CN113167791A - 作为通用增强剂的超亮荧光纳米构建体 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种荧光纳米构建体，其包括具有至少一个局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构，至少一个间隔涂层，至少一种具有最大激发波长(λEX)的荧光剂，和其中荧光纳米构建体的荧光强度比单独的至少一种荧光剂的荧光强度高至少500倍。

Description

作为通用增强剂的超亮荧光纳米构建体
相关申请的交叉参考
本申请要求2018年10月4日提交的美国临时申请No.62/741,237和2019年7月29日提交的美国临时申请No.62/879,824的优先权，将其内容全部按引用并入本文中。
联邦支持
本发明是在美国国家科学基金会授予的CBET1254399和美国国立卫生研究院授予的CA141521的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
本公开的领域总体上涉及可用于增强生物测定的超亮荧光纳米构建体，等离激元(plasmonic)-荧光剂(fluor)(PF)。具体地，本发明涉及等离激元纳米结构、间隔层和荧光团的新组合的使用，其形成在光谱上类似于荧光团但比单独的单个荧光团至少亮500倍的纳米构建体。这些超亮荧光纳米构建体可以与至少一种生物识别元件缀合，并用于增强各种生物测定和方法的性能并改善其检测极限。
与诸如癌症、心脏病、炎症和神经系统疾病等疾病相关的生物分子或生物标志物的相关浓度范围可以在μg/ml到亚-fg/ml的许多个数量级之间，其中有些可能由于缺乏灵敏的生物分析工具而仍未被鉴定出来。还非常希望利用少量的样品在宝贵的生物流体(如呼吸凝结液、眼液、脑脊髓液或来自新生儿的血清或小型动物模型)中进行多重检测，这需要对样品进行稀释，而进一步降低了浓度。作为生物医学和临床研究的基础，基于荧光的生物分析方法被广泛用于各种生物分析物的检测、定量和成像。已经探索了几种方法来改进荧光免疫测定的灵敏度，如增强抗体亲和力、减少背景荧光、促进物质转移和增加底物表面积。然而，弱的荧光信号和相关联的差的荧光标记信噪比仍然是一个挑战，限制了当前基于荧光的测定的最终灵敏度。
大部分之前的等离激元(plasmon)增强的荧光测定方法依赖于通过金属岛的沉积或等离激元纳米结构的吸附将底物工程化为具有等离激元活性。这些方法自然需要利用特殊的表面，并且可能需要对读取设备和生物测定方案进行重大改动。因此，它们不能容易地应用于多种系统或生物测定。
一些等离激元增强荧光测定尝试在溶液相中使用颗粒，但这些颗粒受到不稳定性、带来难以接受的背景信号的高的非特异性结合以及最重要的差的荧光增强等问题的困扰。荧光增强的程度通常小于10倍。
荧光探针和荧光方法已用于生物医学研究中，不仅用作成像工具使得细胞和各种亚细胞物质的位置和动态以及细胞和组织中的分子相互作用可视化，而且还用作荧光免疫测定中的标记，用于分子生物标志物的检测和定量。通过揭示疾病发展、进展和对治疗的反应的基因组、转录组和蛋白质组学特征，基于荧光的技术已从根本上改变了生物学和生命科学。但是，“微弱的信号”在依赖荧光的一系列检测和成像技术中一直是一个持续和反复出现的问题。在不使用专门的试剂、设备或对现有程序进行重大改进的情况下克服这一基本挑战已成为生物医学光学领域中广泛研究的主题。例如，迫切需要可以被大多数生物和临床实验室广泛采用的超灵敏的荧光免疫测定，用于检测低丰度的靶标生物物质。
尽管荧光在诸如比色ELISA或化学发光这样的分析检测方案上提供了诸多好处(包括多路复用、高动态范围、广泛的平台适用性(即，可用于细胞中、细胞上、组织、平板、珠子，溶液等))，但荧光基本上受信号差的限制。在基于平板的测定中，采用了复杂的方案，如聚HRP、PCR-ELISA、亲和素-生物素-复合物(ABC)ELISA和酪酰胺信号放大(TSA)，以提高荧光检测的灵敏度。所有这些都比它们所替代的分析版本更复杂、更昂贵并且动态范围通常更差。为了获得非常高的检测灵敏度，复杂的技术(诸如数字ELISA(Quanterix SimoaSystem)或电化学发光(Meso Scale Discovery))各自需要专门的底物、设备和工作流程。
通常，如果一种测定方法使用用HRP标记的抗体或链霉亲和素来催化将底物转化为发光物质(如在化学发光中)或吸收一定波长的光的物质(如在ELISA中)的反应，则通过使用抗体或链霉亲和素缀合的等离激元荧光剂可以改善该测定的性能。这种测定的实例是ELISA(比色和化学发光)和基于膜的免疫测定，如蛋白质印迹(比色和化学发光)。
在不从根本上偏离现有检测方案的情况下提高检测的信噪比也将放宽对高灵敏度和庞大的光电检测仪的严格要求，降低实施成本，消除跨实验室、跨平台的不一致性，并有可能将这些技术推向即时的、现场的和资源受限的环境。为了改善基于荧光的成像和传感技术的信噪比，已经引入了多种技术，包括多荧光团标签、滚动循环扩增和光子晶体增强。尽管灵敏度有所提高，但这些技术并未在研究和临床环境中广泛采用。这些技术中的大多数都需要对现有实践进行重大改进，如显著延长整体操作时间的额外步骤、专用且昂贵的读出系统、非传统数据处理和分析或需要严格控制的运输和储存条件的对温度敏感的试剂。
靠近等离激元纳米结构的荧光团的发射增强归因于等离激元纳米结构表面增强的电磁场(局部激发场)，以及由于激发的荧光团和纳米结构表面等离激元之间的耦合而导致的荧光寿命降低。到目前为止，已显示出各种等离激元衬底(如金属纳米岛)可导致中等程度的荧光增强，但是这些有等离激元活性的表面需要使用预制的衬底，通常是沉积有金属纳米结构的玻璃载玻片，替代标准的或有时不可替代的生物分析和生物成像平台。特殊底物的要求限制了跨平台和跨实验室的一致性以及与广泛使用的生物分析程序的无缝集成，这极大地限制了它们在生物医学研究和临床环境中的广泛应用。非传统的生物缀合程序和固定于金属表面上的生物分子(例如抗体)差的稳定性，在其广泛应用中提出了进一步的挑战。溶液相等离激元增强的荧光解决方案已经受到了通常差的荧光增强能力和不稳定颗粒的限制。
基于荧光的多路复用微阵列用于表达谱分析、药物-靶标结合测定和高通量蛋白质组学。与单一平台(如酶联免疫吸附测定(ELISA))相比，这种技术使研究人员和临床医生可以平行地检测大量生物标志物，从而在有限的样本量下实现患者分层和多因素疾病的监测，从而最小化进行多个单独的生物标志物测定的测定成本和时间。此外，生物标志物的高通量剖析使得药物个性化，具有疾病的整体分子指纹，可在密切相关的疾病表型之间提供更大的诊断分辨率。例如，通过结合多种生物标志物的尿水平，已证明对肾脏疾病诊断的灵敏度和特异性明显高于单个生物标志物。然而，尽管有各种商品化产品可供使用，但是与ELISA相比，这种多重方法的灵敏度较低，并且检测极限(LOD)相对高，这妨碍了其广泛应用。
2017年11月27日提交的发明名称为“Plasmonic Film as a UniversalFluorescent Enhancer”的美国临时申请62/590,877公开了一种解决各种荧光测定低灵敏度的方法，将其全部按引用并入本文中。在这种方法中，将等离激元纳米结构沉积在聚合物膜上，然后将其放置，使等离激元结构朝下，穿过已应用荧光团的测定或板的顶部。通过以这个方向放置膜，等离激元纳米结构与荧光团的接近提供了出色的荧光增强，并大大提高了测定的灵敏度。尽管非常有用，但某些检测技术与这种方法不兼容(例如，如果未在平的、刚性表面(如微孔板或载玻片)上进行检测)。因此，需要开发一种方法来解决这些缺点中的每一个，同时与更大范围的测定技术阵列兼容。
发明简述
在一个方面中，本文公开了一种荧光纳米构建体。所述纳米构建体总地包括具有至少一个局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构、至少一个间隔涂层和至少一种具有最大激发波长(λEX)的荧光剂。荧光纳米构建体的荧光强度比单独的至少一种荧光剂的荧光强度高至少500倍。
在另一个方面中，本文公开了一种用于构建荧光纳米构建体的方法。所述方法总地包括用至少一种间隔涂层涂覆等离激元纳米结构；任选用功能层涂覆至少一个间隔层；将荧光剂与至少一个间隔层或功能层之一缀合；和，任选将生物识别元件与至少一个间隔涂层或功能层之一缀合。
在再另一个方面中，本文公开了一种使用测定检测分析物的方法。所述方法总地包括将荧光纳米构建体加入测定中，以产生荧光信号；和，通过分析荧光信号来检测分析物。
附图简述
图1是根据本公开的不同摩尔浓度下的常规Cy3和等离激元-荧光剂-Cy3的荧光强度的示例性实施方案。
图2是根据本公开的不同摩尔浓度下的常规荧光剂-800CW和等离激元-荧光剂-800CW的荧光强度的示例性实施方案。
图3是根据本公开的不同摩尔浓度下的常规FITC和等离激元-荧光剂-FITC的荧光强度的示例性实施方案。
图4是根据本公开的等离激元-荧光剂的设计的示例性实施方案。
图5是根据本公开的三种代表性的等离激元纳米结构(从左到右：Au@Ag-490、AuNR-670和AuNR-760)的水溶液的标准化消化光谱的示例性实施方案。Au@Ag-490、AuNR-670和AuNR-760的消光光谱呈现出与吸收光谱(激发光谱)以及FITC、680LT和800CW分别的合适激发波长明显的重叠。
图6A和6B是根据本公开的等离激元颗粒的吸光度与缀合的染料的吸光度/激发光谱重叠的重要性的示例性实施方案。
图7A是AuNR和根据本公开的具有聚合物间隔层的AuNR获得的荧光强度图(左)和增强倍数(右)的示例性实施方案。图7B是常规的荧光团(800CW)和根据本公开的荧光纳米结构(AuNR-800CW)的荧光寿命的示例性实施方案。
图8A是根据本公开的多个共聚焦激光扫描显微镜图像的示例性实施方案，所述图像显示了通过用不同稀释的ErbB2一抗进行探测的，对应于乳腺癌细胞上过表达的蛋白质生物标志物(ErbB2)的荧光信号(上图：使用颗粒增强；下图：未使用颗粒增强)。具有纳米结构增强的ErbB2一抗即使在稀释100000倍后仍显示出荧光信号。图8B是根据本公开的具有和不具有颗粒增强的标记的乳腺癌细胞的平均荧光强度的示例性实施方案。
图9A是根据本公开的用荧光剂和荧光纳米结构获得的对应于ErbB2受体的荧光强度直方图的示例性实施方案。图9B是根据本公开的荧光强度直方图的示例性实施方案。
图10是根据本公开的等离激元-荧光剂设计的示例性实施方案。
图11是根据本公开的等离激元-荧光剂的替换设计的示例性实施方案。
图12是根据本公开的等离激元-荧光剂的其他替换设计的示例性实施方案。
图13是根据本公开的等离激元纳米结构的另一个示例性实施方案。将等离激元纳米结构(涂覆了银的金纳米棒)包埋在介电材料基质中。介电材料基质涂覆了功能层(蓝色云状物)。靶向剂(粉色“y”形状，例如，抗体)与功能层缀合。
图14是根据本公开的与IRDye 800CW(激发最大＝784nm)缀合的等离激元-荧光剂的消光光谱的示例性实施方案。
图15是根据本公开的等离激元-荧光剂的LSPR最大值与IRDye 800CW的激发最大值之间的错配的示例性实施方案。
图16是根据本公开的与Cy3(激发最大值＝550nm)缀合的等离激元-荧光剂(AuNR@Ag立方体等离激元纳米结构)的消光光谱的示例性实施方案。
图17是根据本公开的等离激元-荧光剂(AuNR@Ag立方体等离激元纳米结构)的LSPR最大值和Cy3的激发最大值之间的错配的示例性实施方案。
图18是根据本公开的等离激元纳米结构的示例性实施方案。等离激元纳米结构覆盖在特定厚度的介电基质中(绿色外壳)。荧光团(红色星爆)直接附着到介电基质的外表面。生物识别元件(粉色“y”形，例如抗体)可以直接与间隔物缀合，并且间隔物可以被功能层材料(蓝色云状物)覆盖。
图19是显示了根据本公开的花费280分钟完成的人NGAL ELISA的标准曲线(剂量依赖性比色信号)的图的示例性实施方案。
图20是显示了根据本公开的在20min内进行的p-FLISA的人NGAL剂量依赖性荧光强度的图的示例性实施方案。
图21是根据本公开的使用在20min内完成的p-FLISA测定的肾患者和健康志愿者的尿液样品中的NGAL浓度的示例性实施方案。
图22是根据本公开的使用ELISA(280min测定)和p-FLISA(20min)测定的人NGAL浓度之间的关联性的图的示例性实施方案。
图23是根据本公开的使用生物素化的等离激元-荧光剂的通用夹层免疫测定的示例性实施方案。
图24是根据本公开的使用缀合链霉亲和素的等离激元-荧光剂的通用夹层免疫测定的增强的示例性实施方案。
图25是根据本公开的使用缀合二抗的等离激元-荧光剂的通用夹层免疫测定的示例性实施方案，其中与等离激元-荧光剂缀合的抗体识别检测抗体。
图26是根据本公开的使用缀合一抗的等离激元-荧光剂的通用夹层免疫测定的示例性实施方案，其中与等离激元-荧光剂缀合的抗体识别分析物。
图27A是根据本公开的用于等离激元-荧光剂-800CW中的纳米结构的金纳米棒(AuNR)的TEM图像的示例性实施方案。图27B是根据本公开的显示了AuNR周围的电场强度分布的时域有限差分(FDTD)模拟的示例性实施方案。
图28是示意图的示例性实施方案，所述示意图显示了根据本公开的等离激元纳米结构AuNR上聚合物间隔物形成中涉及的步骤。
图29是AFM图像的示例性实施方案，所述图像描绘了根据本公开的在递增含量的单体(MPTMS、TMPS和APTMS)下AuNR/聚合物直径的增加。
图30是根据本公开的在不同聚合条件下AuNR的UV-vis谱的示例性实施方案。
图31是显示了根据本公开的从AFM图像测量的每种聚合条件下的AuNR直径增加(高于聚合物层厚度两倍)的图的示例性实施方案。
图32是根据本公开的AuNR、AuNR/MPTMS、AuNR/MPTMS/聚硅氧烷(AuNR/聚合物)和等离激元-荧光剂-800CW(AuNR/聚合物/BSA-生物素-800CW)的ζ电位的示例性实施方案。
图33A和图33B是根据本公开的PF-800CW TEM和消光光谱的示例性实施方案。
图34是示意图(未按比例)的示例性实施方案，所述示意图显示了根据本公开的基于在荧光团标记的免疫吸附测定中发生的结合事件的模型系统。
图35是根据本公开的各种体积的用于增强800CW的核AuNR等离激元纳米结构的示例性实施方案。
图36是根据本公开的各种体积的用于增强800CW的核AuNR等离激元纳米结构的示例性实施方案。
图37是根据本公开的AuNR@Ag立方体的消光光谱的示例性实施方案。
图38是根据本公开的适用于增强可以在488nm(Au@Ag-490)、658nm(AuNR-670)和784nm(AuNR-760)激发的荧光团的等离激元纳米结构的示例性实施方案。
图39A和图39B是根据本公开的PF-532(Cy3)的TEM的示例性实施方案。
图40是根据本公开的消光光谱PF-532(Cy3)的示例性实施方案。
图41是根据本公开的使用具有不同聚合物间隔物厚度的等离激元-荧光剂-800CW获得的荧光增强倍数的示例性实施方案。
图42是根据本公开的等离激元增强的荧光和等离激元-荧光剂的胶体稳定性的示例性实施方案。误差条表示s.d.(n≥3个独立测试)。通过使用Welch’s校正的两尾未配对t-检验，数据统计显著性P值＝0.0013，**P<0.01。图42左侧图显示了在4℃下储存的并从冻干粉重建的等离激元-荧光剂悬液的稳定性。误差条表示s.d.(n＝6个重复的测试)。NS：不显著。通过使用Tukey’s事后检验的单向ANOVA，P值>0.9999。图42还显示了描绘重建前后等离激元-荧光剂的冻干粉的照片。
图43是示意图的示例性实施方案，所述示意图显示了根据本公开的在标准96-孔平板中实施的常规FLISA(800CW)和等离激元-荧光剂-800CW增强的FLISA(p-FLISA)的概念。
图44是根据本公开的在各种分析物浓度下的人IL-6FLISA和p-FLISA的荧光强度图的示例性实施方案。
图45是根据本公开的人IL-6FLISA和p-FLISA的荧光强度图(带放大比例尺)以及“金标准”人IL-6ELISA的比色信号照片的示例性实施方案。
图46是根据本公开的人IL-6FLISA、p-FLISA和ELISA的单独数据点、平均值和标准偏差的示例性实施方案。
图47是根据本公开的来自常规FLISA的人IL-6剂量依赖性荧光强度图的示例性实施方案。
图48是根据本公开的常规IL-6FLISA的LOD的示例性实施方案。
图49是根据本公开的来自p-FLISA的人IL-6剂量依赖性荧光强度图的示例性实施方案。
图50A是根据本公开的来自p-FLISA的IL-6剂量依赖性荧光强度的示例性实施方案。图50B是根据本公开的等离激元-荧光剂-800CW的非特异性结合的示例性实施方案。
图51是根据本公开的IL-6p-FLISA之后96-孔平板的底部表面的SEM图像的示例性实施方案。
图52是显示了根据本公开的人IL-6ELISA的标准曲线图的示例性实施方案。
图53是根据本公开的使用p-FLISA测量的人血清样品(稀释10倍)中的IL-6浓度的示例性实施方案。
图54是示意图的示例性说明，所述示意图显示了根据本公开的使用等离激元-荧光剂-Cy3来增强基于珠子的免疫测定(例如，Luminex测定)的灵敏度的概念。
图55A和图55B是根据本公开的利用AuNR@Ag作为等离激元纳米结构的等离激元-荧光剂-Cy3的TEM图像的示例性实施方案。
图56A是根据本公开的单独的等离激元-荧光剂-Cy3的荧光显微镜图像的示例性实施方案。图56B是根据本公开的图56A中所示的单独的等离激元-荧光剂-Cy3的SEM图像的示例性实施方案。图56C是放大的SEM图像(对应于图56A和56B中所示方框)的示例性实施方案，显示了根据本公开的单个等离激元-荧光剂-Cy3(单个纳米立方体)。
图57是根据本公开的用等离激元-荧光剂-Cy3探测前后微珠的SEM图像的示例性实施方案。
图58A是根据本公开的通过等离激元-荧光剂-Cy3探测前Luminex微珠的显微镜明场图像和荧光图像的示例性实施方案。图58B是根据本公开的通过等离激元-荧光剂-Cy3探测后Luminex微珠的显微镜明场图像和荧光图像的示例性实施方案。
图59(A-D)是根据本公开的用等离激元-荧光剂-Cy3染色后Luminex微珠图像的示例性实施方案。图59A是用等离激元-荧光剂-Cy3染色后Luminex微珠的荧光图像，显示了不同发射强度的微珠的条形码(通过633nm激光激发的)。图59B是用等离激元-荧光剂-Cy3染色后Luminex微珠的荧光图像，显示了结合的Cy3的荧光(通过543nm激光激发的)。图59C是微珠的明场图像。图59D是图59(A-C)中所示的明场和荧光的合并图像。
图60是根据本公开的用等离激元-荧光剂-Cy3探测前后微珠的荧光图像的示例性实施方案。
图61是根据本公开的应用等离激元-荧光剂-Cy3前(左)后(右)获得的小鼠IL-6标准曲线的示例性实施方案。
图62是根据本公开的应用等离激元-荧光剂-Cy3前(左)后(右)获得的小鼠TNF-α标准曲线的示例性实施方案。
图63是根据本公开的来自小鼠IL-6Luminex、等离激元-荧光剂-Cy3增强的小鼠IL-6Luminex、小鼠TNF-αLuminex和等离激元-荧光剂-Cy3增强的小鼠TNF-αLuminex测定的单独数据点、平均值和标准偏差的示例性实施方案。
图64A是显示了根据本公开的针对小鼠IL-6的未增强的基于珠子的荧光免疫测定(Luminex)的LOD的图的示例性实施方案。图64B是显示了根据本公开的针对TNF-α的未增强的基于珠子的荧光免疫测定(Luminex)的LOD的图的示例性实施方案。
图65是根据本公开的显示了怎样使用生物素化的等离激元-荧光剂来增强典型的多重微阵列的说明的示例性实施方案。
图66是根据本公开的怎样使用缀合链霉亲和素的等离激元-荧光剂来增强典型的多重微阵列的示例性实施方案。
图67(A-B)是根据本公开的鉴定肾生物标志物阵列上的每对荧光斑点的特定分析物(或对照)的示例性实施方案。通过图67B中的坐标来鉴定图67A中显示的荧光斑点。
图68是SEM图像的示例性实施方案，所述图像显示了根据本公开的等离激元-荧光剂-800CW(一些通过黄色圆圈高亮显示的)在硝基纤维素膜的亚表面区域之上和之中的均匀分布。
图69是荧光强度图的示例性实施方案，所述图表示根据本公开的以0至13的荧光强度比例尺使用常规荧光团(链霉亲和素-800CW)获得的肾病患者的肾病蛋白质标志物谱。
图70是荧光强度图的示例性实施方案，所述图表示根据本公开的使用0至5000的荧光强度比例尺的图45的肾病蛋白质生物标志物谱。
图71是荧光强度图的示例性实施方案，所述图表示根据本公开的添加等离激元-荧光剂-800CW后且使用0至5000的荧光强度比例尺的图69和图70中所示的肾病患者的肾病蛋白质生物标志物谱。
图72A是根据本公开的图67A中所示的肾生物标志物阵列上的荧光斑点对的示例性实施方案。图72B是根据本公开的阴性对照区域(图72A的右下角中所示的蓝色框，对应于图67A中所示的坐标F23和F24)中的硝基纤维素膜的SEM图像的示例性实施方案。
图73是根据本公开的使用等离激元-荧光剂的单独数据点、平均值和标准偏差的示例性实施方案。
图74是根据本公开的未用等离激元-荧光剂的单独数据点、平均值和标准偏差的示例性实施方案。
图75是从移动电话获得的照片描绘的示例性实施例，其显示了根据本公开的添加等离激元-荧光剂-800CW后，含有来自肾病患者的尿液样品的硝基纤维素膜的颜色变化。
图76A是根据本公开的40-丛细胞因子微阵列的设计的示例性实施方案。图76B是根据本公开的使用常规荧光团(链霉亲和素-800CW)获得的细胞因子微阵列的荧光图的示例性实施方案。图76C是根据本公开的添加等离激元-荧光剂-800CW后获得的细胞因子微阵列的荧光图的示例性实施方案。图76D是图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的对应于使用常规荧光团(链霉亲和素-800CW)获得的每种细胞因子的荧光强度。图76E是图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的对应于添加等离激元-荧光剂-800CW后获得的每种细胞因子的荧光强度。图76F是根据本公开的细胞因子微阵列上吸收的等离激元-荧光剂-800CW(AuNR)的暗场散射的示例性实施方案。
