JP2016507067A - 金属ナノシェル被覆バーコード - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明は金属ナノシェルで被覆されたバーコード並びに金属ナノシェル被覆バーコードの作成方法を提供することである。【解決手段】本発明の金属ナノシェル被覆バーコードは、マルチプレックス検出システムを含む検出システムに適用することができる。【選択図】図１

Description

本発明はバーコードの分野並びにバーコードの作成方法に関する。より具体的には、本発明は金属ナノシェル被覆バーコードに関するものである。
ポリマーマイクロビーズは、ケミカルおよびバイオセンシングへの応用のための最も多様性プラットホームの一つである。マイクロビーズプラットホームは、他の検出技術と比較して、より迅速な化学反応速度および生体分子抱合についてのより早い処理能力およびより良好な分析再現性を提供するものである[1]。マイクロビーズを有機蛍光体又は量子ドット（QDｓ）でドーピングしてバーコードを生じさせた場合、何千もの分子を同時に検出することができるであろう。有機蛍光体でバーコード化されたマイクロビーズはマルチプレックス検出方式の礎石となりつつある。これらのバーコードの制限要素は、異なる蛍光体を励起させるための光源の必要性を償うために複雑で高価な読み出し装置を必要とすることが含まれ、それ故、これらのバーコードは特別な環境条件でのみ使用することができる。なぜならば、異なる蛍光体の発光特性が分析環境により影響されるからである。この制限要素はバーコードを作成するのにQDｓを使用することにより克服することができる。40,000を超える異なるバーコードを6種の異なる色および強度レベルのQDｓを用いて巧みに処理することができ、これらを単一波長を用いて励起することができるであろう[2]。このような幅広いマルチプレックス検出技術は、有機質並びに無機質マーカーの種々のメカニズムの迅速分析および高処理スクリーニングにおいて極めて有用であろう。QDバーコードを巧みに処理するための方法が現在多く提案されている[2-5]。しかし、これらの方法はいずれも容易に抱合（接合）させることのできるQDバーコードを作り出させるものではないし、更に、異なる温度、バッファ（緩衝剤/液）又は分析環境において良好な貯蔵寿命および蛍光一致性を示しその技術を広く使用することを可能にするものでもない。分析プロセスの間におけるQD蛍光の如何なる変化もバーコードの誤認につながることがある[6，7]。従って、QDバーコード技術は未だ研究段階に留まっており、広範な利用にまで前進していない。
以前、本発明者は100nm以下のポリスチレンビーズの中央ではQDｓの蛍光は異なる分析条件において変化しないことを示した[8]。残念ながら、この合成方法はより大きなビーズを製造することには採用できない。より大きいQDバーコードを作るため同様の方策を使用として試みた場合、開始剤が反応の間においてQDｓの蛍光特性を消滅ないし変化させるものであった。しかし、この研究はポリスチレンビーズ内部に深く守られたQDｓは、QDｓが水性環境と相互作用することから保護されることを実証するものであった。
R. Wilson, A.R. Cossins, D.G. Spiller, Encoded microcarriers for high-throughput multiplexed detection, Angew Chem Int Ed Engl 45 (2006) 6104- 61 17. M. Han, X. Gao, J.Z. Su, S. Nie, Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules, Nat Biotechnol 19 (2001 ) 631 -635. S. Fournier-Bidoz, T.L. Jennings, J.M. Klostranec, W. Fung, A. Rhee, D. Li, W.C. Chan, Facile and rapid one-step mass preparation of quantum- dot barcodes, Angew Chem Int Ed Engl 47 (2008) 5577-5581 . X. Gao, S. Nie, Doping Mesoporous Materials with Multicolor Quantum Dots, J. Phys. Chem. B 107 (2003) 11575-11578. D. Wang, A.L. Rogach, F. Caruso, Semiconductor Quantum Dot- Labeled Microsphere Bioconjugates Prepared by Stepwise Self-Assembly, Nano Lett. 2 (2002) 857-861. X. Gao, W.C. Chan, S. Nie, Quantum-dot nanocrystals for ultrasensitive biological labeling and multicolor optical encoding, J Biomed Opt 7 (2002) 532-537. J.A. Lee, A. Hung, S. Mardyani, A. Rhee, J. Klostranec, Y. Mu, D. 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このようなことから、本発明の目的は、従来のバーコードとの関連において、抗劣化性および分析感度において安定性又は改良された安定性を有するバーコードを提供することにより前記の諸制限を克服すること、並びに抱合（接合）プロセスを単純化することである。
本発明の更なる他の目的は、以下に記載の発明の要約、詳細な説明および具体例および実施例から理解されるであろう。
一具体例として、本発明はバーコードを提供するものであって、それは試料中の1又はそれ以上の対象標的を検出するための方法ならびに1又はそれ以上の対象標的を検出するためのマルチプレックス（多重）システムに使用することができる。本発明のバーコードは一具体例として、蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズを含むものである。
本発明のバーコードの一具体例において、この蛍光体には有機質蛍光体、無機質蛍光体、又は有機および無機質蛍光体混合物が含まれる。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記マイクロビーズは高分子マイクロビーズである。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記マイクロビーズはポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）の単一ポリマーシステムを有するものである。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記マイクロビーズはポリスチレンとポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）との混合ポリマーシステムを有するものである。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記のポリスチレンとポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）との割合は約4:1ないし約1:1質量比の範囲とする。
本発明のバーコードの他の具体例において、これらポリマーには類似体又は誘導体が含まれる。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記蛍光体は量子ドット（QDｓ）である。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記金属が銀および金から選択されるものである。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記バーコードは前記金属ナノシェルに抱合された標的特異的捕捉プローブを更に有するものである。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記標的には無機物質および有機物質が含まれる。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記有機物質には単細胞生物および多細胞生物並びにそのあらゆる成分、ペプチド、プロテイン、オリゴ糖、脂質、遺伝子、核酸、アミノ酸が含まれ、前記無機物質には金属原子を有する無機分子が含まれる。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記バーコードは、前記マイクロビーズの表面と前記金属ナノシェルとの間のプロテイン層を含むものである。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記金属ナノシェルは、金属ナノシェルを有しないバーコードとの関連においてバーコードの貯蔵寿命を向上させるよう作動するものである。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記金属ナノシェルは、金属ナノシェルを有しないバーコードとの関連においてバーコードの蛍光安定性を向上させるよう作動するものである。
本発明のバーコードの他の具体例において、前記金属ナノシェルは約20nmないし約80nmの厚みを有するものである。
本発明のバーコードの他の具体例は、バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる方法を提供するものである。一例として、このバーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる方法は、(a)前記バーコードを金属ナノ粒子と接触させる工程と、および(b)前記工程(a)で得られたバーコードを前記金属の塩と、バーコード上に前記金属ナノシェルが成長するのに十分な時間、混合させる工程とを具備してなる。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の１具体例において、前記バーコードは蛍光体の1又はそれ以上の集団を有するマイクロビーズを含み、この蛍光体には有機質蛍光体、無機質蛍光体、又は有機および無機質蛍光体混合物が含まれる。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記マイクロビーズは高分子マイクロビーズである。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記マイクロビーズはポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）の単一ポリマーシステムを有するものである。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記マイクロビーズはポリスチレンとポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）との混合ポリマーシステムを有するものである。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記のポリスチレンとポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）との割合は約4:1ないし約1:1質量比の範囲とする。
