 수 있다. 디봇(27-216)은 층(27-235) 내에 형성될 수 있으며, 따라서 샘플 웰(27-214) 및 디봇(27-216)을 점유하는 샘플 체적의 일부는 층(27-216)을 형성하는 재료에 의해 둘러싸인다.
디봇은 임의의 적합한 형상을 가질 수 있다. 디봇은 샘플 웰의 가로 형상과 실질적으로 동등한 가로 형상, 예를 들어, 원형, 타원형, 정사각형, 직사각형, 다각형 등을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 디봇의 측벽은, 샘플 웰의 벽과 같이, 실질적으로 직선이고 수직일 수 있다. 일부 구현에서, 디봇의 측벽은, 도면에 도시된 바와 같이, 경사질 수 있고/거나 만곡될 수 있다. 디봇의 가로 치수는 일부 실시양태에서 샘플 웰의 가로 치수와 대략 동일한 크기일 수 있거나, 일부 실시양태에서 샘플 웰의 가로 치수보다 더 작을 수 있거나, 또는 일부 실시양태에서 샘플 웰의 가로 치수보다 더 클 수 있다. 디봇(27-216)은 샘플 웰 층(27-230)을 넘어서 대략 10 nm 내지 대략 200 nm 연장할 수 있다. 일부 구현에서, 디봇은 샘플 웰 층(27-230)을 넘어서 대략 50 nm 내지 대략 150 nm 연장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 디봇은 샘플 웰 층(27-230)을 넘어서 대략 150 nm 내지 대략 250 nm 연장할 수 있다. 디봇을 형성함으로써, 여기 영역(27-215)은, 도 27c에 도시된 바와 같이, 샘플 웰 밖으로 연장할 수 있다.
일부 실시양태는 도파관에 근접 배치된 디봇을 갖는 샘플 웰을 갖는 통합 디바이스에 관한 것이다. 도 28은 층(28-630) 및 층(28-636)에 형성된 샘플 웰(28-632)을 갖는 통합 디바이스를 보여준다. 층(28-630)은 금속 층일 수 있고, 하나 이상의 금속 (예를 들어, Al)을 포함할 수 있다. 층(28-636)은 유전 층으로서 작용할 수 있고, 하나 이상의 유전 재료 (예를 들어, 이산화규소)를 포함할 수 있다. 샘플 웰(28-632)은 층(28-630) 및/또는 층(28-636)에 평행한 방향으로 가변 치수를 가질 수 있다. 샘플 웰(28-632)은 적어도 통합 디바이스의 층(28-630) 내에서 z-방향을 따라 치수 D2를 가질 수 있고, 일부 실시양태에서 치수 D2는 샘플 웰(28-632)의 직경으로 간주될 수 있다. 샘플 웰(28-632)의 치수 D2는 대략 700 nm, 대략 800 nm, 대략 900 nm, 대략 1 마이크로미터 또는 대략 1.1 마이크로미터일 수 있다. 샘플 웰(28-632)은 통합 디바이스의 층(28-636) 내에서 z-방향을 따라 치수 D1을 가질 수 있고, 일부 실시양태에서 이는 샘플 웰(28-632)의 표면에서의 직경으로 간주될 수 있다. 치수 D1은 대략 100 nm, 대략 150 nm, 대략 200 nm, 또는 대략 250 nm일 수 있다. 치수 D1을 갖는 샘플 웰(28-632)의 표면은 도파관(28-634)으로부터 x-방향을 따라 치수 d1에 배치된다. 거리 d1만큼 도파관(28-634)에 근접하게 샘플 웰(28-632)을 배치하는 것은 도파관(28-634)으로부터 샘플 웰(28-632)로의 여기 에너지의 개선된 커플링을 허용할 수 있다. 치수 d1은 대략 50 nm, 대략 100 nm, 대략 150 nm, 대략 200 nm, 또는 대략 250 nm일 수 있다.
D. 샘플 웰로의 여기 에너지 커플링
통합 디바이스의 하나 이상의 샘플 웰에 여기 에너지를 커플링시키는 것은 하나 이상의 기술을 통해 이루어질 수 있다. 이전에 논의된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 도파관은 여기 소스를 하나 이상의 샘플 웰에 커플링시키도록 배치된다. 여기 에너지가 도파관을 따라 전파함에 따라, 여기 에너지의 일부는 다양한 광 커플링 기술을 통해 하나 이상의 샘플 웰에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 도파관은 여기 에너지를 실질적으로 한 방향으로 유도할 수 있고, 에바네센트 파 또는 꼬리가 이러한 한 방향에 대해 수직으로 형성되고, 일부 경우에 도파관 구조 외부에 위치할 수 있다. 이러한 에바네센트 꼬리는 여기 에너지의 일부를 하나 이상의 샘플 웰로 향하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 층은 여기 에너지가 샘플 웰 내의 국재화된 영역으로 향하도록 설계 및 구성될 수 있다. 샘플 웰은 여기 에너지가 샘플을 향하도록 샘플 웰의 국재화된 영역 내에 샘플을 보유하도록 구성될 수 있다.
추가적으로, 샘플 웰 내로의 여기 에너지의 커플링을 개선시키거나 증진시키기 위해 하나 이상의 컴포넌트를 통합 디바이스 내에서 형성할 수 있다. 이들 추가의 컴포넌트는 픽셀 내에 형성될 수 있고, 도파관으로부터의 여기 에너지를 픽셀로 및 샘플 웰로 커플링시키는 것을 제공할 수 있다. 픽셀에 위치한 하나 이상의 컴포넌트는 도파관으로부터의 여기 에너지의 일부를 픽셀로 탭핑하기 위해 작용할 수 있다. 이러한 컴포넌트는 격자 구조, 산란 구조, 마이크로공동 및/또는 나노-안테나와 같은 광학 구조를 포함할 수 있다. 이들 컴포넌트 중 하나 이상의 특색 또는 구성은 샘플 웰의 행 또는 열 내의 각각의 샘플 웰에 특정 양의 여기 에너지를 커플링시키기 위해 선택될 수 있다. 픽셀의 행에 여기 에너지를 제공하도록 구성된 도파관은 각각의 픽셀 영역 내의 컴포넌트에 커플링되어, 픽셀의 행의 각각의 픽셀에 여기 에너지의 일부를 제공할 수 있다. 도파관이 여기 소스로부터의 여기 에너지가 하나 이상의 픽셀로 향하도록 구성된 경우에, 도파관은 버스 도파관으로 지칭될 수 있다.
샘플 웰에 인접 배치된 컴포넌트는 도파관으로부터의 여기 에너지의 샘플 웰에의 커플링을 개선시킬 수 있다. 이러한 컴포넌트는 탭 및/또는 마이크로공동으로 불릴 수 있다. 마이크로공동은 여기 에너지가 샘플 웰에 도달하도록 도파관으로부터의 여기 에너지의 일부를 편향시킬 수 있다. 여기 에너지를 샘플 웰에 커플링시키는데 하나 이상의 마이크로공동이 사용될 수 있다. 하나 이상의 마이크로공동은 금속 손실을 포함하여 도파관으로부터의 여기 에너지의 손실을 감소시킬 수 있다. 하나 이상의 마이크로공동은 여기 에너지를 샘플 웰에 집속시키는 렌즈로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 마이크로공동은 샘플 웰 내의 마커로부터의 발광이 센서를 향하게 하는 것을 개선시킬 수 있다. 마이크로공동은 원통형, 볼록형, 오목형, 직사각형, 구형 또는 타원형 구성 또는 임의의 다른 적합한 형상을 가질 수 있다. 마이크로공동은 임의의 적절한 재료로 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마이크로공동은 질화규소를 포함할 수 있다.
하나 이상의 마이크로공동은 도파관의 적어도 일부와 오버랩되어, 샘플 웰이 존재하는 통합 디바이스의 상부에서 볼 때 샘플 웰 쪽으로 여기 에너지를 향하게 할 수 있다. 도파관의 두께는 여기 에너지의 손실을 감소시키고 하나 이상의 마이크로공동에의 여기 에너지의 커플링을 개선시키도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰의 행에 따른 마이크로공동은 각각의 샘플 웰에 대한 도파관 사이의 커플링 강도를 변화시킬 수 있다. 마이크로공동은 여기 에너지가 도파관에서 각각의 샘플 웰로 향하게 됨에 따라 도파관에서 감소된 전력을 수용하기 위해 여기 에너지의 전파 방향을 따라 커플링을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 마이크로공동은 샘플 웰에 인접해 있다. 샘플 웰 중심의 위치와 마이크로공동의 중심 사이에 오프셋 거리가 존재할 수 있다. 다른 실시양태에서, 하나의 마이크로공동이 샘플 웰 아래에 위치하여, 샘플 웰이 존재하는 통합 디바이스의 상부에서 볼 때 샘플 웰의 적어도 일부 및 마이크로공동의 일부가 오버랩된다.
통합 디바이스의 도파관의 하나 이상의 치수는 도파관을 통한 광 전파 방향으로 도파관의 길이를 따라 변할 수 있다. 도파관을 따라 하나 이상의 치수가 변하는 것은 커플링 효율 및 복수의 샘플 웰로 도파관에 의해 제공되는 여기 에너지의 양에서의 실질적인 균일성을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관의 단면 폭은 픽셀의 행 또는 열을 따라 변할 수 있다. 도파관은 도파관의 단면 폭이 도파관을 통한 여기 에너지의 전파 방향을 따라 감소하도록 테이퍼를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 테이퍼 도파관은 행 내의 픽셀들이 마이크로공동 및 샘플 웰을 포함하는 픽셀의 행에 대해 유사한 커플링 효율을 위해 구성될 수 있다. 테이퍼 도파관 및/또는 마이크로공동의 가변적인 하나 이상의 치수의 조합은 여기 에너지가 행 내 각각의 샘플 웰에 커플링됨에 따라 도파관의 길이를 따른 여기 에너지의 전력의 감소를 수용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 도파관은 에바네센트 장에 의해 샘플 웰에 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰에 근접 배치된 동심 격자 고리를 갖는 불스아이 격자 구조는 도파관으로부터의 여기 에너지의 샘플 웰에의 커플링을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 도파관은 샘플 웰 부근에서 감소된 단면 폭을 갖는 영역을 포함할 수 있어서, 도파관에서 전파하는 여기 에너지로부터의 에바네센트 장이 샘플 웰에 커플링된다. 픽셀의 행에 대해, 도파관은 행 내의 샘플 웰들 사이의 커플링 균일성 및 효율을 개선시키기 위해 도파관의 길이를 따라 감소된 단면 폭을 갖는 다수의 영역을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 도파관은 도파관을 따라 특정 위치에서 핀치 섹션을 갖는 것으로 간주될 수 있다.
하나 이상의 샘플 웰을 갖는 통합 디바이스의 층은 도파관을 통한 광의 전파를 방해할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 층은 금속 (예를 들어, 알루미늄)으로 형성된다. 손실을 감소시키고 디바이스의 성능을 개선시키기 위해 도파관으로부터 특정 거리에 샘플 웰 층을 위치시키는 것이 바람직할 수 있다. 이들 기술은 층 내의 샘플 웰이 충분한 양의 여기 에너지를 수신할 수 있게 하면서 도파관으로부터 특정 거리에 샘플 웰 층을 배치시킴으로써 목적하는 성능이 달성되도록 할 수 있다.
E. 방출 에너지의 센서로의 지향
통합 디바이스는 샘플 웰 내의 샘플로부터 센서에 의한 발광의 수집을 개선시키기 위해 픽셀의 샘플 웰과 센서 사이에 배치되는 하나 이상의 컴포넌트를 포함할 수 있다. 이러한 컴포넌트는 발광 마커의 개선된 검출을 제공하기 위해 배경 신호에 대한 발광 신호의 신호-대-잡음 비를 개선시킬 수 있다. 일부 컴포넌트는 샘플 웰로부터의 발광을 픽셀 내 상응하는 센서로 향하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴포넌트는 여기 에너지의 샘플 웰로의 적합한 커플링 및 샘플 웰로부터의 발광의 커플링 둘 다를 제공할 수 있다. 다른 컴포넌트 (예를 들어, 필터)는 여기 에너지 및 샘플 및/또는 마커와 연관되지 않은 다른 광이 센서에 의해 획득되는 신호에 기여하는 것을 감소시킬 수 있다.
불스아이 격자는 샘플 웰 주위의 동심 격자 고리로 형성될 수 있다. 불스아이 격자는 샘플 웰과 커플링하여 샘플 웰로부터의 발광 전파를 개선시킬 수 있다. 불스아이 격자 구조는 샘플 웰을 갖는 픽셀 내의 센서 쪽으로 발광을 향하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불스아이 격자에 의해 지향되는 발광의 유효 직경은 대략 5 마이크로미터이다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰로의 여기 에너지의 전파를 가능하게 하기 위해 도파관과 샘플 웰의 커플링을 위해 제공되는 하나 이상의 마이크로공동은 또한 샘플 웰로부터의 발광을 센서로 향하게 할 수 있다.
