ES2908748T3 - Métodos para medir interacciones inter- y/o intramoleculares - Google Patents

Abstract

Un método para medir interacciones entre partículas marcadas y ligandos que comprende las etapas: a) proporcionar una muestra que comprende partículas marcadas y ligandos en una solución, en donde las partículas marcadas están disueltas o dispersas en la solución o están inmovilizadas en un soporte sólido; b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una temperatura predeterminada; c) repetir las etapas (a) y (b) múltiples veces a diferentes concentraciones de los ligandos en la solución; y d) determinar la interacción entre las partículas marcadas y los ligandos basados en el cambio dependiente de la concentración de ligando de la fluorescencia de las partículas marcadas, en donde la etapa (b) comprende las siguientes etapas: b1) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una primera temperatura predeterminada; b2) calentar o enfriar la solución a una segunda temperatura predeterminada; b3) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a la segunda temperatura predeterminada; en donde las partículas marcadas están marcadas con uno o más colorantes seleccionados del grupo que consiste en colorantes representados por las fórmulas generales (I), (IIa), (IIb) o (III): **(Ver fórmula)** en donde X1 es O, S o CR5R6; X2 es O, S o CR7R8; R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y grupos alquilo que pueden estar sustituidos; R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos, grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos; con la condición de que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH2-; a es un número entero de 0 a 4; b es un número entero de 0 a 4; y n es un número entero de 1 a 3, preferiblemente 1 o 2; **(Ver fórmula)** en donde uno de X3 y X4 es NR9 y el otro de X3 y X4 es O, S o CR13R14; R9 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, y grupos alquilo que pueden estar sustituidos; R10, R11, R12, R13 y R14 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos, grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos; con la condición de que al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13 y R14 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH2-; c es un número entero de 0 a 4; d es un número entero de 0 a 2; e es un número entero de 0 a 4; y m es un número entero de 1 a 3, preferiblemente 1 o 2; y **(Ver fórmula)** en donde Y es OR18 o NR19R20; Z es O o +NR21R22; R15, R16 y R17 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos, grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos; con la condición de que al menos uno de R17 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula; R18 es H o un ion de metal alcalino, R19, R20, R21 y R22 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y grupos alquilo que pueden estar sustituidos, preferiblemente, R19, R20, R21 y R22 son cada uno iguales; f es un número entero de 0 a 3; g es un número entero de 0 a 3; y h es un número entero de 1 a 5.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para medir interacciones inter- y/o intramoleculares

La presente invención se refiere a métodos mejorados para medir interacciones inter- y/o intramoleculares de partículas y/o modificaciones de partículas.

Antecedentes de la invención

Se ha descrito que los colorantes fluorescentes sensibles a solvente, es decir, colorantes de merocianina, son adecuados para imagenología in vivo por unión covalente a proteínas. Estos colorantes se pueden usar para estudiar cambios conformacionales de proteínas (Hahn et al. en J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 4132-4145).

Se ha descrito que los colorantes de polimetino son útiles como sondas fluorescentes espectrales para estudiar interacciones no covalentes de estos colorantes con biomacromoléculas tal como ácidos nucleicos y proteínas (Tatikolov en Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews 2012, 13, 55-90).

Además, se ha descrito, que las propiedades fotofísicas de los colorantes de cianina están afectadas por el entorno molecular en una biomolécula, haciendo por tanto estos colorantes adecuados como sondas fluorescentes en investigación biofísica (Levitus et al. en Quaterly Reviews of Biophysics 2010, 1-29).

El aumento de fluorescencia inducido por proteínas es un efecto que se ha presentado para describir un aumento en la intensidad de fluorescencia que se produce cuando una proteína se une a un ácido nucleico en la proximidad de una sonda fluorescente. En particular, los colorantes de cianina que están covalentemente unidos a ADN experimentan un aumento en la intensidad de fluorescencia cuando una proteína se une a ADN (Myong et al. en PNAS 2011, 108, 7414-7418; Levitus et al. en J. Phys. Chem. Lett. 2015, 6, 1819-1823).

Se ha descrito que los colorantes de merocianina son útiles como colorantes para detectar y cuantificar actividades de proteínas tal como cambios conformacionales y unión a ligandos. Además, las moléculas biosensoras que se pueden unir a dianas seleccionadas y métodos para detectar biomoléculas diana y actividades de proteínas se divulgan en el documento WO 2005/088308 A2.

Se divulga un método para medir interacciones de partículas, especialmente interacciones entre biomoléculas y ligandos, por caracterización termoóptica en el documento WO 2008/061706 A1. Esta caracterización termoóptica se basa en termoforesis resultante de la creación de gradientes de temperatura fuertes.

El documento US 9.676.787 B2 divulga compuestos usados como marcadores. Los compuestos se conjugan a proteínas y ácidos nucleicos para imagenología y análisis biológicos.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a métodos mejorados para medir interacciones inter- y/o intramoleculares de partículas y/o modificaciones de partículas. En particular, los métodos de la presente invención proporcionan una sensibilidad mejorada. Además, los métodos de la presente invención emplean colorantes que permiten la detección de interacciones que podrían no haberse medido con suficiente sensibilidad por métodos previamente conocidos. Además, el método es independiente del método/fuente de calor y también independiente de la geometría del recipiente de reacción (es decir, el experimento se puede hacer en una placa de pocillos y no solo en capilares).

En los métodos de la presente invención, se emplean partículas marcadas que están marcadas con uno o más colorantes sensibles a temperatura.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para medir interacciones entre partículas marcadas y ligandos. El método del primer aspecto comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una muestra que comprende partículas marcadas y ligandos en una solución, en donde las partículas marcadas están disueltas o dispersas en la solución o están inmovilizadas en un soporte sólido;

b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una temperatura predeterminada;

c) repetir las etapas (a) y (b) múltiples veces a diferentes concentraciones de los ligandos en la solución; y d) determinar la interacción entre las partículas marcadas y los ligandos basado en el cambio de fluorescencia de las partículas marcadas basado en la concentración de ligando,

en donde la etapa (b) comprende las siguientes etapas:

b1) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una primera temperatura predeterminada;

b2) calentar o enfriar la solución a una segunda temperatura predeterminada;

b3) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a la segunda temperatura predeterminada; y

en donde las partículas marcadas están marcadas con uno o más colorantes como se define en la reivindicación 1.

En un segundo aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir interacciones inter- y/o intramoleculares. El método del segundo aspecto comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una muestra que comprende partículas marcadas;

b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una primera fluorescencia de las partículas excitadas a una primera temperatura predeterminada;

c) calentar o enfriar la solución a una segunda temperatura;

d) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una segunda fluorescencia de las partículas excitadas a la segunda temperatura;

e) caracterizar las interacciones inter- y/o intramoleculares y/o modificaciones/alteraciones de las partículas basado en la primera y segunda fluorescencia.

En un tercer aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir cambios dependientes del tiempo. El método del tercer aspecto comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una muestra que comprende partículas marcadas;

b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una primera fluorescencia de las partículas excitadas;

c) esperar durante un tiempo predeterminado;

d) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una segunda fluorescencia de las partículas excitadas;

e) caracterizar el cambio dependiente del tiempo de las partículas basado en la primera y segunda fluorescencia.

En un cuarto aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir cambios dependientes del entorno. El método del cuarto aspecto comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una primera muestra que comprende partículas marcadas;

b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una primera fluorescencia de las partículas excitadas en la primera muestra;

c) proporcionar una segunda muestra que comprende partículas marcadas a sustancialmente la misma concentración, en donde la segunda muestra se diferencia de la primera muestra;

d) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una segunda fluorescencia de las partículas excitadas en la segunda muestra;

e) caracterizar el cambio dependiente del entorno de las partículas basado en la primera y segunda fluorescencia.

En un quinto aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit de marcaje de proteínas que comprende dos colorantes reactivos, en donde los colorantes tienen un grupo espaciador, el grupo espaciador tiene un grupo reactivo que permite la conjugación del colorante a una proteína.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por temperatura de colorantes de polimetino y xantenos elegidos usando un dispositivo Peltier o láser IR como fuente de calor.

La figura 2 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por temperatura de varios colorantes usando un dispositivo Peltier como fuente de calor.

La figura 3 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por temperatura de los colorantes monosulfoCy5 y DY647P1 que está modulado por el entorno (por ejemplo, pH).

La figura 4 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas usando un dispositivo Peltier o láser IR como fuente de calor para determinar la afinidad de unión del ligando EcoSSB para Cy5-ADNmc.

La figura 5 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas a temperaturas elevadas únicas para determinar la afinidad de unión del ligando BLIP para monosulfoCy5-TEM1.

La figura 6 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por temperatura y un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas a 35 °C para determinar la afinidad de unión del ligando furosemida para anhidrasa carbónica (CAII) marcada con monosulfoCy5 (A) o D647P1 (B).

La figura 7 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas a 6 °C y a 23 °C para determinar la afinidad de unión del ligando Trastuzumab para monosulfoCy5- proteína A.

La figura 8 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas a 37 °C para determinar la afinidad de unión del ligando anakinra para proteína lL-1R marcada con DyLight655 B1 a B4.

La figura 9 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas tras enfriar entre 35 °C y 23 °C para determinar la afinidad de unión del ligando PD169316 para la proteína p38a marcada con Cy5.

La figura 10 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas tras calentar para determinar la afinidad de unión del ligando PD169316 y BIRB para la proteína p38a marcada con Cy5, Z-Cy5, Oregon Green 488, Oregon Green 488-trisNTA, TAMRA o TAMRA X.

La figura 11 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas tras calentar entre 37 °C y 45 °C para determinar la afinidad de unión del ligando BLIP para TEMI y del ligando BIRB para la proteína p38a, que están marcadas con monosulfoCy5 o D647P1.

La figura 12 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas tras calentar entre 37 °C y 45 °C para determinar la afinidad de unión del ligando BLIP para TEM1 y del ligando PD169316 para la proteína p38a, que están marcadas con monosulfoCy5, DY630 o DY631.

La figura 13 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas a una única temperatura determinada que produce un único perfil termoóptico.

La figura 14 muestra esquemáticamente la influencia de la longitud del espaciador entre un colorante y una partícula en el cambio de intensidad de fluorescencia inducido por ligando de partículas marcadas.

La figura 15 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por temperatura de los colorantes monosulfoCy5 y SeTau solos y conjugados a proteína p38a y TEM1 usando un dispositivo Peltier.

La figura 16 muestra un cambio de intensidad de fluorescencia inducido por temperatura de monosulfoCy5 conjugado a MBK y TEM1 para determinar la desnaturalización térmica.

Las figuras 17 y 18 muestran representaciones esquemáticas ejemplares para el cambio de la fluorescencia con la temperatura para el estado unido y sin unir.

Las figuras 19a a 19e muestran estructuras de colorantes específicos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos para medir interacciones entre partículas marcadas y ligandos. En el presente documento se divulgan métodos para medir interacciones inter- y/o intramoleculares de partículas y/o modificaciones de partículas. Los métodos de la presente invención proporcionan una sensibilidad mejorada. Además, los métodos de la presente invención emplean colorantes que permitan la detección de interacciones que podrían no haberse detectado con suficiente sensibilidad por métodos previamente conocidos.

Según la presente invención, la modificación de partículas incluye, por ejemplo, glucosilación, fosforilación, lipidación, carbonilación, oxidación de partículas y similares.

El término interacción comprende interacción entre biomoléculas (por ejemplo, proteína, ADN, ARN, ácidos hialurónicos, etc.), pero también entre (nano)partículas/(micro)perlas (modificadas) y biomoléculas.

En particular, los métodos proporcionados en el presente documento permiten medir la estabilidad de moléculas, como biomoléculas, o la interacción de moléculas, en particular biomoléculas con, por ejemplo, (bio)moléculas adicionales, en particular biomoléculas modificadas, partículas, por ejemplo, nanopartículas o micropartículas, perlas, por ejemplo, microperlas. También se pueden determinar combinaciones de estas características con los medios y métodos de esta invención. Se advierte que la presente invención, sin embargo, no está limitada a la medida/caracterización de biomoléculas. Por tanto, también se pueden medir y determinar las características de otros compuestos/partículas por los medios y métodos divulgados en el presente documento, por ejemplo, se pueden determinar y/o medir sucesos cinéticos e interacciones de moléculas. Según esto, también se pueden medir reacciones químicas (como reacciones inorgánicas u orgánicas) por los métodos de la presente invención. También se prevé determinar formaciones de complejos y/o su disociación.

Esta caracterización comprende, entre otros, la determinación de características biofísicas, como puntos de fusión o curvas de fusión, formaciones de complejos, interacciones proteína-proteína, plegamiento/desnaturalización de proteínas o péptidos, interacciones intramoleculares, interacciones intermoleculares, la determinación de interacciones entre partículas o moléculas, y similares.

Según esto, con los métodos proporcionados en el presente documento es, en otros, posible medir, detectar y/o verificar procesos biológicos, químicos o biofísicos y/o investigar, estudiar y/o verificar muestras, como muestras biológicas o farmacéuticas. También son viables pruebas diagnósticas y son formas de realización de esta invención. Se prevé, entre otros, y es viable medir las características de fusión de proteínas o moléculas de ácido nucleico, como, por ejemplo ADN bicatenario o ARN bicatenario (ADNbc/ARNbc) o de moléculas de ácido nucleico híbridas, como híbridos ADN/ARN, para medir y o analizar secuencias de ácido nucleico, como la detección y/o medida de polimorfismos de nucleótido único (SNP) o para medir la estabilidad de moléculas de ácido nucleico en correspondencia y como función de su longitud relativa; para medir y/o verificar productos finales de PCR, por ejemplo, en diagnóstico médico general, también en diagnóstico de corpúsculo polar, diagnóstico preimplantación, análisis forense. Según esto, es evidente para el experto en la materia que los medios y métodos proporcionados en esta invención son, en particular y sin limitación, útiles en medidas y/o verificaciones en donde las afinidades a otras moléculas/partículas de una partícula/molécula determinada es de interés. Por ejemplo, los métodos proporcionados en el presente documento, así como los dispositivos son útiles en la detección y medida de estabilidad de temperatura, así como puntos de fusión de moléculas de ácido nucleico y proteínas. Por tanto, está dentro del ámbito de la presente invención que, por ejemplo, cebadores de (ADN) y sondas de (ADN o ARN) se midan y o verifiquen después o durante su síntesis. También se prevé la medida de moléculas de ácido nucleico en moldes, como chips de ADN. El término fusión en el contexto de esta invención se refiere a la desnaturalización térmica de biomoléculas, como ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN, ADN) o proteínas.

También se prevé en el contexto de la presente divulgación la medida, detección y/o verificación de mutaciones y variaciones genéticas en moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, en forma de polimorfismos conformacionales de hebra única (SSCP) o en forma de polimorfos de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y similares. La presente invención también proporciona la posibilidad de analizar heterodúplex. Los heterodúplex se generan por desnaturalización por calor y rehibridación de una mezcla de, por ejemplo, moléculas de ADN de tipo salvaje y mutantes. En particular, también es posible medir el efecto de unión de proteínas a una molécula de ADN sobre la estabilidad de la última. Además, es posible medir la estabilidad térmica de proteínas y el efecto de moléculas (por ejemplo, moléculas pequeñas, fármacos, candidatos a fármaco) sobre la desnaturalización térmica.