本発明に係るバーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、これらポリマーには類似体又は誘導体が含まれる。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記蛍光体は量子ドット（QDｓ）である。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記金属が銀および金から選択されるものである。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、該方法が前記金属ナノシェルに対し捕捉プローブを抱合させることにより前記金属ナノシェル被覆バーコードを官能化させることを更に含み、ここで該捕捉プローブは標的と相互作用し得るものである。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記標的には無機物質および有機物質が含まれる。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記有機物質には単細胞生物および多細胞生物並びにそのあらゆる成分、ペプチド、プロテイン、オリゴ糖、脂質、遺伝子、核酸、アミノ酸が含まれ、前記無機物質には金属原子を有する無機分子が含まれる。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、該方法が、前記バーコードを前記金属ナノ粒子と接触させる前に、該バーコード上にプロテイン層を添加する工程を更に含んでいる。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記工程(b)の時間は、前記金属ナノシェルの予め選択された厚みに相当するまで金属ナノシェルを成長させるのに要する時間である。
バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる前記方法の他の具体例において、前記の金属ナノシェルを成長させるのに要する時間が、金属ナノシェルの厚みと、金属ナノシェルの成長時間とを対比する標準曲線から選択されるものである。
１実施例として、本発明は試料中の標的を検出するための検出システムを提供するものである。この検出システムは一例として、複数のバーコードを含み、それぞれのバーコードが蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズと、該金属ナノシェルに抱合された捕捉プローブとを具備してなり、該捕捉プローブが前記標的と相互作用することができ、該システムが該試料中の標的の検出を示唆する検出可能な信号を生じさせることができ、この検出可能な信号が、前記標的に結合された捕捉プローブを有するバーコードからの第1の信号と、前記標的に結合された二次プローブからの第2の信号とからなるものである。
本発明の検出システムの1具体例において、前記検出システムが更に無線通信装置を含み、この無線通信装置が複数のバーコードおよび二次プローブからの検出可能な信号を収集するための手段を有するものである。
本発明の検出システムの他の具体例において、前記無線通信装置が更に前記の複数のバーコードおよび二次プローブから収集された信号を分析するための1つ又は双方の手段と、この収集された信号を遠隔分析のため送信する手段とを有している。
本発明の検出システムの他の具体例において、前記検出システムが更に二次プローブ信号を含むものであり、この二次プローブ信号はバーコード捕捉プローブによる標的の成功裡の捕捉を示唆するものである。
１実施例として、本発明は、単一試料中の対象の多重標的を同時に検出するためのマルチプレックス検出システムを提供するものである。この本発明のマルチプレックス検出システムは、１具体例として、複数のバーコードを含み、それぞれのバーコードが、(i)蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズと、(ii)対象とする多重標的の１つと相互作用し得るバーコードの表面に抱合された１つの捕捉プローブとを具備してなり、前記の複数のバーコードが対象とする多重標的の夫々のための少なくとも１つのバーコードを有し、前記の複数の金属ナノシェル-バーコードが前記の対象とする多重標的のそれぞれについての異なる標的特異的信号を生じさせ得るものであり、該標的特異的信号のそれぞれが、対象の特定の標的と相互作用する捕捉プローブを有するバーコードからの第1の信号と、対象の特定の標的に抱合された二次プローブからの第２の信号とを有するものである。
本発明のマルチプレックス検出システムの1具体例において、該マルチプレックス検出システムは更に二次プローブ信号を含むものであり、この二次プローブ信号はバーコード捕捉プローブによる標的の成功裡の捕捉を示唆するものである。
本発明のマルチプレックス検出システムの他の具体例において、該マルチプレックス検出システムは更に無線通信装置を含み、この無線通信装置が複数のバーコードからの第1の信号および二次プローブ信号からの第2の信号を収集するための手段を有するものである。
本発明のマルチプレックス検出システムの他の具体例において、前記無線通信装置が更に前記の複数のバーコードおよび二次プローブから収集された信号を分析するための1つ又は双方の手段と、この収集された信号を遠隔分析のため送信する手段とを有している。
本発明は、他の実施例として、試料中の対象の標的を検出するための方法を提供するものである。この方法は1具体例において、試料を、(a)複数のバーコードおよび(b)二次プローブと接触させるものであって、夫々のバーコードが蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズと、金属ナノシェルに抱合された１つの捕捉プローブとを具備してなり、該捕捉プローブが対象の標的と相互作用することができるものであり、バーコードの夫々が標的特異的信号を発信できるものであり、前記二次プローブが対象の標的と相互作用し得ると共に二次プローブ信号を発信し得るものであり、ここで前記バーコード信号と前記二次プローブ信号の存在は試料中の標的の検出を示唆させるものである。
試料中の対象の標的を検出するための方法の1具体例において、前記バーコードは蛍光体の1又はそれ以上の集団を有するマイクロビーズを含み、この蛍光体には有機質蛍光体、無機質蛍光体、又は有機および無機質蛍光体混合物が含まれる。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記マイクロビーズは高分子マイクロビーズである。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記マイクロビーズはポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）の単一ポリマーシステムを有するものである。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記マイクロビーズはポリスチレンとポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）との混合ポリマーシステムを有するものである。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記のポリスチレンとポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）との割合は約４：１ないし約１：１質量比の範囲とする。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、これらポリマーには類似体又は誘導体が含まれる。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記蛍光体は量子ドット（QDｓ）である。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記金属が銀および金から選択されるものである。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記標的には無機物質および有機物質が含まれる。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記有機物質には単細胞生物および多細胞生物並びにそのあらゆる成分、ペプチド、プロテイン、オリゴ糖、脂質、遺伝子、核酸、アミノ酸が含まれ、前記無機物質には金属原子を有する無機分子が含まれる。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記バーコードは、前記マイクロビーズの表面と前記金属ナノシェルとの間のプロテイン層を含むものである。
試料中の対象の標的を検出するための方法の他の具体例において、前記金属ナノシェルは約20nmないし約80nmの厚みを有するものである。
本発明の１つの態様において、前記試料は生物学的又は非生物学的試料である。
本発明の他の態様において、前記試料はヒト以外からの試料である。
本発明の他の態様において、前記試料はヒトからの試料である。
本発明の他の態様において、前記試料は固体又は流体試料である。
本発明の他の態様において、前記試料は生物学的又は非生物学的試料であり、生物学的試料としては原核生物、真核生物を含めて動物又は植物界の単細胞生物および多細胞生物から採取された固体、液体又は気体試料を含み、非生物学的試料としては水試料、土壌試料、気体試料および鉱物試料が含まれる。
以下、図面を参照して実施例を記載するが、これらは単に例示に過ぎない。
