ES2641337T3 - Métodos, sistemas y dispositivos para detectar e identificar microorganismos en muestras de cultivo microbiológicas - Google Patents

Métodos, sistemas y dispositivos para detectar e identificar microorganismos en muestras de cultivo microbiológicas Download PDF

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Adam C. Curry
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Wendy Dale WOODLEY
Melody M.H. Kuroda
Ammon David Lentz
Dwight Livingston
Michael Justin Lizzi
Artis R. Lockhart
Ernie Ritchey
Eric A. FALLOWS
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Abstract

Un método para detectar uno o más microorganismos en una muestra, comprendiendo el método: (a) proporcionar una muestra que se sospecha que contiene uno o más microorganismos; (b) disponer dicha muestra en un vial de ensayo, en el que dicho vial de ensayo tiene dispuesto en el mismo un medio de cultivo capaz de dar soporte al crecimiento de microorganismos para formar una muestra de cultivo y un reactivo que comprende una o más partículas indicadoras que tienen asociadas con el mismo al menos un miembro de unión específico que tiene una afinidad por dichos uno o más microorganismos; y una o más partículas de captura magnética que tienen asociadas con las mismas al menos un miembro de unión específico que tiene una afinidad por dichos uno o más microorganismos, en el que el miembro de unión asociado con las partículas indicadoras puede ser el mismo o diferente que el miembro de unión asociado con las partículas de captura magnética; (c) incubar la muestra de cultivo durante un periodo de tiempo predeterminado para formar un complejo de partícula de captura magnética-microorganismo-partícula indicadora si dichos uno o más microorganismos están presentes en la muestra; (d) agitar el vial de ensayo; (e) exponer dicho complejo de partícula de captura magnética-microorganismo-partícula indicadora a un campo magnético para inducir que dicho complejo migre a un área localizada de dicho vial de ensayo; (f) explorar ópticamente dicha área localizada de dicho vial de ensayo para inducir que dicha partícula indicadora produzca una señal detectable para detectar dichos uno o más microorganismos en dicha muestra; (g) dispersar dicho complejo de partícula de captura magnética-microorganismo-partícula indicadora; y (h) repetir las etapas (c)-(g) una o más veces.

Description

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ya que se desconoce que muestras contienen patogenos y a que niveles, los protocolos de ensayo de seguridad alimentaria usan tiempos de cultivo largos para asegurar que se da suficiente tiempo para que crezca hasta una concentracion detectable el peor caso posible de un patogeno danado. Como consecuencia, las muestras con mayores cargas patogenas se cultivan mas tiempo de lo que puede ser estrictamente necesario, lo que conduce a un retardo en el tiempo hasta los resultados. Existe por lo tanto la necesidad en el campo de metodos de ensayo de patogenos que minimicen el tiempo hasta obtener resultados y reduzcan el riesgo de exposicion de la instalacion y el personal a patogenos cultivados.
Estan presentes preocupaciones similares con respecto a muestras clfnicas tales como sangre. Desde mediados de los 80, junto con la expansion del tamano de la poblacion de pacientes inmunocomprometidos, la incidencia de septicemia provocada por patogenos oportunistas, tales como levadura, hongos y micobacterias, ha aumentado. La bacteriemia, la presencia de bacterias en el torrente sangufneo, y la fungemia, la presencia de hongos o levaduras en el torrente sangufneo, se detectan tfpicamente recogiendo una muestra de sangre venosa y poniendo la muestra de sangre en un frasco de cultivo sangufneo que contiene un medio de cultivo adecuado para promover el crecimiento de las bacterias u hongos de interes. Vease en general, Reimer et al., “Update on Detection of Bacteremia and Fungemia,” Clinical Microbiology Reviews 10(3), 444-465 (1997). La muestra de cultivo sangufneo puede despues incubarse durante un periodo de tiempo y comprobarse intermitentemente con respecto a un indicio de crecimiento bacteriano o fungico.
Los metodos instrumentales conocidos en la tecnica para supervisar el crecimiento bacteriano o fungico en frascos de cultivo sangufneo tfpicamente detectan cambios en la concentracion de dioxido de carbono y/u oxfgeno en el frasco de cultivo sangufneo. Estos instrumentos detectan la presencia y ausencia de microorganismos pero no son especfficos con respecto al tipo particular de organismo presente. Para una muestra nominalmente esteril tal como sangre, la deteccion de un microorganismo en la muestra puede ser indicativa de enfermedad grave. Sin embargo, el resultado positivo se considera un resultado parcial o preliminar y tfpicamente no es procesable. Como el tratamiento optimo de la enfermedad se basa en la identificacion del organismo y la determinacion de su susceptibilidad a antibioticos, el personal de laboratorio debe estar disponible para continuar cultivos positivos hasta su identificacion completa (ID) y ensayos de susceptibilidad antimicrobiana (ESA). La identificacion del organismo requiere acceso de la muestra de cultivo sangufneo positiva por parte del personal de laboratorio para tratamiento adicional de la muestra.
El tratamiento de la muestra despues de un resultado de cultivo sangufneo positivo, es decir, un resultado que indica la presencia pero no la identidad de un microorganismo, incluye con frecuencia la clasificacion del microorganismo en una de dos clases amplias de organismos: Gram positivos o Gram negativos. Los ensayos de cultivos sangufneos basados en la deteccion de CO2 u O2 durante el proceso de cultivo no puede distinguir entre organismos patogenos, tales como S. aureus y contaminantes, tales como S. epidermidis ya que estos metodos son sensibles solamente al crecimiento y ausencia de crecimiento. La clasificacion e identificacion de organismos se realiza despues de la deteccion del crecimiento en una muestra de cultivo sangufneo. Por ejemplo, estan disponibles kits para diferenciar entre especies de Staphylococcus y Streptococcus y otros organismos. Tambien estan disponibles kits para diferenciar entre organismos, tales como S. aureus y S. epidermidis. Estos kits, sin embargo, requieren retirar al menos una alfcuota de una muestra de cultivo sangufneo del frasco de cultivo sangufneo y otros procedimientos que pueden exponer potencialmente al operador al patogeno o destruir una parte del cultivo sangufneo que podrfa usarse para otros analisis. Tambien requieren tfpicamente que el personal de laboratorio entrenado este disponible para realizar los ensayos, lo que conduce potencialmente a un retardo en los resultados clfnicos procesables en el caso de que una muestra de cultivo sangufneo resulta positivo cuando no este disponible personal de laboratorio para realizar ensayos adicionales (por ejemplo, en hospitales que funcionan en un unico turno).
Aunque existen en la actualidad instrumentos para detectar la presencia o ausencia de microorganismos en sangre (por ejemplo, mediante el uso de un sensor de dioxido de carbono u oxfgeno), estos instrumentos no son tfpicamente utiles en muestras no esteriles tales como heces o muestras alimentarias. Para muestras tales como, por ejemplo, alimentos, se espera que haya una concentracion significativa de microorganismos benignos, y por lo tanto la deteccion de organismos por sensores de dioxido de carbono u oxfgeno no es inherentemente util. Para una muestra alimentaria, es crftico detectar la presencia de niveles bajos de organismos patogenos en un fondo de microflora benigna alta para evitar la propagacion de enfermedades transmitidas por alimentos.
Por lo tanto, existe la necesidad de metodos, sistemas y dispositivos para detectar no solamente la presencia o ausencia de organismos durante la etapa de cultivo de muestras nominalmente esteriles, sino tambien la identificacion de los organismos. Para muestras no esteriles, tales como heces y alimentos, existe tambien la necesidad de metodos, sistemas y dispositivos para identificar organismos potencialmente perjudiciales en un cultivo de una manera biocontenida. Dichos metodos, sistemas y dispositivos minimizan la intervencion del usuario, minimizando de este modo el tiempo, el personal cualificado, mas exposicion potencial del personal y el ambiente al patogeno.
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Sumario de la invencion
(a) proporcionar una muestra que se sospechosa que contiene uno o mas microorganismos;
(b) disponer dicha muestra en un vial de ensayo, en el que dicho vial de ensayo tiene dispuesto en el mismo un medio de cultivo capaz de dar soporte al crecimiento de microorganismos para formar una muestra de cultivo y un reactivo que comprende una o mas partfculas indicadoras que tienen asociadas con las mismas al menos un miembro de union especffica que tiene una afinidad por dichos uno o mas microorganismos; y una o mas partfculas de captura magnetica que tienen asociadas con las mismas al menos un miembro de union especffica que tiene una afinidad por dichos uno o mas microorganismos, en el que el miembro de union asociado con las partfculas indicadoras puede ser igual o diferente del miembro de union asociado con las partfculas de captura magnetica;
(c) incubar la muestra de cultivo durante un periodo de tiempo predeterminado para formar un complejo de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora si dichos uno o mas microorganismos estan presentes en la muestra;
(d) agitar el vial de ensayo;
(e) exponer dicho complejo de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora a un campo magnetico para inducir la migracion de dicho complejo a un area localizada de dicho vial de ensayo;
(f) explorar opticamente dicha area localizada de dicho vial de ensayo para inducir que dicha partfcula indicadora produzca una senal detectable para detectar dichos uno o mas microorganismos en dicha muestra;
(g) dispersar dicho complejo de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora; y
(h) repetir las etapas (c)-(g) una o mas veces.
Tambien se desvelan en el presente documento sistemas y dispositivos para detectar la presencia, cantidad y/o identidad de microorganismos especfficos en un cultivo microbiologico. De acuerdo con una realizacion, los ensayos desvelados en el presente documento pueden realizarse dentro del vaso de cultivo, de modo que se realice deteccion y/o identificacion de microorganismos especfficos junto con cultivo, sin la necesidad de intervencion del usuario. Pueden identificarse uno o mas microorganismos dentro de un unico cultivo. El vaso de cultivo puede estar completamente biocontenido de modo que el crecimiento del microorganismo y la deteccion e identificacion del microorganismo pueda realizarse sin exponer al usuario o al ambiente circundante. Ademas, debido a la biocontencion del cultivo, el analisis del cultivo puede realizarse sin necesidad de que el usuario acceda al cultivo o lave el cultivo.
Las partfculas indicadoras opticamente activas, tales como nanopartfculas activas en dispersion de Raman potenciada en superficie (SERS), que tienen cada una asociados con las mismas uno o mas miembros de union especfficos que tienen una afinidad por el o los microorganismos de interes, pueden formar un complejo con microorganismos especfficos en la muestra de cultivo microbiologica. Por lo tanto, las partfculas indicadoras opticamente activas pueden ser cualquier partfcula capaz de producir una senal optica que pueda detectarse en una muestra de cultivo sin etapas de lavado. Ademas, pueden usarse partfculas de captura magnetica, que tambien tienen asociadas con las mismas uno o mas miembros de union especfficos que tienen una afinidad por el o los microorganismos de interes, que pueden ser iguales o diferentes a los miembros de union especfficos asociados con las partfculas indicadoras, para capturar el complejo de microorganismo-partfcula indicadora y concentrar el complejo en un area localizada de un recipiente de ensayo para posterior deteccion. Es importante que las realizaciones de los metodos desvelados en el presente documento, sistemas y dispositivos permitan deteccion “en tiempo real” e identificacion de microorganismos en una muestra en la que se produce crecimiento activo del microorganismo. Las muestras pueden incluir cultivos microbiologicos que comprenden un medio de cultivo y una muestra clfnica de un ser humano o animal (domestico o ganado) tal como sangre, heces, orina o lfquido cefalorraqufdeo. Las muestras tambien pueden incluir cultivos microbiologicos que comprenden un medio de cultivo y una muestra industrial tal como alimento, productos lacteos, bebidas, agua, productos ambientales, agrfcolas, productos de cuidado personal (incluyendo cosmeticos), biotecnologfa o productos farmaceuticos. Es importante que el ensayo pueda realizarse de una manera biocontenida sin exposicion del usuario o el ambiente a la muestra (“sistema cerrado”) y puede proporcionar deteccion automatica, constante, e identificacion de microorganismos supervisando la senal de ensayo a lo largo del tiempo a medida que progresa el cultivo. La combinacion de deteccion e identificacion con cultivo microbiologico puede conducir a una disponibilidad mas temprana de resultados procesables.
La deteccion de microorganismos por la presente invencion puede realizarse directa o indirectamente. Para deteccion directa de microorganismos que crecen en cultivo, los miembros de union especfficos asociados con las partfculas de captura magnetica y partfculas indicadoras pueden tener una afinidad por el microorganismo en gran medida intacto, por ejemplo uniendose con la superficie de bacterias o levadura. Para deteccion indirecta, los miembros de union asociados con las partfculas de captura magnetica y partfculas indicadoras pueden tener una afinidad por productos secundarios del microorganismo. Los ejemplos de productos secundarios podrfan incluir pero sin limitacion protefnas secretadas, toxinas y componentes de paredes celulares. Los modos de deteccion directa e indirecta pueden usarse solos o en combinacion.
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Se desvela en el presente documento un vaso para medir una cantidad deseada de muestra de cultivo. El vaso incluye un recipiente para recibir una muestra de cultivo en el mismo, en el que el recipiente tiene un extremo abierto y un extremo cerrado. El vaso tambien incluye una tapa configurada para conectar con el extremo abierto del recipiente en una conexion hermetica. Ademas, el vaso incluye una cesta acoplada a la tapa y que incluye uno o mas depositos, en el que la cesta se dispone entre el extremo abierto y el extremo cerrado del recipiente. Cuando se usa una pluralidad de depositos, cada deposito se configura para contener un volumen diferente de muestra de cultivo. Ademas, el vaso incluye uno o mas conjuntos de agujas conectados a la tapa, en el que el conjunto de aguja incluye una aguja que se extiende dentro de un deposito respectivo. Cada aguja se configura para retirar selectivamente una muestra contenida en un deposito respectivo, en el que cada aguja se configura adicionalmente para conectar con un vial para una transferencia biocontenida de la muestra del deposito al vial. Por lo tanto, el vaso puede ser adecuado para medir una cantidad deseada de muestra para dos ensayos diferentes (por ejemplo, Salmonella o Listeria) en un unico recipiente, facilitando al mismo tiempo la transferencia de la muestra a un vial de deteccion de una manera biocontenida. En otra realizacion de la presente invencion, el vial de ensayo para recibir una muestra se cierra por un obturador o tabique y tapon configurados para mantener un vacfo. Tras la conexion del tapon del vial de ensayo con un orificio compatible que contiene una aguja en el vaso de medicion, la muestra se transfiere de una manera biocontenida. El tapon del vial contiene elementos para retener el fluido expresado de forma externa de la transferencia y proteger al usuario del contacto con superficies de transferencia.
Se desvela en el presente documento un sistema para procesar automaticamente una pluralidad de tubos que contienen una muestra de cultivo. El sistema incluye un incubador para recibir una pluralidad de tubos de muestras del mismo, en el que el incubador se configura para incubar los tubos de muestra a una temperatura predeterminada. Por ejemplo, los tubos pueden situarse horizontalmente y adyacentes entre si. El incubador puede configurarse para incubar diferentes ensayos a temperaturas diferentes de acuerdo con una realizacion. El sistema incluye ademas un primer dispositivo de traslacion (por ejemplo, una “plataforma Y” para movimiento a lo largo de un eje Y) acoplado con la bandeja y configurado para mover los tubos de muestra dentro del incubador, en el que el primer dispositivo de traslacion se configura adicionalmente para mover los tubos de muestra del incubador a una zona de deteccion y agitar los tubos de muestra dentro de la zona de deteccion. Por ejemplo, el primer dispositivo de traslacion puede mover los tubos de muestras a lo largo de sus ejes longitudinales. El sistema tambien incluye un conjunto de iman configurado para aplicar un campo magnetico a la pluralidad de tubos de muestras dentro de la zona de deteccion, asf como un dispositivo optico configurado para explorar cada uno de la pluralidad de tubos de muestras dentro de la zona de deteccion para detectar uno o mas microorganismos. El sistema incluye un segundo dispositivo de traslacion (por ejemplo, una “plataforma X” para movimiento a lo largo de un eje X) acoplado con el dispositivo optico y configurado para mover el dispositivo optico dentro de la zona de deteccion para explorar cada uno de los tubos de muestras. El sistema tambien puede incluir un tercer dispositivo de traslacion (por ejemplo, una “plataforma Z” para el movimiento a lo largo del eje Z) acoplado al conjunto de iman y el dispositivo optico y configurado para mover el conjunto de iman y el dispositivo optico dentro de la zona de deteccion para acceder a otra bandeja de tubos apilados verticalmente sobre la primera bandeja. Por lo tanto, el sistema proporciona un sistema automatico y de alto rendimiento para procesar una pluralidad de muestras en tiempo real durante la incubacion de los tubos de cultivo.
Breve descripcion de los dibujos
Habiendo descrito de este modo la materia objeto desvelada en el presente documento en terminos generales, se hara ahora referencia a los dibujos adjuntos, que no estan dibujados necesariamente a escala, y en los que:
La Figura 1 es un diagrama esquematico que muestra un metodo para detectar e identificar un microorganismo en una muestra de cultivo de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 2 es un diagrama esquematico que muestra un vaso de enriquecimiento y un vial de deteccion para contener y transferir una muestra de cultivo de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 3 es un diagrama esquematico que muestra un metodo de deteccion intermitente e identificacion de un microorganismo en una muestra de cultivo de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 4 es un diagrama esquematico que muestra un metodo de deteccion en tiempo real e identificacion de un microorganismo en una muestra de cultivo de acuerdo con una realizacion de la invencion.
Las Figuras 5A-5E ilustran diversas vistas de un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 6 es una vista en seccion transversal de un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 7 es una vista despiezada de un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
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Las Figuras 9A-9C son diversas vistas de una cesta para un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
Las Figuras 10A y 10B ilustran un tapon para un vial de deteccion de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
Las Figuras 11A y 11B ilustran un tapon para un vial de deteccion de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 12 es una vista en seccion transversal de un tapon que conecta con un vial de deteccion de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
Las Figuras 13A y 13B son una vista en perspectiva y una vista despiezada de un tapon que conecta con un vial de deteccion de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
Las Figuras 14A y 14B son una vista en perspectiva y una vista despiezada de un tapon que conecta con un vial de deteccion de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 15 es una vista en seccion transversal de viales de deteccion que conectan con un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
Las Figuras 16 y 17 son vistas en seccion transversal de un vial de deteccion que conecta con un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 18 es un diagrama esquematico que muestra un complejo de partfcula de captura magnetica- microorganismo-partfcula indicadora SERS-activa dentro de un frasco de cultivo de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 19 representa una partfcula indicadora SERS activa de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 20 representa una partfcula indicadora SERS activa de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 21 representa una partfcula indicadora SERS activa de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 22 muestra un espectro de SERS representativo de una partfcula indicadora SERS activa que tiene asociada con la misma un colorante Raman activo de 4,4'-dipiridilo (DIPY) de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 23 muestra una senal de SERS representativa representada a lo largo del tiempo de cultivo para Salmonella de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 24 representa un sistema para supervision en tiempo real del crecimiento del microorganismo de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 25 representa un sistema para supervision en tiempo real del crecimiento de microorganismos de acuerdo con otra realizacion de la invencion.
Las Figuras 26-29 ilustran diversas vistas de un sistema para supervision en tiempo real de crecimiento del microorganismo de acuerdo con una realizacion adicional de la invencion.
La Figura 30 es una vista en perspectiva de una bandeja para contener tubos de muestras de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 31 ilustra etapas secuenciales para cargar tubos de muestras en una bandeja, cargar la bandeja en un incubador y retirar las bandejas del incubador, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 32 es una vista en perspectiva de una bandeja para contener tubos de muestras de acuerdo con otra realizacion de la presente invencion.
Las Figuras 33A-33C son vistas parciales de bandejas para contener tubos de muestras de acuerdo con diversas
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realizaciones de la presente invencion.
Las Figuras 35-39 son diversas vistas en seccion transversal del sistema mostrado en las Figuras 26-29.
La Figura 40 es una vista ampliada de una puerta trasera de un incubador de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 41 es una vista en perspectiva de una plataforma X de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 42 es una vista en perspectiva de un conjunto de iman, una plataforma X y una plataforma Z de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 43 es una vista lateral de un conjunto de iman, un conjunto de sedimentacion/lectura, una plataforma X, una plataforma Y y una plataforma Z en una posicion baja de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 44 es otra vista en perspectiva del sistema mostrado en las Figuras 26-29.
Las Figuras 45 y 46 son vistas en perspectiva parciales de un conjunto de iman, un conjunto de sedimentacion/lectura y una plataforma X de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 47 es una vista en perspectiva parcial de un conjunto de iman y una plataforma Y de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
Las Figuras 48A-48B son vistas en perspectiva de un sistema para supervision en tiempo real de crecimiento de microorganismos encerrados en un armario de acuerdo con realizaciones de la presente invencion.
La Figura 49 ilustra un metodo para agitar y sedimentar una muestra de cultivo de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 50 representa un sistema de sedimentacion y optico de acuerdo con una realizacion de la invencion.
Las Figuras 51 y 52 ilustran disposiciones de imanes alternativas para sedimentar una muestra de cultivo de acuerdo con realizaciones de la presente invencion.
La Figura 53 representa una deteccion multiple de S. aureus y S. epidermidis de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 54 muestra los resultados de un experimento en el que se comparo el tiempo hasta la deteccion de crecimiento de E. coli para muestras de cultivo sangufneo con y sin los reactivos de SERS HNW adecuados para su uso en las diversas realizaciones de la invencion.
La Figura 55 muestra una grafica en la que el crecimiento de Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium, denominada en el presente documento como Salmonella Typhimurium (u otro nombre de serovar de Salmonella), se superviso en relacion con el efecto de sedimentacion en el mismo de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 56 muestra una grafica que ilustra el efecto de sedimentacion en el crecimiento de microorganismos de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 57 ilustra una imagen de un precomplejo (PC) de perlas magneticas-SERS en agua despues de sedimentacion con un iman fijo de acuerdo con una realizacion.
Las Figuras 58A-58B son imagenes de formacion de sedimentos de PC en medio secundario de Salmonella SDIX usando un iman fijo y diferentes frecuencias de agitacion de acuerdo con una realizacion.
Las Figuras 59A-59B son imagenes de formacion de sedimentos de PC en medio secundario de Salmonella SDIX usando un iman acoplado y diferentes frecuencias de agitacion de acuerdo con una realizacion.
La Figura 60 muestra una grafica en la que se comparo el tiempo hasta la deteccion de C. albicans en sangre usando una deteccion sencilla de SERS de acuerdo con una realizacion de la invencion.
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La Figura 61 muestra una grafica en la que se comparo el tiempo hasta la deteccion de C. albicans en sangre usando un metodo de SERS multiple de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 62 muestra una grafica en la que se comparo el tiempo hasta la deteccion de E. coli y S. epidermidis en sangre usando un metodo de SERS multiple de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 63 ilustra una grafica de deteccion en tiempo real de E. coli en sangre con medio aerobico y resinas que absorben antibioticos de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 64 muestra una grafica de la deteccion de E. coli en sangre para volumenes de muestras diferentes de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 65A muestra una curva de SERS con imagenes capturadas a diversos tiempos durante el enriquecimiento secundario de Salmonella Typhimurium de acuerdo con una realizacion.
La Figura 65B muestra una curva de SERS con imagenes capturadas a diversos tiempos durante el enriquecimiento secundario para una muestra negativa de acuerdo con una realizacion.
La Figura 65C muestra una curva de SERS con imagenes capturadas a diversos tiempos durante el enriquecimiento secundario de Salmonella Typhimurium de acuerdo con una realizacion.
La Figura 66 muestra curvas de SERS solapantes para diferentes velocidades de agitacion durante el enriquecimiento secundario de Salmonella Typhimurium de acuerdo con una realizacion.
La Figura 67 muestra imagenes de sedimentos para una muestra positiva y una muestra negativa, respectivamente, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
Las Figuras 68A-68C ilustran curvas de SERS para la deteccion en tiempo real de E. coli durante el cultivo en muestras alimentarias de acuerdo con realizaciones de la presente invencion.
La Figura 69 ilustra curvas de SERS para la deteccion en tiempo real de Salmonella Enteritidis durante el cultivo en muestras alimentarias de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 70 ilustra curvas de SERS para la deteccion en tiempo real de Listeria obtenida por hisopado de acero inoxidable de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 71 muestra un diagrama de flujo de fases para la deteccion de Salmonella Typhimurium usando agitacion lineal de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 72 ilustra curvas de SERS solapantes durante el enriquecimiento secundario para Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis y muestras negativas de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 73 muestra imagenes de sedimentos formados durante el enriquecimiento secundario de Salmonella Typhimurium de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 74 muestra curvas de SERS obtenidas de agitacion de balanceo y agitacion lineal durante el enriquecimiento secundario de S. Enteritidis y S. Kentucky de acuerdo con una realizacion.
La Figura 75 muestra imagenes de tubos de muestras que contienen S. aureus y S. epidermidis en plasma de conejo EDTA, con y sin reactivos de SERS, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 76 muestra imagenes de ensayos de aglutinacion de latex con S. aureus y S. epidermidis, con y sin reactivos de SERS, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 77 es una imagen ampliada de tincion de gram de una mezcla de partfculas magneticas y marcadores de SERS de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 78 es una imagen ampliada de controles con tincion de gram de S. aureus y E. coli con partfculas magneticas y marcadores de SERS de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 79 muestra imagenes de placas de S. aureus CHROMagar sembradas en estrfas con un cultivo sangufneo de S. aureus y S. epidermidis con reactivos de SERS de acuerdo con realizaciones de la presente invencion.
La Figura 80 es una imagen de una placa de agar sembrada en estrfas con un cultivo sangufneo de E. coli con
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La Figura 81 es una tabla que muestra mediciones de diametro de zona para E. coli, con y sin reactivos, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 82 es una tabla que muestra un sumario de los resultados de ensayo de susceptibilidad a antibioticos manual usando BD Sensi-discs™ y diversos microorganismos con y sin reactivos de SERS, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 83 muestra imagenes de placas de agar sembradas en estrfas con un cultivo sangufneo de E. coli y C. albicans, con y sin reactivos, con discos antifungicos BD Taxo™ superpuestos, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 84 es una tabla que muestra imagenes de sedimentos formados en medios secundarios de Salmonella usando diferentes frecuencias de agitacion y tiempos de sedimentacion, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 85 es una tabla que muestra el efecto de la frecuencia de agitacion en dispersion de sedimentos, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 86 ilustra un vaso de enriquecimiento de acuerdo con otra realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 87 es una vista en seccion transversal de una jeringa de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 88 es una vista en seccion transversal de una jeringa conectada con un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
Las Figuras 89A-89C son vistas en seccion transversal ampliadas de una jeringa conectada con un vaso de enriquecimiento de acuerdo con diversas realizaciones de la presente divulgacion.
Las Figuras 90A y 90B son vistas en seccion transversal ampliadas de una jeringa de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 91 es una vista en seccion transversal de una jeringa y una vista en perspectiva de un embolo de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 92 es una vista en seccion transversal de una jeringa y una vista en perspectiva de un embolo de acuerdo con otra realizacion de la presente divulgacion.
Las Figuras 93-95 ilustran estaciones de reconstitucion de acuerdo con diversas realizaciones de la presente invencion.
La Figura 96 es una imagen de nanopartfculas de sflice fluorescentes fabricadas de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 97 muestra una grafica que representa la intensidad de senal de nanopartfculas de sflice fluorescentes fabricadas y marcadores de SERS convencionales de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 98 muestra una grafica que representa la intensidad de senal a lo largo del tiempo de nanopartfculas de sflice fluorescentes fabricadas y marcadores de SERS convencionales para detectar la presencia de Listeria en espinacas de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 99 muestra una grafica que representa la intensidad de senal a lo largo del tiempo de nanopartfculas de sflice fluorescentes fabricadas y marcadores de SERS convencionales para detectar la presencia de Listeria en col de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
La Figura 100 es una vista en perspectiva de un recipiente para un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 101 es una vista superior de una tapa para un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
La Figura 102 es una vista inferior de la tapa mostrada en la Figura 101.
La Figura 103 es una vista en perspectiva inferior de la tapa mostrada en la Figura 101.
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La Figura 104 es una vista lateral de la tapa mostrada en la Figura 101.
La Figura 105 es una vista en seccion transversal de la tapa mostrada en la Figura 101.
La Figura 106 es una vista lateral de una cesta para un vaso de enriquecimiento de acuerdo con una realizacion
de la presente divulgacion.
La Figura 107 es una vista superior de la cesta mostrada en la Figura 106.
La Figura 108 es una vista inferior de la cesta mostrada en la Figura 106.
La Figura 109 es una vista en perspectiva de la cesta mostrada en la Figura 106.
Descripcion detallada de la invencion
La materia objeto desvelada por la presente se describira ahora mas completamente en lo sucesivo en el presente documento con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestran algunas, pero no todas, de las realizaciones de la materia objeto desvelada por la presente. Los expertos en la materia a la que pertenece la materia objeto desvelada por la presente seran conscientes de muchas modificaciones y otras realizaciones de la materia objeto desvelada por la presente expuesta en el presente documento teniendo el beneficio de las ensenanzas presentadas en las descripciones anteriores y los dibujos asociados. Por lo tanto, debe entenderse que la materia objeto desvelada por la presente no debe limitarse a las realizaciones especfficas desveladas y que se pretende que se incluyan modificaciones y otras realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque se emplean terminos especfficos en el presente documento, estos se usan en un sentido generico y descriptivo solamente y no para fines de limitacion.
Los terminos “un”, “una”, “el” y “la” se refieren a “uno o mas” cuando se usan en la presente solicitud, incluyendo las reivindicaciones. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una muestra” incluye una pluralidad de muestras, a no ser que el contexto claramente indique lo contrario (por ejemplo, una pluralidad de muestras) y asf sucesivamente.
A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, las palabras “comprenden”, “comprende” y “comprender” se usan en un sentido no exclusivo, excepto cuando el contexto requiera otra cosa.
Como se usa en el presente documento, se entiende que el termino “aproximadamente”, cuando hace referencia a un valor, abarca un valor especffico y variaciones del mismo. Dichas variaciones pueden ser, en algunas realizaciones ± 100 %, en algunas realizaciones ± 50 %, en algunas realizaciones ± 20 %, en algunas realizaciones ± 10 %, en algunas realizaciones ± 5 %, en algunas realizaciones ± 1 %, en algunas realizaciones ± 0,5 % y en algunas realizaciones ± 0,1 % de la cantidad especffica, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los metodos desvelados o emplear las composiciones desveladas.
Ademas, cuando se proporciona una cantidad, concentracion u otro valor o parametro como un intervalo, intervalo preferido o una lista de valores superiores preferibles y valores inferiores preferibles, debe entenderse que esta desvela especfficamente todos los intervalos formados a partir de cualquier par de cualquier lfmite del intervalo superior o valor preferido y cualquier lfmite de intervalo inferior o valor preferido, independientemente de si los intervalos se desvelan por separado. Cuando se enumera en el presente documento un intervalo de valores numericos, a no ser que se indique de otro modo, se pretende que el intervalo incluya los puntos finales del mismo, y todos los numeros enteros y fracciones dentro del intervalo. No se pretende que el alcance de la materia objeto desvelada en el presente documento se limite a los valores especfficos enumerados cuando se define un intervalo.
Las realizaciones de la presente invencion proporcionan metodos que utilizan partfculas indicadoras (por ejemplo, partfculas indicadoras activas en dispersion de Raman potenciada en superficie (SERS)), para detectar y/o identificar uno o mas microorganismos en una muestra de cultivo bacteriano por un ensayo sin lavado homogeneo (HNW). Mas especfficamente, las realizaciones de la invencion describen tecnicas para supervisar la concentracion de microorganismos en “tiempo real” a medida que aumenta el nivel de microorganismos a lo largo del tiempo dentro de una muestra. Las partfculas indicadoras tienen asociadas con las mismas uno o mas miembros de union especfficos que tienen una afinidad por el o los microorganismos que se ensayan. Cuando se pone en contacto con una muestra de cultivo microbiologico que contiene uno o mas microorganismos de interes, puede formarse un complejo, denominado en general en el presente documento complejo de partfcula indicadora-microorganismo, entre el o los microorganismos de interes y la partfcula indicadora con un miembro de union especffica asociado. El complejo de partfcula indicadora-microorganismo puede capturarse por una partfcula de captura magnetica y concentrarse para formar un sedimento en un area localizada (es decir, una “zona de medicion”) para deteccion midiendo la senal (por ejemplo, espectro de SERS) y/o una inspeccion visual de una imagen del sedimento. No se pretende que el termino “sedimento”, como se usa en el presente documento, sea limitante y en una realizacion se refiere a una coleccion de una pluralidad de partfculas indicadoras y partfculas de captura magnetica localizadas en un area localizada facilitada por la aplicacion de un campo magnetico, en el que el sedimento es detectable usando medios visuales, opticos u otros adecuados. El sedimento tambien puede incluir microorganismos capturados entre
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medias, si estan presentes, y otros componentes y/o microorganismos pueden unirse de forma no especffica con las partfculas magneticas. El sedimento puede formarse temporalmente ya que el sedimento puede dispersarse tras la retirada del campo magnetico como se analiza en mas detalle posteriormente.
Ademas, las diversas realizaciones de la invencion se refieren a la capacidad de realizar el ensayo de HNW repetidas veces dentro de la misma muestra de cultivo microbiologico, formando, dispersando y reformando el sedimento a lo largo del tiempo. Esto permite que la concentracion de un analito particular se supervise en tiempo real dentro de una muestra de cultivo microbiologico y es particularmente valioso cuando la concentracion de microorganismos cambia a lo largo del tiempo, por ejemplo en respuesta a crecimiento bacteriano. Mas particularmente, las realizaciones de la invencion se refieren a la capacidad para realizar el ensayo de HNW dentro de un vaso de cultivo microbiologico, detectando e identificando de este modo simultaneamente un microorganismo a medida que crece. Ademas, la tecnica puede usarse junto con otros metodos para supervisar la muestra de cultivo (tal como sensor de gases o analisis de imagenes).
De acuerdo con una realizacion de la invencion, se realiza un cultivo microbiologico de la muestra en un vaso que tambien contiene los reactivos de HNW. El vaso de cultivo se inserta en un instrumento que permite la incubacion a una temperatura controlada y contiene dispositivos opticos (por ejemplo, optica de Raman, un laser de Raman y un espectrometro). A intervalos temporales regulares durante el cultivo, se aplica un campo magnetico, y la senal de SERS se lee desde el sedimento magnetico. El sedimento se dispersa entre lecturas para permitir interacciones continuadas de los reactivos con la muestra. A medida que aumenta la concentracion del organismo diana durante el proceso de enriquecimiento, se realiza deteccion e identificacion del microorganismo por la tecnologfa de SERS en cuanto la concentracion del microorganismo alcanza el umbral de deteccion de la tecnologfa. La capacidad de supervisar continuamente la senal de SERS durante el cultivo asegura que se use el mfnimo tiempo de cultivo requerido y que el instrumento pueda alertar automaticamente al usuario cuando se detecte e identifique un microorganismo.