센서 중심에 위치한 틈을 갖는 배플이 샘플 웰과 센서 사이에 형성될 수 있다. 도 26에 제시된 바와 같이, 배플 층(26-226)은 샘플 웰(26-22)과 센서 층(26-230) 사이에 배치된다. 픽셀 내의 배플은 픽셀에 대한 발광 이외의 에너지의 수집을 억제하도록 설계될 수 있다. 샘플 웰 및 센서와 연관된 배플은 샘플 웰로부터의 발광이 센서에 도달하게 하는 한편, 이웃 픽셀로부터의 발광, 여기 에너지, 및 센서와 연관된 샘플 웰로부터의 발광과 연관되지 않은 다른 에너지는 감소되게 할 수 있다. 배플의 틈의 치수는 발광이 동일한 픽셀 상의 불스아이에 의해 지향되도록 구성될 수 있다. 도 26에 제시된 바와 같이, 배플(26-226)은 발광이 층(26-230)에 배치된 센서로 통과할 수 있도록 z-방향을 따라 틈을 갖는다. 배플의 재료는 특정 입사각에서의 특정 광 파장 또는 에너지의 투과를 감소시키는 것과 같은 특정 광학 특성에 대해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 굴절률을 갖는 재료의 다수의 층에 의해 배플이 형성될 수 있다. 배플은 규소, 질화규소 (Si3N4), 규소, 질화티타늄 (TiN), 및 알루미늄 (Al)의 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 배플을 형성하도록 구성된 층은 대략 20 nm, 대략 20 nm, 대략 50 nm, 대략 60 nm, 대략 70 nm, 대략 80 nm, 또는 대략 90 nm의 단면 높이를 가질 수 있다.
센서에 의한 여기 에너지의 수집을 감소시키기 위해 도파관과 센서 사이에 필터링 컴포넌트가 형성될 수 있다. 여기 에너지를 필터링하기 위한 임의의 적합한 방식이 제공될 수 있다. 여기 에너지를 필터링하기 위한 기술은 광의 하나 이상의 특징에 기초한 필터링을 포함할 수 있다. 이러한 특징은 파장 및/또는 편광을 포함할 수 있다. 필터링 컴포넌트는 발광이 센서로 통과하게 하면서 산란된 여기 에너지를 선택적으로 억제할 수 있다. 도 26에 제시된 층(26-228)은 본원에 기재된 하나 이상의 필터링 컴포넌트를 포함할 수 있다.
통합 디바이스는 하나 이상의 특징적 파장의 광을 반사시키고 상이한 특징적 파장을 갖는 광의 투과를 허용하도록 구성된 파장 필터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 파장 필터에 의해 반사된 광은 파장 필터에 의해 투과된 광보다 짧은 특징적 파장을 가질 수 있다. 이러한 파장 필터는 여기 에너지를 반사하고 발광의 투과를 허용할 수 있는데, 이는 마커를 여기시키는데 사용되는 여기 에너지는 전형적으로 여기 에너지에 의해 여기 상태에 도달하는 것에 반응하여 마커에 의해 방출되는 발광보다 짧은 특징적 파장을 갖기 때문이다.
F. 센서
시간 빈 정보를 획득할 수 있는 임의의 적합한 센서가 발광 마커의 수명을 검출하기 위한 측정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 표제 "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS"의 미국 특허 출원 14/821,656은 광자의 도달 시간을 결정할 수 있는 센서를 기재하고 있고, 이는 그 전문이 참조로 포함된다. 센서는 각각의 샘플 웰이 샘플 웰로부터의 발광을 검출하기 위한 적어도 하나의 센서 영역을 갖도록 정렬된다. 일부 실시양태에서, 통합 디바이스는 가이거(Geiger) 모드 애벌란시 포토다이오드 어레이 및/또는 단일 광자 애벌란시 다이오드 어레이 (SPAD)를 포함할 수 있다.
입사 광자의 도달 타이밍을 정확하게 측정 또는 "시간-비닝"할 수 있고, 예를 들어 핵산의 서열분석 (예를 들어, DNA 서열분석)과 같은 다양한 적용에 사용될 수 있는 통합 광검출기가 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 통합 광검출기는 나노초 또는 피코초 해상도로 광자의 도달을 측정할 수 있으며, 이는 입사 광자의 도달의 시간-도메인 분석을 용이하게 할 수 있다.
일부 실시양태는 입사 광자에 반응하여 전하 캐리어를 생성하고, 참조 시간 (예를 들어, 트리거 이벤트)과 관련하여 입사 광자의 도달에 의해 전하 캐리어가 생성되는 타이밍을 구별할 수 있는 광검출기를 갖는 집적 회로에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 전하 캐리어 분리 구조는 상이한 시간에 생성된 전하 캐리어를 분리하고, 전하 캐리어를 상이한 시간 기간 내에 생성된 전하 캐리어를 총합하는 하나 이상의 전하 캐리어 저장 영역 ("빈"으로 불림)으로 향하게 한다. 각각의 빈은 선택된 시간 간격 내에 생성된 전하 캐리어를 저장한다. 각각의 빈에 저장된 전하를 판독하는 것은 각각의 시간 간격 내에 도달한 광자의 수에 관한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 집적 회로는 본원에 기재된 것과 같은 임의의 다양한 용도에 사용될 수 있다.
광검출 영역 및 전하 캐리어 분리 구조를 갖는 집적 회로의 예가 기재될 것이다. 일부 실시양태에서, 집적 회로는 픽셀의 어레이를 포함할 수 있고, 각각의 픽셀은 하기 논의된 바와 같이, 하나 이상의 광검출 영역 및 하나 이상의 전하 캐리어 분리 구조를 포함할 수 있다.
도 29a는 일부 실시양태에 따르면, 픽셀(29-900)의 다이어그램을 보여준다. 픽셀(29-900)은 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902) (광검출 영역으로도 지칭됨), 캐리어 이동/포획 영역(29-906), 본원에서 "전하 캐리어 저장 빈" 또는 단순히 "빈"으로도 지칭되는, 하나 이상의 전하 캐리어 저장 영역을 갖는 캐리어 저장 영역(29-908), 및 전하 캐리어 저장 빈으로부터 신호를 판독하기 위한 판독 회로(29-910)를 포함한다.
광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)은 입사 광자를 광생성 전하 캐리어로 변환시킬 수 있는 반도체 재료 (예를 들어, 규소)의 영역일 수 있다. 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)은 광에 노출될 수 있고, 입사 광자를 수신할 수 있다. 광자가 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)에 의해 흡수될 때, 이는 전자/홀 쌍과 같은 광생성 전하 캐리어를 생성할 수 있다. 광생성 전하 캐리어는 또한 본원에서 단순히 "전하 캐리어"로도 지칭된다.
광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)에 전기장이 확립될 수 있다. 일부 실시양태에서, 전기장은 캐리어 이동/포획 영역(29-906)에서의 변화 전기장과 구별되는, "정적"일 수 있다. 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)에서의 전기장은 외측 컴포넌트, 수직 컴포넌트, 또는 외측 및 수직 컴포넌트 둘 다를 포함할 수 있다. 전기장의 외측 컴포넌트는 화살표로 표시된 바와 같이, 도 29a의 하향 방향일 수 있고, 이는 광생성 전하 캐리어를 캐리어 이동/포획 영역(106)으로 구동하는 힘을 광생성 전하 캐리어에 유도한다. 전기장은 다양한 방식으로 형성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 전극이 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902) 위에 형성될 수 있다. 전극(들)은 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)에서 전기장을 확립하기 위해 그에 인가되는 전압을 가질 수 있다. 이러한 전극(들)은 "포토게이트(들)"로 불릴 수 있다. 일부 실시양태에서, 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)은 전하 캐리어가 완전히 고갈된 규소의 영역일 수 있다.
일부 실시양태에서, 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)에서의 전기장은 PN 접합과 같은 접합에 의해 확립될 수 있다. 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)의 반도체 재료는 광생성 전하 캐리어를 캐리어 이동/포획 영역(29-906)으로 구동하는 힘을 광생성 전하 캐리어에 유도하는 전기장을 생성하는 배향 및/또는 형상을 갖는 PN 접합을 형성하도록 도핑될 수 있다. 일부 실시양태에서, PN 접합 다이오드의 P 단자는 그의 전압을 설정하는 단자에 연결될 수 있다. 이러한 다이오드는 "핀드" 포토다이오드로 지칭될 수 있다. 핀드 포토다이오드는 그의 전압을 설정하고 캐리어를 끌어당기는 단자로 인해, 표면에서 캐리어 재결합을 촉진할 수 있고, 이는 암전류를 감소시킬 수 있다. 포획하고자 하는 광생성 전하 캐리어는 표면의 재결합 영역 밑을 통과할 수 있다. 일부 실시양태에서, 외측 전기장은 반도체 재료에서 등급화된 도핑 농도를 사용하여 확립될 수 있다.
도 29a에 예시된 바와 같이, 광자는 포획될 수 있고 전하 캐리어(29-901A) (예를 들어, 전자)가 시간 t1에 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, (도 29a에 제시된 화살표에 의해 예시된 바와 같이) 전하 캐리어(29-901A)가 도 29a의 하향 방향으로 이동하게 하는 전위 구배가 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902) 및 캐리어 이동/포획 영역(29-906)을 따라 확립될 수 있다. 전위 구배에 반응하여, 전하 캐리어(29-901A)는 시간 t1에서의 그의 위치로부터 시간 t2에서의 제2 위치, 시간 t3에서의 제3 위치, 시간 t4에서의 제4 위치, 및 시간 t5에서의 제5 위치로 이동할 수 있다. 전하 캐리어(29-901A)는 따라서 전위 구배에 반응하여 캐리어 이동/포획 영역(29-906)으로 이동한다.
캐리어 이동/포획 영역(29-906)은 반도체 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 캐리어 이동/포획 영역(29-906)은 (예를 들어, 금속층과 같은 위에 놓이는 불투명한 재료에 의해) 입사 광으로부터 차폐될 수 있다는 점을 제외하고, 캐리어 이동/포획 영역(29-906)은 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)과 동일한 재료 (예를 들어, 규소)의 반도체 영역일 수 있다.
일부 실시양태에서, 및 이하에 추가로 논의되는 바와 같이, 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902) 및 캐리어 이동/포획 영역(29-906)에 이들 영역 위에 배치된 전극에 의해 전위 구배가 확립될 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 기술은 전위 구배를 생성하는데 사용되는 전극의 특정한 위치에 대해 제한되지 않는다. 또한 본원에 기재된 기술은 전극을 사용하여 전위 구배를 확립하는 것으로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 공간적으로 등급화된 도핑 프로파일을 사용하여 전위 구배가 확립될 수 있다. 전하 캐리어가 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902) 및 캐리어 이동/포획 영역(29-906)을 따라 이동하게 하는 전위 구배를 확립하기 위해 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다.
상이한 시간에 생성된 전하 캐리어를 분리하는 것이 가능하도록 픽셀 내에 전하 캐리어 분리 구조를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전하 캐리어 분리 구조의 적어도 일부는 캐리어 이동/포획 영역(29-906) 위에 형성될 수 있다. 하기 기재될 바와 같이, 전하 캐리어 분리 구조는 캐리어 이동/포획 영역(29-906) 위에 형성된 하나 이상의 전극을 포함할 수 있고, 그의 전압은 제어 회로에 의해 제어되어 캐리어 이동/포획 영역(29-906)에서의 전위를 변화시킬 수 있다.
캐리어 이동/포획 영역(29-906)에서의 전위는 전하 캐리어를 포획하는 것이 가능하도록 변화될 수 있다. 전위 구배는 미리 결정된 공간 영역 내에 캐리어를 국한시킬 수 있는 전위 장벽을 생성하기 위해 캐리어 이동/포획 영역(29-906) 위에 놓이는 하나 이상의 전극에 대한 전압을 변화시킴으로써 변화될 수 있다. 예를 들어, 도 29a의 캐리어 이동/포획 영역(29-906)에서 파선 위에 놓인 전극에 대한 전압은, 도 29a의 캐리어 이동/포획 영역(29-906)에서 파선을 따라 전위 장벽을 상승시키기 위해 시간 t5에 변화될 수 있고, 이에 의해 전하 캐리어(29-901A)를 포획할 수 있다. 도 29a에 제시된 바와 같이, 시간 t5에 포획된 캐리어는 캐리어 저장 영역(29-908)의 빈 "빈0"으로 전송될 수 있다. 캐리어의 전하 캐리어 저장 빈으로의 전송은 캐리어가 전하 캐리어 저장 빈으로 이동하도록 캐리어 이동/포획 영역(29-906) 및/또는 캐리어 저장 영역(29-908)에서 전위를 변화시키는 것에 의해 (예를 들어, 이들 영역 위에 놓인 전극(들)의 전압을 변화시키는 것에 의해) 수행될 수 있다.
캐리어 이동/포획 영역(29-906)의 미리 결정된 공간 영역 내에서 특정 시점에 전위를 변화시키는 것은 특정 시간 간격 내에서 발생한 광자 흡수에 의해 생성된 캐리어를 트래핑하는 것을 가능하게 할 수 있다. 상이한 시간 및/또는 위치에서 광생성 전하 캐리어를 트래핑함으로써, 광자 흡수에 의해 전하 캐리어가 생성된 시간이 구별될 수 있다. 이러한 의미에서, 전하 캐리어는 트리거 이벤트의 발생 후 특정 시점 및/또는 공간에서 전하 캐리어를 트래핑함으로써 "시간 비닝"될 수 있다. 특정한 빈 내의 전하 캐리어의 시간 비닝은 광생성 전하 캐리어가 입사 광자의 흡수에 의해 생성된 시간에 관한 정보를 제공하고, 따라서 마찬가지로 트리거 이벤트, 광생성 전하 캐리어를 생성한 입사 광자의 도달에 대하여 "시간 비닝"한다.
