ES2584553T3 - Nanopartículas compuestas espectroscópicamente activas superficialmente potenciadas - Google Patents

Abstract

Una partícula que comprende una nanopartícula de metal que tiene unido a ésta un analito de espectroscopía potenciada superficial (analito SES-activo, caracterizado por que la nanopartícula metálica y el analito (SES)-activo unido a ésta están rodeados por un encapsulante, y por que dicha nanopartícula metálica está compuesta por un metal seleccionado de entre el grupo que consiste en Au, Ag, Cu, Na, Al y Cr.

Description

DESCRIPCION

Nanoparticulas compuestas espectroscopicamente activas superficialmente potenciadas.

5 Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a nanoparticulas compuestas espectroscopicamente activas, superficialmente potenciadas, a metodos de fabricacion de las particulas y a usos de las particulas (incluyendo su uso como marcadores opticos, moleculares o celulares). Mas particularmente, se refiere al area de marcadores o etiquetas de 10 tamano submicrometrico que pueden fijarse de forma covalente o no covalente a entidades de interes con proposito de cuantificacion, localizacion, identificacion y/o seguimiento.

Antecedentes de la invencion

15 Cuando se dirige luz sobre una molecula, la gran mayoria de los fotones incidentes se dispersan elasticamente sin cambiar la frecuencia. Esto se denomina dispersion de Rayleigh. Sin embargo, la energia de algunos de los fotones incidentes (aproximadamente 1 de cada 107 fotones incidentes) se acopla en modos vibracionales distintos de los enlaces de la molecula. Dicho acoplamiento provoca que la molecula disperse de forma inelastica parte de la luz incidente con un intervalo de frecuencias que difieren del intervalo de la luz incidente. Esto se denomina efecto 20 Raman. Representado la frecuencia de dicha luz dispersada de forma ineslastica frente a su intensidad, se obtiene el unico espectro Raman de la molecula que puede observarse. El analisis del espectro Raman de una molecula desconocida puede proporcionar informacion sobre la composicion molecular de la muestra.

La iluminacion incidente para espectroscopia Raman, normalmente proporcionada por un laser, puede concentrarse 25 a una pequena mancha si el espectroscopio se construye con la configuracion de un microscopio. Como la senal Raman puede escalarse linealmente con la potencia laser, la intensidad de la luz en la muestra puede ser muy alta para optimizar la sensibilidad del instrumento. Ademas, como la respuesta Raman de una molecula ocurre esencialmente instantaneamente (sin ningun estado intermedio altamente energetico de larga duracion), es imposible el fotoblanqueo de la molecula Raman-activa incluso mediante esta luz de alta intensidad. Esto pone a la 30 espectroscopia Raman en un contraste absoluto con la espectroscopia de fluorescencia, donde el fotoblanqueo limita drasticamente muchas aplicaciones.

El efecto Raman puede potenciarse significativamente llevando la molecula o moleculas Raman-activas cerca (<50 A) de una superficie metalica estructurada ("Surface-enhanced Raman spectroscopy using metallic nanostructures", 35 T. Vo-Dinh, Trends in Analytical Chemistry, Vol. 17 (1998), paginas 557 - 582"), este campo decae exponencialmente desde lejos de la superficie. Acercar mas las moleculas a las superficies metalicas se consigue tipicamente mediante la adsorcion de la molecula Raman-activa sobre oro, plata o cobre desbastados adecuadamente u otros metales libres de electrones. La potenciacion superficial de la actividad Raman se observa con particulas coloidales metalicas, peliculas metalicas sobre sustratos dielectricos y con series de particulas 40 metalicas. El mecanismo mediante el que ocurre esta dispersion Raman potenciada superficialmente (SERS), se entiende, y se cree que es el resultado de una combinacion de (i) resonancia de plasmones superficiales en el metal que potencia la intensidad local de la luz; y (ii) formacion y transiciones posteriores de complejos de transferencia de carga entre la superficie metalica y la molecula Raman-activa.

45 La SERS permite la deteccion de moleculas unidas a la superficie de una unica nanoparticula de oro o plata. Un metal que potencia Raman que se ha asociado o unido a una molecula o moleculas Raman-activas se denomina nanoparticula SERS-activa. Dichas nanoparticulas SERS-activas pueden tener utilidad como marcadores opticos. Por ejemplo, las nanoparticulas SERS-activas pueden usarse en inmunoensayos cuando se conjugan con un anticuerpo contra una molecula diana de interes. Si la diana de interes se inmoviliza sobre un soporte solido, 50 entonces la interaccion entre una unica molecula diana y un unico anticuerpo unido a nanoparticula puede detectarse buscando el espectro Raman unico de la molecula Raman-activa. Adicionalmente, como un unico espectro Raman (de 100 a 3500 cm-1) puede detectar muchas moleculas Raman-activas diferentes, las nanoparticulas SERS-activas pueden usarse en formatos de ensayo multiplexados.

55 Las nanoparticulas SERS-activas ofrecen el potencial para una sensibilidad, estabilidad y funcionalidad multiplexora sin precedentes, cuando se usan como marcadores opticos en ensayos quimicos. Sin embargo, las nanoparticulas SERS-activas hechas de metales presentan problemas practicos formidables cuando se usan en dichos ensayos. Las nanoparticulas metalicas son muy sensibles a agregacion en solucion acuosa; una vez agregadas no es posible volver a dispersarlas. Ademas, las composiciones quimicas de algunas moleculas Raman-activas son incompatibles

con la quimica usada para unir otras moleculas (tales como proteinas) a nanoparticulas metalicas. Esto restringe las elecciones de moleculas Raman-activas, quimicas de union y otras moleculas a unir a la nanoparticula metalica.

El problema mas significativo del uso de nanoparticulas metalicas como marcadores Raman es la similitud de los 5 espectros Raman de las moleculas a acoplar a las nanoparticulas. Por ejemplo, en un inmunoensayo intercalado multiplexado, los espectros Raman de los anticuerpos secundarios a los que se unen las nanoparticulas serian muy similares y, de esta manera, imposibles de deconvolucionar. Ademas, las partes de los anticuerpos secundarios que son diferentes, es decir, los dominios de union al antigeno tipicamente estan muy lejos de la superficie metalica para poder potenciarse significativamente.

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La tecnica anterior muestra que las propias moleculas pueden usarse como marcadores Raman, con la condicion de que su seccion transversal de dispersion Raman sea suficientemente grande. De esta manera, la union directa de colorantes, por ejemplo a anticuerpos, permite poder usarlos como marcadores para inmunoensayos. Este enfoque, sin embargo, sufre limitaciones extremadamente significativas: las estructuras/caracteristicas moleculares que dan 15 lugar a espectros Raman intensos (por ejemplo, polarizabilidad, aromaticidad, conjugacion, heteroatomos y mas significativamente, la seccion transversal de absorcion significativa), tambien da lugar espectros Raman complejos. El uso de marcadores Raman moleculares requiere extinciones muy altas en la region visible del espectro para acceder a la dispersion Raman por resonancia, lo que aumenta la senal Raman en hasta tres ordenes de magnitud. Hay una incompatibilidad fisica fundamental entre las moleculas que absorben luz visible bien y aquellas que 20 muestran un espectro Raman simple. De esta manera, los espectros Raman de los colorantes descritos anteriormente son extremadamente complejos y no ha sido posible multiplexar estos ensayos.