图77是图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的肾生物标志物的两种读出模式(荧光vs.比色读出)之间的关联。
图78是根据本公开的在不同浓度的ErbB2一抗下用常规荧光剂(800CW，上排)和等离激元-荧光剂-800CW(下排)探测的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像的示例性实施方案。
图79A是根据本公开的用等离激元-荧光剂-800CW标记前(上)后(下)的SK-BR-3的显微镜明场图像的示例性实施方案。图79B是根据本公开的常规荧光剂标记的SK-BR-3细胞的SEM图像的示例性实施方案。图79C是根据本公开的等离激元-荧光剂-800CW标记的SK-BR-3细胞的SEM图像的示例性实施方案，插图显示了细胞膜上均匀分布的等离激元-荧光剂。
图80是图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的用常规荧光剂和等离激元-荧光剂-800CW染色的SK-BR-3细胞的荧光强度。
图81A是根据本公开的在不同ERbB2一抗稀释下使用常规免疫细胞化学程序(细胞按顺序用生物素化的一抗和链霉亲和素-荧光剂(800CW)标记)获得的ErbB2染色的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)的示例性实施方案。图81B是根据本公开的在不同ERbB2一抗稀释下添加等离激元-荧光剂-800CW后ErbB2染色的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)的示例性实施方案。
图82是根据本公开的在6-孔平板上培养的SK-BR-3细胞的荧光图谱的示例性实施方案。
图83是示意图的示例性实施方案，所述示意图显示了根据本公开的通过常规荧光剂(680LT)接着用等离激元-荧光剂-680LT探测的ErbB2染色的SK-BR-3细胞的流式细胞术。
图84A和图84B是根据本公开的680LT TEM图像和消光光谱的示例性实施方案。
图85A是照片的示例性实施方案，所述照片显示了根据本公开的用等离激元-荧光剂-680LT标记后SK-BR-3细胞(上：沉淀物；下：悬液)的颜色变化。图85B是根据本公开的在不同ErbB2一抗稀释下等离激元-荧光剂-680LT标记的SK-BR-3细胞悬液的vis-NR消光光谱的示例性实施方案。
图86是根据本公开的用等离激元-荧光剂-680LT标记前(左)和后(右)SK-BR-3细胞的侧向散射和正向散射的伪色图(以包括单个细胞的门控策略为例)的示例性实施方案。
图87是根据本公开的使用不同浓度的ErbB2一抗探测的SK-BR-3的荧光vs.正向散射(为清晰起见，垂直偏移)的流动轮廓图(具有离群值)的示例性实施方案。
图88是根据本公开的使用常规荧光剂(680LT)接着添加等离激元-荧光剂-680LT(在103倍的一抗稀释下)探测的SK-BR-3细胞的荧光直方图的示例性实施方案。
图89是直方图的示例性实施方案，所述直方图显示了根据本公开的添加等离激元-荧光剂-680LT前(上)后(下)的SK-BR-3细胞的荧光。
图90是图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的在不同一抗浓度下从流式细胞术获得的平均荧光强度。
图91是示意图的示例性实施方案，所述示意图显示了根据本公开的用免疫刺激剂(脂多糖(LPS))处理的骨髓衍生的树突细胞(BMDC)。
图92是根据本公开的在标记细胞上的靶抗原中使用抗体标记的等离激元-荧光剂的两种方案的示例性实施方案的示例性实施方案。
图93是根据本公开的使用常规荧光剂(680LT)获得的对应于初始(对照)和LPS刺激的BMDC的荧光强度分布的示例性实施方案。
图94是根据本公开的使用等离激元-荧光剂-680LT获得的对应于初始(对照)和LPS-刺激的BMDC的荧光强度分布的示例性实施方案。
图95A是伪色图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的使用常规免疫荧光染色的未用LPS刺激(左：初始)和用0.05μg/ml LPS处理后(右)BMDC群的侧向散射vs.CD80荧光。图95B是伪色图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的使用等离激元-荧光剂-680LT的未用LPS刺激(左：初始)和用0.05μg/ml LPS处理后(右)BMDC群的侧向散射vs.CD80荧光。
图96是图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的用不同含量的LPS刺激后BMDC的平均荧光强度(对应于CD80的表达水平)。
图97A是图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开用不同含量的LPS刺激后使用常规免疫荧光染色探测的BMDC的平均荧光(对应于CD80的表达水平)。图97B是图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的用不同含量的LPS刺激后使用等离激元-荧光剂-680LT探测的BMDC的平均荧光(对应于CD80的表达水平)。
图98是根据本公开的促炎细胞因子(TNF-α和IL-12)的分泌水平的示例性实施方案。
图99是根据本公开的对应于LPS刺激后分泌的炎性细胞因子的ELISA结果的单独数据点(吸光度和浓度)、平均浓度和标准偏差。
图100(A-C)是图的示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的来自p-FLISA的IL-6剂量依赖性荧光强度。图100A、图100B和图100C是用不同批次的等离激元-荧光剂-800CW在不同天独立进行的实验的说明。
图101(A-B)是根据本公开的应用等离激元-荧光剂-Cy3后获得的基于珠子的小鼠TNF-α标准曲线的示例性实施方案。图101A和图101B说明了针对不同批次的等离激元-荧光剂-Cy3独立进行的实验。
图102(A-B)是根据本公开的应用等离激元-荧光剂-Cy3后获得的基于珠子的小鼠IL-6标准曲线的示例性实施方案。图102A和图102B说明了针对不同批次的等离激元-荧光剂-Cy3独立进行的实验。
图103A是根据本公开的对应于添加等离激元-荧光剂-800CW前(使用常规荧光团的经典测定)各种尿液生物标志物浓度的荧光强度的另一个示例性实施方案。图103B是根据本公开的对应于添加等离激元-荧光剂-800CW后(使用常规荧光团的经典测定)各种尿液生物标志物浓度的荧光强度的另一个示例性实施方案。
图104A是根据本公开的在不同ERbB2一抗稀释下使用常规免疫化学程序(细胞按顺序用生物素化的一抗和链霉亲和素-荧光剂(800CW)标记)获得的ErbB2染色的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像的另一个示例性实施方案。图104B是根据本公开的在不同ERbB2一抗稀释下添加等离激元-荧光剂-800CW后ErbB2染色的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像的另一个示例性实施方案。
图105A是根据本公开的在不同ERbB2一抗稀释下使用常规免疫化学程序(细胞按顺序用生物素化的一抗和链霉亲和素-荧光剂(800CW)标记)获得的ErbB2染色的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像的再另一个示例性实施方案。图105B是根据本公开的在不同ERbB2一抗稀释下添加等离激元-荧光剂-800CW后ErbB2染色的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像的再另一个示例性实施方案。
图106A是直方图的另一个示例性实施方案，所述直方图显示了根据本公开的添加等离激元-荧光剂-680LT前(上)后(下)SK-BR-3细胞的荧光。图106B是图的另一个示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的在不同一抗浓度下从流式细胞术获得的平均荧光强度。
图107A是直方图的再另一个示例性实施方案，所述直方图显示了根据本公开的添加等离激元-荧光剂-680LT前(上)后(下)SK-BR-3细胞的荧光。图107B是图的再另一个示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的在不同一抗浓度下从流式细胞术获得的平均荧光强度。
图108A是根据本公开的对应于使用常规荧光剂(680LT)获得的初始(对照)和LPS-刺激的BMDC的荧光强度分布的另一个示例性实施方案。图108B是根据本公开的对应于使用等离激元-荧光剂-680LT获得的初始(对照)和LPS-刺激的BMDC的荧光强度分布的另一个示例性实施方案。图108C是图的另一个示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的用不同含量的LPS刺激后BMDC的平均荧光强度(对应于CD80的表达水平)。
图109A是根据本公开的对应于使用常规荧光剂(680LT)获得的初始(对照)和LPS-刺激的BMDC的荧光强度分布的再另一个示例性实施方案。图109B是根据本公开的对应于使用等离激元-荧光剂-680LT获得的初始(对照)和LPS-刺激的BMDC的荧光强度分布的再另一个示例性实施方案。图109C是图的再另一个示例性实施方案，所述图显示了根据本公开的用不同含量的LPS刺激后BMDC的平均荧光强度(对应于CD80的表达水平)。
发明详述
本公开至少部分基于以下发现：可以调节荧光等离激元纳米结构以匹配缀合的荧光团的波长，从而导致荧光强度增强至少500倍。
本公开涉及被专门设计用于靶标分析物的生物检测和定量的超亮荧光纳米结构。作为强有力的实例，在基于微孔板的荧光连接的免疫吸附测定中，与标准靶向剂(例如链霉亲和素)缀合的等离激元-荧光剂比偶联至常用的荧光分子的相同标准靶向剂亮至少500倍。这从灵敏度(检测下限的提高超过一个数量级)和动态范围方面都极大地提高了检测性能。
本公开的设计优势
本文所公开的设计相对于之前版本的优点包括但不限于：(1)等离激元-荧光剂是溶液相，其比用等离激元物质装饰的衬底有用得多；(2)简单直接的、湿式化学合成-与诸如合金化的Cu-Ag NP、光刻(lithography)形成的结构，或气相沉积，或逐层合成等方法相比；(3)颗粒均匀性/稳定性/合成控制高，这对免疫测定是至关重要的：(a)总体而言，纳米颗粒的聚集是一个巨大的问题，会导致严重的伪影；(b)另外，高的非特异性背景是公认的问题；(4)可以严格控制使用MTPMS/APTMS/TMPS的荧光团与等离激元纳米结构核之间的间隔物，以实现纳米级的精确厚度，并可以应用于溶液中；(5)基于硅烷的间隔层易于官能化；(6)分析性能的提高高于以前的方法；(7)每个染料分子的荧光增强(平均)高于先前报道的适于免疫测定应用的排列；和，(8)与其他设计相比，本公开中使用的较大的颗粒可以负载更多的染料分子-更多的染料加上所有缀合的染料的增强等于超亮构建体。
根据本公开，等离激元增强提高了缀合染料的量子产量(这是染料导致的“亮度”中的关键因素)并降低了其荧光寿命。因此，与已经具有高量子产量和短荧光寿命的染料相比，具有低量子产量和/或长荧光寿命的染料可以实现更高的增强倍数(相对亮度增加)。
本文公开的荧光纳米结构颗粒比起它们所附着的荧光物质，当在游离溶液中测量这些荧光物质而不进行等离激元增强时，至少亮500倍。使用亮度度量或测试，其仅将等离激元-荧光剂的荧光强度与单独的荧光物质/试剂进行比较。该亮度度量与纳米结构中使用的功能层和/或生物识别元件无关。该“相对亮度”的测试例如在图1、图2和图3中示出。在该测试中，对于相同的激发和检测条件，将荧光强度绘制为荧光物质浓度的函数。斜率的比率表示荧光物质的相对亮度。如下文所公开的，在不同波长下针对多个PF收集的数据将相对亮度与其缀合的荧光团进行了比较。
在一些实施方案中，纳米结构包括亮度比荧光剂的游离荧光物质亮至少约5倍，至少约10倍，至少约50倍，至少约100倍，至少约500倍，至少约1,000倍，至少约2,000倍，至少约3,000倍，至少约4,000倍，至少约5,000倍，至少约6,000倍，或至少约7,000倍的荧光剂。
本公开的特征包括：
(1)等离激元纳米结构，在一个光的波长范围内充当纳米结构，最大值由颗粒的局部表面等离子体共振(LSPR)波长来限定。等离激元颗粒可以具有一个或多个LSPR波长。等离激元颗粒在波长对应于LSPR波长的光中“拉动”，有效地聚集了光并增强了颗粒表面附近的电磁场。
(2)荧光物质(如有机荧光团)，其被接近至少一个颗粒的LSPR波长的光波长激发，并保持在等离激元颗粒表面附近，从而处于增强的EM场中，同时不会足够接近以进行所谓的“金属诱导的淬灭”。最佳地，等离激元纳米结构和荧光物质之间的分隔范围为约2nm至约10nm。在一些实施方案中，该分隔距离是间隔物的厚度。在其中荧光物质与功能层缀合的其他实施方案中，如图4所示的，该分隔距离是间隔物厚度加上由荧光团和间隔物表面之间的功能层提供的平均间隔。
(3)间隔层，其提供防止金属诱导的猝灭的屏障，并且荧光团可以与其锚定(直接地或通过附着到载体分子上)以保持与等离激元颗粒表面的最佳距离。间隔物材料理想地含有官能团，该官能团允许在等离激元颗粒表面的远端表面上共价缀合荧光团和/或生物识别元件。
(4)功能层，其可用于数种目的：稳定纳米结构，防止聚集和非特异性结合；用作生物识别元件的连接点；和甚至作为荧光团的载体。
(5)生物识别元件，其允许将等离激元-荧光剂用于特异性检测生物识别元件的靶标(例如，如果生物识别元件是抗体和适体，则靶标为靶抗原；如果生物识别元件是链霉亲和素，则靶标为生物素；如果生物识别元件是互补寡核苷酸，则靶标为寡核苷酸)。
目前认为，从未有具有本文所述的荧光纳米结构的组成和性能特征的颗粒。许多先前创建溶液相、等离激元增强的荧光纳米结构的尝试都实现了大约10倍数量级的“亮度增强”。
荧光纳米构建体
本文公开的荧光纳米构建体克服了上述挑战，并提供了将这些荧光纳米构建体广泛应用于免疫测定和其他生物测定的途径。如本文所用的，术语“荧光纳米构建体”还指等离激元-荧光剂(PF)。在一个实例中，关于检测与肾功能有关的生物标志物，结果表明荧光纳米构建体显著增强了阐明低水平肾功能参数(生物标志物)以提供整体肾脏疾病信息的能力。值得注意的是，在使用标准技术检测前，将纳米结构极其简单地添加至测定中，即可获得更好的多重微阵列性能。另外，这种技术代表了一种廉价且易于实施的用于增强荧光的方法。这项易于部署的技术无缝地应用于诊断、蛋白质组学和遗传学等广泛的平台，从而解决了未满足的对更亮信号强度的需求。
在一个方面中，本文公开了一种荧光纳米构建体，该纳米构建体通常包括：等离激元纳米结构、聚合物、生物识别元件和荧光剂。在一些实施方案中，荧光纳米构建体包括具有至少一个局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构；至少一个隔离涂层；至少一种具有最大激发波长(λEX)的荧光剂；和至少一种生物识别元件。
本文公开的荧光纳米构建体可用于增强以微孔板形式、膜形式、抗体微阵列形式和基于珠子的形式还有许多其他形式实施的荧光免疫测定的生物分析参数(灵敏度、LOD和动态范围)。在一些实施方案中，微孔板为标准的6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔或1536孔板的形式。在其他实施方案中，免疫测定的形式是在载玻片、硝基纤维素或PVDF膜、乳胶微珠或本领域已知的其他形式上。在某些方面中，测定或分析的形式是溶液相。在其他实施方案中，将该测定应用于细胞或组织。在一些实施方案中，与用荧光剂标记的但未用等离激元增强的生物识别元件相比，荧光纳米构建体导致荧光强度增强超过10倍、50倍、100倍、200倍、250倍、500倍、1000倍或甚至10,000倍。
大多数现有的等离激元增强的荧光技术要求在预制的等离激元衬底上进行基于荧光的生物测定，所述衬底通常是涂覆有金属纳米结构的玻璃载玻片，而不是标准的或有时不可替代的生物分析平台(例如96孔板、硝基纤维素膜或微珠)，这大大限制了该技术的广泛应用。更重要的是，特定衬底的要求限制了跨平台和跨实验室的一致性以及与广泛采用的生物分析程序的无缝集成，这代表了常规等离激元增强的荧光技术的主要瓶颈。本公开基于等离激元-荧光剂开发了一种“无创”(不改变当前的测定方案)超亮荧光技术，其将被简单地添加到微量滴定孔(或微阵列、微珠、细胞表面)中，来替代传统的荧光。
可定制的等离激元-荧光剂(PF)来最大化荧光增强
根据本公开，对于给定的荧光发射体(有机染料、量子点或上转换纳米颗粒)，通过合理选择纳米结构的大小、形状和组成，可以容易地量身定制和优化等离激元-荧光剂的光学性质(例如，金属纳米结构的LSPR波长，其在最终增强效率中起关键作用)。这与常规等离激元衬底(例如，金属纳米岛)形成鲜明对比，常规等离激元衬底对LSPR波长的控制较差，并且通常仅限于次优的“一刀切”方法。
表1-等离激元-荧光剂PF结构组成
Figure BDA0003100792030000191
Figure BDA0003100792030000201
高稳定性和性能和可承受性
本文公开的用于增强生物测定的技术是用于提高生物测定性能的具有成本效益的解决方案，其中一次处理96孔微量滴定板的等离激元-荧光剂的估算成本与目前的工业标准相当，并且比上述特定衬底(例如，涂覆金属岛薄膜的玻璃载玻片)更便宜。金属纳米结构的高稳定性进一步确保了在生物测定中使用的典型存储/运输/处理条件下，等离激元-荧光剂的完整性和功能性。通常，等离激元荧光剂可以被存储和处理，就像处理荧光标记的生物识别元件一样。总而言之，通过本文所述的技术实现的增强的信噪比显著提高了测定灵敏度、放宽了严格的仪器要求(如低背景噪声和高灵敏度)、减少了所需的样品量和/或显著缩短了整个测定时间，从而使这些测定能够以最小的工作量或成本在各种研究和临床诊断环境中实施，并且大大提高了测定性能。
在已经将荧光检测用作读数的测定中，通过使用等离激元荧光剂代替当前的金标准荧光团引起的荧光强度增加导致生物测定的检测下限(LLOD)提高。在一些实施方案中，LLOD降低至少2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、500倍或甚至1,000倍。另外，这增加了检测的动态范围。在一些实施方案中，动态范围的增加高于2倍、5倍、10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、500倍或甚至1,000倍。在尚未将荧光检测用作读数的测定方法中，但读出方法是化学发光或比色法，例如，在化学发光/比色ELISA或蛋白质印迹中，切换为荧光检测，并在适当的检测仪器上使用等离激元荧光剂将导致相对于所述测定的金标准报告基因方法，至少在生物测定的LLOD和动态范围内具有可比的性能。发现生物分析参数的改进在不同的测定形式、靶标生物标志物和荧光团之间是一致的。重要的是，这种方法可用现有的生物测定实施，只需对标准操作程序进行最少的修改，而无需额外的操作培训。在一些方面中，对现有测定方案的唯一修改是添加荧光纳米构建体代替现有的荧光报道分子。在一些方面中，对现有测定方案的唯一修改是添加荧光纳米构建体代替现有的荧光报道分子并用适当的检测仪器检测荧光。
作为该技术严格验证的一部分，已经对来自肾病患者和健康志愿者的尿液样本进行了分析。与未增强的荧光免疫测定和ELISA相反，等离激元增强的荧光免疫测定能够检测和定量所有患者和健康志愿者的低浓度生物标志物。等离激元增强测定增加的灵敏度使低丰度生物标志物的定量变得容易，并提供了常规免疫测定经常会漏掉的生理和病理信息。
等离激元纳米结构
本文所述的纳米构建体包含等离激元纳米结构核。本文所用的等离激元纳米结构提供了荧光信号的等离激元增强，并且基于许多标准来选择(参见例如表2)。等离激元纳米结构可包括具有可在合适的光波长下共振的表面等离激元的任何材料，如金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)或其组合。等离激元纳米结构的合适实例包括但不限于纳米棒、纳米立方体、纳米球、双金属纳米结构(例如，Au@Ag核-壳纳米立方体)、具有尖锐尖端的纳米结构(例如纳米星)、空心纳米结构，如纳米笼和纳米拨浪鼓(nanorattle)、纳米双锥体、纳米板、自组装纳米结构和纳米树莓(nanoraspberry)。在某些方面中，纳米结构选自金核银壳纳米立方体、纳米管、金纳米棒、银纳米立方体、银纳米球、双金属纳米结构、金纳米棒核、银壳(AuNR@Ag)纳米立方体、具有尖锐尖端的纳米结构、纳米星、空心纳米结构、纳米笼、纳米拨浪鼓、纳米双锥体、纳米板、自组装纳米结构、纳米树莓及其组合。
选择用于荧光纳米结构中的等离激元纳米结构的一个标准是LSPR波长。如图5所示，不同的等离激元纳米结构具有不同的LSPR波长。即使相同的等离激元纳米结构可以具有对应于表面等离激元的不同共振模式的多个LSPR波长。对于荧光团的荧光增强而言最佳的特定LSPR波长是基于该荧光团的激发光谱。特别地，重要的是LSPR波长和荧光团的激发光谱重叠。通常，更多的重叠会导致更好的增强。荧光增强的理想情况会出现在当LSPR波长、荧光团激发最大值和用于激发的光的波长相同时。这允许荧光纳米结构被选择性地调谐以匹配将被用于增强的荧光团。在一些实施方案中，LSPR波长在约200至约1200nm之间，在约250至约950nm之间，在约300至约850nm之间，在约350至约800nm之间，在约400至约750nm之间。在又一个实施方案中，LSPR波长近似(意为±25nm)为300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1000、1050、1100、1150或1200nm。