También dentro del ámbito de la presente divulgación está, por ejemplo, la medida de interacciones proteína-proteína, como formaciones de complejos de estructuras proteinaceas o de proteínas o de fragmentos de las mismas. Tales medidas comprenden, pero no están limitadas a, la medida de reacciones de unión anticuerpo-antígeno (también en forma de anticuerpos monocatenarios, fragmentos de anticuerpo, cromocuerpos y similares). Además, las formas de realización de la presente invención también se refieren a la detección y o medida de sucesos de disociación, como, por ejemplo, la disociación de complejos de proteínas. Por tanto, la invención también es útil en la medida, determinación y/o verificación de sucesos de disociación, como en la medida de la disociación de complejos proteinaceos, por ejemplo, complejos anticuerpo-antígeno y similares.

La presente divulgación no está limitada a la detección de ADN corto o la determinación de moléculas de ácido nucleico bi- o monocatenarias. También se pueden medir interacciones entre partículas/moléculas, conformaciones, radios hidrodinámicos, cinéticas de unión y estabilidades de partículas/moléculas, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN, ARN, APN, ANB), nanopartículas, perlas, en particular microperlas, lípidos, liposomas, vesículas, células, biopolímeros (ácido hialurónico, alginato y similares), láminas lipídicas bidimensionales, sustancias inorgánicas (por ejemplo, nanotubos de carbono, buckybolas, etc.), polietilenglicol (PEG).

En el primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para medir interacciones entre partículas marcadas y ligandos. En este método, la interacción de partículas marcadas con ligandos se puede medir dependiendo de la concentración de ligando.

El método del primer aspecto de la presente invención comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una muestra que comprende partículas marcadas y ligandos en una solución, en donde las partículas marcadas están disueltas o dispersas en la solución o están inmovilizadas en un soporte sólido;

b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una temperatura predeterminada;

c) repetir las etapas (a) y (b) múltiples veces a diferentes concentraciones de los ligandos en la solución; y d) determinar la interacción entre las partículas marcadas y los ligandos basado en el cambio de fluorescencia de las partículas marcadas basado en la concentración de ligando,

en donde la etapa (b) comprende las siguientes etapas:

b1) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una primera temperatura predeterminada;

b2) calentar o enfriar la solución a una segunda temperatura predeterminada;

b3) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a la segunda temperatura predeterminada.

Preferiblemente, las partículas marcadas y los ligandos se proporcionan en la etapa a) en concentraciones predeterminadas en la solución o, en caso de que las partículas marcadas estén inmovilizadas en un soporte sólido, las partículas marcadas se proporcionan en una cantidad predeterminada y los ligandos se proporcionan en una concentración predeterminada. Esto significa que la cantidad de partículas marcadas y ligandos en cada medida fluorescente está predefinida y sin cambiar entre las etapas a) y b), por ejemplo, por una etapa de lavado. Además, la solución proporcionada en la etapa a) se usa en la etapa b) para excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una temperatura predeterminada.

Usando el método del primer aspecto de la presente invención, se puede obtener una curva de unión que muestra el cambio dependiente de la concentración de ligando de la fluorescencia de las partículas marcadas. A partir de esta curva de unión (también denominada “perfil termoóptico”) se puede determinar la constante de disociación de la partícula y el ligando. Por tanto, en una forma de realización particularmente preferida de la presente invención, el método de medir interacciones entre partículas marcadas y ligandos es un método de medir la constante de disociación de las partículas y los ligandos, tal como la constante de disociación de un enlace partícula-ligando.

Preferiblemente las interacciones entre biomolécula/ligando, proteína/ligando, proteína/proteína o receptor/ligando se pueden determinar por el método del primer aspecto de la presente invención.

En el primer aspecto de la presente invención, la etapa (b) comprende las siguientes etapas:

b1) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una primera temperatura predeterminada;

b2) calentar o enfriar la solución a una segunda temperatura predeterminada;

b3) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a la segunda temperatura predeterminada.

La etapa adicional de calentar o enfriar es ventajosa para una regulación específica de la temperatura predeterminada. Con el fin de medir diferencias relativas en fluorescencia de 1/1000, es preferible controlar la temperatura predeterminada usando un elemento calentador o refrigerador tal como un elemento Peltier o un láser IR. Es ventajoso controlar la temperatura predeterminada de modo que se evite un desplazamiento de la temperatura a lo largo del tiempo y las variaciones de temperatura sean menores de /-1 K, preferiblemente menores de /- 0,5 K.

Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se cree que el cambio en fluorescencia de la partícula marcada, es decir, el colorante conjugado a la partícula, cuando el ligando se une a la partícula marcada, se basa en los siguientes principios teóricos:

Uno de los parámetros más importantes de una medida termoóptica se la amplitud de unión AFncrm definida como sigue:

Aquí, F es el valor de fluorescencia medido a una temperatura T. Los valores de fluorescencia se comparan a una temperatura inicial T ^iniciai y a una temperatura final diferente Tm ^a i. La proporción de los dos valores de fluorescencia da la fluorescencia normalizada F ^ncrm . El valor de AF ^ncrm , es decir, la diferencia entre los valores de F ^norm para los estados unido y sin unir, debe ser tan grande como sea posible con el fin de alcanzar resultados de medida óptimos con una razón de señal a ruido óptima. La figura 17 muestra una representación esquemática ejemplar para el cambio de la fluorescencia con la temperatura para el estado unido y sin unir. Los valores de fluorescencia usados se indican en concordancia. El curso real de las curvas puede variar mucho. Además, es bastante concebible llevar a cabo la medida de tal forma que las soluciones se enfríen, es decir, T ^iniciai y T ^{fn a i} están, por tanto, intercambiadas.

AFncrm es en general mayor al aumentar la diferencia de temperatura entre Tiniciai y Tfnai. Sin embargo, AFncrm es siempre también dependiente del fluoróforo usado, así como de la molécula y el ligando titulado.

_{| T fin a l - " F in id a i |} AT

En muchas interacciones

1 Munido (Finicial ) ^sin unir (Finicíai ) 1 ^^ ZnZcZaZ

ya muestra una dependencia de la concentración del ligando titulado. En otras palabras, ya se puede ver una dependencia de ligando del valor de fluorescencia absoluto en el caso de Tiniciai (es decir, la temperatura predeterminada) sin un cambio en la temperatura. El cambio relativo en fluorescencia entre el estado unido y sin unir

^sin unir C^ZnZcZaZ)

F u ñ id o ^ i n i c i a l )

es, sin embargo, muy pequeño (en el intervalo de un pequeño porcentaje) en la mayoría de los casos. Durante la producción de las muestras, se generan desviaciones aleatorias de la concentración diana (y por tanto los valores de fluorescencia absolutos) de varios puntos porcentuales por procesos de manejo de líquidos tanto manuales como automatizados, por lo cual la dependencia del ligando de la fluorescencia absoluta a Tiniciai se enmascara (es decir, razón desfavorable de señal a ruido). Por tanto, es preferido medir la fluorescencia a dos temperaturas diferentes y calcular un cociente de los dos valores (medidos a diferentes temperaturas), mediante lo cual se pueden corregir los errores del manejo de líquidos.

Sin embargo, el cambio relativo de la fluorescencia al cambiar la temperatura como función del ligando, es decir, la amplitud de unión relativa Ar,

es también con frecuencia pequeña, otra vez en el intervalo de un pequeño porcentaje y dependiente de AT. Los errores de pipeteo no desempeñan ningún papel ya que se consideran valores relativos, pero Ar es aproximadamente 1 para todas las temperaturas menores que una temperatura desconocida T ^x (Fig. 18).

Solo para temperaturas mayores que T ^x , Ar empieza a desviarse de 1, y solo en este caso se puede medir un enlace con alta precisión. El resultado de la medida es mejor, cuanto mayor o menor sea A ^r , es decir, cuanto más se desvía Ar de 1.

En resumen, esto significa que la fluorescencia se debe medir a más de una temperatura con el fin de eliminar errores de pipeteo. Por otra parte, la temperatura T ^x a la que Ar se desvía de 1 al principio de la medida depende del fluoróforo usado, la molécula diana marcada y el ligando titulado. Esto significa que se debe barrer un amplio intervalo de temperaturas con el fin de determinar T ^x . La temperatura Tfnai es idealmente mayor que T^x . Dependiendo de cuánto se diferencia Ar de 1, también es preferible una AT mayor en algunos casos con fin de alcanzar proporciones de señal a ruido suficientes. Sin embargo, valores pequeños de AT son preferibles, ya que para valores grandes de AT el equilibrio termodinámico del enlace puede diferenciarse mucho del equilibrio termodinámico a Tiniciai.

La figura 18 muestra una representación esquemática ejemplar para el cambio de la fluorescencia con la temperatura para el estado unido y sin unir. Se marcan términos y valores adicionales mencionados anteriormente. A partir de esta figura, también es aparente que AFnorm se vuelve mayor cuando mayor sea Tiniciai, pero solo si Tiniciai > T ^x . El cambio de fluorescencia mostrado no necesita necesariamente ser lineal, también son posibles caídas exponenciales. La figura 18 muestra una función lineal por simplificación.

Se indica que los métodos de la presente invención no dependen de la caracterización termoóptica basada en termoforesis resultante de la creación de gradientes de temperatura espaciales fuertes.

Por tanto, en el primer aspecto de la presente invención, la etapa (b) comprende las siguientes etapas:

b1) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una primera temperatura predeterminada;

b2) calentar o enfriar la solución a una segunda temperatura predeterminada;

b3) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a la segunda temperatura predeterminada.

En el primer aspecto de la presente invención, la fluorescencia de las partículas marcadas se determina en presencia de concentraciones variables del ligando a dos temperaturas diferentes. Como se ha explicado anteriormente, este procedimiento permite eliminar errores de pipeteo.

En el primer aspecto de la presente invención, la interacción entre las partículas marcadas y los ligandos se pueden determinar basado en el cambio dependiente de la concentración de ligando de la proporción de la fluorescencia F2 a la segunda temperatura predeterminada dividida por la fluorescencia F1 a la primera temperatura predeterminada F1, es decir, F2/F1.

En el primer aspecto de la presente invención, la temperatura predeterminada es una temperatura a la que el ligando se une a la partícula marcada. En otras palabras, la temperatura predeterminada es una temperatura a la que una fracción del colorante que experimenta un cambio conformacional en la excitación de fluorescencia cambia debido a la unión del ligando a la partícula marcada. Además, la temperatura predeterminada es una temperatura a la que una velocidad de fotoisomerización o velocidad de conversión interna del colorante cambia debido a la unión del ligando a la partícula marcada.

En el contexto de la presente invención, el término “unión” del ligando a la partícula marcada, se refiere a unión covalente o unión por fuerzas intermoleculares tal como enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno y fuerzas de van der Waals.

Cuando en lo siguiente se hace referencia a “la temperatura predeterminada”, la misma aplica a la primera temperatura predeterminada y la segunda temperatura predeterminada del primer aspecto de la presente invención.

Es ventajoso seleccionar la temperatura predeterminada dependiendo de la naturaleza de las respectivas partículas. A este respecto, la temperatura predeterminada debe estar preferiblemente por debajo de la temperatura a la que las partículas se disuelven, desnaturalizan y/o alteran. Ejemplarmente para el caso que las partículas sean proteínas, la temperatura predeterminada se puede preferiblemente ajustar para estar por debajo de la temperatura de inicio de desnaturalización térmica de la proteína. La temperatura de inicio se puede determinar realizando una medida de estabilidad térmica como, entre otros, se describe en el documento WO 2017/055583 A1.

La temperatura predeterminada en el primer aspecto de la presente invención está preferiblemente en el intervalo de -20 °C a 115 °C, preferiblemente de 0,1 °C a 100 °C, más preferiblemente en el intervalo de 5 °C a 60 °C, incluso más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 60 °C, lo más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 40 °C. Es preferible generar una temperatura predeterminada estable, es decir, controlar la temperatura predeterminada en un intervalo estrecho en /-1 K, más preferiblemente en /- 0,5 K.

Típicamente, la temperatura ambiente fluctúa en más de /-1 K, incluso si se controla activamente por, por ejemplo, aire acondicionado. Por tanto, si la temperatura predeterminada es temperatura ambiente, es necesario un control adicional de la temperatura predeterminada para lograr una temperatura predeterminada estable. Más preferiblemente, la temperatura predeterminada es diferente de temperatura ambiente. Temperatura ambiente significa una temperatura entre 20 °C a 25 °C, preferiblemente 25 °C.

Asimismo, en el primer aspecto de la presente invención, la primera y segunda temperaturas predeterminadas en la etapa de calentamiento o enfriamiento están preferiblemente en el intervalo de -20 °C a 115 °C, preferiblemente de 0,1 °C a 100 °C, más preferiblemente en el intervalo de 5 °C a 60 °C, incluso más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 60 °C, lo más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 40 °C. La primera temperatura predeterminada está preferiblemente en el intervalo de -20 °C a 115 °C, preferiblemente de 0,1 °C a 100 °C, más preferiblemente en el intervalo de 5 °C a 60 °C, incluso más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 60 °C, lo más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 40 °C. La segunda temperatura predeterminada está preferiblemente en el intervalo de -20 °C a 115 °C, preferiblemente de 0,1 °C a 100 °C, más preferiblemente en el intervalo de 5 °C a 60 °C, incluso más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 60 °C, lo más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 40 °C. Se entiende que, en el caso de calentar, la primera temperatura predeterminada se elige suficientemente baja de modo que la segunda temperatura predeterminada no supere el límite superior descrito anteriormente de la misma. Asimismo, en el caso de enfriar, la primera temperatura predeterminada se elige suficientemente alta de modo que la segunda temperatura predeterminada no supere el límite inferior descrito anteriormente de la misma. Como se describe anteriormente, también aquí es ventajoso que la primera y segunda temperaturas predeterminadas estén establemente controladas para bajar las fluctuaciones de temperatura, preferiblemente menores que /- 1 K, más preferiblemente en /- 0,5 K.

La diferencia entre la primera temperatura predeterminada y la segunda temperatura predeterminada está habitualmente en el intervalo de /- 0,1 K a /- 90 K. Esto significa que el valor absoluto de la diferencia de temperatura |T2' - T1'| está entre 0,1 K y 90 K, es decir, la diferencia de temperatura puede ser positiva (calentar) o negativa (enfriar). Preferiblemente, la diferencia de temperatura está en el intervalo de /-1 K a /- 40 K, más preferiblemente en el intervalo de /-1 K a /- 20 K. Una diferencia de temperatura baja es ventajosa, porque el sistema se altera tan poco como sea posible por el cambio en temperatura. El experto en la materia es consciente que al enfriar la muestra total, es posible una mayor amplitud del aumento de temperatura (es decir, por calentamiento por láser) sin producir daño a materiales sensibles a temperatura.

En el método del primer aspecto de la presente invención, el calentar o enfriar se puede llevar a cabo usando una fuente calentadora o enfriadora seleccionada del grupo que consiste en fluidos o gases calentadores o enfriadores, elementos calentadores (por ejemplo, una resistencia calentadora, u otros elementos basados en el efecto Joule como elementos calentadores metálicos, elementos calentadores cerámicos, elementos calentadores de polímero PCT, elementos calentadores compuestos, elementos calentadores semiconductores), o un elemento termoeléctrico, por ejemplo, un elemento Peltier, o radiación electromagnética (como un LED, por ejemplo un IR-LED, o un láser, por ejemplo un láser IR, o una microonda).