Un segundo problema fundamental de los marcadores basadas en Raman es la debilidad de la senal Raman; no es posible detectar moleculas sencillas (o incluso miles de moleculas) mediante Raman sin usar potenciacion 25 superficial. Idealmente, es deseable un marcador que presente factores de potenciacion asociados a SERS y la capacidad de unir dicho marcador a especies que difunden libremente (lo que claramente no seria posible con superficies SERS-activas).

Es un objeto de esta invencion proporcionar una solucion a los problemas mencionados anteriormente encontrados 30 cuando se usan entidades de dispersion Raman como etiquetas o marcadores opticamente dirigibles en ensayos quimicos o biomoleculares. Otro objeto mas de la invencion es proporcionar un panel de al menos 20 nanoparticulas SERS-activas diferentes para usar como marcadores opticos "sin escision" en sintesis quimica combinatoria basada en perlas. Otro objeto mas de esta invencion es describir un sistema de deteccion optica para ensayos multiplexados.

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La presente invencion se refiere a nanoparticulas compuestas espectroscopicamente activas, superficialmente potenciadas, incluyendo nanoparticulas metalicas SERS-activas (SACN), a metodos de fabricacion de particulas y a usos de las particulas (incluyendo su uso con marcadores opticos, moleculares o celulares). Las etiquetas o marcadores de tamano submicrometrico de la invencion pueden fijarse de forma covalente o no covalente a 40 entidades de interes (que pueden variar de tamano desde moleculas a objetos macroscopicos) con proposito de cuantificacion, localizacion, identificacion y/o seguimiento.

Sumario de la invencion

45 La presente invencion supera los problemas encontrados cuando se usan especies espectroscopicamente activas superficialmente potenciadas (SES-activas), tales como especies de dispersion Raman, como marcador optico. La invencion proporciona nanoparticulas compuestas SES-activas, incluyendo nanoparticulas metalicas SERS-activas (SACN) como se define en la reivindicacion 1. Cada una de dichas nanoparticulas comprende una nanoparticula metalica SES-activa, una submonocapa, monocapa o multicapa de especies SES-activas muy proxima a la 50 superficie metalica y una carcasa encapsulante que comprende un polimero, un vidrio o cualquier otro material dielectrico. Esto situa a la molecula SES-activa (denominada alternativamente en este documento "analito"; no confundir con las especies en solucion que van a cuantificarse finalmente), en la interfaz entre la nanoparticula metalica y el encapsulante.

55 En realizaciones preferidas, el encapsulante es vidrio. Las nanoparticulas cargadas con analito recubiertas con vidrio resultantes (GAN) retienen la actividad de las nanoparticulas metalicas SES-activas secuestrando fuertemente esta actividad desde la superficie exterior de la nanoparticulas. De esta manera, en el caso de dispersion Raman superficialmente activa (SERS), las GAN resultantes presentan actividad SERS, aunque el analito SERS-activo se localice en la interfaz entre la nanoparticula metalica y el encapsulante.

La molecula de analito puede elegirse para presentar espectros Raman extremadamente sencillos porque no hay necesidad de especies que absorban la luz visible. Esto, a su vez, permite fabricar multiples particulas GAN, cada una con diferentes moleculas de analito, de manera que los espectros Raman de cada analito pueden distinguirse 5 en una mezcla de diferentes tipos de particulas GAN.

Las GAN se manipulan y almacenan facilmente. Son tambien resistentes a agregacion, estan estabilizadas contra la descomposicion del analito en disolvente y aire, son quimicamente inertes y pueden centrifugarse y redispersarse sin perdida de actividad SERS.

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Mas importante aun, las carcasas de vidrio de las GAN pueden derivatizarse facilmente mediante tecnicas convencionales. Esto permite a las GAN conjugarse con moleculas (incluyendo biomoleculas tales como proteinas y acidos nucleicos) o a soportes solidos sin interferir con la actividad Raman de las GAN. A diferencia de las nanoparticulas metalicas, las GAN pueden evaporarse hasta sequedad y despues redispersarse completamente en 15 disolvente. Usando las tecnicas proporcionadas en este documento, es posible fabricar GAN que puedan detectarse individualmente usando SERS.

Las SACN proporcionadas por la presente invencion son nanoparticulas identificables unicas. Pueden usarse practicamente en cualquier situacion en la que sea necesario marcar las moleculas u objetos (incluyendo perlas y 20 otros tipos de soporte solido) con un marcador optico. Las biomoleculas pueden conjugarse facilmente al exterior de las SACN por tecnicas convencionales, permitiendo de esta manera que las particulas funcionen como marcadores opticos en ensayos biologicos. Las SACN pueden usarse practicamente en cualquier ensayo que use un marcador optico tal como un marcador fluorescente. Sin embargo, como marcadores opticos las SACN tienen diversas ventajas distinguibles respecto a los marcadores fluorescentes. Estas ventajas incluyen una deteccion enormemente 25 mas sensible, uniformidad quimica y la resistencia absoluta de la actividad SERS a fotoblanqueo o fotodegradacion. Otro beneficio de utilizacion de SACN como marcador optico es la facilidad con la que las SACN individuales que tienen diferentes actividades SERS pueden resolverse unas de otras. Al menos veinte SACN diferentes pueden resolverse unas de otras usando un espectroscopio Raman sencillo. Esto permite realizar ensayos multiplexados usando un panel de SACN diferentes, teniendo cada una una actividad SERS unica y distinguible.

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Ademas, las SACN pueden servir como nuevos marcadores opticos "sin escision" en sintesis quimica combinatoria basada en perlas. En esta realizacion, cada etapa sintetica en el esquema puede ir acompanada de la conjugacion de una unica SACN a la perla. El historial de reaccion de la perla y, de esta manera, la identidad del compuesto sintetizado, puede determinarse entonces leyendo el espectro SERS de la perla sin requerir primero que las SACN 35 se escindan de la perla.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1A muestra microscopios de transmision electronica de GAN que comprenden nucleos de Au de 35 nm con 40 vidrio de 40 nm. La figura 1B muestra nucleos de Au de 60 nm con vidrio de 16 nm.

La figura 2 muestra micrografias de transmision electronica de Au de 35 nm, GAN de vidrio de 8 nm despues de centrifugacion a traves de una solucion de glicerol al 50 %.