Una realizacion adicional usa una camara para supervisar la formacion y el tamano de un sedimento durante un ensayo de HNW que contiene partfculas indicadoras conjugadas y perlas magneticas y el patogeno diana dentro de un vaso de cultivo. Las imagenes muestran que el tamano del sedimento aumenta, y en algunos casos el sedimento desaparece, de la vista de camara a medida que progresa el ensayo de HNW. El crecimiento del tamano del sedimento y/o la desaparicion del sedimento es un indicio de la presencia del patogeno diana. Las imagenes capturadas durante el analisis de muestras que contienen partfculas indicadoras conjugadas y perlas magneticas sin patogeno no muestran ningun cambio en el tamano del sedimento y ninguna desaparicion del sedimento. Este metodo de deteccion puede usarse solo o junto con otro metodo de deteccion.
I. Consideraciones generales para la deteccion e identificacion de microorganismos en una muestra de cultivo microbiologico
Como se usa en el presente documento, la expresion “muestra de cultivo microbiologico” se refiere a una composicion que comprende una muestra “clfnica” o una muestra “industrial” con el potencial de contener microorganismos que se disponen en, se mezclan con o se combinan de otro modo con un medio de cultivo, por ejemplo, un caldo de cultivo de sangre, capaz de dar soporte al crecimiento de uno o mas microorganismos que se sospecha que estan presentes en la muestra. Mas particularmente, las realizaciones de la materia objeto desvelada por la presente proporcionan metodos, sistemas y dispositivos para detectar microorganismos en una muestra de cultivo microbiologico que comprenden un medio capaz de dar soporte al crecimiento del microorganismo en una muestra clfnica, tal como sangre, heces, orina o lfquido cefalorraqufdeo, o en una muestra de producto industrial, tal como alimento, hisopos ambientales o esponjas, agua, productos cosmeticos, productos de higiene, productos farmaceuticos u otros productos que se pretende que sean usados o consumidos por animales o seres humanos.
La deteccion y/o identificacion de microorganismos en muestras de cultivo microbiologico, especialmente con metodos opticos o espectrometricos, puede presentar muchos retos debido a la complejidad de la matriz de muestras. Las muestras clfnicas, particularmente las de sangre o heces, son opticamente absorbentes, haciendo diffcil detectar senales opticas o espectrales sin etapas de lavado o lisis para retirar los componentes de interferencia optica de las muestras originales. Las muestras industriales, tales como, por ejemplo, muestras alimentarias o cosmeticas, pueden ser opticamente absorbentes, requiriendo de nuevo etapas de lavado o lisis para retirar interferentes opticos en la muestra original. Aunque se ha indicado la aplicacion de SERS para detectar celulas de mamffero y microorganismos y la aplicacion de diagnostico de partfculas indicadoras SERS activas para detectar una diversidad de analitos en presencia de muestras de sangre y alimentos, no se ha indicado la aplicacion de partfculas indicadoras SERS activas para supervisar concentraciones de bacterias y hongos en “tiempo real” a medida que las concentraciones cambian debido al crecimiento del microorganismo. Como se usa en el presente documento, no se pretende que “tiempo real” sea limitante y puede referirse a supervision de la muestra de cultivo continuamente o en incrementos de tiempo predeterminados. Por ejemplo, la muestra de cultivo puede ensayarse repetidas veces en incrementos de tiempo predeterminados (por ejemplo, cada 30 minutos, 1 hora, etc.) durante un periodo de incubacion predeterminado sin abrir el tubo de muestras manteniendo de este modo la biocontencion de la muestra. No se pretende que “biocontencion”, como se usa en el presente documento, sea limitante y puede referirse a que la muestra de cultivo esta en un sistema cerrado de modo que el ambiente circundante fuera del
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recipiente en el que se confina la muestra de cultivo no se expone a los microorganismos que se cultivan.
Ademas, los metodos desvelados por la presente permiten el uso diagnostico de partfculas indicadoras en cultivos microbiologicos de una manera que no inhiba el crecimiento del microrganismo que se detecta.
Los metodos actuales de deteccion de la presencia o ausencia de patogenos durante el crecimiento microbiologico, por ejemplo armarios de cultivo de sangre, no detectan especfficamente organismos, sino un producto no especffico del metabolismo (por ejemplo, dioxido de carbono). Por lo tanto, estos sensores pueden potencialmente activarse falsamente por dioxido de carbono producido por otros procesos, tales como oxidacion, degradacion y respiracion de las celulas de cultivo sangufneo (por ejemplo, celulas de mamffero) que son flora normal en una muestra sangufnea. Esta senal “de fondo sangufneo” significativa es una fuente de ruido importante que complica los algoritmos de positividad y reduce la sensibilidad analftica general. La senal generada a partir de un acontecimiento de union especffico, como se describe en los metodos desvelados por la presente, seran un claro indicador de que un patogeno esta presente y probablemente no se interprete erroneamente.
Las diversas realizaciones de la presente invencion permiten el crecimiento continuo, la deteccion e identificacion todos dentro de la geometrfa de un unico vial. La tecnologfa de SERS HNW permite un sistema de cultivo capaz de proporcionar alertas constantes (24 horas/7 dfas a la semana) en muestras positivas para crecimiento junto con informacion de identificacion adicional (por ejemplo, informacion o identificacion de tincion de gram). A diferencia de los sistemas de cultivo sangufneo actualmente en el mercado que detectan la ausencia o presencia de crecimiento, el ensayo de SERS HNW puede proporcionar identificacion del microorganismo o la clase de microorganismos. Pueden seleccionarse anticuerpos conjugados con la SERS y partfculas magneticas para identificar especfficamente bacterias gram positivas frente a gram negativas. Resulta importante que las capacidades de multiplexacion inherentes de la tecnologfa de SERS son claves para el cultivo sangufneo y las aplicaciones industriales.
Los sensores basados en gas existentes tales como los usados en armarios de cultivo sangufneo son inadecuados para detectar la presencia de microorganismos patogenos en muestras (por ejemplo, heces, alimentos o muestras ambientales) en las que hay un alto nivel esperado de microorganismos benignos de fondo. No existe en la actualidad ningun metodo conocido para deteccion de patogenos en tiempo real dentro de un alimento o una muestra ambiental, debido a que estos tipos de muestras tfpicamente tienen microorganismos de fondo (benignos) que tambien crecen durante el cultivo, de modo que un sensor basado en el crecimiento no puede distinguir entre el crecimiento de los organismos de fondo y crecimiento del patogeno diana.
Ademas, los metodos existentes para identificacion de microrganismos requieren una combinacion de etapas de preparacion y/o lavado de muestras para retirar componentes de interferencia, minimizar la senal de fondo y/o generar una muestra que sea opticamente transparente. Debido a los requisitos de preparacion y lavado de muestras, estos metodos no pueden aplicarse dentro de un cultivo continuo.
El ensayo de SERS-HNW supera los problemas de la necesidad de etapas de lavado generando una senal de Raman que puede leerse en una muestra sucia o no aislada. Tambien permite la deteccion e identificacion multiples en matrices de complejo, haciendolo de este modo adecuado para la deteccion multiple de infecciones del torrente sangufneo o patogenos alimentarios. Estos atributos del ensayo de HNW se han desvelado previamente. Sin embargo, en todas las divulgaciones previas conocidas, el ensayo de HNW se aplico una unica vez a una unica muestra, es decir, se formo un sedimento y se leyo para generar la “respuesta” (identificacion + deteccion). No ha habido ningun indicio de que la realizacion del ensayo de HNW sea compatible con los requisitos especfficos de supervision en tiempo real en cultivo, especfficamente:
- La necesidad de mantener la viabilidad del cultivo (la formacion del complejo con el microorganismo no puede inhibir el crecimiento);
- La capacidad de dispersar de forma fiable y reproducible el sedimento magnetico una vez que se ha formado para permitir que la SERS y los reactivos magneticos continuen interaccionando con la muestra;
- La capacidad de la senal del ensayo de SERS HNW para aumentar y reducirse a lo largo del tiempo en respuesta a cambios continuos en la concentracion diana; y
- La capacidad de realizar el ensayo HNW en volumenes grandes tales como los usados tfpicamente en cultivo sangufneo y aplicaciones industriales, ya que se habrfa esperado inicialmente que los requisitos de volumen de reactivo tuvieran costes prohibitivos y/o que no se podrfa formar un sedimento que fuera representativo del volumen completo. (Se esperarfa que cualquier campo magnetico de tamano razonable solamente atrajera partfculas magneticas del microambiente local).
Puede usarse un ensayo de HNW de acuerdo con una realizacion de la invencion para detectar patogenos tales como E. coli, Listeria, Salmonella, etc. que crecen en muestras alimentarias o ambientales. Ya que la presencia de incluso un unico organismo danado es significativa, las muestras se cultivan tfpicamente para recuperar y hacer crecer selectivamente al patogeno hasta un nivel detectable. Debido a que la muestra inicial puede tener un intervalo
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de concentraciones de patogeno, los diversos niveles de dano al patogeno y/o microorganismos de fondo competidores altamente variables, el tiempo de cultivo requerido hasta alcanzar el lfmite de deteccion para cualquier metodo analftico dado puede variar ampliamente. Por esta razon, los protocolos de deteccion se formulan tfpicamente para escenarios “en el peor de los casos”, es decir la duracion del tiempo de cultivo se elige para asegurar que el patogeno danado individual crece hasta un nivel detectable. Despues se realiza deteccion e identificacion del patogeno (por ejemplo, mediante inmunoensayo o PCR) al finalizar el cultivo. Ya que la carga inicial de patogeno en cualquier muestra dada no puede conocerse a priori, todas las muestras se someten a este protocolo de cultivo largo para asegurar que no falta ningun patogeno. Sin embargo, es probable que muchas muestras hubieran producido deteccion e identificacion positiva despues de protocolos de cultivo mas cortos, proporcionando una notificacion mas temprana al experimentador de que hay un problema con la muestra. La combinacion del ensayo de HNW basado en SERS con el cultivo permite la supervision en tiempo real de la carga del patogeno en la muestra a lo largo del cultivo, proporcionando la ventaja significativa de que se detectan muestras con mayores cargas patogenas tan pronto como sea posible en el protocolo de cultivo.
II. Sistemas, metodos y dispositivos para la identificacion de microorganismos en una muestra de cultivo microbiologico
Las realizaciones de la presente invencion se dirigen a metodos para detectar e identificar microorganismos en una muestra de cultivo. En referencia a la Figura 1, el proceso incluye en general proporcionar una pluralidad de partfculas indicadoras, miembros de union y partfculas de captura magnetica en un vaso y anadir una muestra que potencialmente incluye uno o mas microorganismos. El vaso tambien puede incluir medio de cultivo o crecimiento para ayudar en la selectividad o crecimiento adicional de microorganismos. La muestra se incuba despues y se agita durante un periodo de tiempo predeterminado. En los puntos temporales seleccionados o en un programa predeterminado durante el trascurso de la incubacion, se aplica un campo magnetico al vaso para formar un sedimento. El sedimento se explora despues con una fuente de luz para producir una senal detectable (por ejemplo, un espectro de SERS) que se detecta y analiza. El sedimento puede despues dispersarse y el proceso repetirse en el siguiente punto temporal determinado.
La Figura 2 muestra una realizacion de la metodologfa y los dispositivos que pueden usarse para detectar e identificar microorganismos en una muestra de cultivo. A este respecto, la Figura 2 ilustra que se obtiene un volumen deseado de una muestra ambiental (por ejemplo, aproximadamente 1 l o menos), una muestra alimentaria (por ejemplo, aproximadamente 25 g a 375 g que da como resultado un volumen de aproximadamente 250 ml a 3 l) o una muestra clfnica (por ejemplo, de aproximadamente 100 ml o menos) y se coloca en un vaso de enriquecimiento. En este caso, el vaso de enriquecimiento se configura para facilitar el analisis de ensayos de Salmonella o Listeria. El vaso de enriquecimiento se incuba durante un periodo de tiempo predeterminado, despues de lo cual se transfiere una cantidad predeterminada de muestra a un vial de deteccion de una manera biocontenida, que se explicara en mas detalla posteriormente. El vial de deteccion se coloca despues en un sistema de SERS en tiempo real para incubacion adicional y analisis automatico usando tecnologfa SERS, que tambien se analiza en mas detalle posteriormente.
De acuerdo con una realizacion, el sistema de SERS se configura para acomodar una pluralidad de viales de deteccion y de este modo proporcionar un sistema de alto rendimiento. El sistema de SERS tambien puede configurarse para facilitar un analisis automatico de una pluralidad de ensayos diferentes. Por ejemplo, el sistema de SERS puede incluir zonas dedicadas para manipulacion y analisis de cada ensayo.
Los metodos de acuerdo con las realizaciones de la invencion proporcionan supervision en tiempo real del crecimiento de microorganismos en muestras de cultivo microbiologico. La Figura 3 muestra una realizacion de la supervision intermitente del crecimiento de microorganismos o una realizacion de punto final. En esta realizacion, se anaden reactivos de SERS HNW 1 al vaso 2 donde se realiza el cultivo. El medio 3 y la muestra 4 se anaden al vaso 2 y el vaso 2 se coloca en un incubador 5 de modo que se permite el crecimiento del microorganismo (por ejemplo bacterias, levadura o celulas). En puntos temporales seleccionados por el usuario (bien durante el cultivo o bien al final de un periodo de cultivo) el vaso se retira del incubador 5 y se coloca en un lector de SERS 6, que (despues de la mezcla apropiada de la muestra) forma un sedimento magnetico y lee la senal de Raman. El vaso puede despues reinsertarse en el incubador 5 para permitir tiempo de crecimiento adicional, si no se detecta la senal de Raman.
La Figura 4 muestra una realizacion alternativa en la que la senal de SERS se supervisa de forma continua durante el crecimiento bacteriano. En esta realizacion, el incubador y lector de SERS se integran en un unico instrumento 7 que, en puntos temporales prescritos, forma el sedimento magnetico, lee la senal de SERS y dispersa los reactivos sin necesidad de intervencion del usuario.
A. Vaso de enriquecimiento y vial de deteccion
Los frascos de cultivo microbiologico, tubos, jeringas, viales, vasos y similares (por ejemplo, vasos de enriquecimiento y viales de deteccion) adecuados para su uso con los metodos, sistemas y dispositivos desvelados por la presente pueden, en algunas realizaciones, estar hechos de vidrio o plastico. En algunas aplicaciones, es deseable un plastico multicapa para controlar la permeabilidad a gases. En las realizaciones en las que el vaso de
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cultivo microbiologico esta hecho de plastico multicapa, el frasco puede moldearse por inyeccion o soplado y tener capas internas y externas de poliester, polipropileno, polietileno, cloruro de polivinilo, policarbonato, polietilentereftalato (PET), copolfmero de olefina cfclico (COC) o cualquier copolfmero o mezcla del mismo separado por una capa intermedia de nailon, alcohol de etilenvinilo (EVOH), alcohol de polietilenvinilo o copolfmeros o mezclas de los mismos. Sin embargo, se entiende que el vaso puede no ser multicapa en otras realizaciones y formarse usando tecnicas similares, (por ejemplo, moldeo por inyeccion o soplado). En algunas aplicaciones, los componentes del vaso pueden tratarse con recubrimiento de superficie o metodos qufmicos para combatir las interacciones vaso/muestra o propiedades ffsicas. En algunas realizaciones, el vaso puede ser transparente a la radiacion visible, aunque, en realizaciones particulares, no se requiere dicha transparencia. Adicionalmente, en algunas realizaciones, los vasos desvelados por la presente pueden ser adaptables para esterilizacion. Ademas, en algunas realizaciones, el vaso es adecuado para cultivo aerobio o anaerobio. En una realizacion, el vaso es permeable a gases. Ademas, el vaso puede incluir un grosor de pared constante a lo largo de su longitud que puede potenciar la sedimentacion y el analisis optico.
Las Figuras 5A-5E y 7 representan un vaso de enriquecimiento 50 de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion. Opcionalmente, el vaso de enriquecimiento 50 puede contener medio de cultivo seco o lfquido. El vaso de enriquecimiento incluye en general una tapa 52, una cesta 54, conjuntos de agujas 56 y un recipiente 58. La tapa 52 se conecta con la cesta 54 y se configura para conectarse con y sellar el recipiente 58 en una conexion hermetica, tal como usando un ajuste roscado o por presion. En un ejemplo, la tapa 52 puede roscarse en el recipiente 58 pero incluirfa uno o mas elementos de separacion para evitar que se desenrosque la tapa sin desconectarse adicionalmente del elemento de separacion (por ejemplo, presionar hacia abajo y rotar la tapa para su retirada). Por lo tanto, la tapa 52, los conjuntos de agujas 56 y la cesta 54 pueden acoplarse entre si para poder conectar y desconectar del recipiente 58 como una unidad. Por ejemplo, la tapa 52 y la cesta 54 pueden acoplarse entre si por presion o usando otras tecnicas adecuadas tales como adhesivos, sellado por calor o pasadores. A este respecto, la Figura 9C ilustra que la cesta 54 puede incluir orificios de pasadores 60 para conectar con pasadores 62 para fijar la tapa y la cesta entre si (vease tambien Figura 5A). La Figura 8 muestra el fondo de la tapa que incluye una pluralidad de agujeros 65 que se alinean con agujeros respectivos 60 en la cesta (vease Figura 9C) para recibir los pasadores 62 a traves de ellos. De forma similar, los conjuntos de agujas 56 pueden unirse a la tapa 52 usando tecnicas de fijacion similares, tales como un ajuste por presion, conexion enroscada o adhesivos. El recipiente 58 se configura para contener una cantidad deseada de una muestra en el mismo y, por lo tanto, puede ser de diversos tamanos y formas segun sea necesario. Por ejemplo, las Figuras 5A-5C, 7 y 100 ilustran formas ejemplares de un recipiente 58. En una realizacion, la cesta 54 y el recipiente 58 pueden ser transparentes o translucidos para facilitar la visibilidad dentro del recipiente y, en particular, la visibilidad de la muestra dentro de los depositos 64, 66. Ademas, la Figura 100 ilustra que el recipiente 58 puede incluir una o mas lfneas de volumen 59 para visualizar la cantidad de muestra contenida en el recipiente. La Figura 7 tambien ilustra que el vaso 50 puede incluir una junta 68 u otro miembro de sellado usado para asegurar una conexion hermetica entre la tapa 52 y el recipiente 58.
El vaso de enriquecimiento 50 incluye un par de conjuntos de agujas 56 y depositos 64, 66. Sin embargo, se entiende que puede haber uno o mas conjuntos de agujas 56 y depositos 64, 66 en realizaciones alternativas. En la realizacion ilustrada, un conjunto de aguja 56 y deposito 64 o 66 se configura para uso con un tipo de ensayo particular (por ejemplo, Salmonella o Listeria). Debido a que se cultivan diferentes microorganismos usando diferentes medios y tamanos de muestras, el vaso de enriquecimiento facilita el uso de una unica cesta para diferentes ensayos.
La cesta 54 se muestra en mas detalle en las Figuras 9A-9C. La cesta 54 incluye un par de depositos 64, 66, con cada deposito configurado para contener un volumen de muestra predeterminado. Como se muestra, los depositos 64, 66 se separan del fondo del recipiente 58, en el que este espacio se configura para contener una muestra deseada. A este respecto, el primer deposito 66 se configura para contener un volumen mayor que el segundo deposito 64. En una realizacion especffica, el primer deposito 66 se configura para contener aproximadamente 5 ml y el segundo deposito 64 se configura para contener aproximadamente 100 pl. Como se muestra, los depositos 64, 66 pueden moldearse para facilitar la medicion de la muestra asf como alineamiento con un conjunto de aguja respectivo 56. Por ejemplo, las Figuras 5A-5C y 6 ilustran que cada aguja 70 se inserta dentro de un deposito 64, 66 y hasta la posicion mas baja del mismo para asegurar que se retira sustancialmente toda la muestra medida. Por lo tanto, la longitud de la aguja 70 puede ajustarse dependiendo del tamano del deposito, ya que la aguja que se extiende dentro del primer deposito 66 es mas larga que la aguja que se extiende dentro del segundo deposito 64. La forma del deposito 64, 66 puede ser cualquier forma que sea adecuada para conservar la cantidad deseada de muestra. Por ejemplo, las Figuras 5A, 5B, 5C, 5E y 9B muestran que el segundo deposito 64 tiene una forma en general conica, mientras que el primer deposito 66 tiene superficies que se extienden a lo largo de la aguja y se estrechan hacia la base de la aguja.
La Figura 9C en particular ilustra que la cesta 54 incluye varios agujeros 72, 74 definidos por la misma. Tfpicamente, la cantidad de muestra en el recipiente 58 estarfa por debajo de los agujeros 72 cuando el recipiente este en una posicion vertical, pero estarfa al menos por debajo de la entrada a cada deposito 64, 66 de modo que pueda medirse un volumen deseado. Los agujeros 72 pueden definirse dentro de la cesta adyacente a los depositos, mientras que los agujeros 74 pueden definirse mediante una superficie superior 76 de la cesta adyacente a una parte 78 que conecta con la tapa. Los agujeros 72 localizados adyacentes a los depositos 64, 66 se configuran para drenar el
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exceso de muestra dentro de un deposito respectivo. Concretamente, cuando el vaso de enriquecimiento 50 se inclina desde una posicion horizontal erguida para llenar uno de los depositos 64, 66, la devolucion del vaso a la posicion erguida da como resultado que el deposito rebose de muestra y el exceso de muestra se drenara posteriormente a traves de los agujeros 72. Como tal, un volumen deseado se mide de una manera repetible dentro de cada deposito 64, 66. Los agujeros 74 definidos en la superficie superior 76 de la cesta 54 pueden usarse para permitir que la muestra entre en los depositos 64, 66 evitando tambien al mismo tiempo que se transfieran partfculas no deseadas en la muestra a los depositos. Se entiende que la cesta 54 puede modificarse dependiendo de la cantidad de muestra para medir y el tipo de muestra, tal como modificando el tamano y la profundidad del deposito 64, 66, asf como el tamano y la profundidad de los agujeros. A este respecto, la Figura 9C ilustra que los agujeros 72, 74 pueden estrecharse en diferentes direcciones entre si para ayudar a drenar, siendo la entrada a los agujeros 72 adyacentes al deposito mayor que la entrada a los agujeros 74 en la superficie superior 76 de la cesta. La entrada de agujero mas pequeno puede usarse para filtrar la entrada de cualquier partfcula no deseable a los depositos. Ademas, las Figuras 106-109 ilustran una realizacion en la que la cesta 54 incluye los agujeros 72, 74 que son de aproximadamente el mismo tamano. Ademas, la cesta 54 tambien puede incluir un nervio 75 u otra superficie elevada que se configura para ayudar a drenar el fluido a traves de la cesta. En particular, el nervio 75 puede estar en el centro de la cesta 54 para facilitar el vertido durante la filtracion y el drenaje ofreciendo una superficie capaz de drenar el exceso de fluido por encima de la cesta con diferentes caracterfsticas de drenaje que el resto de agujeros en la superficie superior 76 de la cesta. Las Figuras 106 y 108 ilustran una realizacion en la que una superficie de fondo de los depositos 64, 66 puede incluir una o mas protrusiones 119 que ayudan a drenar disipando el fluido del deposito y permitiendo que se incorporen multiples agujeros de drenaje 72.
Como se muestra en la Figura 9B, cada deposito 64, 66 se separa de una superficie superior 76 de la cesta con un espacio de cabeza respectivo 80, 82. Los espacios de cabeza 80, 82 permiten que la muestra entre facilmente en un deposito respectivo 64, 66 cuando se inclina el recipiente. Por lo tanto, cuando el recipiente 58 esta inclinado, la muestra entra a traves de los agujeros 74 definidos en la superficie superior 76 de la cesta 54, en el espacio de cabeza 80 u 82, y entran en el deposito 64 o 66. Cuando el recipiente 58 se devuelve a una posicion erguida, el deposito 64 o 66 rebosa debido a un exceso de muestra localizado en el espacio de cabeza 80 u 82, en el que el exceso de muestra se drena despues a traves de los agujeros 72 definidos adyacentes al deposito y se devuelve al recipiente. Como se muestra en la Figura 9B, los agujeros 72 definidos adyacentes a los depositos 64, 66 se localizan debajo de la apertura que conduce al deposito para facilitar el drenaje y medir la cantidad de muestra deseada.
Cada deposito 64, 66 se alinea con un conjunto de aguja 56 respectivo como se muestra en las Figuras 5A-5C y 6. En una realizacion la tapa 52 incluye una parte 78 que conecta con la tapa, en la que la parte que conecta con la tapa se configura para acoplar la cesta 54 y la tapa entre si como se ha analizado anteriormente. La parte 78 que conecta con la tapa y la cesta 54 tienen un diametro externo mas pequeno que el diametro interno de la apertura del recipiente 58 para configurarlo para insertar dentro del recipiente. La parte 78 que conecta con la tapa tambien puede incluir aperturas para recibir conjuntos de aguja 56 respectivos que se extienden a los depositos 64, 66. Las agujas 70 se localizan dentro de la parte 78 que conecta con la tapa de modo que las agujas se configuran para conectar con un vial de deteccion como se analiza en mas detalle posteriormente. A este respecto, la parte 78 que conecta con la tapa incluye una superficie conica o ahusada 105 frente a una apertura respectiva 102, 104 que se configura para recibir y conectar con un conjunto de aguja 56. Las agujas 70 se extienden adicionalmente a traves de aperturas respectivas definidas en el fondo de la superficie conica 105 al espacio de cabeza 80, 82 y dentro de un deposito respectivo 64, 66 (vease Figuras 5A-5C y 6). La Figura 6 ilustra que cada conjunto de aguja 56 puede conectar con la parte 78 que conecta con la tapa de modo que las agujas 70 se extiendan proximas a los depositos 64, 66. La Figura 6 ilustra que la tapa 52 tambien puede incluir un respiradero 86 definido en el mismo para permitir que escape cualquier producto secundario gaseoso, no peligroso, del recipiente para evitar que se acumule la presion durante el cultivo. Las Figuras 102-103 y 105 ilustran una realizacion alternativa en la que un poste de ventilacion 125 se extiende desde una superficie inferior de la tapa 52. El poste de ventilacion 125 define una apertura a traves de ella para recibir y conectar con un filtro para filtrar cualquier producto secundario gaseoso que salga del recipiente 58. El poste de ventilacion 125 se alinea con el respiradero 86. A este respecto, el poste de ventilacion 125 se configura para dirigir productos secundarios gaseosos, no peligrosos, a traves de la apertura en el poste de ventilacion y a traves del respiradero 86 definido en una superficie superior de la tapa 52.
Las Figuras 102-103 y 105 tambien ilustran que la tapa 52 puede incluir ademas un poste de conexion 127 que se extiende hacia afuera desde una superficie inferior de la tapa. El poste de conexion 127 se configura para alinearse con y conectar con un poste de conexion correspondiente 129 que se extiende hacia afuera desde una superficie superior de la cesta 54, como se muestra en las Figuras 106, 107 y 109. Como se ilustra, el poste de conexion 127 tiene un diametro menor que el poste de conexion 129, aunque los tamanos relativos de los postes pueden invertirse si se desea. Ademas, la parte de conexion 78 mostrada en las Figuras 103-105 se configura para conectar una parte de conexion correspondiente 121 definida en una superficie superior de la cesta 54 (vease Figuras 106, 107 y 109). En particular, puede modificarse el tamano de la parte de conexion 78 y esta puede configurarse para superponerse sobre y rodear la parte de conexion 121. La periferia externa de la superficie de conexion 121 puede definir una pluralidad de nervios 123. Cuando las superficies de conexion 78 y 121 se conectan entre si (por ejemplo, deslizando y/o rotando una con respecto a la otra), los nervios pueden configurarse para comprimir los nervios 123. La compresion puede ser suficiente para crear un ajuste de friccion entre la tapa 52 y la cesta 54. En una
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realizacion, los nervios 123 pueden aplastarse o deformarse de otro modo para crear un ajuste de friccion.
Cada conjunto de aguja 56 se configura para conectar con un vial de deteccion respectivo 100. El vial de deteccion 100 puede incluir una configuracion de tapon particular para acoplarse con una apertura respectiva 102, 104 definida en la tapa 52. Por lo tanto, cada tapon puede asociarse con un tipo especffico de muestra de modo que el riesgo de usar el medio erroneo para un microorganismo se minimiza. Por ejemplo, la tapa 52 puede incluir una apertura en forma de cerradura 104 que solamente permite acoplar el tapon del vial de deteccion cuando el tapon se orienta para conectar con las ranuras 110 (vease Figura 6). La Figura 101 muestra una realizacion alternativa de una tapa 52 en la que las ranuras 110 se definen a lo largo de la longitud de la apertura 104, incluyendo a lo largo de la superfine conica 105. Las ranuras 110 pueden definirse en la superficie interna de la apertura, como se muestra en la Figura 6, o tanto en la superficie interna como en la externa de la apertura como se muestra en las Figuras 101103.
Las Figuras 10A y 10B ilustran una realizacion ejemplar de un tapon 106 adecuado para su uso con un vial de deteccion. A este respecto, el tapon 106 incluye una pluralidad de nervios 108 que se configuran para conectar con ranuras respectivas 110 definidas en la apertura 104 de la tapa 52 (vease Figura 5D). Por lo tanto, para que el tapon 106 se inserte dentro de la apertura 104, los nervios 108 necesitarfan alinearse radialmente dentro de las ranuras 110. Ademas, el tapon 106 incluye una pluralidad de elementos de conexion 112 que se configuran para conectar el vial de deteccion 100 en un ajuste por presion. La conexion por presion puede minimizar la ovalizacion del vial de deteccion 100, asf como desplazamiento del tapon 106 durante la manipulacion. Se entiende que el tapon 106 y el vial de deteccion 100 pueden fijarse juntos usando otras tecnicas adecuadas, tales como una conexion de tapon/manguito enroscado o plegado, adhesivos, soldado ultrasonico y/o sellado por calor. La Figura 13A ilustra el tapon 106 conectado con un vial de deteccion 100, de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion.
Como se ha mencionado anteriormente, el tapon 106 puede tener diferentes configuraciones para diferentes ensayos de modo que se elimina el riesgo de usar el vial de deteccion incorrecto 100. Por ejemplo, las Figuras 11A y 11B ilustran una configuracion de tapon alternativo 114, mientras que la Figura 14A muestra el tapon 114 conectado con un vial de deteccion 100. Como se ilustra, cada tapon 106, 114 puede incluir una pluralidad de nervios 108 y elementos de conexion 112. El tapon 114 puede configurarse para ser recibido dentro de una apertura respectiva 102, aunque no es necesario que la apertura incluya ranuras correspondientes. Por lo tanto, el tapon 114 puede ser recibido dentro de la apertura 102 independientemente de su orientacion radial, pero el tapon 114 no podrfa insertarse dentro de la apertura 104. Por lo tanto, los nervios 108 del tapon 106 pueden evitar el acceso a la apertura 102 en la tapa 52 al igual que el diametro externo del tapon 114 puede evitar el acceso a la apertura 104.
Las Figuras 12, 13B y 14B ilustran elementos adicionales del vial de deteccion 100 y el tapon 114 de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion. Concretamente, el tapon 114 incluye un obturador 116 y una almohadilla absorbente 118 dispuesta entre el tapon y el obturador. La almohadilla absorbente 118 puede usarse para absorber cualquier muestra que salga del vial de deteccion 100 despues de transferir la muestra del vaso de enriquecimiento 50 al vial de deteccion minimizando de este modo la exposicion al tecnico o ambiente. El tapon 114 tambien puede tener un reposadedos 117 para evitar el contacto accidental de una almohadilla potencialmente humeda. Ademas, el obturador 116 puede ser de cualquier material adecuado que este configurado para crear una conexion hermetica con el vial de deteccion 100 (es decir, lfquido y gas), asf como para ser perforado por una aguja para volver a sellar con una conexion hermetica despues de ser perforado por una aguja y para conectar con el vial de deteccion. Por ejemplo, el obturador 116 puede ser una goma adecuada o un material elastomerico. La Figura 12 tambien ilustra la conexion entre los elementos de conexion 112 y la protrusion 115 del vial de deteccion 100. Por lo tanto, los tapones 106, 114 pueden conectar con el vial de deteccion 100 en un ajuste por presion, que evitarfa la retirada o el desplazamiento no intencionados del tapon. La forma de la protrusion 115 puede ser cualquier forma que permita un ajuste por presion retentivo con los elementos de conexion 112.
Los viales de deteccion 100 pueden incluir los reactivos y opcionalmente un medio, tal como por ejemplo un medio de cultivo especffico, dependiendo del microorganismo que se ensaye en la muestra. Los reactivos y medios pueden estar presentes en el vial de deteccion en un formato seco (por ejemplo, deshidratado) o en un formato humedo (por ejemplo, hidratado). Por ejemplo, los medios y el reactivo pueden secarse. Los viales de deteccion 100 tambien pueden contener un vacfo cuando el obturador 116 se conecta con los mismos. Por lo tanto, cuando el vial de deteccion 100 se inserta dentro de una apertura 102, 104 respectiva en la tapa 52, el obturador 116 y la almohadilla absorbente 118 se perforan por la aguja 70, y la muestra dentro del deposito 64 o 66 se saca a traves de la aguja y al vial de deteccion (vease Figuras 15-17). En un ejemplo, la parte de la aguja 70 que se extiende a la apertura 102 o 104 puede incluir un manguito protector 120 que se configura para comprimirse a medida que el vial de deteccion 100 se empuja hacia abajo y en conexion con la aguja. Cuando el manguito protector 120 se comprime, la aguja 70 se expone y penetra en el obturador 116, permitiendo que el vacfo extraiga la parte de la muestra contenida dentro del deposito 64 o 66. Despues de completar la transferencia de fluido y retirada del vial de deteccion 100, el manguito protector 120 vuelve a su forma original cubriendo la aguja 70. Como tal, la transferencia de la muestra entre el vaso de enriquecimiento 50 y el vial de deteccion 100 se produce de una manera biocontenida. El vacfo dentro de cada vial de deteccion 100 puede ser cualquier cantidad suficiente para extraer una cantidad deseada de muestra del deposito (por ejemplo, 8-10 ml de capacidad de extraccion para una muestra de 5 ml). Cualquier exceso de vacfo adicional en el vial de deteccion 100 se extrae por aire despues del fluido del deposito 64 o 66.
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El vial de deteccion 100 puede proporcionarse con reactivos, con o sin medio de cultivo o crecimiento, obturador 116, almohadilla 118 y tapon 106 o 114 con vacfo o sin vacfo, dependiendo del usuario final (por ejemplo, uso externo frente a uso interno). En este sentido, el vial de deteccion 100 puede ensamblarse solamente con el obturador 116 para retencion de reactivos solamente, mientras que el tapon 106 o 114 se proporciona por separado para usuarios que necesitan acceder al interior del vial de deteccion. Como alternativa, el vial de deteccion 100 puede preensamblarse con una combinacion de obturador 116, almohadilla 118 y tapon 106, 114 como se muestra en la Figura 12. Ademas, la cantidad de medio y reactivo se determina por el vial de deteccion 100, no el volumen de enriquecimiento inicial, de acuerdo con una realizacion.