도 29b는 상이한 시점 및 공간에서 전하 캐리어를 포획하는 것을 예시한다. 도 29b에 제시된 바와 같이, 캐리어 이동/포획 영역(29-906)에서 파선 위에 놓인 전극에 대한 전압은 도 29b의 캐리어 이동/포획 영역(106)에서 파선을 따라 전위 장벽을 상승시키기 위해 시간 t9에 변화될 수 있고, 이에 의해 캐리어(29-901B)를 포획할 수 있다. 도 29b에 제시된 바와 같이, 시간 t9에 포획된 캐리어는 캐리어 저장 영역(29-908)의 빈 "빈1"로 전송될 수 있다. 전하 캐리어(29-901B)는 시간 t9에 트래핑되기 때문에, 이는 시간 t5에 포획된 캐리어(29-901A)에 대한 광자 흡수 이벤트 (즉, t1에)와 상이한 시간 (즉, 시간 t6)에 발생한 광자 흡수 이벤트를 나타낸다.
전하 캐리어가 포획되는 시간에 기초하여 다수의 측정을 수행하고 전하 캐리어를 캐리어 저장 영역(29-908)의 전하 캐리어 저장 빈에 총합하는 것은 광자가 광자 흡수/캐리어 생성 영역(29-902)에서 포획되는 시간에 관한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 정보는 상기 논의된 바와 같이 다양한 적용에서 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 여기 펄스 후에 각각의 시간 빈이 포획하는 시간의 지속기간은 달라질 수 있다. 예를 들어, 여기 펄스 직후에 발광을 검출하기 위해 더 짧은 시간 빈이 사용될 수 있는 반면, 여기 펄스로부터 더 먼 시간에서는 더 긴 시간 빈이 사용될 수 있다. 시간 빈 간격을 다르게 함으로써, 각각의 시간 빈과 연관된 전기 신호의 측정에 대한 신호 대 잡음 비가 주어진 센서에 대해 개선될 수 있다. 광자 방출 이벤트의 확률은 여기 펄스 직후에 더 높기 때문에, 이 시간 내의 시간 빈은 더 많은 광자가 검출될 잠재력을 고려하여 더 짧은 시간 간격을 가질 수 있다. 반면에 더 긴 시간에, 광자 방출 확률은 더 낮을 수 있고, 이 시간 내의 시간 빈 검출은 잠재적으로 더 적은 수의 광자를 고려하여 더 길 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 수명을 구별하기 위해 유의하게 더 긴 시간 기간을 갖는 시간 빈이 사용될 수 있다. 예를 들어, 대부분의 시간 빈은 대략 0.1-0.5 ns 범위의 시간 간격을 포획할 수 있는 반면에, 시간 빈은 대략 2-5 ns 범위의 시간 간격을 포획할 수 있다. 시간 빈의 수 및/또는 각각의 빈의 시간 간격은 샘플 대상으로부터 방출된 광자를 검출하는데 사용되는 센서에 의존할 수 있다. 각각의 빈에 대한 시간 간격을 결정하는 것은 샘플의 분석에 사용된 발광 마커를 구별하기 위해 센서에 의해 제공된 시간 빈의 수에 필요한 시간 간격을 식별하는 것을 포함할 수 있다. 기록된 히스토그램의 분포를 유사한 조건 하의 마커 및 시간 빈의 공지된 히스토그램과 비교하여 샘플 웰 내의 마커의 유형을 식별할 수 있다. 본 출원의 상이한 실시양태는 마커의 수명을 측정할 수 있지만, 마커를 여기시키는데 사용되는 여기 에너지, 각각의 픽셀 내의 센서 영역의 수, 및/또는 센서에 의해 검출된 파장은 다를 수 있다.
III. 여기 소스
일부 실시양태에 따르면, 하나 이상의 여기 소스가 통합 디바이스 외부에 위치할 수 있고, 샘플 웰을 갖는 통합 디바이스에 광 펄스를 전달하기 위해 배열될 수 있다. 예를 들어, 2015년 5월 20일에 출원된 표제 "PULSED LASER"의 미국 특허 가출원 62/164,485 및 2016년 3월 18일에 출원된 표제 "PULSED LASER"의 미국 특허 가출원 62/310,398은 여기 소스로서 사용될 수 있는 펄스 레이저 소스의 예를 기재하고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 광 펄스는 복수의 샘플 웰에 커플링될 수 있고, 예를 들어 웰 내의 하나 이상의 마커를 여기시키는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 여기 소스는 일부 구현에 따르면 광 펄스를 하나 이상의 특징적 파장에서 전달할 수 있다. 일부 경우에, 여기 소스는 통합 디바이스가 로딩될 수 있는 베이스 기기에 장착되거나 커플링된 교환가능한 모듈로서 패키징될 수 있다. 여기 소스로부터의 에너지는 적어도 하나의 샘플 웰에 또는 적어도 하나의 샘플 웰 내의 적어도 하나의 샘플에 방사성 또는 비방사성으로 전달될 수 있다. 일부 구현에서, 제어가능한 강도를 갖는 여기 소스가 통합 디바이스의 복수의 픽셀에 여기 에너지를 전달하도록 배열될 수 있다. 픽셀은 선형 어레이 (예를 들어, 행 또는 열)로, 또는 2D 어레이 (예를 들어, 픽셀의 어레이의 하위-영역 또는 픽셀의 전체 어레이)로 배열될 수 있다.
임의의 적합한 광원이 여기 소스로 사용될 수 있다. 일부 실시양태는 인코히런트 광원을 사용할 수 있고, 다른 실시양태는 코히런트 광원을 사용할 수 있다. 비제한적 예로서, 일부 실시양태에 따른 인코히런트 광원은 상이한 유형의 발광 다이오드 (LED), 예컨대 유기 LED (OLED), 양자점 (QLED), 나노와이어 LED 및 유기(무기) 반도체 LED를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 일부 실시양태에 따른 코히런트 광원은 상이한 유형의 레이저, 예컨대 반도체 레이저 (예를 들어, 수직 공동 표면 방출 레이저 (VCSEL), 에지 방출 레이저 및 분산-피드백 (DFB) 레이저 다이오드)를 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 슬래브-커플링된 광학 도파관 레이저 (SCOWL) 또는 다른 비대칭 단일-모드 도파관 구조가 사용될 수 있다. 일부 구현에서, 코히런트 광원은 유기 레이저, 양자점 레이저, 및 고체 상태 레이저 (예를 들어, 레이저 다이오드 또는 플래시램프에 의해 펌핑된, Nd:YAG 또는 ND:유리 레이저)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 레이저-다이오드-펌핑된 섬유 레이저가 사용될 수 있다. 코히런트 광원은 초단 펄스를 생성하기 위해 수동형 모드 로킹될 수 있다. 통합 디바이스 상의 픽셀의 어레이에 대해 하나 초과의 유형의 여기 소스가 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 유형의 여기 소스가 조합될 수 있다. 여기 소스는 선택된 유형의 여기 소스를 제작하는데 사용되는 통상적인 기술에 따라 제작될 수 있다.
서론으로 및 본 발명을 제한하지 않으면서, 코히런트 광원의 예시적인 배열이 도 30a에 도시되어 있다. 도면은 여기 소스로서 초단-펄스 레이저 여기 소스(30-110)를 포함할 수 있는 분석 기기(30-100)를 예시한다. 초단 펄스 레이저(30-110)는 이득 매질(30-105) (일부 실시양태에서 고체-상태 재료일 수 있음), 이득 매질을 여기시키기 위한 펌프 소스 (도시되지 않음), 및 광학 레이저 공동의 말단을 규정하는 적어도 2개의 공동 거울(30-102, 30-104)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 빔 형상화, 파장 선택, 및/또는 펄스 형성의 목적으로 레이저 공동 내에 하나 이상의 추가의 광학 요소가 존재할 수 있다. 작동 시, 펄스-레이저 여기 소스(30-110)는 레이저 공동 내에서 공동의 말단 거울들(30-102, 30-104) 사이 및 이득 매질(30-105)을 통해 앞뒤로 순환하는 초단 광학 펄스(30-120)를 생성할 수 있다. 공동 거울 중 하나 (30-104)는 순환 펄스의 일부를 부분적으로 전송할 수 있어서, 광학 펄스(30-122)의 열이 펄스 레이저(30-110)로부터 광학 컴포넌트 및 통합 디바이스와 같은 후속 컴포넌트(30-160)로 방출된다. 방출된 펄스는 빔 웨이스트 w를 특징으로 하는 빔 (파선으로 표시됨)을 스위핑할 수 있다. 방출된 펄스(30-122)의 측정된 시간 강도 프로파일은 도 30b에 도시된 바와 같이 나타날 수 있다. 일부 실시양태에서, 방출된 펄스의 피크 강도 값은 대략 동등할 수 있고, 프로파일은 가우시안(Gaussian) 시간 프로파일을 가질 수 있지만, 세크(sech) 프로파일과 같은 다른 프로파일이 가능할 수도 있다. 일부 경우에, 펄스는 대칭 시간 프로파일들을 갖지 않을 수 있고 다른 시간 형상을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이득 및/또는 손실 역학은 비대칭 프로파일을 갖는 펄스를 산출할 수 있다. 각각의 펄스의 지속기간은 도 30b에 도시된 바와 같이 반치전폭 (FWHM) 값에 의해 특징화될 수 있다. 초단 광학 펄스는 100 피코초 미만의 FWHM 값을 가질 수 있다.
레이저 여기 소스로부터 방출되는 펄스는 규칙적 간격 T에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, T는 레이저에서 능동 이득 및/또는 손실 변조율에 의해 결정될 수 있다. 모드-로킹된 레이저의 경우에, T는 공동 말단 거울(30-102, 30-104) 사이의 왕복 이동 시간에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 펄스 분리 시간 T는 약 1 ns 내지 약 100 ns일 수 있다. 일부 경우에, 펄스 분리 시간 T는 약 0.1 ns 내지 약 1 ns일 수 있다. 일부 구현에서, 펄스 분리 시간 T는 약 100 ns 내지 약 2 μs일 수 있다.
일부 실시양태에서, 광학 시스템(30-140)은 레이저 여기 소스(30-110)로부터의 펄스(30-122)의 빔에 대해 작동할 수 있다. 예를 들어, 광학 시스템은 빔을 재형상화하고/거나 빔의 발산을 변화시키기 위해 하나 이상의 렌즈를 포함할 수 있다. 빔을 재형성화하는 것은 빔 웨이스트의 값을 증가 또는 감소시키는 것 및/또는 빔의 단면 형상을 변화시키는 것 (예를 들어, 타원형에서 원형으로, 원형에서 타원형으로 등)을 포함할 수 있다. 빔의 발산을 변화시키는 것은 빔 플럭스를 수렴 또는 발산시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 광학 시스템(30-140)은 빔 에너지의 양을 변화시키기 위해 감쇠기 또는 증폭기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 광학 시스템은 파장 필터링 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 광학 시스템은 펄스 형상화 요소, 예를 들어 펄스 스트레쳐 및/또는 펄스 컴프레서를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 광학 시스템은 펄스 길이를 감소시키기 위한 포화가능 흡수체와 같은 하나 이상의 비선형 광학 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 광학 시스템(30-140)은 레이저 여기 소스(30-110)로부터의 펄스의 편광을 변경하는 하나 이상의 요소를 포함할 수 있다.
일부 구현에서, 광학 시스템(30-140)은 여기 소스(30-110)로부터의 출력 파장을 주파수 배가를 통해 더 짧은 파장으로 또는 파라메트릭 증폭을 통해 더 긴 파장으로 변환시키기 위한 비선형 결정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 레이저의 출력은 비선형 결정 (예를 들어, 주기적으로-분극된 리튬 니오베이트 (PPLN)) 또는 다른 비-분극된 비선형 결정에서 주파수-배가될 수 있다. 이러한 주파수-배가 처리는 보다 효율적인 레이저가 선택된 형광단의 여기에 보다 적합한 파장을 생성하는 것을 가능하게 할 수 있다.
어구 "특징적 파장" 또는 "파장"은 여기 소스에 의해 생성된 방사의 제한된 대역폭 내의 중심 또는 우세한 파장을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 여기 소스에 의해 생성된 방사의 대역폭 내의 피크 파장을 지칭할 수 있다. 여기 소스의 특징적 파장은, 예를 들어 생물분석 디바이스에 사용되는 발광 마커 또는 프로브의 선택에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 구현에서, 여기 에너지의 소스의 특징적 파장은 선택된 형광단의 직접 여기 (예를 들어, 단일 광자 여기)를 위해 선택된다. 일부 구현에서, 여기 소스의 특징적 파장은 간접 여기 (예를 들어, 다중-광자 여기 또는 직접 여기를 제공할 파장으로의 고조파 변환)를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 여기 방사는 샘플 웰에의 적용을 위해 특정한 파장에서 여기 에너지를 생성하도록 구성된 광원에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 여기 소스의 특징적 파장은 샘플로부터의 상응하는 방출의 특징적 파장보다 낮을 수 있다. 예를 들어, 여기 소스는 500 nm 내지 700 nm (예를 들어, 515 nm, 532 nm, 563 nm, 594 nm, 612 nm, 632 nm, 647 nm)의 특징적 파장을 갖는 방사를 방출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 여기 소스는 예를 들어 532 nm 및 593 nm와 같은 2개의 상이한 파장에 중심을 둔 여기 에너지를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펄스 여기 소스는 발광 마커의 방출 수명을 측정하기 위해 발광 마커를 여기시키는데 사용될 수 있다. 이는 방출 색상 또는 파장보다 방출 수명에 기초하여 발광 마커를 구별하는데 유용할 수 있다. 예로서, 펄스 여기 소스는 마커의 수명을 결정하는데 사용되는 후속 광자 방출 이벤트를 생성 및 검출하기 위해 발광 마커를 주기적으로 여기시킬 수 있다. 발광 마커의 수명 측정은 여기 소스로부터의 여기 펄스가 발광 마크의 수명보다 짧은 시간의 지속기간에 걸쳐 피크 펄스 전력 또는 강도로부터 더 낮은 (예를 들어, 거의 소멸된) 전력 또는 강도로 전이할 때 가능할 수 있다. 발광 마커의 수명이 평가되고 있을 때 여기-후 단계 동안 발광 마커를 재-여기시키지 않도록 여기 펄스가 신속하게 종료되는 것이 유익할 수 있다. 예로서 및 제한 없이, 펄스 전력은 250 피코초 후에 피크 전력보다 대략 20 dB, 대략 40 dB, 대략 80 dB, 또는 대략 120 dB 아래로 떨어질 수 있다. 일부 구현에서, 펄스 전력은 100 피코초 후에 피크 전력보다 대략 20 dB, 대략 40 dB, 대략 80 dB, 또는 대략 120 dB 아래로 떨어질 수 있다.