本発明の１実施例に係る銀ナノシェル被覆量子ドット(QD) マイクロビーズの形態および蛍光を示している。その内、(A)は、銀ナノシェル被覆QDマイクロビーズを作成および機能化するプロセスを説明するもの。(B,C)は、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）の単一ポリマー(B)又はポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）-ポリスチレン混合ポリマー(C)から作られたQD555（λem = 555nm）を有する非被覆マイクロビーズの蛍光画像をそれぞれ示すもの。(D-F)は、異なる期間で成長させた銀ナノシェルを有するマイクロビーズの走査電子顕微鏡画像(2kVで得たもの)。(D)は、10nm銀ナノ粒子で播種されたビーズで0分間成長させたもの。(E)は、30分間成長させたもので、平均d=70nm。(F)は、120分間成長させたもので、平均d=150nm。(B-F)で、スケールは、単一画像サイズが4 x 4μm、インセット画像サイズが500 x 500nm。(G-I)は、銀ナノシェル被覆マイクロビーズの蛍光画像である。 図１から続く図である。(G)はQD510を有するもの、(H)はQD575を有するもの、(I)はQD665を有するものである。銀ナノシェルの厚みは全て約50nmであった。単一画像サイズが40 x 40μmである。これら全ての蛍光画像は、水銀ランプ励起（λex =350/50）および100x UPlanApoオブジェクティブ（NA=1.35）を用い、ロングパス（>430nm）フィルターを介して得られたものである。(J)は、ビーズの蛍光強度と銀ナノシェルの厚みとの相関関係を示すグラフである。非被覆ビーズの蛍光強度は100％に変換し、他のグループはそれに応じて正規化した。 環境条件下で異なる組成を以って作られたQDマイクロビーズの蛍光安定性を示すグラフ図である。左欄（グラフのa, d, g）は非被覆ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）の単一ポリマーを示し、中央欄（グラフのb, e, h）は銀ナノシェル被覆の単一ポリマーを示し、右欄（グラフのc, f, i）は銀ナノシェル被覆ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）の混合ポリマーを示す。 (A)はサンドイッチ分析の機構を説明するグラフ図である。(B)は非被覆および銀ナノシェル被覆マイクロビーズを使用し、分析感度を比較したものを示すグラフ図である。(C：差込み図)は標的の10フェムトモルまでが測定されたときの図である。黒の中実ドットおよび中空円はそれぞれ銀ナノシェル被覆ビーズおよび非被覆ビーズを示すものである。 銀ナノシェル被覆QDバーコードによるDNA標的の多重検出を示すグラフ図である。グラフ(a)および(b)はそれぞれP. falciparumおよびP. vivax DNA配列の用量反応曲線である。グラフ(c)はDNA標的の多重検出を示す QDバーコードのサイズ分布を説明するバーコードのサイズのヒストグラムである。非被覆QDバーコードの直径および集中度はVi-cell分析器により判定した。前記グラフ中における直径は4.5±0.7nm（中央値±標準偏差）であった。 時間の経過に亘るビーズ上の銀ナノシェルの成長を示すSEM画像である。成長の各時点について、倍率のより低い大きさ（10k X）の画像が上列に示されており、対応するズームイン画像（100k X）が下列に示されている。銀ナノシェルの表面被覆率は成長期間と相関関係があった。 混合ポリマーQDバーコードの蛍光強度に対する銀ナノシェルの厚みの作用効果を示すグラフ図である。 (A)QD600バーコードの蛍光強度に対する並びに(B)前方散乱に対する銀ナノシェル成長時間の作用効果を示すグラフ図である。 銀ナノシェル成長の間におけるQDバーコードの蛍光スペクトルを示すグラフ図である。 銀ナノシェル成長の間におけるQDバーコードの吸光度スペクトルを示すグラフ図である。 本発明の1実施例に係る金ナノシェル被覆マイクロビーズのSEM画像である。 本発明の1実施例に係る金ナノシェル被覆マイクロビーズのSEM画像である。 (A)QDバーコードの蛍光強度に対する並びに(B) QDバーコードの前方散乱に対する金ナノシェル成長時間の作用効果を示すグラフ図である。 単一ポリマーおよび混合ポリマーから作られた非被覆QDバーコードの異なる環境条件下：(A)-pH; (B)-バッファ（緩衝剤）；(C)-温度での蛍光安定性を示すグラフ図である。 環境条件下で異なる組成で作られたQDバーコードの整合性を示す図である。左欄（グラフのa, d, g）は非被覆ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）の単一ポリマーを示し、中央欄（グラフのb, e, h）は銀ナノシェル被覆の単一ポリマーを示し、右欄（グラフのc, f, i）は銀ナノシェル被覆ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）−ポリスチレンの混合ポリマーを示す。この銀ナノシェル被覆は厚みが20-30nmであった。 フローサイトメトリーにおける前方散乱(FSC)-側方散乱(SSC)プロットを示す図である。 異なるpHのもとでのバーコード蛍光の安定性に対する金ナノシェルの作用効果を示すグラフ図である。 非被覆マイクロビーズおよび銀又は金ナノシェル被覆マイクロビーズを使用したときの分析感度の比較を示すグラフ図である。このナノシェルの厚みは、双方の金属について約50 nmであった。これらの分析は並行して行なわれた。双方の金属ナノシェルは、用量-応答曲線で示すように分析性能を向上させるものであった。この銀ナノシェル被覆ビーズは、これら３つの条件の内で最良の分析性能を実証した。 QDｓおよび4-プレックス銀ナノシェル被覆バーコードの発光スペクトルおよびフローサイトメトリーにおけるそれらの発光プロットを示すグラフ図である。これらバーコードを作成するために使用されたQDｓ（QD530およびQD580）の発光スペクトルは蛍光光度計により測定した。これらのQDｓの強度を変化させることにより、本発明者は4つのバーコードを作成し、それらの発光スペクトルについても判定した。これらのバーコードはフローサイトメータのプロットにおいて独特な蛍光強度分布を示した。横軸はFITCチャンネル(525nm)強度を示している。縦軸はPEチャンネル(575nm)強度を示している。バーコード1(B1)およびバーコード4(B4)はそれぞれ陰性対照および陽性対照を示している。B2およびB3はそれぞれP. vivaxおよび P. falciparumを示している。
発明の詳細な説明
定義：
本明細書および特許請求の範囲において、使用されている用語は以下のような意味を有すべく定義される。全ての数字表示、例えば寸法および重量は、その範囲を含めて、近似値であり、典型的には、適当に応じて0.1、1.0又は10.0の増分で(＋)又は(−)に変化することがある。全ての数字表示は“約”の用語が付加されるものと理解されたい。単一形の用語も明確な別段の示唆がない限り、複数も含まれるものである。ここに引用した全ての刊行物並びに優先権の文献はそれら全体が参照として組み込まれている。
“捕捉プローブ”とは、サンプル（試料）中の標的分子と結合する化合物を指すものであって、それらの相対的発現レベルを検出することができるものである。捕捉プローブの例としては、核酸配列、プロテイン、ファージ、抗体、酵素などが含まれる。標的としては有機分子が含まれ、それには核酸、プロテイン、脂質、糖、毒素、毒素、単細胞又は多細胞生物、ウイルスおよびその成分、無機分子(金属原子など)、任意の他の対象標的（捕捉プローブに結合されるもの）などが含まれる。
“二次プローブ”の用語は、捕捉プローブの標的を認識することができ、この捕捉プローブ、該捕捉プローブの標的および二次プローブの間の相互作用に応答して検出可能な信号を起生させることのできる分子を指すものである。この二次プローブとしては、核酸配列、プロテイン、ファージ、抗体、酵素などが含まれる。更に、この二次プローブには蛍光分子が含まれる。
“有する、含む”の用語は、引用された要素が必然的含まれること、更に他の要素も任意のものとして含み得ることを意味する。“基本的に何々からなる”の用語は、引用された要素が必然的含まれること、更に、列挙された要素の基本的および新規な特性に対し実質的に悪影響する要素は除外されること、更に他の要素も任意のものとして含み得ることを意味する。“のみからなる”の用語は、列挙されたもの以外の全ての要素は除外されることを意味する。これらの用語で規定された具体例は本発明の範疇に含まれる。
ここで使用される“量子ドット”（QD）の用語は、当業界で公知のように、半導体光ルミネセンス材料である（例えば、Alivasatos, Science 271:933-937(1996)参照）。QDｓの非限定的例としては、CｄS量子ドット、CdSe量子ドット、CdSe/CｄSコア/シェル量子ドット、CdSe/ZnSコア/シェル量子ドット、CdTe量子ドット、PbS量子ドット及び／又はPbSe量子ドットが含まれる。当業者にとって周知のように、CdSe/ZnSはCdSeコア表面にZnSシェルが被覆されていること（すなわち、“コア-シェル”量子ドット）を意味する。このコア-シェルQDｓのシェル材料は、より高いバンドギャップを有し、コアQDｓ表面を不動態化し、その結果、コアQDｓとの比較において、より高い量子収量、より高い安定性およびより広い応用がもたらされる。
ここで使用される、蛍光体に関する“集団”の用語（QDｓを含めて）は、最大発光および強度の共通波長を共有する複数の蛍光体を指すものである。
ここで使用される“バーコード”の用語は、１、２、３又はそれ以上の集団の蛍光体を有するビーズ又はマイクロビーズを指すものである。もし、蛍光体の強度を変化させ、多重サブ母集団を達成し得るのであれば、単一色を発光する蛍光体の単一の集団を有するものでもよい。各ビーズは特異な光学的サインを有し、それにより表面抱合分子を同定することができる。適当な蛍光体としては、有機蛍光体、QDｓ、マルチ金属ロッド又は光学サインを形成し得る他の任意の蛍光体が含まれる。5-6の異なるカラー量子ドットおよび6つの強度レベルを用いて、約10,000ないし40,000の異なるバーコードを操作することができる（9）。これは有意な多重化を可能にするものであり、これらのバーコードはフローサイトメータ中（10-13）又はマイクロ流体チャネル中（14,15）の標的を検出することができる。