Como tal, la configuracion del vaso de enriquecimiento 50 y el vial de deteccion 100 permite que la muestra se contenga y transfiera de una manera biocontenida, limitando de este modo la exposicion al tecnico o a la instalacion. El vaso de enriquecimiento 50 tambien facilita la medicion precisa de un volumen deseado de muestra, configurandose al mismo tiempo tambien para acomodar una pluralidad de tipos de muestras. Por ejemplo, esto puede ser particularmente util para Salmonella y Listeria, donde se utilizan diferentes ensayos, medios y cantidades de muestra. El vaso de enriquecimiento 50 y vial de deteccion 100 tambien se configuran para reducir el riesgo de que se use el vial incorrecto para ensayar incorporando elementos de acoplamiento entre el vaso de enriquecimiento y el vial de deteccion.
Las Figuras 86 y 88 ilustran otra realizacion de un vaso de enriquecimiento 125. Como antes, el vaso 125 incluye una tapa 126 conectada con un recipiente 128 de una manera hermetica. Como se muestra, el vaso de enriquecimiento 125 incluye un soporte de jeringa longitudinal 130 que se extiende desde la tapa 126 al recipiente 128. El soporte de jeringa 130 puede unirse a la tapa 126 o puede ser parte integral de la misma. El soporte de jeringa 130 incluye una apertura 132 configurada para recibir una jeringa 134 en la misma, y tiene en general una forma en relacion de acoplamiento con la jeringa 134. En la base del soporte de jeringa 130 se conecta un conjunto de aguja que incluye un eje 133 y una aguja 135, en el que el eje esta conectado con un soporte de jeringa, y la aguja se extiende dentro del recipiente 128 y se configura para extraer muestras a traves de la misma. La aguja 135 puede incluir una cubierta comprimible 141 que se extiende sobre la parte de la aguja dentro de la jeringa 134. Como se ha analizado anteriormente tambien, la tapa 126 puede incluir un orificio 131 para permitir que escapen productos secundarios gaseosos no peligrosos del recipiente.
La Figura 87 ilustra una realizacion de una jeringa 134 que incluye en general un asa 136, una varilla de embolo 137 acoplada al asa, un tapon 138, un embolo 139 acoplado al extremo de la varilla de embolo, un tabique 40 y un sello 146. La Figura 87 ilustra ademas que la jeringa 134 se configura para conectar con la apertura 132, tal como con una interfaz de bloqueo por giro 142, para soportar la fuerza de traccion aplicada cuando se extrae la muestra del recipiente 128. Por lo tanto, el embolo 137 puede desplazarse longitudinalmente dentro de la jeringa 134. El tabique 140 se configura para ser perforado por una aguja y volver a sellarse tras la retirada de la aguja. En otras realizaciones, el tabique 140 tambien incluye una almohadilla absorbente y un elemento de guarda para evitar la contaminacion del usuario debido a cualquier fluido que pueda escapar a traves del tabique. El sello 146 se conecta con la jeringa 134 y el tapon 138 para crear una conexion hermetica. La jeringa 134 puede incluir tambien un primer orificio mayor 149 dispuesto dentro de la apertura 132 y una region de cuello 157 que incluye un segundo orificio mas pequeno 151. Como se muestra en las Figuras 87 y 88, una extension 153 se extiende desde la region de cuello 157 y el orificio mayor 149 de modo que una parte del orificio mas pequeno 151 se extiende dentro del orificio mayor 149. Puede haber una o mas ranuras o aperturas 155 definidas entre la extension 153 y la base de la region del cuello 157, como se analiza en mas detalle posteriormente.
Las Figuras 89A-89C ilustran la progresion de una posicion de partida, una parada “blanda” y una parada “dura” cuando se retira la muestra del recipiente 128 y a la jeringa 134. Como se muestra en la Figura 89A, cuando la jeringa 134 conecta con el soporte de jeringa 130, el embolo 139 se situa adyacente a la aguja 135 en la posicion de partida y se configura para comprimir la cubierta 141 para permitir la comunicacion fluida entre el recipiente 128 y la jeringa 134 a traves de la aguja. La Figura 88 ilustra ademas que la aguja 135 se configura para penetrar el tabique 140 cuando la jeringa 134 conecta con el soporte de jeringa 130. A medida que la varilla de embolo 137 se extrae hacia fuera desde la jeringa 134, se extrae una parte 144 de la muestra a traves de la jeringa 135 y al orificio 151, y un elemento de conexion 145 en la varilla de embolo conecta con el sello 146 para detener la extraccion adicional del mismo. De esta manera, la muestra se extrae a una velocidad deseada por lo que el fluido es capaz de alcanzar al vacfo de modo que se evite extraer demasiada poca muestra.
En la Figura 89C, la varilla de embolo 137 se extrae adicionalmente de la jeringa 134, por lo que un segundo elemento de conexion 147 en la varilla de embolo 137 conecta con el sello 146 para evitar la extraccion adicional de la varilla de embolo. Ademas, el primer elemento de conexion 145 se conecta dentro de un bolsillo 148 definido en el sello 146 que evita que la varilla de embolo 137 se desplace adicionalmente fuera de la jeringa 134. Como se muestra en la Figura 89C, el embolo 139 puede disponerse dentro de la extension 153 de la jeringa 134 de modo que no pueda extraerse mas vacfo debido a que la varilla de embolo 137 y el embolo 139 se situan de modo que el orificio 151 ya no este cerrado. Es decir, cuando el embolo 139 ya no cubre las aberturas 155, los orificios 149 y 151 estan en comunicacion fluida entre sf de modo que ya no se extrae un vacfo. Ademas, la conexion de la varilla de embolo 137 y el sello 146 evita que la varilla de embolo se extraiga en la jeringa 134, mientras que tambien evita que un usuario extraiga adicionalmente el embolo y se arriesgue a exposicion a la muestra.
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Las Figuras 90A y 90B ilustran otra realizacion de una varilla de embolo 137. La varilla de embolo 137 incluye nervios longitudinales 159 que estan configurados para deslizarse dentro de ranuras definidas dentro del tapon 138. Ademas, la Figura 90B muestra que el embolo 137 puede girarse para desconectar los nervios 159 de las ranuras y conectar con el tapon 138 para evitar que el embolo vuelva a la jeringa 134.
Las Figuras 91 y 92 ilustran varillas de embolo alternativas y embolos que pueden usarse para extraer diferentes volumenes del recipiente 128. A este respecto, la Figura 91 corresponde a la descrita en relacion con las Figuras 87, 88 y 89A-C. Por lo tanto, el embolo 139 es adecuado para extraer volumenes mas pequenos al orificio menor 151 (por ejemplo, aproximadamente 125 pl). En consecuencia, el tamano del embolo y la longitud de la varilla de embolo pueden variarse segun sea necesario. En otra realizacion, la Figura 92 muestra un embolo 161 adecuado para extraer una muestra al orificio mayor 149 (por ejemplo, aproximadamente 5 ml). Por lo tanto, la jeringa 134 es adecuada para su uso con diferentes embolos para extraer diferentes volumenes de muestra, que es util cuando se ensaya con respecto a diferentes microorganismos (por ejemplo, Listeria y Salmonella). Ademas, el usuario puede recibir la jeringa 134 y el embolo/la varilla de embolo preensamblados, o el usuario puede anadir reactivos, lfquido de reconstitucion, etc. y despues ensamblar el embolo/varilla de embolo con la jeringa.
Un metodo para la deteccion e identificacion de uno o mas microorganismos en una muestra de cultivo microbiologico de acuerdo con una realizacion de la invencion puede realizarse en un vaso de cultivo microbiologico. Un vaso de cultivo microbiologico puede tener dispuestas en el mismo una o mas partfculas indicadoras y una o mas partfculas de captura magnetica teniendo cada una asociadas con las mismas uno o mas miembros de union, por ejemplo, un anticuerpo, que tiene una afinidad por el o los microorganismos que se ensayan. Las partfculas indicadoras y partfculas de captura magnetica pueden disponerse en el vaso de cultivo microbiologico antes de, simultaneamente con o despues de disponer en el mismo una muestra clfnica o industrial que se sospecha que contiene el o los microorganismos que se ensayan. El medio de crecimiento de cultivo puede disponerse en el vaso de cultivo microbiologico antes de, simultaneamente con o despues de la adicion de la muestra clfnica o industrial. Una vez que se han introducido las partfculas indicadoras, partfculas de captura magnetica, el medio de cultivo y la muestra clfnica o industrial en el vaso de cultivo, el vaso de cultivo se agita despues continuamente o de forma intermitente para mezclar las partfculas indicadoras y las partfculas de captura magnetica con la muestra combinada y el medio de cultivo. En realizaciones preferidas descritas en el presente documento, el perfil de agitacion (por ejemplo, velocidad y/o desplazamiento) puede variarse en diferentes estadios del cultivo o el ciclo de lectura. Cuando estan presentes en la muestra clfnica o industrial, el o los microorganismos que se ensayan pueden unirse con el o los miembros de union asociados con las partfculas indicadoras y partfculas de captura magnetica para formar un complejo de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora.
Cuando la partfcula indicadora es SERS activa, la Figura 18 muestra un ejemplo de un complejo de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora SERS activa dentro de un vaso de cultivo 2. La partfcula indicadora SERS activa 10, tiene asociados con la misma uno o mas miembros de union especffica 11 que tienen una afinidad por uno o mas microorganismos 12 que se ensayan. Una partfcula de captura magnetica 13 tambien tiene asociados con la misma uno o mas miembros de union especffica 14 que tienen una afinidad por el o los microorganismos 12 que se ensayan. Las partfculas de captura magnetica 13 pueden unirse con uno o mas microorganismos 12, que tambien pueden unirse con partfcula SERS activa 10, para formar el complejo de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula SERS activa, que tambien se denomina en el presente documento complejo de tipo sandwich, en el que el microorganismo se une simultaneamente con mas de un miembro de union especffica. En este complejo de tipo sandwich particular, al menos un miembro de union especffica 14 esta unido con una partfcula de captura magnetica 13 y al menos otro miembro de union especffica 11 esta unido con una partfcula indicadora SERS activa 10. Por lo tanto, el microorganismo 12 esta “intercalado” entre la partfcula de captura magnetica 13 y la partfcula indicadora SERS activa 10.
Se aplica un campo magnetico a la muestra mediante un iman 15 para atraer las partfculas de captura magnetica 13 para localizar los complejos de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora SERS activa en un sedimento dentro de la zona de medicion 9 dentro del vaso de cultivo 2 para detectar la senal de SERS. La radiacion de la fuente de luz 16 puede despues dirigirse al sedimento y la senal de SERS puede detectarse por detector de Raman 17. Se usan fuente de luz 16 y detector 17 para inducir y medir, respectivamente, la identificacion de Raman producida por la partfcula indicadora SERS activa 10. La localizacion de los complejos de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora SERS activa proporciona una senal de SERS, cuya intensidad refleja la concentracion del microorganismo, localizando las partfculas indicadoras SERS activas que se unen con partfculas magneticas en la zona de deteccion, segregandolas de este modo de las partfculas indicadoras SERS activas no unidas que permanecen en solucion.
En algunas realizaciones, la zona de medicion puede estar localizada a localizar a lo largo de una superficie interna de un frasco o vaso de cultivo microbiologico. Por ejemplo, con respecto a un frasco, la zona de medicion puede localizarse a lo largo de una superficie interna dentro de o adyacente al cuello del frasco; una superficie interna que comprende la seccion media del frasco; o una superficie interna a lo largo de la base del frasco adyacente a, por ejemplo, un sensor separado, por ejemplo, un sensor basado en fluorescencia o un sensor basado en colorimetrfa, o en realizaciones en las que no esta presente un sensor separado, junto con una superficie interna de la base, es decir, el fondo, del frasco de cultivo microbiologico. En una realizacion preferida, la zona de medicion se localiza a lo
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largo de una superficie interna generalmente en la seccion media del frasco o vaso de cultivo. Por lo tanto, la zona de medicion puede localizarse en o mas cerca del centro del frasco o vaso que los extremos del frasco o vaso (por ejemplo, dentro del 50 % intermedio del vaso).
La deteccion y/o identificacion del o los microorganismos de interes se consigue solamente cuando el microorganismo o los microorganismos se unen en el sedimento como parte de un complejo de miembro de union- microorganismo-partfcula indicadora. Es decir, no se genera ninguna senal cuando el o los microorganismos no estan presentes en la muestra de cultivo microbiologico o, si estan presentes, el microorganismo no tiene un epftopo reconocido por el miembro de union asociado con la partfcula indicadora. En dichas circunstancias, las partfculas indicadoras no estan sustancialmente presentes en la zona de medicion.
Si no se observa ninguna senal de SERS significativa tras la aplicacion de un campo magnetico y la exploracion optica del sedimento, las partfculas magneticas extrafdas al sedimento pueden dispersarse de nuevo en solucion para continuar interaccionando con la muestra. Si esta presente un microorganismo por debajo del lfmite de deteccion de la tecnologfa, entonces la concentracion de microorganismo puede aumentarse a lo largo del tiempo a medida que crece el microorganismo en el medio de cultivo de modo que la senal de SERS se detecta en ultima instancia en la zona de medicion tras la aplicacion futura del campo magnetico. En esencia, se forma un sedimento magnetico, se explora opticamente, se dispersa, se permite que interaccione con la muestra y despues se vuelve a formar a una frecuencia especffica hasta que se observa una senal a partir del complejo de miembro de union- microorganismo-partfcula indicadora o se determina que la muestra es negativa para el microorganismo de interes. La agitacion del vaso de cultivo en diversos estadios a lo largo de este proceso puede desempenar un papel crftico. La agitacion cumple una diversidad de fines. En primer lugar, asegura la mezcla de las partfculas magneticas y de SERS con la muestra y el medio de cultivo lo que permite la formacion de complejos de miembro de union- microorganismo-partfcula indicadora. En segundo lugar, permite la dispersion de las partfculas magneticas de nuevo en solucion una vez que el sedimento se ha formado. En tercer lugar, en una realizacion preferida, se puede realizar agitacion mientras se aplica el campo magnetico. La agitacion durante la aplicacion del campo magnetico lleva fluido de diversos puntos espaciales dentro del vaso de cultivo a la region del campo magnetico localizado, asegurando que se recojan partfculas magneticas de regiones de la muestra fuera del campo magnetico localizado. Finalmente, en muestras que contienen partfculas (por ejemplo resinas, carbon o carbonato calcico), la agitacion antes de y durante la sedimentacion puede limitar el numero de estas partfculas que sedimentan en la region de deteccion e interfieren con la senal optica. Diferentes perfiles y velocidad de agitacion pueden ser optimos para cada una de estas funciones diferentes.
Por ejemplo, pueden usarse diferentes velocidades de agitacion (es decir, frecuencia) y “alcance” (es decir, desplazamiento del vial a lo largo de un eje) en diferentes fases de un ciclo de medicion. En una realizacion ejemplar, un ciclo de medicion puede incluir mezclado, dispersion presedimentacion, sedimentacion, lectura y dispersion, teniendo cada fase una velocidad de agitacion y alcance particulares. A este respecto, el mezclado incluye la fase en la que se realiza agitacion durante la incubacion, mientras que la dispersion presedimentacion se realiza despues de mezclar y antes de sedimentar. La sedimentacion se realiza despues de la dispersion presedimentacion y se sigue de la fase de lectura. La fase de lectura corresponde a la exploracion de los viales por la cabeza de lectura, mientras que la fase de dispersion se proporciona para que el sedimento se redisperse dentro del vial. Puede haber o no retardos entre fases. En una realizacion, la velocidad de agitacion y alcance para las fases pueden variar de aproximadamente 0 a 3 Hz y de aproximadamente 0 a 100 mm, respectivamente. Por ejemplo, las siguientes velocidades de agitacion y alcances pueden usarse de acuerdo con realizaciones de la presente invencion: mezclado - aproximadamente 0,5 a 1,5 Hz y 25 a 75 mm; dispersion presedimentacion - aproximadamente 1 a 2 Hz y 25 a 75 mm; sedimentacion - aproximadamente 0,5 a 2 Hz y 25 a 75 mm; lectura - 0 Hz y 0 mm; y dispersion - aproximadamente 1 a 2 Hz y aproximadamente 25 a 75 mm. Ademas, el periodo de tiempo particular para cada fase tambien puede variarse. Por ejemplo, la fase de mezclado puede ser significativamente mas larga (por ejemplo, de aproximadamente 5 a 60 minutos) que las fases de dispersion presedimentacion, sedimentacion, lectura y dispersion (por ejemplo, de aproximadamente 5 a 120 segundos por fase).
La Figura 23 muestra un ejemplo de la intensidad de senal de SERS dependiente del tiempo de complejos de miembro de union-microorganismo-partfcula indicadora capturados por partfculas de captura magnetica para Salmonella. En general, el comienzo de la pendiente ascendente de la senal de SERS puede ser indicativo de la presencia del microorganismo. A este respecto, despues de aproximadamente 6 horas de tiempo de cultivo, la presencia de microorganismo puede indicarse, mientras que el pico a las aproximadamente 9 horas indica una mayor concentracion de microorganismos. Sin embargo, como se muestra tambien en la Figura 23, en la pendiente descendente de la senal de SERS, los microorganismos pueden seguir presentes, tal como a aproximadamente 12 horas. En este caso, la pendiente descendiente tambien puede significar la presencia de un microorganismo, que puede proporcionar un medio util para identificar la positividad en ciertos casos, tal como cuando esta presente un gran numero de microorganismos al comienzo de la incubacion. Como tal, bien una pendiente ascendente o bien una pendiente descendente en la senal de SERS puede ser indicativa de la presencia de un microorganismo en la muestra de cultivo. A este respecto, pueden tomarse lecturas periodicamente a lo largo del tiempo durante el periodo de incubacion para identificar dichos cambios en la senal de SERS.
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B. Partfculas indicadoras
Las “partfculas indicadoras”, como se usa en el presente documento, puede ser cualquier partfcula que sea capaz de producir una senal que pueda detectarse directamente en la muestra de cultivo sin retirar la muestra, tal como para realizar etapas de lavado. Por ejemplo, las partfculas indicadoras pueden producir cualquier senal optica (por ejemplo, fluorescencia o Raman o una imagen optica) cuando se exploran (por ejemplo, con una fuente de luz). Los ejemplos de partfculas indicadoras incluyen partfculas SERS activas, puntos cuanticos, fluoroforos de infrarrojo cercano o partfculas fluorescentes de infrarrojo cercano.
La “dispersion de Raman potenciada en superficie” o “SERS” se refiere al fenomeno que se produce cuando la senal de dispersion de Raman o la intensidad es potenciada cuando se adsorbe una molecula Raman activa en o en proximidad estrecha a, por ejemplo, aproximadamente 50 A de la superficie de ciertos metales (por ejemplo, oro o plata). En dichas circunstancias, la intensidad de la senal de Raman que surge de la molecula Raman activa puede potenciarse. “Dispersion de Raman de resonancia potenciada en superficie” o “SERRS” se refiere a una senal de SERS aumentada que se produce cuando la molecula indicadora en proximidad estrecha a una superficie de nanopartfcula SERS activa esta en resonancia con la longitud de onda de excitacion. “Dispersion de Raman” se refiere en general a la dispersion inelastica de un foton que incide en una molecula. Los fotones que se dispersan de forma inelastica tienen una frecuencia optica (vi), que es diferente de la frecuencia de la luz incidente (v0). La diferencia de energfa (AE) entre la luz incidente y la luz dispersada inelasticamente puede representarse como (AE) = h|v0 - vi|, en la que h es la constante de Planck, y corresponde a energfas que son absorbidas por la molecula. La radiacion incidente puede ser de cualquier frecuencia v0, pero tfpicamente es radiacion monocromatica de la region espectral visible o de infrarrojo cercano. La diferencia absoluta |v0 - vi| es una frecuencia infrarroja, por ejemplo, vibracional. La frecuencia v1 de la radiacion “con dispersion de Raman” puede ser mayor o menor que v0, pero la cantidad de luz con frecuencia v1 < v0 (radiacion de Stokes) es mayor que con la frecuencia v1 > v0 (radiacion anti Stokes).
Como se usa en el presente documento, el termino “radiacion” se refiere a energfa en forma de radiacion electromagnetica que puede inducir dispersion de Raman potenciada en superficie en una muestra que se ensaya, por ejemplo, una muestra que comprende una nanopartfcula SERS activa que tiene una o mas moleculas indicadoras SERS activas asociadas con las mismas. Mas particularmente, el termino “radiacion” se refiere a energfa en forma de radiacion electromagnetica que provoca que la superficie de una nanopartfcula induzca, emita, soporte o de otro modo provoque dispersion de la luz, por ejemplo, dispersion de Raman, en una molecula indicadora proxima a la superficie de la nanopartfcula.
Como se usa en el presente documento, una “molecula indicadora” se refiere a cualquier molecula o compuesto qufmico que sea capaz de producir un espectro de Raman cuando se ilumina con radiacion de una longitud de onda apropiada. Una “molecula indicadora” tambien puede denominarse en el presente documento “marcador”, “colorante”, “molecula Raman activa” o “molecula SERS activa”, cada una de las cuales puede usarse indistintamente.
Un experto habitual en la materia apreciarfa que una diversidad de moleculas pueden actuar como moleculas indicadoras de SERS. Por ejemplo, tambien pueden usarse algunas moleculas colorantes fluorescentes como moleculas indicadoras de SERS. Vease, por ejemplo, Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 12/134.594 de Thomas et al., presentada el 6 de junio de 2008 y Solicitud de Patente Internacional de PCT n.° PCT/US2008/066023 de Thomas et al., presentada el 6 de junio de 2008. En general, las moleculas adecuadas para su uso como moleculas indicadoras de SERS pueden ser una molecula pequena, una molecula grande o una molecula compleja, aunque no es necesario que la molecula sea compleja para actuar como una molecula indicadora de SERS. Las moleculas indicadoras de SERS, en algunas realizaciones, pueden tener al menos un anillo aromatico. Ademas, sin desear quedar ligado a ninguna teorfa particular, se requiere un cambio de la capacidad de polarizacion de un enlace para actividad de Raman. Ademas, las moleculas simetricas tienden a mostrar senales de Raman especfficas y fuertes. Provechosamente, una molecula indicadora muestra una seccion transversal de dispersion de Raman alta y una identificacion espectral bien caracterizada.
Una nanopartfcula SERS activa, como se denomina en el presente documento, incluye una nanopartfcula que tiene una superficie que induce, provoca o de otro modo soporta una dispersion de la luz de Raman potenciada en superficie (SERS) o dispersion de la luz de Raman de resonancia potenciada en superficie (SERRS). Varias superficies son capaces de producir una senal de SERS, incluyendo superficies rugosificadas, superficies texturizadas y otras superficies, incluyendo superficies lisas.
Una partfcula indicadora SERS activa adecuada para su uso con los ensayos desvelados por la presente incluye un nucleo, que induce el efecto de Raman, y puede incluir ademas una o mas capas y tipos de materiales SERS activos localizados en la superficie externa del nucleo, y opcionalmente un encapsulante que encapsula parcial o completamente el nucleo o los materiales SERS activos.
Las Figuras 19-21 muestran diversos ejemplos de partfculas indicadoras SERS activas. La Figura 19 muestra una partfcula indicadora SERS activa 20 con una unica nanopartfcula SERS activa 21 como nucleo, que tiene una
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molecula indicadora 22 localizada en la superficie externa del nucleo de la nanopartfcula y una capa de sflice 23 que encapsula completamente el nucleo y la molecula indicadora. Dichas partfculas indicadoras SERS activas se describen en la Patente de Estados Unidos n.° 6.514.767 de Natan.
Como se usa en el presente documento, el termino “nanopartfcula”, se refiere a una partfcula que tiene al menos una dimension en el intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm, incluyendo cualquier valor de numero entero entre 1 nm y 1000 nm (incluyendo aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 y 1000 nm). En algunas realizaciones, el nucleo de la partfcula indicadora SERS activa es una nanopartfcula metalica. En algunas realizaciones, la partfcula indicadora SERS activa es una partfcula esferica o una partfcula sustancialmente esferica que tiene un diametro entre 2 nm y aproximadamente 200 nm (incluyendo aproximadamente 2, 5, 10, 20, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y 200 nm). En algunas realizaciones, la partfcula indicadora SERS activa tiene un diametro entre aproximadamente 2 nm y aproximadamente 100 nm (incluyendo
aproximadamente 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 nm) y en algunas realizaciones, entre
aproximadamente 20 nm y 100 nm (incluyendo aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63,
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95, 96, 97, 98, 99 y 100 nm).
Las partfculas indicadoras SERS activas adecuadas para su uso con los ensayos desvelados por la presente tambien pueden incluir un nucleo que comprende dos o mas nanopartfculas. La Figura 20 muestra una partfcula indicadora SERS activa 30 con una primera nanopartfcula SERS activa 31 y una segunda nanopartfcula SERS activa 32 en el nucleo, que tiene una molecula indicadora 33 localizada entre la primera nanopartfcula SERS activa 31 y la segunda nanopartfcula SERS activa 32. Dichas partfculas indicadoras SERS activas se describen en la Patente de Estados Unidos n.° 6.861.263 de Natan. Vease tambien, para otro ejemplo, Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 2003/0232388 de Kreimer et al., publicado el 18 de diciembre de 2003. Por lo tanto, el nucleo de una partfcula indicadora SERS activa puede incluir una unica nanopartfcula o puede incluir multiples nanopartfculas agregadas juntas. Dichos agregados pueden tambien encapsularse como se desvela adicionalmente en el presente documento.
El nucleo de una partfcula indicadora SERS activa adecuada para su uso con los metodos desvelados por la presente tfpicamente comprende al menos un metal, es decir, al menos un elemento seleccionado de la Tabla Periodica de los Elementos que se conoce habitualmente como un metal. Los metales adecuados incluyen metales del Grupo 11, tales como Cu, Ag y Au, o cualquier otro metal que los expertos en la materia sepan que soporta SERS, tal como metales alcalinos. En algunas realizaciones, la nanopartfcula del nucleo sustancialmente comprende un unico elemento metalico. Por ejemplo, la preparacion de nanopartfculas de oro se describe en Frens, G., Nat. Phys. Sci., 241, 20 (1972). En otras realizaciones, la nanopartfcula del nucleo comprende una combinacion de al menos dos elementos, tal como una aleacion, por ejemplo, una aleacion binaria. En algunas realizaciones, la nanopartfcula del nucleo es magnetica.
En otras realizaciones, el nucleo de una partfcula indicadora SERS activa incluye dos componentes en los que un primer material forma un nucleo interno que esta rodeado por una cubierta formada a partir de un segundo material, tal como en una partfcula de nucleo-cubierta de Au2S/Au. La Figura 21 muestra dicha partfcula indicadora SERS activa 40 con un nucleo interno 41 de Au2S rodeado por una cubierta externa 42 formada a partir de Au como un nucleo, que tiene una capa de molecula indicadora 43 localizada en la superficie externa del nucleo y una capa de sflice 44 que encapsula completamente el nucleo y la capa de molecula indicadora. Se ha indicado que las partfculas de nucleo-cubierta de Au2S/Au tienen resonancia optica de IR cercano ampliamente ajustable. Vease Averitt, R. D., et al., “Ultrafast optical properties of gold nanoshells,” JOSA B, 16(10), 1824-1832 (1999). Ademas, pueden usarse las partfculas de nucleo de Ag/cubierta de Au, tales como las descritas en Cao, Y. W., et al., “DNA- modified core-shell Ag/Au nanoparticles,” J. Am. Chem. Soc., 123(32), 7961-7962 (2001) o partfculas de nucleo de Au/cubierta de Ag o cualquier combinacion de nucleo-cubierta que implique metales SERS activos. Otras combinaciones adecuadas para su uso en partfculas de nucleo-cubierta tambien son adecuadas para su uso con la materia objeto desvelada por la presente, incluyendo coloides de alumina/sflice funcionalizados con Au o Ag, coloides TiO2 funcionalizados con Au o Ag, nanopartfculas de Au recubiertas con nanopartfcula de Au (vease, por ejemplo, Mucic, et al., “DNA-directed synthesis of binary nanoparticle network materials,” J. Am. Chem. Soc., 120(48), 12674 (1998)); coloides de TiO2 recubiertos con nanopartfcula de Au; y partfculas que tienen un nucleo de Si con una cubierta metalica (es decir “nanocubiertas”), tales como coloides de SiO2 recubiertos con plata o coloides de SiO2 recubiertos con oro. Vease, por ejemplo, Jackson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(52): 17930-5 (2004); vease tambien Patentes de Estados Unidos n.° 6.34.272 y 6.685.986 de Oldenburg et al. Se ha descrito el uso de dichas nanocubiertas en aplicaciones biosensibles. Vease Patente de Estados Unidos n.° 6.699.724 de West et al.
Otra clase de nanopartfculas adecuada para su uso como un nucleo de una nanopartfcula indicadora SERS activa incluye nanopartfculas que tienen una superficie interna. Dichas nanopartfculas incluyen partfculas huecas y nanocristales huecos o nanopartfculas porosas o semiporosas. Vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 6.913.825 de Ostafin et al. En algunas realizaciones, el nucleo/cubierta y las nanopartfculas que tienen una superficie interna pueden mostrar una senal de SERS mejorada.
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Aunque se reconoce que la forma y la relacion de aspecto de las partfculas pueden afectar a las caracterfsticas ffsicas, opticas y electronicas de las nanopartfculas, la forma especffica, la relacion de aspecto o la presencia/ausencia del area de superficie interna no influyen en la clasificacion de una partfcula como una nanopartfcula. En consecuencia, las nanopartfculas adecuadas para su uso como nucleo de una partfcula indicadora SERS activa pueden tener una diversidad de formas, tamanos y composiciones. Ademas, el nucleo de nanopartfcula puede ser solido, o en algunas realizaciones, como se ha descrito inmediatamente antes en el presente documento, hueco. Los ejemplos no limitantes de nanopartfculas adecuadas para su uso como un nucleo incluyen nanobarras huecas o rellenas metalicas coloidales, nanopartfculas magneticas, paramagneticas, conductoras o aislantes, partfculas sinteticas, hidrogeles (coloides o barras) y similares. Los expertos en la materia apreciaran que las nanopartfculas pueden existir en una diversidad de formas, incluyendo pero sin limitacion esferoides, varillas, discos, piramides, cubos, cilindros, nanohelices, nanomuelles, nanoanillos, nanopartfculas en forma de varilla, nanopartfculas en forma de flecha, nanopartfculas en forma de gota, nanopartfculas en forma de tetrapodo, nanopartfculas en forma de prisma y una pluralidad de formas geometricas y no geometricas adicionales.
Ademas, las nanopartfculas adecuadas para su uso como un nucleo de una partfcula indicadora SERS activa pueden ser isotropicas o anisotropicas. Como se indica en el presente documento, las nanopartfculas anisotropicas tienen una longitud y una anchura. En algunas realizaciones, la longitud de un nucleo de nanopartfcula anisotropica es la dimension paralela a la apertura en la que se produjo la nanopartfcula. En algunas realizaciones, el nucleo de nanopartfcula anisotropica tiene un diametro (anchura) de aproximadamente 350 nm o menos. En otras realizaciones, el nucleo de nanopartfcula anisotropica tiene un diametro (anchura) de aproximadamente 250 nm o menos y en algunas realizaciones, un diametro (anchura) de aproximadamente 100 nm o menos. En algunas realizaciones, la anchura del nucleo de nanopartfcula anisotropica esta entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 300 nm. Ademas, en algunas realizaciones, el nucleo de nanopartfcula anisotropico tiene una longitud, en el que la longitud esta de entre aproximadamente 10 nm y 350 nm.
Mucha de la bibliograffa de SERS (tanto experimental como teorica) sugiere que las partfculas anisotropicas (varillas, triangulos, prismas) pueden proporcionar un aumento de la potenciacion de la senal de Raman en comparacion con esferas. Por ejemplo, el denominado “efecto antena” predice que se espera que la potenciacion de Raman sea mayor en areas de mayor curvatura. Se han descrito recientemente muchos informes de partfculas anisotropicas, incluyendo prismas de plata (Ag) y partfculas de oro (Au) “ramificadas”.
Pueden producirse nanovarillas de Au y Ag anisotropicas por electrodeposicion en moldes de alumina preformados, de una manera similar a la produccion de partfculas de Nanobarcodes® (Oxonica Inc., Mountain View, California). Vease, por ejemplo, Nicewarner-Pena, S. R., et al., “Submicrometer metallic barcodes”, Science, 294, 137-141 (2001); Walton, I. D., et al., “Particles for multiplexed analysis in solution: detection and identification of striped metallic particles using optical microscopy”, Anal. Chem. 74, 2240-2247 (2002). Estas partfculas pueden prepararse por la deposicion de capas alternantes de materiales, tfpicamente Au y Ag, en moldes de alumina preformados, y pueden tener un diametro de aproximadamente 250 nm y una longitud de aproximadamente 6 micrometros.
Las partfculas indicadoras SERS activas tambien adecuadas para su uso en los metodos desvelados por la presente incluyen nanoestructuras compuestas, por ejemplo, estructuras de satelite y estructuras de nucleo-cubierta, como se desvela en la Solicitud de Patente Internacional de PCT n.° PCT/US2008/057700 de Weidemaier et al., presentada el 20 de marzo de 2008.
Una ventaja de las realizaciones de ensayos de SERS y dispositivos para detectar microorganismos en muestras de cultivo es la diversidad de nanopartfculas SERS activas que pueden prepararse, teniendo cada una una identificacion de SERS unica. Las partfculas indicadoras SERS activas representativas utiles para los metodos desvelados por la presente incluyen, pero sin limitacion, partfculas indicadoras SERS activas de Oxonica Inc. (Mountain View, California). Dichas partfculas indicadoras SERS activas incluyen un nucleo de nanopartfcula marcado con moleculas indicadoras de SERS y encapsulado en una cubierta de vidrio.
Las moleculas indicadoras no limitantes, representativas, incluyen 4,4'-dipiridil (DIPY), D8-4,4'-dipiridil (d8DIPY), trans-1,2-bis(4-piridil)-etileno (BPE) y 2-quinolinetiol (QSH), cada uno de los cuales se han desvelado como colorantes indicadores Raman activos utiles en la Publicacion de Patente de Estados Unidos n.° 2006/0038979 de Natan et al., publicada el 23 de febrero de 2006. Los ejemplos no limitantes adicionales de moleculas indicadoras adecuadas para los metodos desvelados por la presente incluyen 1,2-dil(4-piridil)acetileno (BPA), 4-azobis(piridina) (4-AZP), GM19, 1-(4-piridil)-1-ciano-2-(2-fluoro-4-piridil)-etileno (CNFBPE), 1 -ciano-1 -(4-quinolinil)-2-(4-piridil)-etileno (CQPE), colorante 10 y 4-(4-hidroxifenilazo)piridina (136-7). Un espectro de SERS representativo de nanopartfculas SERS activadas marcadas con 4,4'-dipiridil (DIPY) se proporciona en la Figura 22. Como se muestra en la Figura 22, la molecula de colorante de DIPY tiene un pico dominante a aproximadamente 1601 cm-1.