발광 마커를 여기시키기 위해 초단 여기 펄스를 사용하는 것의 추가의 이점은 마커의 광-표백을 감소시키는 것이다. 마커에 연속적인 여기 에너지를 가하는 것은 시간의 경과에 따라 발광 마커를 표백 및/또는 손상시킬 수 있다. 여기 소스의 피크 펄스 전력이 연속 노출에서 마커를 급격하게 손상시키는 수준보다 상당히 더 높을 수 있을지라도, 초단 펄스의 사용은 여기 에너지에 의해 마커가 손상되기 시작하기 전 시간의 양 및 유용한 측정의 수를 증가시킬 수 있다.
발광 마커의 수명을 확인하기 위해 펄스 여기 소스를 사용할 때, 여기 에너지의 펄스들 사이의 시간은 각각의 여기 펄스 후에 방출 이벤트를 관측하고 평가하기 위해 마커의 최장 수명만큼 길거나 그보다 길 수 있다. 예를 들어, 여기 펄스들 사이의 시간 간격 T (도 30b 참조)는 검사되는 형광단의 임의의 방출 수명보다 길 수 있다. 이 경우에, 후속 펄스는 이전 펄스로부터 여기된 형광단이 형광을 발하는데 합리적인 시간의 양을 갖기 전에 도달하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 간격 T는 여기 펄스의 종료 후 및 다음 여기 펄스 전에 형광단을 여기시키는 여기 펄스와 형광단에 의해 방출된 후속 광자 사이의 시간을 결정할 수 있을 만큼 충분히 길 필요가 있다.
여기 펄스들 사이의 간격 T는 형광단의 붕괴 특성을 관측할 수 있을 만큼 충분히 길어야 하지만, 또한 T는 단기간 내에 많은 측정이 이루어지는 것이 가능하도록 충분히 짧은 것이 바람직하다. 예로서 제한 없이, 일부 적용에 사용되는 형광단의 방출 수명은 약 100 피코초 내지 약 10 나노초 범위일 수 있다. 따라서, 이러한 수명을 검출 및/또는 확인하는데 사용되는 여기 펄스는 약 25 피코초 내지 약 2 나노초 범위의 지속시간 (FWHM)을 가질 수 있고, 약 20 MHz 내지 약 1 GHz 범위의 펄스 반복율로 제공될 수 있다.
추가의 세부사항에서, 수명 측정을 위해 펄스 여기 소스를 생성하기 위해 여기 에너지를 변조하기 위한 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 레이저와 같은 여기 소스의 직접 변조는 방출된 전력이 펄스의 형태가 되도록 여기 소스의 전기적 구동 신호를 변조하는 것을 수반할 수 있다. 광학 펌핑 전력을 포함하는 광원에 대한 입력 전력, 및 이득 영역의 일부로부터의 여기-상태 캐리어 주입 및/또는 캐리어 제거를 이득 매질의 이득에 영향을 미치도록 변조하여, 동적 이득 형상화를 통해 여기 에너지의 펄스의 형성을 가능하게 할 수 있다. 추가적으로, 광학 공명기의 품질 (Q) 인자는 Q-스위칭 기술을 사용하여 펄스를 형성하기 위한 다양한 수단에 의해 변조될 수 있다. 이러한 Q-스위칭 기술은 능동적 및/또는 수동적일 수 있다. 레이저의 공명 공동의 종방향 모드는 모드-로킹을 통해 방출된 광의 일련의 펄스를 생성하기 위해 위상-로킹될 수 있다. 이러한 모드-로킹 기술은 능동적 및/또는 수동적일 수 있다. 레이저 공동은 별도의 흡수 섹션을 포함하여 캐리어 밀도의 변조 및 그러한 섹션의 흡수 손실의 제어를 가능하게 함으로써, 여기 펄스를 형상화하기 위한 추가의 메카니즘을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 광학 변조기는 연속파 (CW) 광의 빔을 여기 에너지의 펄스의 형태가 되도록 변조하는데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 여기 소스에 커플링된 음향 광학 변조기 (AOM)에 전송된 신호는 출력된 광의 편향, 강도, 주파수, 위상 및/또는 편광을 변화시켜 펄스 여기 에너지를 생성하는데 사용될 수 있다. AOM은 또한 연속파 빔 스캐닝, Q-스위칭 및/또는 모드-로킹에 사용될 수 있다. 상기 기술은 펄스 여기 소스를 생성하기 위해 기재되었지만, 펄스 여기 소스를 생성하기 위한 임의의 적합한 방법이 발광 마커의 수명을 측정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 수명 측정에 적합한 펄스 여기 소스를 형성하기 위한 기술은 광자 방출을 구동하는 입력 전기 신호의 변조를 포함할 수 있다. 일부 여기 소스 (예를 들어, 다이오드 레이저 및 LED)는 입력 전류와 같은 전기 신호를 광 신호로 변환한다. 광 신호의 특징은 전기 신호의 특징에 의존할 수 있다. 펄스 광 신호를 생성할 때, 전기 신호는 가변 광 신호를 생성하기 위해 시간의 경과에 따라 달라질 수 있다. 특정 파형을 갖도록 전기 신호를 변조하는 것은 특정 파형을 갖는 광학 신호를 생성할 수 있다. 전기 신호는 특정 주파수를 갖는 정현파 파형을 가질 수 있고, 생성되는 광 펄스는 주파수와 관련된 시간 간격 내에 발생할 수 있다. 예를 들어, 500 MHz 주파수를 갖는 전기 신호는 2 나노초마다 펄스를 갖는 광 신호를 생성할 수 있다. 서로 유사하거나 상이함에 관계없이, 별개의 펄스 여기 소스에 의해 생성된 조합된 빔은 1 mm 미만의 상대 경로 차이를 가질 수 있다.
레이저 다이오드와 같은 일부 여기 소스에서, 전기 신호는 캐리어 밀도를 변화시키고 전자 및 홀 쌍의 재결합을 통해 광자가 생성된다. 캐리어 밀도가 임계를 초과할 때, 유의한 수의 코히런트 광자가 자극된 방출을 통해 생성되도록 캐리어 밀도는 광 신호와 관련된다. 레이저 다이오드에 공급되는 전류는 전자 또는 캐리어를 디바이스에 주입하여, 캐리어 밀도를 증가시킬 수 있다. 캐리어 밀도가 임계를 초과할 때, 광자는 캐리어를 공급하는 전류보다 빠른 속도로 생성될 수 있고, 따라서 캐리어 밀도는 임계 미만으로 감소할 수 있고 광자 생성이 감소된다. 광자 생성이 감소됨에 따라, 캐리어 밀도는 계속적인 전류 주입 및 광자의 흡수로 인해 다시 증가하기 시작하고, 결국 다시 임계를 초과하여 증가한다. 이러한 사이클은 광자 생성을 위한 임계 값 주위의 캐리어 밀도의 진동으로 이어져, 진동 광 신호를 발생시킨다. 이완 진동으로 공지된 이러한 역학은 캐리어 밀도의 진동으로 인해 광 신호에 아티팩트를 야기할 수 있다. 전류가 처음에 레이저에 공급될 때, 캐리어 밀도에서의 진동으로 인해 광 신호가 안정된 전력에 도달하기 전에 진동이 있을 수 있다. 펄스 여기 소스를 형성할 때, 캐리어 밀도의 진동은 펄스 광 신호에 대한 아티팩트를 도입할 수 있다. 이러한 이완 진동으로부터의 아티팩트는 여기 신호가 발광 마커에 의해 방출된 광자와 오버랩될 수 있기 때문에 펄스 광 신호를 확장하고/거나 광 신호에서 테일을 생성하여 이러한 펄스 광원에 의해 검출될 수 있는 수명을 제한할 수 있다.
일부 실시양태에서, 여기 펄스의 시간 기간을 단축시키는 기술은 발광 마커를 검출하는데 필요한 여기 에너지를 감소시켜 발광 마커에 대한 표백 및 다른 손상을 감소 또는 지연시키는데 사용될 수 있다. 여기 펄스의 시간 기간을 단축시키는 기술은 여기 펄스의 최대 값 또는 피크 이후의 여기 에너지의 전력 및/또는 강도를 감소시켜 더 짧은 수명의 검출을 가능하게 하는데 사용될 수 있다. 이러한 기술은 피크 전력 후에 여기 전력을 감소시키기 위해 여기 소스를 전기적으로 구동할 수 있다. 전기 구동 신호는 피크 펄스 후 가능한 한 빨리 여기 에너지의 펄스 강도를 0으로 구동하도록 조정될 수 있다. 이러한 기술은 피크 전력이 생성된 후 전기 구동 신호의 부호를 반전시키는 것을 수반할 수 있다. 전기 신호는 광학 신호의 제1 이완 진동 또는 제1 진동 후에 캐리어 밀도를 신속하게 감소시키도록 조정될 수 있다. 제1 진동 후에 캐리어 밀도를 감소시킴으로써, 단지 제1 진동의 광 펄스가 생성될 수 있다. 전기 신호는 신호의 피크 후에 방출된 광자의 수를 감소시킴으로써 광 신호를 신속하게 턴 오프하는 짧은 펄스를 생성하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에 따라, 피코초 레이저 다이오드 시스템이 광 펄스를 방출하도록 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반도체 포화가능 흡수체 (SESAM)를 포함한 포화가능 흡수체가 광학 테일을 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 포화가능 흡수체를 사용하는 것은 광학 테일을 3-5 dB만큼, 또는 일부 경우에, 5 dB를 초과하여 억제할 수 있다. 여기 펄스에서 테일의 효과를 감소시키는 것은 여기 에너지의 추가의 필터링에 대한 임의의 요건을 감소 및/또는 제거하고/거나, 측정될 수 있는 수명의 범위를 증가시키고/거나, 더 빠른 펄스 속도를 가능하게 할 수 있다. 여기 펄스 속도를 증가시키는 것은 주어진 시간에 더 많은 실험이 수행되는 것을 가능하게 할 수 있고, 이는 샘플 대상을 표지하는 마커에 대한 수명을 식별하기에 충분한 통계를 획득하는데 필요한 시간을 감소시킬 수 있다.
추가적으로, 이들 기술 중 두 가지 이상을 함께 사용하여 펄스 여기 에너지를 생성할 수 있다. 예를 들어, 직접 변조된 소스로부터 방출된 펄스 여기 에너지는 광학 변조 기술을 사용하여 추가로 변형될 수 있다. 여기 펄스를 변조하고 전기 펄스 구동 신호를 조정하는 기술은 수명 측정을 수행하기 위한 펄스 여기 에너지를 최적화하기 위해 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 조정된 전기 구동 신호는 직접 변조된 소스로부터의 펄스 여기 에너지에 인가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 특정 수의 와이어 본드를 갖는 레이저 다이오드가 펄스 여기 소스로서 사용될 수 있다. 더 많은 와이어 본드를 갖는 레이저 다이오드는 여기 소스의 인덕턴스를 감소시킬 수 있다. 더 낮은 인덕턴스를 갖는 레이저 다이오드는 레이저로의 전류가 더 높은 주파수에서 작동하는 것을 가능하게 할 수 있다. 인덕턴스를 최소화하기 위해 패키징 방법을 선택하는 것은 더 높은 주파수에서 여기 소스에 공급되는 전력을 개선시킬 수 있고, 이는 더 짧은 여기 펄스, 피크 후 광학 전력의 더 빠른 감소, 및/또는 발광 마커 검출을 위한 증가된 펄스 반복율을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 여기 소스와 조합된 전송 라인이 광 펄스를 생성하는데 사용될 수 있다. 전송 라인은 광 펄스의 성능 및/또는 품질을 개선시키기 위해 레이저 다이오드의 임피던스와 매칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전송 라인 임피던스는 50 옴일 수 있다. 일부 경우에, 종단 저항은 반사를 피하기 위해 라인의 저항과 유사할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 종단 임피던스는 반사를 피하기 위해 라인의 임피던스와 유사할 수 있다. 종단 임피던스는 음의 펄스를 반영하기 위해 라인의 임피던스보다 작을 수 있다. 다른 실시양태에서, 종단 임피던스는 음의 반사 펄스의 형상을 제어하기 위해 용량성 또는 유도성 컴포넌트를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 전송 라인은 더 높은 주파수의 펄스를 허용할 수 있다. 전송 라인을 사용하는 것은 40 MHz 내지 500 MHz 범위 내의 주파수를 갖는 전기 펄스를 생성할 수 있다. 특정 시간 기간 및 특정 시간 간격을 갖는 광 펄스를 갖는 펄스 광원을 생성하기 위해 전송 라인은 상기 기재된 조정된 전기 신호와 조합하여 사용될 수 있다.