在一些实施方案中，基于金纳米棒(AuNR)的荧光纳米结构可以具有约600-1200nm的LSPR波长。作为另一个实例，具有银纳米立方体、AuNR@Ag立方体或-Au@Ag立方体的核的等离激元荧光剂可以具有约400nm至约600nm之间的LSPR波长。
在一些实施方案中，等离激元纳米结构具有约400至约1,000nm之间的LSPR波长。在一些实施方案中，用作荧光纳米构建体的等离激元核的等离激元纳米结构是Au@Ag立方体。在一些实施方案中，等离激元纳米结构是金纳米棒(AuNR)。在一些实施方案中，等离激元纳米结构是涂银的金纳米棒(AuNR@Ag)。在一些实施方案中，等离激元纳米结构是任何其他各种等离激元结构中的一种。
在荧光纳米结构的一些实施方案中，等离激元纳米结构包括金纳米棒(AuNR)或涂银的金纳米棒(AuNR@Ag)；间隔涂层包括稳定的硅烷网络，其含有能够被官能化的反应基团；以及生物识别元件包括生物素、链霉亲和素、抗体或这些的任意组合。
表2-等离激元纳米结构(等离激元-荧光剂核)
Figure BDA0003100792030000231
等离激元纳米结构尺寸
形成等离激元-荧光剂核的等离激元纳米结构的尺寸可以是适于增强或放大缀合的荧光团的荧光强度的任何尺寸。在一些实施方案中，等离激元纳米结构的至少一个维度是至少20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm。在一些实施放哪中，等离激元纳米结构的尺寸及其LSPR波长被耦合，使得纳米结构的尺寸被调整为具有与荧光团的激发最大波长最大值重叠的LSPR波长。
波长匹配
如本文所述，可将等离激元纳米结构的尺寸、形状和组成调整为具有与荧光团的激发最大波长最大值匹配的LSPR波长。另外，在用间隔层和/或功能层涂覆之后，LSPR最大值/极大值将转变，并且以下描述的重叠/匹配需要参考涂覆了间隔物和/或功能层的等离激元纳米结构核。波长匹配可以是LSPR波长和荧光团激发光谱的显著重叠；LSPR波长与荧光团的最大激发最大值波长的显著匹配(参见，例如，图5和图6(A-B))，其显示了LSPR/荧光团激发的最大匹配和重叠)；或溶液中纳米结构的消光光谱显示出与溶液中荧光团的消光光谱和/或吸收最大值的显著重叠。激发最大波长LSPR波长和缀合的荧光团激发最大波长的重叠可以是100％重叠，或100％最大LSPR波长与荧光团的最大激发最大波长匹配或重叠。在一些实施方案中，在相似的激发和检测条件下检测时，与溶液中的游离荧光剂相比，与20-2000种荧光剂缀合的，LSPR波长和缀合的荧光团激发最大波长匹配的结果是比荧光纳米结构的荧光强度高至少500倍。
金纳米棒(AuNR)的最大LSPR波长可轻松调整，以匹配在600nm至>1200nm之间的荧光团的激发最大波长。银立方体、AuNR@Ag立方体和Au@Ag立方体的最大LSPR波长可轻松调整，以匹配在400nm至600nm之间的荧光团激发的最大波长。因此，这些被用作示例性材料，但是根据本文所述的方法可以使用可以调整以具有与特定荧光团(例如，任何可见或IR荧光染料)的激发最大波长匹配的LSPR波长的任何等离激元纳米结构。
调整了等离子体纳米结构的尺寸、形状和材料，以使LSPR波长与荧光团的最大激发最大波长匹配。作为另一实例，发现至少一个维度在约60nm至约130nm之间的立方体足以可调地匹配＜600nm的波长。作为另一个实例，发现长度在约30nm至约130nm之间的金纳米棒足以可调地匹配>600nm的波长。例如，如果荧光团的最大激发波长(λEX)在等离激元-荧光剂(PF)的LSPR波长(λLSPR)的约100nm内，则可认为波长是匹配的。
在一些实施方案中，至少一个λLSPR与λEX之差Δ的绝对值是100nm(即，±100nm)。在一些实施方案中，Δ的绝对值小于约75nm。在一些实施方案中，Δ的绝对值为50nm(即，±50nm)。Δ的绝对值越小越好(即接近零的值)，但LSPR吸收峰通常很宽(半最大全宽>50nm或甚至>100nm)，这意味着等离激元荧光剂和荧光团的消光光谱的充分重叠，导致显著的荧光增强，即使光谱(分别为λLSPR和λEX)的最大值是错配的。还公开了用于等离激元纳米结构和染料对的窗口(例如，存在许多可以在与荧光素、Cy3、Cy5、680LT和800CW相似的区域中吸收和发射的荧光染料(荧光团))。
间隔涂层
如本文所述的，间隔涂层被用于涂覆等离激元纳米结构，以通过使荧光团与等离激元纳米结构的表面保持平均的足够距离(例如，距离等离激元纳米结构至少约0.5nm至4nm)来减少或防止猝灭。间隔涂层是可以涂覆等离激元纳米结构并且可以被控制以具有0.5-100nm的厚度的任何材料。在一些实施方案中，间隔物可以用荧光团官能化。
在一些方面中，荧光纳米结构进一步包括形式为等离激元纳米结构上的涂层的间隔物。在一些实施方案中，间隔物是介电材料。在一些实施方案中，涂层的厚度可以调整，以实现不同量的荧光信号的荧光增强。在一些实施方案中，涂层的厚度(d)为约0.5nm至约100nm。在其他实施方案中，涂层的厚度大约为2nm、3nm、4nm、5nm、8nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm或100nm。本文使用的大约表示±25％。在一些实施方案中，可以通过在制备过程中增加单体的浓度来控制涂层的厚度。在一些实施方案中，间隔涂层具有至少0.5nm，至少1nm，至少2nm，至少3nm，至少4nm或至少5nm的厚度。在一些实施方案中，单个荧光纳米构建体上的间隔涂层的厚度变化小于约2nm、3nm、4nm或5nm。
在一些实施方案中，涂层包括可以均匀地沉积在等离激元纳米结构上并可以使用控制以具有上述厚度的任何聚合物或混合物。用作间隔物的聚合物的实例包括，但不限于，蛋白质(例如，BSA)、硅烷和聚乙二醇。优选，涂层是MPTMS、APTMS、TMPS或其组合。在一些实施方案中，间隔物是硅氧烷网络。优选，涂层可以在溶液中施用。在一些实施方案中，间隔涂层共价附着于等离激元纳米结构上。另外，在一些实施方案中，使用无机涂层，如硅石、氧化铝和/或锌氧化物。在一些实施方案中，间隔物是刚性聚合物网络。在一些实施方案中，间隔物涂层含有官能团，用于共价连接其他分子，如胺、醛、羧酸、巯基(sulfhydryl)、酮以及与点击化学相容的部分。在一些实施方案中，间隔涂层是包括介电、刚性聚合物网络的，能够被官能化的聚合物涂层。
在一些实施方案中，间隔物是功能活性的并且含有任何数量的反应基团及其混合物。在一些实施方案中，间隔物用含巯基的部分引发以在金/银表面上形成反应层，并且使用功能性硅烷的混合物从该引发层构建硅氧烷网络。硅烷的优点在于它们是：1)湿化学相容的，2)多种官能团可用于进一步改性和定制颗粒特征[例如，PEG、氨基、环氧、巯基、乙烯基、点击化学部分(TCO、叠氮化物)、PEG-生物素、醛、荧光团和氨基酸]；3)严格控制间隔物厚度在0.5nm至100nm之间。
表3-合适的间隔涂层(通常定义为可以粘附在等离激元纳米结构上并且可以使荧 光剂与等离激元纳米结构表面保持至少0.5nm平均距离的任何材料)
Figure BDA0003100792030000261
Figure BDA0003100792030000271
表4-合适的间隔涂层和/或功能层(通常定义为可以稳定地附着到间隔层和或等 离激元纳米结构的材料)
Figure BDA0003100792030000272
Figure BDA0003100792030000281
在一些实施方案中，间隔涂层或功能层用作发光体(荧光团)和生物识别元件(例如，生物素、链霉亲和素、抗体、核酸)的支架。在一些实施方案中，荧光团附着于功能层，在这种情况下，即使在存在单独的间隔涂层的情况下，功能层也充当荧光团和等离激元纳米结构表面之间另外的间隔物。在一些实施方案中，间隔涂层或功能层用作防止荧光纳米结构聚集的稳定剂。功能层还有助于最小化荧光纳米结构与生物测定表面的非特异性结合。在一些方面中，间隔涂层或功能层是蛋白质。具体实例包括，但不限于，白蛋白、溶菌酶、蛋白A和血红蛋白。在一些方面中，荧光纳米结构上的蛋白质是牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)或其组合。在一些方面中，该蛋白质是BSA。
功能层
在一些方面中，间隔涂层是功能层，或荧光纳米结构可以进一步包括涂覆间隔层的功能层。在一些方面中，功能层是聚合物。可以粘附或附着于纳米结构表面上的间隔涂层表面的任何聚合物或聚合物的组合可以用作功能层。在一些方面，聚合物包含用于共价连接其他分子的官能团，所述其他分子例如胺，醛，羧酸，巯基，酮和与点击化学相容的部分。在一些实施方案中，功能层包含多肽。在一些实施方案中，功能层是白蛋白或其同系物。在一些实施方案中，功能层通过疏水或静电相互作用或其组合吸附于到间隔层。在一些实施方案中，功能层与间隔层共价连接。在一些实施方案中，功能层与免疫测定中用于“阻断”的材料相同。例如，在基于板的免疫测定中，BSA用于阻断表面上的非特异性结合，且将BSA用作功能层材料。
生物识别元件
如本文所述，荧光纳米结构包括生物识别元件(参见例如表5)。生物识别元件靶向特定的分析物或物质。例如，如果靶标是抗原，则生物识别元件可以是抗体，或者生物识别元件可以是链霉亲和素。
在一些实施方案中，生物识别元件选自：生物素、链霉亲和素、抗体(或其功能片段)、寡聚物(如DNA、PNA)、适体、“点击”部分(例如四嗪)、分子印迹聚合物(“人工抗体”)、地高辛、肽标签、蛋白质标签及其组合。在一些实施方案中，靶标选自：链霉亲和素、生物素、靶标抗原、互补寡聚物(DNA、RNA)、靶标分析物，产生对的互补“点击”部分、DIG结合蛋白或抗地高辛抗体及其组合。
在一些实施方案中，经由以下添加荧光团的许多相同化学方法，将生物识别元件(如抗体、链霉亲和素、适体和核酸)添加到间隔层或功能层。另外，在一些实施方案中，将生物素化的等离激元-荧光剂与链霉亲和素直接缀合，并将其进一步与生物素化的抗体缀合。在一些实施方案中，使用柔性接头将生物识别元件连接PF。在一些实施方案中，柔性接头是PEGx，其中x是2-36。在一些实施方案中，荧光纳米结构包括具有至少一个局部表面等离子体共振(LSPR)波长(λLSPR)的等离激元纳米结构，以及包含第一材料的间隔物；至少五种具有激发最大波长(λEX)的荧光有机染料；生物识别元件；其中等离激元纳米结构基本上被厚度为0.5至20nm的间隔物覆盖；其中荧光物质附着在等离激元纳米结构表面远侧的间隔物表面上；其中间隔物基本上被功能层覆盖；其中生物识别元件附着在功能层上；其中LSPR波长与荧光有机染料的激发最大波长之差小于75nm；其中每种荧光有机染料在典型的照明和检测条件下比水溶液中的非缀合的荧光物质亮至少十倍。
表5-示例性生物识别元件/靶向剂
Figure BDA0003100792030000291
Figure BDA0003100792030000301
荧光剂
基于多种标准选择荧光剂。如本文所述，术语荧光剂、荧光物质、荧光团、荧光染料可互换使用。一种选择标准是荧光剂的荧光激发波长最大值。另一个选择标准是将荧光剂附着于荧光纳米结构中的功能层的间隔涂层上的难易程度。在一些实施方案中，荧光剂是任何，紫外线、可见光、近红外(NIR)或红外(IR)有机荧光团。在一些实施方案中，荧光剂选自荧光素、Cy3、Cy5、680LT、800CW、吖啶、吖啶酮、蒽、蒽环、蒽醌、氮杂氮烯(azaazulene)、偶氮氮烯(azo azulene)、苯、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并吲哚碳花青素、苯并吲哚、苯并噻吩、咔唑、香豆素、花青、二苯并呋喃、二苯并噻吩、双吡咯染料、黄酮、荧光素、咪唑、吲哚碳花青素、吲哚花青素、吲哚、异吲哚、异喹啉、萘二苯并菲、萘、萘醌、菲、菲啶、菲啶、吩硒嗪、吩噻嗪、苯恶嗪、苯并呫吨(phenylxanthenes)、多氟苯、嘌呤、吡嗪、吡唑、吡啶、嘧啶酮、吡咯、喹啉、喹诺酮、罗丹明、方酸(squaraine)、并四苯、噻吩、三苯甲烷染料、呫吨、氧杂蒽酮及其衍生物。
另外，本文公开的荧光纳米结构适于增强来自各种不同荧光源或物质的荧光信号。除了本文其他地方公开的荧光剂和测定以外，在一些实施方案中，荧光纳米结构增强来自量子点和上转换纳米颗粒的荧光信号。
在一些实施方案中，通过标准化学方法添加荧光分子：琥珀酰亚胺酯、NHS-酯、TFP酯或异硫氰酸酯添加到伯胺；马来酰亚胺添加到巯基基团；点击化学直接添加到官能化的硅烷(例如四嗪连接的荧光团连接至TCO-PEGn-三乙氧基硅烷)，或通过首先官能化另一种反应基团以具有点击部分；酰肼或羟胺添加到醛或酮。另外，在一些实施方案中，荧光团首先与功能层分子(如蛋白质缀合)，其随后粘附于间隔层。
在一些实施方案中，荧光物质是有机染料。在一些实施方案中，有机染料以每个等离激元-荧光剂5-2000个荧光团的涂覆密度存在。在一些实施方案中，荧光物质与间隔层共价连接。在一些实施方案中，荧光物质共价附着于功能层。
表6-荧光物质(即，荧光团)
荧光物质
有机染料
量子点
上转换纳米颗粒
纳米金刚石
碳点
金属纳米团簇(例如，Au和Ag纳米团簇)
荧光团掺杂的纳米颗粒
Eu掺杂的纳米颗粒
过渡金属络合物
镧系络合物
荧光蛋白
等离激元-荧光剂(PF)的示例性实施方案
以下描述的等离激元-荧光剂(PF)的变体在PF组成部分的排列方式上有所不同，但均包括间隔层中涂覆的等离激元纳米结构，荧光团与等离激元纳米结构表面保持特定距离，附着在PF某处的生物识别元件，以及荧光团和等离激元纳米结构之间的耦合，这由至少一个PF LSPR波长和所附着的荧光团的激发最大值的重叠所定义。在某些情况下，存在一层称为“功能层”。这可以用于多个目的：连接分子(荧光团、生物识别元件)；稳定结构以防止聚集和非特异性结合。
在一些实施方案中，功能层存在于PF上。特别地，公开了一种等离激元纳米结构，其具有至少一个局部表面等离激元共振波长(λLSPR)，基本上覆盖等离激元纳米结构表面的特定厚度(d)的间隔物材料，与间隔物材料缀合的荧光团，基本上覆盖间隔物材料的功能层材料，和，与功能层材料缀合的生物识别元件。
在一些实施方案中，所述方法包括用至少一个间隔涂层涂覆等离激元纳米结构；任选用功能层涂覆至少一个间隔涂层；将荧光剂与至少一个间隔涂层之一或功能层缀合；以及将生物识别元件与至少一个间隔涂层之一或功能层缀合。
在一些实施方案中，用至少一个间隔涂层涂覆等离激元纳米结构包括将引发层施加于等离激元纳米结构核上并将聚硅氧烷涂层施加于引发层上。
在一些实施方案中，引发层包括3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)。在一些实施方案中，聚硅氧烷涂层包含三甲氧基丙基硅烷(TMPS)和3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)。
在一些实施方案中，公开了具有局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构，基本上覆盖等离激元纳米结构表面的特定厚度(d)的间隔物材料，与间隔物材料缀合的荧光团，以及与间隔物材料缀合的生物识别元件。在一些实施方案中，荧光纳米结构包括具有局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构，和包括第一材料的间隔物；荧光物质；生物识别元件；其中纳米结构基本上被具有厚度(d)的间隔物覆盖；其中间隔物与荧光物质缀合；其中生物识别元件附着于间隔物；其中荧光物质具有激发最大波长(λEX)，其中LSPR波长和激发最大波长之差为|Δ|。
在一些实施方案中，公开了具有局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构，基本上覆盖等离激元纳米结构表面的特定厚度(d)的间隔物材料，与间隔物材料缀合的荧光团，与间隔物缀合的生物识别元件以及基本上覆盖间隔物的功能层材料。在一些实施方案中，荧光纳米结构包括具有局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构，和包括第一材料的间隔物；荧光物质；生物识别元件；包括第二材料的功能层；其中纳米结构基本上被具有厚度(d)的间隔物覆盖；其中间隔物与荧光物质缀合；其中生物识别元件附着于间隔物；其中功能层材料附着于间隔物；其中荧光物质具有激发最大波长(λEX)，其中LSPR波长和激发最大波长之差为|Δ|。
在一些实施方案中，公开了具有局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构，基本上覆盖等离激元纳米结构表面的特定厚度(d)的间隔物材料，基本上覆盖间隔物材料的功能层材料，与功能层材料缀合的荧光团，以及与功能层材料缀合的生物识别元件。在一些实施方案中，荧光团附着于功能层，生物识别元件直接附着于间隔物。在一些实施方案中，荧光纳米结构包括具有局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构，和包括第一材料的间隔物；荧光物质；包括第二材料的功能层；生物识别元件；其中纳米结构基本上被具有厚度(d)的间隔物覆盖；其中间隔物基本上被功能层覆盖；其中荧光物质附着于功能层；其中生物识别元件附着于功能层；其中荧光物质具有激发最大波长(λEX)，其中LSPR波长和激发最大波长之差为|Δ|。
在一些实施方案中，荧光纳米结构在pH7水中具有高于约20mV，或约25mV，或约30mV，或约35mV，或约40mV，或约45mV的ζ电位的绝对值。
在一些实施方案中，等离激元-荧光剂的亮度比典型的相同发光和检测条件下的单独荧光物质亮至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍和甚至至少10,000倍。在一些实施方案中，连接等离激元-荧光剂的每种荧光物质的亮度平均比典型的相同发光和检测条件下的游离荧光物质亮至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍。适于与荧光纳米构建体一起使用的测定
本文公开的荧光纳米结构适于与使用荧光或可以使用荧光用于检测和/或定量分析物的任何测定一起使用。适用于本文的测定的实例包括但不限于抗体/蛋白质微阵列、珠子/悬浮液测定、生物芯片测定、毛细管/传感器测定、细胞测定、组织测定、DNA/RNA微阵列、聚合酶链反应基于PCR的测定、聚糖/凝集素阵列、免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、微流芯片和基于膜的测定。
本文公开了一种用于改善生物测定的性能的方法。该方法通常包括在生物测定中使用如本文其他地方所述的荧光纳米构建体作为报告分子，其中所述荧光纳米构建体通过生物识别元件靶向特定的分析物或物质，并且使用本领域已知的用于检测荧光团或荧光信号的任何检法来检测荧光信号，其中分析物浓度与荧光信号成比例。在一些实施方案中，生物识别元件直接靶向特定目标分析物(例如，生物识别元件是分析物的一抗或是与特定靶寡核苷酸互补的寡核苷酸)。在一些实施方案中，生物识别元件靶向特异性结合靶分析物的另一个分子上的部分(例如，生物识别元件是识别与靶分析物结合的一抗的二抗，或生物识别元件是识别生物素化的检测一抗的链霉亲和素)。
由于相对于标准荧光团，通过使用荧光纳米构建体产生大的荧光信号，因此相对于使用当前标准荧光报告分子可达到的检测下限，大大提高了荧光测定的检测下限(即，LOD较低，且可以检测浓度较低的样品)。在一些方面中，使用荧光纳米构建体的测定的检测下限低于使用当前标准荧光报告分子的相同测定的检测下限。在某些方面中，LOD提高了2倍(即，意味着LOD是使用当前标准荧光报告分子检测的一半-检测灵敏度为两倍)。在某些方面中，与使用当前标准荧光报告分子进行的相同测定相比，LOD好至少2倍，好至少3倍，好至少4倍，好至少5倍，好至少10倍，好至少25倍，好至少50倍，好至少100倍，至少500倍，好至少1000倍，好至少5000倍，或甚至好至少10,000倍。
表7-使用等离激元荧光剂作为报告分子的测定
Figure BDA0003100792030000341
Figure BDA0003100792030000351
制造方法
在一些实施方案中，如下合成等离激元-荧光剂：(1)用间隔层涂覆等离激元纳米结构；(3)将荧光物质与间隔层缀合；(4)用功能层覆盖从(3)得到的纳米结构；和(5)将生物识别元件与功能层缀合。这种合成还包括几种变体和其他实施方案。
变体1：与功能层缀合的生物识别元件：(1)从等离激元纳米结构开始；(2)用间隔层覆盖等离激元纳米节藕股，其中间隔层是MPTMS、APTMS和TMPS的混合物，或可以使用交替的硅烷与不同的功能部分(例如，醛或四嗪)，用于连接荧光物质(例如，分别通过肼或TCO)；(3)将荧光物质与间隔层缀合，其中荧光物质与胺共价连接(通过NHS或TFP酯)或可以使用交替的硅烷与不同的功能部分(例如，醛或四嗪)，用于连接荧光物质(例如，分别通过肼或TCO)；(4)将生物识别元件与功能层缀合：(a)生物识别元件是生物素，而功能层是牛血清白蛋白(BSA)，其中使用NHS酯将生物素与BSA(或另一种合适的蛋白质)共价连接，其中生物素在PEGx间隔物上；或(b)使用点击化学将链霉亲和素或抗体直接连接BSA，通过例如NHS-PEGx-TCO与BSA以及NHS-PEGy-四嗪与链霉亲和素或抗体反应，用BSA-TCO涂覆纳米构建体，并随后在以下步骤(5)后在四嗪-生物识别元件中混合；(5)用(4)中的功能层覆盖来自(3)的纳米构建体，在功能层步骤中使用生物素化的BSA(或其他合适的蛋白质)与天然BSA的混合物。
变体2：与功能层缀合的荧光剂-生物识别元件：(1)从等离激元纳米结构开始；(2)用间隔层覆盖等离激元纳米结构；(3)将生物识别元件和荧光团与功能层缀合；和(4)用来自(3)的功能层覆盖来自(2)的颗粒。