45 La figura 3 demuestra la resistencia al ataque con acido del nucleo de oro de las particulas GAN con un nucleo de Au de 35 nm y una carcasa de vidrio de 8 nm. El ataque del nucleo de oro da como resultado una disminucion de la absorbancia; esto se representa en la figura 3A (se indica el tiempo despues de la adicion de la solucion de ataque). La velocidad de ataque de Au se muestra en la figura 3B como una representacion de la absorbancia frente al tiempo en la solucion de ataque.

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La figura 4 muestra el espectro Raman de las GAN que comprenden un nucleo de Au de 40 nm recubierto con trans- 4,4'-bis(piridil)etileno (BpE) encapsulado en vidrio de 4 nm. La traza A muestra la senal Raman de BPE caracteristica, la traza B muestra la senal Raman de las mismas particulas sin el analito BPE.

55 La figura 5 muestra el espectro Raman de una suspension de GAN que comprende Au de 40 nm recubierto con trans-4,4'-bis(piridil)etileno (BPE)/vidrio de 4 nm (traza A); sobrenadante de una primera centrifugacion de las GAN (traza B); y sobrenadante de una segunda centrifugacion de las GAN (traza C).

La figura 6 ilustra los espectros Raman de las GAN (nucleo de Au de 80 nm/vidrio de 20 nm/2-mercaptopiridina

como analito) y de una solucion 50 mM de 2-mercaptopiridina absorbida sobre un sustrato SERS de tres capas convencional.

La figura 7 ilustra los espectros Raman de los siguientes cuatro tipos ("aromas") de partfculas GAN: (A) GAN 5 marcadas con furonitrilo; (B) GAN marcadas con furonitrilo (66 %) y acido cianoacetico (33 %); (C) GAN marcadas con furonitrilo (33 %) y acido cianoacetico (66 %); y (D) GAN marcadas con acido cianoacetico.

La figura 8 ilustra los espectros Raman de las GAN (nucleo de Au de 40 nm, vidrio de 4 nm) (a) marcado con trans- 4,4'-bis(piridil)etileno (BPE-GAN) o (b) marcado con imidazol (IM-GAN) o (c) no marcado.

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Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

La presente invencion se refiere a nanopartfculas compuestas espectroscopicamente activas, superficialmente potenciadas, incluyendo nanopartfculas metalicas SERS-activas (SACN). Se incluyen tambien dentro del alcance de 15 esta invencion metodos de fabricacion de las partfculas como se define en la reivindicacion 12, y usos de las partfculas (incluyendo su uso como marcadores opticos moleculares, o celulares) como se define en las reivindicaciones 13 a 17. Las marcadores o etiquetas de tamano submicrometrico de la invencion pueden fijarse de forma covalente o no covalente a entidades de interes (que pueden variar de tamano desde moleculas hasta objetos macroscopicos) con proposito de cuantificacion, localizacion, identificacion y/o seguimiento.

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Realizaciones preferidas

Las nanopartfculas SERS-activas (SACN) estan compuestas por una nanopartfcula metalica que tiene unida o asociada con su superficie una o mas moleculas Raman-activas (denominadas en este documento alternativamente 25 "analitos"). Este complejo de metal potenciador de Raman y analito (denominado nanopartfculas metalica SERS- activa) se recubre o encapsula despues con un encapsulante. En realizaciones preferidas, el encapsulante es un material de vidrio y la SACN se denomina entonces nanopartfcula cargada con analito recubierto con vidrio (GAN).

En las realizaciones preferidas, las SACN se proporcionan mediante el desarrollo o colocacion de otra manera de 30 una carcasa de un encapsulante adecuado sobre el nucleo de una nanopartfcula metalica SERS-activa. El nucleo de la nanopartfcula metalica es como se define en las reivindicaciones 1 a 3, preferiblemente una esfera de oro o plata de 20-200 nm de diametro. Mas preferiblemente, es un esferoide metalico oblato o prolato de los mismos materiales. Para SERS que usan luz incidente roja (~633 nm), la respuesta SERS optima se obtiene con nucleos de nanopartfculas de oro de 63 nm de diametro. Las nanopartfculas metalicas del tamano deseado pueden 35 desarrollarse como coloides metalicos por numerosas tecnicas bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se ha descrito la reduccion qufmica o fotoqufmica de iones metalicos en solucion usando cualquier numero de agentes reductores. Igualmente la sfntesis de nanopartfculas se ha realizado en volumenes restringidos por ejemplo dentro de una vesfcula. Las nanopartfculas pueden preparase mediante descarga electrica en solucion. Se han descrito docenas de metodos diferentes con fechas que datan desde mediados de 1800.

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Preferiblemente, el encapsulante no altera de forma medible la actividad SERS de la nanopartfcula metalica. Sin embargo, las ventajas de la presente invencion se consiguen aun incluso si el encapsulante tiene algun efecto medible, con la condicion de que no interfiera con la actividad SERS o no anada una complejidad significativa al espectro Raman. Ademas, el encapsulante debe modificarse facilmente para unir las moleculas, incluyendo 45 biomoleculas a su superficie exterior. Los encapsulantes adecuados incluyen, pero sin limitacion, vidrio, polfmeros, metales, oxidos metalicos, (tales como TiO2 y SnO2) y sulfuros metalicos. La encapsulacion se realiza despues o durante la adsorcion al nucleo de la nanopartfcula del analito Raman-activo que va a proporcionar la activad SERS de la SACN. De esta manera, el analito Raman-activo es secuestrado del disolvente circundante como un recubrimiento sobre la superficie del nucleo de la nanopartfcula metalica. Dicha configuracion proporciona al nucleo 50 de la nanopartfculas metalica una actividad SERS estable. Un analito Raman puede formar una submonocapa, una monocapa completa o un ensamblaje multicapa sobre la superficie del nucleo de la nanopartfcula metalica. Un analito Raman-activo puede comprender una especie unica de molecula Raman-activa, o puede ser una mezcla de diferentes moleculas Raman-activas.

55 En realizaciones especialmente preferidas, el encapsulante es vidrio (por ejemplo, SiOx). Para encapsular en vidrio, los nucleos de las nanopartfculas metalicas se tratan preferiblemente en primer lugar con un cebador de vidrio (es decir, material que puede conducir al crecimiento de un recubrimiento uniforme de vidrio, o puede mejorar la adhesion del recubrimiento de vidrio a la partfcula, o ambos). El vidrio crece despues sobre la nanopartfcula metalica por tecnicas convencionales bien conocidas en la tecnica. Las SACN resultantes se denominan nanopartfculas

cargadas con analito de vidrio (GAN).

