KR20230042891A

KR20230042891A - 신규한 다층형 형광-sers 이중방식 나노프로브

Info

Publication number: KR20230042891A
Application number: KR1020210125696A
Authority: KR
Inventors: 정대홍; 손원기; 차명근; 전봉현
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2023-03-30

Abstract

본 발명은 실리카 쉘을 사이에 두고 라만 표지 화합물(RLC)과 양자점(QD)이 각각 도입된 다층형 이중방식 나노프로브; 및 이를 이용하여 시료 내 표적 물질에 대한 형광 및 라만 신호를 동시에 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 RCL과 QD의 다양한 조합을 통해 총 45종의 나노프로브가 각각 상응하는 45개의 스펙트럼을 생성함으로써 선형 판별 분석(LDA)을 비롯한 종래 기술과 비교하여 비약적으로 향상된 인코딩 능력과 민감성을 가진 신뢰도 높은 진단용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 수득된 이중방식 스텍트럼 신호를 학습 알고리즘을 통해 바코드로 전환함으로써 고처리(high-throughput) 형광-SERS 분석에서의 대량의 분석 결과를 신속하게 판독할 수 있다.

Description

신규한 다층형 형광-SERS 이중방식 나노프로브{Novel Multi-layer Dual-Modal Fluorescence-SERS Nanoprobes}

본 발명은 다양한 조합의 라만 표지 화합물 및 양자점이 도입되어 다수의 상이한 구조를 가짐으로써 인코딩 능력이 비약적으로 향상된 이중방식 나노프로브에 관한 것이다.

다중 고처리 스크리닝 기술을 이용한 단일 분석은 시료에 대한 풍부한 정보를 제공한다. 빠른 속도, 높은 민감성 및 신뢰도로 인해 인코딩된 나노입자를 다중 고처리 스크리닝에 사용하려는 시도가 있어왔는데, 인코딩된 입자를 제조하기 위해 형태, 조성 및 광학소자 패턴을 포함하는 내부 표준 라벨링에 기반한 몇몇 전략이 시도되고 있다. 이들 중, 인코딩된 나노입자를 사용하는 표면증강 라만 산란(SERS)-소위 SERS-기반 나노프로브-가 유망한 전략이 되고 있다. SERS-기반 나노프로브는 고유의 분자 지문을 가지는 시각적으로 무한한 코드를 제공하므로 분석대상 검출을 위한 다중 생물분자로서의 잠재력을 가진다. SERS-기반 나노프로브는 또한 매우 민감하고 광표백(photobleaching)에 대한 저항성을 가진다. 이러한 특성들로 인해, 다양한 형태의 SERS-기반 나노프로브가 면역 어세이, 인 비트로 또는 인 비보 분자 이미징 및 광학 인코딩 시스템 등의 다양한 용도에 적용되고 있다. 인코딩 능력을 증가시키고 검출 효율을 향상시키기 위해, SERS-기반 나노프로브를 광음향 영상, 자기공명영상 및 형광 영상과 같은 다른 광학 기술과 조합하는 방안이 연구되었다. 그러나, 종래에 개발된 SERS-기반 나노프로브는 복수의 분석 대상을 검출하는 데에 한계가 있었다. 효율적인 다중 고처리 스크리닝을 위해서는 적은 입자만으로도 충분히 강한 SERS 신호가 얻어져야 한다. 사용 가능한 구조들 중 실리카-코팅된 거친 은나노쉘(AgNS@SiO₂)은 금나노 구조보다 더 높은 SERS 강화 요인을 가질 뿐 아니라, 생체적합성으로 인해 인 비보 검출에 보다 적합하며, 높은 분산 안정성과 쉽게 변형될 수 있는 표면을 가진다. 그러나, 금속 표면에 높은 친화도를 가지는 몇몇 표지 화합물은 불안정성 및 응집을 유발하기 때문에, 나노입자의 실용적인 합성을 위해서는 제한된 수의 라벨링 화합물이 사용되는 것이 바람직하다. 불안정한 나노입자는 균일한 나노프로브 제작을 어렵게 만들기 때문에, 금속 나노입자 표면에 표지 화합물과 11-머캅토운데실산(MUA) 또는 (3-머캅토프로필)트리메톡시실란(MPTS)이 함께 흡착할 수 있는 보편적 SERS-기반 나노프로브를 개발하려는 시도가 있어왔다. 높은 표면 안정성을 부여하고 나노입자 응집을 막아 화학적 특성과 무관하게 어떠한 표지 화합물도 사용할 수 있다.

그러나, SERS 나노프로브가 가장 강력한 나노입자임에도 실용적인 코드의 수가 여전히 약 5-10 cm^-1의 내재적 라만 밴드 너비에 의해 제한되어 대부분의 다중 분석에 비-중첩 밴드가 필수적이다. 이러한 문제점은 SERS-기반 분석 시스템에서 다중 분석을 어렵게 한다. 이러한 문제를 극복하기 위해 다양한 분석 방법이 시도되었으며, 주성분 분석(PCA) 및 선형 판별 분석(LDA)과 같은 기계학습을 이용하는 다변량 분석 방법이 최근 주목받고 있다. PCA 및 LDA는 사전 분류 정보가 필요한지 여부에 따라 비지도 및 지도 방법으로 분류된다. 분석물의 수가 증가하면 효율이 감소하는 PCA와 달리 LDA는 라만 신호를 분석하는 우수한 방법으로, 충분한 트레이닝 데이터가 이용가능할 경우. 그러나, LDA 역시 혼합 스펙트럼의 구분에 한계가 있으며, 삼중 분석에 사용되기 전 LDA를 트레이닝하는 데에 다양한 조합의 라만 스펙트럼이 필요하다. 따라서, 다중 생물분자 동정은 적합한 분석 툴과 충분한 수의 민감하고, 안정적인 이중방식 형광-SERS 나노프로브가 조합되어야 가능하다.