在一些实施方案中，将生物素化的PF用作构建模块来添加其他生物识别元件。可以使用生物素作为生物识别元件，但也可以使用生物素来连接其他生物识别元件(例如，链霉亲和素)。因此，将存在其他步骤，其中将链霉亲和素与生物素化的PF纳米构建体缀合。相似地，可以取这种链霉亲和素缀合的PF并连接生物素化的抗体。在这种情况中，将存在再另一个步骤，其中将生物素化的抗体与链霉亲和素-缀合的PF缀合。
在一些实施方案中，通过将线性或分支亲水性聚合物与功能层、链霉亲和素或抗体连接来进一步修饰PF。在一些实施方案中，亲水性聚合物是PEG。
使用方法
设计等离激元-荧光剂来增强基于荧光的生物测定的性能。具体地，它们被用作报告分子，其中在适当的波长下激发时由等离激元-荧光剂产生的荧光信号与靶分析物的浓度相关。PF可以用于多种不同的分析类型和格式中。PF最明显的用途是作为免疫测定中的报告分子。在这种情况下，将检测一抗用于检测靶分析物，而将PF用于报告存在的检测抗体的浓度，其与靶分析物的量成比例。这可以通过以下方法来完成：将检测抗体直接附着于PF(生物识别元件为检测抗体)上，并使用所得到的构建体结合靶分析物；通过将缀合链霉亲和素的PF(生物识别元件为链霉亲和素)与已经结合靶分析物的生物素化的检测抗体结合；将生物素化的PF(生物识别元件为生物素)与链霉亲和素结合，所述链霉亲和素与已经结合靶分析物的生物素化的检测抗体结合；或结合与二抗(生物识别元件为二抗)缀合的PF，所述二抗针对结合靶分析物的检测抗体。
另外，可以通过以下方式之一使用PF来检测靶核酸序列：1)使用互补核酸序列作为生物识别元件；或2)首先使用生物素化的核酸序列结合靶标，并用链霉亲和素连接的PF(生物识别元件为链霉亲和素)对这进行检测。
在一些实施方案中，检测分析物的方法包括：提供等离激元-荧光剂，其中至少一种生物识别元件靶向分析物(直接或通过以上所述的方式)；用合适的激发波长激发等离激元-荧光剂；和，检测发射的光，其中检测到的光亮与分析物的浓度成比例。
在一些实施方案中，所述测定包括选自以下的基于免疫靶向的测定：FLISA、FACS、流式细胞术、Western印迹、蛋白质微阵列、基于珠子的多重免疫测定(例如，Luminex)、免疫组织化学、免疫细胞化学、侧向流测定、微流体、ELISPOT、荧光显微镜检查、FLIM、点印迹、单细胞Western、细胞中的Western、竞争性免疫测定、数字免疫测定、ImmunoCAP测定、蛋白质Simple’s ELLA测定，及其组合。在一些实施方案中，所述测定包括选自以下的基于核酸的测定：Northern印迹、微阵列、下一代测序、RNA-seq、FISH、EMSA，及其组合。
试剂盒
还提供了试剂盒。这样的试剂盒可以包括本文所述的试剂或组合物，并且在某些实施方案中，还包括使用说明书。这样的试剂盒可以促进本文所述方法的执行。作为试剂盒提供时，组合物的不同成分可以包装在单独的容器中，并在使用前立即混合。成分包括但不限于测定或荧光纳米构建体或其组成部分，如荧光团、等离激元纳米结构、涂层或间隔试剂、聚合物、生物素、链霉亲和素、抗体、蛋白质、结合剂或接头。如果需要，这些组分的单独包装可以在包装或分配器装置中提供，其可以含有一种或多种含有该组合物的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。在某些情况下，这种组分的单独包装还可以允许长期存储，而没有失去组分的活性。
在一些实施方案中，试剂盒在分开的容器中包括试剂，如，例如，待加入分开包装的组分中的无菌水或盐水。例如，密封的玻璃安瓿瓶可以含有一种组分，并且在分开的安瓿瓶中，含有无菌水、无菌盐水或无菌的，其中每种均已包装在中性非反应性气体(如氮气)下。安瓿瓶可由任何合适的材料组成，如玻璃、有机聚合物，如聚碳酸酯、聚苯乙烯、陶瓷、金属或通常用于容纳试剂的任何其他材料。合适容器的其他实例包括可以由与安瓿类似的物质制成的瓶子，以及可以由衬有铝箔(如铝或合金)的内部构成的包壳。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可以具有无菌入口，如具有可以被皮下注射针刺穿的塞子的瓶子。其他容器可以具有两个隔室，由易于移除的膜隔开，该膜在移除时允许组分混合。可移动的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。
在某些实施方案中，试剂盒随附说明材料。说明书可以印刷在纸或其他基质上，和/或可以作为电子可读介质或视频提供。详细说明可能与试剂盒在物理上不相关；相反，可以将用户指引到该试剂盒的制造商或分销商指定的Internet网站。
在一些实施方案中，试剂盒包含荧光纳米构建体；或等离激元纳米结构，间隔物材料，生物识别元件和至少一种荧光剂。在一些实施方案中，与单独的至少一种荧光剂相比，荧光纳米构建体或组合的等离激元纳米结构、间隔材料、生物识别元件和至少一种荧光剂能够具有至少500倍更高的荧光强度。在一些实施方案中，试剂盒含有PF的液体悬浮液。在一些实施方案中，试剂盒含有PF的冷冻溶液。在一些实施方案中，试剂盒含有PF的冻干溶液。在一些实施方案中，试剂盒含有与链霉亲和素缀合的PF和用户使用说明，以将与链霉亲和素缀合的PF与生物素化的一抗缀合并纯化这种与一抗缀合的PF。
以上详细描述了荧光纳米构建体及其使用方法的示例性实施方案。本文所述的荧光纳米构建体和方法不限于所述的特定实施方案，相反，装置、系统、试剂盒的组成部分，和/或方法的步骤可以单独使用并与本文所述的其他组成部分和/或步骤分开使用。例如，所述方法也可以结合其他聚合物、纳米结构和生物测定来使用，并且不限于仅使用本文所述的装置、系统和方法的实施。而是，可以结合许多其他系统来实现和利用示例性实施方案。
尽管可以在一些附图中示出本公开的各种实施方案的特定特征和应用，而在其他附图中不示出，但这仅是为了方便。根据本公开的原理，可以结合任何特征来参考和/或要求保护本文说明的任何特征。
在以下的说明书和权利要求书中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义。除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一(a)”，“一(an)”和“该(the)”包括复数形式。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的，并且意味着除所列要素之外，可能还有其他要素。“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能会发生或可能不会发生，并且该描述包括事件发生的情况和事件没有发生的情况。
如本文在整个说明书和权利要求书中所使用的，近似语言可以用于修饰可以容许改变的任何定量表示，而不会导致与之相关的基本功能发生变化。因此，由诸如“约”、“大约”和“基本上”的一个或多个术语修饰的值不限于所指定的精确值。在至少一些情况中，近似语言可以对应于用于测量该值的仪器的精度。在这里以及整个说明书和权利要求书中，范围限制可以被组合和/或互换；除非上下文或语言另有说明，否则将标识此类范围并包括其中包含的所有子范围。
实施例
以下实施例描述了制备和使用等离激元-荧光剂(PF)来最大化荧光增强的组合物和方法。
实施例1
在荧光纳米构建体的设计和合成中，需要仔细考虑两个因素：(i)附着的荧光团必须与等离激元纳米结构表面足够远，以避免金属诱导的荧光猝灭；(ii)荧光团必须与等离激元纳米结构表面足够近，以受益于增强的电磁场，该电磁场随着与等离激元纳米结构表面的距离增加而迅速衰减。已知等离激元纳米结构的表面处增强的电磁场的渐逝性质导致等离激元纳米结构表面处的荧光增强是高度距离依赖性的。荧光团与等离激元纳米结构直接接触(或非常接近)时，荧光团与金属表面之间的非辐射能量转移会导致荧光猝灭。另一方面，荧光团和金属纳米结构之间的距离的增加导致增强的降低，这是由于电磁场从纳米结构表面衰减而引起的。综上所述，金属表面和荧光团之间的最佳距离是纳米结构确保最大增强的一个关键方面。最佳隔离层厚度(d)<10nm。更具体地，为了最大增强，荧光团直接附着于间隔层时，间隔物的厚度应在1至10nm之间，而当荧光团附着于功能层时，间隔物的厚度应在0.5至5nm之间。
为了在表面上实现等离激元纳米结构和荧光团之间的最佳距离，在等离激元纳米结构的表面上形成聚硅氧烷共聚物层作为间隔层。3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)用于结合等离激元纳米结构表面，以形成间隔物的引发层。水解不稳定的三甲氧基丙基硅烷(TMPS)和3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)通过引发层在等离激元纳米结构上共聚。由于围绕纳米结构的介质的折射率增加，间隔层的形成导致等离激元纳米结构的纵向LSPR波长的红移。
透射电子显微镜和原子力显微镜(AFM)成像证实了在等离激元纳米结构上成功形成了间隔层。聚合前后AuNR的AFM高度分布表明了间隔层的厚度为～3nm。通过将纳米结构结合涂有链霉亲和素-800CW的衬底上，研究了具有和不具有介电间隔物的纳米结构的荧光增强。发现具有和不具有聚合物间隔层的纳米结构的相同密度(通过扫描电子显微镜成像确认)的整体荧光增强倍数分别为～1000和～200，凸显了间隔层对于大的荧光增强的重要性(图7A)。注意到这些颗粒具有附着于BSA的荧光团，其提供了一定的间隔。如果荧光团直接连接到AuNR，则几乎没有荧光。观察到的明亮发射是由增强的激发(增强的EM场)和改变的辐射速率引起的。对于速率增强的详细研究，确定了分散在溶液中的800CW-BSA以及由800CW-BSA组成的纳米结构的激发态寿命。与游离800CW-BSA的荧光寿命(0.75ns)相比，吸附在AuNR上的800CW-BSA的荧光寿命表现出低四倍以上的寿命(0.18ns)(图7B)。荧光寿命的大幅降低直接有助于荧光团的发射率增强。
实施例2：测定验证
在荧光纳米构建体合成后，这些新材料和新方法的应用在几种生物分析技术中得到了验证，以增强微弱的荧光信号和相关的生物分析参数。为了比较以下所述的可商购测定的测定参数的增强，根据供应商的说明书进行了测定，并以＜金标准报告分子浓度10倍的浓度添加等离激元-荧光剂。通过优化试剂孵育时间和浓度可以实现甚至更高的性能。
等离激元-荧光剂在生物测定的最后一步中充当超亮荧光探针，以增强微弱的荧光和信噪比(SNR)，而无需对现有生物测定方案进行任何更改或修改(即“无创”方法)。等离激元-荧光剂的超亮度归因于金属核的存在，其充当天线以强烈地增强表面上的荧光团的荧光发射。金属纳米结构附近的荧光团发射的增强归因于等离激元纳米结构表面增强的电磁场(局部激发场)，以及由于激发的荧光团与纳米结构的表面等离激元之间的耦合而导致的荧光寿命降低。等离激元-荧光剂具有高度的多面性和通用性，并与各种现有的基于荧光的生物分析技术无缝集成。
本公开测试了等离激元-荧光剂作为荧光增强剂在荧光团连接的免疫吸附测定(FLISA)中的应用。典型的夹层FLISA涉及以下主要步骤：(i)通过固定的抗体捕获靶抗原；(ii)生物素化的检测抗体与捕获的抗原的结合；(iii)荧光标记的链霉亲和素的结合。如本文所示的，在最后步骤后(即结合荧光标记的链霉亲和素)添加生物素化的等离激元-荧光剂导致荧光强度的大大增强并显著提高了检测限(LOD)。添加生物素化的等离激元-荧光剂使得测定改进可以与当前荧光标记的报告分子标准品(荧光标记的链霉亲和素)直接面对面比较。这种方法在已经用链霉亲和素测定的样品中添加生物素化的PF，在读数设备无法充分衰减信号的情况下，还允许用户在目标分析物浓度的极高动态范围内对样品进行检测(即高浓度的分析物产生的荧光在使用PF时会使检测器饱和，但可以使用标准的荧光团标记的链霉亲和素读取，其中链霉亲和素可以与一种或多种荧光团缀合)。为了获得高动态范围，用户首先要添加荧光标记的链霉亲和素并测量从测定所得的荧光，然后再添加生物素化的PF并重新读取从测定所得的荧光。这对于基于板和基于珠子的测定特别有吸引力。实际上，最终用户可能更喜欢直接使用缀合的链霉亲和素或检测抗体PF，而不是先添加荧光标记的链霉亲和素、读取、然后再用生物素化的PF进行探测。根据本公开，通过使用96孔微量滴定板作为采样平台，在生物医学研究和临床诊断中广泛采用的标准测定形式，以异质固相形式实施FLISA。
研究的第一个应用是在96孔板中进行的荧光免疫分析，其中将人IL-6用作模型目标。初步结果表明了通过简单地添加荧光纳米结构作为测定的最后一步，荧光强度最多可增加2000倍。由于荧光强度的显著改善，在一些实施方案中，测定灵敏度降低了五个数量级，降至3fg/ml，这比使用当前金标准ELISA测定甚至使用相同的抗体和标准分析物的测定可达到的灵敏度低三个数量级。
800CW-链霉亲和素，常规的荧光标签，后面接着加入纳米结构作为最后一步的信号增强剂。为了探测灵敏度和LOD的提高，将已知浓度的IL-6在有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行系列稀释(6fg/mL至6ng/mL)。应用纳米结构后获得的荧光图像显示，与常规的FLISA相比，荧光强度提高了2000倍。具体而言，仅在两个最高浓度(6和0.6ng/mL)下才能检测到使用常规荧光剂(800CW)的荧光信号。另一方面，可以检测到低至6fg/mL的使用荧光纳米结构的荧光信号。未增强的和等离激元增强的IL-6测定的检测下限(LLOD＝空白的平均值+3σ)分别被确定为600pg/mL和6fg/mL，这代表在添加荧光纳米结构后的LOD提高了105倍。值得注意的是，等离激元增强的测定的LOD比厂商指定的酶联免疫吸附测定(ELISA)低1000倍，后者涉及比色信号的酶促扩增。更令人惊讶的是，等离激元增强的测定显示了七个数量级的动态范围，与ELISA相比，动态范围高出四个数量级。从本质上讲，纳米结构可以极大地改善市售免疫测定试剂盒的生物分析参数(LLOD，定量下限(LLOQ＝空白的平均值+10σ)，动态范围)，而无需繁琐和重复的步骤或任何专门的方法或昂贵的仪器。
研究的第二个应用是蛋白质微阵列中的信号增强。为此，在3D微孔硝基纤维素膜中使用了人肾脏生物标志物微阵列。通过简单地添加荧光纳米结构，人患者尿液样品中的所有38种蛋白质生物标志物都可以通过一项简单的测试进行可视化，而与使用荧光标记的链霉亲和素的分析方法相比，其仅可以揭示15种生物标志物。
在另一个方面中，研究了荧光纳米结构在增强免疫微阵列的灵敏度中的适用性。将人肾病生物标志物的抗体微阵列(R&D系统ARY019)27)用作代表性的实例，以在空间多重和高通量生物传感平台中测试荧光纳米构建体的性能。该微阵列由38种捕获抗体组成，对应于人肾脏蛋白质生物标志物，一式两份印在三维硝基纤维素膜上。生物素化的IgG印作一式两份作为参考(阳性对照)。一式两份的PBS斑点被印作为阴性对照。使用封闭缓冲液将来自肾病患者的人尿液样品稀释2倍，并加入阵列中。随后，将捕获的生物标志物蛋白暴露于生物素化的检测抗体混合物，接着暴露于800CW-链霉亲和素。常规的微阵列程序在此步骤结束，这时通过分析对应于每种分析物的荧光强度来(半)定量生物标志物浓度。在等离激元增强的测定中，将生物素化的荧光纳米结构溶液添加到微阵列上，孵育30分钟，然后彻底漂洗以去除弱结合的纳米结构。这使得可以直接比较金标准报告基因方法和纳米结构，但在实践中，用户可能更喜欢使用链霉亲和素偶联的PF，而不是先添加荧光标记的链霉亲和素，然后再用生物素化的PF进行标记。
使用人的尿液样品通过常规的荧光剂和荧光纳米结构获得的荧光图说明了荧光信号的改善。首先，发现添加纳米结构后，阳性对照的亮度和SNR增强了80倍。同时，未从阴性对照中检测到信号，表明纳米结构与硝基纤维素膜的非特异性结合最少，这对确保低背景至关重要。使用常规荧光剂，在靶向的38种蛋白质生物标记物中，只有14种是可检测到的，其中大多数显示出弱强度。添加纳米结构后，来自微阵列各点的荧光信号强度显著增加。添加荧光纳米结构后硝基纤维素的SEM图像揭示了多孔膜上AuNR的均匀分布，没有聚集的迹象。发现对应于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、β2微球蛋白(Beta 2M)、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3和中性粒细胞明胶酶相关的脂蛋白(NGAL)的荧光信号与荧光标记的链霉亲和素相比增强了500倍。此外，纳米结构能够检测和定量荧光标记的链霉亲和素无法检测到的所有其他靶标。例如，肾脏损伤分子-1(KIM1)是急性肾损伤早期检测的特定生物标志物，只能在添加荧光纳米结构后才能检测到。
实施例3
超亮荧光纳米结构也被应用于细胞成像以探测和揭示细胞表面生物标志物。选择乳腺癌细胞系作为模型，并使用不同稀释度的ErbB2一抗，然后是800CW标记的链霉亲和素，检测过度表达的生物标志物ErbB2。实验表明，在添加生物素化的荧光纳米结构后，对应于ErbB2的荧光强度增加了多达100倍(图8A和图8B)。荧光显微镜图像即使在一抗稀释度为105倍时仍显示出过表达的ErbB2(图8A)。在实践中，大多数用户使用与二抗或一抗连接的PF用于基于细胞或基于组织的实验，包括流式细胞术、免疫细胞化学和免疫组织化学。通过将PF连接抗体，用户可以更轻松地进行多重检测(即，通过使用特定的抗体/PF对同时检测多个标记，其中抗体/PF对具有独特的荧光光谱特征，这是此类使用用常规荧光团标记的抗体的实验中常用的技术)。
实施例4
在再一个方面中，荧光纳米结构增强基于流式细胞术的细胞分析中的SNR的能力(图8(A-B)和图9(A-B))。测试作为模型细胞系的ErbB2(人表皮生长因子受体2)阳性上皮乳腺癌细胞(SKBR3)。使用标准荧光探针对细胞表面受体ErbB2进行免疫染色，然后添加纳米结构。常规的两步染色程序是通过将甲醛固定的SKBR3单细胞悬液与生物素化的抗ErbB2和链霉亲和素荧光团(链霉亲和素-680LT)按序孵育而进行的。通过更改长宽比将LSPR的纵向波长调整为660nm，以优化680LT的纳米结构。用抗生物素蛋白-荧光团标记后，将细胞在纳米结构悬浮液中进一步孵育一个小时。在进行流式细胞术之前，先测试并视觉确认荧光信号的增强。用常规的荧光剂和纳米结构获得细胞的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。如上所述，在与细胞悬浮液孵育之前，将抗ErbB2稀释至不同浓度。与常规染色(即链霉亲和素-荧光团)相比，添加纳米结构后观察到明显更亮的荧光信号，即使在100,000倍的一抗稀释下也可检测到(图8(A-B)和图9(A-B))。
在流式细胞术实验中，通过Guava InCyte分析了5000个细胞，以结合正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)来获取荧光信号(RED-R通道(激发激光：642nm；滤光：662/15nm))。由于其纳米级尺寸(～75nm)，纳米结构与细胞表面的结合不会改变正向散射或侧向散射强度(数据未显示)。荧光信号的直方图显示，与使用链霉亲和素-荧光剂的细胞相比，使用纳米结构的强度高60倍(图9A)。荧光直方图还显示了即使在添加纳米结构后一抗稀释100,000倍，也可以检测到细胞表面上ErbB2的表达(图9B和图8B)。另一方面，单独使用链霉亲和素-荧光剂时，在稀释度高于1000倍下，无法检测到荧光信号。在使用荧光剂和纳米结构的不同稀释度的一抗下获得的荧光平均值证明了新的纳米结构有望用于检测细胞表面上的低丰度靶标(图8B)。
实施例5-可替换的PF设计
图10显示了示例性实施方案，其中首先用聚合物涂覆等离激元纳米结构(步骤1)，该聚合物用作荧光物质和等离激元纳米结构表面之间的间隔物。然后将至少一种荧光物质与聚合物涂层缀合(步骤2)，使得荧光物质与等离激元纳米结构的表面平均保持＞0.5nm的距离。选择等离激元纳米结构和荧光物质，使得在等离激元纳米结构的吸收光谱与荧光物质的激发光谱/吸收光谱之间存在明显的重叠。在适当的激发和检测条件下，由步骤2产生的荧光纳米复合物比未附着的单独荧光物质至少亮500倍。然后，将由步骤2得到的荧光纳米复合物/纳米结构涂覆功能聚合物层(步骤3)，在这个实例中为牛血清白蛋白和生物素化的牛血清白蛋白。由步骤3得到的纳米复合物是生物素化的等离激元-荧光剂。可以将生物素化的等离激元-荧光剂与至少一种链霉亲和素缀合(步骤4)，产生链霉亲和素-等离激元-荧光剂。最后，可以用至少一种生物素化的抗体进一步修饰这种链霉亲和素-等离激元-荧光剂(步骤5)，以产生缀合抗体的等离激元-荧光剂。
图11显示了示例性实施方案，其中首先用聚合物涂覆等离激元纳米结构(步骤1)，该聚合物用作荧光物质和等离激元纳米结构表面之间的间隔物。然后将至少一种荧光物质与聚合物涂层缀合(步骤2)，使得荧光物质与等离激元纳米结构的表面平均保持＞0.5nm的距离。选择等离激元纳米结构和荧光物质，使得在等离激元纳米结构的吸收光谱与荧光物质的激发光谱/吸收光谱之间存在明显的重叠。在适当的激发和检测条件下，由步骤2产生的荧光纳米复合物比未附着的单独荧光物质至少亮500倍。然后，将由步骤2得到的荧光纳米复合物/纳米结构涂覆功能聚合物层(步骤3)，在这个实例中为牛血清白蛋白以及与适用于点击化学反应中的反应部分(例如，反式-环辛烯(TCO))缀合的牛血清白蛋白。可以将由步骤3得到的纳米复合物与至少一种抗体缀合，通过使已用与步骤3中所使用的点击化学相容性部分互补的点击化学相容性部分(例如四嗪)标记的抗体反应，从而产生抗体-等离激元-荧光剂。
图12显示了另一种可替换的设计，其中，本文中描述为抗体的生物识别元件通过接头部分(例如聚乙二醇)连接聚合间隔物层。生物识别元件的其他非限制性实例是链霉亲和素、寡核苷酸或适体。应当注意，来自图9-12的元件可以混合和匹配。例如，可能存在一种聚合接头，如本文所述的，其也可以与BSA一起使用，如9-11中所示的。
硅烷-醛可用于将缀合肼的材料(PEG或荧光团)与间隔层连接。在这种情况下，将在用TMPS/APTMS形成间隔层的过程中添加硅烷醛。
图13显示了用作间隔层/涂层的介电材料基质中的实例等离激元纳米结构。介电材料基质上涂有功能层(蓝色云状物)。靶向剂(粉色的“Y”形，例如抗体)与功能层缀合。