Observese que el vidrio y muchos otros materiales contienen grupos funcionales susceptibles de union molecular, por ejemplo, la inmersion de vidrio en una base permite la union covalente de triclorosilanos de alquilo o 5 trialcoxisilano de alquilo, con funcionalidad adicional disponible en el extremo del grupo alquilo. De esta manera, las superficies de vidrio pueden modificarse con todas las formas de biomoleculas y super-estructuras biomoleculares incluyendo celulas, asi como oxidos, metales, polimeros, etc. Igualmente, las superficies de vidrio pueden modificarse con capas monomoleculares bien organizadas. Resumiendo, los recubrimientos de vidrio soportan esencialmente todas y cada una de las formas de funcionalizacion quimica (derivatizacion). Esto es igualmente 10 cierto para muchas formas diferentes de encapsulante. La cuestion es que las particulas SACN pueden fijarse a cualquier especie con funcionalidad quimicamente reactiva. Todos los grupos funcionales quimicos son reactivos en ciertas condiciones. Por lo tanto, no hay limitacion a las especies que pueden inmovilizarse sobre la superficie del encapsulante.

15 El espesor del encapsulante puede variarse facilmente dependiendo de las propiedades fisicas requeridas por el SACN. Por ejemplo, los recubrimientos que son demasiado gruesos - del orden de 1 micrometro o mayor - pueden impedir obtener espectros Raman intensos. Los recubrimientos demasiado finos pueden conducir a interferencia en el espectro Raman del analito debido a las moleculas que estan sobre la superficie del encapsulante. Al mismo tiempo, las propiedades fisicas tales como coeficiente de sedimentacion, claramente se veran afectadas por el 20 espesor del encapsulante. En general, cuanto mas grueso sea el encapsulante, mas eficaz sera el secuestro del analito o analitos Raman-activos en el nucleo de la nanoparticula metalica del disolvente circundante.

Para las GAN, los espesores de vidrio preferidos varian de 1-40 nm. En algunas realizaciones especialmente preferidas, las GAN comprenden particulas de oro de 60 nm de diametro encapsuladas por una esfera de vidrio de 25 66 nm de espesor. Un experto en la tecnica consigue facilmente la optimizacion de las dimensiones de las SACN. Por consiguiente, puede alterarse la composicion de la particula o su tamano y forma de acuerdo con la invencion, para optimizar la intensidad de la molecula analito Raman usada como marcador. De hecho, se sabe que las nanoparticulas de nucleo-carcasa (Au/AuS) soportan SERS y tienen propiedades opticas muy diferentes comparadas con las nanoparticulas metalicas puras. Igualmente, se sabe que las SERS de esferoides prolatos 30 estan potenciadas respecto a esferas con el mismo eje mayor. Se sabe tambien que la potenciacion de particula unica es fuertemente dependiente de la longitud de onda. De esta manera, puede afinarse el tamano de particula para conseguir una senal maxima para una longitud de onda de excitacion dada.

A menudo es deseable separar las SACN verdaderas de las particulas libres de encapsulante que no han nucleado 35 alrededor de una nanoparticula metalica. Dicha separacion mejora la actividad SERS de la preparacion de nanoparticulas porque las particulas de encapsulante libre no son SERS-activas. Por ejemplo las GAN pueden separase de particulas de vidrio libres por centrifugacion de exclusion de tamanos en glicerol al 50 %.

La presente invencion contempla especificamente la formacion de un panel de al menos 20 SACN diferentes, 40 teniendo cada una un espectro SERS unico. Debido a que las bandas Raman de muchas moleculas son extremadamente estrechas (por ejemplo, CN- es menor de 1 nm a FWHM), es posible sintetizar un panel de SACN en el que cada uno contiene un analito Raman que esta espaciado 20 numeros de onda del espectro de su vecino mas proximo. Por ejemplo, una particula GAN con 13CN como analito, puede distinguir facilmente de una GAN con 12CN como analito y es facilmente distinguible de una 15CN. De esta manera, es posible formar 540 picos 45 distintos y que pueden resolverse facilmente en un unico espectro Raman a 633 nm de 600 a 3000 cm-1 usando un espectrografo para difundir los fotones y una camara CCD como detector. Sin embargo, la practica de la invencion esta limitada a la documentacion descrita anteriormente: los experimentos Raman con GAN o SACN pueden realizarse con irradiacion visible o con IR cercano, usando bandas Raman de 100 cm-1 a 5000 cm-1, empleando cualquier forma de monocromador o espectrometro para resolver espacialmente o temporalmente fotones y 50 cualquier forma de detector de fotones. Esta disposicion facilita la sintesis de paneles de al menos 10 SACN resolvibles y proporciona un amplio ancho de banda para, literalmente, cientos de paneles de SACN.

Para aumentar adicionalmente la capacidad para distinguir las poblaciones SACN individuales en el panel de la actividad Raman de fondo, la invencion contempla el uso de analitos Raman-activos que tienen composiciones 55 isotopicas distintas de las especies abundantes de forma natural. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, 13CN es completamente resolvible respecto a cualquier 12CN natural que pueda estar presente en el fondo. Por supuesto, los especialistas en la tecnica reconoceran que las combinaciones de isotopos asi como las proporciones de isotopos pueden usarse igualmente eficazmente par identificar SACN unicas.

Aunque la actividad SERS de cada poblacion SACN en el panel es unica, las otras propiedades de las SACN se mantienen uniformes a traves del panel. Debido a que la actividad SERS de cada SACN es secuestrada del medio circundante por el encapsulante, las poblaciones individuales no tienen requisitos diferentes de disolvente o almacenamiento. Tambien cada SACN tiene la misma carcasa exterior, simplificando la eleccion de la quimica para 5 el ataque de moleculas a las SACN o ataque de las SACN a soportes solidos.

Aunque los ejemplos anteriores se han centrado sobre dispersion Raman, y en particular la dispersion Raman superficialmente potenciada como mecanismo de deteccion, pueden aplicarse numerosos metodos analogos igualmente bien y se incluyen dentro del alcance de la presente invencion. Por ejemplo, podria emplearse un analito 10 excitado por resonancia, realizando de esta manera la tecnica de dispersion Raman por resonancia superficialmente potenciada (SERRS). Puede obtenerse ventaja tambien de los trabajos publicados sobre espectros de absorcion de infrarrojos potenciados (SEIRA) de superficies desbastadas a nanoescala. Igualmente, Van Duyne y otros han mostrado que la dispersion hiperRaman superficialmente potenciada (SEHRS) ocurre tambien en superficies metalicas desbastadas a nanoescala (asi como la SEHRRS analogo resonante). Observese que para una molecula 15 dada, con vibraciones 3N-5 o 3N-6 unicas, donde N es el numero de atomos, todas las vibraciones pueden encontrarse en cualquiera de los espectros Raman, hiperRaman o infrarrojo. De hecho, la identificacion de ciertas SACN puede basarse en una combinacion de metodos interrogativos opticos incluyendo SERS, SERRS, SEIRA, SEHRS, y SEHRRS.

20 Observese tambien que se sabe que ocurre una cantidad significativa de dispersion de luz (Rayleigh) desde las particulas con dimensiones de al menos 1/10 la longitud de onda de excitacion, creando de esta manera la posibilidad de que la dispersion Rayleigh o hiperRaileigh pueda usarse en la identificacion de las SACN. Ademas, las combinaciones de dispersion elastica (por ejemplo, Rayleigh), dispersion inelastica (por ejemplo, Raman), y absorcion (por ejemplo, IR) puede usarse para identificar particulas.