Se usa preferiblemente un elemento Peltier porque se puede usar para calentar la muestra y/o para enfriar la muestra (por ejemplo, para enfriar la muestra por debajo de la temperatura ambiente). En particular, es posible cambiar de calentar a enfriar revirtiendo la dirección de la corriente a través del elemento Peltier. Un elemento Peltier es uno de los pocos elementos que pueden calentar, pero también enfriar activamente por debajo de temperatura ambiente.

Un láser, preferiblemente un láser cuya radiación electromagnética es directamente absorbida por la muestra, se usa preferiblemente porque la temperatura se puede cambiar rápida y directamente en la muestra sin contacto mecánico con la muestra.

La radicación láser se absorbe directamente por la muestra y se convierte a calor, por ejemplo, la luz láser IR de las longitudes de onda 980 nm /- 30 nm, 1480 nm /- 30 nm, 1550 nm /- 30 nm, 1940 nm /- 30 nm se absorbe muy bien por el agua y calienta muy rápidamente. Este método de calentar es sin contacto, es decir, rápido y sin el riesgo de contaminación. La cámara de la muestra debe solo ser transparente a la luz láser, pero no requiere una buena conductividad térmica, en contraste con calentar con contacto por medio de un elemento calentador.

El cambio de intensidad de fluorescencia inducido por temperatura solamente es dependiente de las propiedades fisicoquímicas de un colorante (Fig. 1). Debido a que el grado del cambio de intensidad de fluorescencia inducido por temperatura depende solo de las propiedades fisicoquímicas del colorante, es independiente de la fuente de calor usada. Por tanto, basado en la intensidad de fluorescencia del colorante a un láser IR definido en tiempo, se puede estimar la temperatura de la sonda.

Con el láser, solo se calienta el intervalo de volumen de nanolitros, del que la fluorescencia se mide por óptica de fluorescencia (el volumen de detección es con frecuencia solo 100 pm x 100 pm x 100 pm = 1 nl). No es necesario calentar un volumen mayor del que la óptica de fluorescencia con frecuencia no puede detectar la fluorescencia.

En el primer aspecto de la presente invención, las etapas (b2) y (b3) se pueden llevar a cabo consecutivamente o simultáneamente.

Según el primer aspecto de la presente invención las partículas incluyen biomoléculas, nanopartículas, micropartículas y vesículas. Las partículas también incluyen células biológicas (por ejemplo, células bacterianas o eucariotas) o fragmentos subcelulares, tejidos biológicos, partículas víricas o virus y orgánulos celulares y similares. Las nanopartículas también incluyen nanodiscos. Un nanodisco es un sistema de membrana modelo sintético compuesto de una bicapa lipídica de fosfolípidos con el borde hidrofóbico apantallado por dos proteínas anfipáticas.

Las biomoléculas preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en aminoácidos, proteínas, péptidos, monoy disacáridos, polisacáridos, lípidos, glucolípidos, ácidos grasos, esteroles, vitaminas, neurotransmisores, enzimas, nucleótidos, metabolitos, ácidos nucleicos, y combinaciones de las mismas. Más preferiblemente, las biomoléculas se seleccionan del grupo que consiste en proteínas, péptidos, enzimas, ácidos nucleicos, y combinaciones de las mismas.

Preferiblemente, las partículas (en las partículas marcadas) son biomoléculas, lo más preferiblemente proteínas o ácidos nucleicos.

Las proteínas se seleccionan del grupo que consiste en enzimas (por ejemplo, anhidrasa carbónica, beta lactamasa TEM1, o quinasas tal como MEK1 o p38), proteínas transportadoras (por ejemplo, MBP), proteínas inhibidoras (por ejemplo, proteína inhibidora de beta lactamasa BLIP, anakinra), proteínas estructurales, proteínas de señalización, proteínas que se unen a ligando, chaperonas (por ejemplo, proteína de choque térmico HSP90), anticuerpos (por ejemplo, Trastuzumab), y receptores (por ejemplo, receptor de interleuquina 1).

Los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN, ANB y APN. El ácido nucleico bloqueado (ANB), con frecuencia denominado ARN inaccesible, es un nucleótido de ARN modificado. La fracción ribosa de un nucleótido ANB está modificada con un puente extra que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. El ácido peptidonucleico (APN) es un polímero sintetizado artificialmente similar al ADN o ARN. El ADN y ARN tienen un esqueleto de azúcar desoxirribosa y ribosa, respectivamente, mientras que el esqueleto de APN está compuesto de un péptido tal como unidades N-(2-aminoetil)-glicina repetitivas unidas por enlaces peptídicos. Las varias bases de purina y pirimidina están unidas al esqueleto por un puente metileno (-CH²-) y un grupo carbonilo (-(C=O)-).

En el contexto de la presente invención, una nanopartícula es una partícula que tiene un tamaño medio de menos de 100 nm. El término “tamaño medio” describe el diámetro efectivo medio medido por dispersión de luz dinámica usando, por ejemplo, instrumento de determinación de tamaño de partícula 90Plus de Brookhaven Instruments o Zetasizer Z90 de Malvern. Preferiblemente, el tamaño de partícula está en el intervalo de 1 nm a 100 nm, preferiblemente de 1 a 70 nm. Las nanopartículas pueden ser partículas orgánicas o inorgánicas. Las nanopartículas también pueden estar presentes como partículas compuestas, tal como un núcleo inorgánico que tiene moléculas orgánicas unidas a su superficie.

Una micropartícula es una partícula microscópica que tiene una dimensión más larga de menos de 1 mm, pero normalmente más de 100 nm. Los métodos de determinar el tamaño que emplean microscopía electrónica de transmisión (MET), microscopía electrónica de barrido (MEB) y dispersión de luz cuasi elástica (QELS) se pueden usar para caracterizar la micropartícula. Las micropartículas también pueden estar presentes en forma de microperlas.

Las micropartículas pueden ser, por ejemplo, partículas de sílice/vidrio/biodegradables recubiertas o sin recubrir, partículas de poliestireno/recubiertas/de citometría de flujo/PMMA/melamina/NIST, partículas de agarosa, partículas magnéticas, partículas de oro o partículas de plata u otras partículas metálicas recubiertas o sin recubrir, partículas de metales de transición, materiales biológicos, semiconductores, partículas orgánicas o inorgánicas, microesferas de poliestireno fluorescentes, microesferas de poliestireno no fluorescentes, materiales compuestos, liposomas, células y similares.

Las micropartículas comercialmente disponibles están disponibles en una amplia variedad de materiales, incluyendo cerámicos, vidrio, polímeros y metales. Las micropartículas encontradas en la vida diaria incluyen polen, arena, polvo, harina, y azúcar en polvo. En sistemas biológicos, las micropartículas son pequeñas vesículas unidas a membrana en la sangre derivadas de células que están en contacto con el torrente sanguíneo, tal como plaquetas y células endoteliales.

Las microperlas preferiblemente son partículas de plástico sólidas fabricadas de menos de 5 milímetros en su mayor dimensión. Las microperlas también pueden ser partículas de polímero uniformes, típicamente de 0,5 a 500 micrómetros de diámetro.

El término “partícula modificada” o “perla modificada” se refiere, en particular, a perlas o partículas que comprenden o están unidas a moléculas, preferiblemente biomoléculas. Esto también comprende el recubrimiento de tales perlas o partículas con estas (bio)moléculas.

Las partículas o perlas según esta invención se pueden modificar de tal modo que, por ejemplo, biomoléculas, por ejemplo, ADN, ARN o proteínas, pueden ser capaces de unirse (en algunas formas de realización específicamente y/o covalentemente) a las partículas o perlas. Por tanto, dentro del ámbito de esta invención está el análisis de características de las perlas y/o partículas y en particular de moléculas unidas a o ligadas a tales perlas o partículas. En particular, tales moléculas son biomoléculas. Según esto, el término “(micro)perlas/(nano- o micro)partículas modificadas”, en particular, se refiere a perlas o partículas que comprenden moléculas adicionales que se van a analizar o caracterizar. Las micropartículas/(nano- o micro)partículas modificadas o sin modificar pueden ser capaces de interaccionar con otras partículas/moléculas tal como biomoléculas (por ejemplo, ADN, ARN o proteínas) en solución.

En los métodos de la presente invención, se emplean partículas marcadas que están marcadas con uno o más colorantes sensibles a temperatura. En el contexto de esta invención, “partículas marcadas” se refiere a moléculas/partículas fluorescentemente marcadas u otras moléculas/partículas que se pueden detectar por medios fluorescentes, por ejemplo, moléculas/partículas que comprenden un fluoróforo intrínseco, o partículas/moléculas con fluoróforos unidos. En particular, las partículas marcadas son preferiblemente partículas que están unidas, por ejemplo, covalentemente unidas a un colorante, o reversiblemente unidas a un colorante sobre una etiqueta de proteína de alta afinidad, como etiqueta de polihistidina, etiqueta FLAG o similar.

Las etiquetas proteicas son secuencias peptídicas injertadas genéticamente en una proteína recombinante. Estas incluyen etiqueta poli(His), aminoácidos polianiónicos, tal como etiqueta FLAG, etiquetas epítopos tal como etiqueta V5, etiqueta Myc, etiqueta HA y etiqueta NE, etiquetas que pueden permitir modificación enzimática específica (tal como biotinilación por biotina ligasa) o modificación química (tal como reacción con FlAsH-EDT2 para imagenología de fluorescencia).

Los colorantes útiles en la presente invención son colorantes que muestran una intensidad de fluorescencia dependiente de la temperatura, es decir, la intensidad de fluorescencia del colorante aumenta o disminuye cuando la temperatura se cambia al enfriar o calentar. Este fenómeno se llama cambio de intensidad de fluorescencia relacionado con temperatura. En el contexto de la presente invención, los colorantes que muestran este comportamiento se denominan “colorantes sensibles a la temperatura”. Preferiblemente, los colorantes usados en la presente invención muestran no solo un cambio inducido por temperatura en la intensidad de fluorescencia, sino también un cambio inducido por unión de ligando en la dependencia de la temperatura de su intensidad de fluorescencia cuando está unidos a una partícula, es decir, partícula marcada.

Los presentes inventores han encontrado que la dependencia de la temperatura de un colorante que está unido a una partícula tal como una biomolécula se puede usar para determinar los parámetros de interacción entre el ligando y la biomolécula.

Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se cree que este hallazgo se basa en los siguientes principios teóricos:

La forma trans de los colorantes de cianina tal como Cy5 es fluorescente, mientras que la forma cis es no fluorescente. La forma trans de los colorantes de cianina es fluorescente debido a resonancia o mesomerismo causado por electrones deslocalizados como se ilustra a continuación:

El rendimiento cuántico de fluorescencia de los colorantes de polimetino depende fuertemente del entorno molecular en que está localizada la sonda, que determina la eficacia para la fotoisomerización cis-trans. La duración de la fluorescencia depende fuertemente de la temperatura y la viscosidad del solvente porque la isomerización es un proceso activado que implica un gran movimiento molecular. La eficacia de la fluorescencia aumenta significativamente cuando la rotación de enlaces está estéricamente impedida como se observa cuando los colorantes están unidos a partículas tal como biomoléculas. Las moléculas de colorante unidas a o en proteínas están estéricamente impedidas de la rotación C=C en estado excitado, y es menos probable que se conviertan al isómero cis. A temperaturas más altas, la libertad vibracional aumentada de los colorantes unidos a las proteínas permite mayores velocidades de conversión al estado cis 'oscuro', que produce una disminución en la fluorescencia medida. Como se demuestra por los experimentos mostrados en los ejemplos, el cambio conformacional inducido por ligando de una biomolécula modula la intensidad de fluorescencia del colorante (que es una consecuencia de cambios en la libertad vibracional del colorante unido a la proteína). Por esta razón, es posible la medida de la afinidad de unión a una única temperatura. El enfoque en el que solamente se usa la dependencia de la temperatura del colorante para determinar los parámetros de interacción entre el ligando y la biomolécula no se ha descrito antes.

Una vez formado, el fotoisómero experimenta una reacción de isomerización de vuelta térmica para dar el isómero todo trans termodinámicamente estable. La eficacia relativa de la fotoisomerización con respecto a los otros dos procesos depende de la temperatura, viscosidad del solvente y la presencia de sustituyentes que podrían crear impedimento estérico. De forma importante, temperaturas más bajas llevan a velocidades menores y mayor rendimiento de fluorescencia.

La dependencia de la temperatura de un colorante, es decir, una propiedad intrínseca del colorante para reaccionar en los cambios de temperatura con cambios en la intensidad de fluorescencia, es solamente dependiente de la estructura química de colorante. La dependencia de la temperatura de una molécula fluorescente está afectada por la libertad rotacional de sus grupos sustituyentes. Los colorantes que tienen una estructura fuertemente rigidizada como, pero no limitados a ATTO647N, ATTO655 y CF640R responden a un aumento de temperatura con cambios despreciables en la intensidad de fluorescencia (Fig. 2). Por tanto, estos colorantes no son adecuados para los fines de la presente invención. Los colorantes que tienen una estructura menos rígida (como, pero no limitado a, fluoresceína, Oregon Green 488, DY495, rodamina, TAIVIRA, IR640) muestran descenso significativo en intensidad de fluorescencia tras aumento de temperatura. Los colorantes más sensibles pertenecen a la familiar de los colorantes de polimetino (como, pero no limitados a, Cy3, monosulfoCy3, DY567, Cy5, monosulfoCy5, DY630, DY647P1, DY650, Alexa 647, y DyLight 655 B1-B4). La fluorescencia de estos colorantes depende mucho de la temperatura (Fig. 2).

La dependencia de la temperatura de los colorantes está modulada por la conjugación a una partícula (biomolécula) produciendo un perfil termoóptico único (Fig. 15). El cambio en intensidad de fluorescencia inducido por temperatura se reduce mucho en presencia de una biomolécula como se muestra para monosulfoCy5 como un representante de colorantes de polimetino y depende significativamente de las propiedades de la biomolécula conjugada al colorante (Fig. 15A). La intensidad de fluorescencia de rotaxanos de escuaraína como SeTau es mucho menos sensible a cambios de temperatura. La sensibilidad a la temperatura no cambia significativamente tras la conjugación de SeTau a la biomolécula (Fig. 15B).

Los colorantes con dependencia de la temperatura de moderada a fuerte (como, pero no limitados a colorantes de xanteno (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, TAMRA, y DY495) y colorantes de polimetino (por ejemplo, Cy3, monosulfoCy3, DY547, Cy5, monosulfoCy5, DY630, DY631, y DY647P1) son muy adecuados para investigaciones termoópticas. Su dependencia de la temperatura está significativamente influida por la conjugación a la biomolécula.

Los colorantes que tienen una dependencia de la temperatura significativa (como, pero no limitados a, DyLight 655 B3, IR650) pueden no ser adecuados para investigaciones termoópticas ya que su sensibilidad a la temperatura no está influida por la conjugación a la biomolécula.

La dependencia a la temperatura de un colorante que produce un cambio en la intensidad de fluorescencia dependiente de la temperatura por tanto es requerida, pero no suficiente para el colorante óptimo para estudios termoópticos. La interacción entre el colorante y la biomolécula únicamente determina la eficacia y sensibilidad del perfil termoóptico del colorante (Figs. 5 y 13). El presente enfoque en el que solamente la dependencia de la temperatura del colorante se usa para determinar los parámetros de interacción entre el ligando y la biomolécula no se ha descrito antes.