특허문헌 1. 국제공개공보 WO 2014/124543호

본 발명자들은 분석대상 시료 내 다수의 표적 분자를 높은 신뢰도로 실시간으로 검출할 수 있는 효율적인 고처리(high-throughput) 다중분석기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 은(Ag) 등의 금속으로 개질된 실리카 나노입자 상에 층을 달리하여 다양한 라만 표지 화합물과 다양한 형광단을 각각 도입하면서 상기 라만 표지 화합물과 형광단 사이에 실리카 셸을 형성시킬 경우, 신호 간 퀀칭이 발생하지 않으면서도 다수의 구별되는 PL(photoluminescenc) 스펙트럼 및 SERS(surface-enhanced Raman scattering) 스펙트럼을 동시에 수득하여 복수의 표적 분자에 대한 정확한 동정이 가능함을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 다층형 이중방식 나노프로브 및 이를 이용한 시료 내 표적 물질에 대한 형광 및 라만 신호의 동시 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 다층형 이중방식 나노프로브를 제공한다:

(a) 실리카 코어 입자;

(b) 상기 실리카 코어 입자의 표면에 도입된 금속 개질층;

(c) 상기 금속 개질층에 도입된 라만 표지 화합물(Raman label compound, RLC);

(d) 상기 (a)-(c)를 포집(encapsulating)하는 실리카 쉘; 및

(e) 상기 실리카 쉘에 도입된 형광단(Fluorophore).

본 발명자들은 분석대상 시료 내 다수의 표적 분자를 높은 신뢰도로 실시간으로 검출할 수 있는 효율적인 고처리(high-throughput) 다중분석기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 은(Ag) 등의 금속으로 개질된 실리카 나노입자 상에 층을 달리하여 다양한 라만 표지 화합물과 다양한 형광단을 각각 도입하면서 상기 라만 표지 화합물과 형광단 사이에 실리카 셸을 형성시킬 경우, 신호 간 퀀칭이 발생하지 않으면서도 다수의 구별되는 PL(photoluminescenc) 스펙트럼 및 SERS(surface-enhanced Raman scattering) 스펙트럼을 동시에 수득함으로써 표적 분자의 보다 신속하고 정확한 동정이 가능함을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“프로브(probe)”는 시료 내 검출하고자 하는 분석물(analyte)과 특이적으로 결합하거나 상기 분석물이 발신하는 신호를 특이적으로 검출함으로써 시료 내 상기 분석물의 존재 여부에 대한 정보를 제공하는 물질을 의미한다.

용어“나노프로브(nanoprobe)”는 나노 수준의 직경을 가지는 복합체 또는 나노입자를 구성 성분으로 포함하는 프로브를 의미한다. 용어“나노입자”는 평균 직경(입경)이 1μm 미만, 구체적으로는 500 nm 미만, 보다 구체적으로는 350 nm 미만의 입자를 의미한다. 나노미터 수준의 직경을 가지는 나노입자는 벌크물질(bulk material)에 비해 미세한 질량과 현저히 증가된 표면적으로 인해 고유의 강도, 전도성, 촉매 활성, 광학적 특성, 자기 특성 등의 다양한 물리 화학적 특징을 가진다.

본 명세서에서 용어“다층형(multilayer) 나노프로브”란 상이한 성분으로 구성되면서 그 경계가 구분되는 복수의 층으로 이루어진 나노프로브 입자를 의미한다. 다층형 구조는 의미 상 복수의 층으로 이루어졌다면 적층형 다층 구조(laminated multilayer), 코어-셸형 다층구조(core-shell multilayer) 및 이들이 조합된 형태를 모두 포함하나, 본 명세서의 나노프로브를 언급하면서 사용되는 용어“다층형”구조는 내층과 외층을 가지는 코어-셸형 다층구조를 주로 의미한다.

본 명세서에서 용어“외층(outer layer)”은 코어-셸 구조의 내층(inner layer)을 둘러싸면서 내층보다 중심(core)에서 먼 층을 의미하며, 용어“내층(inner layer)”은 외층보다 중심(core)에 가까운 층을 의미한다.

본 명세서에서 용어“코어(core)”, “코어층(core layer)”또는“코어 입자(core particle)”는 코어-쉘 다층형 입자 내에서 다른 층과 접하고 있는 면이 하나 뿐인 최내각(innermost) 층 또는 이를 구성하는 입자를 의미한다.

실리카 코어 입자에 금속 입자를 개질하여 금속 개질층을 형성하는 과정은 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어 실리카 나노 입자와 티올기-포함 유기실란 유도체를 반응시킴으로써 표면에 티올기를 도입한 뒤 이를 금속 나노입자와 반응시켜 금속 입자를 실리카 나노입자에 증착시킴으로써 수행될 수 있다. 티올기 도입을 위한 유기실란 유도체로서 예를 들어 MPTS [(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane]가 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 금속 개질층은 은(Ag), 금(Au) 및 구리(Cu)로 구성된 군으로부터 선택되는 금속 개질층이며, 보다 구체적으로는 은(Ag) 개질층이다. 은 개질층이 도입된 실리카 나노입자는 예를 들어 티올기가 도입된 실리카 나노입자에 AgNO₃용액 및 옥틸아민을 순차적으로 처리함으로써 수득될 수 있다.

본 명세서에서 용어“개질(coating)”은 대상표면 상에 특정 물질을 코팅함으로써 일정한 두께의 새로운 층을 형성하는 것을 의미한다. 대상표면과 코팅 물질은 이온결합, 공유결합, 수소결합 등의 다양한 화학적 결합을 통해 개질될 수 있다. 본 발명에서 금속 입자가 실리카 코어를 코팅하는 경우 금속 입자 층은 코어 면을 완전히 둘러싸면서 밀폐된 층을 형성할 수도 있고 부분적으로 밀폐된 층을 형성할 수도 있다.

본 명세서에서 용어 "라만 표지 화합물(Raman label compound, RLC)”은 물질의 진동(vibrational), 회전(rotational) 및 그 밖의 저주파 모드(low-frequency mode)의 라만 신호를 유발하는 물질 중 저분화 화합물을 의미하며, 이러한 라만 신호는 분자의 구조적 지문으로 인식되어 시료 내 타겟 물질을 검출하는 프로브로 사용되고 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 라만 표지 화합물은 하기 화학식 1로 표시된다:

화학식 1

SH-A

상기 화학식에서, A는

(R₁, R₂, R₄및 R₅는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이며, R₃는 수소, 할로겐, C₁-C₃ 알킬, -NH₂, -COOH, NO₂ 또는 C₁-C₃ 알콕시이다),

또는 나프틸(Naphthyl)이다.

본 명세서에서 용어“알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등을 포함한다. C₁-C₃알킬은 탄소수 1 내지 3의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C₁-C₃ 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.

본 명세서에서 용어“할로겐”은 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다.

명세서에서 용어“알콕시”는 알코올에서 수소가 제거되어 형성된 라디칼을 의미하며, 예를 들어 C₁-C₃알콕시는 탄소수 1 내지 3의 알코올에서 수소가 제거되어 형성된 라디칼을 의미한다.