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Uso de las SACN

Las SACN proporcionadas por la presente invencion pueden usarse practicamente en cualquier ensayo en el que se requiera una etiqueta o marcador detectable. En algunas realizaciones, las SACN se usan en ensayos biologicos y 30 quimicos como sustitutos de marcadores fluorescentes convencionales. De hecho, las SACN poseen numerosas caracteristicas que las hacen muy superiores respecto a los marcadores opticos de la tecnica anterior basados en fluoroforos. Por ejemplo, los ensayos que usan deteccion de fluoroforo, habitualmente se ven obstaculizadas por la presencia de autofluorescencia u otros efectos de fondo. Ademas, muchos ensayos requieren el uso de numerosos fluoroforos diferentes; diferentes fluoroforos requieren diferentes quimicas de union y tienen diferentes requisitos 35 ambientales y sensitivos. Es particularmente notable la inactivacion de la actividad fluorescente que se observa cuando algunos fluoroforos se conjugan con proteinas. Finalmente, la fotodegradacion irreversible resultante de la creacion de un estado excitado triplete o singlete, seguido de una reaccion quimica no reversible que elimina permanentemente el estado excitado, da lugar a una grave limitacion sobre la sensibilidad de deteccion. En contraste, las SACN no pueden fotoblanquearse o fotodegradarse, tienen propiedades quimicas y fisicas uniformes, 40 y pueden resolverse facilmente respecto al fondo. Quizas mas importante aun, la deteccion de SACN es significativamente mas sensible que la deteccion de fluoroforo. De hecho, es posible marcar una unica molecula con una unica SACN, y despues detectar la presencia de esta molecula usando espectroscopia Raman. Dicha resolucion sencilla de molecula unica no tiene paralelismo en la tecnica de deteccion de fluoroforo.

45 Un ejemplo de un ensayo biologico en el que las SACN pueden usarse como marcadores opticos es el inmunoensayo intercalado. En ensayos intercalados, una diana a detectar es capturada por una superficie solida. Un anticuerpo (u otro ligando) para la misma diana se une a una SACN y despues se pone en contacto con el soporte solido. La presencia de la senal SERS de la SACN en el soporte solido indica la presencia del antigeno. En general, la SACN puede conjugarse a cualquier molecula que se use para detectar la presencia de una diana especifica en 50 un ensayo.

En una realizacion especificamente contemplada, las SACN se conjugan a moleculas de acido nucleico. De esta manera, pueden usarse practicamente en cualquier ensayo conocido en la tecnica que detecta secuencias de acido nucleico especificas usando sondas de acido nucleico marcadas opticamente.

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Las SACN son especialmente adecuadas para ensayos quimicos multiplexados en los que la identidad de las SACN codifica la identidad de la diana del ensayo. Los ensayos multiplexados de la tecnica anterior que usan fluoroforos para codificar la identidad diana estan sometidos a numerosas restricciones graves impuestas por las propiedades fisicas y quimicas de los fluoroforos. Especificamente, diferentes fluoroforos tienen diferente excitacion maxima, por

lo que no es posible la excitacion coincidente de multiples dianas fluorescentes. Ademas, la emision de fluorescencia ocurre en bandas espectrales amplias de manera que las bandas de un fluoroforo a menudo solapan con las de otro. Como resultado, resolver incluso tres actividades de fluorescencia requiere una optica sofisticada para separar y despues detectar las longitudes de onda de emision individuales. Debido a estos problemas, los ensayos 5 multiplexados que usan fluoroforos dependen de informacion posicional para revelar la identidad de la diana. A menudo, los ensayos multiplexados con fluoroforos usan un soporte solido sobre el que los ligandos se disponen en posiciones definidas. La localizacion de la senal del fluoroforo revela la identidad de la diana; el tamano de la senal del fluoroforo en esta localizacion indica la cantidad de diana. Sin embargo, la sintesis de soporte solido con los reactivos localizados en posiciones especificas es cara y consume tiempo. Hay limites sobre el numero de 10 caracteristicas que pueden definirse sobre una unica superficie.

En contraste, las SACN de la presente invencion ofrecen una notable diversidad espectral y capacidad de resolucion. Como resultado, las SACN pueden usarse en ensayos multiplexados para producir informacion cuantitativa y cualitativa sin requerir la localizacion especifica de la posicion de los reactivos. Cada SACN acoplada 15 al reactivo especifico para la diana puede codificar la identidad de esta diana especifica y la intensidad de una senal Raman en particular revela la cantidad de diana. Por ejemplo, en los inmunoensayos intercalados descritos anteriormente, la identidad de las dianas capturadas sobre el soporte solido puede determinarse usando diferentes aromas de SACN para cada diana.

20 Aunque las SACN son perfectamente adecuadas para usar en aplicaciones de multiplexacion, no es necesario usarlas para codificar la identidad de esta manera. Pueden usarse simplemente como sustitutos para fluoroforos en ensayos multiplexados en los que los reactivos se localizan en posiciones especificas sobre soportes solidos. Cuando se usan de esta manera, ofrecen una deteccion de diana enormemente mas sensible que los fluoroforos.

25 La citometria de flujo es un ejemplo de un formato de ensayo multiplexado en el que la diversidad y capacidad de resolucion de las SACN puede explotarse totalmente. En una realizacion de esta solicitud, se proporcionan poblaciones de perlas a las que se conjugan anticuerpos primarios contra las dianas a detectar. Las perlas se ponen en contacto con la solucion de ensayo que contiene la dianas, y tambien con un segundo conjunto de anticuerpos contra las dianas. Cada anticuerpo secundario se conjuga con una GAN que codifica la identidad de la diana a la 30 que se unira. Las perlas se hacen pasar entonces a traves de un citometro de flujo que adquiere el espectro Raman de cada perla. Debido a que el espectrometro Raman puede muestrear todo el espacio de frecuencia de cada perla, es posible incluso poner muchos anticuerpos primarios diferentes en una sola perla; el espectro Raman de cada perla puede descodificarse para determinar que SACN esta presente y en que cantidad. Esto a su vez pone de manifiesto cuanto de cada diana se une a una sola perla. Se entendera que hay muchas variaciones de este 35 esquema basico, incluyendo el uso de reactivos distintos de anticuerpos para unir a las dianas de interes. Por consiguientes las SACN pueden usarse en diferentes variaciones de este esquema en el que es necesario o util marcar un reactivo.

