CN112834749B - 一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用 - Google Patents

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Abstract

一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法及其应用，它涉及一种试纸的制备方法以及应用。本发明为了解决目前阪崎克罗诺杆菌的检测方法中存在的检测时间长、成本高问题，以及提高检测方法的灵敏度的问题。试纸的制备：一、制备单克隆抗体；组装SERS免疫探针；三、试纸条的组装；所述的试纸在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。本发明的试纸测定时间短且易于操作，成本低，具有优异的灵敏度，能够定量检测，本发明的试纸可以简便、快速地定量检测工业.食品中阪崎克罗诺杆菌。

Description

一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用
技术领域
本发明涉及一种试纸的制备方法以及应用。
背景技术
阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)，曾命名为Enterobacter sakazakii，是引起诸如菌血症，新生儿脑膜炎和坏死性小肠结肠炎等传染病的病原体，致死率很高。婴幼儿配方奶粉经常被阪崎克罗诺杆菌污染。欧盟(欧洲委员会，2005年)规定食品中提取30×10克婴幼儿配方奶粉不得存在阪崎克罗诺杆菌。
当前，关于阪崎克罗诺杆菌的检测方法包括有生化反应或聚合酶链反应(PCR)技术、PCR方法、实时荧光PCR方法等，但是这些方法普遍存在检测时间长、检测成本高的问题，基于免疫识别的免疫层析试纸条由于其具有高特异性，以及易于现场检测的特点，引起了越来越多的关注，然而，对于病原体检测，需要提高试纸条的敏感性和准确性。在试纸条检测中，用单克隆抗体标记金纳米颗粒(AuNPs)，导致抗体与抗原特异性结合时由于胶体金的积聚而发生颜色变化实际上，在肉眼观察到颜色变化之前，抗原/抗体已经有少量的结合。因此，在发生少量的抗原/抗体结合时，就需要检测到信号以此来提高检测方法的灵敏度，但是目前的检测方法普遍存在灵敏度低的问题，无法准确的完成检测。
发明内容
本发明为了解决目前阪崎克罗诺杆菌的检测方法中存在的检测时间长、成本高、只能定性检测问题，以及为了提高检测方法的灵敏度，实现定量检测，而提供了一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用。
本发明检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤一、利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020242，保藏日期为2020年12月9日；
步骤二、拉曼报告分子、单克隆抗体添加到胶体金溶液中，得到SERS免疫探针；
步骤三、试纸条的组装；即得到了检测阪崎克罗诺杆菌的试纸。
上述试纸在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用，具体的应用方法：将上述的阪崎克罗诺杆菌试纸条浸入含有待测物的SERS免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了阪崎克罗诺杆菌的检测。
上述步骤一中的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
本发明的试纸是基于免疫层析和表面增强拉曼散射(SERS)的免疫层析试纸，对阪崎克罗诺杆菌的检测具有高度特异性，并通过测定SERS信号大大提高该方法的灵敏度，本发明可以根据测试线的颜色变化在12分钟内通过视觉评估阪崎克罗诺杆菌是否存在，测试线上免疫探针(mAb-Au-PATP)产生的拉曼信号强度与样品中的阪崎克罗诺杆菌浓度高度相关，从而可以准确定量阪崎克罗诺杆菌浓度。本发明的定量检测范围为102～107cfu/mL，LOD为201cfu/mL，准确度为99～104％。本发明的试纸测定时间短且易于操作，成本低，本发明的试纸中拉曼报告分子标记胶体金标记抗体，具有优异的灵敏度，实现了定量检测，本发明的试纸可以简便、快速地定量检测工业食品中阪崎克罗诺杆菌。
附图说明
图1是免疫探针的制备流程图；
图2是不同阪崎克罗诺杆菌浓度检测结果图；
图3是拉曼图；
图4是定量分析得到非线性校准曲线图；
图5是重现性效果图；
图6是特异性效果图；