보다 구체적으로는, 상기 R₁, R₂, R₄및 R₅는 각각 독립적으로 수소, Br, Cl 또는 F이며, R₃는 수소, Br, Cl, 이소프로필, -NH₂, -COOH, NO₂ 또는 메톡시이다.

가장 구체적으로는, 상기 라만 표지 화합물은 4-FBT, 4-BBT, 4-CBT, 2-CBT, 4-IBT, 4-ATP, 2-NT, 3,4-DCT, BT, 5-PHTT, 4-MBA, 4-MBT, 4-NBT, 4-MOBT 및 TFB로 구성된 군으로부터 선택된다.

금속 개질층을 가지는 실리카 나노입자는 예를 들어 11-MUA (11-Mercaptoundecanoic acid) 용액에 원하는 라만 표지 화합물을 첨가하고 교반시킴으로써 수득할 수 있다.

본 명세서에서 용어“형광단(fluorophore)”은 적절한 파장의 광원이나 전자기장이 조사될 경우 여기(excited)되어 형광을 방출하는 특정 분자의 일부분 혹은 이에 결합된 모이어티를 의미한다. 형광단은 특정 파장의 광원을 흡수하고 이와 상이한 파장의 빛을 방사하는 분자 내 작용기(functional group) 또는 접합체일 수 있다. 사용되는 형광단의 특성 및 이의 화학적 환경에 따라 방사되는 빛의 강도 및 파장, 형광 수명, 비등방성, 분극 등이 좌우된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 형광단은 적색 양자점(quantum dot, QD), 녹색 양자점 및 청색 양자점으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 용어“양자점”은 반도체성 물질의 단일 구형 나노결정으로서 해당 반도체성 물질의 엑시톤 보어 반경(exciton Bohr radius)과 같거나 이보다 작은 반경을 가지는 나노결정을 의미한다. 양자점의 예로서 CdS 양자점, CdSe 양자점, CdSe/CdS 코어/쉘 양자점, Cdse/ZnS 코어/쉘 양자점, CdTe 양자점, PbS 양자점 및 PbSe 양자점을 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 공지되어 있거나 사용되고 있는 어떠한 양자점도 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 나노프로브를 유효성분으로 포함하는 시료 내 표적 물질에 대한 형광 및 라만 신호 동시검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 나노프로브에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 라만 신호는 표면증강 라만 산란(SERS) 신호이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 조성물은

ⅰ) 4-FBT, 4-BBT, 4-CBT, 2-CBT, 4-IBT, 4-ATP, 2-NT, 3,4-DCT, BT, 5-PHTT, 4-MBA, 4-MBT, 4-NBT, 4-MOBT 및 TFB로 구성된 군으로부터 선택되는 10개 이상의 라만 표지 화합물; 및

ⅱ) 적색, 녹색 및 청색 양자점 중 2개 이상의 양자점이 조합된 구성을 포함하는 20종 이상의 상이한 나노프로브를 유효성분으로 포함한다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 조성물은

ⅰ) 4-FBT, 4-BBT, 4-CBT, 2-CBT, 4-IBT, 4-ATP, 2-NT, 3,4-DCT, BT, 5-PHTT, 4-MBA, 4-MBT, 4-NBT, 4-MOBT 및 TFB의 라만 표지 화합물; 및

ⅱ) 적색, 녹색 및 청색 양자점

의 조합을 포함하는 45종의 상이한 나노프로브를 유효성분으로 포함한다.

15개의 라만 표지 화합물과 3개의 양자점이 모든 가능성 조합을 이룰 경우 도 1b에서 보는 바와 같이 완전히 구별되는 형광 및 SERS 신호를 가지는 45개의 상이한 F_QDR_SERS나노프로브를 수득할 수 있으며, 이를 통해 광발광(PL) 스펙트럼과 SERS 스펙트럼이 조합된 45개의 구분되는 광학 인코딩이 가능하다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 시료는 생물학적 시료이다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함하는 동물로부터 얻어지는 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액 뿐 아니라, 인간을 포함하는 동물 개체 자체도 포함하는 의미이다. 따라서, 본원발명은 인 비트로 진단 뿐 아니라 내시경을 이용한 인 비보, 인 시투 진단을 비롯하여 영상 가이드 수술 등의 다양한 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 분석하고자 하는 시료 내 다중 표적 분자에 대한 형광 및 라만 신호 검출방법을 제공한다:

(a) 상술한 본 발명의 조성물을 상기 시료와 접촉시키는 단계;

(b) 상기 시료에 광원을 조사하는 단계; 및

(c) 상기 시료로부터 방출된 형광 신호 및 라만 신호를 검출하는 단계.

본 발명에서 사용되는 나노프로브, 이를 포함하는 형광 및 라만 신호 동시검출용 조성물 및 대상 시료에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 방법은 상기 동시 검출된 형광 및 라만 신호를 이용하여 광발광(photoluminescenc, PL) 스펙트럼 및 표면증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering, SERS) 스펙트럼을 생성하는 단계를 추가적으로 포함한다.

각 45개 나노프로브들의 혼합물에 대하여 특정 파장(예를 들어 300-400nm)의 광원으로 QD를 여기시킴으로써 PL 스펙트럼을 수득하고, 역시 공지된 방법을 통해 라만 현미경 시스템 등을 이용하여 고유의 라만 진동 모드로 구별되는 SERS 스펙트럼을 수득할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 방법은 생성된 PL 스펙트럼 및 SERS 스펙트럼을 바코드로 전환하는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 45개 나노프로브에 의한 PL 및 SERS 스펙트럼은 학습 알고리즘을 통해 이중방식 스펙트럼 바코드로 전환됨으로써 이를 신속하게 판독할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 각 라만 표지를 위한 트레이닝 세트로 사용하기 위해 일정 수의 스펙트럼을 수집하고, 이에 대해 Savitzky-Golay 필터링을 한 뒤, 수집된 피크를 군집으로 분류하여 이 군집들은 바코드의 바(bar)로 번역할 수 있다. 도 3c에서 보는 바와 같이 본 발명자들은 15개 형태의 SERS 신호와 3가지 형태의 QD 신호를 조합하여 45개의 상이한 이중방식 스펙트럼 바코드를 구축함으로써, 바코드 리더 등을 이용하여 대량의 분석물을 신속하고 정확하게 동정할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 실리카 쉘을 사이에 두고 라만 표지 화합물(RLC)과 양자점(QD)이 각각 도입된 다층형 이중방식 나노프로브; 및 이를 이용하여 시료 내 표적 물질에 대한 형광 및 라만 신호를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 RCL과 QD의 다양한 조합을 통해 총 45종의 나노프로브가 각각 상응하는 45개의 스펙트럼을 생성함으로써 선형 판별 분석(LDA)을 비롯한 종래 기술과 비교하여 비약적으로 향상된 인코딩 능력과 민감성을 가진 신뢰도 높은 진단용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

(c) 본 발명은 또한 수득된 이중방식 스텍트럼 신호를 학습 알고리즘을 통해 바코드로 전환함으로써 고처리(high-throughput) 형광-SERS 분석에서의 대량의 분석 결과를 신속하게 판독할 수 있다.