광 펄스의 생성을 개선시키기 위해 전기 신호를 조정하는 기술은 음의 바이어스 능력을 갖는 회로에 여기 소스를 연결하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 광 펄스에서 테일의 방출을 감소시키기 위해 광 펄스가 방출한 후 여기 소스에 음의 바이어스가 제공될 수 있다. 예시적인 회로는 광 펄스에서 테일의 존재를 감소시키기 위해 구현될 수 있는 전류원, 다이오드 레이저, 저항기, 커패시터, 및 스위치를 포함할 수 있다. 이러한 회로는 스위치가 닫히거나 전도 상태에 있을 때 다이오드 레이저를 바이패스하는 일정한 전류를 생성할 수 있다. 스위치가 열릴 때, 스위치는 높은 저항을 가질 수 있고 다이오드 레이저를 통해 전류가 흐를 수 있다. 다이오드 레이저에 간헐적인 전류를 제공하기 위해 스위치를 열고 닫음으로써 광 펄스가 생성될 수 있다. 일부 경우에, 스위치가 열리고 다이오드 레이저가 광을 방출할 때 커패시터 양단에 전압이 존재하도록 저항기는 충분히 높을 수 있고 커패시터는 충분히 작을 수 있다. 스위치가 닫힐 때, 커패시터 양단의 전압은 다이오드 레이저를 역방향 바이어싱할 것이다. 이러한 역방향 바이어스는 광 펄스에서 테일의 존재를 감소시키거나 제거할 수 있다. 이러한 경우에, 스위치는 피크 광 펄스 직후에 레이저 전력을 감소시키기 위해 광 펄스의 피크 후 닫히도록 구성될 수 있다. 회로 내의 저항기의 값은 스위치가 후속해서 열리고/거나 후속 광 펄스가 레이저 다이오드에 의해 생성되기 전에 커패시터 상의 전하가 방전되도록 선택될 수 있다.
광 펄스를 생성하기 위해 레이저 다이오드의 전기 신호를 조정하기 위해 추가의 회로 컴포넌트가 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 커패시터, 저항기, 및 전압이 레이저 다이오드에 공급되는 전기 신호의 파형을 제어하기 위해 네트워크 회로로서 연결될 수 있다. 제어된 파형은 N개의 커패시터 서브-회로가 있을 때 상응하는 신호 S1, S2, ..., SN으로 다수의 전압 V1, V2, ..., VN을 스위칭함으로써 제어된 파형이 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 광 펄스를 생성하기 위한 전기 신호는 무선 주파수 (RF) 및/또는 마이크로파 컴포넌트를 포함한 개별 컴포넌트를 갖는 회로를 사용할 수 있다. 이러한 회로에 포함될 수 있는 개별 컴포넌트는 DC 블록, 어댑터, 로직 게이트, 터미네이터, 위상 시프터, 지연기, 감쇠기, 조합기 및/또는 RF 증폭기이다. 이러한 컴포넌트는 특정 진폭을 갖는 양의 전기 신호에 이어 또 다른 진폭을 갖는 음의 전기 신호를 생성하는데 사용될 수 있다. 양의 전기 신호와 음의 전기 신호 사이에 지연이 있을 수 있다. 다른 실시양태에서, 회로는 여기 소스를 구동하도록 구성된 전기 펄스 신호를 형성하도록 조합된 다수의 전기 신호를 생성할 수 있다. 이러한 회로는 광 펄스의 전력을 증가시키는데 사용될 수 있는 차동 출력을 생성할 수 있다. 회로의 개별 컴포넌트를 조정함으로써, 전기 출력 신호는 수명 측정에 적합한 광 펄스를 생성하도록 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 여기 소스는 수명 측정을 위한 광 펄스를 생성하기 위해 조합될 수 있다. 동기화된 펄스 소스가 특정 거리에 걸쳐 회로 또는 부하에 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 여기 소스는 회로에 병렬로 커플링될 수 있다. 여기 소스는 동일한 소스로부터 유래한 것이거나 다수의 소스로부터 유래한 것일 수 있다. 다수의 소스를 갖는 일부 실시양태에서, 다수의 소스는 여기 소스의 유형에서 다를 수 있다. 소스를 조합할 때, 여기 소스에 충분한 전력이 공급되게 하기 위해 회로 및 여기 소스의 임피던스를 고려하는 것이 중요할 수 있다. 소스의 조합은 펄스 여기 소스를 생성하기 위한 상기-기재된 기술 중 하나 이상을 사용함으로써 달성될 수 있다.
여기 소스는 여기 소스에 전력을 제공하도록 배열된 배터리 또는 임의의 다른 전원 공급장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 여기 소스는 베이스 기기에 위치할 수 있고, 그의 작동 전력은 (예를 들어, 전도성 전력 리드를 통해) 그에 커플링되는 통합 생물분석 디바이스를 통해 수신될 수 있다. 여기 소스는 통합 생물분석 디바이스의 제어와 독립적으로 또는 그와 협력하여 제어될 수 있다. 단지 하나의 예로서, 여기 소스에 대한 제어 신호는 무선으로 또는 퍼스널 컴퓨터 및/또는 통합 생물분석 디바이스와의 유선 상호연결 (예를 들어, USB 상호연결)을 통해 또는 여기 소스에 제공될 수 있다.
일부 구현에서, 여기 소스는 통합 디바이스의 1개 이상의 센서와 시간-게이팅 및/또는 동기화된 방식으로 작동될 수 있다. 예를 들어, 여기 소스를 턴 온하여 발광 마커를 여기시킨 다음 턴 오프할 수 있다. 센서는 여기 소스가 턴 온된 동안 턴 오프될 수 있으며, 그 후 여기 소스가 턴 오프된 후에 샘플링 간격 동안 턴 온될 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서는 여기 소스가 턴 온된 동안 샘플링 간격 동안 턴 온될 수 있다.
IV. 통합 디바이스 및 여기 소스에 의한 예시적인 측정
샘플에서 분자를 검출, 분석 및/또는 프로빙하기 위한 측정은 본 출원에 기재된 통합 디바이스 또는 통합 디바이스 및 여기 소스의 임의의 조합을 사용하여 수득될 수 있다. 여기 소스는 펄스 여기 소스 또는, 일부 경우에, 연속파 소스일 수 있다. 특정 샘플에 태그부착된 발광 마커는 샘플의 존재를 나타낼 수 있다. 발광 마커는 여기 에너지, 발광 방출 파장, 및/또는 마커에 의해 방출된 방출 에너지의 수명에 의해 구별될 수 있다. 유사한 발광 방출 파장을 갖는 마커는 각각의 마커의 수명을 결정함으로써 식별될 수 있다. 추가적으로, 유사한 수명을 갖는 마커는 각각의 마커에 대한 발광 방출 파장에 의해 식별될 수 있다. 방출된 발광의 시간적 및/또는 스펙트럼 특성의 조합에 의해 마커가 식별되는 마커를 사용함으로써, 마커 및 연관 샘플의 정량 분석 및/또는 식별이 수행될 수 있다.
수명 측정은 마커가 샘플 웰에 존재하는지 결정하는데 사용될 수 있다. 발광 마커의 수명은 발광 마커가 여기 상태로 여기되고 그 후 광자가 방출되는 시간이 측정되는 다수의 실험을 수행함으로써 식별될 수 있다. 여기 소스는 여기 에너지의 펄스를 생성하기 위해 펄스되고 마커로 향하게 된다. 여기 펄스와 발광 마커로부터의 후속 광자 방출 이벤트 사이의 시간이 측정된다. 복수의 여기 펄스로 이러한 실험을 반복함으로써, 특정한 시간 간격 내에서 광자가 방출하는 경우의 수가 결정될 수 있다. 이러한 결과는 일련의 이산 시간 간격 또는 시간 빈 내에서 발생하는 광자 방출 이벤트의 수를 나타내는 히스토그램을 채울 수 있다. 수명 및/또는 마커의 특정한 세트를 식별하기 위해 시간 빈의 수 및/또는 각각의 빈의 시간 간격이 조정될 수 있다.
다음은 일부 실시양태에서 발광 마커를 식별하기 위해 수행될 수 있는 예시적인 측정에 대한 설명이다. 구체적으로, 발광 수명 측정만, 연합 스펙트럼 및 발광 수명 측정, 및 발광 수명 측정만을 사용하지만, 2개의 상이한 여기 에너지를 사용하여 발광 마커를 구별하는 예가 논의된다. 실시양태는 하기 상술된 예로 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태는 스펙트럼 측정만을 사용하여 발광 마커를 식별할 수 있다.
임의의 적합한 발광 마커가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상업적으로 입수가능한 형광단이 사용될 수 있다. 예로서 제한 없이, 하기 형광단이 사용될 수 있다: Atto Rho14 ("ATRho14"), 딜라이트® 650 ("D650"), 세타™Tau 647 ("ST647"), CF™ 633 ("C633"), CF™ 647 ("C647"), 알렉사 플루오르® 647 ("AF647"), 바디피® 630/650 ("B630"), CF™ 640R ("C640R") 및/또는 Atto 647N ("AT647N").
추가적으로 및/또는 임의적으로, 발광 마커는 샘플 분석 프로세스의 속도 및 정확도를 증가시키기 위해 임의의 적합한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 광안정화제가 발광 마커에 접합될 수 있다. 광안정화제의 예는 산소 스캐빈저 또는 삼중항-상태 켄처를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 발광 마커에 광안정화제를 접합하는 것은 방출된 광자의 속도를 증가시킬 수 있고, 또한 발광 마커가 광자를 방출하지 않는 "블링킹" 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 이벤트가 밀리초 규모로 발생할 때, 광자 방출의 증가된 속도는 생물학적 이벤트의 검출의 확률을 증가시킬 수 있다. 광자 이벤트의 증가된 속도는 후속하여 발광 신호의 신호-대-잡음 비를 증가시킬 수 있고, 수명 측정이 이루어지는 속도를 증가시킬 수 있어서, 더 빠르고 더 정확한 샘플 분석에 이르게 된다.
또한, 통합 디바이스의 샘플 웰 내의 환경은 필요에 따라 마커의 수명을 조작하기 위해 조정될 수 있다. 이것은 마커의 수명이 환경을 사용하여 조정될 수 있는 마커의 상태 밀도에 의해 영향을 받는다는 것을 인식함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 마커가 샘플 웰의 저부 금속 층에서 멀어질수록 수명이 길어진다. 따라서, 마커의 수명을 증가시키기 위해, 디봇과 같은 샘플 웰의 저부 표면의 깊이는 금속 층으로부터 특정 거리만큼 연장될 수 있다. 또한, 샘플 웰을 형성하는데 사용되는 재료가 마커의 수명에 영향을 미칠 수 있다. 상이한 마커는 전형적으로 그의 수명이 동일한 방향으로 시프트되지만 (예를 들어, 더 길거나 더 짧은), 그 영향은 상이한 마커에 대해 상이하게 척도화될 수 있다. 따라서, 자유-공간에서 수명 측정을 통해 구별될 수 없는 2개의 마커는 다양한 마커의 수명을 조정하기 위해 샘플 웰 환경을 제작함으로써 구별 가능하도록 조작될 수 있다.
A. 수명 측정
샘플 웰 내의 마커를 여기하기 위해 하나의 여기 에너지 파장을 사용하여 수명 측정을 수행할 수 있다. 별개의 수명을 갖는 마커의 조합이 수명 측정에 기초하여 개별 마커를 구별하기 위해 선택된다. 추가적으로, 마커의 조합은 사용된 여기 소스에 의해 조명될 때 여기 상태에 도달할 수 있다. 하나의 여기를 사용하여 수명 측정을 위해 구성된 통합 디바이스는 각각의 샘플 웰이 동일한 도파관과 커플링하도록 구성된 행을 따라 배치된 다수의 픽셀을 포함할 수 있다. 픽셀은 샘플 웰 및 센서를 포함한다. 하나 이상의 마이크로공동 또는 불스아이 격자가 도파관을 각각의 픽셀에 대한 샘플 웰에 커플링시키는데 사용될 수 있다.
펄스 여기 소스는 상기 기재된 기술을 사용하는 펄스 여기 소스 중 하나일 수 있다. 일부 경우에, 펄스 여기 소스는 레이저 다이오드의 직접 변조된 전기 펌핑을 통해 펄스를 방출하도록 구성된 반도체 레이저 다이오드일 수 있다. 펄스의 전력은 피크 후 대략 250 피코초에 펄스 피크 전력의 20 dB 미만이다. 각각의 여기 펄스에 대한 시간 간격은 20-200 피코초 범위이다. 각각의 여기 펄스 사이의 시간 기간은 1-50 나노초 범위이다. 예시적인 측정을 수행할 수 있는 방법의 개략도가 도 31a에 제시된다. 하나의 여기 에너지가 사용되기 때문에, 센서로의 여기 에너지의 전송을 감소시키는데 적합한 여기 필터가 상기 논의된 파장 여기 필터와 같이 통합 디바이스 내에 형성될 수 있다.
각각의 픽셀에 대한 센서는 픽셀당 적어도 하나의 감광성 영역을 갖는다. 광자는 그것이 센서에 도달한 때의 시간 간격 내에서 검출된다. 시간 빈의 수를 증가시키는 것은 일련의 시간 빈에서 수집된 광자의 기록된 히스토그램의 해상도를 개선시킬 수 있고, 상이한 발광 마커 사이의 차별화를 개선시킬 수 있다. 센서가 특정한 파장을 검출하도록 구성된 경우에, 4개의 발광 마커는 특정한 파장과 유사한 발광을 방출할 수 있다. 대안적으로, 4개의 발광 마커는 상이한 파장에서 발광을 방출할 수 있다.