图14显示了与IRDye 800CW缀合的等离激元-荧光剂(涂有Ag等离激元纳米结构的AuNR)的消光光谱(激发最大值＝784)。插图显示了LSPR最大值。
图15显示了等离激元-荧光剂(涂有Ag等离激元纳米结构的AuNR)的LSPR最大值与IRDye 800CW的激发最大值之间的错配，显示出所得到的整体等离激元-荧光剂亮度对等离激元-荧光剂的LSPR最大值和染料的激发最大值之间的重叠的显著影响。
图16显示了与Cy3(激发最大值＝550nm)缀合的等离激元-荧光剂(AuNR@Ag立方体等离激元-纳米结构)的消光光谱。插图显示了最大LSPR波长。
图17显示了等离激元-荧光剂(AuNR@Ag立方体等离激元纳米结构)的LSPR最大值与Cy3的激发最大值之间的错配，表明所得到的整体等离激元-荧光剂亮度对等离激元-荧光剂的LSPR最大值和染料的激发最大值之间的重叠的显著影响小得多。原因是所有使用AuNR@Ag立方体等离激元纳米结构的等离激元-荧光剂在Cy3的激发最大值区域均具有明显的吸收(即，所有这些结构显示出与Cy3的激发光谱的明显重叠)。此外，即使具有最大振幅的LSPR峰与Cy3的激发最大值波长明显不同，这些纳米结构也存在多个LSPR峰，并且有些在Cy3的激发最大值区域内。与图14和图15中的消光光谱相比，对于与IRDye 800CW缀合的等离激元-荧光剂(涂有Ag等离激元纳米结构的AuNR)，很清楚对于显著增强的重要参数是等离激元-荧光剂在荧光染料的激发最大值附近有明显的吸收，且等离激元-荧光剂的吸收光谱显示出与染料的激发光谱有明显的重叠。
图18显示了覆盖在特定厚度的介电基质(绿色壳)中的等离激元体纳米结构(涂有银的金纳米棒)。荧光团(红色星爆)直接附着于介电基质的外表面。生物识别元件(粉色“y”形，例如抗体)可以与间隔物直接缀合，并且间隔物可以被功能层材料(蓝色云状物)覆盖。
实施例6-等离激元-荧光剂制备程序
在一些实施方案中，用与链霉亲和素和/或抗体缀合的等离激元-荧光剂来制备等离激元-荧光剂。为了仅具有BSA-生物素荧光剂，可以在步骤7后停止。步骤如下：
步骤1：校准。基于核心等离激元纳米结构的消光，制备40mL溶液，其LSPR最大值具有消光2。
步骤2：界面层。在通风橱中，将40μL MPTMS加入等离激元纳米结构溶液中，然后在轨道振荡器上以125RPM放置1小时。
步骤3：间隔层。在通风橱中，添加160μL APTMS，并将试管倒置10次，然后添加160μL TMPS，并将其倒置10次，然后将其放在轨道振荡器上4个小时。(因此，该体积的M:A:T比例为1:4:4)。
步骤4：游离的单体/聚合物纯化。将来自步骤3的溶液离心。在沉淀物中收集间隔物涂覆的等离激元纳米结构。除去上清液，并用1mM CTAC代替以除去游离硅烷。
步骤5：染料标记。向上述体积为4mL，在LSPR最大值的消光为20的NP溶液中，添加250μL10X pH 7.4PBS缓冲液。添加0.1-20μL的缀合NHS-酯的染料分子，并在室温下反应1小时。
步骤6：游离染料纯化。将染料标记的纳米颗粒溶液离心并除去上清液。
步骤7：BSA/BSA-生物素涂覆。将来自步骤6的纳米颗粒重悬于pH>6的5mg/mL BSA-生物素溶液(或BSA-生物素和游离BSA的混合物，以改变生物素密度)中，充分混合，并在黑暗中于4℃孵育过夜。通过离心从游离的BSA-生物素中纯化涂覆的纳米颗粒。
步骤8：链霉亲和素涂覆。将来自步骤7的颗粒重悬于pH>6的10mg/mL链霉亲和素溶液中并振荡2hr。通过离心除去游离的链霉亲和素。
步骤9：抗体缀合。将来自步骤7的颗粒重悬于pH>6的10mg/mL生物素化抗体溶液中并振摇2hr。通过离心除去游离的抗体。
为了储存，重悬于pH 7.4的1X PBS中并储存在4℃下。
实施例7-用于等离激元-荧光剂的纳米结构和染料组合：
以下是根据常用的激光激发波长分选的。本领域技术人员将认识到可以用于激发缀合的荧光物质的任何激发源也可以用于激发含有该物质的等离激元-荧光剂。重要的是要注意最佳等离激元纳米结构的LSPR波长通常相对于最佳LSPR波长发生蓝移(即，具有较低的波长)，因为在涂覆间隔物和功能层后LSPR发生红移。所得到的等离激元-荧光剂具有接近染料吸收最大值的吸收最大值，并且在等离激元-荧光剂消光光谱和染料的激发/吸收光谱中有明显重叠。
在一些实施方案中，使用488nm的激光激发波长，合适的染料包括：荧光素/FITC/FAM、AlexaFluor 488、Atto 488、Bodipy、Cy2和Oregon绿。在一些实施方案中，合适的等离激元纳米结构包括AuNR@Ag纳米立方体(由涂有银的金纳米棒构建)，其特征在于：长度＝92nm(根据LSPR而变化，但是尺寸和LSPR在这些特定的等离激元纳米结构中密切关联，与其中LSPR是长宽比函数的AuNR不同)，宽度＝63nm(参见上文)，而LSPR＝460-510nm。
在一些实施方案中，使用532nm或543nm的激光激发波长，合适的染料包括：Cy3、AlexaFluor 532、AlexaFluor 543、AlexaFluor 555、Atto 532、Atto 550、罗丹明/四甲基罗丹明/罗丹明6G/TAMRA/TRITC、Cy3.5。在一些实施方案中，合适的等离激元纳米结构包括：AuNR@Ag纳米立方体，其特征在于长度＝86nm(根据LSPR而变化，但是尺寸和LSPR在这些特定的等离激元纳米结构中密切关联，与其中LSPR是长宽比函数的AuNR不同)，宽度＝73nm(参见上文)，而LSPR＝500-570nm。
在一些实施方案中，使用633nm的激光激发波长，合适的染料包括：Cy 5、Cy 5.5、Alexa fluor 633、Alexa fluor 647、Alexa fluor 660和Atto 633。在一些实施方案中，合适的等离激元纳米结构包括：具有LSPR＝600-670nm的AuNR。
在一些实施方案中，使用784nm的激光激发波长，合适的染料包括：IRDye 800CW(LI-COR)、Cy 7.5、CF 770、CF 790、CF 800、CF 820、Alexa790和DyLight 800。在一些实施方案中，合适的等离激元纳米结构包括：具有LSPR＝720-800nm的AuNR。
实施例8
使用等离激元-荧光剂，完成夹心免疫测定(与标准ELISA相比)所需的时间显著缩短，同时保持与ELISA相似甚至更好的检测灵敏度，如图19-22所示。图19-22显示了用于人NGAL检测和测量的常规ELISA和p-ELISA之间的比较。图19显示了曲线，其显示了花费280分钟完成的人NGAL ELISA的标准曲线(剂量依赖性比色信号)。图20是显示了20min内进行的p-FLISA的人NGAL剂量依赖性荧光强度的图。与常规ELISA相比，涉及超亮荧光纳米结构(等离激元-荧光剂-800CW)的p-FLISA可以在短10倍的时间内完成，同时达到相似的检测限。图21显示了使用20分钟内完成的p-FLISA测定的肾病患者和健康志愿者的尿液样本中的NGAL浓度。图22是显示了了使用ELISA(280min测定)和p-FLISA(20min)测定的人NGAL浓度之间的相关性的图，显示了两种方法之间极好的定量相关性(R2＝0.984)。概括而言，与常规ELISA所需的280min(由供应商推荐并通过本文所述的实验验证)相比，可以使用等离激元-荧光剂在20min内完成人NGAL检测测定。基于等离激元-荧光剂的20min测定显示出与280min ELISA相同的检测限。
实施例9-超亮等离激元-荧光剂作为用于生物分析物的飞摩尔检测的跨平台纳米 标签
如贯穿本公开所指出的，生物流体、细胞和组织内的低丰度生物分子的检测、成像和定量具有根本重要性，但是在生物医学研究以及临床诊断中仍然极具挑战性。利用等离激元增强的荧光，与用相应的近红外(NIR)荧光团(800CW)标记的链霉亲和素相比，等离激元-荧光剂-800CW表现出近6700倍更亮的信号。应当注意，荧光标记的链霉亲和素可以用一种或多种荧光染料标记。
图23说明了等离激元-荧光剂作为“附加”生物标记增强基于荧光的测定的荧光强度和随之产生的信噪比而无需改变现有的测定工作流程的工作原理。图24是根据本公开的使用缀合链霉亲和素的等离激元-荧光剂增强通用的夹心免疫测定的示例性实施方案。图25是根据本公开的使用缀合二抗的等离激元-荧光剂的通用夹心免疫测定的示例性实施方案，其中与等离激元-荧光剂缀合的抗体识别检测抗体。图26是根据本公开的使用缀合一抗的等离激元-荧光剂的通用夹心免疫测定的示例性实施方案，其中与等离激元-荧光剂缀合的抗体识别分析物。应当注意的上述检测和读出的实例除了夹心免疫测定外还与其他测定类型兼容。如果抗原结合到表面(例如细胞表面、膜、衬底)，则可以使用相同的通用检测方案。
实施例10
由于其具有纵横比的纵向局部表面等离激元共振(LSPR)波长及其末端的大电磁场增强的容易调谐性，因此将金纳米棒(AuNR)用作代表性的等离激元纳米结构(参见图27(A-B))。图27A显示了用作等离激元-荧光剂-800CW中的纳米结构的金纳米棒(AuNR)的TEM图像。图27B是有限差分时域(FDTD)模拟，其显示了AuNR周围的电场强度分布(入射光束的偏振沿着AuNR的长轴)。用(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)修饰AuNR(长度83.0±8.0nm；直径24.3±1.8nm)，其用作两种有机硅烷单体即(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)和三甲氧基丙基硅烷(TMPS)共聚的界面层(图28)。图28是显示了在AuNR上形成聚合物间隔物中涉及的步骤的示意图。在水性介质中，APTMS和TMPS迅速水解，并随后在MPTMS修饰的AuNR周围缩合，形成无定形共聚物网络(图28)。硅氧烷共聚物用作金属表面和荧光团之间的间隔层，以防止荧光猝灭。这种溶胶-凝胶方法使得能够容易地控制隔离层厚度低至1nm，如通过原子力显微镜(AFM)所证明的(图29-31)。图29是AFM图像，其描绘了随着单体(MPTMS、TMPS和APTMS)含量递增，AuNR/聚合物的直径增加。图30显示了在不同聚合条件下AuNR的UV-可见光谱。图31是显示了从AFM图像测量的在每种聚合条件下AuNR直径的增加(比聚合物层厚度高两倍)的图。由于用较少电荷的硅氧烷共聚物部分取代带正电荷的封端剂(CTAB)，用MPTMS修饰AuNR和随后进行APTMS/TMPS聚合可将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)封端的AuNR的ξ电位分别从+38.4±2.3mV降至+29±2.6mV和+25.8±1.9mV(图32)。图32显示了AuNR、AuNR/MPTMS、AuNR/MPTMS/聚硅氧烷(AuNR/聚合物)和等离激元-荧光剂-800CW(AuNR/聚合物/BSA-生物素-800CW)的ζ电位。误差条表示s.d.(n＝3次重复测试)。
实施例11
通过碳二亚胺偶联化学将近红外(NIR)荧光团800CW和生物素缀合至BSA，以实现蛋白质/生物素/荧光团比例为1:8.7:1.2的缀合物。由于对亲和素的亲和力更强，生物素取代了与亲和素结合的HABA，并导致吸收强度降低。使用780nm和280nm处的吸光度值来定量染料与BSA的比例。随后，BSA-生物素-800CW缀合物通过BSA与聚硅氧烷层的官能团(-NH3+、-CH3、-OH)之间的静电、疏水和氢键相互作用吸附在聚硅氧烷涂层的AuNR上，从而实现等离激元-荧光剂-800CW。由于等电点为4.7的BSA中的丰富羧酸基团，由此形成的等离激元-荧光剂-800CW显示出负电荷(在pH＝10时ξ电位为-46.9±0.5mV)(图32)。AuNR的LSPR波长呈现出2.6nm和2.7nm的渐进红移，分别为聚合物间隔层的形成和BSA-生物素-800CW吸附(图33(A-B))。图33(A-B)显示了PF-800CW TEM图像和消光光谱。
等离激元-荧光剂-800CW结构表征后，测定了荧光纳米结构的亮度。游离800CW(与BSA缀合)和等离激元-荧光剂-800CW的激发态荧光寿命分别为0.74±0.01ns和0.179±0.001ns，计算为量子产率增加了7倍(从～11％至～79％，如此处计算的)。为了进一步了解等离激元-荧光剂-800CW的亮度，估算了与单个AuNR缀合的荧光团的数量。浓度为76.2pM(消光度为～0.63)的等离激元-荧光剂-800CW由～16nM 800CW(如本文计算的)组成。因此，据估计大约210个荧光团与单个AuNR缀合。值得注意的是，发现来自76.2pM等离激元-荧光剂-800CW(包含16nM 800CW)的荧光强度等于来自544nM 800CW的荧光强度(基于图2测量)。两条曲线的斜率差异表明单个等离激元-荧光剂-800CW与6700(±900)个荧光团一样亮。因此，可以得出结论，由于存在等离激元纳米结构，每个800CW都被增强了近30倍。误差条代表s.d.(n＝3次重复测试)。这表示每个附着的荧光团增强约30倍。对于其中800CW与功能层BSA缀合的等离激元-荧光剂获得了这个结果。图2显示了常规荧光剂-800CW和等离激元-荧光剂-800CW在不同摩尔浓度下的荧光强度，其中等离激元-荧光剂-800CW的800CW直接附着厚度为～2-4nm在间隔层上。基于AuNR的与800CW缀合的等离激元-荧光剂相对于溶液中游离的未缀合的800CW的荧光强度图上的斜率差异作为荧光物质浓度的函数表明了等离激元-荧光剂-800CW比游离800CW亮～20,000X。这些数据是在Azure Sapphire扫描仪上收集的，对等离激元荧光剂和游离800CW使用相同的激发和发射条件(在784nm处激发，并通过以832nm为中心，宽度为37nm的带通滤光片进行检测)。观察到的强发射可以归因于等离激元纳米结构表面上增强的电磁场(局部激发场)(图27(A-B))以及由于激发的荧光团和纳米结构的表面等离激元之间的耦合导致的荧光寿命缩短。
如图34中所示，通过将等离激元-荧光剂-800CW结合到涂有链霉亲和素-800CW的衬底上，使用等离激元-荧光剂-800CW作为超亮荧光报道分子，进行了可行性测试，图34是显示基于这个测试中发生的结合事件的模型系统的示意图(未按比例绘制)。与链霉亲和素-800CW相比，与等离激元-荧光剂-800CW的结合导致整体荧光强度平均增加1200(±40)倍，显示了800CW-链霉亲和素，接着通过生物素-链霉亲和素相互作用特异性结合等离激元-荧光剂-800CW的荧光强度，显示荧光强度平均增加1200(±40)倍。通过使用相对较低浓度的等离激元-荧光剂(76pM)，可以实现显著的信号增强。应该注意的是，在所有的免疫测定中，为进一步验证荧光的等离激元增强，使用与“正在共振(on-resonant)”AuNR(7850nm2/AuNP；8064nm2/AuNR)具有相似表面积的“偏离共振(off-resonant)”金纳米颗粒(参见图5(A-B))。为了说明等离激元纳米结构的吸光度和缀合染料的吸收/激发光谱重叠的重要性，使用金球、AuNP和金纳米棒AuNR作为等离激元纳米结构核，800CW作为结合BSA的缀合的荧光物质并随后吸附到间隔层上，并且生物素作为生物识别元件，形成了等离激元-荧光剂。左图显示了它们各自的消光光谱以及800CW的吸收/激发和发射光谱。右图显示了在784nm处激发的相同浓度物质所得到的荧光。AuNP显示了相对于单独的荧光剂800CW荧光有一定的增强，但其亮度却比以AuNR为核心的等离激元纳米结构低100倍。毫不奇怪，AuNP-等离激元-荧光剂-800CW的荧光强度仅增强18倍，比AuNR-等离激元-荧光剂-800CW获得的低～70倍，证实了等离激元增强了荧光(图5(A-B))。
图1显示了基于AuNR@Ag纳米立方体的，与Cy3缀合的等离激元-荧光剂相对于溶液中游离的未缀合的Cy3的荧光强度曲线上的斜率差异，其作为浓度的函数表明了等离激元-荧光剂Cy3比游离Cy3亮～10,000倍。这些等离激元-荧光剂具有与聚合物间隔层直接缀合的染料，其厚度为～2nm。这些数据是在BioTek Synergy H1上收集的，对等离激元-荧光剂和游离Cy3使用相同的激发和发射条件(在530nm处激发，并在570nm处检测)。
图35和图36显示了通过调节添加的种子量而产生的各种体积的用于增强800CW的核AuNR颗粒。等离激元纳米颗粒文献中最常用的种子量为48μL。等离激元-荧光剂由各种AuNR核颗粒和800CW产生，并在标准化为相同摩尔浓度后，使用Azure Sapphire扫描仪测量荧光强度，激发波长为784nm，并通过以832nm为中心的宽度为37nm的带通滤光片进行检测。对于相同的LSPR波长(用#表示)，较大的AuNR具有比最常用的AuNR明显高得多的亮度。
图37显示了AuNR@Ag立方体的消光光谱，其形成了用于等离激元-荧光剂的核心颗粒，所述等离激元-荧光剂被设计用于增强在488nm附近具有激发最大值的染料，如FITC和AlexaFluor 488。
图3显示了基于AuNR@Ag纳米立方体的，与FITC缀合的等离激元-荧光剂(参见图35)相对于溶液中游离的未缀合的FITC的荧光强度曲线上的斜率差异，作为浓度的函数，表明了等离激元-荧光剂FITC比游离FITC亮～16,667倍。这些等离激元-荧光剂具有与聚合物间隔层直接缀合的染料，其厚度为～2-4nm。这些数据是在BioTek Synergy H1上收集的，对等离激元荧光剂和游离FITC使用相同的激发和发射条件(在490nm处激发，并在530nm处检测)。
实施例12
图38显示了适用于增强荧光团的等离激元纳米结构，其可以在488nm(Au@Ag-490)、658nm(AuNR-670)和784nm(AuNR-760)处被激发。突出显示了对应于相应的等离激元颗粒的常用标准荧光团激发方案。
实施例13
图39(A-B)显示了(左)AuNR@Ag纳米立方体和(右)等离激元-荧光剂-Cy3的TEM图像，其由AuNR@Ag纳米立方体、聚合物壳和BSA-生物素-Cy3涂层组成。涂层(功能层加上隔离层)的厚度为～6nm。图40显示了AuNR@Ag纳米立方体、涂覆有聚合物间隔物的AuNR@Ag纳米立方体和等离激元-荧光剂-Cy3的消光光谱，揭示了在每个涂覆步骤后的连续红移。
实施例14
金属表面和荧光团之间的最佳距离对于通过平衡两个相对因素(即增强的电磁场和非辐射能量转移)来最大化荧光增强是至关重要的。通过将不同厚度的介电间隔物(MPTMS、APTMS和TMPS)结合到涂有链霉亲和素-800CW的衬底上，研究了使用这些间隔物的等离激元-荧光剂-800CW的荧光增强。发现没有聚合物间隔层的等离激元-荧光剂的整体荧光增强倍数(定义为在涂有缀合荧光团的链霉亲和素的表面上添加等离激元-荧光剂之后和之前获得的荧光强度的比率)为～146±81。随着间隔物厚度的增加，增强效率逐渐增加到～1200(±40)倍(图41)。注意到此处绘制的聚合物厚度实际上不是所附着的荧光剂与金属表面之间的距离。该图表示了在其中的BSA被荧光标记的等离激元荧光剂。虽然该图似乎表明，通常，最佳间隔物厚度在0.8到2.9nm之间，但对于其中荧光团直接连接间隔涂层的等离激元-荧光团，不一定是这种情况。在其中荧光团连接BSA的情况中，其用作功能层，换句话说，聚合物的厚度实际上不是附着的荧光团与等离激元纳米结构表面之间的距离，因为BSA本身作为荧光团和等离激元纳米结构之间的间隔物。通过缀合荧光团的BSA，一些荧光团紧邻间隔物层并且一些距离隔离层为～4nm。因此，可以认为荧光团与等离激元纳米结构表面的平均距离比间隔层的厚度大～2nm。从2017年11月27日提交的发明名称为“Plasmonic Film as a Universal Fluorescent Enhancer”的美国临时申请62/590,877(将其全部按引用并入本文中)的工作中发现了荧光团和等离激元纳米结构表面之间的最佳间隔为2至5nm，与本文显示的结果一致。值得注意的是，等离激元-荧光剂的胶体溶液在黑暗中于4℃储存1个月后显示出稳定的荧光信号(图42)。为了进一步简化存储、运输和处理，可以将等离激元-荧光剂冻干并根据需要进行重构，而荧光信号不会明显降解(图42)。
实施例15-等离激元-荧光剂增强的荧光连接的免疫吸附测定(p-FLISA)和基于多 重珠的测定：
在等离激元-荧光剂的许多应用中，在标准微量滴定板上实施了等离激元增强的荧光团连接的免疫吸附测定法(p-FLISA)。人白介素6(IL-6)，一种促炎细胞因子，被用作代表性的蛋白质生物标志物。常规的FLISA涉及捕获抗体、分析物(IL-6)、生物素化检测抗体的标准夹心形式，然后暴露于链霉亲和素-荧光团(本研究中为800CW)(图43)。图43是示意图，显示了在标准96孔板中实施的常规FLISA(800CW)和等离激元-荧光剂-800CW增强的FLISA(p-FLISA)的概念。P-FLISA测定不需要在常规工作流程中进行任何更改，除了将添加等离激元-荧光剂为新的最后一步。在p-FLISA中，在最后一步后引入等离激元-荧光剂-800CW作为信号增强剂(图43)。为了确定灵敏度和检测限((LOD，定义为空白的平均+3σ))的提高，将已知浓度的连续稀释的IL-6(6ng/ml至6fg/ml，在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲的1％BSA中)用作标品。在此处测试的最高分析物浓度(6ng/ml)下，应用等离激元-荧光剂-800CW后获得的荧光信号显示，与常规FLISA相比，整体荧光强度提高了近1440倍(图44、图45和图46)。图44显示了在各种分析物浓度下人IL-6FLISA和p-FLISA的荧光强度图。图45显示了人IL-6FLISA和p-FLISA的荧光强度图(带有放大的比例尺)和“金标准”人IL-6ELISA的比色信号照片。常规FLISA的LOD计算为～95pg/ml(图47、图48和图46，多项式拟合)。图47显示了来自常规FLISA的人IL-6剂量依赖性荧光强度图。图48显示了常规IL-6FLISA的LOD。使用多项式拟合生成标准曲线。误差条表示s.d.(n＝2次重复测试)。图46显示了来自人IL-6FLISA、p-FLISA和ELISA的各个数据点、平均值和标准偏差。另一方面，可以检测到低至20fg/ml(～1fM)的p-FLISA荧光信号(图49和图46，四参数对数(4PL)拟合)，其代表与常规FLISA相比，LOD提高了4750倍。图49显示了来自p-FLISA的人IL-6剂量依赖性荧光强度的图。与常规FLISA相比，p-FLISA的检出限(LOD)提高了4750倍，且动态范围扩大了三个数量级以上。值得注意的是，等离激元-荧光剂在生物测定中表现出极高的特异性(对链霉亲和素)以及与干扰生物分子的低非特异性结合(图50(A-B))。图50A显示了来自p-FLISA的IL-6剂量依赖性荧光强度。误差条表示s.d.(n＝2次重复测试)。图50B显示了等离激元-荧光剂-800CW的非特异性结合。C：捕获抗体；D：检测抗体；S：链霉亲和素；PF：等离激元-荧光剂；空白：无等离激元-荧光剂。与空白相比，将等离激元-荧光剂-800CW应用于BSA、捕获抗体或捕获和检测抗体后，未观察到信号。使用Tukey’s post检验，通过单向ANOVA，****P<0.0001。NS：不显著。仅在引入链霉亲和素时，在IL-6浓度为零时才出现非特异性信号，这意味着等离激元-荧光剂具有极好的特异性。误差条表示s.d.(n＝3次重复测试)。等离激元-荧光剂的这种“BSA阻断”策略对于提高信噪比至关重要。扫描电子显微镜(SEM)图像揭示了随着IL-6浓度递增，微量滴定孔底部的等离激元-荧光剂-800CW的密度增加(图51)。图51显示了IL-6p-FLISA后96孔板底表面的SEM图像，揭示了随着IL-6浓度递增，等离激元-荧光剂-800CW的密度增加。在空白孔中观察到极低密度的等离激元-荧光剂，将其与1％BSA孵育，再次表明等离激元-荧光剂的低非特异性结合(图51)。