도 1은 양자점 (QD)-고정된 표면증강 라만 산란(SERS) 나노프로브(F_QDR_SERS)의 모식도를 보여주는 그림이다. 도 1a는 실리카-코팅된 은나노쉘을 합성하고 이후 양자점과 접합되는 과정을 나타낸다. 도 1b는 합성된 45개 형태의 F_QDR_SERS입자를 나타낸 그림이다.
도 2는 F_QDR_SERS나노입자(NP)의 특성을 보여주는 대표적 데이터를 나타낸다. 도 2a는 380nm의 광여기 파장에서의 F_RR_4-FBT(붉은색), F_GR_4-BBT(녹색) 및 F_BR_4-CBT의 정규화된 광냉광 스펙트럼을 보여주는 그림이다. 도 2b는 (i)F_RR_4-FBT, (ⅱ)F_GR_4-BBT 및 (ⅲ)F_BR_4-CBT의 표면증강 라만 산란(SERS) 스펙트럼을 각각 나타낸다. SERS 스펙트럼은 마이크로-라만시스템을 이용하여 수득하였다. 레이저 전력은 11mW, 광획득 시간은 10초, 광여기 파장은 660nm이다. F_RR_4-FBT(도 2c), F_GR_4-BBT(도 2d) 및 F_BR_4-CBT(도 2e)의 투과전자현미경 이미지를 각각 나타내었다.
도 3은 형광 및 표면증강 라만산란(SERS) 신호를 이용하여 이중방식 스펙트럼 바코드의 제조 과정을 보여주는 그림이다. 도 3a는 바코드 학습 알고리즘을 도출하는 과정을 나타내는 플로우 차트이다. 도 3b는 노이즈 적용의 밀도-기반 공간 군집화(DBSCAN) 및 상응하는 바코드에 의한 FR_RGBR_4-BBT나노프로브 스펙트럼 결과이다. 도 3c는 FR_RGBR_4-BBT나노프로브로부터 구별되는 형광 및 SERS 신호에 기반한 45개의 상이한 이중방식 스펙트럼 바코드를 나타낸다.
도 4는 바코드 동정 및 이의 검증 과정을 나타내는 그림이다. 도 4a는 DBSCAN를 4-브로모벤젠티올(4-BBT)의 스펙트럼에 적용한 결과 및 상응하는 바코드를 보여준다. 도 4b는 미지의 시료에 대해 수행된 매칭 판정 과정을 나타낸다. 도 4c는 바코드 동정과정을 통해 수득한 도 4a의 시료 스펙트럼의 매칭 점수를 보여준다. 도 4d는 바코드 학습 동정 알고리즘의 10배 교차검증을 위한 혼돈 행렬을 보여준다 .
도 5는 F_QDR_SERS를 이용한 이중방식 고처리 삼중 분석의 모형 실험 결과를 보여주는 그림이다. 도 5a는 F_GR_SERS-흡착된 TentaGel®비드의 공초점 레이저주사현미경(CLSM) 이미지이다. 도 5b는 도 5a의 동일한 4개의 대표적인 시료에 대한 매칭 점수 그래프이다. 도 5c는 모든 F_GR_SERS시료(n=270)에 대한 라만 동정 혼돈 행렬을 보여주는 그림이다. 도 5d는 9개 형태의 F_QDR_SERS입자의 바코드 동정의 중첩 결과를 보여주는 F_QDR_SERS-흡착된 TG 비드의 CLSM 이미지이다. 도 5e는 9개 형태의 F_QDR_SERS입자(n=265)에 대한 이중방식 삼중 분석의 전체 데이터를 나타낸다. 마이크로-라만 시스템을 이용하여 표면증강 라만산란(SERS) 스펙트럼을 수득하였다. 레이저 전력은 0.5 mW이고, 광획득 시간은 3초, 광여기 파장은 660 nm이다.
도 6은 삼중 F_QDR_SERS혼합물에 의해 생성된 다중 표면증강 라만 산란(SERS) 신호를 동정한 결과를 보여준다. 도 6a는 삼중 SERS 신호 동정을 위한 6개 형태의 대표적인 SERS 스펙트럼을 나타낸다. 도 6b는 도 6a의 스펙트럼에 대한 매칭 점수를 나타낸다. SERS 스펙트럼은 마이크로-라만 시스템을 통해 수득하였다. 레이저 전력은 0.5mW, 광획득 시간은 3초, 광 여기 파장은 660nm이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

실험재료

테트라에틸 오쏘실리케이트 (TEOS), 수산화 암모늄 (NH₄OH, 28-30%), 3-머캅토프로필트리메톡시실란(MPTS), 에틸렌글리콜, 폴리(비닐피롤리돈)(PVP, MW ~40,000), 질산은(AgNO₃, 99.9999+% 미량 금속 기준), 옥틸아민(OA), 11-머캅토운데실산(11-MUA), 4-플루오로티오페놀(4-FBT), 4-브로모벤젠티올(4-BBT), 4-클로로벤젠티올(4-CBT), 2-클로로벤젠티올(2-CBT), 4-이소프로필벤젠티올(4-IBT), 4-아미노티오페놀(4-ATP), 2-나프탈렌티올(2-NT), 3,4-디클로로벤젠티올(3,4-DCT), 벤젠티올(BT), 5-페닐-1H-1,2,4-트리아졸-3-티올(5-PHTT), 4-머캅토벤조산(4-MBA), 4-머캅토톨루엔(4-MBT), 4-니트로벤젠티올(4-NBT),4-메톡시티오페놀(4-MOBT), 2,3,5,6-테트라플루오로벤젠티올(TFB), 규산나트륨 용액(시약 등급) 및 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES, 99%)은 시그나-알드리치(St.Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 추가 정제 없이 사용하였다. 에탄올(98%), N-메틸피롤리돈(NMP), 에탄올(99.9%) 및 디클로로메탄은 Daejung Co. Ltd.(Busan, Korea)에서 구입하였다. 양자점(QD)은 Zeus Co., Ltd.(Osan, Korea)에서 구입하였다. TentaGel®(TG) 마이크로비드(0.22 mol NH₂g^-1, 35μm)는 RappPolymere GmbH(T

Germany)에서 구입하였다. 모든 실험에서 탈이온화(DI)수가 사용되었다.