Los colorantes que se pueden usar en la presente invención deben demostrar una dependencia de la temperatura en una forma libre que es preferiblemente > 0,3 %/K, más preferiblemente > 0,5 %, y lo más preferiblemente > 1 %/K.

La dependencia a la temperatura del colorante se debe modular por conjugación a una partícula marcada. El colorante debe demostrar una dependencia de la temperatura en una forma conjugada que es preferiblemente > 0,3 %/K, más preferiblemente > 0,5 %/K, y lo más preferiblemente > 1 %/K.

El colorante debe preferiblemente tener baja tendencia a producir agregación de partículas marcadas tras el marcaje.

Aunque la incorporación de sulfonato o grupos similares en los colorantes produce agregación reducida de biomoléculas marcadas, una baja carga neta (preferiblemente > -2) del colorante tras la conjugación con la biomolécula es preferible para el perfil termoóptico óptimo del colorante.

El colorante óptimo para medidas termoópticas de interacciones ligando-^partícula marcada o desnaturalización térmica de una biomolécula es un miembro de los colorantes de polimetino (definidos como compuestos orgánicos que contienen una cadena de grupos metino (=CH-) con dobles enlaces conjugados), preferiblemente, pero no limitados a, colorantes de cianina simétricos y asimétricos, es decir, un colorante sintético con la fórmula general R²N[CH=CH]nCH=N+R² ^ R²N+=CH[CH=CH]nNR² (en donde n es un número pequeño) en el que el nitrógeno y opcionalmente una parte de la cadena conjugada habitualmente es una parte de un sistema heterocíclico tal como, pero no limitado a, imidazol, piridina, pirrol, quinolina y tiazol.

El colorante óptimo para medidas termoópticas de interacciones ligando^partícula marcada o desnaturalización térmica de una biomolécula también puede ser un miembro de los colorantes de xanteno, es decir, un compuesto orgánico, que es un derivado de xanteno que incluye, pero no está limitado a, colorantes basados en fluoresceína y rodamina, y que se caracteriza por una libertad rotacional de sus grupos sustituyentes.

La sensibilidad de la lectura termoóptica se puede manipular variando la longitud y las propiedades químicas del espaciador entre el colorante y la biomolécula (Figs. 10 y 14). Los grupos enlazadores más largos con propiedades químicas únicas tal como carácter dipolar en Z-Cy5 contribuyen a percepción extensa de cambios conformacionales inducidos por ligando comparados a Cy5 con espaciador hexanoilo clásico (Fig. 10A). Los espaciadores demasiado cortos como en Oregon Green 488 o TAMRA puede prevenir la percepción eficaz de cambios en el microentorno debido a cambios conformacionales inducidos por ligando en la biomolécula (Fig. 10B-C). La longitud y propiedades químicas del espaciador entre el colorante y la biomolécula determina así la sensibilidad del perfil termoóptico. La longitud del espaciador que rige la distancia entre el colorante y la biomolécula tras la conjugación debe lo más preferiblemente ser más largo que dos grupos CH².

La modulación de la dependencia de la temperatura del colorante por la biomolécula depende de la carga neta que el colorante muestra después de la conjugación a la biomolécula. Un número creciente de grupos sulfonato se correlaciona negativamente con la calidad de lectura termoóptica (Fig. 8) como se demuestra con los experimentos, en los que IL-1R se marcó con colorantes de polimetino que contienen un núcleo de benzopirilio y varios números de grupos sulfonato. Se determinó la afinidad del ligando anakinra para IL-1R marcado. Un número mayor (>2) de grupos sulfonato redujo la aplicabilidad del colorante para perfil termoóptico. Se muestra un efecto similar por la comparación de los colorantes de carbocianina monosulfoCy5 y DY647P1 que portan uno y dos grupos sulfonato, respectivamente, que ilustra que el número de grupos sulfonato determina crucialmente la aplicabilidad del colorante para estudios termoópticos (Fig. 11).

Se pueden usar colorantes específicos para aplicaciones específicas para lograr la mejor razón señal a ruido. El ruido se define como variaciones en la señal termoóptica que no están causadas por la unión de un ligando. Como se muestra en la figura 12, los colorantes de polimetino asimétricos DY630 y DY631 son superiores en el ensayo que detecta interacción proteína-proteína (Fig. 12A), pero muestran mal perfil termoóptico en el ensayo que detecta la unión de molécula pequeña a la proteína (Fig. 12B). Por otra parte, el colorante de carbocianina simétrico monosulfoCy5 muestra un perfil superior en el ensayo que detecta la unión de molécula pequeña a la proteína.

Los colorantes sensibles a temperatura que se pueden usar en la presente invención se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en colorantes de polimetino y colorantes de xanteno. Los colorantes de polimetino preferiblemente incluyen colorantes de cianina simétricos y asimétricos o colorantes de polimetino que tienen un núcleo de benzopirilio. Los colorantes de xanteno incluyen colorantes de rodamina y colorantes de fluoresceína.

Los colorantes de polimetino preferidos que tienen un núcleo de benzopirilio incluyen, pero no están limitados a, Chromeo P543, DY630, DY631, DY650, DyLight 655 B2, DyLight 655 B3. Los colorantes de cianina preferidos incluyen, pero no están limitados a, Cianina 2, Cy3, Monosulfo Cy3, Cy5, Monosulfo Cy5 (versión 1), Monosulfo Cy5 (versión 2), Disulfo Cy5, Z-Cy2, Z-Cy5, Monosulfo Z-Cy5, Alexa647, DY547P1 y DY647P1. Los colorantes de xanteno preferidos incluyen, pero no están limitados a, TAMRA, TAMRA X, DY495, y Oregon Green. Los colorantes de xanteno más preferidos incluyen, pero no están limitados a, TAMRA X, y DY495.

Colorantes especialmente preferidos son DY630, DY631, DY650, DyLight 655 B2, DyLight 655 B3, Cianina 2, Z-Cy2, Z-Cy5, Monosulfo Cy5 (versión 1), Monosulfo Cy5 (versión 2), y TAMPRA X. Las figuras 19a a 19e muestran fórmulas estructurales de los colorantes mencionados anteriormente. En las figuras 19a a 19e, se muestran los colorantes, algunas veces como colorantes puros sin grupo espaciador, algunas veces como colorantes reactivos incluyendo grupo espaciador y reactivo.

Según el primer aspecto de la presente invención, las partículas marcadas están marcadas con uno o más de los colorantes seleccionados del grupo que consiste en colorantes representados por las fórmulas generales (I), (IIa), (IIb) o (III):

X1 es O, S o CR5R6;

X2 es O, S o CR7R8;

R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y grupos alquilo que pueden estar sustituidos;

R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos (preferiblemente alquilo de C^1-4), grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos;

con la condición de que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH²-;

a es un número entero de 0 a 4;

b es un número entero de 0 a 4; y

n es un número entero de 1 a 3, preferiblemente 1 o 2;

en donde

uno de X3 y X4 es NR9 y el otro de X3 y X4 es O, S o CR13R14;

R9 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, y grupos alquilo que pueden estar sustituidos;

R10, R11, R12, R13y R14se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos (preferiblemente alquilo de C^1-4), grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos;

con la condición de que al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13 y R14 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH²-;

c es un número entero de 0 a 4;

d es un número entero de 0 a 2;

e es un número entero de 0 a 4; y

m es un número entero de 1 a 3, preferiblemente 1 o 2; y

en donde

Y es OR18 o NR19R20;

Z es O o NR21R22;

R15, R16 y R17 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos (preferiblemente alquilo de C^1-4), grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos;

con la condición de que al menos uno de R17 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula; R18 es H o un ion de metal alcalino,

R19, R20, R21 y R22 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y grupos alquilo que pueden estar sustituidos, preferiblemente, R19, R20, R21 y R22 son cada uno iguales;

f es un número entero de 0 a 3;

g es un número entero de 0 a 3; y

h es un número entero de 1 a 5.

El grupo alquilo de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R19, R20, R21 y R22 preferiblemente es un grupo alquilo de C^1-4 que puede estar sustituido como, pero no limitado a, metilo, etilo, propilo, n-butilo, tert-butilo, metoxietilo.

Los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, R19, R20, R21 y R22 preferiblemente no contienen grupos grandes como grupos arilo que introducen gran impedimento estérico que puede alterar el cambio de intensidad de fluorescencia tras la unión del ligando a la partícula marcada.

El grupo alquenilo de R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16 y R17 preferiblemente es un grupo alquenilo de C^1-4 que puede estar sustituido. El grupo alcoxi de R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16 y R17 preferiblemente es un grupo alcoxi de C^1-4 que puede estar sustituido.

El grupo alquilo de R1 y R2 puede estar sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alcoxi y sulfonato, preferiblemente metoxi y sulfonato.

El grupo éster carboxilato, grupo alquilo, grupo alquenilo o grupos alcoxi de R3, R4, R5, R6, R7 y R8 puede estar sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en grupos oxo y sulfonatos, preferiblemente sin sustituyentes.

El grupo alquilo de R9 puede estar sustituido con los mismos sustituyentes que el grupo alquilo de R1 y R2 y puede preferiblemente estar sustituido con uno o más grupos sulfonato.

El grupo éster carboxilato, grupo alquilo, grupo alquenilo o grupo alcoxi de R10, R11, R12, R13y R14 puede estar sustituido con los mismos sustituyentes que el grupo alquilo, grupo alquenilo o grupo alcoxi de R3, R4, R5, R6, R7 y R8 y puede preferiblemente estar sustituido con uno o más grupos alquilo, preferiblemente grupos metilo.

El grupo éster carboxilato, grupo alquilo, grupo alquenilo o grupo alcoxi de R15, R16 y R17 puede estar sustituido con los mismos sustituyentes que el grupo alquilo, grupo alquenilo o grupo alcoxi de R3, R4, R5, R6, R7 y R8 y puede preferiblemente no tener sustituyentes.

El grupo alquilo de R19, R20, R21 y R22 puede estar sustituido con los mismos sustituyentes que el grupo alquilo de R1 y R2 y puede preferiblemente no tener sustituyentes.

El grupo espaciador es un grupo mediante el cual el colorante se conjuga a la partícula. Lo más preferiblemente, el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH², tal como un grupo espaciador hexanoilo.

En el contexto de la presente invención, los términos “ácido sulfónico” y “grupo sulfonato” se usan de forma intercambiable y se refieren al grupo “-SO³"”. Como entenderá un experto en la materia, este grupo tiene carga negativa. Esta carga negativa requiere o bien una correspondiente carga positiva en la partícula marcada (sal interna) o un correspondiente ion positivo debe estar presente en la solución. El ion positivo puede ser cualquier ion que sea soluble en la solución que comprende las partículas marcadas y se puede seleccionar preferiblemente de iones amonio, iones de metales alcalinos e iones de metales alcalinotérreos, lo más preferiblemente iones sodio o potasio. Asimismo, una partícula marcada que tiene una carga positiva global requiere un correspondiente ion negativo en la solución. El ion negativo puede ser cualquier ion que sea soluble en la solución que comprende las partículas marcadas y puede preferiblemente seleccionarse de iones halogenuro, iones sulfato, iones hexafluorofosfato o tetrafluorofosfato.

Los colorantes de fórmula (I) son preferiblemente colorantes representados por la fórmula general (I'):

en donde

X1 es O o CR5R6;

X2 es O o CR7R8;

R1, R2, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan cada uno independientemente de un grupo alquilo de C^1-20 que puede estar sustituido;

R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y ácido sulfónico o una sal del mismo;

con la condición de que al menos uno de R1, R2, R5, R6, R7 y R8 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH²-; y

n es un número entero igual a 1 o 2.

Los colorantes de la fórmula (IIa) o (IIb) son preferiblemente colorantes representados por la fórmula general (IIa') o (IIb'):

en donde

uno de X3 y X4 es NR9 y el otro de X3 y X4 es CR13R14;

el grupo sulfonato está en posición 4 con respecto a NR9;

R9 es un grupo alquilo de C¹-C²⁰ que puede estar sustituido;

R11, R12, R13 y R14 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos (preferiblemente alquilo de C^1-4), grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos;

con la condición de que al menos uno de R9, R13 y R14 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH²-;

d es un número entero de 0 a 2;

e es un número entero de 0 a 3; y

m es un número entero de 1 a 2.

Incluso más preferiblemente, los colorantes de fórmula (IIa') o (IIb') son colorantes representados por las fórmulas generales (IIa'') o (IIb''):

uno de X3 y X4 es NR9 y el otro de X3 y X4 es CR13R14;

el grupo sulfonato está en posición 4 con respecto a NR9;

R9 es un grupo alquilo de C^3-6 que puede estar sustituido;

R13 y R14 son cada uno independientemente un grupo alquilo de C^1-4 que puede estar sustituido;

con la condición de que al menos uno de R9, R13 y R14 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH²-; y

m es un grupo entero igual a 1 o 2.

Los colorantes de fórmula (III) son preferiblemente colorantes representados por la fórmula general (III'):

en donde

Y es OH o N(CHa)²;

Z es O o N(CHa)²;

R15 y R16 son cada uno independientemente hidrógeno, o un halógeno;

R17 es un grupo espaciador mediante el que el colorante está conjugado a la partícula; y

R17a es un grupo carboxi, o una sal del mismo.

Preferiblemente, el grupo espaciador en dichos colorantes de fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa” ) o (IIb'') es una cadena de alquileno de C⁴ a C²⁰, que puede estar sustituida, en donde uno o más átomos de carbono de la cadena de alquileno se puede sustituir independientemente por grupos alicíclicos, grupos arilo, grupos heterocíclicos, grupos heteroarilo, o heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N, y S. Más preferiblemente, los colorantes de las fórmulas generales (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa” ) o (IIb” ) comprenden este grupo espaciador preferido. Incluso más preferiblemente los colorantes de las fórmulas generales (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa'') o (IIb'') comprenden este grupo espaciador preferido conjugado a una biomolécula, preferiblemente conjugado a una proteína.

Incluso más preferiblemente, el grupo espaciador de fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa'') o (IIb'') es una cadena de alquileno de C⁴ a C6, que puede estar sustituida, en donde un átomo de carbono puede estar sustituido por un grupo arilo. Incluso más preferiblemente los colorantes de las fórmulas generales (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa'') o (IIb'') comprenden este grupo espaciador incluso más preferido. Lo más preferiblemente, los colorantes de las fórmulas generales (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa'') o (IIb'') comprenden este grupo espaciador incluso más preferido conjugado a una biomolécula, preferiblemente conjugado a una proteína.

Preferiblemente, el grupo espaciador en dichos colorantes de fórmulas generales (III) o (III') es una cadena de alquileno de C² a C¹⁰, que puede estar sustituida, en donde uno o más átomos de carbono de la cadena de alquileno se puede sustituir independientemente por grupos alicíclicos, grupos arilo, grupos heteroarilo, grupos heterocíclicos, o heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N, y S. Más preferiblemente, los colorantes de la fórmula general (III') comprenden este espaciador preferido. Incluso más preferiblemente, los colorantes de la fórmula general (III') comprenden este espaciador preferido conjugado a una biomolécula, preferiblemente conjugado a una proteína.

Incluso más preferiblemente, el grupo espaciador en dichos colorantes de fórmulas generales (III) o (III') es una cadena de alquileno de C³ a C⁷, que puede estar sustituida, en donde uno o más átomos de carbono de la cadena de alquileno se puede sustituir por heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N, y S. Incluso más preferiblemente, los colorantes de la fórmula general (III') comprende este grupo espaciador incluso más preferido. Lo más preferiblemente, los colorantes de la fórmula general (III') comprende este grupo espaciador incluso más preferido conjugado a una biomolécula, preferiblemente conjugado a una proteína.