Las partfculas indicadoras SERS activas adecuadas para su uso con los metodos desvelados por la presente incluyen, pero sin limitacion, nucleos de nanopartfculas que comprenden una molecula indicadora activa en dispersion de Raman potenciada en superficie (SERS) desvelada en la Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 12/134.594 de Thomas et al., presentada el 6 de junio de 2008 y Solicitud de Patente Internacional de PCT n.° PCT/US2008/066023 de Thomas et al., presentada el 6 de junio de 2008 y la diversidad de partfculas indicadoras
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En algunas realizaciones, la partfcula indicadora SERS activa comprende un encapsulante. Las nanopartfculas SERS activas tienen una tendencia a agregarse en solucion acuosa y una vez agregadas son diffciles de redispersar. Ademas, la composicion qufmica de algunas moleculas Raman activas es incompatible con las qufmicas usadas para unir otras moleculas, tales como protefnas, con nanopartfculas metalicas. Estas caracterfsticas pueden limitar la eleccion de molecula Raman activa, qufmicas de union y otras moleculas para unir con la nanopartfcula metalica. En consecuencia, en algunas realizaciones, los metodos desvelados por la presente comprenden partfculas indicadoras SERS activas en las que la molecula indicadora cuando se fija, por ejemplo, se adsorbe o se une covalentemente con un nucleo de nanopartfcula, puede recubrirse o encapsularse, por ejemplo, en una cubierta, de un material diferente, incluyendo un material dielectrico, tal como un polfmero, vidrio, metal, oxidos metalicos tales como TiO2 y SnO2, sulfuros metalicos o un material ceramico. Se describen metodos para preparar dichas partfculas indicadoras SERS activas en la Patente de Estados Unidos n.° 6.514.767 de Natan.
El grosor del encapsulante puede variarse dependiendo de las propiedades ffsicas requeridas de la partfcula indicadora SERS activa. Dependiendo de la combinacion particular de nucleo de nanopartfcula, encapsulante y colorante, los recubrimientos espesos de encapsulante, por ejemplo, recubrimientos de aproximadamente un micrometro o mas, podrfan atenuar potencialmente la senal de Raman. Ademas, un recubrimiento fino podrfa conducir a interferencia en el espectro de Raman del microorganismo asociado por las moleculas en la superficie de encapsulante. Al mismo tiempo, las propiedades ffsicas, tales como el coeficiente de sedimentacion pueden verse afectadas por el grosor del encapsulante. En general, cuanto mas grueso sea el encapsulante, mas eficaz sera la inmovilizacion de los colorantes SERS activos del nucleo de nanopartfcula metalica del disolvente circundante.
En realizaciones en las que el encapsulante es vidrio, el grosor del vidrio tfpicamente puede variar de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 70 nm. En realizaciones ejemplares, no limitantes, las partfculas indicadoras SERS activas comprenden nanopartfculas de oro que tienen un diametro que varfa de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 100 nm encapsuladas en una esfera de vidrio que tiene un grosor que varfa de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 65 nm, en algunas realizaciones, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 50 nm; en algunas realizaciones, de aproximadamente 15 nm a aproximadamente 40 nm; y, en algunas realizaciones, aproximadamente 35 nm. La optimizacion de las dimensiones de las partfculas indicadoras SERS activas desveladas por la presente puede conseguirse por un experto en la materia.
Ademas, las partfculas indicadoras SERS activas que comprenden colorantes SERS activos pueden funcionalizarse con una molecula, tal como un miembro de union especffica de un par de union, que puede unirse con un microorganismo diana. Tras la union del microorganismo diana, la senal de SERS de la molecula indicadora SERS activa cambia de tal modo que podra determinarse la presencia o cantidad del microorganismo diana. El uso de una partfcula indicadora SERS activa funcionalizada tiene varias ventajas frente a una partfcula indicadora no funcionalizada. En primer lugar, el grupo funcional proporciona un grado de especificidad por la partfcula indicadora proporcionando una interaccion especffica con un microorganismo diana. En segundo lugar, no es necesario que el microorganismo diana sea Raman activo en sf mismo; su presencia puede determinarse observando cambios en la senal de SERS del colorante Raman activo unido al nucleo de nanopartfcula. Dichas mediciones se denominan en el presente documento “deteccion indirecta”, en la que la presencia o ausencia de un microorganismo diana en una muestra de cultivo se determina detectando una senal de SERS que no surge directamente del microorganismo de interes.
En otras realizaciones, la partfcula indicadora SERS activa comprende una nanopartfcula SERS activa como un nucleo, sin ninguna molecula indicadora o encapsulante presente. La superficie del nucleo puede funcionalizarse con una molecula, tal como un miembro de union especffica de un par de union, que puede unirse con un microorganismo diana. Tras la union del microorganismo diana, el espectro de SERS del microorganismo diana en sf mismo se detecta para confirmar la presencia o cantidad del microorganismo diana. Dichas mediciones se denominan en el presente documento “deteccion directa”, en la que la presencia o ausencia de un microorganismo diana en una muestra de cultivo sangufneo se determina detectando una senal de SERS que surge directamente del microorganismo de interes.
Las partfculas indicadoras SERS activas pueden funcionalizarse para unirse con un analito diana de al menos dos formas diferentes. En algunas realizaciones, la molecula indicadora SERS activa, es decir, el colorante SERS activo, puede conjugarse con un miembro de union especffica de un par de union, mientras que en otras realizaciones, un miembro de union especffica de un par de union puede unirse directamente con el nucleo de nanopartfcula. En realizaciones en las que el nucleo de nanopartfcula esta al menos parcialmente rodeado por una cubierta encapsulante, el miembro de union puede unirse con una superficie externa de la cubierta encapsulante.
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C. Miembros de union especffica
Como se usa en el presente documento, la expresion “miembro de union especffica” y derivaciones gramaticales de la misma, se refiere a una molecula para la que existe al menos una molecula de union complementaria, separada. Un miembro de union especffica es una molecula que se une, se fija o se asocia de otro modo con una molecula especffica, por ejemplo, un microorganismo de interes. Cuando un miembro de union especffica de un tipo particular se une con un tipo particular de molecula, los miembros de union especffica se denominan “par de union especffica”. Por ejemplo, un anticuerpo se unira especfficamente con un antfgeno. En consecuencia, “par de union especffica” se refiere a dos moleculas diferentes, en las que una de las moleculas mediante medios ffsicos o qufmicos se une especfficamente con la segunda molecula. En este sentido, un microorganismo que se ensaya es un miembro recfproco de un par de union especffica. Se proporcionan en el presente documento posteriormente miembros de union representativos adecuados para su uso con microorganismos particulares que se ensayan.
Ademas, los pares de union especffica pueden incluir miembros que son analogos de los companeros de union especffica originales, por ejemplo, un analogo de analito que tenga una estructura similar al analito. Por “similar” se entiende que, por ejemplo, un analogo de analito tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos aproximadamente 60 % o 65 % de identidad de secuencia, aproximadamente 70 % o 75 % de identidad de secuencia, aproximadamente 80 % u 85 % de identidad de secuencia, aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mas identidad de secuencia de aminoacidos en comparacion con una secuencia de aminoacidos de analito usando programas de alineamiento y parametros convencionales bien conocidos en la tecnica. Un analogo de un analito puede tener tambien la misma funcion que un analito.
Un miembro de union especffica, cuando se conjuga, por ejemplo, con una partfcula indicadora SERS activa, interacciona con un microorganismo especffico que se ensaya de una manera capaz de producir una senal de Raman detectable diferenciable de cuando un microorganismo particular esta presente o ausente, o cuando un microorganismo particular esta presente en diversas concentraciones a lo largo del tiempo.
La expresion “producir una senal detectable” se refiere a la capacidad de reconocer la presencia de un grupo indicado o un cambio en una propiedad de un grupo indicador, por ejemplo, moleculas indicadoras SERS activas, de una manera que permite la deteccion del complejo de miembro de union-microorganismo. Ademas, la produccion de una senal detectable puede ser reversible o no reversible. El acontecimiento productor de senal incluye medios continuos, programados y episodicos incluyendo aplicaciones de una sola vez o reutilizables. El acontecimiento productor de senal reversible puede ser instantaneo o puede depender del tiempo, siempre que se establezca una correlacion con la presencia o concentracion del analito.
La union, fijacion o asociacion entre el miembro de union especffica y, por ejemplo, un microorganismo, puede ser qufmica o ffsica. El termino “afinidad” se refiere a la fuerza de atraccion entre un miembro de union y otro miembro de un par de union en un sitio de union particular. El termino “especificidad” y derivaciones del mismo, se refiere a la probabilidad de que un miembro de union se una preferentemente con el otro miembro pretendido de un par de union (la diana a diferencia de los otros componentes en la muestra). Dicha union entre un miembro de union, por ejemplo, una protefna de union, y otro miembro de union de un par de union, por ejemplo, un ligando o analito, puede ser reversible.
Ademas, como se desvela en la Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 12/134.594 de Thomas et al., presentada el 6 de junio de 2008, y Solicitud de Patente Internacional de PCT n.° PCT/US2008/066023 de Thomas et al., presentada el 6 de junio de 2008, en algunas realizaciones, puede usarse un enlazador de polietilenglicol (PEG) para unir un miembro de union especffica con una partfcula indicadora SERS activa, una partfcula de captura magnetica, o un soporte solido. En los metodos desvelados por la presente, una molecula enlazadora, por ejemplo, PEG, tambien puede usarse para unir un miembro de union especffica con una partfcula indicadora SERS activa, o una partfcula de captura magnetica. El uso de un enlazador de PEG puede reducir la union no especffica en los ensayos desvelados por la presente. La eliminacion de adsorcion no especffica puede ser un reto significativo para el rendimiento de ensayo. Por ejemplo, en ensayos de captura magnetica, la union no especffica puede incluir el proceso en el que protefnas u otras biomoleculas de solucion se adhieren a las superficies de la partfcula de captura magnetica o partfcula indicadora SERS activa que presenta miembros de union para el analito diana o el proceso por el que las superficies de la partfcula de captura magnetica y nanopartfcula SERS activa se adhieren entre sf mediante interacciones no especfficas. En algunas realizaciones, el enlazador de PEG comprende una molecula de PEG bifuncional que tiene un grupo funcional en uno de los extremos terminales de la molecula lineal, separada por dos o mas subunidades de etilenglicol. En algunas realizaciones, la molecula de PEG comprende entre 2 y aproximadamente 1000 subunidades de etilenglicol. En realizaciones particulares, el enlazador de PEG comprende al menos 12 subunidades de etilenglicol. Ademas, el enlazador de PEG puede caracterizarse por tener un peso molecular de aproximadamente 200 Da a aproximadamente 100.000 Da.
Dependiendo del miembro de union, un experto habitual en la materia reconocerfa tras la revision de la materia objeto desvelada por la presente que pueden usarse enlazadores distintos de PEG. Por ejemplo, pueden usarse alcanotioles como enlazadores para anticuerpos y peptidos. Pueden usarse alcanotioles de cadena corta, incluyendo, pero sin limitacion, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) y N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP)
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como enlazadores despues de la desproteccion de sulfhidrilo. Otras propiedades tambien pueden determinar la eleccion de enlazador, tal como la longitud de la cadena enlazadora. Por ejemplo, PEG puede ser deseable porque tambien actua para proteger la superficie del reactivo y es flexible, lo que puede potenciar la capacidad del reactivo para unirse con el analito de interes.
En algunas realizaciones, el miembro de union especffica es una inmunoglobulina, tambien denominada en el presente documento anticuerpo, que comprende una region de union a antfgeno que se une con antfgenos en el microorganismo diana o secretados por el mismo.
Los anticuerpos y fragmentos de los mismos adecuados para su uso en los metodos y dispositivos desvelados por la presente pueden ser de origen natural o derivar de forma recombinante y pueden incluir, pero sin limitacion, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecfficos, humanos, humanizados, primatizados o quimericos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de union a epftopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs, Fv monocatenarios (scFv), Fv con enlaces disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un domino ligero variable (VL) o pesado variable (VH), fragmentos producidos por una biblioteca de expresion de Fab y anticuerpos antiidiotfpicos (anti Id). En todos los casos, el anticuerpo o fragmento del mismo tendra una o mas regiones determinantes de complementariedad (CDR) especfficas para el antfgeno diana. Para fines de la invencion, una “region determinante de complementariedad de un anticuerpo” es la parte de un anticuerpo que se une con un epftopo, incluyendo cualquier region marco conservada necesaria para dicha union, y que puede estar comprendida por un subconjunto de restos de aminoacidos codificados por las regiones V, D y J de cadena pesada humana, las regiones V y J de cadena ligera humana y/o combinaciones de las mismas.
Los expertos en la materia pueden realizar cualquiera de dichos derivados de anticuerpo usando tecnicas reconocidas en este campo convencionales. Por ejemplo, Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525 desvela el reemplazo de las CDR de un anticuerpo humano con las de un anticuerpo de raton. Marx (1985) Science 229: 455456 analiza anticuerpos quimericos que tienen regiones variables de raton y regiones constantes humanas. Rodwell (1989) Nature 342: 99-100 analiza elementos de reconocimiento de menor peso molecular derivados de la informacion de CDR de anticuerpos. Clackson (1991) Br. J. Rheumatol. 3052: 36-39 analiza anticuerpos monoclonales modificados por ingenierfa genetica, incluyendo derivados de fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios, protefnas de fusion, anticuerpos quimericos y anticuerpos de roedor humanizados. Reichman et al. (1988) Nature 332: 323-327 desvela un anticuerpo humano en el que se han injertado regiones hipervariables de rata. Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536 ensena el injerto de un sitio de union a antfgeno de raton en un anticuerpo humano.
D. Partfculas de captura magnetica
Las partfculas de captura magnetica adecuadas para su uso con las realizaciones desveladas por la presente pueden comprender de aproximadamente 15 % a aproximadamente 100 % de material magnetico tal como, por ejemplo, magnetita, incluyendo aproximadamente 15 % de magnetita, aproximadamente 20 % de magnetita, aproximadamente 25 % de magnetita, aproximadamente 30 % de magnetita, aproximadamente 35 % de magnetita,
aproximadamente 40 % de magnetita, aproximadamente 45 % de magnetita, aproximadamente 50 % de magnetita,
aproximadamente 55 % de magnetita, aproximadamente 60 % de magnetita, aproximadamente 65 % de magnetita,
aproximadamente 70 % de magnetita, aproximadamente 75 % de magnetita, aproximadamente 80 % de magnetita,
aproximadamente 85 % de magnetita, aproximadamente 90 % de magnetita, aproximadamente 95 % de magnetita,
y cualquier numero entero entre aproximadamente 15 % y aproximadamente 100 %. Ademas, las partfculas de captura magnetica pueden tener un diametro que varfa de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 12 micrometros. En algunas realizaciones, las partfculas de captura magnetica tienen un diametro que varfa de aproximadamente 400 nm a aproximadamente 8 micrometros. En otras realizaciones, las partfculas de captura magnetica tienen un diametro que varfa de aproximadamente 800 nm a aproximadamente 4 micrometros. En otras realizaciones mas, las partfculas de captura magnetica tienen un diametro que varfa de aproximadamente 1,6 micrometros a aproximadamente 3,5 micrometros, incluyendo pero sin limitacion, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,9, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,1,
aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6,
aproximadamente 2,7, aproximadamente 2,8, aproximadamente 2,9, aproximadamente 3,0, aproximadamente 3,1,
aproximadamente 3,2 y aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5 y aproximadamente 4,5
micrometros. Pueden obtenerse partfculas representativas adecuadas para su uso como partfculas de captura magnetica de Bangs Laboratories, Inc. (Fishers, Indiana), Life Technologies (Carlsbad, CA), o Polyscience Laboratories (Warrington, Pensilvania).
Puede conseguirse captura magnetica de las partfculas usando cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo, pero sin limitacion, colocacion de un iman fuerte o induccion de un campo magnetico en un area localizada del vaso de ensayo. El campo magnetico localizado puede inducirse, por ejemplo, por uno o mas imanes permanentes, electroimanes y/o materiales (por ejemplo, metales ferrosos) para conducir, restringir o centrar un campo magnetico. Como se representa en la Figura 18, que representa una realizacion, el iman 15 se usa para localizar los complejos de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora SERS activa dentro de la zona de medicion 9. La radiacion incidente de una longitud de onda deseada, por ejemplo, un haz de laser, puede despues centrarse
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E. Sistema en tiempo real de supervision del crecimiento en una muestra de cultivo microbiologico
La Figura 24 representa una realizacion de un sistema en tiempo real 150 que proporciona supervision en tiempo real del crecimiento de microorganismos en muestras de cultivo microbiologico para la deteccion automatica de patogenos en muestras clfnicas e industriales. El sistema 150 incluye un carrusel 152 que contiene una pluralidad de vasos de cultivo 154 dentro de un recinto de temperatura controlada. Por ejemplo, pueden usarse hasta 25 vasos de cultivo microbiologico. En esta realizacion, los vasos 154 se colocan alrededor de la periferia de un carrusel 152, que rota para presentar cada vaso en una estacion de sedimentacion y lectura 156 en secuencia a una frecuencia programable (por ejemplo, una lectura cada 10-60 minutos). La estacion de sedimentacion y lectura 156 incluye un conjunto de iman para formar un sedimento junto con una cabeza de lectura optica que contiene filtros y lentes apropiados para epiiluminacion y recogida de senales. Por ejemplo, la iluminacion puede proporcionarse por un laser estabilizado a longitud de onda de 785 nm y la senal recogida se detecta en un espectrometro apropiado para espectroscopia de Raman. Despues de sedimentar y leer una muestra dada, el carrusel 152 rota hasta presentar la siguiente muestra en el carrusel a la estacion de sedimentacion y lectura 156. La secuencia continua hasta que todas las muestras en el carrusel 152 se leen, en cuyo punto el carrusel entra en un modo de giro en el que el carrusel rota continuamente hasta el siguiente ciclo de medicion. El carrusel y la estacion de sedimentacion y lectura se montan en un brazo que se extiende desde una plataforma de balanceo. El movimiento de “balanceo equilibrado” resultante proporciona agitacion mediante movimiento tanto lineal como de balanceo. La plataforma de balanceo actua a una frecuencia seleccionada para todas las fases de un ciclo de mediciones, durante el transcurso del experimento. La agitacion cumple multiples fines. En primer lugar, desde el extremo de un ciclo de medicion hasta el inicio del siguiente, asegura el mezclado de las partfculas de SERS y magneticas con la muestra y el medio de cultivo, permitiendo la formacion de complejos de miembro de union-microorganismo-partfcula indicadora. En segundo lugar, despues de haberse lefdo el sedimento, permite la dispersion de las partfculas magneticas de nuevo en solucion. En tercer lugar, durante la sedimentacion, la agitacion porta partfculas magneticas en el fluido de diversos puntos espaciales dentro del vaso de muestra en la region del campo magnetico localizado, lo que asegura que se recojan partfculas magneticas de regiones de la muestra fuera del campo magnetico localizado. Finalmente, en muestras que contienen partfculas (por ejemplo resinas, carbon o carbonato calcico), la agitacion antes y durante la sedimentacion puede evitar que estas partfculas se depositen en la region de deteccion e interfieran con la senal optica. A medida que aumenta la concentracion del organismo diana mediante el proceso de enriquecimiento, se produce deteccion e identificacion del microorganismo por optica, tal como tecnologfa de SERS, en cuanto la concentracion del microorganismo alcance el umbral de deteccion de la tecnologfa. La capacidad de supervisar continuamente la senal de SERS durante el cultivo asegura que se use el tiempo de cultivo requerido mfnimo y que el instrumento pueda alertar automaticamente al usuario cuando se detecte e identifique un patogeno o microorganismo.
La Figura 25 muestra otra realizacion de un sistema 200 configurado para procesar una pluralidad de muestras. En esta realizacion particular, cada una de las muestras de cultivo microbiologico se procesa en paralelo y se incuba dentro de la misma zona termica. En esta realizacion, los tubos de muestras se alinean en el mismo plano horizontal. El sistema 200 puede colocarse dentro de un recinto que forma la zona termica.
Todas las muestras se agitan juntas durante las fases de union de reactivo, sedimentacion y dispersion del sedimento. En una realizacion, despues de la sedimentacion, la agitacion se detiene para todas las muestras, y estas se leen en sucesion. El procesamiento en paralelo requiere una disposicion de muestras diferente que el carrusel usado en la primera configuracion del sistema 150. Aquf, los tubos de muestra 202 se situan adyacentes entre sf en una bandeja plana 204. En esta realizacion, la agitacion es por reciprocidad lineal a lo largo del eje longitudinal de los tubos 202, que puede programarse para diferentes frecuencias y perfiles a lo largo del ensayo. Esto permite diferentes tipos y niveles de agitacion para la formacion de sedimentos, dispersion de sedimentos y fases de union de reactivos. Tambien permite detener la agitacion para la lectura. La programacion de diferente agitacion en cada fase se hace posible por el enfoque de procesamiento de muestras en paralelo.
El sistema 200 mostrado en la Figura 25 incluye un conjunto de iman 206 que esta configurado para girar en una posicion adyacente a los tubos 202 para sedimentar y despues alejarse girando de los tubos de muestra para exploracion. Para la realizacion del sistema 200 mostrada en la Figura 25, la exploracion optica puede realizarse con el conjunto de iman 206 alejado girando de los tubos de muestra 202 despues de la formacion de sedimentos para permitir el acceso de la cabeza de lectura optica 208 a la zona de medicion de los tubos de muestra. La retirada del conjunto de iman 206 es posible en esta configuracion debido a que las muestras no se estan agitando durante la lectura. Como alternativa, pueden disponerse un par de imanes de tal manera que proporcionen una ranura a traves de la cual la cabeza de lectura 208 toma las lecturas, con los imanes mantenidos en posicion despues de la sedimentacion. Por lo tanto, la cabeza de lectura 208 se configura para moverse a lo largo de la ranura entre los imanes para explorar cada tubo. Esto ofrece ventajas eliminando la necesidad de mover los imanes entre la sedimentacion y la lectura de los tubos.
Las Figuras 26-29 ilustran otra realizacion de un sistema 250 para supervision automatica y en tiempo real del
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crecimiento de microorganismos en muestras de cultivo. El sistema 250 se configura para procesar automaticamente uno o mas ensayos diferentes simultaneamente. En general, el sistema 250 incluye una pluralidad de incubadores 252 en los que actua un unico conjunto de sedimentacion/lectura 254 que se mueve detras de los incubadores para actuar en (sedimentar y leer) cada bandeja 256 uno cada vez en una zona de deteccion. Cada incubador 252 se configura para recibir una bandeja 256 que contiene una pluralidad de tubos de muestra 258. Cada bandeja 256 de tubos se configura para moverse desde el incubador 252 al conjunto de sedimentacion/lectura 254 donde se forman sedimentos y se recogen datos en la zona de deteccion. El conjunto de sedimentacion/lectura 254 comprende un conjunto de iman 260 para formar sedimentos y los componentes opticos (por ejemplo, optica de Raman, laser y espectrometro) para recoger las senales opticas.
En una realizacion, el sistema 250 incluye una pluralidad de incubadores 252. Diversos ensayos pueden incubar muestras de cultivo a diferentes temperaturas. Por lo tanto, el sistema 250 puede incluir una pluralidad de zonas termicas 262 (zonas de incubacion) que pueden actuar a diferentes temperaturas, en el que cada zona incluye uno o mas incubadores. Los ensayos en cada incubador 252 se procesan simultaneamente, en el que cada incubador puede incluir una o mas bandejas 256 que contiene uno o mas tubos de muestras 258. Sin embargo, los tubos de muestra 258 pueden no procesarse necesariamente en un lote. A este respecto, cada tubo de muestras 258 puede colocarse en el incubador 252 en un momento diferente, teniendo de este modo un tiempo de inicio diferente para su periodo de ensayo. Los tubos de muestras 258 pueden exponerse todos al mismo ciclo de ensayo repetido durante sus periodos de ensayo. La mayorfa de tubos de muestras 258 pueden introducirse juntos en lotes. Como se muestra en las Figuras 26 y 27, el sistema incluye cuatro incubadores 252 que se dividen en dos zonas termicas 262. Las zonas termicas 262 pueden disponerse verticalmente de modo que dos incubadores 252 se asocien con una zona termica respectiva. Las zonas termicas identicas 262 se apilan verticalmente como se muestra en la Figura 27. Sin embargo, se entiende que las zonas termicas 262 pueden disponerse horizontalmente, o lateralmente, si se desea. Cada zona 262 puede incluir uno o mas incubadores 252 mantenidos a niveles de incubador identicos que actuan a una temperatura comun. En una realizacion ejemplar, las zonas 262 se configuran para procesar ensayos de Salmonella y Listeria, que se mantienen a diferentes temperaturas (por ejemplo, aproximadamente 42 °C y 30 °C, respectivamente). Por lo tanto, el sistema 250 se configura para procesar diferentes tubos de muestras 258 (por ejemplo, viales de deteccion) independientemente del tipo de ensayo.
En una realizacion, cada incubador 252 forma un recinto adecuado para recibir una bandeja 256 en el mismo y mantener una temperatura predeterminada necesaria para cultivar una muestra particular. Un ejemplo de un incubador 252 se muestra en la Figura 34. El incubador 252 puede incluir un bloque base 264, incluyendo las superficies inferiores y laterales, puertas frontales y traseras 266, 268 y una superficie superior 270. El incubador 252 puede estar formado por una diversidad de materiales adecuados para proporcionar un recinto de temperatura controlada. Por ejemplo, los incubadores 252 pueden construirse a partir de un unico bloque base metalico mecanizado 264 (por ejemplo, aluminio) que forma el fondo y los laterales de la region de temperatura controlada, mientras que una placa metalica (por ejemplo, aluminio) forma la superficie superior 270. El incubador 252 tambien puede incluir un canal 272 en el lado izquierdo del bloque base que se configura para soportar una correa 274 para oscilar la bandeja 256 en una direccion Y bajo el control de una plataforma Y 278. El rango de movimiento de la bandeja 256 se extiende mas alla de la profundidad de zona caliente para proporcionar impulso de bandeja en el area de sedimentacion/lectura detras del incubador 252. Por lo tanto, el rango de movimiento de cada bandeja 256 se basara en distancia necesaria para agitar apropiadamente los tubos 258 asf como resituar los tubos fuera del incubador 252 para sedimentacion y analisis de imagenes por el conjunto de sedimentacion/lectura 254.
En una realizacion, el incubador 252 incluye una puerta frontal 266 y una puerta trasera 268, en el que las puertas cooperan con la superficie superior 270 y el bloque base 264 para formar un recinto. La puerta frontal 266 se configura para abrirse y cerrarse selectivamente por un operador (vease por ejemplo Figura 31). Por ejemplo, la puerta frontal 266 puede configurarse para oscilar hacia abajo de modo que la bandeja 256 pueda extenderse desde el frontal del incubador 252 a una distancia minima y la puerta no obstruya el acceso del tubo o la visibilidad. La puerta frontal 266 puede montarse usando una diversidad de tecnicas para facilitar la apertura y el cierre. Por ejemplo, la puerta frontal 266 puede montarse en bisagras cargadas con muelle de torsion que cierran la puerta tras la extraccion de la bandeja al incubador 252. Un mecanismo de empuje puede extenderse desde uno o ambos lados del frontal de la bandeja para ayudar a abrir la puerta. De acuerdo con un aspecto, se localiza una bandera dentro de la puerta frontal 266 que se configura para interrumpir un sensor optico montado en la pared lateral interior del incubador 252 para detectar cuando se cierra la puerta frontal.
De forma similar, la puerta trasera 268 puede configurarse para abrir y cerrar despues de que la bandeja 256 salga y vuelva a entrar en la parte posterior del incubador 252 (vease Figura 40). Por lo tanto, a medida que la bandeja 256 sale del incubador 252, la bandeja se configura para empujar la puerta trasera 268 para que se abra al menos parcialmente. Como la puerta frontal 266, la puerta trasera 268 puede montarse en bisagras cargadas con muelles de torsion y puede configurarse un elemento en la parte trasera de la bandeja 256 para empujar la puerta trasera para que se abra a medida que la bandeja sale de la parte posterior del incubador 252. Se configura una funda 276 para recibir la bandeja 256 tras salir del incubador 252 y se configura para moverse a lo largo de un eje Z como se explica en mas detalle posteriormente. Una vez que se ha abierto parcialmente la puerta trasera 268, la funda 276 puede configurarse para abrir completamente la puerta trasera a medida que la funda se eleva a lo largo del eje Z para alinearse con el incubador 252. Manteniendo la funda 276 la puerta abierta, la bandeja 256 se puede mover
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libremente en el area de sedimentacion/lectura sin interferencia de la puerta trasera 268. La puerta trasera 268 se configura para cerrarse cuando la bandeja 256 se retraiga al incubador 252 y la funda 276 se baja. El incubador 252 puede incluir un sensor para indicar que la bandeja 256 esta situada de forma apropiada en el mismo. Por ejemplo, una bandera en el interior de la puerta trasera 268 puede configurarse para interrumpir un sensor optico montado en la pared lateral interior del incubador para detectar cuando se cierra la puerta trasera. Este sensor puede tambien usarse como un indicador de acoplamiento para la bandeja 256. Por lo tanto, el sensor de la puerta trasera puede establecer la posicion de la bandeja 256 en o fuera de la parte trasera del incubador 252. Un segundo sensor de acoplamiento puede localizar el acoplamiento para cada bandeja 256 en relacion con la sedimentacion y el hardware optico durante cada traslado a la region de sedimentacion/lectura.
Debido a que cada incubador 252 tiene la temperatura controlada, el incubador puede envolverse en un material aislante (por ejemplo, un aislante de espuma de celda cerrada). Cada una de las zonas termicas 262 tambien puede separarse por un material aislante, que es util cuando las zonas se mantienen a diferentes temperaturas. Tambien puede haber huecos entre zonas para limitar la interaccion entre zonas. Ademas, el material aislante puede usarse para evitar la interaccion termica cuando se abra una puerta incubadora 266 o 268 a la parte frontal o la parte posterior y la otra este cerrada. Los espaciadores aislantes pueden separar incubadores en una zona 262. De forma similar, las zonas 262 tambien pueden separarse usando espaciadores y material aislante.
Cada incubador 252 se calienta usando un elemento de calentamiento. Por ejemplo, el elemento de calentamiento puede configurarse para conducir calor a traves del bloque base 264 o proporcionar aire caliente dentro del incubador. De acuerdo con una realizacion, el elemento de calentamiento es un elemento de calentamiento plano adherido a o integrado de otro modo con la superficie inferior del bloque base 264. La distribucion de potencia del elemento de calentamiento puede adaptarse para minimizar los gradientes termicos a traves de los tubos 258 en la bandeja 256 para compensar la perdida termica a traves de los componentes del impulsor Y 278 en el lado izquierdo del incubador 252. Cada incubador 252 puede equiparse con uno o mas sensores para supervisar la temperatura en el mismo, tal como la temperatura del bloque base 264 y/o el aire dentro del incubador.
Como se ha analizado anteriormente, cada incubador 252 se configura para recibir una bandeja respectiva 256 en el mismo. Las Figuras 30-32 ilustran realizaciones ejemplares de bandejas 256 adecuadas para situarse dentro de un incubador respectivo. Una bandeja 256 en cada incubador 252 se configura para acomodar una pluralidad de tubos 258. En la realizacion ilustrada, la bandeja 256 contiene 15 tubos 258 de modo que cada zona termica 262 contenga 30 tubos, aunque puede usarse cualquier numero de tubos. Los tubos 258 pueden disponerse horizontalmente en una matriz plana en cada una de las bandejas 256. En una realizacion mostrada en la Figura 31, un tecnico coloca manualmente tubos de muestras 258 en bandejas de muestras desmontables 256. El tecnico coloca despues las bandejas 256 en los incubadores 252. Un ensayo esta completo cuando se determina un resultado positivo o cuando el resultado permanece negativo durante un periodo de tiempo predeterminado. Cuando el ensayo se ha completado, el tecnico retira las bandejas 256 para recargar con nuevos tubos 258. Como alternativa, el tecnico puede retirar y/o anadir tubos a la bandeja individualmente segun sea necesario sin detener los ensayos que ya estan en progreso dentro de otros tubos en la bandeja o incubadores adyacentes. Las muestras positivas pueden segregarse para analisis adicional. En otra realizacion, las bandejas 256 no son desmontables. Por lo tanto, los tubos 258 pueden colocarse individualmente en una bandeja no desmontable 256 en cada incubador 252. En otra realizacion mas, la bandeja 256 puede ser innecesaria cuando el incubador 252 incluya medios adecuados para sostener los tubos 258 en el mismo.
La disposicion de los tubos 258 horizontalmente y lateralmente en las bandejas 256 facilita la carga de tubos de muestra individuales o bandejas desde el frontal del incubador 252. La carga frontal evita el uso de espacio de asiento o espacio de pasillo enfrente del sistema, ya que una bandeja de carga superior necesitarfa extenderse desde el frontal del sistema casi la longitud de un tubo para facilitar la carga superior. Ademas, la bandeja y el soporte deslizante necesitarfan soportar altas cargas cuando un usuario ejerza presion excesiva en la bandeja extendida voladiza.
Cada bandeja 256 puede ser de una diversidad de tamanos y configuraciones para contener tubos 258 y facilitar la colocacion dentro del incubador 252. Por ejemplo, la Figura 31 ilustra que los tubos 258 se insertan dentro de ranuras respectivas 284 definidas en la bandeja 256. Los tubos 258 pueden mantenerse en su sitio usando una fuerza o un ajuste de interferencia o elementos de distorsion dispuestos dentro de la bandeja 256. Cuando las bandejas 256 sean desmontables del incubador 252, las bandejas pueden incluir uno o mas elementos de agarre 286 que permitan a un tecnico sostener las bandejas y manipular las bandejas dentro del incubador, como se muestra en las Figuras 33A-33C.
En una realizacion, la bandeja 256 incluye ranuras longitudinales 284 de modo que una parte de los tubos 258 sea visible a traves de la bandeja. Las ranuras longitudinales 284 tambien permiten que los tubos 258 sobresalgan por debajo de la superficie inferior de la bandeja 256 para proporcionar un area de contacto con los imanes de sedimentacion 288. Para asegurar el contacto suficiente con los imanes a traves de la bandeja 256, cada tubo 258 puede tener conformidad vertical en la bandeja. Por ejemplo, un muelle puede sostener el tubo 258 pegado a los imanes a medida que se elevan para encontrarse con el tubo. El muelle tambien puede conservar los tubos 258 en la bandeja 256 por friccion contra el movimiento de bandeja oscilatorio.
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a) Agitacion para mezcla cinetica en el incubador 252;
b) Extension de los tubos del frontal del incubador 252 para carga y descarga por parte del operador;
c) Extension de los tubos desde la parte posterior de los incubadores 252 al conjunto de sedimentacion/lectura
254;
d) Agitar los tubos 258 para dispersar materiales sedimentados, por ejemplo, componentes solidos de medios o
muestras;
e) Agitar los tubos 258 y los imanes 288 en el conjunto de sedimentacion/lectura 254 para formar sedimentos;
f) Situar los tubos 258 sobre la cabeza de lectura 290 para recogida de datos;
g) Situar las etiquetas de los tubos sobre un lector de codigo de barras para ID de la muestra;
h) Situar los sedimentos sobre una camara para visualizar sedimentos con respecto a controles internos,
metodos de deteccion basados en imagenes o diagnostico remoto;
i) Agitar los tubos 258 para dispersar los sedimentos despues de la lectura;
j) Operar la puerta frontal 266 del incubador;
k) Operar la puerta posterior 268 del incubador;
l) Circular aire en el incubador 252 para reducir los gradientes de temperatura.