“サンプル（試料）”の用語は、固体および流体試料の双方を含むものである。固体タイプの試料は適当な流体中で可溶化してもよい。これら試料は生物学的及び／又は環境的（すなわち、非生物学的）のものであってもよい。生物学的試料（流体又は固体）としては、原核生物、真核生物を含めて動物又は植物界の生体（単細胞生物および多細胞生物）から採取された試料が含まれる。非流体試料は適当な溶液中で可溶化してもよい。環境的試料（流体又は固体）としては、水試料、土壌試料、鉱物試料などが含まれる。
ここで使用される“捲種（seeding）”の用語は、ビーズ表面への金属粒子又はイオンの添加を指すものであり、これはビーズの周りに金属シェルを形成させるための核形成サイトとして役立つものである。
本明細書において、“貯蔵寿命”の用語は、バッファ（緩衝剤）のタイプ、溶液のpHの範囲、温度範囲などの種々の環境条件においてビーズおよびバーコードが無傷を維持し得る能力、並びに、これらの可変的な環境上の示唆に応答してそれらの蛍光信号を維持し得るビーズおよびバーコードの能力を指すものである。
金属ナノシェル被覆バーコード：
ここに記載したものは、新規で、非自明的ナノシェル被覆バーコードであって、改善された安定性および改善された分析感度を有するもの、並びに、この金属ナノシェル被覆バーコードの製造方法についてである。
１実施例において、本発明のバーコードには蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズが含まれる。
このマイクロビーズは、単一ポリマーシステム又は混合ポリマーシステムから作られた重合体（ポリマー）ビーズであってもよい。このポリマーとしては、任意の適当なポリマー、例えば異なる分子量のポリスチレン、其の他のポリスチレン（ランダム又はブロック）コポリマー、更に、それらの類似体又は誘導体が含まれる。単一ポリマービーズは任意の適当なポリマーからなるものであってもよい。1具体例として、この単一ポリマービーズはポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）又はその類似体又は誘導体である。混合ポリマーシステムとしてはポリマーの混合物が含まれる。1具体例として、ポリマーの混合物は、ポリスチレンとポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）とからなるもの、又は、それらの類似体又は誘導体の混合物からなるものである。前記のポリスチレンとポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）(又はそれらの類似体又は誘導体)との割合は約4:1ないし約1:1質量比の範囲で変化し得る。
前記ナノシェルは金属から作られるものであってもよい。使用される金属には銀および金が含まれる。バーコードマイクロビーズの表面にシェルを形成することができ、実質的な貯蔵寿命並びに実質的な分析感度を提供し得る他の適当な金属を使用することもできる。
本発明の金属ナノシェル被覆バーコードは、以下に記載のように標的特異的捕捉プローブで官能化（functionalize）することができる。
金属ナノシェル被覆バーコードの製造方法：
１実施例として、本発明はバーコード上に金属ナノシェルを形成する方法を提供するものである。１具体例として、この方法は、(a)バーコードの1又はそれ以上の集団を金属ナノ粒子に対し接触ないし播種させる工程と、および(b)前記金属ナノシェルで播種させたバーコードを前記金属の塩と混合させる工程とを具備してなる。
本発明の方法の１具体例において、前記方法は更に、前記金属ナノシェルに対し標的特異的捕捉プローブを抱合させる工程を含む。
この方法の１具体例において、前記蛍光体はポリスチレン被覆QDｓであってもよい。他の具体例において、前記QDｓは、マトリックスポリマーと構造的に類似する或る範囲の疎水性ポリ芳香族ポリマーを用いて前記QDｓを変性させマイクロビーズの内部領域を作り上げるようにしてもよい。
バーコードの作成：
次に、本発明の金属ナノシェル被覆バーコードを製造するための１例を図１Aに示す。
図１Aを参照すると、バーコードには、蛍光体102の1又はそれ以上の集団を有するマイクロビーズ101が含まれている。このバーコード100は当該分野で周知の方法により作ることができる。例えば、濃度制御フローフォーカシング（focusing）(CCFF)技法である[2]。蛍光体102、例えばQDｓ、は単一ポリマーシステムと混合して単一ポリマーバーコードを形成させることができ、又は、混合ポリマーシステムと混合して混合ポリマーバーコードを形成させることができる。単一ポリマーシステムは任意の適当なポリマー、例えば、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）単独から作られたものでよい。混合ポリマーシステムは2種以上の異なるポリマーの混合物から作られたものでよい。1具体例として、この混合ポリマーシステムはポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）とポリスチレンとから作ることができる。単一又は混合ポリマーシステムにおいて、ビーズを作るのに使用される他のポリマーの例としては、異なる分子量のポリスチレン、其の他のポリスチレン（ランダム又はブロック）コポリマーが含まれる。前記のポリスチレンとポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）との割合は4:1ないし1:1質量比の範囲で変化し得る。
バーコードを作るのに使用される蛍光体はアミノ末端ポリスチレンポリマーで被覆させることができる。ポリスチレン被覆QDｓは当該分野で公知の任意の方法で作成することができる[1]。1具体例として、QDｓはトリ-n-オクチルフォスフィンオキシド（TOPO）QDｓとして提供される。一例として、このTOPOQDｓを使用してQDｓ表面上のTOPOリガンドをアミノ末端ポリスチレンポリマーで置換してポリスチレン被覆QDｓを得ることができる。TOPOリガンドをアミノ末端ポリスチレンポリマーで置換するのにリガンド交換プロセスを使用してもよい。量子ドットの界面化学を変性するための他の方法としては、単座又は多座チオール-、フォスフィン-、又はアミノ化リガンドを用いるリガンド交換法、ポリマーカプセル化法、シラン化法などが含まれる。表面変性量子ドットを作成するのにこれらの任意の方法を採用することができる。
図１Bおよび図２Cは SEM写真図であって、単一ポリマーから作られたQDｓを有する非被覆マイクロビーズ(図1B)並びに混合ポリマーから作られたQDｓを有する非被覆マイクロビーズ(図1C)を示しており、これらは広視野顕微鏡のもとで画像化されたものである。QDｓは単一ポリマービーズにおいては均一に分布されているように見え(図1B)、他方、ポリマーの混合物が存在するときはQDｓは小滴中に封鎖されているように見える(図1C)。
マイクロビーズ表面上での金属ナノシェルの成長：
図１Aを参照すると、金属ナノシェル106は単一ポリマー又は混合ポリマーバーコード100の表面上に成長させることができる。金属ナノシェル106の成長には、バーコード100の高分子マイクロビーズ101（単一ポリマー又は混合ポリマー）に金属ナノシェル104を用いて播種する工程と、還元剤および前記金属の塩を添加することによりマイクロビーズ101の表面上に金属ナノシェル106を成長させ、金属ナノシェル被覆バーコード120を形成させる工程とが含まれる。この金属ナノシェル被覆バーコードは1又はそれ以上の捕捉プローブ108、110を用いて官能化することができる。これらの捕捉プローブは以下に記載のように金属ナノシェル被覆バーコード120に対し取着される。
金属ナノシェルを成長させるため、播種プロセスのために使用された金属ナノシェルに対し高い親和性を有する基でバーコードのマイクロビーズ面も富化させてもよい。1具体例として、この富化工程はチオール又はスルフィドリル基を用いてマイクロビーズの表面を富化することにより達成することができる。バーコードのマイクロビーズ面に、表面官能化のためカルボキシル基を設けるようにしてもよい。例えば、カルボキシル基は無水マレイン酸を用いて形成することができる。1具体例として、マイクロビーズ表面のカルボン酸官能基はシスタミンを用い例えばカルボジイミド媒介反応を介して変性してもよい。このチオール化マイクロビーズはついで播種プロセスとして金属ナノ粒子を用いて培養することができる（図１D参照）。商業的に最も入手可能なマイクロビーズは表面官能化のためにカルボキシル基に依存する。しかし、アミン官能化マイクロビーズも入手可能である。アミンマイクロビーズをチオール化するために、チオグリコール酸又はチオール基を有するアミン反応性エステルをシスタミンの代わりに使用してもよい。純粋なポリスチレンからなるマイクロビーズは、プロテインを吸収する疎水性表面を有する。プロテイン層はポリスチレンビーズで培養した後に、ビーズ表面に形成することができる。このプロテイン層は、播種工程において播種のために使用される金属ナノ粒子に対し高い親和性を有する。
金属ナノ粒子の直径は6ないし12nmの範囲でよい。1具体例においては、金属ナノ粒子は平均径が6nmのものであり、他の具体例においては、その平均径が7nmのものであり、更に他の具体例においては、その平均径が8nmのものであり、更に他の具体例においては、その平均径が9nmのものであり、更に他の具体例においては、その平均径が10nmのものであり、更に他の具体例においては、その平均径が11nmのものであり、更に他の具体例においては、その平均径が12nmのものである。金属ナノシェルは、還元剤および使用される金属の塩を添加することによりバーコードのマイクロビーズ表面上に成長させることができる。銀の場合、その金属塩は硝酸銀でよく、金の場合、その金属塩は塩化金でよい。マイクロビーズ表面上の金属シェルの厚みおよび表面被覆率は、成長時間の延長又は短縮により、若しくは還元剤および硝酸銀/塩化金の連続的添加を介して調整ないし制御することができる。この成長時間はゼロ分（図１D参照）から2時間の範囲でよい（図１F参照）。2時間以上でも可能である。このナノシェルの厚みは20ないし80nmの範囲でよい。金属塩に対する還元剤の割合は1:1でよい。このプロセスは走査電子顕微鏡のもとで特徴づけられた（図１D-F）。このシェルの厚みは2時間の成長で150nmに増大した。異なる発光色のQDｓを有するバーコードに厚み約50nmの銀ナノシェルの被覆を施すことができる（図１G-I）。時間の経過における金属ナノシェル成長のより詳細な画像が図6に示されている。このように、金属ナノシェルの厚みと成長時間とを比較した標準曲線を作ることができる。この標準曲線は次に、このシェルを予め選択された厚みに対応する成長時間に亘って成長させることにより、予め選択された厚みの金属ナノシェルを有する本発明のバーコードの製造方法に利用することができる。
検出システムおよび多重検出システム：