En las realizaciones preferidas, las SACN se usan como marcadores opticos para citometria de exploracion con 40 laser de microvolumen (MLSC), en lugar de citometria de flujo. La MLSC se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con N° de serie 09/378.259, presentada el 20 de agosto de 1999, y la Solicitud de Patente de Estados Unidos con N° serie 09/558.094, presentada el 26 de abril del 2000. En una realizacion del sistema, un microscopio Raman explora un capilar que contiene los reactivos descritos anteriormente para las aplicaciones de citometria de flujo. El microscopio Raman mide el espectro Raman de cada perla en el capilar, obteniendo de esta 45 manera datos cuantitativos para cada diana a detectar. De nuevo es la senal Raman de cada SACN la que codifica la identidad de la diana. No se requieren reactivos especificos de posicion.

En otras realizaciones, las SACN se usan como marcadores opticos en la sintesis quimica combinatoria basada en soporte solido ("combi-quim") de bibliotecas de nuevos compuestos. Uno de dichos metodos se conoce como 50 sintesis "cortar y combinar". En este metodo, una preparacion de perlas resinosas adecuadamente derivatizadas se divide aleatoriamente en multiples poblaciones y cada poblacion se introduce en una mezcla de reaccion diferente. Las mezclas de reaccion diferentes pueden contener diferentes reactivos o los mismos reactivos aunque en diferentes condiciones de reaccion. Despues de la reaccion, las perlas se lavan, se recombinan y se dividen de nuevo en un conjunto de mezclas de reaccion. Debido a la manera aleatoria en la que se distribuyen las perlas, cada 55 perla experimental un historial de reaccion unico. El resultado es una biblioteca basada en perlas que comprende todos los compuestos sintetizados usando las diferentes permutaciones de las mezclas de reaccion. La biblioteca puede seleccionarse entonces para identificar los compuestos directores con la actividad deseada. Los compuestos directores a su vez pueden analizarse para determinar su composicion y estructura. El metodo combi-quim se ha usado para sintetizar bibliotecas de peptidos, benzodiazapenos y demas.

Si se conoce el historial de reaccion de una perla individual, entonces puede determinarse la composicion quimica y estructura del compuesto unido a la misma. Hay diversas maneras conocidas en la tecnica para codificar perlas con su historial de reaccion. En algunos metodos, cada mezcla de reaccion contiene una molecula identificadora que se 5 une a la perla durante la etapa de reaccion. Una vez completada la sintesis las moleculas identificadoras pueden escindirse de la perla de interes, y el historial de reaccion de la perla puede determinarse detectando las moleculas identificadoras individuales liberadas de la perla. Por ejemplo, los metodos de la tecnica anterior han usado oligonucleotidos cortos para codificar historiales de reaccion. Estos oligomeros deben escindirse de las perlas, amplificarse y despues secuenciarse para descodificar el historial de reaccion; este en un proceso que consume 10 tiempo. Debido a que dichas moleculas identificadoras deben escindirse en primer lugar de la perla, es necesario elegir una quimica en la que (a) escindir el identificador de la perla no modifique o escinda el compuesto director de la perla; y/o (b) escindir el compuesto director de la perla no modifique o escinda la molecula identificadora. Ademas, la quimica usada para acoplar el identificador y a menudo la simple presencia de las propias moleculas identificadoras en la superficie de las perlas puede interferir con las reacciones combi-quim reales. Dichas 15 consideraciones ponen muchas restricciones a todos los aspectos de la quimica usada en la sintesis combi-quim codificada.

Las SACN proporcionadas por la presente invencion pueden usarse para codificar el historial de reaccion de las perlas en dichos esquemas combinatorios. Cada mezcla de reaccion puede contener una especie unica de SACN de 20 manera que cada etapa de reaccion va acompanada de por la union de numerosas SACN a la perla tras lo cual tiene lugar la sintesis combinatoria. Por ejemplo, la mezcla de reaccion A puede codificarse por SACN1 cuando se usa en la etapa 1 del esquema de sintesis y por SACN2 cuando se usa en la etapa 2 del esquema de sintesis, y asi sucesivamente hasta SANCn cuando se usa en la etapa n del esquema de sintesis. Al final del esquema de sintesis, las perlas individuales pueden explorarse para la actividad del compuesto director deseada. Las perlas con actividad 25 deseada del compuesto director se examinan entonces por espectroscopia Raman. El espectro Raman de cada perla se descodifica automaticamente para detectar las especies individuales de las SACN que se han unido a cada perla. Esta informacion pone de manifiesto el historial de reaccion de la perla y, de esta manera, la estructura del compuesto director.

30 El uso de las SACN para codificar esquemas de sintesis combi-quim es un avance significativo respecto a la tecnica anterior. Todo el historial de reaccion de una perla puede determinarse tomando una unica medida espectral sin requerir que la perla experimente ninguna manipulacion fisica o quimica. De hecho, el espectro Raman puede obtenerse incluso en pocillos de microtitulacion. Debido a que la actividad Raman de las SACN puede medirse sin escindirlas de la perla, las restricciones de la eleccion de la quimica descritas anteriormente se reducen en gran 35 medida. De forma similar, la unica agrupacion quimica que las SACN exponen en la superficie de las perlas son los grupos de derivatizacion que unen la SACN a la perla y el encapsulante estable. De nuevo, esto reduce en gran medida los problemas de interferencia de la molecula identificadora con la sintesis combi-quim. Finalmente, la diversidad espectral sin precedentes ofrecida por las SACN permite la robusta codificacion de esquemas combi-quim que son mucho mas complejos que los permitidos por los metodos de codificacion de la tecnica anterior.

40

Ejemplos

Ejemplo 1

45 Sintesis de nanoparticulas cargadas con analitos de vidrio (GAN)

Materiales: el agua usada para todas las preparaciones era de 18,2 M^, destilada a traves de un sistema nanopuro Barnstead. Un tubo de dialisis de piel de serpiente, 3.500 MWCO, se adquirio en Pierce. 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTMS), 3-mercaptotrimetoxisilano (MPTMS), y 3-mercaptorpopilmetildiemtoxisilano (MPMDMS) se obtuvieron de 50 United Chemical. HAuCL-3H2O, citrato trisodico dihidrato, hidroxido sodico, trans-1,2-bis(4-piridil)etileno (BPE), piridina, 2-mercaptopiridina, silicato sodico, ortosilicato de tetraetilo (TEOS) se obtuvieron de Sigma-Aldrich. BPE se recristalizo varias veces antes de su uso. La resina de intercambio de cationes Dowex (malla 16-40) se obtuvo de J.T. Baker. El alcohol etilico puro (EtOH) se adquirio de Pharmco.

55 Preparacion de coloide: Au coloidal de 12 nm (casi esferico, con una desviacion tipica menor de 2 nm), se preparo a partir de HAuCL-3H2O reducido por citrato como se describe en Grabar y col., Analytical Chemistr y 67: 735-743 (1995). El coloide >12 nm se preparo de la siguiente manera: se anadieron 3 ml de HAuCL 12 mM por cada 97 ml de H2O. La solucion se llevo entonces a ebullicion con agitacion vigorosa y 1 ml de coloide de Au 12 nm como semilla y se anadieron 0, 5 ml de citrato sodico al 1% por 100 ml de HAuCL en solucion y se hirvio durante 10 minutos. El

tamano de las partfculas resultantes se determino por microscopia de transmision electronica usando software de imageries Gatan o NIH. Finalmente los iones citrato que rodeaban al coloide de Au se retiraron con dialisis, 7 intercambios de al menos 4 horas cada uno.