显著地，发现p-FLISA的LOD和定量下限((LLOQ)，被定义为空白的平均+10σ，～82fg/ml)比“金标准”酶联免疫吸附测定(ELISA)(其涉及比色信号的酶促扩增)低189倍和120倍(图45、图52和图46)。图52是显示人IL-6ELISA的标准曲线的图。与ELISA相比，p-FLISA的LOD低189倍，且动态范围大2个数量级以上。更重要的是，p-FLISA的动态范围(定量上下限之比)为五个数量级，比ELISA的高出两个多数量级。为了测定性能的验证，使用p-FLISA测试了健康的人血清样品和IL-6加强的血清。将血清样品稀释10倍，因此单个受试者仅需要10μl初始样品。健康个体中IL-6的浓度通常在0.2-7.8pg/ml的范围内。血清中IL-6的水平升高可以指示全身性炎症、代谢和生理刺激。值得注意的是，在ELISA、FLISA和p-FLISA中，只有后一种技术能够测定健康个体中的IL-6浓度，稀释倍数校正后测量为8.1pg/ml，1.8pg/ml和2.8pg/ml(图53)。图53显示了使用p-FLISA测量的人血清样品中的IL-6浓度(稀释10倍)。误差条表示s.d.(n＝3次重复测试)。
除了微量滴定板形式外，还研究了等离激元-荧光剂作为超亮报告子在基于微珠的多重荧光免疫测定中的应用，其利用了非平面的采样表面。将Luminex测定用作实例，其利用嵌入有比率设定荧光团的磁性微珠作为每种独特分析物的条形码(图54)。图54是示意图，显示了使用等离激元-荧光剂-Cy3来增强基于珠子的免疫测定法(例如，Luminex测定)的灵敏度的概念。缀合了抗体的微珠以典型的夹心形式捕获并促进了分析物的检测，随后通过缀合有藻红蛋白(PE)(一种从红藻或蓝藻中分离出来的明亮荧光蛋白)的链霉亲和素探测。但是，Luminex测定中使用的PE在结构上不稳定并且容易发生光漂白。在此，将Cy3用作PE的替代物，其是一种高度稳定的荧光团，与PE相似，分别在554nm和568nm处具有吸收和发射。如上所述，选择具有与荧光团的激发最大波长匹配的LSPR波长的等离激元纳米结构非常重要。为此，使用LSPR波长为520nm的AuNR@Ag纳米立方体来制备等离激元-荧光剂-Cy3(图55(A-B)、图39(A-B)和图40)。图55(A-B)是利用AuNR@Ag作为等离激元纳米结构的等离激元-荧光剂-Cy3的TEM图像，且间隔物涂层厚度大约为6nm。图39(A-B)显示了(左)AuNR@Ag纳米立方体和(右)等离激元-荧光剂-Cy3的TEM图像，等离激元-荧光剂-Cy3由AuNR@Ag纳米立方、聚合物壳和BSA-生物素-Cy3涂层组成。涂层的厚度为～6nm。图40显示了AuNR@Ag纳米立方体、涂有聚合物间隔物的AuNR@Ag纳米立方体和等离激元-荧光剂-Cy3的消光光谱，揭示了每个涂覆步骤后的连续红移。值得注意的是，如合成的等离激元-荧光剂-Cy3呈现出极高的亮度，并且可以在普通的落射荧光显微镜下轻松鉴定出单个纳米结构(图56(A-C))。图56A显示了单个等离激元-荧光剂-Cy3的荧光显微图像。图56B显示了图56A中所示的各个等离激元-荧光剂-Cy3的相应SEM图像。图56C是放大的SEM图像，其对应于图56A和图56B中所示的方框，显示了单个等离激元-荧光剂-Cy3(单个纳米立方体)。荧光图像是通过非激光落射荧光显微镜获得的，该显微镜可在普通研究实验室中广泛使用。
Luminex测定被定制以同时检测小鼠IL-6和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，它们是参与细胞信号转导和免疫调节的重要促炎细胞因子。将微珠用连续稀释的TNF-α和IL-6的混合物一起孵育，然后用检测抗体混合物、链霉亲和素-Cy3和生物素化的等离激元-荧光剂-Cy3孵育(图54)。随后使用基于双激光流的仪器(Luminex 200)读取珠子，其中分类激光(635nm)解密每个珠子的条形码，而报告激光(532nm)确定Cy3荧光的强度，即与结合的分析物含量直接成比例(图54)。微珠的SEM图像显示等离激元-荧光剂-Cy3均匀结合，没有聚集迹象(图57)。图57显示了用等离激元-荧光剂-Cy3探测前后的微珠的SEM图像。等离激元-荧光剂-Cy3的结合没有改变珠子的大小和形状(图58(A-B))或光学条形码信号(图59(A-D))。图58(A-B)显示了用等离激元-荧光剂-Cy3探测前(图58A)后(图58B)的Luminex微珠的显微镜明场图像和荧光图像。图59(A-D)显示了用等离激元-荧光剂-Cy3染色后的Luminex微珠的荧光图像，揭示了(图59A)不同发射强度的微珠的条形码和(图59B)结合Cy3的荧光(由633nm激光激发)和(图59C)微珠的明场图像。(图59D)明场和荧光的合并图像。比例尺代表50μm。在结合等离激元-荧光剂-Cy3后，观察到微珠荧光强度的显著增加(图60)。图60显示了用等离激元-荧光剂-Cy3探测前后的微珠的荧光图像。经等离激元增强的小鼠IL-6和TNF-测定的LOD分别确定为56.6fg/ml(2.7fM)和7.5fg/ml(0.3fM)(图61、图62和图63)。图61显示了施用等离激元-荧光剂-Cy3前(左)后(右)获得的小鼠IL-6标准曲线。图62显示了施用等离激元-荧光剂-Cy3前(左)后(右)获得的小鼠TNF-α标准曲线。所有标准曲线在不同的日期用不同批次的等离激元-荧光剂至少独立地进行三次。与未增强的对应物相比(图61、图62、图63和图64(AB))，针对小鼠IL-6和小鼠TNF-α的等离激元增强的测定分别显示出LOD低143倍和814倍。图63显示了来自小鼠IL-6Luminex、等离激元-荧光剂-Cy3增强的小鼠IL-6Luminex、小鼠TNF-αLuminex和等离激元-荧光剂-Cy3增强的小鼠TNF-αLuminex测定的各个数据点、平均值和标准偏差。图64A是显示了针对小鼠IL-6的未增强的基于珠子的荧光免疫测定(Luminex)的LOD的图。图64B是显示了针对TNF-α的未增强的基于珠的荧光免疫测定(Luminex)的LOD的图。使用多项式拟合生成曲线。误差条表示s.d.(n＝2次重复测试)。值得注意的是，针对小鼠IL-6(2.3pg/ml)和小鼠TNF-α(1.47pg/ml)的供应商指定的LOD(使用PE-链霉亲和素)被认为次于等离激元-增强的Luminex测定41倍和196倍。从本质上讲，等离激元-荧光剂可以作为一种强大的平台技术来增强各种现有免疫测定的生物分析参数(LOD、LLOQ、动态范围)，而无需繁琐的步骤或任何专门的仪器。
实施例16-等离激元-荧光剂增强的高通量多路蛋白质组学阵列：
基于荧光读出的生物分子(微)阵列是重要的临床和研究工具，尤其是对于简单、高通量和快速的蛋白质组学和遗传分析，使得可以在一小块分析基质上将数千种测定小型化。尽管具有诸如高多重性、快速筛选和低样品量等优点，但这种方法仍存在灵敏度低(甚至低于ELISA)的缺点，这阻碍了其广泛应用。
研究了等离激元-荧光剂在增强免疫阵列灵敏度方面的适用性。所有误差条均表示s.d.(n＝2次重复测试)。针对人肾病生物标志物的抗体阵列被用作代表性实例(图65)。图65是显示了应用等离激元-荧光剂-800CW来增强在硝基纤维素膜上实施的人肾病生物标记物的多重蛋白质组分析仪的生物分析参数的图。该实例说明了如何使用生物素化的等离激元-荧光剂来增强典型的多重微阵列，其中特定分析物的捕获抗体以空间上不同的点被印在膜、载玻片或聚苯乙烯基质上。在这种方法中，用户可以先用标准的荧光标记的链霉亲和素标记阵列，然后用生物素化的等离激元-荧光剂标记。在一些实施方案中，缀合链霉亲和素的等离激元-荧光剂被用于增强典型的多重微阵列，其中特定分析物的捕获抗体以空间上不同的点被印在膜、载玻片或聚苯乙烯基质上(图66)。该阵列由38种对应于人肾病蛋白质生物标记物的捕获抗体组成，一式两份印在微孔硝基纤维素膜上(图67(A-B))。图67(A-B)显示了肾脏生物标志物阵列上每对荧光点的特定分析物(或对照)的鉴定。图67A中所示的荧光点由图67B中的坐标识别。将生物素化的IgG和PBS分别印为参考阳性对照和阴性对照(图67(A-B))。使用封闭缓冲液将肾病患者的人类尿液样品稀释10倍，与生物素化的检测抗体混合物混合，然后添加到硝基纤维素膜上。孵育后，将膜暴露于链霉亲和素-800CW。最后，在阵列上添加等离激元-荧光剂-800CW悬浮液，孵育并彻底冲洗以除去未结合的纳米结构(图65)。
来自阳性对照区域的SEM图像揭示了等离子激元-荧光剂在膜上(包括多孔的次表面区域)的均匀分布(图68)。图68是SEM图像，显示了硝酸纤维素膜的次表面区域之上或之中的等离激元-荧光剂-800CW(由黄色圆圈突出显示的一些)的均匀分布。图71显示了荧光强度图，其表示在添加等离激元-荧光剂-800CW后图69和图70中所示的肾病患者的肾病蛋白质生物标志物谱(注意荧光强度比例尺的差异)。同时，没有从阴性对照中检测到信号(图71：蓝色框)，并且在来自这些位置的SEM图像中未观察到等离激元-荧光剂，表明了它们的最小非特异性结合(图72(A-B))。图72A显示了图67A的肾脏生物标志物阵列。图72B是显示了阴性对照区域(图72A的右下角的蓝色框(对应于图67A中所示的坐标F23和F24处的对))中的硝基纤维素膜的SEM图像；注意到在添加等离激元-荧光剂-800CW后不存在等离激元-荧光剂-800CW的荧光信号，表明等离激元-荧光剂-800CW的低非特异性结合。使用常规的荧光团，在38种靶蛋白生物标志物中，仅26种可检测到，其中大多数呈现出弱强度(图69、图70、图73和图74)。图69和图70显示了荧光强度图，其代表使用常规荧光团(链霉亲和素-800CW)获得的肾病患者的肾病蛋白质生物标志物谱。图73和图74分别显示了使用和未用等离激元-荧光剂的各个数据点、平均值和标准偏差。图75是用手机拍摄的数码照片，显示了添加等离激元-荧光剂-800CW后，来自肾病患者的尿液样品的硝基纤维素膜的颜色变化。添加等离激元-荧光剂-800CW后，来自蛋白质阵列每个点的荧光信号强度显著增加(图71、图73和图74)，从而可以检测和相对定量常规荧光剂无法检测的所有其他靶标。另外，将市售的40-重细胞因子微阵列用作对等离激元-荧光剂的另一种验证，其中也观察到微阵列灵敏度的显著提高(图76(A-F))。图76A显示了40-重细胞因子微阵列的布局。每种抗体水平印为一式四份，每个斑点直径约140μm。使用常规荧光团(链霉亲和素-800CW)(图76B)和添加等离激元-荧光剂-800CW后(图76C)获得的细胞因子微阵列的荧光图(图76B)。显示了对应于使用常规荧光团(链霉亲和素-800CW)(图76D)和添加等离激元-荧光剂-800CW后(图76E)获得的每种细胞因子的荧光强度的图。误差条代表s.d.(n＝4次重复测试)。(图76F)细胞因子微阵列上吸收的等离激元-荧光剂-800CW(AuNR)的暗场散射。每个圆圈对应于每种分析物的一个微点区域。比例尺代表50μm。AuNR(等离激元-荧光剂-800CW)在每个微斑点上的分布可以清楚地显示出来并进行数字计数。
已知在LSPR波长处的等离激元纳米结构呈现出大的消光截面，其可以比大多数有机染料的光吸收大5-6个数量级。等离激元纳米结构的这种独特性质使得利用等离激元-荧光剂作为多峰生物标记成为可能。的确，等离激元-荧光剂与传感域的结合产生了分析物浓度依赖性色斑，其可以用肉眼直接观察到(图75)。分析了使用智能手机相机在环境光条件下获取的数码照片中每个点的颜色强度，并与相应的荧光强度进行了比较。在两种采集模式之间观察到良好的相关性(R2＝0.88，图77)，这表明这种纳米结构在资源有限的环境中作为“可见标签”的潜在适用性，以减轻对专用且昂贵的读数仪器的依赖。图77是显示了肾脏生物标志物阵列的两种读出模式(荧光与比色法读出)之间的相关性的图。
实施例17-等离激元-荧光剂增强的免疫细胞化学/免疫荧光(ICC/IF)：
基于免疫荧光的免疫细胞化学是一种成熟的半定量方法，用于分析细胞中的靶抗原的相对丰度、构象和亚细胞定位。同样，由于常规荧光团的微弱荧光信号，这种方法缺乏区分低丰度生物分子和噪声水平的灵敏度。自发荧光是生物结构自然发出的光，进一步导致总体低的信噪比。
为了测试等离激元-荧光剂在ICC/IF中的适用性，将ErbB2(人表皮生长因子受体2)阳性上皮乳腺癌细胞(SK-BR-3)用作模型细胞系。使用标准方法(生物素化的ErbB2一抗和链霉亲和素-800CW)对表面受体ErbB2进行免疫染色，然后添加等离激元-荧光剂-800CW(图78)。图78显示了在不同浓度的ErbB2一抗下用常规荧光剂(800CW，上排)和等离激元-荧光剂-800CW(下排)探测的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。比例尺代表10μm。在与细胞孵育前，将ErbB2一抗(1mg/ml)稀释至不同浓度。SEM图像揭示了等离激元-荧光剂在细胞膜上的均匀分布(图79(A-C))。图79A显示了在用等离激元-荧光剂-800CW标记前(顶部)后(底部)的SK-BR-3细胞的显微镜明场图像。常规的荧光剂(图79B)标记的SK-BR-3细胞和等离激元-荧光剂-800CW(图79C)标记的SK-BR-3细胞的SEM图像显示了等离激元-荧光剂在细胞膜上的均匀分布。细胞的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像显示了添加等离激元-荧光剂(20pM)后，荧光信号最高可提高100倍(减去背景)(图78、图80、图81(A-B))，图82)，甚至在将一抗稀释100,000倍(10ng/ml)时，也可以对ErBb2受体的表达进行成像(图78，图81(A-B))。图80是显示用常规荧光剂和等离激元-荧光剂-800CW染色的SK-BR-3细胞的荧光强度的图。误差条代表s.d.(在三个不同的位置)。使用常规免疫细胞化学方法获得的ErbB2染色的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像(依次用生物素化的一抗和链霉亲和素-荧光剂(800CW)标记细胞，参见图81A)，然后在不同稀释度的ERbB2一抗中加入等离激元-荧光剂-800CW(图81B)。比例尺代表15μm。图82显示了在6孔板上培养的SK-BR-3细胞的荧光图谱。用常规荧光团(顶部)和随后用等离激元-荧光剂-800CW(底部)探测细胞。比例尺代表1cm。与之形成鲜明对比的是，使用常规荧光团只能在100倍稀释的一抗(典型稀释度；10μg/ml)下成像荧光信号(图78)。这些结果不仅证明了等离激元-荧光剂在显著减少ICC/IF中所需的抗体量(以及随之而来的成本)方面的适用性，还证明了使用等离激元-荧光剂在细胞表面成像低丰度生物标志物的能力。
实施例18-等离激元-荧光剂增强的流式细胞术测量
流式细胞术广泛用于细胞分析中，以每秒数千或更多个细胞的速率测量细胞上或细胞内特定分析物的表达和相对丰度(图83)。图83是示意图，显示了通过常规荧光剂(680LT)接着用等离激元-荧光剂-680LT探测的ErbB2染色的SK-BR-3细胞的流式细胞术。然而，由于目标物质高速穿过激光焦点，因此流式细胞术在荧光信噪比方面也面临重大挑战，从而限制了荧光读出的时间。同样，来自细胞的背景荧光(自发荧光)在描绘胞内和胞外靶标表达水平的细微变化方面造成了困难。
为了在基于流式细胞术的细胞分析中测试等离激元-荧光剂增强信噪比的能力(图83)，将SK-BR-3细胞悬液与ErbB2一抗、链霉亲和素-680LT一起孵育，然后加入等离激元-荧光剂-680LT。随后，通过温和离心(1000rpm)并同时去除未结合的等离激元-荧光剂，来收集标记的细胞。为了匹配激发激光和荧光团发射，采用LSPR波长约为647nm的AuNR作为纳米结构，以产生等离激元-荧光剂-680LT(图84(A-B))。图84(A-B)显示了680LT TEM图像和消光光谱。等离激元-荧光剂-680LT的特异性结合引起细胞沉淀物颜色的显著变化(图85(A-B))。图85A描述了照片，显示了用等离激元-荧光剂-680LT标记后SK-BR-3细胞的颜色变化(顶部：沉淀物；底部：悬浮液)。图85B显示了在不同稀释度的ErbB2一抗下，等离激元-荧光剂-680LT标记的SK-BR-3细胞悬液的可见光-近红外(vis-NIR)消光光谱。细胞表面上的等离激元-荧光剂-680LT的存在不会改变正向散射或侧向散射强度(图86)，表明在等离激元-荧光剂-680LT结合后，细胞大小和粒度/复杂度实际上保持不变。图86显示了用等离激元-荧光剂-680LT标记前(左)后(右)的SK-BR-3细胞侧向散射和正向散射的伪彩色图(带有门控策略的实例以包括单细胞)，表明其尺寸轮廓没有明显变化。SK-BR-3细胞的荧光vs.正向散射(为清楚起见，垂直偏移)的流式细胞图揭示了与使用常规荧光团获得的相比，用等离激元-荧光剂-680LT染色的细胞群分离更加明显(图87)。图87显示了使用不同浓度的ErbB2一抗(红色：对照组，未添加一抗。蓝色：用不同稀释度的一抗处理的细胞)探测的SK-BR-3细胞的荧光vs.正向散射(为清楚起见，垂直偏移)的流式轮廓图(flow contour plot)(有离群值)。将细胞用常规的荧光剂(680LT，左图)染色的，然后添加等离激元-荧光剂-680LT(右图)。细胞质荧光信号的直方图揭示了使用等离激元-荧光剂-680LT的强度比常规对应物高60倍(减去了背景)(图88)。图88显示了使用常规荧光剂(680LT)，然后添加等离激元-荧光剂-680LT(103倍稀释的一抗)探测的SK-BR-3细胞的荧光直方图。误差条代表s.d.(n＝3个独立测试)。通过使用Welch’s校正的两尾未配对t检验，****p<0.0001。荧光直方图揭示了使用等离激元-荧光剂-680LT标记，即使稀释200,000倍的一抗(5ng/ml)，也可以检测到细胞表面上的ErbB2表达(图89，图90)。图89是直方图，显示了添加等离激元-荧光剂-680LT前(顶部)后(底部)SK-BR-3细胞的荧光。红色：无一抗；蓝色：稀释度为2×105倍；橙色：稀释105倍；浅绿色：稀释104倍；绿色：稀释103倍；玫瑰色：由供应商提供的储液的102倍稀释。图90是显示了在不同的一抗浓度下从流式细胞仪获得的平均荧光强度的图。另一方面，常规标记要求抗体稀释小于1000倍(即浓度>0.5μg/ml)，以确保与背景(空白)相比的可检测的荧光信号增加(图89，图90)。
为了进一步验证等离激元-荧光剂描绘表面受体表达水平有小差异的细胞群的性能，采用骨髓衍生的树突状细胞(BMDC)作为模型系统，其中可以使用免疫原性刺激调节受体的表面表达。暴露于免疫原性刺激后的树突状细胞经历激活和成熟，从而导致细胞因子分泌和成熟标志物(如CD40、CD80、CD86、MHC I和MHC II)的上调。在此，从6-8周龄的C57BL/6小鼠中分离了BMDC，并将脂多糖(LPS)用作免疫原性刺激，以剂量依赖性方式触发CD80的上调和细胞因子释放。随后，将细胞固定并用生物素化的CD80抗体处理。最后，用常规荧光团(680LT)接着用等离激元-荧光剂-680LT探测BMDC，并使用流式细胞术比较荧光水平(图91)。图91是示意图，显示了用免疫刺激剂(脂多糖(LPS))处理的骨髓衍生的树突细胞(BMDC)。通过免疫荧光染色，然后添加等离激元-荧光剂-680LT来检测刺激后的成熟标志物(CD80)表达的小变化。图92显示了两种使用抗体标记的等离激元-荧光剂标记细胞上的靶抗原的方案。
对应于使用常规荧光剂(680LT)和等离激元-荧光剂-680LT获得的初始(对照)和LPS(0.05μg/ml)刺激的BMDC的荧光强度分布直方图分别显示于图93和图94中。显然，等离激元-荧光剂染色的BMDC在激活的(蓝色)和初始的(红色)细胞之间显示出显著的荧光差异(图93、图94和图95(A-B))。图95(A-B)显示伪色图，显示了未用LPS刺激的(左：初始)，以及使用常规免疫荧光染色(图95A)和等离激元-荧光剂-680LT(图95B)经0.05μg/ml LPS处理后(右)的BMDC群的侧向散射vs.CD80荧光。进一步研究了BMDC的LPS剂量依赖性(0到0.05μg/ml)刺激，其中使用等离激元-荧光剂-680LT观察到平均荧光强度急剧增加，随后在更高的LPS剂量下达到平稳状态(图96，图97(A-B))，表明CD80表达增加。图96是显示了用不同量的LPS刺激后BMDC的平均荧光强度(对应于CD80的表达水平)的图。但是，用常规荧光团染色的BMDC随LPS剂量呈现出浅的荧光增加，而高荧光背景则掩盖了该现象(图96和图97(A-B))。图97(A-B)显示了用不同量的LPS刺激后的BMDC的平均荧光图(对应于CD80的表达水平)。使用常规免疫荧光染色(图97A)探测BMDC，然后使用等离激元-荧光剂-680LT探测(图97B)。此外，促炎细胞因子(TNF-α和IL-12)的分泌水平显示出随着LPS浓度的增加而增加的趋势(图98、图99)。图98显示了促炎细胞因子(TNF-α和IL-12)的分泌水平，这证实了BMDC的剂量依赖性激活和成熟。图99显示了对应于LPS刺激后分泌的炎性细胞因子的ELISA结果的各个数据点(吸光度和浓度)、平均浓度和标准偏差。这进一步证实了BMDC的剂量依赖性激活和成熟以及等离激元-荧光剂在区分细胞表面成熟标志物中的微小变化的特异性和准确性。