거친(bumpy) 은나노쉘(AgNS)의 제작

AgNS은 본 발명자들이 앞서 개발한 방법으로 제작하였다. 요약하면, TEOS (1.6 mL)를 순수 에탄올(40 mL, 99.9%)에 용해시키고, 액상 수산화암모늄 (4 mL, 28%-30.0%)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 자성 교반막대로 25℃에서 20시간 동안 강하게 저어주었다. 합성된 실리카 나노입자(NP)를 4℃에서 15분 간 원심분리(8000 rpm)하고 에틴올로 수회 세척하여 과량의 시약을 제거하였다. 실리카 NP를 티올기로 수식하였다. 실리카 NP(50 mg)를 에탄올(1 mL) 포함 MPTS(50μL) 및 액상 수산화암모늄(10μL, 28%-30.0%)에 분산시키고, 혼합물을 25℃에서 9시간 동안 교반하였다. MPTS-처리된 실리카 NP를 원심분리하고 에탄올로 수회 세척하였다. MPTS-처리된 실리카 NP(3 mg)를 에틸렌글리콜(25 mL)과 혼합하고 PVP(5 mg)를 첨가하였다. 에틸렌글리콜(25 mL) 내 AgNO₃용액을 실리카 NP에 첨가하고 생성된 분산액을 잘 섞어주었다(AgNO₃의 최종 농도는 3.5mM). 옥틸아민(41.3μL, 5mM)을 신속하게 첨가하여 1시간 동안 25℃에서 강하게 저어주었다. 마지막으로 NP를 원심분리하고 에탄올로 수회 세척하였다.

실리카-코팅된 거친 은 나노쉘(AgNS@SiO ₂ ) 프로브의 제작

AgNS@SiO₂프로브를 본 발명자들이 앞서 개발한 방법으로 제작하였다. 요약하면, AgNS(1mg)를 11-MUA(0.15 mM)를 포함하는 에탄올(1 mL)에 분산시켰다. 이후 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 강하게 교반하였다. 생성된 11-MUA-처리 AgNS를 원심분리하고 에탄올로 세척하였다. 다음으로, 각 15개의 상이한 라만 표지 화합물(4-FBT, 4-BBT, 4-CBT, 2-CBT, 4-IBT, 4-ATP, 2-NT, 3,4-DCT, BT, 5-PHTT, 4-MBA, 4-MBT, 4-NBT, 4-MOBT 및 TFB; 에탄올 내 1 mL, 4 mM)을 첨가하고 각 분산액을 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 각각 상이한 라만 표지 화합물이 표면에 흡착된 15개 상이한 형태의 AgNS를 원심분리 에탄올로 2회 세척하였다. AgNS를 실리카 쉘로 포집하기 위해, 각 형태의 라만 표지-처리된 AgNS(3 mg)를 희석된 규산나트륨 용액(15mL, 0.036wt% SiO₂)에 분산시켰다. 각 분산액을 자성 교반막대로 25℃에서 15시간 동안 저어주었다. 각 반응 혼합물에 에탄올(60 mL)을 첨가하고 분산액을 다시 3시간 동안 저어주어 얇은 실리카 쉘을 형성하였다. 이러한 과정을 통해, AgNS의 표면을 라만 표지 화합물 뿐 아니라 얇은 실리카 쉘로 포집하여 산화로부터 보호하였다. 마지막으로, 액상의 수산화암모늄(250μL, 28%-30%) 및 TEOS(25μL)를 첨가하고, 각 반응 혼합물을 25℃에서 24시간 동안 저어주었다. 생성된 AgNS@SiO₂프로브를 원심분리하여, 에틴올로 수회 세척 후 마지막으로 3 mL 에탄올에 분산시켰다.

QD의 AgNS@SiO ₂ 프로브 표면에의 고정

QD-고정된 AgNS@SiO₂프로브를 앞서 개발된 방법을 조금 변형하여 제작하였다. 요약하면, AgNS@SiO₂프로브(1 mg)을 MPTS(50μL) 및 NH₄OH(10μL) 함유 에탄올(1 mL)에 분산시켰다. 혼합물을 25℃에서 15시간 동안 저어주었다. 생성된 티올-수식된 AgNS@SiO₂프로브를 원심분리하여 에탄올로 수회 세척 후 마지막으로 에탄올(1 mL)에 분산시켰다. 다음으로, 티올-수식된 AgNS@SiO₂프로브를 QD(0.7mg; 붉은색, 녹색 및 파란색)를 포함하는 디클로로메탄(4 mL)에 분산키고 혼합물을 3분 동안 600rpm에서 강하게 저어주었다. MPTS(50μL)를 혼합물에 첨가하고 다시 25℃에서 3시간 동안 강하게 저어주었다. 반응 혼합물을 추가적으로 NH₄OH(10μL)와 함께 저어주어 QD-고정된 영역을 얇은 층의 실리카로 코팅하였다. 마지막으로, 생성된 혼합물을 원심분리하고 에탄올로 수회 세척한 뒤 에탄올 (2 mL)에 분산시켰다.

F _R R _SERS 를 이용한 비드의 인코딩

다중 디코딩 과정을 검증하기 위해 ca. 100 mm의 TG 마이크로비드를 마이크로비드 표면에 물리적으로 흡착된 몇몇 형태의 F_RR_SERS(ca. 500 nm)로 인코딩하였다. F_RR_SERSs(0.1mL, 0.5mg/mL)를 TG 비드(1.25mg)에 첨가하고 NMP(0.5 mL)에 분산시켰다. 생성된 혼합물을 상온에서 30분 간 교반하였다. TG 비드에 흡착하지 않은 F_RR_SERSs를 원심분리하면서 세척하여 제거한 뒤 에탄올(0.3mL)에 재분산시켰다.