Los colorantes de fórmulas generales (III) o (III') también comprende un grupo espaciador como se define con respecto al grupo espaciado de los colorantes de las fórmulas generales (I'), (IIa'), (IIb'), (IIa'') o (IIb'').

El grupo espaciador de las fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa''), (IIb''), (III) o (III') habitualmente no contiene dos heteroátomos consecutivos. El grupo espaciador de cualquiera de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, y R17 habitualmente es un grupo que está unido a la estructura de colorante a través de un grupo metileno, es decir, el grupo espaciador R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, y R17 empieza en el extremo, que está próximo a la estructura del colorante, con un grupo metileno. El extremo lejano del grupo espaciador, es decir, el extremo del grupo espaciador que está unido a la partícula, es con frecuencia un grupo carbonilo. Además, el grupo espaciador de las fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa''), (IIb''), (III) o (III') es preferiblemente una cadena de alquileno de C⁴ a C²⁰, que puede estar sustituida, en donde uno o más átomos de carbono de la cadena de alquileno pueden estar sustituidos independientemente por heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N, y S, en donde el extremo lejano del grupo espaciador es un complejo TrisNTA-Ni, que comprende tres iones Ni(II). En otras palabras, el grupo espaciador está unido al colorante como se muestra ejemplarmente en la figura 19e para TrisNTA647 y TrisNTA Oregon Green 488. El TrisNTA se conjuga a la partícula a través de los iones Ni.

Los sustituyentes del grupo espaciador en las fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa” ), (IIb” ), (III) o (III') se pueden seleccionar de grupos oxo, alquilensulfonatos de C^1-4, y alquilo de C^1-4.

La cadena de alquileno de C⁴ a C²⁰ del grupo espaciador de las fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa” ) o (IIb'') puede estar sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en grupos oxo, alquilensulfonatos de C^1-4, y alquilo de C^1-4, preferiblemente grupos oxo, metilensulfonatos y alquilo de C^1-4.

La cadena de alquileno de C⁴ a C6 del grupo espaciador de las fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa'') o (IIb'') puede estar sustituida con los mismos sustituyentes que la respectiva cadena de alquileno de C⁴ a C²⁰ y puede preferiblemente estar sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en grupos oxo.

El N-heteroátomo opcional en la anterior cadena de alquileno de C⁴ a C²⁰ de la cadena de alquileno de las fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa'') o (IIb'') puede estar sustituido con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo de C^1-4.

La cadena de alquileno de C² a C¹⁰ del grupo espaciador de las fórmulas generales (III) o (III') puede estar sustituida con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en grupos oxo y alquilo de C^1-4, preferiblemente grupos oxo.

El N-heteroátomo opcional en la anterior cadena de alquileno de C² a C¹⁰ de las fórmulas generales (III) o (III') puede estar sustituida con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo de C^1-4, preferiblemente hidrógeno.

Los grupos alicíclicos, grupos arilo, grupos heteroarilo, grupos heterocíclicos opcionales en la cadena de alquileno de los grupos espaciadores de las fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb'), (IIa''), (IIb''), (III) o (III') pueden estar sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en grupos oxo y alquilo de C^1-4, preferiblemente grupos oxo.

Los colorantes se pueden obtener de Dyomics, Thermo Fischer Scientific, Lumiprobe, Cyandye o Kerafast. Alternativamente, los colorantes empleados en la presente invención se pueden preparar por métodos conocidos. Los métodos específicos de preparar colorantes de benzopirilio tal como DY631 se describen en el documento US 6.924.372 B2; la preparación de DY647P1 y monosulfo DY647P1 se describe en el documento US 2013/0251637 A9; la síntesis de colorantes tales como Z-Cy5 se describe en el documento US 8.197.758 B2; y un método de preparar monosulfoCy5 se proporciona en el documento US 5.268.486. Estos documentos se incorporan al presente documento mediante referencia en su totalidad.

Las partículas marcadas se pueden formar haciendo reaccionar la partícula (tal como una biomolécula) con un colorante reactivo que tiene un grupo reactivo que permite la conjugación del colorante a la partícula. Un grupo reactivo particularmente preferido es un grupo éster activado de N-hidroxisuccinimida (NHS), que se usó en los ejemplos. Sin embargo, el grupo reactivo no está limitado a NHS, sino que otros grupos que permiten la conjugación del colorante a la partícula se pueden emplear tales como maleimida, amida, sulfonamida, urea y formación de tiourea con ésteres activados de N-hidroxisuccinimida, cloruros de sulfonilo, isocianatos, isotiocianatos, azidas, alquinos, hidrazida, ácido carboxílico y grupos amino. En principio, cualquier modificación del colorante que permita su conjugación a la biomolécula se puede emplear. Los métodos de modificar biomoléculas se han estudiado por E. M. Sletten y C. R. Bertozzi en Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009; 48(38): 6974-6998, que se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad.

Un procedimiento de marcaje de proteínas ejemplar comprende las siguientes etapas:

1. preparar la partícula en un correspondiente tampón de marcaje;

2. añadir el colorante y mezclarlo con la partícula;

3. incubar durante un periodo de tiempo determinado en la oscuridad a la temperatura determinada (la mayoría de las veces en hielo, temperatura ambiente o 37 °C); y

4. eliminar el colorante no unido por métodos de purificación como, pero no limitado a, cromatografía en gel, cromatografía de exclusión molecular; como el tampón de elución se puede usar el tampón de ensayo.

Para el marcaje de proteína-etiquetas la eliminación del colorante libre habitualmente no es necesaria debido a la proporción de marcaje estequiométrico, en el que todo el colorante se une a la etiqueta.

Puesto que el colorante se unirá a la partícula a través de un grupo espaciador, el grupo reactivo anteriormente mencionado habitualmente se une al otro extremo del grupo espaciador en el colorante reactivo, es decir, un grupo espaciador se une en un extremo al colorante y en el otro extremo al grupo reactivo. Después de la reacción del colorante reactivo que tiene un grupo reactivo con la partícula, el colorante se une a la partícula a través del grupo espaciador.

Los colorantes reactivos se pueden proporcionar en un kit de mareaje de proteínas. Cada kit puede contener material suficiente para múltiples reacciones de marcaje de proteínas, tal como 2 a 8, preferiblemente 3 a 5 reacciones de marcaje de proteínas. Dependiendo en la cantidad de proteína usada, se puede proporcionar suficiente material para aproximadamente 1000 experimentos a microescala.

El kit de marcaje incluye como un componente principal el colorante reactivo. Preferiblemente, el kit puede incluir más de un colorante como en el quinto aspecto de la presente divulgación, tal como 2 o 3 diferentes colorantes, más preferiblemente 2 diferentes colorantes por separado. El kit de marcaje de proteínas preferiblemente además comprende un manual de instrucciones que explica el uso del kit en al menos uno de los métodos de la presente invención.

Además, el kit con frecuencia además incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en columnas de intercambio de tampón, columnas de purificación, tampones de marcaje, adaptadores, y combinaciones de los mismos.

La unión de ligando a una biomolécula diana como una proteína puede producir una amplia gama de cambios conformacionales tal como cadenas laterales de aminoácidos, movimiento de bucles o dominios. El ligando que se puede usar en el primer aspecto de la presente invención se puede (pero sin limitar a) seleccionar del grupo que consiste en iones, metales, compuestos, fragmentos de fármacos (pequeños fragmentos químicos, que se pueden unir solo débilmente a la diana biológica), hidratos de carbono, moléculas pequeñas tal como ATP (compuestos orgánicos que tienen un peso molecular bajo (< 900 dalton); las moléculas pequeñas pueden ayudar a regular un proceso biológico y habitualmente tienen un tamaño del orden de 1 nm), fármacos, profármacos, lípidos, biomoléculas, proteínas tal como quimioquina y citoquina, péptidos, peptoides, enzimas, antígenos, cofactores, ácidos nucleicos, aptámeros, inhibidores, receptores de Fc, ADNmc, nanopartículas, liposomas, vesículas unilamelares (incluyendo vesículas unilamelares pequeñas (SUV) y vesículas unilamelares gigantes (GUV)), polímeros, moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, complejos metálicos, hormonas, sabores, odorantes, partículas y (micro)perlas. Preferiblemente, los ligandos se seleccionan del grupo que consiste en iones, metales, compuestos, fragmentos de fármacos, hidratos de carbono, moléculas pequeñas, fármacos, profármacos, lípidos, proteínas, péptidos, peptoides, enzimas, ácidos nucleicos, aptámeros, hormonas, sabores y odorantes.

En lo siguiente, las combinaciones partícula-ligando se muestran usando la notación “partículas-ligando”, es decir, la partícula se muestra en el lado izquierdo de la flecha y el correspondiente ligando se muestra en el lado derecho de la flecha.

Las combinaciones partículas-ligando preferidas se seleccionan del grupo que consiste en enzimaslípido, receptorshormona, receptorsquimioquina, enzimasinhibidor, receptorsneutransmisor, receptorscitoquina, enzimasion, receptorsion, receptorsaminoácido, enzimascofactor, receptorslípido, receptorsesterol, enzimasfragmento, receptorspéptido, receptorsfragmento, enzimasmetabolito, receptorsreceptor, receptorsglucolípido, enzimasADN, receptorsodorante, receptorsprofármaco, enzimasARN, receptorsfármaco, enzim asm onos/d i- o polisacárido, enzimasácido graso, enzimasvitamina, enzimasprofármaco, enzimasfármaco, liposomasproteína, proteína transportadorassustrato, anticuerposantígeno, partícula víricasreceptor, virussproteína estructural, anticuerposreceptor de Fc, chaperonasATP, ADNmcsADNmc, aptámerosligando, chaperonasiones, ARNsmolécula pequeña, poliscáridosmolécula pequeña, chaperonasproteína, ADNsmoléclula pequeña, proteína estructuralsproteína estructural, proteína de señalizaciónsproteína de señalización, proteína de señalizaciónsmolécula pequeña, proteína de señalizaciónsprofármaco, proteína de señalizaciónsfármaco, proteína de señalizaciónslípido, proteína estructuralsiones, nanopartículasproteína, orgánulo celularsproteína, nanopartículasADN, orgánulo celularslípido, nanopartículasARN. Las combinaciones partículasligando más preferidas se seleccionan del grupo que consiste en enzimaslípido, receptorshormona, receptorsquimioquina, enzimasinhibidor, receptorsneutransmisor, receptorscitoquina, enzimasion, receptorsion, receptorsaminoácido, enzimascofactor, receptorslípido, receptorsesterol, enzimasfragmento, receptorspéptido, receptorsfragmento, enzimasmetabolito, receptorsreceptor, receptorsglucolípido, enzimasADN, receptorsodorante, receptorsprofármaco, enzimasARN, receptorsfármaco, enzimasmono/di- o polisacárido, enzimasácido graso, enzimasvitamina, enzimasprofármaco, enzimasfármaco, liposomasproteína, proteína transportadorassustrato, anticuerposantígeno, partícula víricasreceptor, virussproteína estructural, anticuerposreceptor de Fc, chaperonasATP, ADNmcsADNmc, aptámerosligando, chaperonasiones, ARNsmolécula pequeña, chaperonasproteína, ADNsmoléclula pequeña, proteína estructuralsproteína estructural, proteína de señalizaciónsproteína de señalización, proteína de señalizaciónsmolécula pequeña, proteína de señalizaciónsprofármaco, proteína de señalizaciónsfármaco, proteína de señalizaciónslípido, proteína estructuralsiones.

Las combinaciones partículasligando más preferidas se seleccionan del grupo que consiste en enzimaslípido, receptorshormona, receptorsquimioquina, enzimasinhibidor, receptorsneutransmisor, receptorscitoquina, enzimasion, receptorsion, receptorsaminoácido, enzimascofactor, receptorslípido, receptorsesterol, enzimasfragmento, receptorspéptido, receptorsfragmento, enzimasmetabolito, receptorsreceptor, receptorsglucolípido, enzimasADN, receptorsodorante, receptorsprofármaco, enzimasARN, receptorsfármaco, enzimasmono/di- o polisacárido, enzimas-ácido graso, enzimasvitamina, enzimasprofármaco, enzimasfármaco, liposomasproteína, proteína transportadorassustrato, anticuerposantígeno, anticuerposreceptor de Fc, chaperonasATP, ADNmcsADNmc, aptámerosligando, chaperonasiones, ARNsmolécula pequeña, chaperonasproteína, ADNsmoléclula pequeña, proteína estructuralsproteína estructural, proteína de señalizaciónsproteína de señalización, proteína de señalizaciónsmolécula pequeña, proteína de señalizaciónsprofármaco, proteína de señalizaciónsfármaco, proteína de señalizaciónslípido, proteína estructuralsiones. En las anteriores combinaciones partículasligando más preferidas, las partículas y ligandos preferiblemente derivan de células eucariotas, más preferiblemente de células humanas, de ratón, rata o primate; o de patógenos como Plasmodium ssp., Trypanosoma ssp., Vibrio ssp., Salmonella ssp., Mycobacterium tubercolosis y virus como Zika, Ébola, virus de Marburgo, Nipah, Síndrome respiratorio agudo grave (SARS), coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio(MERS-CoV), fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (CCHF), fiebre del valle de Rift (RVF), VIH.

Puesto que la dependencia a la temperatura del colorante está influida por el entorno local en el que reside el colorante, se espera que los cambios conformacionales inducidos por ligando se traduzcan a un único perfil termoóptico dependiente de la concentración del ligando presente en el sistema (Fig. 13). Como se muestra para la unión de Cy5-ADNmc a la proteína EcoSSB (es decir, proteína de unión a ADN monocatenario de Escherichia coli, Fig. 4), la modulación de la dependencia a la temperatura del colorante por el entorno local en que reside el colorante se puede usar para la determinación de la afinidad de unión usando el enfoque termoóptico y un dispositivo Peltier o láser IR como la fuente de calor (Fig. 4). El enfoque termoóptico también se puede aplicar cuando la sonda se enfría. Como se muestra en la figura 9, la sonda se precalentó con el láser IR y el cambio en fluorescencia inducido por la temperatura se siguió tras enfriar. Como fuentes adicionales de dispositivos Peltier de refrigeración, se pueden usar fluidos o gases refrigerantes (incluyendo aire).

La desnaturalización térmica de biomoléculas como proteínas se caracteriza por grandes cambios conformacionales. Puesto que la dependencia a la temperatura del colorante está influida por el microentorno local y este entorno cambia tras la desnaturalización, el enfoque termoóptico se puede usar para determinar la temperatura de fusión de la biomolécula como se muestra para MBP y TEMI (Fig. 16).

La muestra que se va a usar en el método del primer aspecto de la presente invención es una solución que comprende las partículas marcadas y los ligandos. En el presente documento, las partículas marcadas se pueden disolver o dispersar en la solución. Alternativamente, las partículas marcadas se pueden inmovilizar en un soporte sólido que se pone en contacto con la solución que contiene los ligandos. Preferiblemente, las partículas marcadas se disuelven o dispersan en la solución. La solución acuosa preferiblemente se ajusta a un valor de pH de 2 a 10, más preferiblemente de 4 a 10, incluso más preferiblemente de 5 a 9, lo más preferiblemente de 6 a 8,5, usando un tampón.