Como se muestra en la Figura 34, el sistema incluye una plataforma Y 278 para mover las bandejas 256 a lo largo de un eje Y, incluyendo para oscilar o agitar las bandejas y meter y sacar las bandejas de la parte posterior del incubador 252. Como se muestra en la Figura 27, cada incubador 252 puede incluir una plataforma Y 278 respectiva dispuesta a lo largo del eje Z para separar verticalmente entre si. La bandeja 256 puede acoplarse a la plataforma Y 278 usando uno o mas carros 282. Por ejemplo, la bandeja 256 puede volarse desde un carro 282 montado en un carril lineal 292, en el que el carril lineal se monta en el bloque base 264 del incubador. La plataforma Y 278 incluye un motor 280 para conducir una cinta 274 alrededor de poleas dentadas en ambos extremos del carril 292. Se entiende que la plataforma Y 278 se configura para agitar las bandejas 256 a una diversidad de frecuencias y amplitudes dependiendo del ensayo y la aplicacion particulares. Por ejemplo, las bandejas 256 pueden oscilarse mas lentamente mientras que esten en los incubadores 252 que cuando se situen en el conjunto de sedimentacion/lectura 254.
Los componentes de plataforma Y 278 pueden tambien encerrarse por un material aislante, mientras que el motor 280 que conduce la plataforma Y esta fuera del area aislada. Las bandejas 256 y el carro 282 pueden moverse a traves de una apertura en el material aislante.
El sistema 250 tambien incluye una plataforma Z 294 localizada detras de los incubadores 252 (vease Figuras 39, 42 y 43). La plataforma Z 294 se configura para portar la funda 276, el conjunto de iman 260, los componentes opticos (por ejemplo, espectrometro 308, sonda de Raman 310, etc.) y la plataforma X 296 a lo largo de un eje Z. La plataforma Z 294 puede incluir un carro 298 configurado para correr en un carril lineal vertical 300. Se configura un motor 302 para subir y bajar la plataforma Z en una direccion Z (por ejemplo, usando un tornillo y tuerca lineal dispuestos dentro del astil 304 acoplado a un soporte de plataforma Z 306). Puede usarse un sensor para indicar cuando la plataforma Z 294 esta en la parte inferior de su desplazamiento en la direccion Z. El espectrometro 308, el conjunto de iman 260, funda 276 y plataforma X 296 se montan en el soporte de plataforma Z 306 y viajan todos juntos en la direccion Z como una unidad. La plataforma Z 294 se configura para moverse en la direccion Z para acomodar cada bandeja 256 que salga del incubador 252. La plataforma Z 294 tambien se configura para desplazarse por debajo del incubador de fondo 252 suficientemente para permitir que se cierre la puerta trasera de incubador de fondo 268.
El sistema 250 tambien incluye un conjunto de iman 260, como se muestra en las Figuras 42, 45 y 46. El conjunto de iman 260 puede incluir uno o mas imanes 288 montados en un marco de imanes 318 configurado para aplicar un campo magnetico a los tubos 258, facilitando de este modo la formacion de un sedimento dentro de cada tubo. Por ejemplo, las Figuras 45 y 46 ilustran un par de imanes longitudinales 288 separados a una distancia suficiente para permitir que la cabeza de lectura 290 se extienda a traves de ellos para obtener una lectura. Por lo tanto, los imanes 288 pueden permanecer en su posicion despues de la sedimentacion y mientras la cabeza de lectura 290 lee los tubos 258. Cada iman longitudinal 288 puede ser un iman sencillo o una coleccion de una pluralidad de imanes dispuestos de extremo a extremo.
Pueden formarse sedimentos cuando los imanes 288 se ponen en contacto con, o en proximidad estrecha a, el fondo de los tubos orientados en horizontal 258. Los tubos 258 e imanes 288 oscilan suavemente durante la formacion de sedimentos para asegurar que las partfculas magneticas en suspension pasen a traves del campo magnetico y sean atrafdas a un punto focal de campo magnetico. De acuerdo con una realizacion, el conjunto de iman 260 se monta en un carro 312 que se desplaza en la direccion Y en un carril 314 fijado al soporte de plataforma Z 306 (vease Figura 46). El carril 314 puede ser paralelo al carril de plataforma Y 292.
Cuando la bandeja 256 se extiende desde la parte trasera del incubador 252 y al conjunto de sedimentacion/lectura
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254, la plataforma Z 294 puede elevarse desde abajo a lo largo de un eje Z. Como se muestra en las Figuras 42 y 47, un pasador 316 que se extiende hacia fuera desde el marco de imanes 318 se configura para conectar con un agujero en la parte inferior de la bandeja 256. Una vez conectado, el marco de imanes 318 se acopla con la bandeja 256, y el marco de imanes y la bandeja son capaces de moverse juntos en la direccion Y a lo largo del carril 314. Por lo tanto, en una realizacion, el conjunto de sedimentacion/lectura 254 se configura para procesar una bandeja 256 cada vez. La amplitud de oscilacion de sedimentacion puede variar dependiendo del numero de factores especfficos para un ensayo particular. En un ejemplo, la amplitud de oscilacion puede ser de hasta aproximadamente 50 mm. El marco de imanes 318 y la bandeja 256 pueden acoplarse en una posicion de desplazamiento completo de la plataforma Y en la direccion Y, mientras que el centro de las oscilaciones de sedimentacion pueden localizarse hacia adelante desde la localizacion de acoplamiento para acomodar la mitad de la amplitud en la direccion Y.
En una realizacion, una cantidad pequena de movimiento relativo entre los tubos oscilantes 258 y los imanes 288 permiten que el campo magnetico reuna las partfculas magneticas en un sedimento mas ajustado. Por lo tanto, un acoplamiento suelto entre la bandeja 256 y el marco de imanes 318 puede ser deseable. Dicho acoplamiento puede implementarse, por ejemplo, montando el marco 318 en un bloque mantenido en una ranura en el marco 318 entre dos muelles. A medida que la bandeja 256 oscila hacia adelante y hacia atras en la direccion Y, el marco 318 se mueve en relacion con la bandeja a medida que los muelles se comprimen alternativamente en un segundo movimiento oscilatorio. El impulso de acoplamiento suelto puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5 mm. Las constantes de muelle se seleccionaran para proporcionar la frecuencia de oscilacion optima.
El conjunto de iman 260 se configura para sedimentar cada uno de los tubos 258 en la bandeja 256 simultaneamente, segun una realizacion de la presente invencion. Los imanes 288 pueden configurarse para permanecer en su lugar mientras que los tubos 258 se leen por la cabeza de lectura 290. Como alternativa, los sedimentos pueden ser adecuadamente persistentes para permitir que el iman 288 o los tubos 258 se alejen entre si para la lectura.
La Figura 41 muestra un ejemplo de una plataforma X 296 que esta acoplada a la plataforma Z 294. Por lo tanto, la plataforma X 296 esta configurada para moverse en la direccion Z por la plataforma Z. La plataforma X 296 tambien facilita el movimiento de la cabeza de lectura 290 en la direccion X para la lectura de cada uno de los tubos 258. La plataforma X 296 explora la cabeza de lectura 290 bajo la serie de tubos 258 para recoger datos de ensayo despues de haberse formado los sedimentos. Durante la sedimentacion, la plataforma X 296 se mueve a una posicion X que permite que una bandeja acoplada 256 se mueva sin interferencia con la cabeza de lectura 290 y el conjunto de iman 260. Despues de sedimentar, con la bandeja 256 estacionaria, la plataforma X 296 se traslada a cada tubo 258, deteniendose para recoger datos hasta que se han lefdo todos los tubos. La plataforma X 296 se resitua despues en su posicion de partida antes de moverse la bandeja 256. En una realizacion ejemplar, el impulsor de plataforma X (por ejemplo, motor 320 y cinta 322) se monta en un canal 324 en el soporte de plataforma Z 306 y utiliza un diseno similar al de la plataforma Y 278. La cabeza de lectura 290 se monta en un carro 326 que se configura para moverse a lo largo de un carril 328 de la plataforma X 296. Puede usarse un manguito flexible 330 para dirigir los cables electricos de la cabeza de lectura 290 y el cable optico de fibra flexible de la plataforma Z 294 a la cabeza de lectura en movimiento. El manguito flexible 330 se configura no solamente para proteger el haz de fibra optica sino tambien para permitir que la fibra se doble en la direccion X y proporcionar un radio de flexion deseado.
De acuerdo con otra realizacion, la plataforma X 296 se configura para portar un lector de codigo de barras (no mostrado) para leer un codigo de barras u otro identificador en cada uno de los tubos 258. Por ejemplo, el lector de codigos de barras puede usarse para confirmar que el tubo 258 este en la zona termica correcta 262, evitando de este modo falsos negativos. El codigo de barras podrfa incluir otros datos, tales como identificacion e informacion de ensayo. Como se ha analizado anteriormente, los tubos 258 pueden incluir ranuras longitudinales 284 que facilitan dicha lectura por un lector de codigo de barras. Adicionalmente, el lector de codigo de barras puede proporcionar datos de imagenes en sedimentos para controles internos, metodos de deteccion basados en imagenes y/o diagnostico remoto.
Como se ha analizado anteriormente, se configura una funda 276 para recibir cada bandeja 256 a medida que la bandeja sale de la parte posterior del incubador 252. En particular, la funda aislada 276 se porta en la plataforma Z 294 y se configura para alinearse con cada incubador 252 para rodear la bandeja 256 cuando se extiende desde la parte posterior del incubador a la region de sedimentacion/lectura 254. La funda aislada 276 minimiza el cambio de temperatura de la bandeja mientras que la bandeja 256 se extiende desde el incubador 252. La funda 276 proporciona un manguito aislado y bloquea el enfriamiento por parte del flujo de aire de la bandeja 256 y los tubos 258 contenidos en la misma. Ademas, la funda 276 se construye de materiales que minimizan su masa termica y por lo tanto el intercambio de energfa calorica con una bandeja 256 a una temperatura diferente de la de la zona precedente. Por ejemplo, la funda 276 puede comprender una estructura de aluminio fina rodeada por un material aislante. En una realizacion especffica, una bandeja a aproximadamente 30 °C que entra en una funda a aproximadamente 42 °C no aumentara su temperatura en mas de aproximadamente 0,5 °C.
Puede haber un hueco 332 definido entre el incubador 252 y la funda alineada 276 de modo que el incubador no puede regular completamente la temperatura en la funda. En esos casos cuando la temperatura en el incubador 252
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es mayor que la temperature ambiente, el aire que rodea la funda 276 puede ser mas trio que la bandeja 256, de modo que cualquier transferencia termica desde la funda sera hacia una temperatura de bandeja menor. Sin embargo, algunos ensayos tienen una tolerancia de temperatura aceptable si hubiera variaciones resultantes del movimiento de la bandeja 256 desde el incubador 252 a la funda 276. Por ejemplo, los ensayos son mas tolerantes a bajadas de temperatura negativas breves, por ejemplo, aproximadamente -2 °C, que a aumentos de temperatura, por ejemplo, aproximadamente +0,5 °C para Salmonella a 42 °C y Listeria a 30 °C. Por lo tanto, puede ser innecesario formar un buen sellado termico con el incubador 252 siempre que las variaciones negativas esten dentro de tolerancias aceptables.
Ademas de rodear la bandeja extendida 256, la funda 276 tambien puede envolver el conjunto de iman 260 como se muestra en la Figura 42. Por lo tanto, la funda 276 puede ser de un tamano que permita que la plataforma Z 294 se mueva verticalmente con el conjunto de iman 260 para acoplar y desacoplar la bandeja 256, como se ha analizado anteriormente. Ademas, la funda 276 puede incluir recortes para proporcionar espacio para la cabeza de lectura 290 a lo largo del fondo de la funda y para que los carros 282 se muevan a lo largo del lateral mediante la plataforma Y 278. La parte superior de la funda 276 tambien puede incluir un recorte para la puerta de incubador posterior 268.
Los componentes anteriormente mencionados del sistema 250 pueden encerrarse en un armario 334, como se muestra en las Figuras 48A y 48B. Una piel forma un armario 334 alrededor del incubador 252 y region de sedimentacion/lectura 254 para controlar el flujo de aire y anadir control termico. El armario 334 tambien puede proporcionar un recinto seguro en el que los componentes opticos actuan (por ejemplo, laser). El sistema 250 puede incluir ademas una o mas senales visibles o auditivas para indicar el estado de los ensayos. Por ejemplo, pueden usarse uno o mas LED 336 para indicar que el ensayo esta en progreso y cuando se produce un resultado positivo. Cada tubo 258 y/o bandeja 256 puede incluir un LED 336 asociado para dicho fin. Pueden usarse diferentes colores de LED para diferentes indicaciones, en las que los colores pueden ser visibles cuando la puerta frontal 266 del incubador 252 esta abierta o cerrada.
Los incubadores 252 tfpicamente se mantienen a una temperatura que es mayor que la ambiental. Para ayudar a conseguir esta diferencia de temperatura y asegurar que no se suministra exceso de calor a las bandejas 256 que se extienden a la funda 276, puede emplearse una ruta de flujo de aire. Tambien pueden usarse ventiladores con filtros para presurizar el armario 334 para reducir la infiltracion de polvo, y pueden usarse otras tecnicas de disipacion del calor para componentes tales como los motores. Otras tecnicas, tales como un enfriador electrico termico pueden usarse para enfriar adicionalmente el armario 334.
Pueden usarse diversos componentes electricos para interaccionar con y controlar el sistema 250 como conocen los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, pueden usarse diversas tarjetas de controlador de motor para controlar los motores y proporcionar la interfaz a los otros dispositivos tales como sensores y codificadores. Pueden usarse otras tarjetas para proporcionar funcionalidad adicional tal como proporcionar potencia y senales de interfaz para la cabeza de lectura 290 y el espectrometro 308 asf como controlar calentadores y leer los termistores asociados. Adicionalmente, el sistema 250 puede emplear diversos otros componentes tales como un microcontrolador para controlar el sistema de una manera automatica como conocen los expertos habituales en la materia.
E. Tecnicas de agitacion y sedimentacion
La Figura 49 representa metodos de agitacion y sedimentacion de acuerdo con una realizacion de la invencion que se han desarrollado para minimizar el volumen de reactivo y obtener una lectura que es representativa de un volumen grande (por ejemplo, hasta 250 ml). Esto se consigue principalmente agitando el vaso de cultivo a lo largo de su eje longitudinal durante la aplicacion del campo magnetico. El sedimento se forma en el lado del tubo, a lo largo de la direccion del eje longitudinal. Puede seleccionarse una combinacion de volumen de muestra con respecto a tubo (por ejemplo 1:2), relacion de aspecto de longitud/anchura del tubo (por ejemplo, 7:1) y resultados de parametros de agitacion para optimizar el rendimiento. La agitacion promueve una formacion de sedimentos mas eficaz asegurando que las partfculas del volumen mayor se pongan en proximidad estrecha con el iman. Ademas, la agitacion ayuda a mantener celulas no en complejo, microorganismos y solidos sueltos (por ejemplo resina en muestras de cultivo sangufneo) fuera del sedimento aplicando una fuerza en direccion distinta a la direccion del campo magnetico.
La Figura 50 representa una realizacion de un dispositivo para formar y explorar el sedimento magnetico. Este dispositivo puede usarse en la realizacion del sistema de carrusel 150 mostrado en la Figura 24. En la realizacion ilustrada en la Figura 50, el conjunto de iman consiste en una pila de imanes anulares que rodean y son colineales con la parte de la cabeza de lectura optica que contiene la lente del objetivo. Una punta de acero conica hueca centra el campo magnetico en la punta del cono, provocando que el sedimento se forme en el foco de la cabeza de lectura. Esta disposicion alinea automaticamente el sedimento con el foco de la cabeza de lectura y suaviza las restricciones sobre el alineamiento del tubo, el iman y la cabeza de lectura. El alineamiento uniforme de sedimento, iman y cabeza de lectura es importante para mediciones uniformes por todas las muestras durante el transcurso del ensayo, y este diseno proporciona formacion de sedimento fiable y repetible entre tubos de muestras, durante multiples lecturas durante el transcurso de un ensayo, y entre diferentes instrumentos.
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Las Figuras 51 y 52 muestran metodos alternatives de formacion del sedimento que se han usado de acuerdo con los sistemas descritos anteriormente. El alineamiento de los tubos en un plano horizontal permite que la senal optica se lea con los imanes extrafdos despues de la sedimentacion o mantenidos en la posicion de sedimentacion. Esto permite ensayar diversas geometrfas de imanes. Se ha demostrado que dos de ellas son especialmente eficaces. Una, denominada “Norte-arriba” usa un iman en barra con magnetizacion dirigida perpendicular al tubo (Figura 52). Esto forma un sedimento circular simetrico ideal para leer con la cabeza de lectura. La otra geometrfa se denomina “par Norte en direccion Norte” (Figura 51), en la que dos imanes en barra se situan adyacentes y paralelos entre si. La magnetizacion se dirige a lo largo de la lfnea perpendicular a los imanes a traves del grosor de cada iman, de modo que los polos Norte se enfrentan entre si. Con separacion apropiada entre los imanes, la region del mayor gradiente de campo esta en la region entre los imanes, dando como resultado un sedimento centrado en la region entre los imanes, a la que se puede acceder facilmente para lectura con los imanes en su sitio.
En otra realizacion de la invencion tambien se anade una camara a la estacion de ensayo para supervisar la formacion y el tamano del sedimento durante el ensayo de SERS-HNW que contiene partfculas indicadoras de SERS conjugadas y perlas magneticas y el patogeno diana dentro de un vaso de cultivo. El tamano del sedimento aumenta, y en algunos casos el sedimento desaparece de la vista de la camara a medida que avanza el ensayo de HNW. El crecimiento del tamano del sedimento y/o la desaparicion del sedimento es un indicio de la presencia del patogeno diana. Las imagenes capturadas durante el analisis de muestras que contienen partfculas indicadoras de SERS conjugadas y perlas magneticas sin patogeno no muestran ningun cambio en el tamano del sedimento y no muestran ninguna desaparicion de sedimento. Este metodo de deteccion de patogenos puede usarse solo o junto con otro metodo de deteccion tal como el analisis de SERS previamente descrito como medio de validacion.
Pueden realizarse realizaciones de los metodos desvelados por la presente con cualquier espectrometro adecuado o sistemas de espectrometro de Raman conocidos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, un Espectrometro de Raman de Espectrometro Multiple Multimodo (Centice, Morrisville, Carolina del Norte, Estados Unidos de America), tal como el sistema de espectrometro de Raman desvelado en la Patente de Estados Unidos n.° 7.002.679 de Brady et al. Otros ejemplos no limitantes de espectrometros adecuados o sistemas de espectrometros de Raman incluyen el Hamamatsu C9405CA y el Intevac ReporteR, e incluyen configuraciones opticas tanto acopladas a fibra como de espacio libre. Se desvela instrumentacion adicional adecuada para su uso con las partfculas indicadoras SERS activas desveladas por la presente en la Solicitud de Patente Internacional de PCT n.° PCT/US2008/057700 de Weidemaier et al., presentada el 20 de marzo de 2008.
Se desvelan metodos representativos para realizar ensayos de SERS basados en lfquido de captura magnetica en la Solicitud de Patente Internacional de PCT n.° PCT/US2008/057700 de Weidemaier et al., presentada el 20 de marzo de 2008. Dichos metodos pueden incluir metodos de referencia y control para compensar variaciones en el tamano, la forma o la situacion de sedimentos magneticos, y metodos para generar espectros de referencia de Raman mejorados y analisis espectral en ensayos basados en lfquidos de extraccion magnetica, como tambien se desvela en el documento PCT/US2008/057700. Ademas, pueden usarse multiples moleculas indicadoras para crear una senal de referencia interna que puede usarse para distinguir el ruido de fondo de la deteccion de senal, particularmente en muestras que muestran o se espera que muestren una senal relativamente debil.
Ademas, como se desvela en la Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 12/134.594 de Thomas et al., presentada el 6 de junio de 2008, y Solicitud de Patente Internacional de PCT n.° PCT/US2008/066023 de Thomas et al., presentada el 6 de junio de 2008, los colorantes adecuados para su uso como moleculas indicadoras en partfculas indicadoras SERS activas muestran tfpicamente espectros de Raman relativamente sencillos con anchuras de lfnea estrechas. Esta caracterfstica permite la deteccion de varias especies Raman activas diferentes en el mismo volumen de muestras. En consecuencia, esta caracterfstica permite fabricar multiples partfculas indicadoras SERS activas, que incluyen cada una diferentes colorantes, de modo que el espectro de Raman de cada colorante pueda distinguirse en una mezcla de diferentes tipos de partfculas indicadoras. Esta caracterfstica permite la deteccion multiple de varias especies diana diferentes en un volumen de muestra pequeno, denominado en el presente documento ensayos multiples.
En consecuencia, en algunas realizaciones, puede unirse mas de un tipo de miembro de union a la partfcula indicadora SERS activa. Por ejemplo, el tipo de miembro de union unido a la partfcula indicadora SERS activa puede variarse para proporcionar multiples reactivos que tengan diferentes afinidades por diferentes microorganismos diana. De esta manera, el ensayo puede detectar mas de un microorganismo de interes o mostrar diferentes selectividades o sensibilidades para mas de un microorganismo. La partfcula indicadora SERS activa puede adaptarse para muestras de cultivo en las que la presencia de uno o mas microorganismos, o las concentraciones del o los microorganismos, pueden variar.
Un reactivo de ensayo de SERS puede incluir mas de un tipo de marcador, por ejemplo, mas de un tipo de molecula indicadora SERS activa, dependiendo de los requisitos del ensayo. Por ejemplo, pueden usarse moleculas indicadoras SERS activas que muestran una senal de Raman a diferentes longitudes de onda para crear una “identificacion” de Raman unica para un microorganismo de interes especffico, potenciando de este modo la especificidad del ensayo. Pueden unirse diferentes moleculas indicadoras a nucleos de nanopartfculas que tienen unidos a los mismos diferentes miembros de union especffica para proporcionar un reactivo capaz de detectar mas
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de un microorganismo de interes, por ejemplo, una pluralidad de microorganismos de interes.
En una realizacion de la invencion, las capacidades de multiplexacion de la tecnologfa de SERS HNW se usan para identificar seis de los organismos mas comunes que provocan infecciones del torrente sangufneo. Estan presentes seis tipos o “estilos” diferentes de partfculas indicadoras SERS activas en un frasco de cultivo sangufneo, cada uno conjugado con anticuerpos especfficos para uno de los seis organismos para detectar. Ademas en el vaso hay partfculas de captura magnetica capaces de formar sandwiches con las partfculas indicadoras SERS activas. Las partfculas de captura magnetica pueden configurarse de modo que haya un anticuerpo de captura comun o conjunto de anticuerpos que intercalen multiples partfculas indicadoras SERS activas o como alternativa podrfa haber seis conjugados magneticos separados presentes en el vaso, siendo cada conjugado magnetico capaz de forma unica de formar un sandwich con cada una de las seis partfculas indicadoras SERS activas. Cuando se forma un sedimento magnetico y se lee la senal de SERS del sedimento, el espectro de Raman medido sera una contribucion de cada estilo de partfcula indicadora SERS activa presente en el sedimento; la presencia de una partfcula indicadora SERS activa indica la presencia del microorganismo para el que las partfculas indicadoras SERS activas son especfficas. Los algoritmos de desconvolucion pueden distinguir eficazmente los espectros de las seis partfculas indicadoras SERS activas individuales del espectro agregado medido.
La Figura 53 muestra un esquema de una realizacion multiple que usa solamente dos partfculas indicadores SERS activas. En una realizacion preferida, se conserva un sensor de gas convencional (por ejemplo BACTEC™), de modo que se supervisen simultaneamente la senal de SERS y las senales sensoras de pH. Esto permite la deteccion eficaz de cualquier microorganismo que no reconozcan los anticuerpos de SERS HNW.
Como se desvela adicionalmente en la Solicitud de Patente Internacional de PCT n.° PCT/US2008/057700 de Weidemaier et al., presentada el 20 de marzo de 2008, en los ensayos desvelados por la presente que implican partfculas indicadoras SERS activas, los espectros de SERS puede amplificarse mediante la adicion de una segunda alfcuota de moleculas indicadoras capaces de generar una senal detectable y tener asociado con las mismas al menos un miembro de union especffica que tenga una afinidad por la al menos una molecula indicadora SERS activa asociada con la o las partfculas indicadoras SERS activas antes de, simultaneamente con o despues de disponer la muestra y/o la al menos una molecula indicadora SERS activa en la misma, en la que la segunda alfcuota de moleculas indicadoras es la misma que la al menos una moleculas indicadora SERS activa asociada con las partfculas indicadoras SERS activas. En algunas realizaciones, la segunda alfcuota de moleculas indicadoras comprende una molecula indicadora SERS activa asociada con una partfcula indicadora SERS activa capaz de producir una senal de SERS. En las realizaciones en las que se dispone una segunda alfcuota de moleculas indicadoras en el vaso de ensayo, el miembro de union especffica de la segunda alfcuota de moleculas indicadoras no reconoce el o los miembros de union especffica que comprenden la zona de captura o unidos a las partfculas de captura magnetica.
F. Ejemplos de flujo de trabajo
Segun una realizacion ejemplar, una muestra de cultivo para detectar e identificar Salmonella puede proporcionarse junto con las realizaciones anteriormente mencionadas. En una realizacion, Salmonella se cultiva en primer lugar en un medio no selectivo dentro del vaso de enriquecimiento, seguido de una transferencia biocontenida a un vial de deteccion que contiene los reactivos de deteccion y un segundo medio selectivo. En general, el ensayo de Salmonella incluye anadir medios con complemento opcional a un vaso de preparacion de medios. El medio se distribuye despues al vaso de enriquecimiento y se anade una muestra al vaso de enriquecimiento. Opcionalmente, la muestra se homogeneiza (por ejemplo, por agitacion en bolsa o mezclado) antes de la adicion al vaso de enriquecimiento. En este caso, el medio del vaso de preparacion de medios se anade junto con la muestra al homogeneizador. Despues de la homogeneizacion, la muestra se transfiere al vaso de enriquecimiento, y se une una tapa al vaso. Una vez que se han anadido medio y muestra al vaso de enriquecimiento y se ha unido la tapa del vaso de enriquecimiento, puede leerse un codigo de barras en el vaso para fines de identificacion de cadena de custodia. El vaso de enriquecimiento se incuba despues durante un periodo de tiempo predeterminado. Despues de la incubacion, el vaso de enriquecimiento y un vial de deteccion pueden explorarse con un lector de codigo de barras. El vial de deteccion incluye un medio selectivo y reactivos de deteccion que son particulares para detectar Salmonella. En caso de que el medio en el vial de deteccion se deshidrate, se anade fluido de reconstitucion al vial de deteccion y el vial se invierte para su mezclado. El recipiente de enriquecimiento se inclina despues para llenar un deposito respectivo con una cantidad deseada de muestra (por ejemplo, 100 pl). El vial de deteccion se inserta en el vaso de enriquecimiento para conectar una aguja dentro de la apertura para una transferencia biocontenida de la muestra al vial de deteccion. El vial de deteccion se inserta despues dentro de un sistema automatico en tiempo real para incubacion y ensayo automatico de la muestra, incluyendo sedimentacion y analisis optico de la muestra. Tras la deteccion de una muestra positiva, el vial de deteccion puede retirarse, leerse por un lector de codigo de barras y dirigirse a procesamiento adicional.
En una realizacion ejemplar alternativa, puede proporcionarse una muestra de cultivo para detectar e identificar Listeria junto con las realizaciones anteriormente mencionadas. En una realizacion preferida, el cultivo de Listeria dentro del vial de deteccion se produce en el mismo medio que se usa en el vaso de enriquecimiento, de modo que se usa un unico medio a lo largo del flujo de trabajo. En general, el ensayo de Listeria incluye anadir medio con
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complemento adicional a un vaso de preparacion de medios. El medio se distribuye despues al vaso de enriquecimiento y se anade una muestra al vaso de enriquecimiento. Opcionalmente, la muestra se homogeneiza (por ejemplo, por agitacion en bolsa o mezclado) antes de la adicion al vaso de enriquecimiento. En este caso, el medio para el vaso de preparacion de medio se anade junto con la muestra al homogeneizador. Despues de la homogeneizacion, la muestra se transfiere al vaso de enriquecimiento, y se une una tapa al vaso. Una vez que se han anadido medio y muestra al vaso de enriquecimiento y se ha unido la tapa del vaso de enriquecimiento, tambien puede leerse un codigo de barras en el vaso para fines de identificacion de cadena de custodia. El vaso de enriquecimiento se incuba despues durante un periodo de tiempo predeterminado. Despues de la incubacion, el vaso de enriquecimiento y un vial de deteccion pueden leerse con un lector de codigo de barras. El vial de deteccion incluye reactivos de deteccion que son particulares para detectar Listeria. El recipiente de enriquecimiento se inclina despues para llenar un deposito respectivo con una cantidad deseada de muestra (por ejemplo, 5 ml). El vial de deteccion se inserta en el vaso de enriquecimiento para conectar con una aguja dentro del orificio para una transferencia biocontenida de la muestra al vial de deteccion. El vial de deteccion se inserta despues dentro de un sistema automatico en tiempo real para incubacion y ensayo automatico de la muestra, incluyendo sedimentacion y analisis optico de la muestra. Tras deteccion de una muestra positiva, el vial de deteccion puede retirarse, explorarse por un lector de codigo de barras y dirigirse a procesamiento adicional.
G. Estacion de reconstitucion
Las Figuras 93-95 ilustran estaciones de reconstitucion que pueden usarse junto con realizaciones de la presente invencion. Como se ha analizado anteriormente, puede anadirse fluido de reconstitucion al vial de deteccion en el que el medio en el vial de deteccion se deshidrata. Las estaciones de reconstitucion facilitan la medicion de un volumen deseado y permiten la adicion del lfquido de reconstitucion sin agotar un vacfo conservado dentro del vial de deteccion. La Figura 93 ilustra una realizacion en la que la estacion de reconstitucion 350 incluye una bolsa 352 o deposito secundario similar con una valvula de pinza 354. La estacion de reconstitucion 350 se alimenta por gravedad de modo que el lfquido se configura para desplazarse del deposito principal, a traves de los tubos 358 y a la bolsa 352 cuando la valvula 354 esta abierta. Por ejemplo, una palanca 356 puede rotarse en el sentido de las agujas del reloj para conectar con o pinzar el tubo 358 para cerrar el tubo en la valvula 354. Despues un usuario puede insertar el vial de deteccion 360 en el orificio de acceso 362 de modo que una aguja dispuesta dentro del orificio de acceso conecte con el obturador 364 para extraer el lfquido de reconstitucion al tubo. Despues de retirarse el vial de deteccion 360 del orificio de acceso 362, el obturador 364 se configura para sellar el vial de deteccion para mantener el vacfo en el mismo. Ademas, la bolsa 352 se configura para rellenar automaticamente de modo que la estacion de reconstitucion 350 siempre este lista.
Como alternativa, la Figura 94 ilustra una estacion de reconstitucion 375 que incluye una valvula rotatoria 376, de acuerdo con otra realizacion. A este respecto, el lfquido de reconstitucion se almacena en el deposito 378 y se alimenta por gravedad en un segundo deposito o bolsa. Cuando la valvula rotatoria 376 esta en una posicion “cerrada”, no puede escapar ningun lfquido del orificio de acceso 380 debido a filtracion de la bolsa. Para transferir fluido, la valvula rotatoria 376 puede rotarse a una posicion “abierta”. Se inserta un vial de deteccion 382 dentro del orificio de acceso 380 por el que el fluido puede despues retirarse de la bolsa cuando el obturador conecta con una aguja dispuesta dentro del orificio de acceso. La rotacion de la valvula 376 a la posicion abierta tambien cierra la lfnea de gravedad que alimenta a la bolsa. Cuando la valvula 376 se rota de vuelta a la posicion cerrada, la bolsa es capaz de rellenarse automaticamente. La valvula rotatoria 376 puede operarse por un boton u otro mecanismo adecuado para abrir y cerrar la valvula, aunque no se requiera una accion rotatoria para efectuar dicha apertura y cierre de la valvula (por ejemplo, una valvula accionada mediante movimiento lineal).
La Figura 95 representa una estacion de reconstitucion 400 que incluye una jeringa 402 en comunicacion fluida con una valvula rotatoria 404, de acuerdo con otra realizacion de la presente invencion. A diferencia de las realizaciones anteriores, la estacion de reconstitucion 400 no es alimentada por gravedad, de modo que el lfquido de reconstitucion se extrae del deposito 406 y a la jeringa 402 mediante el accionamiento de la jeringa. A este respecto, la jeringa 402 puede configurarse para extraer una cantidad deseada del lfquido de reconstitucion a la jeringa o una bolsa dispuesta en la misma cuando la valvula rotatoria 404 esta en una posicion cerrada. Una vez que se llena la jeringa, la rotacion de la valvula 404 a una posicion abierta permite el acceso al lfquido contenido dentro de la jeringa insertando un vial de deteccion dentro del orificio de acceso 408 y conectando con la aguja dispuesta en el orificio de acceso 408. La rotacion de la valvula 404 a la posicion abierta cierra la lfnea que alimenta la bolsa del deposito 406. De nuevo, se entiende que la valvula rotatoria 404 puede ser cualquier mecanismo adecuado para facilitar la apertura y el cierre de la valvula. De forma similar, la jeringa 402 puede ser cualquier dispositivo adecuado configurado para extraer una cantidad deseada de lfquido de reconstitucion del deposito 406.
Los ejemplos representados demuestran estaciones de reconstitucion que no requieren fuentes de energfa externas. Un experto en la materia puede prever sistemas de medicion de lfquidos con fuentes de energfa.
III. Microorganismos representativos
Pueden usarse realizaciones de la presente invencion para detectar infecciones del torrente sangufneo sospechadas que surgen de bacteriemia y fungemia. Se recogen multiples muestras sangufneas tfpicamente de venas separadas
de un sujeto, por ejemplo, un paciente, a diferentes intervalos temporales dependiendo de los sfntomas del sujeto, por ejemplo, la observacion de una fiebre, o algun otro diagnostico inicial. Puede disponerse un volumen de la muestra sangufnea, por ejemplo, de aproximadamente 3 ml a aproximadamente 10 ml para adultos y aproximadamente 1 ml para muestras pediatricas, en un frasco de crecimiento de cultivo sangufneo despues de la 5 recogida. Tfpicamente para cada ciclo de recogida, se dispone una muestra en un frasco de crecimiento de cultivo sangufneo adecuado para organismos aerobios y se dispone una muestra en un frasco de crecimiento de cultivo sangufneo adecuado para organismos anaerobios.