다중 분석을 위한 SERS 및 형광 측정

바코드 시스템을 이용하여 다중 신호를 디코딩하기 위해, 3가지 형태의 F_RR_SERS를 혼합하고 모세관 튜브에 주입하였다. 15가지 형태의 F_RR_SERS를 포함하는 혼합물에 의해 생성된 SERS 스펙트럼을 라만 현미경 시스템을 이용하여 수득하였다. x10 대물렌즈를 사용하였으며, 광여기 파장은 660 nm이고, 레이저 전력은 11 mW이며, 획득 시간은 10초이다. LDA를 다중 디코딩에 적용하기 위해, 각 상이한 형태의 F_RR_SERS-인코딩된 마이크로비드의 시료를 글래스 슬라이드에 적상하였다. 각 형태의 F_RR_SERS-인코딩된 마이크로비드의 SERS 스펙트럼은 x50 대물렌즈(Olympus, 0.70 조리개수(NA))를 이용하여 수득하였다. 광여기 파장은 660 nm, 레이저 전력은 0.5 mW, 획득 시간은 5초이다. TG 비드의 형광 이미지는 자외선 휘선(405 nm, 488 nm 및 543 nm)의 LSM710 공초점 레이저주사현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 수득하였다.

장비

F_QDR_SERS프로브의 형상, 크기 및 QD-고정 형태는 JEM1010 TEM(JEOL, Akishima, japan)을 이용하여 측정하였다. 형광 스펙트럼은 LS-55 발광 분광계(PerkinElmer, Wellesley, MA, USA)를 이용하여 수득하였으며, 형광 이미지는 LSM710 공초점 레이저 주사 현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 수득하였다. SERS 스펙트럼은 BX41 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)이 장비된 LabRAM 300 공초점 마이크로-라만 시스템(Jobin Yvon-Horiba, Lille, France)을 이용하여 수득하였다. 후방산란 배열을 이용하여 라만 산란 신호를 수집하였으며, 열전기적으로 냉각된(-70℃) 전하-커플링 장비를 이용하여 신호를 검출하였다. 라만 신호는 x10, x50 및 x100 대물렌즈(Olympus, 0.90 NA)를 이용하여 수집하였다.

바코드 학습 동정 알고리즘

전체 과정은 MATLAB 패키지(MathWorks, Natick, Massachusetts, USA)를 이용하여 수행하였다. 15개 라만 표지의 모든 기준 스펙트럼은 Savitzky-Golay 필터링(오더: 5, 프레임 길이: 15)을 통해 부드럽게 조정하였다. 기저선을 arPLS(Asymmetrically reweighted penalized least squares)로 제거하였다(람다: 10000; 반복: 50). 신호 프로세싱 뒤, 각 신호의 절대값의 하위 70% 에 대한 표준편차를 계산하고 MATLAB(Minpeak높이=3σ_noise, MinpeakProm = 15σ_noise)의 findpeaks 함수를 이용하여 표준편차보다 높은 피크를 수집하였다. 피크 위치를 Lorentzian 곡선 피팅을 이용하여 이동시켰다. 수집된 피크를 DBSCAN(입실론: 2; 최소 포인트: 5)을 이용하여 이들의 위치 및 상대적 높이(높이의 총합으로 나눈 높이)에 따라 군집 또는 노이즈로 분류하였다.

시료 스펙트럼은 상기와 동일한 신호 프로세싱을 수행한 뒤 학습 알고리즘을 수행하였다. 그러나, 발견된 피크가 학습 피크보다 민감도가 더 높았는데(Minpeak높이 = 3σ_noise, MinpeakProm=3σ_noise), 이는 일반적으로 시료 스펙트럼의 S/N 비율이 기준 스펙트럼보다 낮기 때문이다. 상이한 z 점수에 대한 각각의 매칭 점수를 계산하였으며, 1.5 내지 4.0 x 0.1의 범위였다.

선형 판별 분석

MATLAB 분류 툴 박스를 이용하여 LDA 분류자를 생성하였다. 모든 입력 데이터는 바코드 알고리즘에 입력한 데이터들과 동일하게 취급하였다.

실험결과

F _QD R _SERS 나노프로브의 제작 및 특성 분석

도 1a는 전체적인 F_QDR_SERS나노프로브의 제작과정을 보여준다. 거친 은나노쉘(AgNS) 구조에 형광 모드를 부여하기 위해, 먼저 AgNS 입자를 실리카쉘로 코팅하여 AgNS@SiO₂프로브를 제작하였다. 쉘 두께는 ca. 20 nm이었으며 이를 통해 은 영역이 도입된 QD 형광단과 분리되어 퀀칭을 피할 수 있음을 확인하였다. 본 발명자들이 종래에 보고한 프로토콜을 이용하여 AgNS@SiO₂프로브를 합성하였다(M.G. Cha, er al., Nanoscale 9 (2017) 12556-12564). 다음으로, MPTS를 실리카 쉘의 외부 표면에 도입하여 티올기로 수식하였다. 이어서 QD를 AgNS@SiO₂ 프로브 상의 티올기에 공유결합시켰다. 마지막으로, AgNS@SiO₂프로브의 안정성을 증가시키고 추가 작용기 결합 능력을 개선하기 위해 변형된 St

방법을 이용하여 MPTS 및 NH₄OH로 얇은 실리카 쉘을 코팅하였다.

본 발명자들은 구별되는 형광 및 SERS 신호를 가지는 45개의 상이한 F_RR_SERS나노프로브를 제작함으로써 이중방식 다중 분석에 이용하기 위한 F_QDR_SERS나노프로브를 제작하였다(도 1b). 각각 벤젠고리 및 티올 작용기를 포함하는 유기 저분자인 15개의 상이한 라만 표지 화합물을 선정하였다. 각 라만 표지 화합물은 다중 분석을 위한 구별되는 SERS 신호를 가진다. 본 발명자들은 또한 3개의 상이한 QD(붉은색, 녹색, 파란색)을 도입하여 본 발명의 나노프로브의 인코딩 능력을 추가적으로 향상시키고자 하였다. 이에, 다중 분석을 위한 강한 형광-SERS 신호를 가지는 45개의 실용적인 광학 인코딩 물질을 제작하였다.