수명 측정에 기초하여 구별가능한 4개의 발광 마커의 예시적인 세트는 도 31b의 플롯에 의해 제시된 바와 같은 ATRho14, Cy®5, AT647N, 및 CF™633이다. 이들 4개의 마커는 다양한 수명을 갖고, 적어도 4개의 시간 빈이 사용될 때 구별되는 히스토그램을 생성한다. 도 31c는 16개의 시간 빈에 걸친 이들 마커 각각에 대한 신호 프로파일을 약술한다. 신호 프로파일은 각각의 마커에 대해 정규화된다. 시간 빈은 각각의 마커에 대해 고유 신호 프로파일을 제공하기 위해 시간 간격이 다르다. 도 32a 및 32b는 수명 측정에 기초하여 구별가능한 마커의 또 다른 예시적인 세트, ATTO Rho14, D650, ST647, 및 CF™633 각각의 연속 및 이산 신호 프로파일 둘 다를 도시한다. 마커의 다른 세트는 ATTO Rho14, C647, ST647, CF™633; 알렉사 플루오르® 647, B630, C640R, CF™633; 및 ATTO Rho14, ATTO 647N, 알렉사플루오르647, CF™633을 포함한다.
B. 스펙트럼 - 수명 측정
수명 측정은 1종 이상의 발광 마커의 스펙트럼 측정과 조합될 수 있다. 스펙트럼 측정은 개별 마커에 대한 발광의 파장에 의존할 수 있고, 픽셀당 적어도 2개의 센서 영역을 사용하여 포획된다. 통합 디바이스의 예시적인 구조는 각각의 영역이 상이한 파장을 검출하도록 구성된 2개의 별개의 영역을 갖는 센서를 각각 갖는 픽셀을 포함한다. 다중-파장 필터는 각각의 센서 영역에 상이한 파장의 광을 선택적으로 전송하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 센서 영역 및 필터 조합은 적색 광을 검출하도록 구성될 수 있고, 또 다른 센서 영역 및 필터 조합은 녹색 광을 검출하도록 구성될 수 있다.
수명 측정과 스펙트럼 측정 둘 다를 조합하는 것은 샘플 웰 내의 마커를 여기하기 위해 하나의 여기 에너지 파장을 사용하여 수행될 수 있다. 적어도 2개의 별개의 발광 파장을 갖는 마커의 조합이 선택되며, 수명 및 스펙트럼 측정에 기초하여 개별 마커를 구별하기 위해 상이한 수명을 갖는, 파장에서 방출하는 마커가 선택된다. 추가적으로, 마커의 조합은 사용된 여기 소스에 의해 조명될 때 여기 상태에 도달할 수 있도록 선택된다.
여기 소스는 펄스 여기 소스이고, 상기 기재된 기술을 사용하는 여기 소스 중 하나일 수 있다. 일부 경우에, 펄스 여기 소스는 레이저 다이오드의 직접 변조된 전기 펌핑을 통해 펄스를 방출하도록 구성된 반도체 레이저 다이오드일 수 있다. 펄스의 전력은 피크 후 250 피코초 후에 피크 전력의 20 dB 미만이다. 각각의 여기 펄스에 대한 시간 기간은 20-200 피코초 범위이다. 각각의 여기 펄스 사이의 시간 간격은 1-50 나노초 범위이다. 예시적인 측정을 수행할 수 있는 방법의 개략도가 도 33a에 제시된다. 하나의 여기 에너지가 사용되기 때문에, 센서로의 여기 에너지의 전송을 감소시키는데 적합한 여기 필터가 사용될 수 있다.
각각의 픽셀에 대한 센서는 픽셀당 적어도 2개의 감광성 영역을 갖는다. 일부 실시양태에서, 픽셀당 2개의 감광성 영역이 존재한다. 다른 실시양태에서, 픽셀당 4개의 감광성 영역이 존재한다. 각각의 감광성 영역은 상이한 파장 또는 파장 범위를 검출하도록 구성된다. 광자는 그것이 센서에 도달한 때의 시간 간격 내에서 검출된다. 시간 빈의 수를 증가시키는 것은 일련의 시간 빈에서 수집된 광자의 기록된 히스토그램의 해상도를 개선시킬 수 있고, 그의 개별 수명에 의해 상이한 발광 마커 사이의 차별화를 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서의 영역당 2개의 시간 빈이 존재한다. 다른 실시양태에서, 센서의 영역당 4개의 시간 빈이 존재한다.
수명 측정에 기초하여 구별될 수 있는 4개의 발광 마커의 예시적인 세트는 ATTO Rho14, AS635, 알렉사 플루오르® 647, 및 ATTO 647N이다. 이들 4개의 마커는 하나의 유사한 파장 및 또 다른 유사한 파장에서 방출하는 2개를 갖는다. 유사한 파장에서 방출하는 마커의 각각의 쌍 내에서, 마커의 쌍은 상이한 수명을 갖고, 적어도 4개의 시간 빈이 사용될 때 구별되는 히스토그램을 생성한다. 이러한 예에서 ATTO Rho14 및 AS635는 유사한 발광 파장을 방출하고 별개의 수명을 갖는다. 알렉사 플루오르® 647 및 ATTO 647N은 ATTO Rho 14 및 AS635에 의해 방출되는 파장과 상이한, 유사한 발광 파장을 방출하고, 별개의 수명을 갖는다. 도 33b는 이러한 마커 세트에 대한 방출 파장의 함수로서의 플롯 수명을 제시하여, 이들 마커 각각이 수명 및 방출 파장의 조합에 기초하여 어떻게 구별가능한지 예시한다. 도 34a는 ATT Rho14, 알렉사 플루오르® 647, 및 ATT) 647N에 대한 파장의 함수로서의 전력 플롯을 제시한다. 도 34b는 135 nm의 직경을 갖는 샘플 웰에 존재할 때 이들 마커 중 각각 하나에 대한 시간의 경과에 따른 형광 신호의 플롯을 제시한다. 도 35a는 4개의 감광성 영역에 걸친 이들 마커에 대한 신호 프로파일을 예시하고, 각각의 영역은 4개의 시간 빈을 포획한다. 신호 프로파일은 정규화되며, 이는 4개의 시간 빈 각각에 대해 감광성 영역에 의해 포획된 상대적인 광자 수에 따라 상이한 마커를 구별하는데 사용된다. 이러한 스펙트럼-수명 측정을 위한 4개의 형광단의 다른 세트는 ATRho14, D650, ST647, CF™633; ATTO Rho14, C647, ST647, CF™633; 알렉사 플루오르® 647, B630, C640R, CF™633; 및 ATTO Rho 14, ATTO 647N, 알렉사 플루오르® 647, CF™633이다. 도 35b는 ATRho14, D650, ST647, 및 C633에 대한 시간의 경과에 따른 강도의 신호 프로파일의 플롯을 제시한다. 도 35c는 ATRho14에 대한 신호 프로파일을 예시한다.
C. 수명-여기 에너지 측정
적어도 2개의 여기 에너지 파장의 사용과 조합된 수명 측정을 사용하여 다수의 마커를 구별할 수 있다. 하나의 여기 파장이 사용되고 또 다른 파장이 사용되지 않을 때 일부 마커가 여기될 수 있다. 별개의 수명을 갖는 마커의 조합은 수명 측정에 기초하여 개별 마커를 구별하기 위해 각각의 여기 파장에 대해 선택된다. 이러한 실시양태에서, 통합 디바이스는 하나의 영역을 갖는 센서를 갖는 각각의 픽셀을 갖도록 구성될 수 있고, 외부 여기 소스는 시간 인터리빙을 갖는 전기적으로 변조된 펄스 다이오드 레이저로 2개의 여기 에너지 파장을 제공하도록 구성될 수 있다.
여기 소스는 적어도 2개의 여기 에너지의 조합이다. 여기 소스는 펄스 여기 소스이고, 상기 기재된 기술을 사용하는 여기 소스 중 하나 이상일 수 있다. 일부 경우에, 펄스 여기 소스는 레이저 다이오드의 직접 변조된 전기 펌핑을 통해 펄스를 방출하도록 구성된 2개의 반도체 레이저 다이오드일 수 있다. 펄스의 전력은 피크 후 250 피코초에 펄스 피크 전력보다 20 dB 낮다. 각각의 여기 펄스에 대한 시간 간격은 20-200 피코초 범위이다. 각각의 여기 펄스 사이의 시간 간격은 1-50 나노초 범위이다. 펄스당 하나의 여기 파장이 방출되며, 여기 파장을 알면 별개의 수명을 갖는 마커의 하위세트가 고유하게 식별된다. 일부 실시양태에서, 여기 펄스는 상이한 파장 사이에서 교대한다. 예를 들어, 2개의 여기 파장이 사용될 때 후속 펄스는 하나의 파장과 다른 파장 사이에서 교대한다. 예시적인 측정을 수행할 수 있는 방법의 개략도가 도 36a에 제시된다. 다수의 여기 소스를 조합하고, 상이한 파장을 갖는 펄스를 인터리빙하기 위한 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 하나 초과의 여기 파장의 펄스를 샘플 웰의 행에 전달하기 위한 일부 기술의 예가 본원에 예시되고 기재된다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰의 행당 단일 도파관이 존재하고, 여기 에너지의 펄스가 2개의 여기 파장 사이에서 교대하도록 조합된 2개의 여기 소스가 존재한다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰의 행당 2개의 도파관이 존재하고, 각각의 도파관은 2개의 여기 파장 중 하나를 운반하도록 구성된다. 다른 실시양태에서, 픽셀의 행당 단일 도파관이 존재하고, 하나의 파장은 도파관의 하나의 말단에 커플링되고, 또 다른 파장은 다른 말단에 커플링된다.
각각의 픽셀에 대한 센서는 픽셀당 적어도 하나의 감광성 영역을 갖는다. 감광성 영역은 5 마이크로미터 x 5 마이크로미터의 치수를 가질 수 있다. 광자는 그것이 센서에 도달한 때의 시간 간격 내에서 검출된다. 시간 빈의 수를 증가시키는 것은 일련의 시간 빈에서 수집된 광자의 기록된 히스토그램의 해상도를 개선시킬 수 있고, 상이한 발광 마커 사이의 차별화를 개선시킬 수 있다. 센서는 적어도 2개의 시간 빈을 갖는다.
수명 측정에 기초하여 구별가능한 4개의 발광 마커의 예시적인 세트는 알렉사 플루오르® 546, Cy®3B, 알렉사 플루오르® 647, 및 ATTO 647N이다. 도 36b에 제시된 바와 같이, 알렉사 플루오르® 546 및 Cy®3B는 532 nm와 같은 하나의 파장에서 여기되고, 별개의 수명을 갖는다. 알렉사 플루오르® 647 및 ATTO 647N은 또 다른 파장 640 nm에서 여기되며, 도 37a에 제시된 바와 같이 별개의 수명을 갖는다. 둘 다 640 nm에서 여기된, ATTO647N 및 CF™633에 대한 16개의 시간 빈에 걸친 구별가능한 정규화된 신호 프로파일이 도 37b에 제시된다. 공지된 여기 파장 후에 광자를 검출함으로써, 이들 2개의 쌍의 마커 중 하나는 이전의 여기 파장에 기초하여 결정될 수 있고, 쌍에 대한 각각의 마커는 수명 측정에 기초하여 식별된다.
등가물 및 범주
본 출원의 다양한 측면이 단독으로, 조합하여, 또는 상기 기재된 실시양태에서 구체적으로 논의되지 않은 다양한 배열로 사용될 수 있고, 따라서 그의 적용은 상기 설명에 제시되거나 도면에 예시된 컴포넌트의 세부설명 및 배열로 제한되지 않는다. 예를 들어, 한 실시양태에 기재된 측면은 다른 실시양태에 기재된 측면과 임의의 방식으로 조합될 수 있다.
또한, 본 발명은 방법으로 구현될 수 있고, 그 중 적어도 하나의 예가 제공된다. 방법의 부분으로서 수행되는 동작은 임의의 적합한 방식으로 순서화될 수 있다. 따라서, 동작이 예시된 것과 상이한 순서로 수행되는 실시양태가 구축될 수 있으며, 예시적 실시양태에서 순차적 동작으로서 제시됨에도 불구하고, 일부 작동을 동시에 수행하는 것을 포함할 수 있다.
청구항에서 "제1," "제2," "제3" 등과 같은 서수 용어를 사용하여 청구항 요소를 수식하는 것은 그 자체에 의해 한 청구항 요소의 또 다른 청구항 요소에 대한 임의의 우선순위, 우위 또는 순서, 또는 방법을 수행하는 동작에서의 시간적 순서를 내포하는 것이 아니라, 단지 특정 명칭을 갖는 하나의 청구항 요소를 (서수 용어 사용을 제외하고는) 동일한 명칭을 갖는 또 다른 요소와 구별하여 청구항 요소를 구별하기 위한 라벨로서만 사용된다.