A diferencia de los metodos conocidos en la tecnica que detectan un aumento en la produccion de gas como una 10 medida del crecimiento microbiano en muestras de cultivo sangufneo, los metodos desvelados por la presente permiten provechosamente la deteccion de patogenos intracelulares (por ejemplo, bacterianos, vfricos). Los microorganismos o patogenos intracelulares crecen y se reproducen dentro de otras celulas (por ejemplo, celulas eucariotas) y por lo tanto no pueden detectarse usando sensores de gas conocidos en la tecnica. Los microorganismos intracelulares representativos que pueden detectarse con los metodos desvelados por la presente 15 incluyen, pero sin limitacion, Chlamydia trachomatis y Mycobacterium tuberculosis.
Los microorganismos presentados en la Tabla 1 se encuentran habitualmente en sujetos como la causa de bacteriemia o septicemia y se clasifican en el orden en que se encuentran en los sujetos. Tambien se indican en la Tabla 2 los microorganismos que representan colectivamente el 80 % de todos los resultados positivos en muestras 20 de cultivo sangufneo y los microorganismos que se considera que tienen tratamiento inadecuado.
Tabla 1. Organismos por Aparicion de Especies Bacterianas o Grupo en 2002
Clasificacion
Especie Bacteriana o Grupo % Representa el 80 % de todos los BC positivos Tratamiento Inadecuado
1
Staphylococcus Coagulasa negativo (incluyendo S. epidermidis) 42 X X
2
S. aureus 16,5 X X
3
E. faecalis 8,3 X
4
E. coli 7,2 X X
5
K. pneumoniae 3,6 X X
6
E. faecium 3,5 X
7
grupo de Streptococci viridans 3,4
8
Psuedomonas aeruginosa 2,5 X
9
S. pneumoniae 2,3
10
Enterobacter cloacae 1,9
11
Serratia marcescens 1,0
12
Acinetobacter baumannii 0,9 X
13
Proteus mirabilis 0,9
14
Streptococcus agalactiae 0,8
15
Klebsiella oxytoca 0/6
16
Enterobacter aerogenes 0,5
17
Stenotrophomonas maltophilia 0,3
18
Citrobacter freundii 0,3
19
Streptococcus pyogenes 0,3
20
Enterococcus avium 0,2
21
Otros 3,4
Hongos > Levadura C. albicans X
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Tabla 1. Organismos por Aparicion de Especies Bacterianas o Grupo en 2002
Clasificacion
Especie Bacteriana o Grupo % Representa el Tratamiento
80 % de todos Inadecuado
los BC positivos
'Karlowsky, J. A. et al., “Prevalence and antimicrobial susceptibilities of bacteria isolated from blood cultures of hospitalized patients in the United States in 2002,” Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 3: 7 (2004).
Las muestras alimentarias, de agua, cosmeticas, farmaceuticas y ambientales se exploran habitualmente con respecto a microorganismos incluyendo, pero sin limitacion, Escherichia coli enterotoxinogena (ETEC), Escherichia coli enteropatogena (EPEC), Escherichia coli enterohemorragica (EHEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), Escherichia coli enteroagregante (EAEC), Escherichia coli difusamente adherente (DAEC), Escherichia coli productora de toxina shiga (STEC), E. coli 0157, E. coli O157:H7, E. coli 0104, E. coli 026, E. coli 045, E. coli 0103,
E. coli O111, E. coli O121 y E. coli O145, especies de Shigella, especies de Salmonella, Salmonella bongori, Salmonella enterica, especies de Campylobacter, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, especies de Vibrio, Vibrio cholerae, especies de Listeria, Listeria monocytogenes, Listeria grayii, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria seeligeri, Listeria welshmeri, especies de Staphylococcus, especies de Staphylococcus Coagulasa negativas, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium periringens, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, especies de Cronobacter, Cronobacter sakazakii (formalmente Enterobacter sakazakii), especies de Streptococcus, S. pyogenes, especies de Micrococcus, especies de Psuedomonas, P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, especies de Legionella, especies de Serratia, K. pneumoniae, especies de Enterobacter, especies de Alcaligenes, especies de Achromobacter, levadura y mohos tales como especies de Aspergillus, especies de Penicillium, especies de Acremonium, especies de Cladosporium, especies de Fusarium, especies de Mucor, especies de Rhizopus, especies de Stachybotrys, especies de Trichoderma, especies de Alternaria, especies de Geotrichum, especies de Neurospora, especies de Rhizomucor, especies de Rhizopus, especies de Ustilago, especies de Tolypocladium, especies de Mizukabi, especies de Spinellus, especies de Cladosporium, especies de Alternaria, especies de Botrytis, especies de Monilia, especies de Manoscus, especies de Mortierella, especies de Oidium, especies de Oosproa, especies de Thamnidium, especies de Candida, especies de Saccharomyces, especies de Trichophyton.
Ademas, estas muestras se exploran con frecuencia con respecto a organismos indicadores incluyendo, pero sin limitacion, coliformes, coliformes fecales, E. coli, Enterobacteriaceae, especies de Enterococcus, colffagos o bacteriofagos.
Adicionalmente, algunas muestras se explorar con respecto a cepas resistentes a antibioticos clfnicamente significativas de microorganismos, incluyendo, pero sin limitacion, S. aureus resistentes a meticilina y especies de Enterococcus resistentes a vancomicina.
Los microorganismos que pueden detectarse de acuerdo con realizaciones de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, bacterias Gram negativas, bacterias Gram positivas, bacterias Gram positivas acidorresistentes y hongos, incluyendo levaduras. Los microorganismos bacterianos y fungicos representativos, es decir, antfgenos, que son dianas para los ensayos de cultivo sangufneo desvelados por la presente se proporcionan inmediatamente a continuacion en el presente documento, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion. Como se observa en otra parte del presente documento, los anticuerpos que tienen especificidad por los antfgenos presentados inmediatamente a continuacion en el presente documento pueden incluir pero sin limitacion, anticuerpos policlonales, monoclonales, Fab', Fab'', recombinantes, anticuerpos monocatenarios (SCA), anticuerpos humanizados o anticuerpos quimericos. En todos los casos, el anticuerpo tendra una o mas CDR especfficas para el antfgeno enumerado inmediatamente a continuacion en el presente documento. Se conocen en la tecnica anticuerpos y estan disponibles facilmente para antfgenos seleccionados. En algunos casos, los antfgenos estan presentes en la superficie celular. En otros casos, los antfgenos se secretan de la celula y estan presentes en el medio de cultivo sangufneo como “antfgeno libre”. En otras casos mas, pueden medirse antfgeno tanto libre como unido simultaneamente para confirmar una bacteriemia o fungemia.
Independientemente de la informacion de diagnostico que se busque en el vaso de cultivo, un miembro de union especffica tendra con frecuencia especificidad amplia. Los miembros de union especffica pueden ser pancepa, panserogrupo, panespecie o pangenero.
La pared celular bacteriana es una estructura compleja, semirrfgida, que define la forma del organismo, rodea la membrana citoplasmatica fragil subyacente y protege a la celula bacteriana del ambiente externo. La pared celular bacteriana esta compuesta por una red macromolecular conocida como peptidoglucano, que comprende carbohidratos y polipeptidos que forman una reticula alrededor de la celula bacteriana. La pared celular bacteriana proporciona la estabilidad mecanica para la celula bacteriana y evita la lisis osmotica. De forma mas relevante para la presente invencion, lo que se usa para diferenciar las principales especies de bacterias es la composicion qufmica de la celula.
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Las paredes celulares de diferentes especies de bacterias pueden diferir en gran medida en el grosor, la estructura y la composicion. Sin embargo, existen dos tipos predominantes de pared celular bacteriana y si una especie dada de bacteria tiene uno o el otro tipo de pared celular puede determinarse en general por la reaccion de la celula a ciertos colorantes. Quizas el colorante mas ampliamente usado para tenir bacterias sea la tincion de Gram. Cuando se tinen con esta tincion de violeta en cristal y yodo, las bacterias que conservan la tincion se denominan Gram positivas y las que no, se denominan Gram negativas.
Como se usa en el presente documento, por “bacterias Gram positivas” se entiende una cepa, un tipo, una especie o un genero de bacteria que, cuando se expone a tincion de Gram, conserva el colorante y se tine, por lo tanto, de color azul-purpura.
Como se usa en el presente documento, por “bacterias Gram negativas” se entiende una cepa, un tipo, una especie o un genero de bacteria que, cuando se expone a tincion de Gram no conserva el colorante y, por lo tanto, no se tine de color azul-purpura. El practicante experto habitual reconocera, por supuesto, que dependiendo de la concentracion del colorante y de la longitud de exposicion, una bacteria Gram negativa puede captar una ligera cantidad de tincion de Gram y tenirse con un color azul-purpura claro. Sin embargo, en comparacion con una bacteria Gram positiva tenida con la misma formulacion de tincion de Gram durante la misma cantidad de tiempo, una bacteria Gram negativa tendra un color azul-purpura mucho mas claro en comparacion con una bacteria Gram positiva.
Las bacterias Gram negativas representativas incluyen, pero sin limitacion, bacterias en la familia Enterobacteriaceae. Las bacterias Gram negativas representativas en la familia Enterobacteriaceae incluyen, pero sin limitacion, bacterias en el genero Escherichia, tal como especie E. coli (modelo). Los miembros de union adecuada, por ejemplo, anticuerpos, que tienen una afinidad por bacterias Gram negativas en la familia Enterobacteriaceae incluyen, pero sin limitacion, los anticuerpos que se unen especfficamente con el lipopolisacarido (LPS) o la protefna de membrana externa (OMP). El componente de Lfpido A de LPS, la region O de LPS y el nucleo de LPS que tiene regiones de nucleo interna y externa pueden actuar como antfgenos adecuados para miembros de union especfficos que tienen una afinidad por bacterias Gram negativas en el genero Escherichia.
Los miembros representativos del genero Escherichia incluyen: E. adecarboxylata, E. albertii, E. blattae, E. coli, E. fergusonii, E. hermannii y E. vulneris.
Otro genero representativo dentro de la familia Enterobacteriaceae es el genero Klebsiella, incluyendo pero sin limitacion, Klebsiella pneumoniae (modelo). Los miembros de union adecuados, por ejemplo, anticuerpos, que tienen una afinidad por bacterias Gram negativas en el genero Klebsiella incluyen, pero sin limitacion, los que se unen especfficamente con LPS, polisacarido capsular (CPS) o antfgenos K (polisacarido capsular de alto peso molecular con un peso molecular de aproximadamente 50 a aproximadamente 70 kDa) u OMP.
Los miembros representativos del genero Klebsiella incluyen K. granulomatis, K. mobilis, K. ornithinolytica, K. oxytoca, K. ozaenae, K. planticola, K. pneumoniae, K. rhinoscleromatis, K. singaporensis, K. terrigena, K. trevisanii y K. varricola.
Las bacterias Gram negativas tambien incluyen bacterias que pertenecen a la familia Chlamydiaceae. Las bacterias Gram negativas representativas en la familia de Chlamydiaceae incluyen, pero sin limitacion, bacterias en el genero Chlamydia, tales como la especie C. trachomatis (modelo). Los miembros de union adecuados, por ejemplo, anticuerpos, que tienen una afinidad por bacterias Gram negativas en la familia Chlamydiaceae incluyen, pero sin limitacion, los que se unen especfficamente con lipopolisacarido (LPS) o protefna de la membrana externa (OMP), incluyendo protefna de la membrana externa principal (MOMP).
Los miembros representativos del genero Chlamydia incluyen: C. muridarum, C. suis y C. trachomatis.
Las bacterias Gram negativas adecuadas tambien pueden incluir las que estan dentro del genero Pseudomonas, incluyendo pero sin limitacion P. aeruginosa (modelo), el genero Stenotrophomonas, incluyendo pero sin limitacion, S. maltophilia (modelo) y el genero Acinetobacter, incluyendo pero sin limitacion A. baumannii (modelo). Los antfgenos adecuados que son reconocidos por miembros de union especfficos con afinidad por bacterias Gram negativas dentro del genero Pseudomonas incluyen, pero sin limitacion, LPS, OMP, protefnas de membrana reguladas por hierro (IRMP), flagelos, exopolisacarido mucoide (MEP) y protefna de membrana externa F (OprF). Los antfgenos adecuados que son reconocidos por miembros de union especfficos con afinidad por bacterias Gram negativas dentro del genero Stenotrophomonas incluyen, pero sin limitacion, LPS, flagelos, proteasa extracelular principal, OMP, la protefna expuesta de 30 kDa que se une con el Fc IgG, y la protefna de membrana de 48,5 kDa. Los antfgenos adecuados que son reconocidos por miembros de union especfficos con afinidad por bacterias Gram negativas dentro del genero Acinetobacter incluyen, pero sin limitacion, LPS, LPS con D-rhamos, Bap (factor asociado a biopelfcula), polisacarido capsular (CPS) y OMP.
Las bacterias Gram positivas representativas incluyen, pero sin limitacion, bacterias en la familia de Micrococcaceae. Las bacterias Gram positivas en la familia Micrococcaceae incluyen, pero sin limitacion, bacterias en el genero
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Staphylococcus, incluyendo la especie S. epidermidis (modelo). Los miembros de union adecuados, por ejemplo, anticuerpos, que tienen una afinidad por bacterias Gram positivas, incluyen, pero sin limitacion, los que se unen especfficamente con Acido Lipoteicoico (LTA), peptidoglucano, antfgenos de biopelfcula, incluyendo antfgenos de biopelfcula de 140/2200 kDa y polisacarido de 20 kDa (PS) o Lfpido S (glicerofosfoglucolfpido). Otros miembros de union adecuados que tienen una afinidad por bacterias Gram positivas en el genero Staphylococcus, incluyendo pero sin limitacion S. aureus, incluyen los que se unen especfficamente con acido teicoico, componentes de superficie microbiana que reconocen moleculas de matriz de adhesion (MSCRAMMS), determinante A de superficie sensible a hierro (IsdA), las protefnas de 110 kDa, 98 kDa y 67 kDa, protefna activadora de ARNIII (RAP), diana de la protefna activadora de ARNIII (TRAP), toxina alfa, poli-n-succinil beta-1-6-glucosamina (PNSG), lipasa, estafilolisina, FnBPA, FnBPB, antfgeno estafilococico inmunodominante, polisacarido capsular o el antfgeno de superficie celular asociado con resistencia a meticilina.
Los miembros representativos del genero Staphylococcus incluyen: S. aureus, S. auricularis, S. capitis, S. caprae, S. cohnii, S. epidermidis, S. felis, S. haemolyticus, S. hominis, S. intermedius, S. lugdunensis, S. pettenkoferi, S. saprophyticus, S. schleiferi, S. simulans, S. vitulus, S. warneri y S. xylosus.
Otras bacterias Gram positivas representativas incluyen bacterias en el genero Enterococcus, incluyendo, pero sin limitacion, E. faecalis (tambien conocida como Streptococcus del Grupo D) y E. faecium. Los miembros de union adecuados, por ejemplo, anticuerpos, que tienen una afinidad por E. faecalis incluyen, pero sin limitacion, los que se unen especfficamente con acido lipoteicoico (LTA), antfgeno de superficie de union a colageno (CNA), sustancia de agregacion (AS), polisacarido capsular, polisacarido capsular de tipo acido teicoico, producto genico de Esp, Gls24, producto genico de Epa, Ace (agente de union de ECM) o peptidoglucano. Los miembros de union adecuados, por ejemplo, anticuerpos, que tienen una afinidad por E. faecalis incluyen, pero sin limitacion, los que se unen especfficamente con protefna ACM (agente de union de colageno) o protefna SagA.
Las bacterias Gram positivas acidorresistentes representativas incluyen, pero sin limitacion, bacterias en la familia Mycobacteriaceae. Las bacterias Gram positivas acidorresistentes en la familia Mycobacteriaceae incluyen, pero sin limitacion, bacterias en el genero Mycobacterium, tal como la especie M. bovis (modelo) y la especie M. tuberculosis (modelo). Los miembros de union adecuados, por ejemplo, anticuerpos, que tienen una afinidad por bacterias Gram positivas acidorresistentes, incluyen pero sin limitacion, las que se unen especfficamente con arabinomanona (AM), lipoarabinomanona (LAM) o el antfgeno de 38 kDa.
Los miembros representativos del genero Mycobacterium incluyen: M. abscessus, M. africanum, M. agri, M. aichiense, M. alvei, M. arupense, M. asiaticum, M. aubagnense, M. aurum, M. austroafricanum, complejo de Mycobacterium avium (MAC), incluyendo, M. avium, M. avium paratuberculosis, M. avium silvaticum, M. avium “hominissuis,” M. boenickei, M. bohemicum, M. bolletii, M. botniense, M. bovis, M. branderi. M. brisbanense, M. brumae, M. canariasense, M. caprae, M. celatum, M. chelonae, M. chimaera, M. chitae, M. chlorophenolicum, M. chubuense, M. colombiense, M. conceptionense, M. confluentis, M. conspicuum, M. cookii, M. cosmeticum, M. diernhoferi, M. doricum, M. duvalii, M. elephantis, M. fallax, M. farcinogenes, M. flavescens, M. florentinum, M. fluoroanthenivorans, M. fortuitum, M. fortuitum subsp. acetamidolyticum, M. frederiksbergense, M. gadium, M. gastri, M. genavense, M. gilvum, M. goodii, M. gordonae, M. haemophilum, M. hassiacum, M. heckeshornense, M. heidelbergense, M. hiberniae, M. hodleri, M. holsaticum, M. houstonense, M. immunogenum, M. interjectum, M. intermedium, M. intracellulare, M. kansasii, M. komossense, M. kubicae, M. kumamotonense, M. lacus, M. lentiflavum, M. leprae, M. lepraemurium, M. madagascariense, M. mageritense, M. malmoense, M. marinum, M. massiliense, M. microti, M. monacense, M. montefiorense, M. moriokaense, M. mucogenicum, M. murale, M. nebraskense, M. neoaurum, M. neworleansense, M. nonchromogenicum, M. novocastrense, M. obuense, M.
palustre, M. parafortuitum, M. parascrofulaceum, M. parmense, M. peregrinum, M. phlei, M. phocaicum, M. pinnipedii, M. porcinum, M. poriferae, M. pseudoshottsii, M. pulveris, M. psychrotolerans, M. pyrenivorans, M. rhodesiae, M. saskatchewanense, M. scrofulaceum, M. senegalense, M. seoulense, M. septicum, M. shimoidei, M. shottsii, M. simiae, M. smegmatis, M. sphagni, M. szulgai, M. terrae, M. thermoresistibile, M. tokaiense, M. triplex, M. triviale, complejo de Mycobacterium tuberculosis (MTBC), incluyendo M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. canetti, M. caprae, M. pinnipedii’, M. tusciae, M. ulcerans, M. vaccae, M. vanbaalenii, M. wolinskyi y M. xenopi.
Los hongos representativos, incluyendo levaduras, incluyen, pero sin limitacion, la familia Saccharomycetaceae, incluyendo el genero Candida, tal como con C. albicans (modelo). Los miembros de union adecuados, por ejemplo, anticuerpos, que tienen una afinidad por hongos que pertenecen al genero Candida incluyen, pero sin limitacion, los que se unen especfficamente con manano, fosfomanano, manoprotefna 58 (mp58), galactomanano, beta-D-glucano, metaloabinitol, gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa asociada a la pared celular, Enolasa -(47/48 kDa), Aspartil Proteinasa Secretada (SAP) o protefna de choque termico 90 (HSP-90).
Los miembros representativos del genero Candida incluyen: C. aaseri, C. albicans, C. amapae, C. anatomiae, C. ancudensis, C. antillancae, C. apicola, C. apis, C. atlantica, C. atmosphaerica, C. auringiensis, C. austromarina, C. azyma, C. beechii, C. bertae, C. berthetii, C. blankii, C. boidinii, C. boleticola, C. bombi, C. bombicola, C. buinensis,
C. butyri, C. cantarellii, C. caseinolytica, C. castellii, C. castrensis, C. catenulata, C. chilensis, C. chiropterorum, C. chodatii, C. ciferrii, C. coipomoensis, C. conglobata, C. cylindracea, C. dendrica, C. dendronema, C. deserticola, C. diddensiae, C. diversa, C. drimydis, C. dubliniensis, C. edax, C. entomophila, C. ergastensis, C. ernobii, C.
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ethanolica, C. euphorbiae, C. euphorbiiphila, C. fabianii, C. famata, C. famata var. famata, C. famata var. flareri, C. fennica, C. fermenticarens, C. firmetaria, C. floricola, C. fluviatilis, C. freyschussii, C. friedrichii, C. fructus, C. galacta, C. geochares, C. glabrata, C. glaebosa, C. glucosophila, C. gropengiesseri, C. guilliermondii, C. guilliermondii var. guilliermondii, C. guilliermondii var. membranaefaciens, C. haemulonii, C. homilentoma, C. humilis, C. incommunis, C. inconspicua, C. insectalens, C. insectamans, C. insectorum, C. intermedia, C. ishiwadae, C. karawaiewii, C. kefyr, C. krissii, C. kruisii, C. krusei, C. lactiscondensi, C. laureliae, C. lipolytica, C. Ilanquihuensis, C. lodderae, C. lusitaniae, C. lyxosophila, C. magnoliae, C. maltosa, C. maris, C. maritima, C. melibiosica, C. membranifaciens, C. mesenterica, C. methanosorbosa, C. milleri, C. mogii, C. montana, C. multigemmis, C. musae, C. naeodendra, C. natalensis, C. nemodendra, C. norvegensis, C. norvegica, C. odintsovae, C. oleophila, C. oregonensis, C. ovalis, C. palmioleophila, C. paludigena, C. parapsilosis, C. pararugosa, C. pelliculosa, C. peltata, C. petrohuensis, C. pignaliae, C. pini, C. populi, C. pseudointermedia, C. pseudolambica, C. psychrophila, C. pulcherrima, C. quercitrusa, C. quercuum, C. railenensis, C. reukaufii, C. rhagii, C. robusta, C. rugopelliculosa, C. rugosa, C. saitoana, C. sake, C. salida, C. salmanticensis, C. santamariae, C. santjacobensis, C. savonica, C. schatavii, C. sequanensis, C. shehatae, C. shehatae var. Insectosa, C. shehatae var. lignosa, C. shehatae var. shehatae, C. silvae, C. silvanorum, C. silvatica, C. silvicultrix, C. solani, C. sonorensis, C. sophiaereginae, C. sorbophila, C. sorbosa, C. sorboxylosa, C. spandovensis, C. stellata, C. succiphila, C. suecica, C. tanzawaensis, C. tapae, C. techellsii, C. tenuis, C. torresii, C. tropicalis, C. tsuchiyae, C. utilis, C. vaccinii, C. valdiviana, C. valida, C. vanderwaltii, C. vartiovaarae, C. versatilis, C. vini, C. viswanathii, C. wickerhamii, C. xestobii y C. zeylanoides.
Tambien pueden usarse anticuerpos terapeuticos tales como Aurograb™ con especificidad por las cepas de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) en superficies de captura o indicadoras. De forma similar, el anticuerpo monoclonal (mab) terapeutico Myograb™ (Efungumab) con una especificidad por la Protefna de choque Termico HSP90 puede usarse para deteccion de C. albicans.
Las partfculas indicadoras SERS activas desveladas por la presente memoria pueden distinguirse de los muchos otros materiales opticamente activos que pueden estar presentes en un ambiente de cultivo, tales como componentes de medios de cultivo usados para dar soporte al crecimiento, sangre completa, anticoagulante SPS, partfculas alimentarias y aditivos. Ademas, las partfculas indicadoras SERS activas especfficas muestran la intensidad de senal necesaria para permitir la deteccion de cantidades pequenas de celulas bacterianas. Adicionalmente, una diversidad de partfculas indicadoras SERS activas, que tienen cada una una identificacion de SERS unica, permiten explorar muestras de cultivo sangufneo con respecto a uno cualquiera de una pluralidad de microorganismos (por ejemplo, veinte) que puede encontrarse tfpicamente en sangre de mamffero, por ejemplo, humana. En dichas realizaciones, la deteccion de cada microorganismo particular puede realizarse simultaneamente, lo que se denomina en el presente documento “ensayo multiple”.
De acuerdo con una realizacion, por ejemplo, el cultivo sangufneo, las dianas primarias para los ensayos multiples desvelados por la presente incluyen: Staphylococcus Coagulasa negativos, S. aureus, E. faecalis, E. coli, K. pneumoniae, E. faecium, estreptococos del grupo Viridans, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, Streptococcus agalactie, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Stenotrophomonas maltophilia, Citrobacter freundii, Streptococcus pyogenes y Enterococcus avium. Dichas multiples dianas pueden detectarse simultaneamente, en algunas realizaciones, por un ensayo multiple desvelado por la presente.
IV. Medios de cultivo representativos
Se proporcionan medios de cultivo representativos adecuados para su uso con realizaciones de la presente invencion inmediatamente a continuacion en el presente documento. Un experto habitual en la materia reconocera que las formulaciones desveladas por la presente pueden modificarse para cumplir requisitos de rendimiento especfficos. Adicionalmente, estas formulaciones, dependiendo de la aplicacion particular, pueden tener dispuestas en las mismas, CO2, O2, N2 y combinaciones de los mismos, para crear un ambiente adecuado para crecimiento aerobico, anaerobico o microaerofflico. Opcionalmente, algunos medios de cultivo contienen adsorbentes para aislar, es decir, retirar, del medio de cultivo, interferentes, tales como antibioticos o elementos inmunitarios que pueden estar presentes en una muestra de sangre de un sujeto o metabolitos producidos durante el cultivo. Vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 5.624.814. Por ejemplo, el Medio BD BACTEC™ Plus Anaerobico/F, BD BACTEC™ Plus Aerobico/F y BD BACTEC™ PEDS Plus/F, cada uno de los cuales esta disponible de Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, contienen todos resinas para aislar antibioticos que de otro modo pueden inhibir el crecimiento microbiano en el medio de cultivo sangufneo. Las resinas tienen un diametro sustancialmente mayor que cualquier componente de la sangre y son mas rfgidas que las celulas de mamffero halladas en sangre. Otro ejemplo de un absorbente de cultivo es el carbonato calcico precipitado (1 % - 2,5 % p/v) hallado en diversas formulaciones de Caldo de cultivo de Tetrationato usadas para cultivar selectivamente Salmonella en muestras alimentarias y ambientales. Las partfculas de carbonato calcico neutralizan el acido sulfurico producido por la reduccion del tetrationato cultivando Salmonella.
A. Viales de cultivo lftico BD BACTEC™ Myco/F
Los Viales de Cultivo Lftico BD BACTEC™ Myco/F soportan el crecimiento y la deteccion de microorganismos
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Mycobacterium tuberculosis (MTB) y micobacterias distintas de tuberculosis (MOTT), especialmente el complejo de Mycobacterium avium (MAC), estan reapareciendo. Desde 1985 a 1992, el numero de casos de MTB presentados aumentaron un 18 %. Entre 1981 y 1987, la vigilancia de casos de SIDA indico que el 5,5 % de los pacientes con SIDA tenfan infecciones micobacterianas no tuberculosas diseminadas, por ejemplo, MAC. En 1990, los casos aumentados de infecciones micobacterianas no tuberculosas diseminadas habfan dado como resultado una incidencia acumulativa de 7,6 %. La incidencia de fungemia tambien ha aumentado constantemente desde principios de los anos ochenta. Estos aumentos han elevado la necesidad de procedimientos diagnosticos eficaces para fungemia y micobacteriemia.
Los componentes de las formulaciones desveladas por la presente pueden incluir, pero sin limitacion, citrato de amonio ferrico o un equivalente que proporciona una superficie de hierro para cepas especfficas de micobacterias y hongos, saponina o un agente de lisis sangufneo equivalente y protefnas especfficas y azucares para proporcionar complementos nutricionales.
B. Viales de cultivo de micobacterias BD BACTEC™ 12B Middlebrook 7H12
El Medio de Micobacterias cualitativo BACTEC™ 12B puede usarse para el cultivo y la recuperacion de micobacterias de muestras de ensayo clfnicas, esputo, muestras de ensayo gastricas, orina, tejido, muestras de ensayo mucopurulentas, otros fluidos corporales y otras secreciones respiratorias, diferenciacion del complejo de Mycobacterium tuberculosis de otras micobacterias y ensayos de susceptibilidad farmacologica de M. tuberculosis.
C. Viales de cultivo BACTEC™ LlTICO/10 Anaerobico/F
El Medio BACTEC™ LITICO/10 Anaerobico/F tambien es adecuado para realizaciones de la presente invencion.
D. Caldo de digestion de caseina de soja de viales de cultivo BACTEC™ Plus Aerobico/F* y Plus Anaerobico/F*
Los Medios BACTEC™ Plus Aerobico/F y Plus Anaerobico/F proporcionan un procedimiento cualitativo para el cultivo y la recuperacion de microorganismos (bacterias y levadura) de sangre y se han formulado para permitir la adicion de hasta 10 ml de sangre. La adicion de estos volumenes de muestra mayores da como resultado tasas de deteccion generales mayores y tiempos mas tempranos hasta la deteccion.
E. Digestion de caseina de soja de viales de cultivo BD BACTEC™ convencional anaerobico/F
El Caldo de Digestion de Caseina de Soja de Viales de Cultivo BD BACTEC™ Convencional Anaerobico/F proporciona un procedimiento cualitativo para el cultivo y la recuperacion de microorganismos anaerobicos de sangre.
F. Viales de cultivo BD BACTEC™ PEDS PLUS™/F
Se pretende usar los viales de cultivo BACTEC™ tipo PEDS PLUS™/F (Caldo de Digestion de Caseina de Soja enriquecido con CO2) para cultivos aerobicos y posibilitar el cultivo y la recuperacion de microorganismos aerobicos (principalmente bacterias y levaduras) de muestras de ensayo pediatricas y otras sangufneas que son en general de menos de 3 ml de volumen.
G. Viales de cultivo convencional/10 aerobico/F
Se pretende usar viales de cultivo BACTEC™ Convencional/10 Aerobico/F (caldo de Digestion de Caseina de soja enriquecido con CO2) en cultivos de sangre aerobicos y posibilitar el cultivo y la recuperacion de microorganismos aerobicos (bacterias y levaduras) de la sangre.
H. Viales de cultivo BacT/ALERT™
Se pretende usar viales de cultivo BacT/ALERT™ FAN, BacT/ALERT™ FN y BacT/ALERT™ SN (bioMerieux, Durham, NC) en cultivos sangufneos anaerobicos y posibilitar el cultivo y la recuperacion de microorganismos anaerobicos (bacterias y levadura) de sangre.
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I. Medios de cultivo selectivo de E. coli
El agua de peptona tamponada modificada con piruvato (mBPWp) y Complemento de Acriflavina-Cefsulodina- Vancomicina (ACV) es un medio prescrito por el Manual Analftico Bacteriologico (BAM) de la FDA para enriquecer muestras para la deteccion de Escherichia coli diarreagenicas.
J. Medios de cultivo selectivos de Listeria
Se usan Base de Caldo de Cultivo Frasier y Complemento de Caldo de Cultivo Fraser para enriquecer y detectar selectivamente especies de Listeria. El Manual del Laboratorio Microbiologico (MLG) de la USDA recomienda el uso de Caldo de Cultivo Fraser cuando se ensaya con respecto a L. monocytogenes en muestras de carne roja, aves, huevos y ambientales (USDA MLG Capftulo 8.07, revisado el 3/8/09).
K. Medios de cultivo selectivos de Salmonella
El Caldo de Cultivo Base de Tetrationato, Hajna es un medio disenado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella. El tetrationato se genera por la adicion de yodo y yoduro de potasio justo antes del enriquecimiento. El Manual del Laboratorio Microbiologico de USDA estipula este caldo de cultivo para el enriquecimiento selectivo de Salmonella en productos de carne, aves, huevos pasteurizados y siluro (USDA MLG Capftulo 4.05, revisado 20/1/11.
L. Medio de cultivo de Salmonella
Ademas de los medios de cultivo enumerados anteriormente, existen varios caldos de cultivo conocidos habitualmente en la tecnica para cultivar o mantener Salmonella, incluyendo, pero sin limitacion, Caldo de Infusion de Corazon y Cerebro, enriquecimiento de Sulfa Verde Brillante (BD Difco™), Caldo de Cultivo Verde Brillante modificado (BD Difco™), Agua de Peptona Tamponada (BD Difco™), Agua de Casefna de Peptona Tamponada (BD Difco™), Caldo de Cultivo Dey-Engly (BD Difco™), enriquecimiento de Mossel de Caldo de Cultivo EE (Bd Difco™), Caldo de Cultivo Gram Negativo (bD Difco™), Caldo de Cultivo Gram Negativo Hajna (BD Difco™), Caldo de Cultivo de Lactosa (BD Difco™), Caldo de Cultivo de Letheen (BD Difco™), Caldo de Cultivo de Lisina Descarboxilasa, Caldo de Cultivo M (BD Difco™), Caldo de Cultivo de Malonato (BD Difco™), Caldo de Cultivo MR-VP, Caldo de Cultivo Nutritivo, Caldo de Cultivo One-Salmonella (Oxoid), Caldo de Cultivo de Carbohidrato de Rojo Fenol (BD BBL™), Caldo de Cultivo de Cianuro de Potasio, Caldo de Cultivo de Carbohidrato Purpura (BD BBL™), medio primario de Salmonella RapidChek® (SDIX), medio primario de Salmonella con complemento RapidChek® SELECT™ (SDIX), medio secundario de Salmonella RapidChek® SELECT™ (SDIX), Medio Rappaport-Vassiliadis, Medio Rappaport-Vassiliadis modificado, Caldo de Cultivo de Rappaport-Vassiliadis R10 (BD Difco™), Caldo de Cultivo de Soja de Salmonella Rappaport-Vassiliadis (RVS) (BD Difco™), Caldo de Cultivo de Peptona de Soja Rappaport-Vassiliadis, Caldo de Cultivo de Selenita (BD Difco™), Caldo de Cultivo de Selenita F (BD BBL™), Caldo de Cultivo de Cistina de Selenita (BD Difco™), Caldo de Cultivo de Tetrationato, Caldo de Cultivo de Tetrationato (Hajna), Caldo de Cultivo de Triptona, Caldo de Cultivo de Tripticasa de Soja, Caldo de Cultivo de Tripticasa de Soja con sulfato ferroso, Caldo de Cultivo Preenriquecimiento Universal, Caldo de Cultivo Preenriquecimiento Universal sin citrato de amonio ferrico y Caldo de Cultivo de Urea.
M. Medio de Cultivo de Listeria
Ademas de los medios de cultivo enumerados anteriormente, existen varios caldos de cultivo conocidos habitualmente en la tecnica para cultivo o mantenimiento de Listeria, incluyendo, pero sin limitacion, Caldo de Cultivo de Infusion de Corazon y Cerebro (BHI), Caldo de Enriquecimiento de Listeria Tamponado (BLEB), Caldo de Cultivo Nutritivo, base de caldo de cultivo de fermentacion de carbohidratos Purpura (M13015), que contiene soluciones al 0,5 % de dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa, medio SIM, caldo de cultivo de Tripticasa de soja con extracto de levadura al 0,6 %, Caldo de Cultivo de Triptosa, Caldo de Cultivo de la Universidad de Vermont Modificado (UVM), Caldo de Cultivo de enriquecimiento de Listeria tamponado con acido Morfolinopropanosulfonico (MOPS-BLEB), Demi Frasier, caldo de cultivo de Fraser, caldo de cultivo de enriquecimiento de Listeria (BD Difco™, Oxoid), Caldo de Cultivo One de Listeria (Oxoid), medio de Listeria RapidChek® con complemento (SDIX) y medio de Listeria RapidChek® FAST™ (SDIX).