다음으로, 고처리 다중분석에 있어서 이들 45개 F_QDR_SERS나노프로브의 유용성을 평가하였다. 먼저, 380nm 광원으로 이의 QD를 여기시킴으로써 각 F_QDR_SERS나노프로브의 광발광(PL) 스펙트럼을 수득하였다. 도 2a는 F_RR_4-FBT(붉은선), F_GR_4-BBT(녹색선) 및 F_BR_4-CBT(파란선) 나노프로브의 대표적인 정규화 PL 스펙트럼을 보여준다. 각 F_QDR_SERS나노프로브는 QD 퀀칭 없이 구별되는 PL 스펙트럼을 생성하였으며, 각 스펙트럼은 특유의 최대 방사파장(F_RR_4-FBT는 616 nm, F_GR_4-BBT는 520 nm, F_BR_4-CBT는 449 nm)을 보였다. 나머지 42개 F_QDR_SERS나노프로브 역시 고유의 최대 방사 파장을 가지는 PL 스펙트럼을 생성하였다. 도 2b는 3개의 대표적인 F_QDR_SERS나노프로브의 정규화된 SERS 스펙트럼을 나타낸다. 3개의 F_QDR_SERS나노프로브(F_RR_4-FBT, F_GR_4-BBT 및 F_BR_4-CBT) 모두 고유의 라만 진동 모드로 구별되는 SERS 스펙트럼을 생성하였다. 나머지 42개 F_QDR_SERS나노프로브 역시 300-1800cm^-1범위에서 고유의 SERS 스펙트럼을 나타냈다. 이러한 특유의 강력한 PL 및 SERS 스펙트럼이 고처리 다중 분석에 유용함을 말해준다.

본 발명의 나노프로브 구조를 조사하기 위하여, 각 F_QDR_SERS나노프로브에 대한 투과전자현미경(TEM) 이미지를 수득하였다. 도 2c-2e는 각각 F_RR_4-FBT, F_GR_4-BBT및 F_BR_4-CBT나노프로브에 대한 대표적인 TEM 이미지로서 AgNS의 은 영역에 완전한 실리카쉘이 형성되고 실리카 표면에 QD가 흡착하였음을 보여준다.

학습 알고리즘을 이용한 이중방식 스펙트럼 신호의 바코드로의 전환

본 발명자들은 PL 및 SERS 스펙트럼에 기반하여 45개 F_QDR_SERS나노프로브에 대한 이중방식 스펙트럼 바코드를 생성시켰다. 각 표지 화합물의 라만 진동 모드를 조합하여 바코드를 구축하였다. 각 바코드는 학습 알고리즘에 따라 생성되었다(도 3a). 각 라만 표지를 위한 트레이닝 세트로 사용하기 위해 약 100개 스펙트럼을 수집하였다. 스펙트럼에 대해 Savitzky-Golay 필터링을 하고, 기저선을 arPLS로 제거하였다. 신호 프로세싱 뒤에, σ_noise보다 15배 이상 높은 피크를 동정하였다. 노이즈 신호의 표준편차를 계산하여 절대값 하위 70%로부터 노이즈를 계산하였다. 피크 위치를 Lorentzian 곡선 피팅을 이용하여 이동시켰다. 모든 수집된 피크를 DBSCAN를 이용하여 군집으로 분류하였다. 특정 수 이상의 피크가 인접한 거리에 가까워지면 군집으로 분류하고 그렇지 않을 경우 노이즈로 분류하였다. 이후 군집들은 바코드의 바(bar)로 번역되었다. 모든 피크가 균등한 것은 아니므로, 각 바에는 상응하는 비중을 부여하였다. 두드러진 피크는 눈에 잘 띄지만 다른 피크는 노이즈 또는 다른 표지의 신호와의 중첩으로 인해 검출이 어렵다. 따라서, 두드러진 피크는 더 많은 비중을 부여하여 다양한 상황에서도 동정이 잘 되도록 하였다. 상대적인 피크 높이는 피크 높이를 스펙트럼 내 모든 피크 높이의 합으로 나눈 정규화된 값이며, 수(population)는 전체 트레이닝 데이터 수에 대한 관찰된 피크 수의 비율이다. 상대적 높이는 피크의 중요도를 나타내며, 피크의 수는 피크의 검출 빈도를 나타낸다. 모든 비중의 합은 1로 정규화하였다. 도 3b 하단은 4-BBT에 대한 바코드를 보여준다. 각 피크의 비중은 상응하는 밴드의 진하기로 표시하였다. F_QDR_SERS나노프로브의 형광 방사를 바코드의 가장자리 색으로 표시하였다. 예를 들어, F_RR_4-BBT의 경우 방사 파장이 616 nm이기 때문에 바코드 가장자리 색은 붉은색이다. 15개 형태의 SERS 신호와 3가지 형태의 QD 신호를 조합하여 45개의 상이한 이중방식 스펙트럼 바코드를 만들었다(도 3c).

바코드 동정 및 검증

도 3c의 바코드를 참조하여 신호를 동정하였으며, 동정 과정은 도 4a에 나타내었고, 4-BBT의 스펙트럼 및 이의 기준 바코드가 표시되어 있다. 도 4b에 나타난 과정을 통해 계산된 매칭 점수에 근거하여 동정을 하였으며, 시료 스펙트럼은 기준 스펙트럼에 비해 더 낮은 신호-노이즈(S/N) 비율을 보이기 때문에 σ_signal대비 5배 초과의 피크를 검출하였다. 피크 위치를 이동시킨 뒤, 피크 매칭 여부를 판정하였다. 판정 기준은 라만 피크 위치의 일반적인 분포에 따랐다. 유의 간격(significance interval)의 길이는 바의 폭으로 반영되었으며 z 점수를 변환함으로써 바꿀 수 있다. 유의 간격에 대한 표준편차는 전체 트레이닝 세트 유래 피크 위치의 표준편차의 평균이다. 만약 시료의 피크 위치가 바(bar) 내에 있다면 판정은 참이 되고, 그렇지 않으면 거짓이 된다(도 4a 우측). 매칭 점수는 참으로 판정된 기준 피크들의 비중의 합이다. 라만 신호의 강도는 농도에 따라 다르므로, 각 시료 피크의 상대적 높이는 동정 과정에서 고려되지 않았다. 매칭된 피크 비율의 제곱에 비중의 합을 곱함으로써 몇 개의 주요 피크만을 가지는 표지에서 매칭 점수가 과대평가되는 것을 방지하였다(도 4c). 더 명확한 결과를 얻기 위해, 바 너비를 결정하는 z 점수를 1.5에서 4 사이에서 최적화하였다. 라만 신호가 n 요소를 포함한다는 가정 하에, 최적의 z 점수는 n^th매칭 점수와 n+1^th매칭 점수 간의 간격을 평가함으로써 결정하였다. z 점수가 너무 낮으면 대부분의 매칭 점수가 과소평가되고, 반대로 z 점수가 너무 높으면 대부분의 매칭 점수가 과대평가될 것이다. 두 경우 모두 대비(contrast)가 적을 것이나, z 점수가 정확하고 명확한 판단이 이루어지면 대비는 증가하였다.