实施例19-用于增强800CW和680LT的AuNR的合成：
通过种子介导的方法制备了适于增强800CW的AuNR-760(LSPR波长～760nm)。通过将0.6ml冰冷的NaBH4溶液(10mM)(Sigma-Aldrich，71321)加入含有0.25ml HAuCl4(10mM)(Sigma-Aldrich，520918)和9.75ml CTAB(0.1M)(Sigma-Aldrich，H5882)的溶液中，在室温下剧烈搅拌10分钟，来合成Au种子。溶液的颜色从黄色变为棕色，表明形成了Au种子。对于AuNR的合成，通过依次添加含水HAuCl4(0.01M，2ml)、CTAB(0.1M，38ml)、AgNO3(0.01M，0.5ml，Sigma-Aldrich，204390)、HCl(1M，0.8ml，Sigma-Aldrich，H9892)和抗坏血酸(0.1M，0.22ml，Sigma-Aldrich，A92902)，然后轻轻颠倒使溶液均匀，从而制备生长液。AgNO3和HCl的体积比可以变化以获得合适的波长。随后，将5μl种子液加入生长液中，并在黑暗中静置24小时。将AuNR溶液以7000rpm离心40分钟来除去上清液，然后将AuNR重新分散到纳米纯水中，以达到最终的消光峰～2.0。对于适合增强680LT的AuNR-647(LSPR波长～647nm)，生长液含有HAuCl4(0.01M，2ml)、CTAB(0.1M，38ml)，AgNO3(0.01M，0.2ml，该值可能改变)和抗坏血酸(0.1M，0.32ml)。
实施例20-用于Cy3的AuNR@Ag的合成：
将具有约711nm LSPR波长的AuNR用作合成AuNR@Ag纳米结构的核心。具体地，在搅拌下将3ml 711nm AuNR(峰消光～4)与8ml的CTAC(20mM)在60℃下温育20分钟。然后，依次添加8ml的AgNO3(4mM)、4ml的CTAC(20mM)和0.8ml的抗坏血酸(0.1M)，并在磁力搅拌下于60℃孵育4h以形成AuNR@Ag纳米立方体。最后，将AuNR@Ag纳米立方体溶液以6000rpm离心，并将纳米立方体重新分散在纳米纯水中。
实施例21-荧光标记的功能层等离激元荧光剂的缀合程序：
通过EDC/NHS化学将生物素和800CW按序缀合至BSA。在pH7-9缓冲液中，NHS酯通过亲核攻击与伯氨基(-NH2)有效反应，形成酰胺键并释放NHS。具体地，将2mg NHS激活的生物素(NHS-PEG4-生物素，Thermo Scientific，产品编号#：21329)加入2.2ml的BSA(Sigma-Aldrich，A7030)溶液(5mg/ml在1X PBS中)中。将混合物在室温(～22℃)下孵育1小时以完成反应。使用用1XPBS预平衡的脱盐柱(5mL，7000MWCO，Thermo Scientific，产品编号#：21329)从溶液中除去过量NHS-PEG4-生物素。接着，将800CW缀合至BSA-生物素。将0.1ml的1M磷酸钾缓冲液(K2HPO4，pH＝9)添加到1ml纯化的BSA-生物素溶液中以提高pH值。接着，将25μl 4mg/ml的NHS-800CW(LI-COR，929-70020)加入混合物中，并将该溶液在23℃下温育2.5小时。然后使用用纳米纯水预平衡的Zeba脱盐柱将游离的NHS-800CW与缀合物分离。除了改变荧光团以外，使用类似的方法制备了BSA-生物素-680LT和BSA-生物素-Cy3。
实施例22-基于荧光标记的功能层的等离激元-荧光剂的合成
为了制造具有高荧光增强功效的等离激元-荧光剂，为给定的荧光团选择“共振”的等离激元纳米结构非常重要。对于800CW，将AuNR-760(长度和直径分别为83和24nm)用作纳米结构。将1μl MPTMS(Sigma Aldrich，175617)加入1ml消光度为～2.0的AuNR中，并将混合物振摇1小时，从而在AuNR上形成界面层。将MPTMS改性的AuNR与不同体积的APTMS(SigmaAldrich，281778)和TMPS(Sigma Aldrich，662275)(0.5μl至2μl)混合，以在AuNR上形成聚合物间隔层。最后，将AuNR/聚合物溶液各以6000rpm离心两次，每次10分钟，以除去游离单体。第二次离心后，将AuNR/聚合物浓缩至10μl的最终体积。
接着，将BSA-生物素-800CW缀合物围绕AuNR/聚合物包被。具体地，将1μl 20mg/ml柠檬酸(Alfa Aesar，36664)加入100μl BSA-生物素-800CW(～4mg/ml)中以降低pH值。随后将浓缩的AuNR/聚合物溶液加入该混合物中，并在黑暗条件下超声处理20分钟。然后使用温和离心(5000rpm，3分钟)收集纳米结构。随后，将AuNR与0.5ml BSA-生物素-800CW(～0.4mg/ml，pH＝10)在黑暗条件下于4℃孵育3天。最后，使用纳米纯水(pH＝10)通过在6000rpm下离心将纳米结构洗涤四次。在最后的洗涤步骤后，将颗粒重新分散到1％BSA(用1X PBS缓冲)中。
材料表征：使用JEOL JEM-2100F场发射(FE)仪器获得了透射电子显微镜(TEM)图像。将一滴水溶液在涂有碳的栅格上干燥，该栅格已通过辉光放电而变得亲水。SEM图像是使用FEI Nova 2300场发射扫描电子显微镜在10kV的加速电压下获得的。在轻敲模式下，使用标称弹簧常数为40N/m的硅悬臂在Dimension 3000上进行AFM成像。使用Shimadzu UV-1800分光光度计获得了等离激元纳米结构的消光光谱。使用时间相关的单光子计数(在Fluorolog-3中实施的TCSPC，Horiba Jobin Yvon)，用PMT R928P检测器(HamamatsuPhotonics，日本)的90°下的740nm激发源
Figure BDA0003100792030000671
(脉冲重复频率1MHz)，测量了荧光寿命。除非另有说明，否则大多数荧光图谱都是使用LI-COR Odyssey CLx成像系统记录的。使用Luminex 200系统来读取来自微珠的荧光信号。在40倍水浸物镜下，使用OlympusFV1000 LSM共焦激光扫描显微镜(785nm激发激光)进行细胞成像。使用GUAVA easyCyte来获取流式细胞术数据。
蛋白质/生物素比例的计算：通过4-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)测定来计算BSA/生物素比例。具体地，将生物素化的BSA(0.4mg/ml×100μl)加入HABA(Thermo Scientific，1854180)和亲和素溶液(900μl，Thermo Scientific，21121)的混合物中。由于其对亲和素的亲和力更高，生物素替代了亲和素中的HABA，并且在500nm处的吸光度成比例降低。使用以下公式计算了吸光度的变化：
ΔAs00＝(0.9×A500)-A500B， (1)
其中A500和A500B分别代表添加生物素化的BSA前后的HABA/亲和素的吸光度。使用校正因子(0.9)来调整通过添加生物素化的BSA的HABA/亲和素溶液的稀释度。可以使用Beer’s定律来计算样品的浓度：
Aλ＝ελbC， (2)
其中Aλ是样品在波长λnm处的吸光度(ΔA500)，ελ代表在波长λnm处的消光系数(34,000M-1cm-1)，b是细胞路径长度(使用石英比色杯时为1cm)，C为样品的浓度。使用这个公式，生物素浓度经计算为：
Figure BDA0003100792030000681
BSA浓度为6×10-7mmol/ml。平均而言，有8.7个生物素分子与BSA分子缀合。同样，使用以下公式计算了染料与蛋白质的比例：
Figure BDA0003100792030000682
其中0.03是280nm处800CW吸光度的校正因子，εDye(270,000M-1cm-1)和εprotein(43,824M-1cm-1)分别是800CW和BSA的消光系数，且A780＝0.3和A280＝0.05分别是BSA-800CW在780nm和280nm处的吸光度。因此，最终的染料与蛋白质的比例计算为1.2。
荧光寿命测量：
使用时间相关的单光子计数(TCSPC，在Fluorolog-3中实施，Horiba JobinYvon)，用PMT R928P检测器(Hamamatsu Photonics，日本)的90°下的740nm激发源
Figure BDA0003100792030000683
(脉冲重复频率1MHz)，测量了荧光寿命(FLT)。将检测器设置为800nm，带通为20nm，并收集数据，直到峰信号达到2,000个计数。该系统的详细信息已在以前的研究中发表。使用在丙烯酸透明比色杯中以740nm发射的Ludox-40(在MQ水中0.05％；Sigma-Aldrich)的Rayleigh散射获得了仪器响应函数。通过使用衰减分析软件(DAS6 v6.8；Horiba)拟合衰减曲线获得了寿命值，基于
Figure BDA0003100792030000684
其中，I表示荧光强度，t表示衰减时间和τ表示寿命。拟合的质量由χ2值，Durbin-Watson参数以及拟合线、残差和自相关函数的视觉观察来判断。拟合(双指数拟合)提供了两个荧光寿命值：τ1和τ2，如下表所示(表8)。由于τ2与普通荧光团相比非常大，并且贡献不明显(<5％)，因此将该值视为背景噪声。使用双指数拟合的原因是将环境光子拟合出来(通常具有更长的寿命)，以便获得更清晰的真实荧光寿命的第一指数值。
表8：使用双指数拟合获得的荧光寿命和χ2
样品 τ<sub>1</sub> τ<sub>2</sub>(背景) χ<sup>2</sup>
800CW-BSA 0.722ns(95.42％) 4.81ns(4.58％) 1.014
等离激元-荧光剂-800CW 0.178ns(93.12％) 4.77ns(4.41％) 1.107
量子产量的计算：可以从测得的寿命和800CW(与BSA缀合的)的量子产量计算辐射和非辐射衰减率：
Figure BDA0003100792030000691
Figure BDA0003100792030000692
其中Γ和knr分别表示800CW的辐射和非辐射衰减率。Q0(11％)和τ0(0.74ns)表示测量的800CW的量子产量和寿命。认为将荧光团与AuNR缀合后，Knr保持不变(由于观察到的最小猝灭)。因此，可以将800CW的辐射速率增强(ΓAuNR)和AuNR诱导的提高的量子产量(QAuNR)计算为：
Figure BDA0003100792030000693
QAuNR＝ΓAuNR*τAuNR＝0.79 (9)
其中τAuNR(0.179ns)表示800CW与AuNR缀合后的寿命。结果表明，与具有最佳光学性能和间隔层的AuNR缀合后，荧光团的量子产量提高了7倍(从11％到79％)。
实例等离激元-荧光剂-800CW上吸收的800CW量的估算：为了估算AuNR上的荧光团量，首先使用双辛可宁酸测定(BCA测定)估计了BSA(-缀合物)的量。根据BSA的量，可以计算出800CW浓度，因为染料与蛋白质的比例已确定为1.2(如上所述)。测试使用Micro BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific，产品号23235，批号QG218473A)。具体地，通过混合2.5ml试剂MA、2.4ml试剂MB和0.1ml试剂MC来制备BCA工作试剂。将150μl BSA标品(0至40μg/ml)或等离激元-荧光剂-800CW(消光～4.6)与150μl工作试剂混合，并将混合物在60℃下孵育1小时。通过平板阅读器测量了562nm处的吸光度，并获得了BSA标准曲线。基于标准曲线，将吸附在等离激元-荧光剂-800CW周围的BSA浓度为6.2μg/ml。因此，具有～0.63消光的等离激元-荧光剂-800CW由～0.9μg/ml的BSA(～13.5nM)和～16.2nM的800CW组成。
AuNR的消光系数(长度～83nm和直径～24nm)计算为ε≈8.27×109(LM-1cm-1)。对应于0.63光学消光的AuNR的摩尔浓度可以源自Beer’s定律，其计算为76.2pM。因此，可以基于
Figure BDA0003100792030000701
计算单个AuNR上的800CW数(n)：
其中C800CW(16nM)和CAuNR(76.2pM)分别代表800CW和AuNR的摩尔浓度。这个版本的等离激元-荧光剂，其中染料与BSA缀合，其然后粘附到间隔物涂覆的纳米结构上，显示出荧光亮度是游离800CW的6500倍。
实施例23-使用AuNR-等离激元-荧光剂-800CW和AuNP-等离激元-荧光剂-800CW的 800CW-链霉亲和素的荧光增强的示例性条件
用于该测试的实验程序(其结果在本文其他地方公开)说明于图34中，并且数据在图5(A-B)中示出。具体地，首先通过在室温下将孔与50ng/ml BSA-生物素(在1X PBS中)孵育15分钟，将BSA-生物素固定在塑料96孔板的底部。使用PBST(1X PBS中的0.05％Tween20)将板洗涤3次，然后使用
Figure BDA0003100792030000702
封闭缓冲液(PBS)(LI-COR，P/N 927-40100)封闭。随后将涂有BSA-生物素的孔用1μg/ml链霉亲和素-800CW(在
Figure BDA0003100792030000703
封闭缓冲液中)孵育10分钟，以使链霉亲和素与生物素特异性结合。接着，将板用PBST洗涤3次，然后与～76pM等离激元-荧光剂-800CW(在1％BSA中)孵育。使用PBST将板再洗涤三次，以除去游离的等离激元-荧光剂。最后，向每个孔中加入200μl PBST，并使用具有以下扫描参数的LI-COR CLx荧光成像仪记录加入等离激元-荧光剂前后的荧光信号：激光功率～L2；分辨率～169μm；频道：800；高度：4mm。独立地重复该实验四次，并比较了添加等离激元-荧光剂-800CW前后的荧光强度。数据具有统计学意义，P值计算为0.0044，通过使用Welch’s校正的两尾未配对t检验，**P<0.01。
实施例24-用于人IL-6ELISA的示例性条件
使用人IL-6DuoSet ELISA试剂盒(R&D，目录号#DY206，批号P173353)，其结果在本文其他地方公开。具体地，首先用捕获抗体(PBS中2μg/ml)包覆96孔板，在室温下孵育过夜，然后用300μl试剂稀释剂(含3％BSA的1X PBS，0.2μm过滤的)封闭。用PBST洗涤3次后，将100μl连续稀释的标品以及患者的血清样品(使用试剂稀释剂稀释10倍)添加到不同的孔中，并将板在室温下孵育2小时。随后洗涤板，并用生物素化的检测抗体(PART#840114，试剂稀释剂中浓度为50ng/ml)孵育2小时，再次用PBST洗涤，并用HRP标记的链霉亲和素(PART#893975，使用试剂稀释液稀释200倍)孵育20分钟。将100μl底物溶液(彩色试剂A(H2O2)和彩色试剂B(四甲基联苯胺)的1:1混合物(R&D Systems，目录号
#DY999))加入每个孔中，并在20min后，通过添加50μl H2SO4(2N)(R&D Systems，目录号#DY994)停止反应。立即使用设置为450nm的微平板阅读器来测定每个孔的光密度。
实施例25-人IL-6FLISA和p-FLISA
采用与上述ELISA类似的方法实施人IL-6FLISA，除了将HRP标记的链霉亲和素替换为800CW标记的链霉亲和素(LI-COR P/N 926-32230，50ng/ml，持续20分钟)。使用PBST将板洗涤3次，然后用纳米纯水洗涤。在p-FLISA中，随后添加等离激元-荧光剂-800CW(消光～1)，孵育1小时，并将板用试剂稀释液和PBST各自洗涤3次。使用LI-COR CLx荧光成像仪以以下扫描参数将板成像：激光功率～L2；分辨率～169μm；频道：800；高度：4mm。独立实验的结果显示于图47和图49，以及图100(A-C)中。图100(A-C)显示了来自p-FLISA的IL-6剂量依赖性荧光强度的图。在图100A、图100B和图100C中，数据代表在不同天用不同批次的等离激元-荧光剂-800CW独立进行的实验。误差条代表s.d.(n≥2次重复测试)。
实施例26-等离激元-荧光剂增强的基于Luminex珠子的测定：
小鼠磁性Luminex测定购自R&D system(目录号：LXSAMSM-03，批号#L126064)，其被定制为同时检测小鼠TNF-α和小鼠IL-6。首先，在96孔板中将50μl含有不同浓度TNF-α和IL-6(PART#984658)的标品与50μl稀释的微珠混合物(PART#894724)混合。通过使用设置在800rpm的微孔板轨道振荡器(0.12“轨道)水平振荡2小时，将混合物均质。随后使用设计用于容纳微孔板的磁性装置(Millipore Sigma 40-285)收集微珠，并通过除去液体并装满洗涤缓冲液(PART#895003)来洗涤。将洗涤步骤重复3次。接着，将50μl稀释的生物素-抗体混合物(PART#894666)引入每个孔中，并在振荡器上800rpm下孵育1小时。将微珠再次洗涤三遍，然后用100ngml Cy3-链霉亲和素(在1X PBS缓冲的3％BSA中)在800rpm下孵育30分钟。三次洗涤后，用50μl等离激元-荧光剂-Cy3(在LSPR最大值下消光～5)在800rpm下将微珠孵育1小时，并用3％BSA和洗涤缓冲液各自洗涤3次。最后，将微珠重悬于100μl洗涤缓冲液中并在800rpm下孵育2分钟，接着进行读数。使用Luminex 200仪器进行荧光读出。在ConfocorII LSM系统(Carl Zeiss-Evotec，Jena，德国)上使用×40倍水浸物镜观察微珠的双模荧光。独立实验的结果显示于图61和图62，以及图101(A-B)和图102(A-B)中。图101(A-B)显示了在施加等离激元-荧光剂-Cy3后获得的基于珠子的小鼠TNF-α标准曲线。在图101A和图101B中，数据表示在不同天用不同批次的等离激元-荧光剂-Cy3独立地进行了三次实验。误差条代表s.d.(n＝2次重复测试)。图102(A-B)显示了在施加等离激元-荧光剂-Cy3后获得的基于珠子的小鼠IL-6标准曲线。在图102A和图102B中，数据代表在不同天用不同批次的等离激元-荧光剂-Cy3独立进行了三次的实验。误差条代表s.d.(n＝2次重复测试)。
实施例27-等离激元-荧光剂增强的人肾脏生物标志物测定：
人肾生物标志物阵列试剂盒购自R&D system(目录号#ARY019，批号#1311110)。这项研究采用了来自肾病患者(ID#25，年龄61，男性)的尿样。该研究得到华盛顿大学IRB201601082“用于肾癌干预的纳米技术生物标志物：临床验证和实用性”的批准。从参与者那里获得了知情同意。通过用2ml封闭缓冲液(PART#893573)在4孔多培养皿中温和摇动孵育1.5小时来封闭硝基纤维素膜(PART#893967)。在封闭过程中，将肾病患者(ID#25)尿样(150μl)用500μl封闭缓冲液和850μl阵列缓冲液(PART#895876)稀释，得到总共10倍。将稀释的尿样与15μl重构的检测抗体混合物(PART#893966)混合，并将混合物在室温下孵育1小时。从封闭溶液中取出硝基纤维素膜，并与尿样和生物素化的检测抗体的混合物在4℃下孵育过夜。随后在轻微摇动下用20ml的1X洗涤缓冲液(PART#895003)洗涤膜10分钟，并将洗涤过程再重复两次。接着，将膜用800CW-链霉亲和素(50ng/ml，在1％BSA中)在轻微摇动下温育30分钟，洗涤三次，并用等离激元-荧光剂-800CW(消光～0.5)再孵育一小时。最终，扫描膜。然后使用LI-COR CLx成像仪以L2激光功率将膜成像，聚焦高度为0.5mm，且分辨率为169μm。使用iPhone6相机获取蛋白质阵列的照片，并使用Image Studio Lite软件分析图像以测量每个斑点的中值强度(减去背景)。独立实验的结果显示于图103(A-B)中。图103(A-B)显示了肾脏生物标志物阵列的第二个独立实验。荧光强度对应于添加等离激元-荧光剂-800CW前(图103A)后(图103B)的各种尿液生物标志物的浓度(使用常规荧光团的典型测定)。误差条代表s.d.(n＝2次重复测试)。
实施例28-用于等离激元-荧光剂增强的人细胞因子微阵列的示例性条件
使用四十重人细胞因子微阵列(RayBiotech，目录号#：QAH-CYT-4)来进一步测试等离激元-荧光剂的功效，并且其结果在本文其他地方公开。首先，将微阵列的玻璃基底用100μl样品稀释剂(产品目录号#：QA-SDB)封闭，然后在室温下与样品标品(目录号#：QAH-CYT-4-STD)在温和摇动下孵育2小时。使用1X洗涤缓冲液I(目录号#：AA-WB1-30ML)将微阵列洗涤五次，然后用1X洗涤缓冲液II(目录号#：AA-WB2-30ML)洗涤两次。接着，将80μl重构的检测抗体混合物加入每个孔中，并在温和摇动下再孵育2小时。孵育后，如上所述再次重复洗涤过程。随后，将80μl800CW-链霉亲和素(1％BSA中50ng/ml)添加到阵列载玻片上，并孵育20分钟，洗涤，并用等离激元-荧光剂-800CW浸渍(消光～1)一小时。使用LI-COR CLx扫描仪以以下参数扫描载玻片：激光功率～3.5；分辨率～21μm；频道：800；高度：1.8mm。