5 Preparation de las GAN:todas las reacciones se realizaron en matraces Erlenmeyer de plastico. Podia usarse cualquier cantidad de coloide en una preparacion y los reactantes posteriores se anadieron en cantidades apropiadas basadas en el area superficial y concentracion del coloide de Au.

Un experimento tipico usaba 25 ml de coloide de Au 0,17 nM de 0,50 nm dializado. El pH del coloide se ajusto de 5 10 a 7 con la adicion de 50 pl de NaOH 0,1 M. El coloide se hizo vitreofilo con adicion de 125 pl de MPTMS 0,5 mM (o APTMS, o MPMDMS). Despues de 15 minutos de agitacion magnetica, se anadieron 167 pl de una solucion 0,5 mM del marcador Raman (BPE, piridina, o 2-mercaptopiridina). Despues de otro periodo de 15 minutos de agitacion, se preparo una solucion al 0,54% de silicio activa mezclando 1 g de silicato sodico con 50 ml de NaOH 3 M y disminuyendo el pH a 10 con una resina de intercambio de cationes. Se anadio un ml de la silice activa y la solucion 15 resultante tenia un pH de aproximadamente 9. La solucion permanecio en agitacion durante 15 minutos y despues se dejo reposar.

Despues de un periodo de 24 horas, se anadieron 100 ml de EtOH a la solucion para proceder con el crecimiento de la silice mediante el metodo descrito en Stober y col., J. colloid interface Sci. 26: 62 (1968). El crecimiento de ~4 nm 20 de carcasa de vidrio adicional se consiguio con adiccion de 15 pl de TEOS y 125 pl de amoniaco. La reaccion se agito durante 15 minutos y despues se dejo reposar durante al menos 12 horas. La adicion de TEOS y amoniaco continuo hasta que se obtuvo el espesor de carcasa deseado.

Ejemplo 2

25

Microscopia de transmision electronica de las GAN

Las imagenes de microscopia de transmision electronica (TEM) se tomaron de las preparaciones de las GAN; estas imagenes TEM ilustran la uniformidad de las preparaciones de GAN. La figura 1A muestra GAN que comprenden 30 nucleos de Au de 35 nm con vidrio de 40 nm. La figura 1B muestra nucleos de Au de 60 nm con vidrio de 16 nm. La figura 2 ilustra Au de 35 nm, GAN de vidrio de 8 nm despues de la centrifugacion a traves de una solucion de glicerol al 50 %.

Ejemplo 3

35

Demostracion del secuestro del nucleo metalico desde el disolvente

Para las GAN que funcionan en diversos entornos quimicos, es necesario que el analito Raman-activo sea secuestrado del disolvente circundante. Para demostrar este secuestro pueden observarse las velocidades de 40 difusion a traves de la red de vidrio. Esto se realiza controlando la velocidad a que el agua regia (3 HCl:1 HNO3) puede atacar el nucleo de Au de una GAN. La figura 3 demuestra uno de dichos experimentos para un lote partfculas GAN con un nucleo de Au de 35 nm y carcasas de vidrio de 8 nm. Para 500 pl de GAN ~0,17 nM se anadieron 200 pl de una solucion de ataque (50 pl de HNO3 y 150 pl de HCl). La absorbancia de la solucion se midio (Xmax 546 nm) en diversos momentos despues de la adicion de la solucion de ataque. El ataque del nucleo de oro da 45 como resultado una disminucion en la absorbancia; esto se representa en la figura 3A (se indica el tiempo despues de la adicion de la solucion de ataque). La velocidad de ataque de Au se muestra en la figura 3B como una representacion de la absorbancia frente al tiempo en la solucion de ataque (derecha). Estudios adicionales realizados por los inventores han demostrado que el ataque de un nucleo de Au por agua regia no ocurre con una carcasa de vidrio de 20 nm en un periodo de tiempo de 4 horas.

50

Ejemplo 4

Espectros SERS de partfculas GAN

55 Las GAN que comprenden un nucleo de Au de 40 nm recubierto con trans-4,4'-bis(piridil)etileno (BPE) encapsulado en 4 nm de vidrio se sintetizaron y examinaron por espectroscopia Raman. En la figura 4 se representa el espectro Raman obtenido usando 20 mW a 632,8 nm de excitacion con una lente de 3 mm y 30 segundos de integracion. La traza A del grafico muestra la senal Raman de BPE caracteristica; la traza B muestra la senal Raman de las mismas partfculas sin el analito BPE. Puede observarse que las GAN sin el analito BPE no da esencialmente una senal

Raman.

Ejemplo 5

5 Confinamiento del analito Raman-activo en el nucleo metalico de las GAN por encapsulacion con vidrio

La figura 5 muestra el espectro Raman de una suspension de GAN que comprende Au de 40 nm recubierto con trans-4,4'-bis(piridil)etileno (BPE)/vidrio de 4 nm (traza A); sobrenadante de una primera centrifugacion de las GAN (traza B); y sobrenadante de una segunda centrifugacion de las GAN (traza C). Puede observarse que la senal 10 de BPE no deja las GAN durante cada etapa de centrifugacion, lo que indica que el BPE se ha adherido al nucleo de Au y esta secuestrado fuertemente alli por la encapsulacion de vidrio.

Ejemplo 6

15 Comparacion de los espectros SERS de analitos Raman-activos de las GAN con otros sustratos SERS

Las GAN (nucleo de Au 80 nm/vidrio 20nm) que contenian 2-mercaptopiridina como analito Raman-activo se analizaron por espectroscopia Raman usando 25 mW de excitacion a 632, 8 nm, con una lente de 3 mm y 60 segundos de integracion. El espectro Raman de la preparacion de GAN se compara entonces con el espectro 20 Raman obtenido cuando una solucion 50 mM de 2-mercaptopiridina se absorbe sobre un sustrato SERS de 3 capas convencional (25 mW excitacion 632, 8 nm, lente 3 mm, integracion 30 segundos). La figura 6 muestra los dos espectros Raman. Puede observarse que los dos espectros tienen caracteristicas e intensidades identicas, lo que ilustra que las GAN son sustratos SERS eficaces.

25 Ejemplo 7

Espectros SERS de las GAN con mezclas de analitos Raman-activos.