또한, 본원에 사용된 어구 및 용어는 기재를 위한 것이고, 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다. 본원에서 "포함한", "포함하는" 또는 "갖는", "함유하는", "수반하는" 및 그의 변형의 사용은 이전에 열거된 항목 및 그의 등가물, 뿐만 아니라 추가의 항목을 포괄하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Quantum-Si Incorporated <120> METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING <130> R0708.70011WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 14/821,688 <151> 2015-08-07 <150> US 62/164,482 <151> 2015-05-20 <150> US 62/164,506 <151> 2015-05-20 <150> US 62/164,464 <151> 2015-05-20 <150> US 62/164,485 <151> 2015-05-20 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 aacccacccc ccaaacacaa cataatctct aatcacaaca accaacacca acaccaccaa 60 acaaacatat ctctctcaac aaacacaacc accccaacac aaacacatac ctctccaaca 120 acaacaaacc acacactaaa acacacacat acatctctca acaacaacaa cccaacacca 180 ccaaaaaaca caatatctct tctcacaaca acaaacccca atcaaaaaaa acacacatat 240 tctctctcaa caa 253 <210> 2 <211> 266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 aacccaccac caccaaaaca cacacatatc tctctcaaca acaacaaccc accaccacca 60 aaacacacac atatctctct caacaacaac aacccaccac caccaaaaca cacacatatc 120 tctctcaaca acaacaaccc accaccacca aaacacacac atatctctct caacaacaac 180 aacccaccac caccaaaaca cacacatatc tctctcaaca acaacaaccc accaccacca 240 aaacacacac atatctctct caacaa 266 <210> 3 <211> 219 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 acaccaacaa taaaaaaaaa aaacctctcc aaacacaaca caaaaaaaaa aaaaaatact 60 cccaacaaca aacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atatctctca caacaacaac 120 aaaaaaaaaa aaaaatatcc ctctcaacac acaacaataa aaaaaaaaaa tctcctcaca 180 acaaaacaaa aaaaaaaaaa aaaaaatttc tctaaacac 219 <210> 4 <211> 263 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatatctctc tcaacaacaa caacaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaatat ctctctcaac aacaacaaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatatctctc 120 tcaacaacaa caacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatat ctctctcaac aacaacaaca 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatatctctc tcaacaacaa caacaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaatat ctctctcaac aac 263 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 tccgtacgac 10 <210> 6 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 6 Met Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser 1 5 10 15 Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr 20 25 30 Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg 35 40 45 Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp 50 55 60 Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr 65 70 75 80 Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln 85 90 95 Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr 100 105 110 Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 Glu Glu Glu Glu Glu Glu 130 <210> 7 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 7 Met Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Ala Gln Leu Gly Asp 1 5 10 15 Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr 20 25 30 Glu Ala Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg 35 40 45 Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp 50 55 60 Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr 65 70 75 80 Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln 85 90 95 Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr 100 105 110 Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 8 aaaatataat aataattaaa aaaaaataaa aaaattaaaa aattttttta aaaaaaaaaa 60 taaaaaaata aaaaaatttt taaaaaaaaa aaatatttta aaaaattaaa aaaaaaaatt 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atatttaaaa aaaaaaaaaa ataaaaatta aaaaaaaaat 180 aaaaaatatt ttattt 196 <210> 9 <211> 194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 9 aaaaaaaaaa aatattttaa aaaaaaaaaa aaaaaaatat tttaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aatattttaa aaaaaaaaaa aaaaaaatat tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aatattttaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaatat tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aatattttaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaatat ttta 194 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 10 Leu Cys Thr Pro Ser Arg Gly Ser Leu Phe Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 11 Asp Ser Leu Glu Phe Ile Ala Ser Lys Leu Ala 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 12 Val Leu Asp Ser Leu Glu Phe Ile Ala Ser Lys Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 13 Gly Ser Gln Asp Val Leu Asp Ser Leu Glu Phe Ile Ala Ser Lys Leu 1 5 10 15 Ala <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 14 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 15 Cys Val Ile Ala 1 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 16 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 17 Gly Phe Glu Ile Asp Lys Val Trp Tyr Asp Leu Asp Ala 1 5 10

Claims (86)

  1. 단일 분자의 발광 수명 및 임의로 발광 강도를 결정하는 것을 포함하는, 샘플에서 단일 분자를 식별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단일 분자의 발광 수명 및 발광 강도 둘 다를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플에 하나 이상의 여기 에너지의 일련의 펄스를 전달하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플로부터 복수의 방출된 광자를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플로부터의 복수의 방출된 광자 각각에 대해 방출된 광자의 검출과 이전에 전달된 여기 에너지 사이의 시간 기간을 기록하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 식별하는 것이 단일 분자를 복수의 가능한 유형의 분자 중 하나의 유형으로서 식별하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 복수의 가능한 유형의 분자가 4종의 유형의 분자를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 4종의 유형의 분자가 4종의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 4종의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 아데닌을 포함하는 제1 뉴클레오티드, 구아닌을 포함하는 제2 뉴클레오티드, 시토신을 포함하는 제3 뉴클레오티드, 및 티민 또는 우라실을 포함하는 제4 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 단일 분자가 핵산에 혼입된 발광 표지된 뉴클레오티드인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 단일 분자를 식별하기 위해 반복되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 일련의 단일 분자가 프라이머를 포함하는 핵산에 순차적으로 혼입된 일련의 발광 표지된 뉴클레오티드인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 프라이머를 포함하는 핵산에 순차적으로 혼입된 발광 표지된 뉴클레오티드의 서열을 분석함으로써 주형 핵산의 서열을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 펄스 각각이 단일 여기 에너지를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 펄스의 제1 부분이 제1 여기 에너지를 포함하고, 복수의 펄스의 제2 부분이 제2 여기 에너지를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 펄스가 약 10 MHz 내지 약 100 MHz 또는 약 100 MHz 내지 약 1 GHz의 평균 주파수로 전달되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 주파수가 약 50 MHz 내지 약 200 MHz인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 식별된 각각의 단일 분자에 대해, 검출된 방출된 광자의 수가 약 10 내지 약 100개, 또는 약 100 내지 약 1,000개인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 식별된 각각의 단일 분자가 고체 지지체 상에 고정된 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 고체 지지체가 샘플 웰의 저부 표면을 포함하는 것인 방법.
  21. (i) 주형 핵산, 프라이머, 및 중합 효소를 포함하는 표적 체적 내의 복합체를, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드에 노출시키는 단계이며, 여기서 각각의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명 및/또는 발광 강도를 갖는 것인 단계;
    (ii) 하나 이상의 여기 에너지의 일련의 펄스를 표적 체적 부근으로 향하게 하는 단계;
    (iii) 프라이머를 포함하는 핵산에의 순차적 혼입 동안 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 복수의 방출된 광자를 검출하는 단계; 및
    (iv) 방출된 광자의 타이밍 및 임의로 주파수를 결정함으로써 혼입된 뉴클레오티드의 서열을 식별하는 단계
    를 포함하는, 주형 핵산의 서열을 결정하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 검출하는 단계가 각각의 검출된 방출된 광자에 대해 방출된 광자의 검출과 여기 에너지의 이전 펄스 사이의 시간 기간을 기록하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 각각의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 단일 여기 에너지에 의해 조명된 후 광자를 방출하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 단일 여기 에너지가 약 470 내지 약 510 nm, 약 510 내지 약 550 nm, 약 550 내지 약 580 nm, 약 580 nm 내지 약 620 nm, 또는 약 620 nm 내지 약 670 nm의 스펙트럼 범위 내인 것인 방법.
  25. 제21항 또는 제22항에 있어서, 하나 이상의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 제1 여기 에너지에 의해 조명된 후 광자를 방출하고, 하나 이상의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 제2 여기 에너지에 의해 조명된 후 광자를 방출하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 제1 여기 에너지가 약 470 nm 내지 약 510 nm, 약 510 내지 약 550 nm, 약 550 내지 약 580 nm, 약 580 nm 내지 약 620 nm, 또는 약 620 nm 내지 약 670 nm의 스펙트럼 범위 내이고, 제2 여기 에너지가 약 470 내지 약 510 nm, 약 510 내지 약 550 nm, 약 550 내지 약 580 nm, 약 580 nm 내지 약 620 nm, 또는 약 620 nm 내지 약 670 nm의 스펙트럼 범위 내인 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 제1 여기 에너지가 약 520 내지 약 550 nm의 스펙트럼 범위 내이고, 제2 여기 에너지가 약 550 내지 약 580 nm의 스펙트럼 범위 내인 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 제1 여기 에너지가 약 520 내지 약 550 nm의 스펙트럼 범위 내이고, 제2 여기 에너지가 약 580 내지 약 620 nm의 스펙트럼 범위 내인 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 제1 여기 에너지가 약 520 내지 약 550 nm의 스펙트럼 범위 내이고, 제2 여기 에너지가 약 560 내지 약 670 nm의 스펙트럼 범위 내인 것인 방법.
  30. 제26항에 있어서, 제1 여기 에너지가 약 550 내지 약 580 nm의 스펙트럼 범위 내이고, 제2 여기 에너지가 약 580 내지 약 620 nm의 스펙트럼 범위 내인 것인 방법.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 단일 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출하는 것인 방법.
  32. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 제1 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출하고, 하나 이상의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 제2 스펙트럼 범위 내에서 광자를 방출하는 것인 방법.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 유형, 적어도 2개의 유형, 적어도 3개의 유형, 또는 적어도 4개의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각이 6-TAMRA, 5/6-카르복시로다민 6G, 알렉사 플루오르(Alex Fluor) 546, 알렉사 플루오르® 555, 알렉사 플루오르® 568, 알렉사 플루오르® 610, 알렉사 플루오르® 647, 아베리어 스타 635, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 647N, ATTO Rho14, 크로미스 630, 크로미스 654A, 크로메오(Chromeo)™ 642, CF™514, CF™532, CF™543, CF™546, CF™546, CF™555, CF™568, CF™633, CF™640R, CF™660C, CF™660R, CF™680R, Cy®3, Cy®3B, Cy®3.5, Cy®5, Cy®5.5, 디오믹스-530, 디오믹스-547P1, 디오믹스-549P1, 디오믹스-550, 디오믹스-554, 디오믹스-555, 디오믹스-556, 디오믹스-560, 디오믹스-650, 디오믹스-680, 딜라이트(DyLight)® 554-R1, 딜라이트® 530-R2, 딜라이트® 594, 딜라이트® 635-B2, 딜라이트® 650, 딜라이트® 655-B4, 딜라이트® 675-B2, 딜라이트® 675-B4, 딜라이트® 680, 하이라이트(HiLyte)™ 플루오르 532, 하이라이트™ 플루오르 555, 하이라이트™ 플루오르 594, 라이트사이클러(LightCycler)® 640R, 세타(Seta)™ 555, 세타™ 670, 세타™700, 세타™u 647, 및 세타™u 665로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 표지를 포함하거나, 또는 하기 화학식 (염료 101), (염료 102), (염료 103), (염료 104), (염료 105), 또는 (염료 106)을 갖는 것인 방법:
    Figure pct00037

    Figure pct00038

    여기서 각각의 술포네이트 또는 카르복실레이트는 독립적으로 임의로 양성자화된다.
  34. 제33항에 있어서, 적어도 1개의 유형, 적어도 2개의 유형, 적어도 3개의 유형, 또는 적어도 4개의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각이 알렉사 플루오르® 532, 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, 알렉사 플루오르® 594, 알렉사 플루오르® 610, CF™532, CF™543, CF™555, CF™594, Cy®3, 딜라이트® 530-R2, 딜라이트® 554-R1, 딜라이트® 590-R2, 딜라이트® 594, 딜라이트® 610-B1로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 표지를 포함하거나, 또는 화학식 (염료 101), (염료 102), (염료 103), (염료 104), (염료 105), 또는 (염료 106)을 갖는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 적어도 1개의 유형, 적어도 2개의 유형, 적어도 3개의 유형, 또는 적어도 4개의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각이 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, Cy®3B, Cy®3.5, 딜라이트® 554-R1, 알렉사 플루오르® 546, Atto Rho6G, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO Rho6G, 및 ATTO 542로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 염료를 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 546을 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 2개의 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 555 및 Cy®3.5를 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 Cy®3.5를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 546을 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 딜라이트® 554-R1을 포함하는 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 Cy®3.5를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 ATTO Rho6G를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 딜라이트® 554-R1을 포함하는 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 ATTO Rho6G를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 딜라이트® 554-R1을 포함하는 것인 방법.
  40. 제35항에 있어서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 ATTO 542를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 딜라이트® 554-R1을 포함하는 것인 방법.
  41. 제35항에 있어서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 555를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 ATTO 542를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 546을 포함하는 것인 방법.
  42. 제35항에 있어서, 제1 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 Cy®3.5를 포함하고, 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 Cy®3B를 포함하고, 제3 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 ATTO Rho6G를 포함하고, 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 딜라이트® 554-R1을 포함하는 것인 방법.
  43. 제33항에 있어서, 제1 및 제2 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각이 알렉사 플루오르® 532, 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, CF™532, CF™543, CF™555, Cy®3, 딜라이트® 530-R2, 딜라이트® 554-R1로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 표지를 포함하고, 제3 및 제4 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각이 알렉사 플루오르® 594, 알렉사 플루오르® 610, CF™594, 딜라이트® 590-R2, 딜라이트® 594, 딜라이트® 610-B1로 이루어진 군으로부터 선택된 발광 표지를 포함하거나, 또는 화학식 (염료 101), (염료 102), (염료 103), (염료 104), (염료 105), 또는 (염료 106)을 갖는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 제1 유형의 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 546을 포함하고, 제2 유형의 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르 555를 포함하는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 제1 유형의 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 546을 포함하고, 제2 유형의 뉴클레오티드가 CF™555를 포함하는 것인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 제1 유형의 뉴클레오티드가 딜라이트® 530-R2를 포함하고, 제2 유형의 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르 555를 포함하는 것인 방법.
  47. 제43항에 있어서, 제1 유형의 뉴클레오티드가 딜라이트® 530-R2를 포함하고, 제2 유형의 뉴클레오티드가 딜라이트® 530-R2 및 CF™555를 포함하는 것인 방법.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유형의 뉴클레오티드가 딜라이트® 610-B1을 포함하고, 제4 유형의 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 594, CF™594 또는 딜라이트®594를 포함하는 것인 방법.
  49. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유형의 뉴클레오티드가 Cy®3.5를 포함하고, 제4 유형의 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 594, CF™594 또는 딜라이트®594를 포함하는 것인 방법.