本発明のナノシェル被覆バーコードは、試料中の有機又は無機標的を検出するためのシステムおよび方法での使用に適している。本発明の金属ナノシェル被覆バーコードは更に、多重有機標的(生物学的標的、例えば病原体、ペプチド、プロテオーム又はゲノム標的、アミノ酸配列、核酸配列、脂質、多糖類など)又は無機標的（単一試料中に金属原子を有するものなど）の同時検出のための方法および多重検出システムにおいても使用することができる。
このように、1実施例として、本発明は試料中の対象標的を検出するための方法を提供するものである。この方法は、1具体例として、試料に(a)複数のバーコードおよび(b)二次プローブと接触させるものであって、ここで、前記バーコードの夫々が蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズと、金属ナノシェルに抱合された１つの捕捉プローブとを具備してなり、該捕捉プローブが対象の標的と相互作用することができるものであり、バーコードの夫々が標的特異的信号を発信できるものであり、前記二次プローブが対象の標的と相互作用し得ると共に二次プローブ信号を発信し得るものであり、ここで前記バーコード信号と前記二次プローブ信号の存在は試料中の標的の検出を示唆させるものである。
他の実施例として、本発明は試料（サンプル）中の標的を検出するための検出システムを提供するものである。この検出システムは一例として、複数のバーコードを含み、それぞれのバーコードが蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズと、該金属ナノシェルに抱合された捕捉プローブとを具備してなり、該捕捉プローブが前記標的と相互作用することができ、該システムが該試料中の標的の検出を示唆する検出可能な信号を生じさせることができ、この検出可能な信号が、前記標的に結合された捕捉プローブを有するバーコードからの第1の信号と、前記標的に結合された二次プローブからの第2の信号とからなるものである。
他の実施例として、本発明は、単一試料中の対象の多重標的を同時に検出するためのマルチプレックス検出システムを提供するものである。この本発明のマルチプレックス検出システムは、１具体例として、複数のバーコードを含み、それぞれのバーコードが、(i)蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズと、(ii)対象とする多重標的の１つと相互作用し得るバーコードの表面に抱合された１つの捕捉プローブとを具備してなり、前記の複数のバーコードが対象とする多重標的の夫々のための少なくとも１つのバーコードを有し、前記の複数の金属ナノシェル-バーコードが前記の対象とする多重標的のそれぞれについての異なる標的特異的信号を生じさせ得るものであり、該標的特異的信号のそれぞれが、対象の特定の標的と相互作用する捕捉プローブを有するバーコードからの第１の信号と、対象の特定の標的に抱合された二次プローブからの第2の信号とを有するものである。
１実施例として、前記の検出システム又はマルチプレックス検出システムは、本発明の金属ナノシェル被覆バーコードと、無線通信装置（例えば、コンピュータ、携帯電話、タブレットおよび時計）とを組み合わせ、試料中の多重の有機質又は無機質標的を同時に検出することを可能にするものでもよい。本発明のこの無線マルチプレックス検出システムは、マルチプレックス検出システムからの検出可能な信号を画像化するカメラを備えた無線通信装置を用いて多重の標的の検出および定量的分析を可能にするものである。本発明のシステムおよび方法におけるこのワイヤレス機能は、これらを遠隔設定での使用を可能にし、解釈のためデータの無線通信を可能にし、標的の広がりのマッピングおよび監視を可能にするものである。この無線通信装置はバーコードからの信号の収集手段、収集された信号を送信する手段、又はこれら双方の手段を含むものであってもよい。
利点：
本発明のナノシェル被覆バーコードは、以下に更に例示したように、異なる生物学的環境において実質的な蛍光安定性および一致性（コンシステンシー）を有し(図２参照)、優れた貯蔵寿命を有し(図１３、１４参照)、捕捉プローブと容易に抱合し(図３および表２参照)、対象の有機質又は無機質の標的のためのマルチプレックス検出システムとして有用である(図４参照)。
本発明のナノシェル被覆バーコードの他の利点として以下のことが言える。すなわち、(a) マイクロビーズの直径、QDｓの蛍光および金属ナノシェルの厚みは調節可能である。(b)本発明のバーコードの蛍光は、広範なpH領域、バッファーおよび温度条件のもとで実質的にすぐれたコンシステンシーを示す。これらのパラメータについての制御はバーコード信号のコンシステンシーの改良につながるものである。(c) 金属ナノシェル被覆マイクロビーズを使用することにより遺伝子標的を検出するための分析感度において約２桁の増加が非被覆マイクロビーズとの比較において観察された。その分析プロセスは簡単で信頼性があり比較的迅速である。この検出感度は、信号増幅機構を備えた他のビーズベースの検出プラットホームに匹敵し得るものである[29,30]。(d) マイクロビーズはすぐれたバーコードパフォーマンスを伴った多重（マルチプレックス）検出が可能である。本発明者により、このバーコードが致命度の小さいマラリア種（例えば、Plasmodium vivax）から潜在的に致命的なPlasmodium falciparumマラリア病原体を区別するのに使用し得ることが示された。これらの利点は、このプラットホームが広範な分野において超高感度で高処理能力の多重感知装置的用途において理想的な候補となり得ることを示している。
本発明が更に理解されるよう、以下に実施例を示す。これらの実施例は説明だけを目的とするものであり、如何なる意味おいても、それらは本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
実験手順
QDの合成：
トリ-n-オクチルフォスフィンオキシド（TOPO）ZnSでキャップされたCdSe QDｓを合成し、公知の手法に基づいて特徴づけ[31]、クロロホルム中にて貯蔵した。QDｓの量子収量は、バッチにもよるが、0.2ないし0.4の範囲であった。
QD表面でのリガンドの交換：
TOPO被覆QDｓのクロロホルム溶液を静かな気流により蒸発させた。アミノ末端ポリスチレンポリマー(Mn=5000、ポリマー源からのもの）およびQDｓ（モル比=1000:1）をトルエン中に溶解させ、60℃で一晩培養させた。メタノールを添加することによりポリスチレン被覆QDｓを沈降させ、ビーズ合成のためクロロホルム中に再懸濁させた。
QDバーコードの合成：
先のレポート[32]から改良された濃度制御フローフォーカシング（focusing）(CCFF)技法によりQDバーコードを合成した。ポリスチレン被覆QDｓをポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）ポリマー単独(4％、w/v)と、あるいはポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）(2％)-ポリスチレン(2％)混合ポリマーとクロロホルム中で混合させた。この溶液を、0.2μmPTFEフィルターを介してろ過し、ついでシリンジポンプ（World Precision Instrument社）を用いてカスタマイズされたノズルシステム（Ingeniatrics社）中に1.2mL/hourの割合で注入すると共に、同時にデジタルギアポンプ（Cole Parmer Instrument社）を用いて集束（フォーカシング）流体（水）を180mL/hourの割合で注入した。前記ノズルの底部は水中に浸した。合成後、QDバーコードを一晩攪拌することにより硬化させ、遠心分離により収集した。バーコードのサイズおよび濃度はVi-Cell分析機（Beckman Coulter社）によって判定した。
バーコード表面上の金属ナノシェルの成長：
百万のQDバーコードを、100μLのEDC(pH=6.5のMESバッファー中20mg/mL, 50mM)および30μLのシスタミン(MESバッファー中50mM)を用いて室温で4時間培養した。5,000Gでの遠心分離を5分間繰り返すことにより、過剰のシスタミンを水中に洗い流した。チオール化したビーズを銀又は金ナノ粒子（平均粒径＝10nm、Nanocomposix社からのもの１mMクエン酸塩中100nMの100μL）を用い、室温で一晩培養させた。この金属ナノ粒子は、金属成長のための核形成部位として作用した。ついで、バーコードを、500Gでの遠心分離を5分間繰り返すことにより、水中（0.05%のTWEEN-20を含む）で洗浄した。銀又は金を播種したバーコードをそれぞれ50μLの硝酸銀又は塩化金（1mM）およびハイドロキノン（1mM）中で2時間まで再懸濁させ、ついで100Gでの遠心分離を5分間繰り返すことにより、水中（0.05%のTWEEN-20を含む）で洗浄した。この金属ナノシェル被覆バーコードを水中に4℃で貯蔵した。
走査電子顕微鏡（SEM）による画像化：
金属ナノシェル被覆バーコードをカーボンフィルム被覆グリッド(300メッシュ、Ted Pella社からのもの)上の滴下し、ついでHitachi S-5200 SEMを用い2.0kＶで画像化した。
DNAプローブによるバーコード表面の官能化：
DNAプローブによるバーコード表面の官能化の手法を発行レポート[33]から改良した。百万のビーズを50μLのチオール化捕捉プローブ(0.9Mの塩化ナトリウムを含むPBST中30μM)を用い室温で2時間培養した。バーコードを、100Gでの遠心分離を5分間繰り返すことにより、水中（0.05%のTWEEN-20を含む）で洗浄した。非被覆ビーズについては、抱合条件を前もって最適化した[34]。百万の被覆ビーズを、アミノ化捕捉プローブ（銀ナノシェル被覆バーコードについて使用したチオール化捕捉プローブの場合と同じ量）およびEDC(pH=5.0、100μLのMESバッファー中10mg, 100mM)を用いて一晩室温で培養した。ついで、このバーコードを、5,000Gでの遠心分離を5分間繰り返すことにより水中で洗浄した。ビーズ上の捕捉プローブの量は、抱合および遠心分離後の上澄み中の残留DNAを測定し、それを捕捉プローブの総量から引くことにより計算した。この抱合プロセスの間においては、同量の捕捉プローブを、非被覆および銀ナノシェル被覆ビーズについて使用した。ビーズ一つ当りの捕捉プローブの量を表２に示す。
DNA分析：