实施例29-等离激元-荧光剂增强的免疫细胞化学/免疫荧光(ICC/IF)：
人上皮乳腺癌细胞SK-BR-3[SKBR3](
Figure BDA0003100792030000741
HTB30TM)购自ATCC(Manassas，VA)，并在含有10％胎牛血清和抗生素(100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素)(Sigma，St Louis，MO)的McCoy's 5A培养基中亚培养(FBS)。细胞在T-25组织培养瓶中在37℃和5％CO2-湿润的气氛下在水套培养箱中生长。一旦细胞达到90％汇合，用PBS洗涤，并使用刮刀将其从烧瓶底部分离。离心后，将细胞重新分散在培养基中，并接种在6孔板上过夜，以使其附着于板底部。随后将细胞用3.7％甲醛(在1X PBS中)固定30分钟，用1X PBS洗涤三次，并用3％BSA封闭1小时。接着，使用1％BSA稀释ErbB2一抗(抗人HER-2/生物素，eBioscience，克隆2G11，REF#BMS120BT，批号#186281000)，并与SK-BR-3细胞孵育1.5小时。随后将细胞洗涤三遍，用800CW-链霉亲和素(1％BSA中1μg/ml)孵育30分钟，再洗涤三遍，并用等离激元-荧光剂-800CW探测(消光～0.3)。最后，在40倍水浸物镜下，使用Olympus FV1000 LSM共焦激光扫描显微镜(785nm激发激光)将细胞成像。独立实验的结果显示于图78以及图104(A-B)、图105(A-B)中。图104(A-B)显示了第二个独立的免疫细胞化学实验。使用常规免疫细胞化学步骤获得的ErbB2染色的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像(依次用生物素化的一抗和链霉亲和素-荧光素(800CW)标记细胞，参见图104A)，然后在ERbB2一抗的不同稀释度下添加等离激元-荧光剂-800CW(图104B)。比例尺代表15μm。图105(A-B)显示了第三个独立的免疫细胞化学实验。使用常规免疫细胞化学方法获得的ErbB2染色的乳腺癌细胞(SK-BR-3)的共焦激光扫描显微镜(CLSM)图像(依次用生物素化的一抗和链霉亲和素-荧光素(800CW)标记细胞，参见图105A)，然后在ERbB2一抗的不同稀释度下添加等离激元-荧光剂-800CW(图105B)。比例尺代表15μm。
实施例30-SK-BR-3流式细胞术测量：
使用上述方法培养和收获SK-BR-3细胞。将细胞在1000rpm下离心10分钟以除去培养基，随后使用1X PBS中的3.7％甲醛固定30分钟。再次离心细胞悬浮液以除去游离甲醛，随后将细胞用3％BSA封闭过夜。接着，将不同量的ErbB2一抗添加至细胞悬液中，并将混合物在温和振荡下孵育1小时。将细胞在1000rpm下离心并用1X PBS洗涤一次以除去游离抗体，用链霉亲和素-680LT(LI-COR：P/N 926-6803；1％BSA中1μg/ml)孵育1小时，再洗涤两次，并用等离激元-荧光剂-680LT(消光～2.0)孵育1小时。最后，通过Guava easyCyte分析了5000个细胞，以结合正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)来获取荧光信号(RED-R通道(激发激光：642nm；滤光片：662/15nm))。独立实验的结果显示于图89和图90，以及图106(A-B)和图107(A-B)中。图106(A-B)显示了第二个独立的SK-BR-3流式细胞术实验。图106A是直方图，显示了添加等离激元-荧光剂-680LT前(顶部)后(底部)SK-BR-3细胞的荧光。红色：无一抗；蓝色：稀释2×105倍；橙色：稀释105倍；浅绿色：稀释104倍；绿色：稀释103倍；玫瑰色：供应商提供的储液(1mg/ml)稀释102倍。图106B是显示了在不同的一抗浓度下从流式细胞术获得的平均荧光强度的图。图107(A-B)显示了第三个独立的SK-BR-3流式细胞术实验。图107A是直方图，显示了在添加等离激元-荧光剂-680LT前(顶部)后(底部)SK-BR-3细胞的荧光。红色：无一抗；蓝色：稀释2×105倍；橙色：稀释105倍；浅绿色：稀释104倍；绿色：稀释103倍；玫瑰色：供应商提供的储液稀释102倍(1mg/ml)。图107B是显示了在不同的一抗浓度下从流式细胞术获得的平均荧光强度的图。
实施例31-BMDC分离和流式细胞术测量：
5至6周龄的雌性C57BL/6(H-2b)小鼠购自Jackson Labs(Bar Harbor，ME，USA)。将小鼠保持在无病原体的条件下。所有使用小鼠的实验都是根据圣路易斯华盛顿大学医学院动物研究委员会批准的实验动物方案进行的。使用CO2窒息和颈椎脱位使小鼠安乐死。将安乐死的小鼠在70％(v/v)乙醇中放置1min。分离股骨和胫骨，并用纱布垫小心地去除肌肉附着物。用剪刀切开骨头的两端，并将骨髓在合适的离心管(0.6ml管，有一个孔插入1.5ml管中)中在1000rpm下离心10秒钟。通过在RPMI 1640培养基中强烈吸移将沉淀物重悬。使细胞通过70μm细胞过滤器以制备单细胞悬液。清洗一次(1200rpm，5min)后，用RBC裂解缓冲液(Sigma-Aldrich)去除红细胞。收集骨髓细胞并在含有10mL RPMI培养基的100-mm培养皿中培养，该培养基中补充了10％热灭活的FBS、50IU mL-1青霉素，50μg mL-1链霉素和20ng mL-1小鼠重组体粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，R&D Systems，MN，USA)。在6孔板上培养1×106BMDC，并通过添加1ml不同浓度的LPS(0.5μg/ml，0.2μg/ml，0.1μg/ml，0.05μg/ml，0.01μg/ml和0μg/ml)刺激24小时。使用细胞刮刀收集细胞用于进一步的染色和流式细胞术分析。
使用常规的荧光团，接着使用等离激元-荧光剂-680LT探测细胞表面上过表达的CD80。具体地，将刺激的BMDC用1X PBS洗涤一次，以除去培养基(在2000rpm下离心5min)，并使用10％中性福尔马林缓冲液固定20分钟。然后洗涤细胞(2000rpm，5分钟)，并用3％BSA封闭，在4℃过夜。接着，将生物素化的CD80一抗(抗Mo CD80/生物素(Invitrogen，REF#13-0801-82，克隆16-10A1，批号#1934784)加入BMDC悬浮液中，使最终抗体浓度为100ng/ml，并将混合物温育1小时。将BMDC洗涤一次(2000rpm，5min)，且随后用1μg/ml链霉亲和素-680LT(在1％BSA中)孵育40分钟。最后，将细胞再洗涤两次，并用等离激元-荧光剂-680LT(消光～2)孵育1小时，然后再洗涤一次以除去未结合的等离激元-荧光剂-680LT。通过GuavaeasyCyte分析了10,000个细胞，以结合正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)来获取荧光信号(RED-R通道(激发激光：642nm；滤光片：662/15nm))。独立实验的结果显示于图108(A-C)和图109(A-C)。图108(A-C)显示了通过等离激元-荧光剂-680LT探测的BMDC成熟标志物的第二个独立流式细胞术测量。荧光强度分布对应于使用常规荧光剂(680LT)(图108A)和等离激元-荧光剂-680LT(图108B)获得的初始(对照)和LPS刺激的BMDC。(图108C)该图显示了用不同量的LPS刺激后BMDC的平均荧光强度(对应于CD80的表达水平)。图109(A-C)显示了通过等离激元-荧光剂-680LT探测的BMDC成熟标志物的第三个独立流式细胞术测量。荧光强度分布对应于使用常规荧光剂(680LT)(图109A)和等离激元-荧光剂-680LT(图109B)获得的初始(对照)和LPS刺激的BMDC。图109C是显示了用不同量的LPS刺激后BMDC的平均荧光强度(对应于CD80的表达水平)的图。
统计学：为了分析两组之间的统计差异，使用了使用Welch’s校正的未配对的两尾t检验。为了分析两个以上组之间的统计学差异，使用了使用Tukey’s事后真实检验的单向方差分析。数据的统计显著性计算为95％(p<0.05)CI。所有值均表示为平均±标准偏差。GraphPad Prism 6(San Diego，CA，USA)用于所有统计分析。采用四参数对数(4PL)或多项式拟合来计算生物测定标准曲线中的检出限。检出限定义为对应于空白的平均荧光强度加上其三倍标准偏差(平均+3σ)的分析物浓度。使用Origin 2016(Northampton，MA，USA)来计算检测限。

Claims (56)

1.一种荧光纳米构建体，其包括：
具有至少一个局部表面等离激元共振波长(λLSPR)的等离激元纳米结构；
至少一个间隔涂层；和
至少一种具有最大激发波长(λEX)的荧光剂；和
其中荧光纳米构建体的荧光强度比单独的至少一种荧光剂的荧光强度高至少500倍。
2.根据权利要求1所述的荧光纳米构建体，其中至少一个λLSPR与λEX之差小于75nm。
3.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种荧光剂包含至少约5、至少约10、至少约20、至少约50、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500或至少约1000种荧光剂。
4.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其进一步包含至少一种生物识别元件。
5.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层进一步包括功能层或荧光纳米构建体进一步包括功能层。
6.根据权利要求2-6任一项所述的荧光纳米构建体，其中等离激元纳米结构包含选自金(Au)、银(Ag)、铜(Cu)或其组合的等离激元活性材料。
7.根据权利要求2-6任一项所述的荧光纳米构建体，其中等离激元纳米结构选自纳米棒、纳米立方体、纳米球、双金属纳米结构、金核-银壳纳米立方体、纳米管、金纳米棒、银纳米立方体、银纳米球、金纳米棒核-银壳(AuNR@Ag)纳米立方体、具有尖锐尖端的纳米结构、纳米星、空心纳米结构、纳米笼、纳米拨浪鼓、纳米双锥体、纳米板、自组装纳米结构、纳米树莓及其组合。
8.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中λLSPR在约200至约1200nm之间，在约250至约950nm之间，在约300至约850nm之间，在约350至约800nm之间，或在约400至约750nm之间。
9.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中λLSPR近似为(意为±25nm)300nm、350nm、400nm、
450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm或1000nm。
10.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层具有足以降低或防止荧光剂淬灭的厚度。
11.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中纳米结构上的间隔涂层具有约0.5nm至约100nm，或约1nm至约20nm的厚度。
12.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层具有至少约1nm、至少2nm或至少3nm的厚度。
13.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层厚度的变化小于2nm。
14.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层是包括介电、刚性聚合物的，能够被官能化的反应性聚合物涂层。
15.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层包含至少一种包含介电基质的聚合物涂层。
16.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层是刚性聚合物网络。
17.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层包含硅氧烷网络。
18.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层包含至少一种选自巯基硅烷、氨基丙基硅烷、三甲氧基丙基硅烷及其组合的聚合物涂层。
19.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层基本上覆盖了等离激元纳米结构。
20.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，在pH7水中具有高于约20mV，或约25mV，或约30mV，或约35mV，或约40mV，或约45mV的ζ电位的绝对值。
21.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层包封了等离激元纳米结构。
22.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层包括选自以下的材料：APTMS/APTES、TMPS、MPTMS、氧化钛、聚多巴胺、Polyoctopamine、硅烷和硅烷混合物、PEG、金属氧化物、聚电解质双层、逐层组装的多层、氧化锌、氧化铝，多糖、二氧化硅、蛋白质、多肽、肽、聚脯氨酸、DNA/RNA、PSS/PAH、壳聚糖、藻酸盐及其组合。
23.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种荧光剂选自荧光蛋白、有机染料、量子点、上转换纳米颗粒、纳米金刚石、碳点、金属纳米簇(例如Au和Ag纳米簇)、荧光团掺杂的纳米颗粒、Eu掺杂的纳米颗粒、过渡金属络合物、镧系元素络合物及其衍生物。
24.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种荧光剂选自荧光素、Cy3、Cy5、680LT、800CW、吖啶、吖啶酮、蒽、蒽环、蒽醌、氮杂氮烯(azaazulene)、偶氮氮烯(azo azulene)、苯、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并吲哚碳花青素(benzoindocarbocyanine)、苯并吲哚、苯并噻吩、咔唑、香豆素、花青、二苯并呋喃、二苯并噻吩、双吡咯染料、黄酮、荧光素、咪唑、吲哚碳花青素、吲哚花青素、吲哚、异吲哚、异喹啉、萘二苯并菲(naphthacenedione)、萘、萘醌、菲、菲啶、菲啶、吩硒嗪、吩噻嗪、苯恶嗪、苯并呫吨(phenylxanthenes)、多氟苯、嘌呤、吡嗪、吡唑、吡啶、嘧啶酮、吡咯、喹啉、喹诺酮、罗丹明、方酸(squaraine)、并四苯、噻吩、三苯甲烷染料、呫吨、氧杂蒽酮及其衍生物。
25.根据权利要求4所述的荧光纳米构建体，其中至少一种生物识别元件选自链霉亲和素、生物素、抗体、核酸及其组合。
26.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层包括柔性接头，并且进一步其中至少一种生物识别元件连接柔性接头。
27.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中功能层包括柔性接头，并且进一步其中至少一种生物识别元件连接柔性接头。
28.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中柔性接头是PEGx，并且x等于2至36。
29.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种生物识别元件是经由生物素与间隔涂层缀合的链霉亲和素。
30.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种生物识别元件是与链霉亲和素缀合的生物素化的抗体，并且其中链霉亲和素通过生物素与间隔涂层缀合。
31.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，进一步包括功能层。
32.根据权利要求31所述的荧光纳米构建体，其中功能层是聚合物。
33.根据权利要求31所述的荧光纳米构建体，其中功能层包括选自以下的材料：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血红蛋白、卵清蛋白、溶菌酶或其同源物、白蛋白或其同源物、聚合物(例如均聚物、二嵌段、三嵌段、无规、交替和统计共聚物)、两性聚合物、两性离子聚合物、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、羧基甜菜碱聚合物、磺基甜菜碱聚合物、PEG/甜菜碱聚合物、多核苷酸、多糖、多肽及其组合。
34.根据权利要求31、32或33所述的荧光纳米构建体，其中功能层选自多肽、白蛋白蛋白质或白蛋白蛋白质同系物。
35.根据权利要求31至34任一项所述的荧光纳米构建体，其中功能层基本上覆盖至少一个间隔涂层或其中功能层包封至少一个间隔涂层。
36.根据权利要求31至35任一项所述的荧光纳米构建体，其中功能层通过疏水性相互作用、静电相互作用或其组合吸附于至少一个间隔涂层上。
37.根据权利要求31至36任一项所述的荧光纳米构建体，其中功能层稳定纳米结构，以免聚集和非特异性结合。
38.根据权利要求31至37任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种荧光剂和至少一种生物识别元件各自与功能层缀合。
39.根据权利要求31至37任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种荧光剂与至少一个间隔涂层缀合和至少一种生物识别元件与功能层缀合。
40.根据权利要求31至37任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种荧光剂与功能层缀合和至少一种生物识别元件与至少一个间隔涂层缀合。
41.根据权利要求38或39所述的荧光纳米构建体，其中功能层包括反应基团，并且进一步其中至少一种生物识别元件与功能层上的反应基团共价连接。
42.根据权利要求1至37任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种荧光剂和至少一种生物识别元件各自与间隔涂层缀合。
43.根据权利要求1至37任一项所述的荧光纳米构建体，其中至少一种生物识别元件与间隔涂层上的反应基团共价连接。
44.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中荧光剂维持在等离激元纳米结构表面的约0.5nm至约10nm内。
45.根据前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体，其中荧光纳米构建体的荧光强度比单独的至少一种荧光剂的荧光强度高至少约1,000倍、至少约2,000倍、至少约3,000倍、至少约4,000倍、至少约5,000倍、至少约6,000倍、至少约7,000倍或至少约10,000倍。
46.根据权利要求4所述的荧光纳米构建体，其中
等离激元纳米结构包括金纳米棒或涂有银的金纳米棒；
间隔涂层包括稳定的硅烷网络和能够被官能化的反应基团；和
生物识别元件包括生物素。
47.根据权利要求46所述的荧光纳米构建体，其中稳定的硅烷网络包括聚硅氧烷。
48.根据权利要求47所述的荧光纳米构建体，其中聚硅氧烷包括3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)、三甲氧基丙基硅烷(TMPS)、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，或其组合。
49.根据权利要求46至48任一项所述的荧光纳米构建体，其中生物识别元件与间隔涂层上的反应基团共价连接。
50.根据权利要求46至49任一项所述的荧光纳米构建体，其中间隔涂层进一步包括包含BSA的功能层，并且生物识别元件与功能层上的反应基团共价连接或与间隔涂层共价连接。
51.根据权利要求46至50任一项所述的荧光纳米构建体，其中
间隔涂层为约1nm至约10nm厚；和
等离激元纳米结构具有至少一个长于60nm的维度。
52.一种用于构建前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体的方法，该方法包括：
用至少一个间隔涂层涂覆等离激元纳米结构；
任选用功能层涂覆至少一个间隔涂层；
将荧光剂与至少一个间隔涂层或功能层缀合；和
任选将生物识别元件与至少一个间隔涂层或功能层中的一个缀合。
53.根据权利要求52所述的方法，其中用至少一个间隔涂层涂覆等离激元纳米结构包括将引发层施加于等离激元纳米结构表面上并将聚硅氧烷涂层施加于引发层上。
54.根据权利要求53所述的方法，其中引发层包括3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)。
55.根据权利要求53所述的方法，其中聚硅氧烷涂层包括三甲氧基丙基硅烷(TMPS)和3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)。
56.一种使用测定检测分析物的方法，该方法包括：
将前述权利要求任一项所述的荧光纳米构建体加入测定中，以产生荧光信号；和
通过分析荧光信号检测分析物。
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