En el primer aspecto de la presente invención, la concentración preferida de las partículas marcadas en la solución es desde 10 picomolar a 1 micromolar, más preferiblemente de 100 picomolar a 100 nanomolar. La concentración del ligando es preferiblemente desde 0,01 picomolar a 1 molar, más preferiblemente desde 1 picomolar a 100 milimolar, incluso más preferiblemente de 10 picomolar a 10 milimolar.

La muestra se proporciona en una cámara de muestra preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en una placa multipocillo, un chip microfluídico, un capilar, una cubeta, un tubo de reacción, una punta de pipeta, microfluídicos, gotitas y un envase translúcido. El envase translúcido puede ser un envase de vidrio o un envase plástico.

Es ventajoso proporcionar la sonda de muestra en una cámara que tenga un espesor en la dirección del haz de excitación de la fluorescencia desde 1 pm a 500 pm, en particular de 1 pm a 250 pm, en particular de 1 pm a 100 pm, en particular de 3 pm a 50 pm, en particular de 5 pm a 30 pm. Un experto en la materia entenderá que el término cámara también se refiere a, por ejemplo, un capilar, un chip microfluídico, o placa multipocillo.

El experto en la materia entiende que el término “fluorescencia” como se emplea en el presente documento no está limitado a “fluorescencia” por sí, sino que los medios, métodos y dispositivos divulgados en el presente documento también se pueden usar y emplear mediante el uso de otros medios, en particular luminiscencia, tal como fosforescencia. Según esto, el término “excitar fluorescentemente dichas partículas marcadas y en primer lugar detectar y/o medir la fluorescencia de dichas partículas excitadas” se refiere a la “etapa de excitación” en el método anteriormente identificado y puede comprender la correspondiente excitación de luminiscencia, es decir, la excitación se lleva a cabo con una longitud de onda más corta que la detección de la siguiente emisión. Por tanto, el término “detectar y/o medir en segundo lugar una fluorescencia de las partículas” en el contexto de esta invención significa una etapa de detección de dicha emisión después de la excitación. El experto en la materia es consciente de que en el contexto de esta invención la longitud de onda de la “excitación” y la longitud de onda de la “emisión” tienen que estar separadas.

Los medios para excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas no están limitados y se puede emplear cualquier medio adecuado que conozca el experto en la materia.

Según la presente invención, los medios preferibles para excitar, preferiblemente excitar fluorescentemente las partículas/moléculas marcadas puede ser cualquier dispositivo adecuado seleccionado del grupo que consiste en láser, láser de fibra, láser de diodo, LED, halógeno, conjunto de LED, HBO (las lámparas HBO son, por ejemplo, lámparas de arco corto en las que el arco de descarga dispara en una atmósfera de vapor de mercurio a alta presión) HXP (las lámparas HXP son, por ejemplo, lámparas de arco corto en las que el arco de descarga se quema en una atmósfera de vapor de mercurio a presión muy alta. Por ejemplo, en contraste con las lámparas HBO se operan a una presión sustancialmente mayor y emplean ciclo halógeno. Las lámparas HXP generan luz UV y visible, incluyendo una porción significativa de luz roja).

Según la presente invención, los medios preferibles para detectar las partículas excitadas, en particular para detectar la fluorescencia, en la solución pude ser cualquier dispositivo adecuado seleccionado del grupo que consiste en cámara CCD (CCD 2D o de escáner en línea), cámara en línea, tubo fotomultiplicador (PMT), fotodiodo de avalancha (APD), cámara CMOS.

Los métodos de la presente invención se pueden llevar a cabo en cualquier dispositivo adecuado. Preferiblemente, el método se puede llevar a cabo usando uno de los siguientes dispositivos: Monolith NT.115 G/R MO-G009, Monolith NT.115 R/B MO-G008, Monolith NT.115 B/G MO-007, o Monolith NT.115 Pico MO-006, pero no está limitado a los mismos.

En un segundo aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir interacciones inter- y/o intramoleculares. El método del segundo aspecto comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una muestra que comprende partículas marcadas;

b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una primera fluorescencia de las partículas excitadas a una primera temperatura;

c) calentar o enfriar la solución a una segunda temperatura;

d) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una segunda fluorescencia de las partículas excitadas a la segunda temperatura;

e) caracterizar las interacciones inter- y/o intramoleculares y/o modificaciones/alteraciones de las partículas basado en la primera y segunda fluorescencia.

El método del segundo aspecto abarca, pero no está limitado a, interacciones de unión de ligando a partícula marcada como el primer aspecto de la presente invención. Además, el método del segundo aspecto de la presente invención incluye métodos de medir reacciones químicas (como reacciones inorgánicas u orgánicas, incluyendo glucosilación, fosforilación, lipidación, carbonilación, oxidación de partículas), así como formaciones de complejos y/o su disociación.

En un tercer aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir cambios dependientes del tiempo. El método del tercer aspecto comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una muestra que comprende partículas marcadas;

b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una primera fluorescencia de las partículas excitadas;

c) esperar durante un tiempo predeterminado;

d) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una segunda fluorescencia de las partículas excitadas;

e) caracterizar el cambio dependiente del tiempo de las partículas basado en la primera y segunda fluorescencia.

El método del tercer aspecto es útil para medir cambios dependientes del tiempo de las partículas marcadas, por ejemplo, para medidas cinéticas de cambios conformacionales, cinética de unión, o medidas de estabilidad para medidas de control de calidad.

En un cuarto aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para medir cambios dependientes del entorno. El método del cuarto aspecto comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una primera muestra que comprende partículas marcadas;

b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una primera fluorescencia de las partículas excitadas en la primera muestra;

c) proporcionar una segunda muestra que comprende partículas marcadas en sustancialmente la misma concentración, en donde la segunda muestra se diferencia de la primera muestra;

d) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar una segunda fluorescencia de las partículas excitadas en la segunda muestra;

e) caracterizar el cambio dependiente del entorno de las partículas basado en la primera y segunda fluorescencia.

El método del cuarto aspecto se puede usar para determinar influencias de cambios ambientales de las partículas marcadas. Tales cambios ambientales incluyen, pero no están limitados a, cambios de pH, cambios de temperatura, cambios de presión, cambios del solvente, cambios en la concentración de otros solutos tal como sales, y similares.

En los métodos del segundo, tercer y cuarto aspectos de la presente divulgación, las mismas partículas marcadas, marcadas con los mismos colorantes se emplean como en el primer aspecto de la presente invención. El término interacción se usa de la misma manera que en el primer aspecto de la presente invención. Las temperaturas a las que los métodos del segundo, tercer y cuarto aspectos se llevan a cabo corresponden a las temperaturas predeterminadas del primer aspecto de la presente invención. La diferencia de temperatura en el segundo aspecto preferiblemente es la misma que en el primer aspecto de la presente invención. Lo mismo aplica a los métodos de calentar y enfriar. La concentración de las partículas marcadas en la solución de muestra en el segundo, tercer y cuarto aspectos es preferiblemente la misma que en el primer aspecto de la presente invención. Las combinaciones partícula-ligando preferidas en el segundo, tercer y cuarto aspectos son preferiblemente las mismas que en el primer aspecto de la presente invención. También se pueden emplear las mismas cámaras de muestra. Los medios para excitar fluorescentemente las partículas marcadas y para detectar las partículas excitadas en el segundo, tercer y cuarto aspectos son preferiblemente también los mismos que en el primer aspecto de la presente invención.

La patente en EE. UU. US 9.676.787 B2 divulga ciertos compuestos de benzopirilio y su uso en el marcaje de biomoléculas. En este documento, solo se detectaron ligandos. Se hizo una serie de diluciones solamente para mostrar un intervalo de detección mejorado de los colorantes de benzopirilio divulgados comparados con colorantes preexistentes. En principio una única concentración de ligando hubiera sido suficiente para demostrar este efecto. Por tanto, se demostró solamente que los colorantes en cuestión son adecuados para aplicaciones estándar tal como inmunotransferencias. Allí, la intensidad de fluorescencia depende del número de fluoróforos que permanecen en la muestra medida. En detalle, este documento describe el siguiente procedimiento:

(a) Antígenos (ligandos) en una solución con una concentración definida se unen a una superficie.

(b) La solución de antígenos se elimina y la superficie se lava.

(c) Posteriormente, se añadieron anticuerpos marcados con los colorantes fluorescentes a la superficie y se incubó. (d) La solución que contiene los anticuerpos marcados se elimina y la superficie se lava.

(e) La fluorescencia de los anticuerpos unidos a la superficie a través de antígenos se detecta.

(f) La temperatura a la que los experimentos se llevan a cabo no se describe. Sin embargo, no era necesario un control cuidadoso de la temperatura ya que los cambios en fluorescencia son grandes.

Un experto en la materia que lee el documento US 9.676.787 B2 asumiría que el cambio en la intensidad de fluorescencia deriva del hecho de que se une más o menos anticuerpo a la superficie en el momento de detección de fluorescencia ya que había más o menos antígeno al que unirse. Se implica que cada anticuerpo muestra la misma intensidad de fluorescencia, sin importar si un ligando está unido o no. Además, para la detección de un antígeno, una única concentración de antígeno es suficiente. Esto es fundamentalmente diferente de la presente invención.

En el método de la presente invención, se pueden detectar las constantes de unión entre ligandos y partículas y no simplemente la presencia de ligandos. Por tanto, ya en el principio del ensayo, la concentración de ligando y partícula están predefinidas. La principal diferencia es que el cambio en intensidad de fluorescencia que se mide no deriva de un cambio en la cantidad de partícula marcada fluorescentemente, sino de un cambio de brillo del colorante fluorescente que percibe el entorno y por tanto el brillo cambia dependiendo del estado de unión de la partícula. En detalle, la presente invención se diferencia del documento anterior como sigue

(a) La cantidad de partícula y ligando en cada medida fluorescente está predefinida y no cambia, por ejemplo, por etapas de lavado.

(b) Cada brillo de los marcadores (fluoróforos) depende de si la particula marcada está o no unida a un ligando. (c) La temperatura se controla cuidadosamente, ya que los cambios de fluorescencia esperados pueden ser muy pequeños y pueden estar enmascarados por pequeños cambios de fluorescencia dependientes de temperatura.

En la presente invención, el cambio en fluorescencia no deriva de una cantidad diferente de partícula fluorescente, sino de un cambio en la intensidad de fluorescencia de las partículas individuales basado en si un ligando está o no unido. En particular, la fluorescencia puede aumentar o disminuir cuando un ligando está unido a la partícula marcada (fluorescente). Determinar una constante de unión (llamada Kd o Ka) requiere una serie de diluciones. Además, tanto ligando como partícula están presentes durante la medida de fluorescencia en la misma concentración que se ha predefinido. No hay etapas de lavado.

Ejemplos

Reactivos:

Los colorantes derivatizados de N-hidroxisuccinimida (NHS) se obtuvieron de Thermo Fischer Scientific (fluoresceína, Oregon Green 488, TAMRA), Lumiprobe (Cy3, Cy5, disulfoCy5, Cy5.5), Dyomics (DY495, DY567P1, DY630, DY631, DY647P1, DY650), Seta Biochemicals (SeTau-647), Cyandye (monosulfoCy3, monosulfoCy5) y ATTO TECH (ATTO488, ATTO647N, ATTO 655). Las estructuras de todos los colorantes usados se muestran en las figuras 19a a 19e. Las proteínas se obtuvieron de Crelux (Hsp90, p38a(p38 alfa), TEMI, BLIP, proteína de unión a maltosa (MBP)), anhidrasa carbónica II (CAII) se compraron de Sigma-Aldrich. El tampón de marcaje de NHS y las columnas de separación de colorantes se obtuvieron de NanoTemper Technologies GmbH. Como tampón de ensayo se usótampón Tris-MgCl² suplementado con Tween 20 al 0,05 % [Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl²10 mM).

Mareaje de proteínas:

Las proteínas diana (p38a, anhidrasa carbónica, TEMI, Hsp90) se marcaron en tampón carbonato a pH 8,2. La proporción colorante a proteína varió entre 3:1 y 5:1. La reacción de marcaje tuvo lugar a temperatura ambiente durante 30 min. Se separó un colorante libre de la proteína marcada usando columnas de separación de colorantes proporcionadas por NanoTemper Technologies.

Dispositivos usados:

A) IR.Rojo, IR.Verde o IR.Azul: se usaron prototipos de NanoTemper Technologies que incorporan un canal de detección de fluorescencia rojo, verde o azul y un láser IR (longitud de onda 1480 nm) como fuente de calor. Se usaron filtros ópticos (extinción/emisión (en nm)): IR.Rojo 500-580/655-720 nm, IR.Verde 515-555/618-652 nm, e IR.Azul 450-490/600-650 nm. Los LED usados fueron: IR.Rojo 20 mA, 2,1 V, 630 nm, IR.Verde 20 mA, 3,4 V, 540 nm; e IR.Azul 20 mA, 3,4 V, 480 nm. Estos dispositivos se usaron para la caracterización termoóptica de diferentes fluoróforos y su sensibilidad para comunicar sucesos de unión.

B) Prometheus NT.48: Un dispositivo NT.48 estándar de NanoTemper Technologies que tiene una óptica de excitación y detección en el intervalo UV. El calentamiento de las muestras de logró con un dispositivo Peltier. La aplicación principal es la detección de curvas de fusión de proteínas.

C) PR.Rojo: Prototipo de NanoTemper Technologies que usa calentamiento de la muestra basado en un dispositivo Peltier en combinación con canal de detección de fluorescencia roja (500-580/655-720 nm). Este dispositivo se usó para la caracterización termoóptica de diferentes fluoróforos y su sensibilidad para sucesos de unión y para desnaturalización térmica de las proteínas.

Medidas de fluorescencia:

Los cambios en la intensidad de fluorescencia tras el calentamiento se midieron usando IR.Rojo, IR.Verde o IR.Azul para calentar las sondas usando láser IR, o PR.Rojo para calentar las sondas usando el dispositivo Peltier. Para los experimentos las sondas o se cargaron en placas de 384 pocillos o contenedor de vidrio personalizado. Las sondas contenían colorante libre, solamente diana marcada con fluorescencia a una concentración determinada o una serie de diluciones de un ligando específico mezclado con diana marcada con fluorescencia a una concentración determinada.

Adquisición de datos y análisis:

Durante la adquisición de datos, los datos sin procesar de un convertidor analógico-digital se mostraron como intensidad de fluorescencia (en unidades arbitrarias). Cada curva individual se normalizó después para empezar en 1. Para la representación de una curva de unión, los intervalos antes y después del calentamiento se ajustaron y los datos en el intervalo se promediaron y se calculó Fnorm. Cada punto de datos en la curva de unión representa una Fnorm media a ciertas concentraciones de ligando.

Las constantes de disociación (K ^d ) se determinaron con software de análisis MO Affinity (NanoTemper Technologies GmbH) u Origin (Origin Lab). Los cambios inducidos por temperatura en la intensidad de fluorescencia se normalizaron como: la intensidad de fluorescencia inicial (F) se definió como 1 y los datos se normalizaron como F ^t /F ^í , donde F ^t es la intensidad de fluorescencia a una temperatura aumentada determinada. La Fnorm resultante se representó frente a la concentración creciente del ligando determinado. La constante de disociación (K ^d ) se determinó según el ajuste que describe una interacción molecular con una estequiometría 1:1 según la ley de acción de masas. La Kd se estima ajustando la ecuación:

c crf

f (c) = Sin unir (Unido — Sin unir) x

donde f(c) es la fracción unida a una concentración de ligando determinada c, Sin unir es la señal de Fnorm de la diana, Unido es la señal de Fnorm del complejo, Kd es la constante de disociación o afinidad de unión, y cdana es la concentración final de la diana en el ensayo.