图7是奶粉中阪崎克罗诺杆菌含量的曲线图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤一、利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020242，保藏日期为2020年12月9日；
步骤二、拉曼报告分子、单克隆抗体添加到胶体金溶液中，得到SERS免疫探针；
步骤三、试纸条的组装；即得到了检测阪崎克罗诺杆菌的试纸。
本发明步骤一单克隆抗体的制备方法：复苏阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544(美国典型培养物保藏中心)，37℃培养20～28小时；然后以3500-5,000×g收集阪崎克罗诺杆菌细胞10分钟，在26℃下，以200-350瓦的声波将颗粒超声破碎30-70次，持续5s，间隔为9s(VCX605，Sonics，美国)；再用等量的50-90％提取裂解液，在40-70℃下保持30分钟，然后在室温下使用5,000-9,000MW的透析管(德国汉堡的Biomol GmbH)透析管透析48小时；透析液用PEG 20000浓缩并纯化，得到粗制LPS(脂多糖)，与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫8周龄BALB/c雌性小鼠，随后每2周免疫一次，共5次免疫(Scharinger等人，2003)；免疫的小鼠处死后收集其脾淋巴细胞，在PEG 1500中以5：1的比例与骨髓瘤细胞融合，筛选后得到具有高抗体活性的杂交瘤细胞(杂交瘤细胞保藏号为CCTCC NO：c2020242)；将杂交瘤细胞(保藏号为CCTCC NO：c2020242)用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基传代培养，并冷冻保存在液氮中；向8周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔注射0.5mL石蜡；7天后，将杂交瘤细胞重悬于RPMI1640培养基中，向小鼠腹膜内注射(Wu等，2015；Scharinger等，2016)。然后收集腹水，并通过辛酸-硫酸铵方法纯化单克隆抗体(mAbs)(Shi等，2018)。使用小鼠单克隆抗体Ig/亚类检测试剂盒(Thermo Scientific，西棕榈滩，美国)确定抗体亚型(Jaradat等，2011)。
本发明步骤二中免疫探针(mAb-Au-PATP)的制备如图1所示，即是通过将拉曼报告分子(PATP)和抗体顺序添加到胶体金溶液中来组装免疫探针(mAb-Au-PATP)。具体方法为：用0.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液至pH为7～9，随后，将8～12mL胶体金溶液与8～12μL1mmol/LPATP溶液混合(PATP标记到胶体金颗粒溶液)，并在25℃下搅拌15min；将混合物在4℃下静置1h，然后将针对阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体(mAb)加入0.5～2mL PATP标记的胶体金颗粒溶液中，在室温下搅拌15min，然后在4℃下静置1h即获得免疫探针mAb-Au-PATP。为了封闭非特异性结合位点，将100μL的5％BSA加入溶液中，并在4℃下放置过夜。最后，5000r/min离心10分钟并用磷酸钾缓冲液重悬，最终的mAb-Au-PATP溶液在4℃下保存。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中的胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备得到。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
本实施方式胶体金的制备方法为：用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，即将超纯水加热至沸腾，然后添加HAuCl4以获取300mL的0.01％水溶液；然后将2-6mL1％柠檬酸三钠溶液添加到沸腾溶液中15分钟后获得胶体金颗粒，并将胶体溶液冷却至室温。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三中试纸条由样品垫、硝酸纤维素膜条和吸收垫组成。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
本实施方式试纸条的制备方法：在硝酸纤维素膜(NC膜)上，分别铺展10μL1 mg/mL包被抗体(具体实施方式一中步骤一制备的单克隆抗体)和10μL山羊抗小鼠IgG(1:50稀释度)，形成一条测试线(T线)和一条对照线(C线)；将分配的膜在室温下干燥1小时；将玻璃纤维膜(作为样品垫)在PB中浸泡24小时(0.5M，pH 7.4，含20％PVP，20％Tween-20)；将硝酸纤维素膜组装在PVC板上；将样品垫和吸收垫附着到硝酸纤维素膜的两端，并且重叠1.5mm；然后将它们切成4毫米宽的条；将条密封在玻璃小瓶中，并在4℃下保存。