V. Muestras representativas
La cantidad de uno o mas microorganismos presentes en una muestra que se ensaya puede representarse como una concentracion. La concentracion puede expresarse como un valor cualitativo, por ejemplo, como un resultado de tipo negativo o positivo, por ejemplo, una respuesta de “SI” o “NO”, que indica la presencia o ausencia de un microorganismo, o como un valor cuantitativo. Ademas, la concentracion de un microorganismo dado en una muestra de cultivo puede presentarse como una cantidad relativa o una cantidad absoluta, por ejemplo, como un “valor cuantitativo”.
La cantidad (es decir, concentracion) de un microorganismo puede ser igual a cero, lo que indica la ausencia del analito particular que se busca o que la concentracion del analito particular esta por debajo de los lfmites de
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deteccion del ensayo. La cantidad medida puede ser la senal, por ejemplo, una senal de SERS, sin ninguna medicion o manipulacion adicional. Como alternativa, la cantidad medida puede expresarse como una diferencia, un porcentaje o una relacion del valor medido del microorganismo particular con respecto a un valor medido de otro compuesto incluyendo, pero sin limitacion, un patron u otro microorganismo. La diferencia puede ser negativa, lo que indica una reduccion en la cantidad de microorganismo o microorganismos medidos. Las cantidades tambien pueden expresarse como una diferencia o relacion de microorganismo o microorganismos consigo mismos, medida en un punto temporal diferente. Las cantidades de microorganismo pueden determinarse directamente a partir de una senal generada, o la senal generada puede usarse en un algoritmo, con el algoritmo disenado para correlacionar el valor de las senales generadas con la cantidad de microorganismo o microorganismos en la muestra. Como se ha analizado anteriormente, las realizaciones de la presente invencion son susceptibles de uso con dispositivos capaces de medir las concentraciones de uno o mas microorganismos en tiempo real.
Ejemplos
Los siguientes Ejemplos se han incluido para proporcionar orientacion a un experto en la materia para practicar realizaciones representativas de la materia objeto desvelada por la presente. A la luz de la presente divulgacion y el nivel general de experiencia en la tecnica, los expertos pueden apreciar que se pretende que los siguientes Ejemplos sean solamente ejemplares y que puedan emplearse numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin alejarse del alcance de la materia objeto desvelada por la presente. Los siguientes ejemplos se presentan como ilustracion y no como limitacion.
Ejemplo 1
Efecto de reactivos de SERS HNW en el tiempo hasta la deteccion para E. coli
La Figura 54 muestra el resultado de un experimento en el que el tiempo hasta la deteccion de crecimiento de E. coli se comparo para muestras de cultivo sangufneo con y sin los reactivos de SERS HNW adecuados para su uso en las diversas realizaciones de la invencion.
En este ejemplo, se esterilizaron partfculas indicadoras SERS activas no conjugadas (marcadores de SERS 440) y partfculas de captura magnetica no conjugadas (perlas Dynal®) lavando con etanol al 70 %. Las partfculas indicadoras SERS activas esterilizadas y partfculas de captura magnetica se anadieron despues a frascos de Medio BACTEC™ Convencional/10 Aerobico/F inoculadas con E. coli. El tiempo hasta la deteccion para crecimiento de E. coli por un sensor BACTEC™ 9050 se comparo para frascos con y sin los reactivos de ensayo de HNW. Los frascos BACTEC™ sin E. coli pero con y sin los reactivos de ensayo de HNW se incluyeron como controles negativos. Como puede verse, el tiempo hasta la deteccion de BACTEC™ no se vio afectado por la presencia de las partfculas indicadoras SERS activas y partfculas magneticas en este experimento. Por lo tanto los reactivos de ensayo de SERS HNW no influyen significativamente en la capacidad de un microorganismo para crecer.
Ejemplo 2
La sedimentacion repetida es compatible con el crecimiento de microorganismos
La Figura 55 muestra el resultado de un experimento en el que el crecimiento de Salmonella Typhimurium se superviso durante el transcurso de un experimento para determinar si la sedimentacion afecta negativamente al crecimiento del organismo.
En este ejemplo, se cultivo S. Typhimurium (ATCC 14028) en un cultivo de una noche en medio primario Select de Salmonella SDIX con complemento a 42 °C. Se realizo una dilucion 1:100 en Medio Secundario de Salmonella SDIX. Se determino que la inoculacion de partida en medio secundario era de 1,8 x 107 ufc/ml por recuento de placas en placas de agar Nutritivo. El medio secundario inoculado se puso despues en multiples tubos, que contenfan todos marcadores de SERS y partfculas magneticas conjugadas con anticuerpos de Salmonella SDIX. Los tubos se colocaron en el sistema 150 (vease Figura 24) para supervision durante el cultivo a 42 °C. Los tubos se sedimentaron y se exploraron cada 0,5 horas durante el crecimiento. En este experimento, los tubos se retiraron del instrumento despues de 1, 3, 6, 9 y 11 ciclos de sedimentacion y lectura. Estos tubos se enumeraron por siembra de diluciones en placas de agar Nutritivo. Como puede verse, el crecimiento de S. Typhimurium no se ve comprometido por la presencia de marcadores de SERS y partfculas magneticas, ni esta comprometido por la sedimentacion y exploracion repetidas del sedimento por el laser.
Ejemplo 3
Efecto de ajuste de la frecuencia de sedimentacion
En un experimento que examinaba el efecto de la sedimentacion repetida en el crecimiento de microorganismos y el rendimiento del ensayo, se selecciono una unica colonia de Salmonella Kentucky (ATCC 9263) de una placa sembrada en estrfas de Agar Nutritivo BD BBL™ y se cultivo durante una noche a 42 °C en 6 ml de medio de cultivo
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primario SELECT™ de Salmonella SDIX RapidChek® de 6 ml con 60 pi de complemento de fago. Despues del cultivo primario, se prepararon 5 ml de un medio de cultivo secundario, que consistfa en 90 % de medio secundario y 10 % de medio primario SELECT™ de Salmonella SDIX RapidChek®. En paralelo, se preparo una dilucion 1:100 de cultivo primario en el medio primario, y se inocularon 125 pl de esa dilucion en un tubo BD MGIT™ que contenfa los 5 ml de medio secundario, 16 pl de marcadores de SERS y 20 pl de perlas magneticas. La dilucion resultante de 1:4000 de la concentracion final del cultivo primario produjo una concentracion de inoculacion aproximada de 2,5 x 105 UFC/ml. Los tubos se pusieron despues en uno de dos sistemas basados en carrusel (vease por ejemplo, Figura 24) durante 24 horas a 42 °C a una velocidad de agitacion lineal de ~ 1 Hz. Todos los parametros experimentales excepto la frecuencia de lectura se mantuvieron iguales entre los dos instrumentos. La frecuencia de lectura para cada instrumento se ajusto a 5 o 2 lecturas/hora.
La Figura 56 muestra un conjunto representativo de datos del experimento. Los datos de los dos sistemas se muestran con ejes de intensidad a escala para comparacion (observese que las intensidades absolutas de los pesos de marcadores entre instrumentos no deberfan compararse debido a diferencias en las eficacias opticas). Las formas de las curvas de crecimiento son casi identicas, lo que indica que el numero aumentado de ciclos de formacion de sedimentos, medicion y dispersion no impidio el crecimiento o la deteccion. La unica diferencia significativa es que la curva con lecturas mas frecuentes proporciona mejor resolucion en la cinetica de crecimiento.
Ejemplo 4
Efecto del movimiento relativo de tubo de muestra e imanes
La formacion de sedimento reproducible es una etapa crftica para conseguir senal de ensayo reproducible. Este ejemplo se refiere a dos modos distintos de formar un sedimento. En el primero (iman fijo), el iman se mantiene fijo en un sitio, mientras que el tubo se mueve sobre el iman durante la duracion completa del turno de agitacion. En la segunda configuracion preferida (acoplada), mostrada en la Figura 49, el iman se mueve junto con el tubo. En una serie de experimentos, se unieron covalentemente marcadores de SERS con partfculas magneticas activadas por tosilo para formar un precomplejo de perlas magneticas-SERS (PC). Las perlas en precomplejo se preparan por enlace covalente de partfculas de SERS con partfculas magneticas activadas por Tosilo Dynabeads® M-280 mediante reaccion de grupos tiol (-SH) en la superficie de SERS con grupos tosilo (Tos) en la superficie de las partfculas magneticas. PC actua como un sistema modelo para ensayo de la formacion de sedimentos en el que el sedimento puede explorarse con respecto a senal de SERS. La formacion de sedimentos en PC en agua asf como en un medio secundario comercial para Salmonella (SDIX RapidChek® Salmonella SELECT™) se comparo con respecto a las geometrfas de iman fijo y acoplado. Estos ensayos se realizaron usando una configuracion de sistema de lecho plano (vease, por ejemplo, Figura 25).
La Figura 57 muestra una imagen de PC en agua despues de sedimentar con un iman fijo. PC en agua se sedimento durante 1,5 minutos moviendo el tubo sobre un iman en barra fijo a una frecuencia de agitacion de 0,5 Hz y 25 mm de alcance. Se detuvo la agitacion y se permitio que el iman persistiera durante 30 segundos antes de separar la barra de los tubos. Como se muestra en la Figura 57, se formo un unico sedimento. Esta imagen destaca la capacidad para arrastrar los complejos magneticos con el iman a traves del agua.
Por el contrario, las Figuras 58A y 58B muestran la formacion de sedimento de PC en medio secundario de Salmonella SDIX usando un iman fijo y dos frecuencias de agitacion diferentes. Se sedimento PC en medio secundario SDIX durante 3 minutos moviendo el tubo sobre un iman en barra fijo a 2 Hz (21A) o 0,5 Hz (21B) de frecuencia de agitacion y 25 mm de alcance. La agitacion se detuvo y se permitio que el iman persistiera durante 30 segundos antes de separar la barra de iman de los tubos. Como se muestra en la Figura 58A, se arrastraron dos sedimentos de complejos magneticos al fondo del tubo, localizado en los lfmites del movimiento relativo entre el tubo y el iman. Para la agitacion mas lenta (Figura 58B), se formaron dos sedimentos en los extremos del desplazamiento del iman junto con una lfnea poco definida que conecta los sedimentos. Como la senal de SERS reproducible se obtiene mejor con un sedimento colocado de forma reproducible, denso, las Figuras 58A y 58B destacan las desventajas de la configuracion de iman fijo, que parece ser incapaz de arrastrar las perlas magneticas a traves del medio secundario de Salmonella SDIX, supuestamente debido a las partfculas solidas presentes en este medio.
La Figura 59A muestra una realizacion preferida usando la configuracion de iman acoplado. Se sedimento PC en medio secundario de Salmonella SDIX durante 1,5 minutos moviendo el tubo acoplado con un iman en barra a una frecuencia de agitacion de 1,5 Hz y 25 mm de alcance. La agitacion se detuvo y se permitio que el iman persistiera durante 30 segundos antes de separar el iman en barra de los tubos. Se formo un unico sedimento denso donde el iman en barra entra en contacto con el tubo de muestras. En comparacion con los sedimentos formados usando la configuracion de iman fijo, el sedimento formado usando imanes acoplados es mas compacto y denso, como se muestra en la Figura 59A. La Figura 59B muestra un experimento similar con un iman acoplado, usando solamente una frecuencia de agitacion de 0,8 Hz. Aunque se formo un unico sedimento, el medio depositado interfiere con la capacidad para extraer un sedimento denso, como se demuestra por las partfculas difusas en el centro del sedimento.
Los resultados ilustrados en las Figuras 57-59 muestran que para un alcance de 25 mm, el enfoque de
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sedimentacion de iman fijo no consiguio formar un unico sedimento denso en presencia de medio secundario de Salmonella SDIX usando una diversidad de frecuencias de agitacion. Este medio contiene partmulas solidas que se depositan rapidamente e interfieren con la capacidad del iman para arrastrar los complejos magneticos a lo largo del fondo del tubo. Aunque la agitacion rapida evitara que el medio solido se deposite, se forman dos sedimentos en los lfmites del movimiento relativo entre el tubo y el iman. A medida que la agitacion se ralentiza hasta detenerse, estos sedimentos no pueden arrastrarse a traves del medio para formar un unico sedimento. Debido a que los complejos magneticos pueden arrastrarse a traves del agua, el enfoque de iman fijo puede usarse para sedimentar PC en agua.
El enfoque de sedimentacion de iman acoplado forma un unico sedimento denso en presencia de medio secundario de Salmonella SDIX a una diversidad de frecuencias de agitacion. El acoplamiento de los imanes al tubo para sedimentar no requiere arrastrar complejos magneticos a lo largo del fondo del tubo porque se extraen a un punto comun para formar un unico sedimento.
Usando imanes acoplados, la agitacion rapida forma un sedimento mas denso en comparacion con la agitacion lenta. Esto probablemente se deba a que el medio solido se deposita usando agitacion lenta e interfiere con la formacion de sedimento. Usando agitacion rapida, el solido se suspende en solucion y pueden extraerse complejos magneticos en un sedimento con menos interferencia del medio.
Ejemplo 5
Deteccion sencilla de C. albicans en sangre humana
La Figura 60 muestra un ejemplo de deteccion e identificacion de microorganismos dentro de una muestra de cultivo sangumeo (sangre con adiciones) para un formato sencillo. En este experimento, se cultivo Candida albicans (ATCC 10231) en un cultivo de una noche en Caldo de Cultivo de Dextrosa Sabouraud de una unica colonia a 30 °C en un cultivo de agitacion. El cultivo se diluyo y se inoculo en sangre humana a 3 ufc/ml o 0 ufc/ml como un control negativo. Se inocularon muestras positivas y negativas en frascos BACTEC™ Convencional 10 Aerobico/F sin reactivos de deteccion asf como en tubos que conteman medio BACTEC™ Convencional 10 Aerobico/F y los reactivos de deteccion (marcadores de SERS y partmulas magneticas conjugados con anticuerpo anti Candida albicans Virostat 6411). La relacion de sangre total con respecto al medio fue de 1:8. Los inoculos se sembraron en placas de CHROMagar™ BBL™ para enumeracion. Los tubos de deteccion se insertaron en el sistema de carrusel 150 (vease Figura 24) y se insertaron frascos BACTEC™ en el instrumento BACTEC™ FX para supervision en tiempo real durante el cultivo a 35 °C. El tubo de SERS positivo se detecto a las 18 horas y el frasco de BACTEC™ fue positivo a las 30 horas. La senal de SERS proporciona deteccion e ID al menos 12 horas antes de BACTEC™ FX para este ensayo sencillo en sangre humana
Ejemplo 6
Deteccion de C. albicans en un formato de ensayo cuadruple
La Figura 61 muestra un ejemplo de deteccion e identificacion de microorganismos dentro de una muestra de cultivo sangumeo (sangre con adiciones) para un formato multiple. En este ensayo cuadruple para la deteccion de C. albicans, E. coli 0157, K. pneumoniae y S. aureus, se conjugaron marcadores de SERS con cuatro indicadores Raman distintos cada uno con anticuerpos para uno de los cuatro organismos (anticuerpos conjugados con marcadores de SERS policlonal Virostat 6411 anti C. albicans, monoclonal Biodesign MAV119-499 anti E. coli O157:H7, monoclonal Biodesign C55573M anti Staphylococcus y monoclonal Santa Cruz Biotechnology sc-80861 anti K. pneumoniae). Los cuatro tipos de marcador de SERS estaban presentes en la mezcla de ensayo, junto con perlas magneticas conjugadas con anticuerpos de captura para los cuatro microorganismos. Las perlas magneticas presentes en el ensayo fueron un grupo de perlas magneticas que consistfan en partmulas magneticas anti E. coli 0157 Dynal® (Life Technologies n.° de catalogo 710-03), perlas M280 Dynal® conjugadas con anticuerpo policlonal Virostat 6411 anti C. albicans, perlas M280 Dynal® conjugadas con anticuerpo monoclonal Biodesign C55573M anti Staphylococcus y perlas M280 Dynal® conjugadas con anticuerpo policlonal PA1-7226 de Affinity Bioreagents anti K. pneumoniae.
En el experimento representado en la Figura 61, se cultivo C. albicans (ATCC 10231) en un cultivo de una noche en Caldo de Cultivo de Dextrosa Sabouraud a partir de una unica colonia a 30 °C en un cultivo en agitacion. El cultivo se diluyo y se inoculo en sangre humana a 3 ufc/ml o 0 ufc/ml como control negativo. Se inocularon muestras positivas y negativas en frascos de BACTEC™ Convencional 10 Aerobico/F asf como tubos de muestras que conteman medio BACTECT™ Convencional 10 Aerobico/F con los reactivos de deteccion. La relacion de sangre con respecto a medio en la muestra final fue de 1:8. Los inoculos de C. albicans se sembraron en placas de CHROMagar™ BBL™ para enumeracion. Los tubos de muestras que conteman los reactivos de SERS se insertaron en un sistema de carrusel (vease Figura 24), mientras que los frascos de BACTEC™ sin reactivos de deteccion se insertaron en el instrumento BACTEC™ FX para supervision en tiempo real durante el crecimiento a 35 °C.
Se detecto C. albicans por SERS a las 16,6 horas, mientras que el sensor de gas de BACTECT™ proporciono
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deteccion positiva a las 28 horas. Ademas, la deteccion por SERS se vio acompanada de identificacion del microorganismo como C. albicans, mientras que el instrumento BACTEC™ no proporciono ninguna informacion de identificacion. Como puede verse en la Figura 61, la deteccion de C. albicans por SERS en un formato multiple no dio como resultado ninguna senal de SERS significativa de los otros marcadores de SERS (distintos de C. albicans).
Ejemplo 7
Deteccion de coinfeccion por E. coli y S. epidermis en sangre de conejo
La Figura 62 muestra un ejemplo de deteccion multiple e identificacion de microorganismos dentro de una muestra de cultivo sangufneo (sangre con adiciones) para un modelo de coinfeccion. Se cultivaron por separado E. coli O157:H7 (ATCC 700728) y S. epidermidis (AtCC 55133) en cultivos durante una noche en Caldo de Cultivo Nutritivo BD a partir de una unica colonia a 37 °C en un cultivo de agitacion. Los cultivos se diluyeron y se coinocularon en sangre de conejo a 2,6 ufc/ml para E. coli O157: H7 y 12,5 ufc/ml para S. epidermidis. Se inocularon muestras positivas y negativas en frascos de BACTEC™ Convencional 10 Aerobico/F (sin reactivos SERS) asf como tubos que contenfan medio BACTEC™ Convencional 10 Aerobico/F y los reactivos de deteccion descritos en el Ejemplo 6 (marcadores de SERS conjugados con Virostat 6411, Biodesign MAV119-499, Biodesign C55573M y Santa Cruz Biotechnology sc-80861, asf como partfculas magneticas anti E. coli 0157 Dynal® y partfculas M280 Dynal® conjugadas con Virostat 6411, Biodesign C55573M y Affinity Bioreagents PA1-7226). La sangre se diluyo 1:8 en medio BACTEC™. Los inoculos se sembraron en placas de CHROMagar™ BBL™ para enumeracion. Se insertaron tubos de deteccion que contenfan los reactivos de SERS en el sistema de carrusel 150 (vease Figura 24), mientras que se insertaron frascos de BACTEC™ sin reactivos de SERS en el instrumento de BACTEC™ FX para supervision en tiempo real durante el crecimiento a 35 °C. Se detecto E. coli O157:H7 y se identifico por SERS a las 7,9 horas, mientras que S. epidermidis se detecto e identifico por SERS a las 11,4 horas. El frasco de BACTEC™ fue positivo a las 10,4 horas, pero no proporciono ningun nivel de identificacion.
Ejemplo 8
Deteccion por SERS en tiempo real en muestras que contienen partfculas
En este ejemplo, se descongelo E. coli O157:H7 (ATCC 700728) a partir de una reserva de glicerol y se inoculo en sangre de conejo diluida en medio BACTEC™ Plus Aerobico/F a una relacion de 1:8. El Medio BACTEC™ Plus Aerobico/F contiene partfculas de resina (17 % p/v) para potenciar la recuperacion de organismos sin la necesidad de procesamiento especial. El medio plus de sangre inoculada se enumero por recuentos de placa para confirmar una inoculacion de 5 ufc/ml. La muestra se coloco en tres tubos repetidos que contenfan SERS y conjugados de perlas magneticas (anticuerpos Biodesign MAV119-499 y G5V119-500). Se insertaron tubos de deteccion en el sistema de carrusel 150 (vease Figura 24) para supervision en tiempo real durante el crecimiento a 35 °C. Los resultados se muestran en la Figura 63. El sistema de carrusel fue capaz de formar y explorar eficazmente un sedimento en presencia de la resina.
Ejemplo 9
Deteccion en grandes volumenes
La agitacion proporcionada durante la sedimentacion permite que las perlas magneticas se capturen eficazmente, incluso en volumenes de muestras grandes o a concentraciones de perlas magneticas bajas.
En un ejemplo, se realizaron ensayos con SERS y volumenes de reactivos de partfculas magneticas mantenidos constantes, variando al mismo tiempo volumenes de muestras para conseguir un intervalo de concentraciones de reactivos. Se ensayaron muestras de 5, 10, 20, 30, 40 y 50 ml de una dilucion 1:10 de sangre de conejo en medio de cultivo sangufneo Bd BACTEC™ Convencional 10 Aerobico/F en 50 ml de Tubos Falcon™ en un sistema de ensayo basado en carrusel modificado para volumenes de muestra grandes (vease por ejemplo, Figura 24). Se descongelo E. coli 0157 a partir de una reserva congelada y se anadio a cada muestra a 104 ufc/ml. Durante el transcurso de seis dfas, cada volumen se ensayo por triplicado, ensayandose solamente una muestra de un volumen dado por dfa.
En cada tubo, se creo una mezcla maestra usada tfpicamente para muestras de 5 ml combinando 125 pl de marcadores de SERS y 80 pl de partfculas magneticas en 795 pl de sangre y medio 1:10. La mezcla maestra de 1 ml resultante se anadio a cada muestra de ensayo. Se usaron marcadores de SERS conjugados con anticuerpos Biodesign MAV119-499 anti E. coli y partfculas magneticas Dynabeads® Anti E. coli 0157 (710-04) de Life Technologies™.
Las muestras se colocaron en un sistema de ensayo basado en carrusel (vease por ejemplo, Figura 24) a 35 °C, con sedimentacion durante 60 segundos, una potencia de laser incidente a 50 mW, un tiempo de integracion de CCD de 5 segundos, basculador que actua a ~ 0,5 ciclos/segundo y una frecuencia de lectura de 5/hora.
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Se muestran los resultados para una muestra representativa de cada volumen en la Figura 64. Aunque la fuerza de senal se reduce con concentraciones de reactivo menores, el sistema es capaz de formar eficazmente sedimentos y detectar el crecimiento incluso a una concentracion 10x menor a la convencional. Como puede verse, el ensayo detecta eficazmente el crecimiento para una diversidad de volumenes.
Ejemplo 10
Incapacidad de sedimentar usando agitacion rapida en sistema de carrusel
En el sistema de carrusel (vease por ejemplo, Figura 24), las muestras se agitan mientras que el sedimento magnetico se forma para asegurar que los complejos magneticos del volumen del lfquido completo pasen a traves del campo magnetico localizado. Una camara captura imagenes del sedimento durante la exploracion con laser para supervisar la formacion de sedimento a lo largo del ensayo.
La Figura 65A muestra un ejemplo en el que no se consigue formar un sedimento en unas pocas horas de enriquecimiento secundario de 107 UFC/ml de Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) a frecuencias de agitacion rapidas en el sistema de carrusel 150 (vease Figura 24). Se cultivo Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) durante una noche en medio primario SELECT™ de Salmonella SDIX RapidChek® con complemento a 42 °C. Se inoculo una dilucion 1:100 del cultivo con Medio Secundario de Salmonella SDIX en un recipiente secundario con partfculas magneticas conjugadas y marcadores de SERS y se coloco en el sistema de carrusel 150. Se determino que la inoculacion de partida en medio secundario era de 1 x 107 UFC/ml por recuento de placa en placas de agar Nutritivo. El instrumento leyo 2 veces por hora, sedimento durante 30 segundos y agito a 2 Hz con 25 mm de alcance. La Figura 65A muestra la curva de SERS resultante con imagenes capturadas en diversos tiempos durante el enriquecimiento secundario. La primera imagen de sedimento contiene un cfrculo amarillo para destacar el area en el que deberfa formarse el sedimento. Esta figura muestra que el sedimento crece en tamano a las 2 horas y no consigue formarse en casi 3 horas de tiempo de enriquecimiento secundario.
Para cargas muy altas de Salmonella, el sedimento se hace particularmente grande porque hay mucho patogeno presente en el sedimento. Cuando la agitacion es demasiado rapida, el campo magnetico es incapaz de superar la dinamica de fluido y no consigue formarse el sedimento.
La Figura 65B muestra la curva de SERS e imagenes correspondientes durante el enriquecimiento secundario para una muestra negativa (perlas magneticas conjugadas y marcadores de SERS conjugados en medio). Estos datos muestran una senal de Raman uniformemente baja y tamano de sedimento uniforme durante el ensayo.
Ralentizando la frecuencia de agitacion a 1 Hz durante el enriquecimiento secundario de 107 UFC/ml de Salmonella Typhimurium (ATCC 14028), el sedimento se formo uniformemente por todo el ensayo. Se cultivo Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) durante una noche en medio primario SELECT™ de Salmonella SDIX RapidChek® con complemento a 42 °C. Se inoculo una dilucion 1:100 del cultivo con Medio secundario de Salmonella SDIX en un recipiente secundario con partfculas magneticas conjugadas y marcadores de SERS y se coloco en el sistema de carrusel 150. Se determino que la inoculacion de partida en medio secundario era de 1 x 107 UFC/ml por recuento de placas en placas de agar Nutritivo. El instrumento leyo 2 veces por hora, sedimento durante 30 segundos y agito a 1 Hz con alcance de 25 mm. La Figura 65C muestra la curva de SERS resultante con imagenes capturadas en diversos tiempos durante el enriquecimiento secundario. La primera imagen de sedimento contiene un cfrculo amarillo para destacar el area en el que deberfa formarse el sedimento. La Figura 65C muestra que el sedimento se conserva durante todo el experimento. La Figura 66 muestra la influencia de la velocidad de agitacion en la persistencia del sedimento superponiendo las curvas de SERS de las velocidades de agitacion de 2 Hz y 1 Hz (Figuras 65A y 65C, respectivamente). Con agitacion mas lenta, la degradacion de la senal es mucho mas lenta y el pico es mucho mas amplio que cuando la agitacion es rapida. Ademas, la supervision en tiempo real del sedimento mediante una camara en lfnea indica que la perdida de senal para agitacion rapida se debe a la ausencia del sedimento, mientras que para la agitacion lenta el sedimento siempre se forma. El sedimento no consigue formarse en casi 3 horas de agitacion a 2 Hz, pero siempre esta presente usando agitacion a 1 Hz. La formacion uniforme del sedimento a alta carga de organismo conduce a persistencia mas larga de la senal de SERS. Esta persistencia en la senal de SERS puede ser ventajosa si, por ejemplo, existe un retardo entre cuando se anade la muestra a los reactivos de deteccion y cuando se coloca la muestra en el instrumento.
Ejemplo 11
Determinacion de la presencia de un patogeno diana usando inspeccion visual del sedimento en inmunoensayos de tipo sandwich.
En este ejemplo, se describe un metodo para deteccion de microorganismos dentro de una muestra microbiologica que puede eliminar la necesidad de laseres, optica y espectrometro de acuerdo con una realizacion de la invencion. Este metodo implica el uso de una camara para capturar imagenes durante lecturas para supervisar la formacion de un sedimento durante el transcurso de un ensayo de SERS-HNW.
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En el experimento descrito en el ejemplo 11 y mostrado en las Figuras 65A, 65B y 65C, la presencia del microorganismo provoca que crezca el tamano del sedimento (Figuras 65A y 65C). Por el contrario, cuando el microorganismo esta ausente, tanto el tamano del sedimento como la senal de SERS permanecen estables. Sin la presencia del patogeno diana, no puede formarse ningun sandwich, dando como resultado ausencia de senal de Raman y ausencia de aumento del tamano del sedimento. La Figura 67 muestra el tamano del sedimento para una muestra negativa en comparacion con el tamano del sedimento para una muestra positiva despues de 3 horas de enriquecimiento secundario en un sistema de carrusel (vease por ejemplo, Figura 24). Esta figura muestra un sedimento mayor formado para la muestra positiva en comparacion con la muestra negativa.
Durante el enriquecimiento secundario de una muestra que contiene marcadores de SERS conjugados y perlas magneticas y el patogeno diana, las imagenes muestran que el tamano del sedimento aumenta, y en algunos casos, no consigue formarse a medida que continua el ensayo. El crecimiento del tamano del sedimento y/o la desaparicion del sedimento es un indicio de la presencia del patogeno diana. Las imagenes capturadas durante lecturas de muestras que contienen marcadores de SERS conjugados y perlas magneticas sin patogeno no muestran ningun cambio en el tamano del sedimento y ninguna desaparicion del sedimento. El uso de analisis de imagenes para supervisar el tamano del sedimento puede presentar un metodo para detectar microorganismos en el ensayo. Este metodo de deteccion puede usarse solo o junto con otro metodo de deteccion.
Ejemplo 12
Deteccion en tiempo real de E. coli 0157:H7 durante el cultivo en muestras alimentarias
Las Figuras 68A, 68B y 68C muestran datos representativos adquiridos con un sistema de carrusel (vease por ejemplo, Figura 24) para la deteccion de E. coli 0157 en ternera picada, agua de lavado de espinacas y solidos de leche agitados en bolsa.
La ternera picada cruda se preparo de acuerdo con el Manual de Laboratorio de Microbiologfa de la USDA (Capftulo 5 de MLG). Se diluyeron muestras de 25 g de ternera picada con 225 ml de mTSB con Novobiocina en una bolsa stomacher. Cada bolsa stomacher se agito despues en un Seward Stomacher® 400 durante 2 minutos. Se transfirieron alfcuotas de 5 ml de la ternera picada agitada en bolsa a tubos que contenfan marcador de SERS y conjugados de partfculas magneticas. Se cultivo E. coli O157:H7 (ATCC 43888) en un cultivo durante una noche en Caldo de Cultivo Nutritivo de una unica colonia a 37 °C en un cultivo de agitacion. El cultivo se diluyo en serie hasta aproximadamente 102 - 104 en Caldo de Cultivo Nutritivo. Se anadio una alfcuota de 0,05 ml a cada tubo positivo y se anadio una alfcuota de 0,05 ml de Caldo de Cultivo Nutritivo a tubos de control negativos.
La muestra de aclarado de espinaca se preparo de acuerdo con el Manual Analftico Bacteriologico de la FDA (Capftulo 4A del BAM). Se anadio un peso igual de tampon de fosfato de Butterfield a hojas de espinaca en una bolsa de plastico resellable y se agito manualmente durante 5 minutos. El agua de lavado de espinacas se anadio despues a un volumen igual de mBPWp de doble fuerza (x2). Se cultivo E. coli O157:H7 (ATCC 43888) en un cultivo de una noche en Caldo de Cultivo Nutritivo a partir de una unica colonia a 37 °C en un cultivo de agitacion. El cultivo se diluyo en serie y se inoculo en el agua de lavado de espinacas + mBPWp (x2) a una concentracion de 103 o 0 ufc/ml. Se anadieron alfcuotas de 5 ml de estas muestras a tubos que contenfan marcador de SERS y conjugados de partfculas magneticas.
La muestra de leche se preparo de acuerdo con el Manual Analftico Bacteriologico de la FDA (Capftulo 4A del BAM). Se centrifugo leche entera durante 10 minutos a 10.000 x g. La capa del sobrenadante se retiro por vertido y el sedimento se resuspendio en mBPWp a 1,125 veces el volumen de leche original. Se cultivo E. coli O157:H (ATCC 43888) en un cultivo de una noche en Caldo de Cultivo Nutritivo a partir de una unica colonia a 37 °C en un cultivo de agitacion. El cultivo se diluyo hasta 5000 ufc/ml en Caldo de Cultivo Nutritivo. Se anadieron alfcuotas de 50 pl del cultivo de E. coli O157:H7 diluido o Caldo de Cultivo Nutritivo (control negativo) a tubos de 5 ml del cultivo de leche resuspendido mas reactivos de ensayo.
Todos los inoculos se sembraron para enumeracion en placas CHROMagar™ BD BBL™. Los tubos se insertaron en el sistema de carrusel para supervision en tiempo real durante el crecimiento a 35 °C durante 8 horas.
Ejemplo 13
Deteccion en tiempo real de Salmonella durante el cultivo en muestras alimentarias
La Figura 69 muestra un ejemplo en el que se detecto S. Enteritidis con tension termica (ATCC 13076) durante crecimiento en tiempo real en ternera picada mas medio de cultivo. Se cultivo Salmonella Enteritidis en un cultivo de una noche en Caldo de Cultivo Nutritivo a partir de una unica colonia a 37 °C en un cultivo de agitacion. El cultivo se diluyo hasta 1:100 en Caldo de Cultivo Nutritivo y se sometio a tension termica durante 20 minutos a 54 °C. La muestra sometida a tension termica se diluyo adicionalmente hasta 200 ufc/ml en Caldo de Cultivo Nutritivo. Se inocularon dos muestras de 25 g de ternera picada cruda con alfcuotas de 1 ml del cultivo sometido a tension termica, diluido de S. Enteritidis. El inoculo se sembro para enumeracion en placas de Agar Nutritivo. Las muestras
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de ternera picada inoculada se agitaron manualmente en una bolsa stomacher durante 2 minutos para mezclar exhaustivamente el inoculo. Se anadieron 225 ml de Medio Primario SELECT™ de Salmonella SDIX RapidChek® con complemento a las muestras inoculadas en la bolsa stomacher. Se prepararon muestras de control negativo con 25 g de ternera picada cruda en 225 ml de Medio Primario SELECT™ de Salmonella SDIX RapidChek® con complemento. Cada bolsa stomacher se agito despues en un Seward Stomacher® 400 durante 2 minutos. Las bolsas stomacher se colocaron despues en un incubador a 42 °C durante aproximadamente 22 horas. Despues se anadieron muestras de 100 pl de los cultivos primarios enriquecidos a tubos que contenfan 4,5 ml de medio secundario de Salmonella SDIX, 0,4 ml de medio primario SELECT™ de Salmonella SDIX RapidChek® y reactivos de ensayo. Los tubos se insertaron despues en el sistema de carrusel (vease Figura 24) para supervision en tiempo real durante el crecimiento a 42 °C durante 8 horas. Se detectaron muestras positivas en un periodo de aproximadamente 2 horas, mientras que las muestras negativas dieron como resultado curvas de deteccion planas.
