CN108795790A - 一种培养基及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种培养，还涉及其制备方法以及用途。一种培养基，包括以下组份：碳源；氮源；pH缓冲剂；所述pH缓冲剂是磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，所述磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的摩尔比例为99:1‑30:70，优选为93.2:6.8‑35.2:64.8；在所述培养基中，pH缓冲剂的磷酸根的总浓度为0.01M‑0.3M，优选为0.75M‑0.125M；所述培养基的初始pH值为6‑9，优选7‑8。该培养基的制备方法较为常规。该培养基的用途，是用作摇瓶发酵培养表达L‑赖氨酸脱羧酶的细菌的培养基。本发明的培养基，成本低廉，制备方法简单，在本发明的培养基中培养的蜂房哈夫尼菌，其细胞OD显著提升，所产的L‑赖氨酸脱羧酶产量也显著提高，发酵液对于相同浓度的L‑赖氨酸的转化率也显著提高。

Description

一种培养基及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种培养基，又涉及该培养基的制备方法，还涉及该培养基的用途。
背景技术
L-赖氨酸脱羧酶是一种可以催化L-赖氨酸脱羧反应并生成二氧化碳和1,5-戊二胺的生物酶。其产物之一的1,5-戊二胺是一个比较常见的二胺化合物。因1,5-戊二胺可以与二元酸聚合生成新型的聚酰胺而备受关注。通过生物法将葡萄糖或L-赖氨酸催化生成1,5-戊二胺，进而制备聚酰胺5.6等，替代依赖于石油来源的尼龙6.6，是一项绿色的化学革命，具有较好的前景。L-赖氨酸脱羧酶主要存在于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)、尸杆菌(Bacterium cadaveris)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)等细菌，也存在于黄瓜等高等植物(Sabo,D.L.,E.A.Boeker,B.Byers,H.Waronand E.H.Fischer(1974)."Purification and physical properties of inducibleEscherichia coli lysine decarboxylase."Biochemistry13(4):662-670；Fecker,L.F.,H.Beier and J.Berlin(1986)."Cloning and Characterization of a LysineDecarboxylase Gene from Hafnia-Alvei."Molecular&General Genetics 203(1):177-184)。为了能够高效地表达L-赖氨酸脱羧酶，通常利用大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌进行发酵表达，或者将表达L-赖氨酸的重组质粒转化到大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌中进行发酵表达。
摇瓶发酵培养是一种简便、实用的培养方法，也因此很快便被发展成为微生物培养中极重要的技术，其可以广泛用于工业微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验、种子培养等。
目前有多种摇瓶培养基用于蜂房哈夫尼菌培养并生产L-赖氨酸脱羧酶，如葡萄糖2％、酵母膏2％、玉米浆4％、MgSO4 0.03％、KH2PO4 0.01％、NaCl 0.5％、L-赖氨酸0.5％、维生素B60.1％(朱婧，杜连祥，路福平，张菊(2008).蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶培养基优化.2008年全国酶制剂研究开发应用技术研讨会论文集.天津:135-138.)，又如：蔗糖2％、玉米浆2％、酵母膏0.5％、牛肉膏0.3％、蛋白胨1％、NaC1 0.5％、硫酸铵0.2％、维生素B6 0.5％、L-赖氨酸0.1％，2-(N-吗啉代)乙磺酸2.13％，pH＝7.0(朱婧，杜连祥，路福平，樊欣迎，武薇(2009).“诱导蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶条件的研究”工业微生物(3):1-5)，又如蛋白胨1％、牛肉浸膏0.3％、氯化钠0.5％(蒋丽丽，吴晓燕，刘毅，刘茜，焦庆才(2006)."赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质."精细化工23(11):1060-1063,1067.)。这三个培养基配方中，第一个较为廉价，后两个成本比第一个较高。为了控制发酵成本，一般选用第一个培养基作为蜂房哈夫尼菌L-赖氨酸脱羧酶生产的发酵液。在发酵罐中使用这个培养基发酵时，可以通过严格控制发酵过程中的参数如供氧、pH、搅拌速率、培养温度等使发酵过程得以持续进行，并保证最终的发酵液中得到较高的细胞密度、较高的L-赖氨酸脱羧酶产出、较高的单位发酵液对L-赖氨酸的转化率以及较高的碳源、氮源利用率；但是因为摇瓶培养过程中无法控制供氧、pH等问题，这些培养基在摇瓶发酵过程中仅能维持较短的发酵时间，导致L-赖氨酸脱羧酶产量并不高，发酵液对L-赖氨酸的转化能力弱，发酵液中的葡萄糖残余量较大，这对成本与产出都是损失。