具体实施方式四：具体实施方式一所述的试纸在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：将上述的阪崎克罗诺杆菌试纸条浸入含有待测物的SERS(拉曼)免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了阪崎克罗诺杆菌的检测。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
本实施方式本实施方式中显色是通过观察测试线颜色变化来判断样品是否存在阪崎克罗诺杆菌，然后利用拉曼信号确定待测样品中阪崎克罗诺杆菌的含量。
具体实施方式六：本实施方式杂交瘤细胞株，其特征在于杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020242，保藏日期为2020年12月9日。
本实施方式杂交瘤细胞株的制备方法为：
复苏阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544(美国典型培养物保藏中心)，37℃培养20～28小时；然后以3500-5,000×g收集阪崎克罗诺杆菌细胞10分钟，在26℃下，以200-350瓦的声波将颗粒超声破碎30-70次，持续5s，间隔为9s(VCX605，Sonics，美国)；再用等量的50-90％提取裂解液，在40-70℃下保持30分钟，然后在室温下使用5,000-9,000MW的透析管(德国汉堡的Biomol GmbH)透析管透析48小时；透析液用PEG 20000浓缩并纯化，得到粗制LPS(脂多糖)，与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫8周龄BALB/c雌性小鼠，随后每2周免疫一次，共5次免疫(Scharinger等人，2003)；免疫的小鼠处死后收集其脾淋巴细胞，在PEG 1500中以5：1的比例与骨髓瘤细胞融合筛选得到本实施方式的杂交瘤细胞株。
实施例1检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤一、利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020242，保藏日期为2020年12月9日；其中单克隆抗体的制备方法为：复苏阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544(美国典型培养物保藏中心)，37℃培养20～28小时；然后以3500-5,000×g收集阪崎克罗诺杆菌细胞10分钟，在26℃下，以200-350瓦的声波将颗粒超声破碎30-70次，持续5s，间隔为9s(VCX605，Sonics，美国)；再用等量的50-90％提取裂解液，在40-70℃下保持30分钟，然后在室温下使用5,000-9,000MW的透析管(德国汉堡的Biomol GmbH)透析管透析48小时；透析液用PEG 20000浓缩并纯化，得到粗制LPS(脂多糖)，与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫8周龄BALB/c雌性小鼠，随后每2周免疫一次，共5次免疫(Scharinger等人，2003)；免疫的小鼠处死后收集其脾淋巴细胞，在PEG 1500中以5：1的比例与骨髓瘤细胞融合筛选得到具有高抗体活性的杂交瘤细胞(保藏号为CCTCC NO：c2020242)；将杂交瘤细胞(保藏号为CCTCC NO：c2020242)用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基传代培养，并冷冻保存在液氮中；向8周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔注射0.5mL石蜡；7天后，将杂交瘤细胞重悬于RPMI 1640培养基中，向小鼠腹膜内注射(Wu等，2015；Scharinger等，2016)。然后收集腹水，并通过辛酸-硫酸铵方法纯化单克隆抗体(mAbs)(Shi等，2018)。