Ejemplo 14
Deteccion de Listeria en una muestra ambiental
La Figura 70 muestra la deteccion de Listeria monocytogenes (ATCC 19115) en una probeta de acero inoxidable. Se cultivo L. monocytogenes (ATCC 19115) en un cultivo de una noche en caldo de cultivo de infusion de corazon y cerebro a partir de una unica colonia a 30 °C en un cultivo de agitacion. El cultivo se diluyo hasta 5 x 104 o 0 ufc/ml en PBS + leche 5 %. Se coloco una alfcuota de 0,1 ml en una probeta de acero inoxidable de 2,54 cm x 2,54 cm y se permitio que se secara al aire durante una noche. Al dfa siguiente, se pasaron hisopos de punta de algodon, humedos con caldo de neutralizacion D/E, por la superficie varias veces. Los hisopos se anadieron despues a 5 ml de medio de Listeria SDIX con complemento, marcadores de SERS y partfculas magneticas en tubos. Los tubos se insertaron despues en el sistema de carrusel (vease Figura 24) para supervision en tiempo real durante el crecimiento a 30 °C. Se detectaron muestras positivas entre aproximadamente 19 y 27 horas, mientras que las muestras negativas dieron como resultado curvas de deteccion planas.
Ejemplo 15
Deteccion de Salmonella usando un sistema de lecho plano
En este ejemplo se detecto Salmonella usando agitacion lineal y un sistema de lecho plano (vease por ejemplo Figura 25). Se cultivaron Salmonella Typhimurium (ATCC 14028) y Salmonella Enteritidis (ATCC 13076) por separado en cultivos de una noche en medio primario SELECT™ de Salmonella SDIX RapidChek® con complemento a 42 °C. Se preparo una dilucion 1:100 de cada cepa en lotes de Medio Secundario de Salmonella SDIX separados. Se determino que la inoculacion de partida para cada cepa en medio secundario era de 1 x 107 UFC/ml por recuento de placa en placas de agar Nutritivo. Cada cepa se inoculo por duplicado en tubos que contenfan marcadores de SERS y partfculas magneticas conjugadas con anticuerpos anti Salmonella (Virostat 0701). Estos tubos, junto con dos muestras negativas (medio secundario SDIX y marcadores de SERS conjugados y partfculas magneticas sin Salmonella) se colocaron en el instrumento para supervision durante el enriquecimiento secundario a 42 °C.
El sistema usado en este ejemplo fue una configuracion de lecho plano (vease por ejemplo Figura 25). En esta configuracion, la agitacion es por reciprocidad lineal a lo largo del eje de los tubos, que puede programarse para diferentes frecuencias y perfiles a lo largo del ensayo. Cada ciclo consiste en las siguientes fases: mezclado, dispersion presedimentacion, sedimentacion, lectura y dispersion. La configuracion de iman usada en este ejemplo fue un unico iman en barra con el polo Norte orientado hacia las muestras. Una vez que se formo un sedimento, la barra se separo de las muestras para permitir su lectura. La Figura 71 muestra la frecuencia de agitacion y el alcance usado para cada fase. El experimento se proceso durante ~19 horas repitiendose un ciclo cada ~20 minutos.
Se pretende que la fase de dispersion presedimentacion resuspenda el solido depositado en el medio secundario SDIX antes de la sedimentacion. Se sabe que el solido depositado del medio interfiere con la sedimentacion de complejos magneticos. El iman en barra individual se pone en contacto con los tubos durante la agitacion y las muestras se sedimentan durante 60 segundos. La agitacion se detiene durante 5 segundos y el iman se separa de los tubos de muestras para permitir que el aparato optico explore cada sedimento. Una camara tambien captura imagenes de cada sedimento. La agitacion se reanuda para dispersar el sedimento y el ciclo se repite.
La Figura 72 muestra las curvas de SERS durante el enriquecimiento secundario de S. Typhimurium (ATCC 14028), S. Enteritidis (ATCC 13076) y muestras negativas. Como puede verse, las curvas de SERS son suaves y pueden distinguirse facilmente de las negativas. La Figura 73 muestra imagenes de los sedimentos formados a diversos tiempos durante el enriquecimiento secundario de S. Typhimurium. Como puede verse, se forman uniformemente sedimentos densos, redondos, a lo largo del ensayo usando el instrumento de lecho plano.
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Ejemplo 16
Aqitacion lineal frente a balanceo
En este ejemplo, se procesaron ensayos de Salmonella identicos en dos sistemas de carrusel (vease por ejemplo Fiqura 24) usando diferentes metodos de aqitacion: una reciprocidad lineal a lo larqo del eje de los tubos y una oscilacion de balanceo. Se cultivaron Salmonella Enteritidis (ATCC 13076) y Salmonella Kentucky (ATCC 9263) por separado en cultivos de una noche en medio primario SELECT™ de Salmonella SDIX RapidChek® con complemento a 42 °C. Se realizo una dilucion 1:100 de cada cepa en lotes de Medio Secundario de Salmonella SDIX separados. Se determino que la inoculacion de partida para cada cepa en medio secundario era de 1 x 107 UFC/ml por recuento de placas en placas de aqar Nutritivo. Cada cepa se inoculo por duplicado en tubos que contenfan marcadores de SERS y partfculas maqneticas conjuqadas con anticuerpos anti Salmonella de Virostat (0701). Estos tubos se colocaron en los sistemas de carrusel para supervision durante el enriquecimiento secundario a 42 °C. Cada instrumento leyo 2 veces por hora, sedimento durante 30 sequndos y aqito a 1 Hz.
La Fiqura 74 muestra curvas de SERS obtenidas de la aqitacion de balanceo y el sistema de carrusel de aqitacion lineal durante el enriquecimiento secundario de S. Enteritidis y S. Kentucky. Puede verse que se obtienen buenos resultados con ambos metodos.
En este ejemplo, la aqitacion lineal dio como resultado alqunas ventajas sobre el movimiento de balanceo. El rendimiento de sedimentacion fue mejor usando aqitacion lineal en comparacion con balanceo debido a que el sedimento se formo siempre en el centro de la cabeza de lectura usando aqitacion lineal. El sistema de aqitacion de balanceo no oscila simetricamente alrededor del brazo de balanceo, provocando que la rueda de tubos favorezca el movimiento hacia delante. Este movimiento fluido asimetrico provoca que la fuerza del fluido en el sedimento favorezca el lado frontal de los tubos. Debido a su simplicidad mecanica en comparacion con la aqitacion de balanceo, la aqitacion lineal es un metodo preferido de aqitacion.
Ejemplo 17
Compatibilidad de ensayo sin lavado en tiempo real con procesamiento de muestras posterior
En este ejemplo, se ensayo la compatibilidad del ensayo en tiempo real basado en SERS con ensayos de procesamiento de muestras que se realizan tfpicamente despues de la deteccion de una muestra de cultivo sanqufneo positiva por sensores de qases convencionales. Estos ensayos pueden usarse para proporcionar identificacion de orqanismos a partir de un frasco de cultivo sanqufneo positivo. Estos ensayos incluyen ensayos de coaqulasa de tubo convencional, ensayos de aqlutinacion de latex, tincion de qram, desarrollo de medio cromoqenico, ensayos de susceptibilidad antibiotica manual e inhibicion antifunqica en cultivos en placa.
Los ensayos de coaqulasa en tubo convencionales se realizaron seleccionando por separado varias colonias de S. aureus o S. epidermidis a partir de una placa sembrada en estrfas y emulsionandolas en medio BACTEC™. Se anadio una muestra de 50 pl de bacterias emulsionadas con o sin reactivos de SERS (a concentraciones de ensayo) a 500 pl de plasma de conejo de EDTA y se incubaron a 37 °C. Las muestras de S. aureus con y sin reactivos de SERS coaqularon el plasma en un periodo de 4 horas (Fiqura 75). Las muestras de S. epidermidis no coaqularon el plasma de conejo en un periodo de 4 horas. Por lo tanto, la presencia de reactivos de SERS no impide la capacidad de distinquir S. aureus de S. epidermidis mediante actividad coaqulasa, incluso a concentraciones de reactivo de SERS relativamente altas.
Tambien se evaluo un ensayo de aqlutinacion de latex para identificacion de S. aureus con respecto a cualquier interferencia provocada por las partfculas de ensayo de SERS. Las muestras de S. aureus y S. epidermidis con y sin reactivos de SERS (a concentraciones de ensayo) se prepararon como se ha descrito anteriormente. Despues se anadio una qota de latex de ensayo BD BBL™ Staphyloslide™ a la tarjeta de ensayo, asf como una qota de latex de control. A cada tipo de latex, se anadieron muestras de 10 pl de 1) S. epidermidis con reactivos de SERS, 2) S. epidermidis sin reactivos de SERS, 3) S. aureus con reactivos de SERS y 4) S. aureus sin reactivos de SERS. Las soluciones se mezclaron y se balancearon durante ~20 s. La Fiqura 76 muestra las tarjetas con S. epidermidis (tarjeta izquierda) y S. aureus tipo 8 (tarjeta derecha). Se anadieron muestras bacterianas con reactivos de SERS a la fila superior, mientras que las muestras sin reactivos de SERS se anadieron a la fila inferior. Los resultados son identicos para muestras con y sin reactivos, mostrando solamente las muestras de S. aureus aqlutinacion. Las unicas muestras que muestran aqlutinacion fueron las muestras de S. aureus con y sin reactivos de SERS, lo que demuestra que los reactivos de SERS no impiden la aqlutinacion de latex en presencia de S. aureus, no aqlutinan falsamente latex de control y no aqlutinan falsamente latex de ensayo en presencia de S. epidermidis.
Tambien se realizo tincion de Gram con reactivos de ensayo como un ensayo de compatibilidad de procesamiento corriente abajo. Se anadieron marcadores de SERS y partfculas maqneticas a Portaobjetos de Gram de Control BD BBL que contenfan Staphylococcus aureus ATCC 25923 (cocos qram positivos) y Escherichia coli ATCC 25922 (bacilos qram neqativos) y se capturaron imaqenes usando un objetivo con inmersion en aceite 100X, como se usa tfpicamente en la clfnica. La Fiqura 77 muestra las partfculas maqneticas y marcadores de SERS sin los orqanismos
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de control. Las partfculas magneticas son claramente visibles como esferas marrones grandes. Las partfculas magneticas tambien son de color y tamano uniformes, actuando efectivamente como un patron de tamano interno (~3 pm) para microscopia. Los marcadores de SERS, que son de 0,1 - 0,2 pm de diametro, no son visibles. La Figura 78 muestra una partfcula magnetica en presencia de una mezcla de S. aureus (cocos purpuras) y E. coli (bacilos rosa) cuya imagen se ha capturado a 100X. Las partfculas magneticas estan claramente destenidas y son facilmente distinguibles de los microorganismos en esta imagen.
El medio cromogenico CHROMagar™ permite la identificacion, diferenciacion y separacion de patogenos individuales por un unico color desarrollado en el medio solido. Las muestras de cultivos sangufneos de una noche de S. aureus de tipo 8 y S. epidermidis que contienen reactivos de SERS se sembraron en estrfas en placas de CHROMagar™. Los resultados obtenidos (Figura 79) indican que los reactivos de SERS no influyen en la capacidad para obtener colonias individuales y no impiden el desarrollo de color de CHROMagar™ especffico de especie, en el que se muestra S. aureus a la izquierda y se muestra S. epidermidis a la derecha. Como se esperaba, las colonias de S. aureus son de color malva mientras que las colonias de S. epidermidis son de color blanco cuando se siembran en estrfas en placas de Staphylococcus aureus BD BBL™ CHROMagar™.
Tambien se realizo ensayo antibiotico manual usando el metodo de difusion de disco de agar (BD Sensi-disc™) en presencia de reactivos de SERS. Se sembraron en estrfas cultivos sangufneos de una noche de E. coli 0157 con reactivos de SERS en placas de agar Mueller Hinton II BD BBL™ y se colocaron tres discos de ensayo BD BBLTM Sensi-disc™ encima y se permitio que el cultivo creciera a 37 °C durante una noche. Al dfa siguiente, se midieron las zonas de inhibicion (Figura 80) (en mm) y se compararon con el Diagrama Interpretativo de Diametro de Zona de Sensi-disc™ para la determinacion de aislados sensibles, inhibidores o resistentes. La Figura 80 muestra Ampicilina 10 (arriba a la izquierda), Levofloxacina 5 (arriba a la derecha), Vancomicina 30 (parte inferior). Las mediciones del diametro de zona no variaron mas de 1-2 mm entre el cultivo de E. coli con reactivos y el cultivo sin reactivos (Figura 81). Este proceso se repitio con otras bacterias de cultivo sangufneo y levadura (Tabla 82), lo que muestra que la capacidad para determinar la susceptibilidad del antibiotico de un microorganismo usando el metodo de difusion en disco no se ve influida por la presencia de reactivos de SERS.
Para ensayar levadura, se usaron discos de Nistatina Taxo™. Estos discos no se usan para ensayos de susceptibilidad, sino para diferenciacion y aislamiento de bacterias de muestras de ensayo tanto con bacterias como con levadura. Por lo tanto, se ensayo un metodo ligeramente diferente. Se sembraron en estrfas cultivos de sangre mixtos de E. coli y C. albicans con y sin reactivos de SERS en placas de TSA II. Los discos de Nistatina Taxo™ se colocaron encima y los cultivos se dejaron crecer a 37 °C durante una noche. En ambas muestras con (imagen izquierda de la Figura 83) y sin (imagen derecha de la Figura 83) reactivos de ensayo, la inhibicion por Nistatina del crecimiento de C. albicans dio como resultado areas de colonias de E. coli aisladas.
Ejemplo 18
Efecto de la frecuencia de agitacion y el tiempo de sedimentacion en la formacion de sedimento
Este ejemplo se refiere a la sedimentacion que usa una configuracion en la que el tubo se acopla al iman (vease por ejemplo Figura 49) de modo que el iman se mueve con el tubo y se mantiene en la misma posicion relativa con respecto al tubo durante toda la agitacion. En una serie de experimentos, se unieron covalentemente marcadores de SERS con partfculas magneticas activadas por tosilo para formar un precomplejo (PC) de perlas magneticas de SERS. Se preparan perlas en precomplejo por enlace covalente de partfculas de SERS con partfculas magneticas activadas por Tosilo M-280 Dynabeads® mediante la reaccion de grupos tiol (-SH) en la superficie de SERS con grupos tosilo (Tos) en la superficie de las partfculas magneticas. El PC actua como un sistema modelo para un ensayo de formacion de sedimentos en el que el sedimento puede explorarse con respecto a senal de SERS. En este ejemplo, la formacion de sedimento de PC en un medio secundario comercial para Salmonella (SDIX RapidChek® Salmonella SELECT™) se comparo usando una diversidad de frecuencias de agitacion y tiempos de sedimentacion. Estos ensayos se realizaron usando una configuracion de sistema de lecho plano (vease por ejemplo Figura 25) con un unico iman en barra individual con el polo Norte orientado hacia los tubos (vease por ejemplo Figura 52).
La Figura 84 muestra una tabla con imagenes de sedimentos formados usando PC en medio secundario de Salmonella SDIX usando tres frecuencias de agitacion diferentes y tres tiempos de sedimentacion diferentes. El PC en medio secundario SDIX se sedimento agitando los tubos acoplados con el iman en barra a diversas frecuencias de agitacion a 50 mm de alcance (amplitud). La agitacion se detuvo y se permitio que el iman persistiera durante 5 segundos antes de separar el iman en barra de los tubos. Se capturaron imagenes de los sedimentos una vez que el iman en barra se separo de los tubos.
Como se muestra en la Figura 84, la agitacion rapida forma un sedimento mas denso en comparacion con la agitacion lenta. Esto probablemente se deba a que el medio solido se deposita al usar agitacion lenta e interfiere con la formacion de sedimento. Usando agitacion rapida, el solido se suspende en solucion y pueden extraerse complejos magneticos en un sedimento con menos interferencia del medio. Puede verse en los sedimentos formados usando frecuencia de agitacion de 0,7 Hz con tiempos de sedimentacion de 30, 60 y 90 segundos que el
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medio depositado interfiere con la capacidad para extraer un sedimento denso, como se demuestra por el sedimento difuso.
Ejemplo 19
Efecto de la frecuencia de aqitacion en la dispersion del sedimento
Este ejemplo se refiere a la medicion del tiempo requerido para dispersar completamente un sedimento usando una diversidad de alcances de aqitacion (amplitud) y frecuencias. En cada caso, se formo un sedimento usando una configuracion en la que el tubo se acopla al iman (vease por ejemplo Fiqura 49) de modo que el iman se mueve con el tubo y se mantiene en la misma posicion relativa con respecto al tubo durante toda la aqitacion. El iman usado en este ejemplo fue un unico iman en barra con el polo N orientado hacia los tubos de muestra, tal como se muestra en la Fiqura 52.
En este ejemplo, el tubo se aqito manualmente antes de cada ensayo para mezclar exhaustivamente el medio (SDIX RapidChek® Salmonella SELECT™) y PC. La muestra se carqo en el instrumento de lecho plano y se formo un sedimento aqitando a 1,8 Hz y 25 mm de alcance durante 90 sequndos. La aqitacion se detuvo y se permitio que el iman persistiera durante 5 sequndos antes de separar la barra de iman de los tubos. Se usaron diversas frecuencias de aqitacion y alcances en ensayos separados para dispersar el sedimento. La dispersion de sedimentos se superviso por inspeccion visual y se midio el tiempo requerido para dispersar completamente el sedimento. Los datos con un asterisco indican que no se observo ninqun medio depositado.
Como se muestra en la Fiqura 85, la aqitacion rapida dispersa el sedimento en menos tiempo en comparacion con la aqitacion lenta. Ademas, para una frecuencia de aqitacion dada, el sedimento se dispersa mas rapidamente con un alcance de aqitacion mas larqo. Basandose en observaciones en este ejemplo, el medio solido en el medio secundario permanece suspendido en solucion a frecuencias de aqitacion por encima de 2,5 Hz a 25 mm de alcance y por encima de 1,5 Hz a 50 mm de alcance.
Ejemplo 20
Ensayo de viabilidad del ensayo de fluorescencia HNW en presencia de alimento
Este ejemplo demuestra la viabilidad de realizar un ensayo sin lavado homoqeneo junto con cultivo usando partfculas fluorescentes de infrarrojo cercano (“NIR”) en luqar de marcadores de SERS. En este ejemplo, se fabricaron nanopartfculas de sflice fluorescente usando una tecnica de cultivo de Stober modificada que incorpora tanto un conjuqado de silano-colorante de NIR (para proporcionar la senal fluorescente) como un silano tiolado (para proporcionar un asa qufmica para conjuqacion de anticuerpos). Las partfculas se caracterizaron por microscopia electronica de transmision (“MET”), espectroscopia de extincion de uV/Vis y espectroscopia de fluorescencia, y se descubrio que eran relativamente monodispersas y brillantes. La Fiqura 96 ilustra una imaqen de MET de nanopartfculas de sflice fluorescentes de NIR (la barra de escala es de 200 nm), mientras que la Fiqura 97 ilustra un espectro de fluorescencia de nanopartfculas fluorescentes NIR (DO 0,5) y espectro de Raman de marcadores de SERS ES/HB convencionales (DO 1,2). Se conjuqaron nanopartfculas fluorescentes con Ab de Listeria usando un protocolo de conjuqacion convencional que se modifico para ajustarse a las diferencias en la concentracion de nanopartfculas fluorescentes, el area de superficie y la masa relativa a marcadores de SERS. Las nanopartfculas de sflice fluorescentes conjuqadas se ensayaron en un ensayo HNW de Listeria en un sistema de carrusel 150 (vease Fiqura 24) usando muestras mezcladas 10 % p/v de espinaca y col. Se realizaron ensayos de control usando marcadores de SERS con muestras tanto de espinacas como de col.
Los marcadores fluorescentes fueron capaces de detectar con exito Listeria en ambas muestras alimentarias. La Fiqura 98 representa los datos de espinacas recoqidos usando marcadores de nanopartfculas fluorescentes NIR y marcadores de SERS, mientras que la Fiqura 99 representa los datos de col recoqidos usando marcadores de nanopartfculas fluorescentes de NIR y marcadores de SERS. Se descubrio que tanto la senal como el fondo eran mayores para marcadores fluorescentes que para marcadores de SERS, sin embarqo, la deteccion fue exitosa con relaciones de senal con respecto a fondo relativamente altas de ~4:1.
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REIVINDICACIONES
1. Un metodo para detectar uno o mas microorganismos en una muestra, comprendiendo el metodo:
(a) proporcionar una muestra que se sospecha que contiene uno o mas microorganismos;
(b) disponer dicha muestra en un vial de ensayo, en el que dicho vial de ensayo tiene dispuesto en el mismo un medio de cultivo capaz de dar soporte al crecimiento de microorganismos para formar una muestra de cultivo y un reactivo que comprende una o mas partfculas indicadoras que tienen asociadas con el mismo al menos un miembro de union especffico que tiene una afinidad por dichos uno o mas microorganismos; y una o mas partfculas de captura magnetica que tienen asociadas con las mismas al menos un miembro de union especffico que tiene una afinidad por dichos uno o mas microorganismos, en el que el miembro de union asociado con las partfculas indicadoras puede ser el mismo o diferente que el miembro de union asociado con las partfculas de captura magnetica;
(c) incubar la muestra de cultivo durante un periodo de tiempo predeterminado para formar un complejo de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora si dichos uno o mas microorganismos estan presentes en la muestra;
(d) agitar el vial de ensayo;
(e) exponer dicho complejo de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora a un campo magnetico para inducir que dicho complejo migre a un area localizada de dicho vial de ensayo;
(f) explorar opticamente dicha area localizada de dicho vial de ensayo para inducir que dicha partfcula indicadora produzca una senal detectable para detectar dichos uno o mas microorganismos en dicha muestra;
(g) dispersar dicho complejo de partfcula de captura magnetica-microorganismo-partfcula indicadora; y
(h) repetir las etapas (c)-(g) una o mas veces.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que:
(i) se produce repeticion de las etapas (c)-(g) en intervalos temporales regulares;
(ii) se producen las etapas (c) y (d) simultaneamente; o
(iii) la etapa (e) forma un sedimento que comprende complejos de partfcula de captura magnetica- microorganismo-partfcula indicadora, opcionalmente
en el que el sedimento es detectable usando medios visuales u opticos.
3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la muestra comprende una muestra sangufnea, una muestra alimentaria o una muestra ambiental.
4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la disposicion de dicha muestra en un vial de ensayo comprende transferir una cantidad deseada de dicha muestra, junto con medio de cultivo opcional, de un vaso, en el que el vaso comprende:
un recipiente para recibir una muestra de cultivo en el mismo, teniendo el recipiente un extremo abierto y un extremo cerrado;
una tapa configurada para conectar con el extremo abierto del recipiente en una conexion hermetica; una cesta acoplada a la tapa y que incluye al menos un deposito, disponiendose la cesta entre el extremo abierto y el extremo cerrado del recipiente, estando configurado el deposito para contener un volumen de muestra de cultivo en el mismo; y
al menos un conjunto de aguja conectado con la tapa, incluyendo el conjunto de aguja una aguja que se extiende dentro del deposito,
en el que la aguja se configura para extraer selectivamente una muestra contenida en el deposito, y en el que la aguja se configura adicionalmente para conectar con un vial para una transferencia biocontenida de la muestra del deposito al vial.
5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la disposicion de dicha muestra en un vial de ensayo comprende extraer la muestra, junto con medio de cultivo opcional, de una manera biocontenida, de un vaso en el que no estan presentes la partfcula magnetica y las partfculas indicadoras.

Claims (1)

  1. cn
    co
    Marcador de SERS i
    Parti'cula
    magnetica
    L
    imagen1
    imagen2
    Anadir muestra; incubar
    imagen3
    Aplicar campo magneticol
    imagen4
    Explorar el sedimento magnetico con laser; detectar el espectro de SERS
    imagen5
    Figura 1
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Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI541504B (zh) * 2014-01-20 2016-07-11 國立陽明大學 尿晶體檢測系統及方法
US10422795B2 (en) 2014-01-20 2019-09-24 National Yang-Ming University Urinary crystal detection method
CN105462824B (zh) 2014-05-27 2021-02-02 Bd控股私人有限公司 在商业无菌检测中使用血培养基平台的改进
CN104062276A (zh) * 2014-06-06 2014-09-24 上海交通大学 基于dna快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法
FR3027678B1 (fr) * 2014-10-24 2016-12-30 Viovy Jean Louis Procede de detection d'organismes dans un echantillon dilue
WO2016095961A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Medcom Advance, S.A Analysis device, analysis apparatus for identification of analytes in fluids and use of the analysis device
US20160291002A1 (en) * 2015-03-12 2016-10-06 Pathogen Systems, Inc. dba Crystal Diagnostics Ltd Sample Preparation and Specific Capture for Multiplex Detection of Target Analytes (i.e., Bacteria, Viruses, Etc.)
WO2016172387A1 (en) * 2015-04-21 2016-10-27 Purdue Research Foundation Culture imaging system
CN104807993B (zh) * 2015-04-23 2017-01-25 广东国际旅行卫生保健中心（广东出入境检验检疫局口岸门诊部） 一种结核分枝杆菌esat‑6蛋白检测试剂盒、制备方法以及使用方法
CN105137072B (zh) * 2015-04-30 2017-03-01 广东国际旅行卫生保健中心（广东出入境检验检疫局口岸门诊部） 一种结核分枝杆菌lam检测试剂盒、制备方法以及使用方法
US10054522B1 (en) * 2015-05-15 2018-08-21 Colleen Kraft Systems, devices, and methods for specimen preparation
MX2017015203A (es) * 2015-05-28 2018-08-15 Bd Kiestra Bv Método y sistema automatizados para obtener y preparar una muestra de microorganismo para ensayos tanto de identificación como de susceptibilidad a antibióticos.
EP3108962A1 (de) * 2015-06-22 2016-12-28 Thinxxs Microtechnology Ag Probenträger
FR3046797A1 (fr) * 2016-01-15 2017-07-21 Biofilm Control Procede de detection rapide de sensibilite de microorganismes aux drogues
FR3046795A1 (fr) * 2016-01-15 2017-07-21 Biofilm Control Procede de classification de microorganismes
CA3011991A1 (en) * 2016-01-21 2017-07-27 T2 Biosystems, Inc. Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods
KR20180128424A (ko) 2016-03-18 2018-12-03 앤드류 알리안스 에스. 에이. 액체 핸들러의 팁에서의 비드 조작 방법 및 장치
JP2017169479A (ja) * 2016-03-23 2017-09-28 オリンパス株式会社 観察装置、測定システム及び培養容器
KR102043491B1 (ko) * 2016-03-29 2019-11-13 주식회사 포스코 철분 제거 장치 및 이를 포함하는 재생 시스템
CN109562142B (zh) * 2016-04-04 2022-09-13 纽约哥伦比亚大学董事会 使用核苷酸类似物和拉曼检测的dna合成测序
CN105866436B (zh) * 2016-06-01 2017-12-15 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种华纳氏葡萄球菌间接血凝检测试剂盒及其应用
MX2019000902A (es) 2016-07-21 2020-09-03 I2Pure Corp Desinfectantes topicos emolientes.
AU2017326760A1 (en) * 2016-09-16 2019-05-02 The University Of Western Australia Magnetic tool and method of collecting magnetic particles using same
CN106370644A (zh) * 2016-12-01 2017-02-01 无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司 一种动物组织中磺胺二甲基嘧啶的检测方法及试纸条
EP3605107A4 (en) * 2017-04-28 2020-12-30 Ezdia Tech Inc. AUTOMATED IMMUNOASSAY DEVICE AND METHOD USING A LARGE MAGNETIC COMPLEX OF PARTICLES
CN108795790A (zh) * 2017-04-28 2018-11-13 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种培养基及其制备方法和用途
US20180314803A1 (en) 2017-04-30 2018-11-01 Genefluidics, Inc. Generation of data for use with antimicrobials
US11433402B2 (en) 2017-07-19 2022-09-06 Amgen Inc. Magnetic assisted separation apparatuses and related methods
US11371071B2 (en) 2017-08-08 2022-06-28 International Business Machines Corporation Cell culturing structure including growth medium and non-growth medium
CN108254559A (zh) * 2018-01-03 2018-07-06 北京市理化分析测试中心 快速检测微生物的方法
EP3824094A4 (en) * 2018-07-18 2022-03-16 Selux Diagnostics Inc. TESTING FOR ANTIBIOTIC SENSITIVITY AND MICROBIAL IDENTIFICATION
EP3837531A4 (en) * 2018-08-17 2022-05-04 Genefluidics, Inc. GENERATION OF DATA FOR USE WITH ANTIMICROBIAL SUBSTANCES
CN109395875B (zh) * 2018-12-11 2023-10-20 苏州英赛斯智能科技有限公司 一种磁珠分离机构、装置以及磁珠分离方法
KR102170259B1 (ko) * 2019-07-15 2020-10-28 주식회사 어큐노스 형광 이미징 기반의 미생물 신속 검출을 위한 용액 치환형 자성입자 농축방법 및 장치
KR102257511B1 (ko) * 2019-08-13 2021-05-31 고려대학교 산학협력단 자성-광학 복합 나노구조체
CN110954696A (zh) * 2019-11-27 2020-04-03 深圳华瑞达生物科技有限公司 一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒及其应用
CN112834749B (zh) * 2020-12-14 2023-05-02 黑龙江大学 一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用
CN112646720B (zh) * 2021-01-07 2022-07-05 东莞兰卫医学检验实验室有限公司 一种针对突变型小分子抗癌药物研发装置
CN112725403A (zh) * 2021-01-25 2021-04-30 宁夏医科大学总医院 一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法
CN113504346B (zh) * 2021-09-09 2021-11-23 南通化学环境监测站有限公司 一种用于公共场所的卫生检测装置
KR102594680B1 (ko) * 2021-10-08 2023-10-25 한국생명공학연구원 표면증강라만산란 기반 표적 바이러스 면역검정법
WO2023073399A1 (en) * 2021-10-26 2023-05-04 Alakhmimi Nuha An automated system for microbial testing
EP4205849A1 (en) * 2021-12-30 2023-07-05 Elmedix NV System and method for thermal treatment of cancer cells
WO2023235793A2 (en) * 2022-06-01 2023-12-07 The Regents Of The University Of California Novel technique to quantify gaseous reactive chlorine species by liquid ion chromatograpy

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5624814A (en) 1981-08-20 1997-04-29 Becton Dickinson And Company Culture medium and method for culturing body fluids containing antibiotics
GB9020352D0 (en) * 1990-09-18 1990-10-31 Anagen Ltd Assay or reaction apparatus
US5128103A (en) * 1990-12-14 1992-07-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Apparatus for automatically processing magnetic solid phase reagents
US5312009A (en) 1993-06-07 1994-05-17 Sage Products, Inc. Liquid specimen collector with removable extraction device
US5374395A (en) * 1993-10-14 1994-12-20 Amoco Corporation Diagnostics instrument
US5653686A (en) 1995-01-13 1997-08-05 Coulter Corporation Closed vial transfer method and system
US6344272B1 (en) 1997-03-12 2002-02-05 Wm. Marsh Rice University Metal nanoshells
US6699724B1 (en) 1998-03-11 2004-03-02 Wm. Marsh Rice University Metal nanoshells for biosensing applications
EP2316571A3 (en) 1998-05-01 2011-07-27 Gen-Probe Incorporated Automated diagnostic analyzer and method
US20030232388A1 (en) 1999-09-27 2003-12-18 Kreimer David I. Beads having identifiable Raman markers
DK1226422T3 (da) 1999-10-06 2008-04-14 Oxonica Inc Overflade-forstærkede spektroskopi-aktive nano-partikler
WO2002079764A1 (en) 2001-01-26 2002-10-10 Nanoplex Technologies, Inc. Surface-enhanced spectroscopy-active sandwich nanoparticles
JP4513085B2 (ja) * 2001-09-11 2010-07-28 アイキューム インク 試料の容器
US20030053938A1 (en) * 2001-09-19 2003-03-20 Becton, Dickinson And Company. Liquid specimen collection container
US6913825B2 (en) 2001-09-20 2005-07-05 University Of Notre Dame Du Lac Process for making mesoporous silicate nanoparticle coatings and hollow mesoporous silica nano-shells
US20060038979A1 (en) 2004-08-05 2006-02-23 Michael Natan Nanoparticles as covert taggants in currency, bank notes, and related documents
US20050054101A1 (en) * 2003-07-17 2005-03-10 Global Cell Solutions Llc Automated cell culture system and process
US20050191665A1 (en) 2003-12-29 2005-09-01 Xing Su Composite organic-inorganic nanoclusters
US7002679B2 (en) 2004-05-11 2006-02-21 Duke University Encoded excitation source Raman spectroscopy methods and systems
EP1861721B1 (en) * 2005-03-10 2017-05-03 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples
ES2493990T3 (es) * 2006-02-08 2014-09-12 Becton Dickinson And Company Ensayos con nanoetiquetas SERS
US20080025877A1 (en) 2006-05-15 2008-01-31 Alley Kenneth A Specimen collection and testing apparatus
EP2044402B2 (en) 2006-07-24 2016-11-30 Becton Dickinson and Company Apparatus and method for performing an assay using magnetic particles
US7891446B2 (en) 2006-10-06 2011-02-22 Irobot Corporation Robotic vehicle deck adjustment
US7745169B2 (en) * 2006-11-10 2010-06-29 Biolumix Inc. Device and method for the detection and enumeration of multiple groups of microorganisms
EP2461163A3 (en) * 2007-03-20 2012-09-26 Becton, Dickinson and Company Assays using surface-enhanced raman spectroscopy (sers)-active particles
EP2152319B1 (en) 2007-06-06 2015-04-08 Becton Dickinson and Company Near-infrared dyes as surface enhanced raman scattering reporters
ITFI20070275A1 (it) * 2007-12-07 2009-06-08 Diesse Diagnostica Senese Spa "dispositivo e metodo di analisi microbiologica di campioni biologici"
US20090169433A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-02 Sankaran Kumar System for improved biodetection
WO2009102824A1 (en) 2008-02-14 2009-08-20 3M Innovative Properties Company Methods and compositions for detecting microorganisms
JP2011516075A (ja) * 2008-04-09 2011-05-26 バイオニア コーポレーション 自動精製装置、マルチウェルプレートキット及び生物学的試料からヘキサンを抽出する方法
JP5685538B2 (ja) 2008-09-24 2015-03-18 ストラウス ホールディングス インコーポレイテッド 分析物を検出するためのキットおよび装置
AU2010327159B2 (en) 2009-12-04 2013-10-10 Unisensor A/S System and method for time-related microscopy of biological organisms
JP2011163910A (ja) 2010-02-09 2011-08-25 Beckman Coulter Inc 分注精度管理方法、分注量補正方法、攪拌性能管理方法、自動分析装置および分析キット
FR2962445B1 (fr) 2010-07-08 2013-06-28 Biomerieux Sa Procede de detection et d'identification directe d'un microorganisme dans un echantillon biologique dilue dans un bouillon d'enrichissement

Also Published As

Publication number Publication date
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