因此需要对培养基进行改进使得其在发酵中得到最优化。
发明内容
本发明的第一方面目的在于提供一种培养基，使利用该培养基发酵培养蜂房哈夫尼菌生产的L-赖氨酸脱羧酶形成的发酵液对赖氨酸转化率提高，以解决现有培养过程中不控制pH值则转化率低的技术问题。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，实现本发明的目的。
一种培养基，包括以下组份：
碳源；
氮源；
pH缓冲剂；
所述pH缓冲剂包括磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，所述磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的摩尔比例为99:1-30:70，优选为93.2:6.8-35.2:64.8；在所述培养基中，pH缓冲剂的磷酸根的总浓度为0.01M-0.3M，优选为0.05M-0.2M，更优选为0.075M-0.125M；所述培养基的初始pH值为6-9，优选为6.5-8，更优选为7-8。
优选地，所述碳源的含量为5g/L-20g/L；进一步，所述碳源包括下列任一种碳源：葡萄糖，蔗糖，糖蜜，葡萄糖和蔗糖的混合物，葡萄糖和糖蜜的混合物，蔗糖和糖蜜的混合物，葡萄糖、蔗糖和糖蜜的混合物。
优选地，所述氮源的含量为：10.1g/L-49g/L；进一步，所述氮源包括下列任一种氮源：玉米浆；酵母膏；玉米浆和酵母膏的混合物。
优选地，所述磷酸一氢盐可以是磷酸氢二钾和/或磷酸氢二钠，所述磷酸二氢盐可以是磷酸二氢钾和/或磷酸二氢钠。更优选的，所述pH缓冲剂是磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
优选地，所述培养基还包括含微量元素的无机盐。所述含微量元素的无机盐的含量为：1.1g/L-5.5g/L；进一步，所述含微量元素的无机盐包括：可溶性镁盐、钾盐和钠盐中的一种或两种以上；又进一步，所述含微量元素的无机盐包括可溶性镁盐和钠盐；更进一步，所述镁盐的含量为0.1g/L-0.5g/L，所述钠盐的含量为1g/L-5g/L。
进一步，本发明提供了一种成本低廉的培养基，所述的一种培养基，包括以下组份及浓度：
为99:1-30:70，优选为93.2:6.8-35.2:64.8，更优选为68.5：31.5；在所述培养基中，磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的磷酸根的总浓度为0.01M-0.3M，优选为0.05M-0.2M，更优选为0.075-0.125M，又更优选为0.1M；所述培养基的初始pH值为6-9，优选为6.5-8，更优选为7-8。
本发明的第二方面目的在于提出上述培养基的制备方法。
一种培养基的制备方法，所述培养基如上文任一项技术方案所述，包括以下步骤：
1)将所述氮源、所述含微量元素的无机盐溶解在去离子水中；
2)加入所述pH缓冲剂；
3)加入所述碳源的去离子水溶液；
4)灭菌。
本发明的第三方面目的在于提出上述培养基的用途。
一种培养基的用途，所述培养基如上文任一项技术方案所述，所述培养基的用途是用作发酵培养表达L-赖氨酸脱羧酶的细菌的培养基。
进一步，所述表达L-赖氨酸脱羧酶的细菌包括野生型或重组的大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)或产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
本发明的培养基，成本低廉，制备方法简单；本发明的培养基在使用过程中，无需调pH值，能简化发酵工艺；在本发明的培养基中培养的蜂房哈夫尼菌，其细胞OD显著提升，所产的L-赖氨酸脱羧酶产量也显著提高，发酵液对于相同浓度的赖氨酸的转化率也显著提高。
附图说明
图1是对比例4相同初始pH值，不同碳酸钙含量的培养基，发酵过程的pH值变化图；
图2是实施例2不同初始pH值的0.1M的pH缓冲剂的培养基，发酵过程中pH值的变化图；图3是实施例3中不同初始pH值的0.01M的pH缓冲剂的培养基，发酵过程中pH值的变化图；
图4是对比例5、实施例2、实施3不同条件下OD600值的结果图；
图5是对比例5发酵过程的pH值变化图。
具体实施方式
本发明提出了一种成本低廉、用作发酵培养(包括摇瓶发酵、发酵罐发酵)表达L-赖氨酸脱羧酶的细菌的培养基。所述表达L-赖氨酸脱羧酶的细菌是野生型蜂房哈夫尼菌或重组型蜂房哈夫尼菌。