Los espectros SERS de los siguientes cuatro aromas de particulas GAN se obtuvieron usando 26 mW a una 30 excitacion de 632, 8 nm, una lente de 3 mm, e integracion de 30 segundos: (A) GAN marcadas con furonitrilo; (B) GAN marcadas con furonitrilo (66 %) y acido cianoacetico (33 %); (C) GAN marcadas con furonitrilo (33 %) y acido cianoacetico (66 %); y (D) GAN marcadas con acido cianoacetico. Los porcentajes indicados son las concentraciones relativas de cada compuesto en la solucion de marcado anadida. La figura 7 muestra que el furonitrilo y el acido cianoacetico tienen una intensidad de senal relativamente igual y tienen perfiles espectrales 35 similares. El hecho de que los espectros de B y C sean muy similares al espectro de D indica que el acido cianoacetico tiene una mejor afinidad por la nanoparticula de Au que el furonitrilo.

Ejemplo 8

40 Espectros SER de GAN marcadas con imidazol (IM) y trans-4,4’-bis(piridil)etileno (BPE)

Las GAN (nucleo de Au 40 nm/vidrio 4 nm) se marcaron con (a) trans-4,4'-bis(piridil)etilen (BPE-GAN) o (b) imidazol (IM-GAN). Los espectros SERS de estos analitos Raman-activos se muestran en la figura 8 junto con los espectros SER de las GAN no marcadas (c) de las mismas dimensiones. BPE-GAN e IM-GAN muestran ambos las bandas 45 Raman caracteristicas de los analitos Raman-activos respectivos; las GAN no marcadas no muestran estas bandas.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una partfcula que comprende una nanoparticula de metal que tiene unido a esta un analito de espectroscopia potenciada superficial (analito SES-activo, caracterizado por que la nanoparticula metalica y el

   5 analito (SES)-activo unido a esta estan rodeados por un encapsulante, y por que dicha nanoparticula metalica esta compuesta por un metal seleccionado de entre el grupo que consiste en Au, Ag, Cu, Na, Al y Cr.
2. 2. La partfcula de la reivindicacion 1, en la que dicha nanoparticula metalica comprende una aleacion de al menos dos metales seleccionados de entre el grupo que consiste en Au, Ag, Cu, Na, Al y Cr.

   10
3. 3. La partfcula de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que dicha nanoparticula metalica es un nucleo revestido con al menos una cubierta metalica, y en la que dicho nucleo y al menos una de dichas cubiertas metalicas estan compuestos por un metal seleccionado de entre el grupo que consiste en Au, Ag, Cu, Na, Al y Cr.

   15 4. La partfcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha nanoparticula metalica es

   menor de 200 nm de diametro, y tiene preferiblemente un diametro de 40-100 nm.
4. 5. La partfcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho encapsulante tiene un espesor de 1 -40 nm, y tiene preferiblemente un espesor de 3-10 nm.

   20
5. 6. La partfcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho analito SES-activo forma una submonocapa, una monocapa o un revestimiento multicapa sobre dicha nanoparticula metalica, preferiblemente en la que dicho analito SES-activo se selecciona de entre el grupo que consiste en una especie inorganica, una especie organica, una mezcla de especies organicas, una mezcla de especies inorganicas, o una

   25 mezcla de especies organicas e inorganicas, un complejo no covalente de especies organicas, un complejo no covalente de especies inorganicas, y un complejo no covalente entre una especie organica y una especie inorganica, o se selecciona de entre el grupo que consiste en especies cargadas positivamente, especies cargadas neutras, y especies cargadas negativamente.

   30 7. La partfcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho analito SES-activo tiene

   una composicion isotopica distinta de una especie abundante en la naturaleza.
6. 8. La partfcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho encapsulante se selecciona de entre el grupo que consiste en vidrio, polimeros, metales, oxidos metalicos, y sulfuros metalicos, en la

   35 que opcionalmente dicho encapsulante comprende al menos dos materiales seleccionados de entre el grupo que consiste en vidrios, polimeros, metales, oxidos metalicos y sulfuros metalicos.
7. 9. La partfcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho encapsulante es oxido de vidrio (SiOx), en la que preferiblemente la nanoparticula metalica que tiene unida a esta un analito SES-activo esta

   40 rodeada por una red de oxido de vidrio (SiOx).
8. 10. La partfcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el analito SES-activo es detectable, identificable o cuantificable por un metodo seleccionado de entre el grupo: SERS, SERRS, SEHRS, SEHRRS o SEIRA.

   45
9. 11. La partfcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho encapsulante comprende un polimero, preferiblemente un polimero que no interfiere con la actividad SERS.
10. 12. Un metodo para fabricar las particulas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que 50 comprende:

    a) Unir un analito SES-activo a una nanoparticula metalica; y

    b) revestir dicha nanoparticula metalica unida a analito con un encapsulante.

    55 13. Un metodo para marcar opticamente una molecula, celula, perla o soporte solido que comprende unir

    la partfcula como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 a dicha molecula, celula, perla o soporte solido, en el que opcionalmente dicha molecula es una biomolecula, preferiblemente un acido nucleico o una proteina.
11. 14. Un metodo para realizar un ensayo que comprende: usar una partfcula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para senalar el resultado del ensayo; y medir el espectro SES de dicho ensayo para determinar la presencia de dicha partfcula,

    opcionalmente en el que el metodo comprende usar un panel de diferentes particulas que tiene un unico espectro 5 SERS en un ensayo multiplexado.
12. 15. Un metodo para codificar el historial de reaccion de un soporte solido, comprendiendo dicho metodo las etapas de (a) hacer reaccionar dicho soporte solido con un primer reactivo en una primera condicion de reaccion; (b) unir al soporte una primera especie de particulas que comprende una nanoparticula metalica que tiene unida a

    10 esta un primer analito SES-activo y esta rodeada por un encapsulante como se ha definido en la reivindicacion 1, en

    el que dicha primera especie de particulas codifica el primer reactivo o primera condicion de reaccion; (c) hacer

    reaccionar el soporte con un segundo reactivo en una condicion de reaccion; y (d) unir al soporte una segunda especie de particulas que comprende una nanoparticula metalica que tiene unida a esta un segundo analito SES- activo y esta rodeada por un encapsulante como se ha definido en la reivindicacion 1, codificando dicha segunda 15 especie de partfcula el segundo reactivo o segunda condicion de reaccion, teniendo dicha segunda especie de partfcula un espectro diferente de dicha primera especie de partfcula; en el que un compuesto se sintetiza en dicho soporte solido por un proceso que comprende la etapa (a) y la etapa (c), y en el que el historial de reaccion codificada de dicho soporte solido se decodifica analizando dicho soporte solido por SES.

    20 16. El metodo de la reivindicacion 13 o la reivindicacion 14, en el que el metodo o metodos de deteccion,

    identificacion o cuantificacion para el analito SES-activo se escoge de entre el grupo: SERS, SERRS, SEHRS,

    SEHRRS o SEIRA.
13. 17. Uso de una partfcula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 como un marcador

    25 optico en un inmunoensayo tipo sandwich, en un ensayo multiplexado, para citometria de exploracion con laser de microvolumen, o sintesis quimica combinatoria basada en soporte solido de bibliotecas de nuevos compuestos.