Ejemplo de referencia 1

100 nM de fluoróforos éster de NHS (colorante IR 650 (LI-COR Biotechnology), CF647 (Biotium), Dylight 655 B1, B2 y B3 (Thermo Scientific) y CF64OR (Biotium)) el tampón de ensayo, se cargaron en capilares tratados en Prometheus NT.48 estándar (NanoTemper Technologies) en duplicado y se sometieron a experimentos termoópticos en un dispositivo IR con una óptica Monolith NT.115 Azul/Roja usando 4, 8, 16, 24, 32 y 40 mW de potencia láser IR. El cambio inducido por el laser IR en la fluorescencia se siguió durante 20 segundos. Las mismas muestras también se sometieron a rampa de temperatura lineal calentando mediante un elemento Peltier a 1 K/min. La fluorescencia de la muestra se recogió usando óptica Monolith NT.115 Azul/Roja (NanoTemper Technologies). Para el análisis, la pérdida de fluorescencia relativa en los experimentos termoópticos se correlacionó con la temperatura y la pérdida de fluorescencia relativa de los experimentos usando calentamiento lineal en el dispositivo Peltier. Los resultados se proporcionan en la figura 1.

Los cambios inducidos por temperatura en la intensidad de fluorescencia observados con PR.Rojo se correlacionan estrictamente con los cambios inducidos por temperatura en la intensidad de fluorescencia observados con IR.Rojo a la misma temperatura (Fig. 1A y 1B).

Ejemplo de referencia 2

Los colorantes se prediluyeron en DMSO y se diluyeron más en el tampón de ensayo a una concentración final de 100 nM. Los colorantes llenaron después capilares de vidrio Prometheus de alta sensibilidad y se cargaron en triplicados en el PR.Rojo. La rampa de calentamiento se ajustó a 1 K/min y los datos se registraron de 293-368 K. Los resultados se proporcionan en la figura 2.

Ejemplo de referencia 3

Los colorantes se prediluyeron en DMSO y se diluyeron más en los tampones determinados a una concentración final de 100 nM. Los colorantes llenaron después capilares de vidrio Prometheus de alta sensibilidad y se cargaron en triplicados en el PR.Rojo. La rampa de calentamiento se ajustó a 1 K/min y los datos se registraron de 293-368 K.

Se ha encontrado que el cambio de intensidad de fluorescencia inducido por temperatura está además modulado también por el entorno en el que reside el colorante como se muestra en la figura 3. El grado de esta sensibilidad depende de las estructuras del colorante. DY647P1 y monosulfoCy5 son colorantes de polimetino, que se diferencian en el número de grupos sulfonato. DY647P1 posee dos, monosulfoCy5 posee solo un grupo sulfonato.

Ejemplo 1

Se purificó proteína EcoSSB recombinante como se describe por Curth U. et al. en Biochemistry, 1993, 32 (10), pp 2585-2591, que se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad. La proteína se diluyó de 1 pM a 0,4 nM en una dilución en serie en Hepes 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM y EDTA 2 mM en un volumen final de 10 pl por concentración. Posteriormente, 10 pl de una solución que contenía Cy5-oligodT3520 nM (Metabion) en el mismo tampón se añadieron a cada concentración de EcoSSB. 10 ml de cada solución llenaron capilares recubiertos Monolith NT.LabelFree Premium (para experimentos que usan el dispositivo de Peltier PR.Rojo) y capilares recubiertos Monolith NT.115 Premium (para experimentos en el dispositivo láser IR.Rojo). El calentamiento se realizó en una gradiente lineal de 293 K a 368 K a 7 K/min en el PR.Rojo y con una potencia láser de 16 mW en el IR.Rojo. El cambio de fluorescencia normalizado a la temperatura de 302 K se representó frente a la concentración de EcoSSB. Los resultados se proporcionan en la figura 4.

Ejemplo 2

Marcaje de proteína: La proteína TEM1 se marcó con monosulfoCy5 usando tampón de marcaje de NHS y una proporción de proteína a colorante de 1:3. Por tanto, 100 pl de solución de colorante 24 pM se mezclaron con 100 pl de solución de proteína 8 pM y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. El colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular. Para esto, se equilibró columna B usando 9 ml de tampón de ensayo, antes de cargar la reacción de marcaje para que entrara en la resina. Después de la adición de 300 pl de tampón de ensayo, las proteínas marcadas se eluyeron usando 600 pl de tampón de ensayo. Aquí, los primeros 100 pl no contienen proteína y se desecharon.

Preparación de la dilución en serie: Después del marcaje de la proteína, se preparó una dilución en serie de los ligandos. BLIP se diluyó en tampón de ensayo a 1 pM. Empezando con esta solución, se preparó una dilución en serie de 16 etapas usando un volumen de muestra de 10 pl. Después de la preparación de la dilución en serie, 10 pl de TEM1 marcada 132 nM se añadieron a la serie de diluciones. Las muestras se mezclaron pipeteando arriba y abajo. Antes de cargar capilares de vidrio recubiertos superiores, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 4 °C y 15.000 g.

Medidas con PR.Rojo y análisis de datos: Los experimentos se realizaron usando PR.Rojo. Las medidas de afinidad de TEM1 para BLIP se llevaron a cabo usando LED al 20 %. Los datos se analizaron usando software de análisis MO Affinity (NanoTemper Technologies). Los resultados se proporcionan en la figura 5.

Ejemplo 3

Mareaje de proteína: La proteína CAII se marcó con monosulfoCy5 o DY647P1 usando tampón de mareaje de NHS y una proporción de proteína a colorante de 1:3. Por tanto, 100 |jl de solución de colorante 24 jM se mezclaron con 100 |j| de solución de proteína 8 jM y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. El colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular como se describe en el ejemplo 2.

Preparación de la dilución en serie: Después del marcaje de la proteína, se preparó una dilución en serie de los ligandos. Furosemida se diluyó en tampón de ensayo a 50 jM . Empezando con esta solución, se preparó una dilución en serie de 16 etapas usando un volumen de muestra de 10 jl. Después de la preparación de la dilución en serie, 10 j l de CAII marcada 100 nM se añadieron a la serie de diluciones. Las muestras se mezclaron pipeteando arriba y abajo. Antes de cargar capilares de vidrio recubiertos superiores, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 4 °C y 15.000 g.

Medidas con PR.Rojo y análisis de datos: Los experimentos se realizaron usando PR.Rojo. Las medidas de afinidad de CAII para furosemida se llevaron a cabo usando LED al 20 %. Los datos se analizaron usando software Origin (Origin Lab Corporation). Los resultados se proporcionan en la figura 6.

Ejemplo 4

Marcaje de proteína: La proteína A se marcó con monosulfoCy5 usando tampón de marcaje de NHS y una proporción de proteína a colorante de 1:3. Por tanto, 100 j l de solución de colorante 24 jM se mezclaron con 100 j l de solución de proteína 8 jM y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. El colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular como se describe en el ejemplo 2.

Preparación de la dilución en serie: Después del marcaje de la proteína, se preparó una dilución en serie de los ligandos. Trastuzumab se diluyó en tampón PBS-Tween 20 al 0,05 % a 2,5 jM . Empezando con esta solución, se preparó una dilución en serie de 16 etapas usando un volumen de muestra de 10 jl. Después de la preparación de la dilución en serie, 10 j l de proteína A marcada 10 nM se añadieron a la serie de diluciones. Las muestras se mezclaron pipeteando arriba y abajo. Antes de cargar capilares de vidrio recubiertos superiores, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 4 °C y 15.000 g.

Medidas con IR.Rojo y análisis de datos: Los experimentos se realizaron usando IR.Rojo. Las medidas de afinidad de Proteína A para trastuzumab se llevaron a cabo usando LED al 20 % y el láser IR apagado. Los datos se analizaron usando software de análisis MO Affinity (NanoTemper Technologies) y GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc.). Los resultados se proporcionan en la figura 7.

Ejemplo 5

Marcaje de proteína: La proteína IL-1R se marcó con derivados de DyLight655 según protocolo de marcaje de NHS estándar. Para esto, el colorante se prediluyó en DMSO y se diluyó más en tampón de marcaje de NHS a una concentración final de 6 jM . La proteína se diluyó a una concentración final de 2 jM en el mismo tampón optimizado para reacción de marcaje. Para la reacción de marcaje 100 j l de solución de colorante se mezclaron con 100 j l de solución de proteína y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de ello, el colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular. Para esto, se equilibró columna B usando 9 ml de tampón de ensayo, antes de cargar la reacción de marcaje para que entrara en la resina. Después de la adición de 300 j l de tampón de ensayo, las proteínas marcadas se eluyeron usando 600 j l de tampón de ensayo. Aquí, los primeros 100 j l no contienen proteína y se desecharon.

Preparación de la dilución en serie: Después del marcaje de la proteína, se preparó una dilución en serie del ligando anakinra en un volumen de muestra de 10 jl. Después de la preparación de la dilución en serie, 10 j l de proteína marcada 1 nM se añadieron a todas las diluciones de ligando. Las muestras se mezclaron pipeteando arriba y abajo. Antes de cargar capilares de vidrio recubiertos superiores, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 4 °C y 15.000 g.

Medidas con IR.Rojo y análisis de datos: Los experimentos se realizaron usando IR.Rojo a potencia de láser IR de 12 mW para calentar las sondas a 310 K a potencia LED del 60 %. Los datos se analizaron usando software de análisis MO Affinity (NanoTemper Technologies). Los resultados se proporcionan en la figura 8.

Ejemplo 6

Marcaje de proteína: La proteína p38 alfa se marcó con Cy5 usando química de marcaje de NHS. Para esto, el colorante se prediluyó en DMSO y se diluyó más en tampón de marcaje de NHS a una concentración final de 24 jM . La proteína se diluyó a una concentración final de 8 jM en el mismo tampón optimizado para reacción de marcaje. Para la reacción de marcaje 100 j l de solución de colorante se mezclaron con 100 j l de solución de proteína y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de ello, el colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular. Para esto, se equilibró columna B usando 9 ml de tampón de ensayo, antes de cargar la reacción de marcaje para que entrara en la resina. Después de la adición de 300 j l de tampón de ensayo, las proteínas marcadas se eluyeron usando 600 |jl de tampón de ensayo. Aquí, los primeros 100 |j| no contienen proteína y se desecharon.

Preparación de la dilución en serie: Después del mareaje de la proteína, se preparó una dilución en serie de los ligandos. El tampón de ensayo con DMSO al 4 % sirvió como el tampón de ensayo. PD169316 se diluyó en tampón de ensayo a 10 jM y DMSO al 4 %. Empezando con esta solución, se preparó una dilución en serie de 16 etapas usando un volumen de muestra de 10 jl. Después de la preparación de la dilución en serie, 10 j l de la proteína marcada 100 nM se añadieron a todas las diluciones de ligando. Las muestras se mezclaron pipeteando arriba y abajo. Antes de cargar capilares de vidrio recubiertos superiores, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 4 °C y 15.000 g.

Medidas con IR.Rojo y análisis de datos: Los experimentos se realizaron usando IR.Rojo a potencia de láser IR de 24 mW y la potencia LED del 20 %. La sonda se precalentó con el láser IR a la temperatura de 308 K. Después de enfriar la sonda a 296 K, se siguió el cambio en la fluorescencia. Los datos se analizaron usando software de análisis MO Affinity (NanoTemper Technologies). Los resultados se proporcionan en la figura 9.

Ejemplo 7

Marcaje de proteína: La proteína p38a etiquetada con histidina se marcó con derivado tris-NTA de Oregon Green 488. Para esto el colorante se diluyó en PBST a una concentración final de 100 nM, mientras la concentración de proteína se ajustó a 200 nM usando tampón PBST. Ambas muestras se mezclaron 1:1 con un volumen final de 200 j l y la reacción de marcaje se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de ello, la mezcla de reacción se centrifugó durante 10 min a 4 °C y 15.000 g.

La proteína p38 alfa etiquetada con histidina se marcó con Oregon Green 488, Cy5, Z Cy5, TAMRA y TAMRAX usando química de marcaje de NHS. Para esto, el colorante se prediluyó en DMSO y se diluyó más en tampón de marcaje de NHS a una concentración final de 6 jM para Z-Cy5 y 24 jM para los otros colorantes. La proteína se diluyó a una concentración final de 2 jM para Z-Cy5 y 8 jM para los otros colorantes usando el mismo tampón optimizado para reacción de marcaje. Para la reacción de marcaje 100 j l de solución de colorante se mezclaron con 100 j l de solución de proteína y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de ello, el colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular. Para esto, se equilibró columna B usando 9 ml de tampón de ensayo, antes de cargar la reacción de marcaje para que entrara en la resina. Después de la adición de 300 j l de tampón de ensayo, las proteínas marcadas se eluyeron usando 600 j l de tampón de ensayo. Aquí, los primeros 100 j l no contienen proteína y se desecharon.

Preparación de la dilución en serie: Después del marcaje de la proteína, se preparó una dilución en serie de los ligandos. El tampón de ensayo con DMSO al 4 % sirvió como el tampón de ensayo. PD169316 para p38 marcada con Z-Cy5 y BIRB para los otros productos de marcaje se diluyeron en tampón de ensayo a 10 jM y DMSO al 4 %. Empezando con esta solución, se preparó una dilución en serie de 16 etapas usando un volumen de muestra de 10 jl. Después de la preparación de la dilución en serie, 10 j l de la proteína marcada 100 nM se añadieron a todas las diluciones de ligando. Las muestras se mezclaron pipeteando arriba y abajo. Antes de cargar capilares de vidrio recubiertos superiores, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 4 °C y 15.000 g.

Medidas con IR.Rojo y análisis de datos: Los experimentos se realizaron usando IR.Rojo a potencia de láser IR de 24 mW. Para los colorantes Cy5, Z-Cy5, Oregon Green 488 y Oregon Green 488-tris NTA las sondas se calentaron de 296 K a 310 K y para TAMRa y TAMRA X a 318 K. Debido a diferencias intrínsecas en la intensidad de fluorescencia de los colorantes, la potencia LED se tuvo que optimizar para cada colorante. Para p38a-Cy5 se midió usando el 20 %, mientras que p38 alfa Z-Cy5 se analizó usando potencia LED al 60 %. p38 alfa marcada con TAMRA y TAMRAX se ensayó usando potencia LED al 100 % y el 40 %. p38 alfa marcada con Oregon Green 488 y Oregon Green 488-tris-NTA se detectó usando potencia LED al 100 % y el 40 %, respectivamente. Los datos se analizaron usando software de análisis MO Affinity (NanoTemper Technologies). Los resultados se proporcionan en la figura 10.

Ejemplo 8

Marcaje de proteína: Se marcaron las proteínas tanto TME1 como p38 alfa con DY647P1 y monosulfoCy5 usando tampón de marcaje de NHS y una proporción de marcaje de proteína a colorante de 1:3. Por tanto, 100 j l de solución de colorante 24 jM se mezclaron con 100 j l de solución de proteína 8 jM y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. El colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular como se describe en el ejemplo 2.