步骤二、拉曼报告分子、单克隆抗体添加到胶体金溶液中，得到SERS免疫探针；其中SERS免疫探针的制备方法：用0.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液至PH为8～11，随后，将8～12mL胶体金溶液与8～12μL1 mmol/LPATP溶液混合(PATP标记到胶体金颗粒溶液)，并在25℃下搅拌15min；将混合物在4℃下静置1h，然后将针对阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体(mAb)加入0.5～2mL PATP标记的胶体金颗粒溶液中，在室温下搅拌15min，然后在4℃下静置1h即获得免疫探针mAb-Au-PATP。为了封闭非特异性结合位点，将100μL的5％BSA加入溶液中，并在4℃下放置过夜。最后，5000r/min离心10分钟并用磷酸钾缓冲液重悬至原始体积，最终的mAb-Au-PATP溶液在4℃下保存；
步骤三、试纸条的组装；其中试纸条(试纸条的ICA条带)由样品垫、硝酸纤维素膜条和吸收垫组成；其制备方法：在硝酸纤维素膜(NC膜)上，分别铺展10μL1 mg/mL包被抗体(本实施例步骤一制备的单克隆抗体)和10μL山羊抗小鼠IgG(1:50稀释度)，形成一条测试线(T线)和一条对照线(C线)；将分配的膜在室温下干燥1小时；将玻璃纤维膜(作为样品垫)在PB中浸泡24小时(0.5M，pH 7.4，含20％PVP，20％Tween-20)；将硝酸纤维素膜组装在PVC板上；将样品垫和吸收垫附着到硝酸纤维素膜的两端，并且重叠1.5mm；然后将它们切成4毫米宽的条；将条密封在玻璃小瓶中，并在4℃下保存；即得到了检测阪崎克罗诺杆菌的试纸。
上述试纸在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用，具体的应用方法：将上述的阪崎克罗诺杆菌试纸条浸入含有待测物的SERS(拉曼)免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了阪崎克罗诺杆菌的检测。
1、本实施例试纸的定量性能
为了确定用于阪崎克罗诺杆菌分析的本发明试纸的检测限，在优化的分析条件下，以0-107CFU/mL阪崎克罗诺杆菌测定SERS-ICA的定量性能，如图2所示，从图2可以看出，随着阪崎克罗诺杆菌浓度的增加，测试线的颜色变得更深，可以用肉眼观察到的红色的浓度估计为105cfu/mL。
结合了mAb-AuNPs-PATP免疫探针的C.sakazakii和抗原-抗体复合物被测试线上的包被抗体捕获，拉曼信号强度随着C.sakazakii-mAb-AuNPs-PATP复合物中PATP的积累而增加，拉曼结果如图3所示，如图所示拉曼信号强度随着阪崎克罗诺杆菌浓度的增加而增加。
定量分析得到非线性校准曲线图4，如图所示，菌浓度为102cfu/mL时产生的拉曼信号强度为1126.87±24.90a.u.，比空白样品(957.51±57.28a.u.)信号强度更高(P＝0.04)。在菌浓度0cfu/mL的情况下，通过3倍标准偏差计算得出的检测下限(LOD)为201cfu/mL，当阪崎克罗诺杆菌的样品在37℃培养18h时，在这些条件下，根据ISO 22964：2017方法，在缓冲蛋白胨水(BPW)肉汤中细菌浓度达到约201cfu/mL，试纸条可以显示阳性结果。通过预培养步骤，SERS免疫层析试纸条是控制工业生产中阪崎克罗诺杆菌感染的有效方法。
用PATP和抗体标记的SERS纳米颗粒显着改善了条带的LOD，相对于目测评估颜色变化实现的灵敏度提高了大约两个数量级。
2、本实施例纸条检测阪崎克罗诺杆菌的重现性和特异性
为了评估本发明试纸的重现性，在每个阪崎克罗诺杆菌浓度为107至103cfu/mL的条件下进行了十次测量，记录了从测试线中间的点在1081cm-1处平行测量的SERS强度，结果如图5所示，不同菌浓度的相对标准偏差(RSD)分别为3.4％，2.8％，5.2％，5.5％和5.3％，表明具有较高的精密度，重现性与其他有害物质检测技术相类似(Zong等人，2018)。RSD低于条带的可见光信号(Akineden等，2020，Wang等，2012)
通过竞争ELISA方法检测的单克隆抗体(mAb)的特异性和基于免疫色谱结合表面增强拉曼散射试纸条方法的特异性，分别取菌株Cronobacter sakazakii ATCC 128868,Cronobacter sakazakii ATCC 29004,Cronobacter muytjensii ATCC 51329,Cronobacter universalis NCTC 9529,Staphylococcus aureus ATCC25923,Salmonellatyphimurium ATCC14028,Shigella flexneri ATCC29931,Listeria monocytogenesATCC19114,Escherichia coli ATCC25922用竞争ELISA法检测mAb的，结果如表1所示，阪崎克罗诺杆菌3株显示阳性结果，其他菌株显示阴性结果，表明没有与其他病原体的交叉反应。
表1
Figure GDA0002911288460000071
1+＝阳性结果；-＝阴性结果.