各試料について、約5000のマイクロビーズを、標的DNAストランド（鎖）およびAlexa647−標識二次プローブの異なる濃度を用い、最終量が20μLのハイブリッド化バッファー（Sigma社からの5X SSCバッファー）中で培養した。レポータープローブの量は、この分析における最大目標量に対し100倍のモル過剰であった。この反応はHL-2000 HybriLinker ハイブリッド化用オーブン（UVP）中で温度40℃で20分間行い、ついで96-ウエルの0.45μmフィルタープレート（Millipore社）を介して洗浄した。ついで、このマイクロビーズをPBST中で再懸濁させ、フローサイトメーター（BD Bioscience社）を用いて分析した。
DNAストランドの配列：
DNAストランド（鎖）をIDT又はBio Basicを用いて合成した。
Figure 2016507067
結果：
金属ナノシェル被覆バーコードの蛍光強度：
本発明の金属被覆QDバーコードの蛍光強度は、広視野顕微鏡下で明確さを維持するものであった。更に、制御された厚みを有する金属ナノシェルはQDｓのバーコード容量に実質的な悪影響を与えないことが示された。本発明のQDマイクロビーズの蛍光強度はシェル厚の増加に伴って減少した（図１J参照）。なぜならば、光子（フォトン）は、より厚いシェルを有するマイクロビーズ中を浸透、透過することは、より困難となるからである。
図７，８および９に示すように、金属ナノシェルの厚みの増加に関連する蛍光の減少は単一並びに混合ポリマーバーコードにおいて同様であり、異なる発光QDｓを有するバーコードについても同様であった。図７は混合ポリマーQDバーコードの蛍光強度に対する銀ナノシェルの厚みの作用を示すグラフ図である。図１Jと同様に、銀ナノシェルを混合ポリマーからなるバーコード上に時間を異ならせて成長させ、フローサイトメトリーにより測定した。非被覆ビーズの蛍光強度の中央値を100％に正規化させた。
図８は、（A）QD600バーコードの蛍光強度並びに（B）前方散乱に対する銀ナノシェルの成長時間の作用を示すグラフ図である。銀ナノシェルを、QD600を有するマイクロビーズ上に時間を異ならせて成長させ、フローサイトメトリーにより測定した。非被覆ビーズの蛍光強度ならび前方散乱（FSC）値の中央値をそれぞれ100％に正規化させた。この銀ナノシェルはQD600バーコードの蛍光強度を、図１１(パネルA)のQD555バーコードと同様にして、減少させた。FSC値は成長時間につれて増大し、銀ナノシェルにより付加されたマイクロビーズの径の増大を反映させるものであった（図８B）。
図９は、銀ナノシェル成長の間におけるQDバーコードの(A)蛍光スペクトルおよび(B)吸光度スペクトルを示すグラフ図である。同じ試料の蛍光スペクトルを、銀ナノシェル成長の間に蛍光光度計で記録した。その励起波長は450nmに設定した。QDバーコードの発光ピークは銀ナノシェルの成長時間全体に亘って555nmで一定であった（図９A）。同じ試料の吸光度も分光計で記録した（図９B）。
図９に示すように、この金属ナノシェルはQDバーコードの蛍光強度を減少させるのみで、それらの発光波長をシフトさせるものではなかった。従って、実際の応用においては、このナノシェルの厚みは、蛍光が励起され、カメラ又は光検出器により捕捉されるように制御することができる。これはバーコードの正しい同定を可能にすることになる。QDバーコードの数を増加するために、異なる厚みのシェルを使用することもできる。なぜならば、その厚みは蛍光強度に影響を与えるからである。
図１１は、(A)QDバーコードの蛍光強度に対する並びに(B) QDバーコードの前方散乱に対する金ナノシェル成長時間の作用効果を示すグラフ図を含む。図１１のケースにおいては、QDバーコードは金（Au）ナノシェルで異なる時間に亘って被覆され、フローサイトメトリーにより測定された。非被覆ビーズの蛍光強度ならびFSC値の中央値をそれぞれ100％に正規化させた。その結果は銀ナノシェルで得られたものと同様であった。銀ナノ粒子が約420nmを吸収するという事実は、二次蛍光体の比較的大きい選択を提供するものとなる。
金属ナノシェル被覆バーコードの蛍光安定性：
図１２は、単一ポリマーおよび混合ポリマーから作られた非被覆QDバーコードの異なる環境条件下： pH(図１２A);バッファ（緩衝剤）(図12B)；温度(図１２C)での蛍光安定性を示すグラフ図を示している。pH=7、水および25℃でのマイクロビーズの蛍光強度の中央値を各条件について別々に100％に正規化させた。図１２に示すように、２つの組成物のバーコード蛍光はこれらの条件において同様の傾向を示した。
非被覆単一ポリマーQDバーコードを銀ナノシェル被覆単一および混合ポリマーバーコードと比較した。非被覆混合ポリマーバーコードは比較しなかった。なぜならば、先に示したように、そのポリマー組成物が、それらの貯蔵寿命に有意に悪影響を及ぼすものでないからである(図12参照)。図２は異なる組成から作られたQDマイクロビーズの蛍光安定性を示すものである。この銀ナノシェルは厚みが20-30nmであった。マイクロビーズを、pH=4ないし11で24時間（a-c）、又は水中、HEPES(pH=7)、TE (pH=8)、PBS(pH=7)およびSSC(pH=7)緩衝液中で24時間（d-f）、又、25℃ないし95℃で20分間（g-i）培養した。マイクロビーズの蛍光強度の中央値は処理後フローサイトメトリーにより測定した。各条件において、pH=7、水および25℃でのマイクロビーズの強度値を100％に変換し、他のグループはそれに応じて正規化した。図２に示すように、非被覆単一ポリマービーズの蛍光は、８を越えるpH、100mMを超える塩濃度を有する緩衝液および40℃を超える温度で劇的に降下した（図2a,2d,2g）。非被覆ビーズと比較して、銀ナノシェルは、テストした緩衝液および温度条件のもとでは、単一および混合ポリマーマイクロビーズの双方について蛍光安定性が有意に改善された。
金属ナノシェル被覆バーコードの貯蔵寿命：
マイクロビーズを、pH=4ないし11で24時間（図１３、a-c）、又は水中、HEPES(pH=7)、TE (pH=8)、PBS(pH=7)およびSSC(pH=7)緩衝液中で24時間（図１３、d-f）、又、25℃ないし95℃で20分間（図１３、g-i）培養した。これらの試料は図２におけるものと同じ試料であった。異なる条件下での無傷のビーズの数を、フローサイトメトリーにおける前方散乱(FSC)-側方散乱(SSC)プロットにより判定し、上述のようにまとめた（図１４）。各条件において、pH=7、水および25℃での無傷のマイクロビーズの数を100％に変換し、他のグループはそれに応じて正規化した。結果は、図１３および１４に示されている。
前記前方散乱および側方散乱プロットは、アルカリ性、高いイオン強度、高温条件のもとでは非被覆ビーズは容易に劣化することを示唆している(図１４)。銀ナノシェルを有するマイクロビーズはこれらの条件下でも無傷を維持した。図１４は非被覆単一ポリマービーズがpH=11で劇的に劣化したことを示している。銀ナノシェル被覆混合ポリマーバーコードにおいては、全てのpHにおいて明らかなシフトは見られなかった。緩衝液および温度におけるマイクロビーズのプロットは上述のものと同様の結果を示した。銀ナノシェル被覆単一ポリマービーズは無傷であったが、それらの蛍光は高いpHにおいて変化した（図２ｂ）。銀ナノシェルを有する混合ポリマーで作られたビーズは、4ないし11のpH、全ての緩衝液および70℃までの温度において最適の適合性を実証しているように見える（図２c, f, i）。このマイクロビーズ内の特異な層分離領域は水性イオンをQDｓとの接触および相互作用から防止するものであった。従って、銀ナノシェルおよび混合ポリマーの双方は、良好な蛍光安定性およびQDバーコードのビーズ構造を達成するのに重要であると思われる。
図１５に示すように、金ナノシェル（約50nmの厚み）銀ナノシェルの場合と同様に、バーコードに対し同様の保護作用を付与することが実証された。双方のビーズは単一ポリマーから作られたものであった。
金属ナノシェル被覆バーコードの用途：
本発明の金属ナノシェル被覆バーコードは、捕捉プローブを金属ナノシェルの表面に抱合させることにより官能化させることができる。
本発明者は、非被覆マイクロビーズと、銀ナノシェル被覆マイクロビーズとを、検出分析における分析パーフォーマンスについて比較した。マルチプレックス実験で使用した陽性対照DNAストランド（鎖）（cggcgatgaatacctagcacacttactaggccgccgatattgg）を、モデル標的として選択した。非被覆QD555ビーズを、カーボジイミドカップリング剤により標的ストランド（鎖）（aaaaaaaaaccaatatcggcggcc）のアミノ化捕捉プローブと抱合させた。この抱合条件は先の研究[16,17]に沿って最適化した。簡単に述べると、百万の非被覆ビーズを、10mgのEDCおよび28ピコモルの捕捉プローブを含む100μLのMESバッファー（(pH=6.5、50mM）中にて一晩培養した。銀ナノシェル被覆ビーズをチオール化捕捉プローブで官能化した。抱合のための捕捉プローブの量は非被覆バーコードと、銀ナノシェル被覆QDバーコードとの間で一定に保った。ついで、この標的ストランドを、並行して行なった双方のタイプのビーズを用い、サンドイッチ分析法により測定した（図３A）。このサンドイッチ分析法は、バーコード上の捕捉プローブおよび二次プローブの双方に対する標的の結合を指すものである。この分積の間の、非被覆物を除去するための洗浄工程の後（バーコードは、その表面への捕捉プローブの抱合の後に洗浄してもよいし、捕捉プローブを有するバーコードを標的で培養させた後に洗浄してもよいし、バーコードと標的との複合体を二次プローブで培養してから洗浄してもよい）、これらバーコードおよび二次プローブの双方からの信号の存在は標的の成功裡の捕捉を示唆するものである。