  50. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유형의 뉴클레오티드가 화학식 (염료 101)의 뉴클레오티드를 포함하고, 제4 유형의 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 594, CF™594 또는 딜라이트®594를 포함하는 것인 방법.
  51. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유형의 뉴클레오티드가 화학식 (염료 102)의 뉴클레오티드를 포함하고, 제4 유형의 뉴클레오티드가 알렉사 플루오르® 594, CF™594 또는 딜라이트®594를 포함하는 것인 방법.
  52. 제21항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 펄스가 약 10 MHz 내지 약 100 MHz 또는 약 100 MHz 내지 약 1 GHz의 평균 주파수로 전달되는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 평균 주파수가 약 50 MHz 내지 약 200 MHz인 방법.
  54. 제21항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 혼입된 발광 표지된 뉴클레오티드에 대해, 검출된 방출된 광자의 수가 약 10 내지 약 100개, 또는 약 100 내지 약 1,000개인 방법.
  55. 제21항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 DNA 폴리머라제를 포함하는 것인 방법.
  56. 제21항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체가 고체 지지체 상에 고정된 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 복합체가 비오틴, 스트렙타비딘, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 그의 조합을 포함한 부착에 의해 고정된 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 고체 지지체가 샘플 웰의 저부 표면인 방법.
  59. 제21항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 복합체가 표적 체적 내에 국한된 것인 방법.
  60. 제21항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 아데닌을 포함하는 제1 뉴클레오티드, 구아닌을 포함하는 제2 뉴클레오티드, 시토신을 포함하는 제3 뉴클레오티드, 및 티민 또는 우라실을 포함하는 제4 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  61. 제21항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 데옥시아데노신을 포함하는 제1 뉴클레오티드, 데옥시구아노신을 포함하는 제2 뉴클레오티드, 데옥시시티딘을 포함하는 제3 뉴클레오티드, 및 데옥시티미딘을 포함하는 제4 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  62. 제21항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각이, 약 100 내지 약 200 nm의 샘플 웰에서 측정 시, 약 0.1 ns 내지 약 2 ns의 발광 수명을 갖는 것인 방법.
  63. 제21항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 2종이 상기 뉴클레오티드의 발광 수명을 결정함으로써 식별되는 것인 방법.
  64. 제21항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 3종이 상기 뉴클레오티드의 발광 수명을 결정함으로써 식별되는 것인 방법.
  65. 제21항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 4종이 상기 뉴클레오티드의 발광 수명을 결정함으로써 식별되는 것인 방법.
  66. 제21항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 2종이 상기 뉴클레오티드의 발광 수명 및 발광 강도를 결정함으로써 식별되는 것인 방법.
  67. 제21항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 3종이 상기 뉴클레오티드의 발광 수명 및 발광 강도를 결정함으로써 식별되는 것인 방법.
  68. 제21항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 중 적어도 4종이 상기 뉴클레오티드의 발광 수명 및 발광 강도를 결정함으로써 식별되는 것인 방법.
  69. 제21항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드 각각이 링커에 의해 연결된 발광 표지 및 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 링커가 발광 표지 및 중합 효소 사이의 상호작용의 정도를 최소화하는 보호 분자를 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 보호 분자가 단백질을 포함하는 것인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 보호 분자가 핵산을 포함하는 것인 방법.
  73. 제49항에 있어서, 하나 이상의 여기 에너지의 일련의 펄스를 표적 체적 부근으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  74. (i) 주형 핵산, 프라이머, 및 중합 효소를 포함하는 표적 체적 내의 복합체를, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드에 노출시키는 단계이며, 여기서 각각의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드는 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖는 것인 단계;
    (ii) 하나 이상의 여기 에너지의 일련의 펄스를 표적 체적 부근으로 향하게 하는 단계;
    (iii) 프라이머를 포함하는 핵산에 혼입된 발광 뉴클레오티드로부터 복수의 방출된 광자를 검출하는 단계; 및
    (iv) 혼입된 발광 표지된 뉴클레오티드에 대해 발광 수명 및 임의로 발광 강도, 또는 둘 다를 식별함으로써 혼입된 뉴클레오티드를 식별하는 단계
    를 포함하는, 주형 핵산의 뉴클레오티드를 식별하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 하나 이상의 여기 에너지의 일련의 펄스를 표적 체적 부근으로 전달하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  76. 복수의 나노개구이며, 사용 동안, 복수의 나노개구의 각각의 표적 체적은 (i) 각각 핵산, 프라이머, 및 중합 효소를 포함하는 복수의 복합체 중 적어도 하나, 및 (ii) 각각의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드가 상이한 발광 수명 또는 발광 강도를 갖는, 복수의 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 포함하는 것인 복수의 나노개구;
    하나 이상의 여기 에너지의 펄스를 각각의 표적 체적 부근으로 제공하도록 구성된 하나 이상의 여기 소스;
    복수의 나노개구의 각각으로부터 방출된 광자를 검출하도록 구성된 복수의 센서; 및
    복수의 센서에 작동가능하게 커플링된 하나 이상의 컴퓨터 프로세서이며, 여기서 하나 이상의 컴퓨터 프로세서는 방출된 광자의 타이밍 및 임의로 주파수를 결정함으로써 핵산에 혼입된 뉴클레오티드의 서열을 식별하도록 개별적으로 또는 집합적으로 프로그래밍된 것인 하나 이상의 컴퓨터 프로세서
    를 포함하는, 핵산 서열분석을 위한 시스템.
  77. (i) (a) 표적 핵산, (b) 상기 표적 핵산에 상보적인 프라이머, (c) 중합 효소, 및 (d) 상기 표적 핵산에 상보적인 신장 핵산 가닥에의 혼입을 위한 뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계이며, 여기서 상기 뉴클레오티드는 상이한 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 발광 표지된 뉴클레오티드는 상기 신장 핵산 가닥에의 순차적인 혼입 동안 검출가능한 신호를 생성하고, 상기 상이한 유형의 발광 표지된 뉴클레오티드에 대한 검출가능한 신호는 검출가능한 신호의 타이밍 및/또는 주파수를 결정함으로써 서로 차별화가능한 것인 단계;
    (ii) 상기 (i)의 혼합물을 상기 프라이머의 연장에 의해 상기 신장 핵산 가닥을 생성하는데 충분한 조건 하에 중합 반응에 적용하는 단계;
    (iii) 상기 신장 핵산 가닥에의 순차적 혼입 동안 상기 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 상기 검출가능한 신호를 측정하는 단계; 및
    (iv) 상기 신장 핵산 가닥에의 순차적 혼입 시 상기 발광 표지된 뉴클레오티드로부터 상기 측정된 검출가능한 신호의 타이밍 및/또는 주파수를 결정하여 상기 신장 핵산 가닥에의 상기 발광 표지된 뉴클레오티드의 혼입의 시간 순서를 식별함으로써, 상기 표적 핵산의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 표적 핵산을 서열분석하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 표적 핵산 분자 또는 상기 중합 효소가 지지체에 부착된 것인 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 혼입의 시간 순서가 상기 (i)의 혼합물을 상기 중합 반응에 적용하는 단계에 후속하여 식별되는 것인 방법.
  80. 제77항에 있어서, 상기 검출가능한 신호가 광학 신호인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 광학 신호가 발광 신호인 방법.
  82. 제77항에 있어서, 상기 측정된 검출가능한 신호의 타이밍 및/또는 주파수를 결정하는 단계가 (i) 1개 이상의 센서에서 상기 검출가능한 신호를 수신하는 것, 및 (ii) 상기 1개 이상의 센서에 수신된 상기 검출가능한 신호에 반응하여 생성된 복수의 전하 캐리어의 전하 캐리어를, 상기 전하 캐리어가 생성된 시간에 기초하여 적어도 하나의 전하 캐리어 저장 영역으로 선택적으로 향하게 하는 것을 포함하는 것인 방법.
  83. 제77항에 있어서, 상기 측정된 검출가능한 신호의 상기 타이밍 및/또는 주파수가 붕괴 수명의 측정을 포함하는 것인 방법.
  84. 제77항에 있어서, 상기 측정된 검출가능한 신호의 상기 타이밍 및/또는 주파수가 상기 검출가능한 신호를 검출하는 1개 이상의 센서에서의 상기 검출가능한 신호의 도달 시간의 측정을 포함하는 것인 방법.
  85. 제82항에 있어서, 상기 검출가능한 신호에 의해 생성된 전하 캐리어를 상기 검출가능한 신호의 상기 도달 시간에 기초하여 상기 하나 이상 센서와 연관된 빈으로 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  86. 제77항에 있어서, 상기 측정된 검출가능한 신호의 상기 타이밍 및/또는 주파수가 비-스펙트럼 측정인 방법.
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2021007934A (es) 2014-08-08 2023-01-17 Quantum Si Inc Dispositivo integrado para el depósito temporal de fotones recibidos.
CR20180288A (es) 2015-10-25 2018-09-11 Us Health Proteínas de union triespecíficas y/o trivalentes para la prevención o el tratamiento de la infección por vih
US10441174B2 (en) 2016-02-17 2019-10-15 Tesseract Health, Inc. Sensor and device for lifetime imaging and detection applications
MY192090A (en) 2016-04-13 2022-07-26 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins
EP4141416A3 (en) * 2016-12-16 2023-06-07 Quantum-si Incorporated Integrated device and method of forming the same
TWI836905B (zh) 2016-12-22 2024-03-21 美商寬騰矽公司 具有直接合併像素之整合式光電偵測器
WO2018204810A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Quantum-Si Incorporated Substrates having modified surface reactivity and antifouling properties in biological reactions
CN110945395B (zh) * 2017-05-19 2023-01-17 哥本哈根大学 相干单光子源
EP3845902B1 (en) * 2017-06-23 2022-09-14 NanoTemper Technologies GmbH Methods for measuring inter- and/or intra-molecular interactions
WO2019023146A1 (en) * 2017-07-24 2019-01-31 Quantum-Si Incorporated PHOTONIC STRUCTURES WITH OPTICAL RELEASE
CN111148850A (zh) * 2017-07-24 2020-05-12 宽腾矽公司 高强度经标记的反应物组合物及用于测序的方法
US11162138B2 (en) 2017-10-30 2021-11-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Multi-amplitude modular labeled compounds
KR20210022688A (ko) 2018-06-22 2021-03-03 퀀텀-에스아이 인코포레이티드 가변 검출 시간의 전하 저장 빈을 갖는 집적 광검출기
WO2020010589A1 (en) * 2018-07-12 2020-01-16 Shenzhen Genorivision Technology Co., Ltd. An apparatus for biopolymer sequencing
MX2021002414A (es) * 2018-08-29 2021-04-28 Quantum Si Inc Sistema y metodos para la deteccion de vida util usando fotodetectores de conteo de fotones.
JP7428701B2 (ja) * 2018-08-29 2024-02-06 クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド サンプルウェル作製技法および集積センサデバイス用の構造
CN111333605B (zh) * 2018-12-18 2022-07-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶ⅸ荧光探针
WO2020142643A1 (en) * 2019-01-03 2020-07-09 Quantum-Si Incorporated Optical waveguides and couplers for delivering light to an array of photonic elements
CA3127102A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Quantum-Si Incorporated High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
CN110066723A (zh) * 2019-05-05 2019-07-30 京东方科技集团股份有限公司 基因测序芯片、设备、制造方法
JP2022551523A (ja) 2019-10-11 2022-12-09 クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド 気相における表面修飾
WO2021146473A1 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Quantum-Si Incorporated Integrated sensor for lifetime characterization
AU2021208557A1 (en) 2020-01-14 2022-09-01 Quantum-Si Incorporated Sensor for lifetime plus spectral characterization
EP4111178A1 (en) 2020-03-02 2023-01-04 Quantum-si Incorporated Integrated sensor for multi-dimensional signal analysis
US20210318238A1 (en) 2020-04-08 2021-10-14 Quantum-Si Incorporated Integrated sensor with reduced skew
GB2599729A (en) * 2020-10-12 2022-04-13 Sumitomo Chemical Co Method comprising light emitting marker
EP4356135A1 (en) * 2021-06-17 2024-04-24 Roche Diagnostics GmbH Thermostable affinity polypeptides
WO2023275738A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Method and device for performing spectrally and temporally resolved spectroscopy of single photon emission in a quantum device
EP4397673A1 (en) 2021-08-31 2024-07-10 FUJIFILM Corporation Compound and labeled biomaterial using same
US20230184678A1 (en) * 2021-12-14 2023-06-15 Quantum-Si Incorporated Methods for loading and data acquisition

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2119126C (en) * 1991-09-16 1996-09-03 Stephen T. Yue Dimers of unsymmetrical cyanine dyes
US5597696A (en) * 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
SE506700C2 (sv) * 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
JP3690271B2 (ja) * 2000-11-29 2005-08-31 株式会社島津製作所 核酸の塩基配列決定のためのマトリックス値を得る方法
DE60235376D1 (de) 2001-08-29 2010-04-01 Ge Healthcare Bio Sciences Markierte nukleosidpolyphosphate
JP2007033159A (ja) * 2005-07-25 2007-02-08 Assay Corp 蛍光分子で標識された測定対象物質
JP2010066212A (ja) * 2008-09-12 2010-03-25 Univ Of Tokyo 測定装置及び観察対象の測定方法
US9670243B2 (en) * 2010-06-02 2017-06-06 Industrial Technology Research Institute Compositions and methods for sequencing nucleic acids
JP5928906B2 (ja) * 2013-08-27 2016-06-01 横河電機株式会社 核酸配列計測方法、核酸配列計測用デバイス、核酸配列計測用デバイスの製造方法および核酸配列計測装置

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