本发明的试纸条可特异性的检测阪崎克罗诺杆菌，阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和SERS试纸条对阪崎克罗诺杆菌具有高特异性，对S.aureus，S.typhimurium，E.coli，S.flexneri，L.monocytogenes无交叉反应，SERS试纸条与试纸条中使用的mAb具有相同的特异性，如图6所示。检测阪崎克罗诺杆菌的试纸条上可检测出拉曼信号，而检测非阪崎克罗诺杆菌的试纸条上未检测出拉曼信号。
3、本实施例的试纸(SERS免疫层析)在婴幼儿配方奶粉中检测阪崎克罗诺杆菌的应用
具体方法：通过SERS免疫色谱法测定奶粉(2×102至1.6×106加标菌液)中阪崎克罗诺杆菌的含量，所得曲线如图7所示；并通过平板计数法确定个浓度的阪崎克罗诺杆菌数量，这是目前的权威标准如表2所示。根据SERS免疫层析试纸条测定的值与平板计数测定的值之间的比率来计算评估准确性，结果显示准确度在99％到105％之间，表明本发明的试纸方法可用于奶粉中阪崎克罗诺杆菌浓度的准确测量。灵敏度为201cfu/mL，免疫印迹试验为105cfu/mL，该方法在37℃，18h的培养过程中可检测到1cfu/100g，比ELISA法更灵敏。
表2.通过SERS免疫层析试纸条法检测奶粉中的阪崎肠杆菌(平均值±SD,n＝5)
Figure GDA0002911288460000072
Figure GDA0002911288460000081
本发明的试纸是基于SERS免疫层析获得的，对阪崎克罗诺杆菌的检测具有高度特异性，并通过测定SERS信号大大提高该方法的灵敏度。在该方法中，可以根据测试线的颜色变化在12分钟内通过视觉评估阪崎克罗诺杆菌的存在。测试线上mAb-Au-PATP免疫探针产生的拉曼信号强度与样品中的阪崎克罗诺杆菌浓度高度相关，从而可以准确定量阪崎克罗诺杆菌浓度。其中，定量检测范围为102-107cfu/mL，LOD为201cfu/mL，准确度为99-104％，这是通过与不进行预培养的平板菌落计数进行比较而确定的。根据ISO 22964：2017可知，该方法满足了欧盟委员会(2005)的检测要求，由于测定时间短且易于操作，本发明试纸是简便、快速地定量检测工业食品中特定病原体的有效工具。

Claims (5)

1.一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，其特征在于检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤一、利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020242，保藏日期为2020年12月9日；
步骤二、拉曼报告分子、单克隆抗体添加到胶体金溶液中，得到SERS免疫探针；
步骤三、试纸条的组装；即得到了检测阪崎克罗诺杆菌的试纸；其中步骤一所述的杂交瘤细胞株的制备方法为：复苏阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544，37℃培养20~28小时；然后以3500-5,000×g收集阪崎克罗诺杆菌细胞10分钟，在26℃下，以200-350瓦的声波将颗粒超声破碎30-70次，持续5 s，间隔为9 s；再用等量的50-90％提取裂解液，在40-70℃下保持30分钟，然后在室温下使用5,000-9,000 MW的透析管透析管透析48小时；透析液用PEG 20000浓缩并纯化，得到粗制LPS，与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫8周龄BALB / c雌性小鼠，随后每2周免疫一次，共5次免疫；免疫的小鼠处死后收集其脾淋巴细胞，在PEG 1500中以5：1的比例与骨髓瘤细胞融合筛选得到杂交瘤细胞株；步骤三中试纸条由样品垫、硝酸纤维素膜条和吸收垫组成。
2.根据权利要求1所述的检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，其特征在于步骤二中的胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备得到。
3.如权利要求1所述的试纸在检测婴幼儿奶粉中的阪崎克罗诺杆菌的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于具体的应用方法为：将权利要求1所述的阪崎克罗诺杆菌试纸条浸入含有待测物的SERS免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了阪崎克罗诺杆菌的检测。
5.一种杂交瘤细胞株，其特征在于杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020242，保藏日期为2020年12月9日；所述的杂交瘤细胞株的制备方法为：复苏阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544，37℃培养20~28小时；然后以3500-5,000×g收集阪崎克罗诺杆菌细胞10分钟，在26℃下，以200-350瓦的声波将颗粒超声破碎30-70次，持续5 s，间隔为9 s；再用等量的50-90％提取裂解液，在40-70℃下保持30分钟，然后在室温下使用5,000-9,000 MW的透析管透析管透析48小时；透析液用PEG 20000浓缩并纯化，得到粗制LPS，与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫8周龄BALB / c雌性小鼠，随后每2周免疫一次，共5次免疫；免疫的小鼠处死后收集其脾淋巴细胞，在PEG 1500中以5：1的比例与骨髓瘤细胞融合筛选得到杂交瘤细胞株。
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