도 4d는 바코드 학습 동정 알고리즘을 검증하기 위해 사용된 혼돈 행렬이다. 알고리즘 검증을 위해 모든 데이터를 10개 그룹으로 나누어 하나의 그룹을 트레이닝 알고리즘 시험에 사용하고 나머지 그룹들을 각 단계의 트레이닝 세트로 사용하는 10배 교차검증(CV)을 수행하였다. 바코드 알고리즘의 정확도는 허용 가능한 수준이었다.

모형 실험을 통한 바코드 동정 과정의 적용

교차검증 후, 모형 실험을 수행하여 바코드 알고리즘을 검증하고자 하였다. TG 비드를 유사한 생물표적 모델로 사용하였다. 충분한 양의 F_QDR_SERS나노입자를 TG 비드에 흡착시키고, 생성된 형광 및 SERS 신호를 각각 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)과 라만 현미경으로 측정하였다. 도 5a는 CLSM 이미지와 조합된 바코드 동정 결과로서 10개 형태의 라만 표지를 가지는 F_GR_SERS입자를 보여준다. 도 5b는 A-D로 표지된 입자의 성공적인 동정 결과를 나타낸다. 도 5c에서 데이터는 혼돈 행렬로 정렬되었다. LDA는 바코드 분석과 동일한 결과를 나타내어 100% 정확도를 보였다. 도 5c 및 5d는 형광 및 라만 표지의 9개 조합을 가지는 F_RR_SERS, F_GR_SERS 및 F_BR_SERS에 대한 결과를 보여준다. 이들의 형광 및 라만 신호는 쉽게 구분되었다. 바코드 동정의 정확도 역시 100%였다.

라만 표지 혼합물을 사용하는 시스템의 효율성을 시험하였다. 도 6a는 라만 표지 조합을 선정하는 대표적인 스펙트럼을 보여준다. 혼합 스펙트럼에서 피크가 종종 중첩되어 단일 밴드 전략은 성공하기 어렵다. 그러나, 바코드 알고리즘 분석은 모든 표지의 피크를 포함함으로써 피크 중첩에 상대적으로 덜 영향을 받으며, 나아가 단일 표지로부터 학습된 피크 위치를 사용하므로 대비되는 혼합 스펙트럼을 이용한 사전 트레이닝이 불필요하다. LDA가 미지의 스펙트럼이 트레이닝 프로파일에 따라 분류되어야 하는지를 결정하므로, 분류 전 분석하고자 하는 혼합된 스펙트럼이 트레이닝에 사용되어야 한다. 결론적으로, LDA는 다중분석 전 모든 사용가능한 라만 스펙트럼 조합을 사용하여 트레이닝되어야 한다. 나아가, 바코드 분석은 피크 강도가 아닌 피크 위치에 기반하므로, 성분의 농도 변화로 인한 스펙트럼 프로파일의 다양성에 덜 영향을 받는다. 도 6b은 삼중 라만 신호를 이용한 바코드 동정 결과를 나타낸다. z 점수를 최적화하여 3^rd및 4^th매칭 점수 간의 대비를 최대화하였다. 혼합 스펙트럼이 동정 전의 트레이닝에 사용되지 않았음에도, 6개의 결과 모두 정확하였으며 대비도 용인 가능한 수준이었다. 이러한 결과는 본 발명의 동정용 바코드 시스템이 고처리 형광-SERS 분석에 유용함을 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음을 포함하는 다층형 이중방식 나노프로브:
(a) 실리카 코어 입자;
(b) 상기 실리카 코어 입자의 표면에 도입된 금속 개질층;
(c) 상기 금속 개질층에 도입된 라만 표지 화합물(Raman label compound, RLC);
(d) 상기 (a)-(c)를 포집(encapsulating)하는 실리카 쉘; 및
(e) 상기 실리카 쉘에 도입된 형광단(Fluorophore).
제 1 항에 있어서, 상기 라만 표지 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 나노프로브:
화학식 1
SH-A
상기 화학식에서, A는
(R₁, R₂, R₄및 R₅는 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이며, R₃는 수소, 할로겐, C₁-C₃ 알킬, -NH₂, -COOH, NO₂ 또는 C₁-C₃ 알콕시이다),
또는 나프틸(Naphthyl)이다.
제 2 항에 있어서, 상기 라만 표지 화합물은 4-FBT, 4-BBT, 4-CBT, 2-CBT, 4-IBT, 4-ATP, 2-NT, 3,4-DCT, BT, 5-PHTT, 4-MBA, 4-MBT, 4-NBT, 4-MOBT 및 TFB로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노프로브.
제 1 항에 있어서, 상기 형광단은 적색 양자점(quantum dot, QD), 녹색 양자점 및 청색 양자점으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노프로브.
제 1 항에 있어서, 상기 금속 개질층은 은(Ag), 금(Au) 및 구리(Cu)로 구성된 군으로부터 선택되는 금속 개질층인 것을 특징으로 하는 나노프로브.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 나노프로브를 유효성분으로 포함하는 시료 내 표적 물질에 대한 형광 및 라만 신호 동시검출용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물은
ⅰ) 4-FBT, 4-BBT, 4-CBT, 2-CBT, 4-IBT, 4-ATP, 2-NT, 3,4-DCT, BT, 5-PHTT, 4-MBA, 4-MBT, 4-NBT, 4-MOBT 및 TFB로 구성된 군으로부터 선택되는 10개 이상의 라만 표지 화합물; 및
ⅱ) 적색, 녹색 및 청색 양자점 중 2개 이상의 양자점이 조합된 구성을 포함하는 20종 이상의 상이한 나노프로브를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 조성물은
ⅰ) 4-FBT, 4-BBT, 4-CBT, 2-CBT, 4-IBT, 4-ATP, 2-NT, 3,4-DCT, BT, 5-PHTT, 4-MBA, 4-MBT, 4-NBT, 4-MOBT 및 TFB의 라만 표지 화합물; 및
ⅱ) 적색, 녹색 및 청색 양자점
의 조합을 포함하는 45종의 상이한 나노프로브를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 시료는 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는 조성물.
다음의 단계를 포함하는 분석하고자 하는 시료 내 다중 표적 분자에 대한 형광 및 라만 신호 검출방법:
(a) 제 6 항의 조성물을 상기 시료와 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료에 광원을 조사하는 단계; 및
(c) 상기 시료로부터 방출된 형광 신호 및 라만 신호를 검출하는 단계.
제 10 항에 있어서, 상기 방법은 상기 검출된 형광 및 라만 신호를 이용하여 광발광(photoluminescenc, PL) 스펙트럼 및 표면증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering, SERS) 스펙트럼을 생성하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.