銀ナノシェル被覆ビーズは、3アトモルの検出限界を示した。これは非被覆ビーズとの対比において2桁の改善であった（図３B参照）。この検出感度は、何らの信号増幅を用いることなく、1-ステップ20-分サンドイッチ分析法により達成された。これらの知見はマイクロビーズ表面上の金属ナノシェルが、バイオセンシングの検出感度を有意に改善することを実証する第1の結果である。信号向上に寄与する幾つかの潜在的機序が見られた。第1に、各銀ナノシェル被覆ビーズ上には、非被覆ビーズよりも約3倍の捕捉プローブが存在していた（表２参照）。その結果、標的ストランド（鎖）は銀ナノシェル被覆バーコードにより捕捉されるチャンスがより高いものとなる。このビーズ表面上の捕捉プローブの量の増加は、検出感度における総体的増加を十分に説明し得るものでないことは明らかである。１つの機構は、銀ナノシェルの表面が若干粗面化していることである。非被覆ビーズについては、本発明者は捕捉プローブの立体作用が分析感度を影響を与えたことを見出している[16]。従って、粗面上の捕捉プローブは若干乱れる傾向を示し、これが標的分子と捕捉プローブとの間の立体的相互作用を小さくしてしまう。更に本発明者は、非被覆ビーズが種々の条件下で可なり分解し、それが分析信号を減少させることを見出した。図２に示す結果と合致して、銀ナノシェルは、分析条件下でのバーコード安定性を増加するものであった。これは分析パーフォーマンスの改善に寄与するものとなる。非被覆ビーズは更に、銀ナノシェル被覆ビーズと比較して二次プローブの高いレベルの非特異的結合を示し、これは、より高いバックグラウンド信号および検出感度の減少につながるものであった（図３）。他の可能性のある要因は、銀ナノシェルによるレポータ蛍光体の蛍光作用の金属による向上である。銀ナノシェルは蛍光体の蛍光強度を距離-および厚み-依存的に向上させることができる[18, 19]。Alexa647、実施例の分析で使用された二次蛍光プローブについては、強い金属強化蛍光が、10ないし150nmの厚み/直径の銀ナノ粒子から15ないし50nm離れた位置で起生された[20、21]。ここに記載の設計では、Alexa647と銀ナノシェルとの間の距離は、捕捉プローブおよびレポータープローブの長さに基づいて約25nmであり（表１において入手可能な配列）、これは金属強化蛍光の範囲内である。前記の要因および未知の要因の組合せが検出感度の最終的向上につながったものと思われる。
マルチプレックス検出システム：
本発明者は更に、Plasmodium falciparum(マラリアの潜在的に致命的な種)の他の非致命的マラリア種からの分化のための4-プレックスDNA分析の実行によるマルチプレックス検出において、本発明の金属ナノシェル被覆QDバーコードの実用的応用を実証した。
毎年、百万人以上の人がマラリア感染により死亡している[22、23]。人間にマラリアを発症させる4種類の寄生虫が存在している。つまり、P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaeである。潜在的に致命的なP. falciparumを他の種から示差的に識別することができるということは、患者の正しい医療処置や薬剤耐性減少のために重要である。
P. falciparumを他のマラリア種から検出するため、捕捉プローブを、P. falciparumおよび P. vivaxの18S rRNA遺伝子の遺伝的に保存された領域に基づいて設計した[24、25]。更に、Alexa647-ラベルの配列を二次プローブとして使用した。陰性および陽性対照ストランドも設計した（DNA配列は表１から得ることができる）。4つの異なる蛍光シグネチャの銀ナノシェル被覆QDバーコードを、各標的のためチオール化捕捉プローブで官能化させた[26]。
P. falciparumおよび P. vivaxの容量応答曲線が図４aおよび図４ｂに示されている。双方の標的ストランドは、それらの濃度と分析信号との間で良好な直線性を示した。P. vivaxの信号強度はP. falciparumのものよりも約10倍高かった。本発明者により、同様の差異が他の研究においても同じく観察された[16]。これらストランドの内での分析信号の差はDNAの配列に関連する。なぜならば、ヌクレオチドの組成は溶融温度および結合親和性に影響を及ぼし分析（アッセイ）効率のバラツキにつながるからである。異なるDNA標的は異なる分析信号強度を示した。これは捕捉プローブの二次構造、標的ストランドおよび抱合効率の差により生じたものである。これら標的ストランドの中での交差反応性を調査するため、5つの異なる模擬遺伝子試料を、標的ストランド＋陽性対照ストランドの異なる組合せを混合させることにより作成した(10フェムトモル)。全ての陰性グループに示すように、銀ナノシェル被覆ビーズに対するレポータープローブの非特異的結合は無視できる程度であった。標的ストランドは互いに他の信号に影響をもたらすものではなかった。これはストランド間に交差反応性がないことを示唆するものである（図4c）。これらの結果は、単一反応用バイアル中で、マラリア寄生虫の異なるマラリアストレイン（菌株）を区別することのできるというこれらのバーコードの能力を明らかに実証している。マラリア種を区別するための現行のゴールドスタンダード法は、プロテインバイオマーカーを使用する側流分析法である[27]。この臨床的に承認された技法は、P. falciparumおよび高い寄生虫血症（すなわち、血液中の負荷）での他のマラリア種を検出することしかできず、低い寄生虫血症での感染においては信頼性が可なり小さいものである[28]。PCR診断技法は、側流分析法よりも分析感度が良好であり、マラリア種を区別することができるが、PCRは現場設定又は遠隔設定での使用は困難である。本発明の金属ナノシェル被覆バーコードの分析感度はPCRのものに近いが、ビーズ分析を容易に自動化することができ、顕微鏡、蛍光光度計およびフローサイトメトリーを使用して検出することができる。それ故、このビーズ分析はPCRと比較して現場での使用可能性を可なり大きい。
本発明者は更に、一般的に金属ナノシェルが分析パーフォーマンスを向上させるか否かについて研究した。図１６に示すように、金および銀ナノシェル（〜3ミクロンのビーズ上の厚み〜50nm）をバーコード上に形成した。この双方のナノシェルは、非被覆バーコードとの比較において分析パーフォーマンスを向上させ、銀ナノシェルは金ナノシェルよりも良好な信号を示した。図１７Aはこのマルチプレックス分析において使用された4-プレックスバーコードの蛍光スペクトルを示している。QD540およびQD580を、4-プレックスバーコードを作成するために使用し、それらの発光スペクトルが図１７Bに示されている。これらのバーコードはフローサイトメトリープロットにおいて独特な蛍光強度分布を示した（図１７C）。その横軸はFITCチャンネル(525nm)強度である。縦軸はPEチャンネル(575nm)強度である。バーコード１(B1)およびバーコード４(B4)はそれぞれ陰性および陽性対照である。B2およびB3はそれぞれP. vivaxおよびP. falciparumを示している。我々はビーズ表面上のDNA捕捉プローブの密度を測定した。表２に示すように、銀ナノシェル被覆バーコードは非被覆バーコードよりも有意に高いDNA密度を示した。図１８は非被覆ビーズおよび銀ナノシェル被覆ビーズ上の捕捉プローブの量を示す表である。
Figure 2016507067
ここに示したのは、ナノシェル被覆QDバーコードおよび金属ナノシェル被覆QDバーコードの合成方法である。マイクロビーズの直径、QDｓの蛍光および金属ナノシェルの厚みは大きく調整可能である。本発明のQDバーコードの蛍光は、非被覆ビーズと比較して、広範囲のpH、緩衝剤および温度条件下でより大きい一貫性（コンシステンシー）を示す。これによりバーコード信号の一貫性が改善する。本発明者は、金属ナノシェル被覆マイクロビーズを使用することにより、遺伝子標的を検出する際の分析感度を、非被覆ビーズと比較して、少なくとも2桁増加させ得ることを実証した。その分析プロセスは非常に単純であり、信頼性があり、迅速であり、その検出感度は、信号増幅メカニズムを伴う他のビーズベースの検出プラットホームに匹敵するものである[29，30]。最後に、このような複合マイクロビーズがすぐれたバーコードパーフォーマンスを以ってマルチプレックス検出を実行し得ることが、ここに示されている。本発明のバーコードは、潜在的に致命的なP. falciparumマラリア病原体を他のマラリア種から区別することができた。これらの利点は、広範な分野において、超高感度、高処理量のマルチプレックス感知装置としての応用への理想的な候補にさせるものである。
本明細書で引用した優先権文献、全ての刊行物および特許出願は、あたかも、個々の刊行物および特許出願が具体的に、個々に参照として組み込まれているかのようにして、参考としてここに組み込まれている。前述の発明は、理解を明確にする目的で説明および実施例として詳述されているが、本発明の教示にてらして或る種の変更および改良を、添付の特許請求の範囲の精神又は範疇から逸脱することなく、行なうことができることは当業者にとって自明であろう。

Claims (66)

  1. バーコードであって、蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズを具備してなることを特徴とするもの。
  2. 前記蛍光体が、有機質蛍光体、無機質蛍光体、又は有機および無機質蛍光体混合物を含む請求項１に記載のバーコード。
  3. 前記マイクロビーズが高分子マイクロビーズである請求項１に記載のバーコード。
  4. 前記マイクロビーズがポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体の単一ポリマーシステムを具備してなる請求項１に記載のバーコード。
  5. 前記マイクロビーズがポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との混合ポリマーシステムを具備してなる請求項１に記載のバーコード。
  6. 前記ポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との割合が約4:1ないし約1:1質量比の範囲である請求項５に記載のバーコード。
  7. 前記蛍光体が量子ドット（QDｓ）である請求項１に記載のバーコード。
  8. 前記マイクロビーズが高分子マイクロビーズである請求項７に記載のバーコード。
  9. 前記マイクロビーズがポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体の単一ポリマーシステムを具備してなる請求項７に記載のバーコード。
  10. 前記マイクロビーズがポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との混合ポリマーシステムを具備してなる請求項７に記載のバーコード。
  11. 前記ポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との割合が約４：１ないし約１：１質量比の範囲である請求項１０に記載のバーコード。
  12. 前記金属が銀および金から選択されるものである請求項１に記載のバーコード。
  13. 前記バーコードが前記金属ナノシェルに抱合された標的特異的捕捉プローブを更に有する請求項１に記載のバーコード。
  14. 前記標的が無機物質および有機物質を含む請求項１３に記載のバーコード。
  15. 前記有機物質として、単細胞生物および多細胞生物並びにそのあらゆる成分、ペプチド、プロテイン、オリゴ糖、脂質、遺伝子、核酸、アミノ酸が含まれ、前記無機物質として、金属原子を有する無機分子が含まれる請求項１４に記載のバーコード。
  16. 前記バーコードが、前記マイクロビーズの表面と前記金属ナノシェルとの間にプロテイン層を含む請求項１に記載のバーコード。