Preparación de la dilución en serie: Después del marcaje de la proteína, se preparó una dilución en serie de los ligandos. El tampón de ensayo con DMSO al 4 % sirvió como el tampón de ensayo para p38 frente a BIRB, mientras que el tampón de ensayo se usó para TEM1 frente a BLIP. Tanto BIRB como BLIP se diluyeron en tampón de ensayo a 10 jM y DMSO al 4 % y 1 jM , respectivamente. Empezando con estas soluciones, se preparó una dilución en serie de 16 etapas usando un volumen de muestra de 10 jl. Después de la preparación de la dilución en serie, 10 j l de la p38 alfa marcada 100 nM o TEM1 marcada 132 nM se añadieron a las series de diluciones. Las muestras se mezclaron pipeteando arriba y abajo. Antes de cargar capilares de vidrio recubiertos superiores, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 4 °C y 15.000 g.

Medidas con IR.Rojo y análisis de datos: Los experimentos se realizaron usando IR.Rojo a potencia de láser IR de 24 mW a la temperatura entre 310 K y 318 K. Debido a diferencias intrínsecas en la intensidad de fluorescencia de los colorantes, la potencia LED se tuvo que optimizar para cada colorante. Las medidas de afinidad de TEM1 para BLIP se llevaron a cabo usando potencia LED al 30 % para TEM1 marcada con DY647P1 y potencia LED al 80 % para TEM1 marcada con monosulfoCy5. La afinidad de p38 alfa-DY647P1 para BIRB se midió usando potencia LED al 30 %, mientras p38 monosulfo-Cy5 se analizó usando potencia LED al 80 %. Los datos se analizaron usando software de análisis MO Affinity (NanoTemper Technologies). Los resultados se proporcionan en la figura 11.

Ejemplo 9

Marcaje de proteína: Se marcaron las proteínas tanto TME1 como p38 alfa con monosulfo-Cy5, DY630 y DY631 usando química de marcaje de NHS y una proporción de marcaje de proteína a colorante de 1:3, 1:3 y 1:5, respectivamente. Por tanto, 100 pl de solución de colorante 24 pM se mezclaron con 100 pl de solución de proteína 8 |jM y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. El colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular como se describe en el ejemplo 2.

Preparación de la dilución en serie: Después del marcaje de la proteína, se preparó una dilución en serie de los ligandos BLIP y PD169316. El tampón de ensayo con d Ms O al 4 % sirvió como el tampón de ensayo para p38 alfa frente a PD169316, mientras que el tampón de ensayo se usó para TEM1 frente a BLIP. Tanto PD169316 como BLIP se diluyeron en tampón de ensayo a 10 pM y DMSO al 4 % y 1 pM, respectivamente. Empezando con estas soluciones, se preparó una dilución en serie de 16 etapas usando un volumen de muestra de 10 pl. Después de la preparación de la dilución en serie, 10 pl de la p38 alfa marcada 100 nM o TEM1 marcada 132 nM se añadieron a las series de diluciones. Las muestras se mezclaron pipeteando arriba y abajo. Antes de cargar capilares de vidrio recubiertos superiores, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 4 °C y 15.000 g.

Medidas con IR.Rojo y análisis de datos: Los experimentos se realizaron usando IR.Rojo a potencia de láser IR de 24 mW a la temperatura entre 310 K y 318 K. Debido a diferencias intrínsecas en la intensidad de fluorescencia de los colorantes, la potencia LED se tuvo que optimizar para cada colorante: potencia LED al 100 % para TEM1 marcada con DY630, potencia LED al 80 % para TEM1 marcada con DY631 y potencia LED al 60 % para TEM1 marcada con monosulfoCy5. Los datos se analizaron usando software de análisis MO Affinity (NanoTemper Technologies). Los resultados se proporcionan en la figura 12.

Ejemplo 10

Se marcaron las proteínas tanto p38a como TEM1 con monosulfo-Cy5. Además, p38 alfa se marcó usando SeTau647. Para esto, los colorantes se disolvieron en DMSO y se diluyeron adicionalmente a una concentración final de 24 pM usando tampón de marcaje de NHS. Para una proporción de proteína a colorante de 1:3, las proteínas se diluyeron a una concentración final de 8 pM usando el tampón de marcaje de NHS. Para la reacción de marcaje 100 pl de solución de colorante se mezclaron con 100 pl de solución de proteína y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de ello, el colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular. Para esto, se equilibró columna B usando 9 ml de tampón de ensayo, antes de cargar la reacción de marcaje para que entrara en la resina. Después de la adición de 300 pl de tampón de ensayo, las proteínas marcadas se eluyeron usando 600 pl de tampón de ensayo. Aquí, los primeros 100 pl no contienen proteína y se desecharon. Después de la purificación en columna B, las proteínas se cargaron directamente en capilares de vidrio Prometheus de alta sensibilidad (1,6 pM) y se midieron en duplicado usando el PR.Rojo con los siguientes ajustes del dispositivo: 1 K/min; de 293-368 K.

Los colorantes libres se prediluyeron en DMSO y se diluyeron adicionalmente en tampón de ensayo a una concentración final de 100 nM. Los colorantes de llenaron después en capilares de vidrio Prometheus de alta sensibilidad y se cargaron en triplicados en el dispositivo PR.Rojo. La rampa de calentamiento se ajustó a 1 K/min y los datos se registraron de 293-368 K. Los datos se analizaron usando Microsoft Excel. Los resultados se proporcionan en la figura 15.

Ejemplo 11

Se marcaron las proteínas tanto TEM1 como MBP con monosulfo-Cy5 usando tampón de marcaje de NHS y una proporción de proteína a colorante de 1:3. Para esto, el colorante se disolvió en DMSO y se diluyó adicionalmente en tampón de marcaje de NHS a una concentración final de 24 pM. Las proteínas se diluyeron a una concentración final de 8 pM usando el mismo tampón optimizado para reacción de marcaje. Para la reacción de marcaje 100 pl de solución de colorante se mezclaron con 100 pl de solución de proteína y la reacción se llevó a cabo durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de ello, el colorante libre se eliminó usando cromatografía de exclusión molecular. Para esto, se equilibró columna B usando 9 ml de tampón de ensayo, antes de cargar la reacción de marcaje para que entrara en la resina. Después de la adición de 300 pl de tampón de ensayo, las proteínas marcadas se eluyeron usando 600 |jl de tampón de ensayo. Aquí, los primeros 100 |jl no contienen proteína y se desecharon. Después de la purificación en columna B, las proteínas se cargaron directamente en capilares de vidrio Prometheus de alta sensibilidad (1,6 jM ) y se midieron en duplicados usando dos dispositivos: PR.Rojo usando 1 K/min de 293-368K y Prometheus NT.48 usando 5 K/min de 293-368 K. Los datos se exportaron directamente del software del dispositivo. Los resultados se proporcionan en la figura 16.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Un método para medir interacciones entre partículas marcadas y ligandos que comprende las etapas:

   a) proporcionar una muestra que comprende partículas marcadas y ligandos en una solución, en donde las partículas marcadas están disueltas o dispersas en la solución o están inmovilizadas en un soporte sólido; b) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una temperatura predeterminada;

   c) repetir las etapas (a) y (b) múltiples veces a diferentes concentraciones de los ligandos en la solución; y d) determinar la interacción entre las partículas marcadas y los ligandos basados en el cambio dependiente de la concentración de ligando de la fluorescencia de las partículas marcadas,

   en donde la etapa (b) comprende las siguientes etapas:

   b1) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a una primera temperatura predeterminada;

   b2) calentar o enfriar la solución a una segunda temperatura predeterminada;

   b3) excitar fluorescentemente las partículas marcadas y detectar la fluorescencia de las partículas excitadas a la segunda temperatura predeterminada;

   en donde las partículas marcadas están marcadas con uno o más colorantes seleccionados del grupo que consiste en colorantes representados por las fórmulas generales (I), (Ila), (IIb) o (III):

   

   en donde

   X1 es O, S o CR5R6;

   X2 es O, S o CR7R8;

   R1 y R2 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y grupos alquilo que pueden estar sustituidos;

   R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos, grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos;

   con la condición de que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH²-;

   a es un número entero de 0 a 4;

   b es un número entero de 0 a 4; y

   n es un número entero de 1 a 3, preferiblemente 1 o 2;

   

   en donde

   uno de X3 y X4 es NR9 y el otro de X3 y X4 es O, S o CR13R14;

   R9 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, y grupos alquilo que pueden estar sustituidos;

   R10, R11, R12, R13y R14 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos, grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos;

   con la condición de que al menos uno de R9, R10, R11, R12, R13 y R14 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH²-;

   c es un número entero de 0 a 4;

   d es un número entero de 0 a 2;

   e es un número entero de 0 a 4; y

   m es un número entero de 1 a 3, preferiblemente 1 o 2; y

   

   en donde

   Y es OR18 o NR19R20;

   Z es O o NR21R22;

   R15, R16 y R17 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos, grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos;

   con la condición de que al menos uno de R17 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula;

   R18 es H o un ion de metal alcalino,

   R19, R20, R21 y R22 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y grupos alquilo que pueden estar sustituidos, preferiblemente, R19, R20, R21 y R22 son cada uno iguales;

   f es un número entero de 0 a 3;

   g es un número entero de 0 a 3; y

   h es un número entero de 1 a 5.

   El método según la reivindicación 1, en donde dichos colorantes de fórmula (I) son colorantes representados por la fórmula general (I'):

   

   en donde

   X1 es O o CR5R6;

   X2 es O o CR7R8;

   R1, R2, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan cada uno independientemente de un grupo alquilo de C^1-20 que puede estar sustituido;

   R3 y R4 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, y ácido sulfónico o una sal del mismo;

   con la condición de que al menos uno de R1, R2, R5, R6, R7 y R8 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH²-; y

   n es un número entero igual a 1 o 2.

   El método según la reivindicación 1, en donde dichos colorantes de fórmula (IIa) o (IIb) son colorantes representados por la fórmula general (IIa') o (IIb'):

   

   en donde

   uno de X3 y X4 es NR9 y el otro de X3 y X4 es CR13R14;

   el grupo sulfonato está en posición 4 con respecto a NR9;

   R9 es un grupo alquilo de C¹-C²⁰ que puede estar sustituido;

   R11, R12, R13 y R14 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidroxi, carboxi, ácido sulfónico, tiol o una sal del mismo, hidrógeno, halógeno, grupos éster carboxilato que pueden estar sustituidos, grupo nitro, aminas, amidas, grupos alquilo que pueden estar sustituidos, grupos alcoxi que pueden estar sustituidos, y grupos alquenilo que pueden estar sustituidos;

   con la condición de que al menos uno de R9, R13 y R14 sea un grupo espaciador por el que el colorante se conjuga a la partícula, en donde el grupo espaciador es más largo que dos grupos CH²-;

   d es un número entero de 0 a 2;

   e es un número entero de 0 a 3; y

   m es un número entero de 1 a 2.

   El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el grupo espaciador en dichos colorantes de fórmulas generales (I), (I'), (IIa), (IIb), (IIa'), (IIb') es una cadena alquileno de C⁴ a C²⁰, que puede estar sustituida, en donde uno o más átomos de carbono de la cadena de alquileno puede estar independientemente sustituido por grupos alicíclicos, grupos arilo, grupos heterocíclicos, grupos heteroarilo, o heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N, y S.

   El método según la reivindicación 1, en donde dichos colorantes de fórmula (III) son colorantes representados por la fórmula general (III'):

   

   en donde

   Y es OH o N(CH³)²;

   Z es O o N(CH³)²;

   R15 y R16 son cada uno independientemente hidrógeno, o un halógeno;

   R15 *7 es un grupo espaciador mediante el que el colorante está conjugado a la partícula; y

   R17a es un grupo carboxi, o una sal del mismo.

   6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el grupo espaciador en dichos colorantes de fórmulas generales (III) o (III') es una cadena alquileno de C² a C¹⁰, que puede estar sustituida, en donde uno o más átomos de carbono de la cadena de alquileno puede estar independientemente sustituido por grupos alicíclicos, grupos arilo, grupos heteroarilo, grupos heterocíclicos, o heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N, y S.

   7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde calentar o enfriar se lleva a cabo usando una fuente calentadora o enfriadora seleccionada del grupo de un fluido calentador o enfriador, un gas calentador o enfriador, un elemento calentador, un elemento peltier, radiación electromagnética, y combinaciones de los mismos.

   8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la primera y la segunda temperatura predeterminadas están en el intervalo de -20 °C a 115 °C, preferiblemente de 0,1 °C a 100 °C, más preferiblemente en el intervalo de 5 °C a 60 °C, incluso más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 60 °C, lo más preferiblemente en el intervalo de 10 °C a 40 °C.

   9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la primera y la segunda temperatura predeterminadas están controladas en /-1 K, preferiblemente en /- 0,5 K.

   10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la diferencia entre la segunda temperatura y la primera temperatura está en el intervalo de /- 0,1 K a /- 90 K, preferiblemente en el intervalo de /-1 K a /- 40 K, más preferiblemente en el intervalo de /-1 K a /- 20 K.

   11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde las partículas se seleccionan del grupo que consisten en moléculas orgánicas, biomoléculas, nanopartículas, micropartículas, vesículas, células biológicas o fragmentos subcelulares, tejidos biológicos, partículas víricas, virus y orgánulos celulares.

   12. El método según la reivindicación 11, en donde dichas biomoléculas se seleccionan del grupo que consiste en proteínas, péptidos, enzimas, ácidos nucleicos, y combinaciones de los mismos.

   13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dichos ligandos se seleccionan del grupo que consiste en iones, metales, compuestos, fragmentos de fármacos, hidratos de carbono, moléculas pequeñas, fármacos, profármacos, lípidos, proteínas, péptidos, peptoides, enzimas, ácidos nucleicos, nanopartículas, liposomas, SUV, GUV, polímeros, moléculas orgánicas, moléculas inorgánicas, complejos metálicos, hormonas, sabores, odorantes, partículas y (micro)perlas.

   14. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la partícula y el ligando se seleccionan del grupo que consiste en las siguientes combinaciones indicadas como partículas-ligando:

   enzimaslípido, receptorshormona, receptorsquimioquina, enzimas-inhibidor, receptorsneutransmisor, receptorscitoquina, enzimasion, receptorsion, receptorsaminoácido, enzimascofactor, receptorslípido, receptorsesterol, enzimasfragmento, receptorspéptido, receptorsfragmento, enzimasmetabolito, receptorsreceptor, receptorsglucolípido, enzimasADN, receptorsodorante, receptorsprofármaco, enzimasARN, receptorsfármaco, enzim asm onos/di- o polisacárido, enzimasácido graso, enzimasvitamina, enzimasprofármaco, enzimasfármaco, liposomasproteína, proteína transportadorassustrato, anticuerposantígeno, partícula víricasreceptor, virussproteína estructural, anticuerposreceptor de Fc, chaperonasATP, ADNmcsADNmc, aptámerosligando, chaperonasiones, ARNsmolécula pequeña, poliscáridosmolécula pequeña, chaperonasproteína, ADNsmoléclula pequeña, proteína estructuralsproteína estructural, proteína de señalizaciónsproteína de señalización, proteína de señalizaciónsmolécula pequeña, proteína de señalizaciónsprofármaco, proteína de señalizaciónsfármaco, proteína de señalizaciónslípido, proteína estructuralsiones, nanopartículasproteína, orgánulo celularsproteína, nanopartículasADN, orgánulo celularslípido, nanopartículasARN.

   15. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el método de medir interacciones entre partículas marcadas y ligandos es un método de medir la constante de disociación de las partículas y los ligandos.