  17. 前記金属ナノシェルが、金属ナノシェルを有しないバーコードとの関連においてバーコードの貯蔵寿命を向上させるよう作動するものである請求項１に記載のバーコード。
  18. 前記金属ナノシェルが、金属ナノシェルを有しないバーコードとの関連においてバーコードの蛍光安定性を向上させるよう作動するものである請求項１に記載のバーコード。
  19. 前記金属ナノシェルが約20nmないし約80nmの厚みを有する請求項１に記載のバーコード。
  20. バーコードの表面に金属ナノシェルを成長させる方法であって、(a)前記バーコードを金属ナノ粒子と接触させる工程と、および(b)前記工程(a)で得られたバーコードを前記金属の塩と、バーコード上に前記金属ナノシェルが成長するのに十分な時間、混合させる工程とを具備してなることを特徴とする方法。
  21. 前記バーコードが蛍光体の1又はそれ以上の集団を有するマイクロビーズを含み、この蛍光体には有機質蛍光体、無機質蛍光体、又は有機および無機質蛍光体混合物が含まれる請求項２０に記載の方法。
  22. 前記マイクロビーズが高分子マイクロビーズである請求項２１に記載の方法。
  23. 前記マイクロビーズがポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体の単一ポリマーシステムを具備してなる請求項２１に記載の方法。
  24. 前記マイクロビーズがポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との混合ポリマーシステムを具備してなる請求項２１に記載の方法。
  25. 前記ポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との割合が約4:1ないし約1:1質量比の範囲である請求項２４に記載の方法。
  26. 前記蛍光体が量子ドット（QDｓ）である請求項２１に記載の方法。
  27. 前記マイクロビーズが高分子マイクロビーズである請求項２６に記載の方法。
  28. 前記マイクロビーズがポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体の単一ポリマーシステムを具備してなる請求項２６に記載の方法。
  29. 前記マイクロビーズがポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との混合ポリマーシステムを具備してなる請求項２６に記載の方法。
  30. 前記ポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との割合が約4:1ないし約1:1質量比の範囲である請求項２９に記載の方法。
  31. 前記金属が銀および金から選択されるものである請求項２０に記載の方法。
  32. 前記金属ナノシェルに対し捕捉プローブを抱合させることにより前記金属ナノシェル被覆バーコードを官能化させることを更に含み、ここで該捕捉プローブは標的と相互作用し得るものである請求項２０に記載の方法。
  33. 前記標的として無機物質および有機物質を含む請求項３２に記載の方法。
  34. 前記有機物質として、単細胞生物および多細胞生物並びにそのあらゆる成分、ペプチド、プロテイン、オリゴ糖、脂質、遺伝子、核酸、アミノ酸が含まれ、前記無機物質として、金属原子を有する無機分子が含まれる請求項３３に記載の方法。
  35. 前記バーコードを前記金属ナノ粒子と接触させる前に、該バーコード上にプロテイン層を添加する工程を更に含む請求項２０に記載の方法。
  36. 前記工程(b)の時間が、前記金属ナノシェルの予め選択された厚みに相当するまで金属ナノシェルを成長させるのに要する時間である請求項２０に記載の方法。
  37. 前記の金属ナノシェルを成長させるのに要する時間が、金属ナノシェルの厚みと、金属ナノシェルの成長時間とを対比する標準曲線から選択されるものである請求項３６に記載の方法。
  38. 試料中の標的を検出するための検出システムであって、複数のバーコードを含み、それぞれのバーコードが蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズと、該金属ナノシェルに抱合された捕捉プローブとを具備してなり、該捕捉プローブが前記標的と相互作用することができ、該システムが該試料中の標的の検出を示唆する検出可能な信号を生じさせることができ、この検出可能な信号が、前記標的に結合された捕捉プローブを有するバーコードからの第1の信号と、前記標的に結合された二次プローブからの第2の信号とを含むものであることを特徴とする検出システム。
  39. 更に無線通信装置を含み、この無線通信装置が複数のバーコードおよび二次プローブからの検出可能な信号を収集するための手段を有する請求項３８に記載の検出システム。
  40. 前記無線通信装置が更に前記の複数のバーコードおよび二次プローブから収集された信号を分析するための1つ又は双方の手段と、この収集された信号を遠隔分析のため送信する手段とを有する請求項３９に記載の検出システム。
  41. 前記試料が生物学的試料又は非生物学的試料である請求項３８に記載の検出システム。
  42. 単一試料中の対象の多重標的を同時に検出するためのマルチプレックス検出システムであって、複数のバーコードを含み、それぞれのバーコードが、(i)蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズと、(ii)対象とする多重標的の１つと相互作用し得るバーコードの表面に抱合された１つの捕捉プローブとを具備してなり、前記の複数のバーコードが対象とする多重標的の夫々のための少なくとも１つのバーコードを有し、前記の複数の金属ナノシェル-バーコードが前記の対象とする多重標的のそれぞれについての異なる標的特異的信号を生じさせ得るものであり、該標的特異的信号のそれぞれが、対象の特定の標的と相互作用する捕捉プローブを有するバーコードからの第1の信号と、対象の特定の標的に抱合された二次プローブからの第2の信号とを有するものであることを特徴とするマルチプレックス検出システム。
  43. 更に二次プローブ信号を含み、この二次プローブ信号がバーコード捕捉プローブによる標的の成功裡の捕捉を示唆するものである請求項４２に記載のマルチプレックス検出システム。
  44. 更に無線通信装置を含み、この無線通信装置が複数のバーコードからの第1の信号および二次プローブ信号からの第2の信号を収集するための手段を有する請求項４２に記載のマルチプレックス検出システム。
  45. 前記無線通信装置が更に前記の複数のバーコードおよび二次プローブから収集された信号を分析するための1つ又は双方の手段と、この収集された信号を遠隔分析のため送信する手段とを有する請求項４４に記載のマルチプレックス検出システム。
  46. 前記試料が生物学的試料又は非生物学的試料である請求項４２に記載のマルチプレックス検出システム。
  47. 試料中の対象の標的を検出するための方法であって、試料を、(a)複数のバーコードおよび(b)二次プローブと接触させるものであって、夫々のバーコードが蛍光体の1又はそれ以上の集団を有する金属ナノシェル被覆マイクロビーズと、金属ナノシェルに抱合された１つの捕捉プローブとを具備してなり、該捕捉プローブが対象の標的と相互作用することができるものであり、バーコードの夫々が標的特異的信号を発信できるものであり、前記二次プローブが対象の標的と相互作用し得ると共に二次プローブ信号を発信し得るものであり、ここで前記バーコード信号と前記二次プローブ信号の存在は試料中の標的の検出を示唆させるものであることを特徴とする方法。
  48. 前記バーコードが蛍光体の1又はそれ以上の集団を有するマイクロビーズを含み、この蛍光体には有機質蛍光体、無機質蛍光体、又は有機および無機質蛍光体混合物が含まれる請求項４７に記載の方法。
  49. 前記マイクロビーズが高分子マイクロビーズである請求項４７に記載の方法。
  50. 前記マイクロビーズがポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体の単一ポリマーシステムを具備してなる請求項４７に記載の方法。
  51. 前記マイクロビーズがポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との混合ポリマーシステムを具備してなる請求項４７に記載の方法。
  52. 前記ポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との割合が約4:1ないし約1:1質量比の範囲である請求項５１に記載の方法。
  53. 前記蛍光体が量子ドット（QDｓ）である請求項４７に記載の方法。
  54. 前記マイクロビーズが高分子マイクロビーズである請求項５３に記載の方法。
  55. 前記マイクロビーズがポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体の単一ポリマーシステムを具備してなる請求項５３に記載の方法。
  56. 前記マイクロビーズがポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との混合ポリマーシステムを具備してなる請求項５３に記載の方法。
  57. 前記ポリスチレンと、ポリ（スチレン-コ-無水マレイン酸）若しくは、その類似体又は誘導体との割合が約4:1ないし約1:1質量比の範囲である請求項５３に記載の方法。
  58. 前記金属が銀および金から選択されるものである請求項４７に記載の方法。
  59. 前記標的として無機物質および有機物質を含む請求項４７に記載の方法。
  60. 前記有機物質として、単細胞生物および多細胞生物並びにそのあらゆる成分、ペプチド、プロテイン、オリゴ糖、脂質、遺伝子、核酸、アミノ酸が含まれ、前記無機物質として、金属原子を有する無機分子が含まれる請求項５９に記載の方法。
  61. 前記バーコードが、前記マイクロビーズ表面と、前記金属ナノシェルとの間にプロテイン層を有する請求項４７に記載の方法。
  62. 前記金属ナノシェルが約20nmないし約80nmの厚みを有する請求項４７に記載の方法。
  63. 前記試料が生物学的試料又は非生物学的試料である請求項４７に記載の方法。
  64. 前記生物学的試料がヒトから採取されたものである請求項４７に記載の方法。
  65. 前記生物学的試料がヒト以外の組織から採取されたものである請求項４７に記載の方法。
  66. 前記試料が環境試料である請求項４７に記載の方法。
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