本具体实施方式中的培养基，包括以下组份：碳源；氮源；含微量元素的无机盐；pH缓冲剂；所述pH缓冲剂包括磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的摩尔比例为99:1-30:70，优选为93.2:6.8-35.2:64.8；在所述培养基中，pH缓冲剂的磷酸根的总浓度为0.01M-0.3M，优选为0.05M-0.2M，更优选为0.075M-0.125M；所述培养基的初始pH值为6.0-9.0，优选为6.5-8.0，更优选为7.0-8.0。
优选地，所述磷酸一氢盐可以是磷酸氢二钾和/或磷酸氢二钠，所述磷酸二氢盐可以是磷酸二氢钾和/或磷酸二氢钠。更优选的，所述pH缓冲剂是磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
所述碳源的含量为5g/L-20g/L；进一步，为了提供一种成本低廉的培养基，所述碳源包括下列任一种碳源：葡萄糖，蔗糖，糖蜜，葡萄糖和蔗糖的混合物，葡萄糖和糖蜜的混合物，蔗糖和糖蜜的混合物，葡萄糖、蔗糖和糖蜜的混合物。
所述氮源的含量为：10.1g/L-49g/L。所述氮源包括下列任一种氮源：玉米浆；酵母膏；玉米浆和酵母膏的混合物。
所述含微量元素的无机盐的含量为：1.1g/L-5.5g/L。所述含微量元素的无机盐包括：可溶性镁盐、钾盐和钠盐中的一种或两种以上；又进一步，所述含微量元素的无机盐包括可溶性镁盐、钾盐和钠盐；更进一步，所述可溶性镁盐的含量为0.1g/L-0.5g/L，所述钠盐的含量为1g/L-5g/L。可溶性镁盐如氯化镁、硫酸镁、硝酸镁。钾盐如氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。钠盐如氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠。
进一步，本发明提供了一种成本低廉的培养基，所述的一种培养基，包括以下组份及浓度：
99:1-30:70，优选为93.2:6.8-35.2:64.8，更优选为68.5：31.5；在所述培养基中，磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的磷酸根的总浓度为0.01M-0.3M，优选为0.05M-0.2M，更优选0.075-0.125M，又更优选为0.1M；所述培养基的初始pH值为6-9，优选为6.5-8，更优选为7-8。
上述培养基的制备方法，所述培养基如上文任一项技术方案所述，包括以下步骤：
1)将所述氮源、所述含微量元素的无机盐溶解在去离子水中；
2)加入所述pH缓冲剂；
3)加入所述碳源的去离子水溶液；
4)灭菌。
本发明的培养基，成本低廉，制备方法简单；本发明的培养基在使用过程中，无需调pH值，能简化发酵工艺；在本发明的培养基中培养的蜂房哈夫尼菌，其细胞OD显著提升，所产的L-赖氨酸脱羧酶产量也显著提高，发酵液对于相同浓度的L-赖氨酸的转化率也显著提高。
对比例1
参考文献(朱婧，杜连祥，路福平，张菊(2008).蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶培养基优化.2008年全国酶制剂研究开发应用技术研讨会论文集.天津:135-138.)
中配方配置蜂房哈夫尼菌的摇瓶培养基，配方如下：葡萄糖2％(即20g/L)、酵母膏2％、玉米浆4％、MgSO4 0.03％、KH2PO4 0.01％、NaCl 0.5％、L-赖氨酸0.5％、维生素B60.1％，初始pH＝6.5。
制备方法如下：在烧杯中加入500ml去离子水，并将玉米浆(品名：玉米浆，外观：棕色液体，其中干物质含量41.2wt％，干物质中蛋白质含量43.96wt％，氨氮氮含量1.41wt％，以下对比例、实施例同)、酵母膏(品名：酵母提取物，产品类型：膏状，产品等级：一级，以下对比例、实施例同)、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B6、L-赖氨酸按照配方中的含量加入烧杯中，充分搅拌溶解后定容至900ml。调节pH至6.5(调节pH值的方式采用加入NaOH，以下对比例、实施例同)。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。121℃灭菌15min。使用前在每个摇瓶中加入5ml灭好菌的葡萄糖溶液。
使用的蜂房哈夫尼菌是转化有组成型表达大肠杆菌CadA基因的质粒重组菌，其制备方法如下，将来源于大肠杆菌MG1655(购自北京天恩泽生物技术有限公司)的CadA基因插入到质粒pUC18上lac启动子之后，构得pUCadA，再将重组质粒pUCadA转化到蜂房哈夫尼菌(蜂房哈夫尼菌CGMCC1.1009，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)中，得到重组蜂房哈夫尼菌(以下实施例、对比例同)。将重组蜂房哈夫尼菌在LB的试管种子培养基中培养过夜(16小时，以下对比例、实施例同)后以2％(体积比，以下对比例、实施例同)的转接量转接至上述摇瓶培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的摇床(振幅40mm，以下摇床同)中培养。培养至18h、24h、42h、和48h时取样分析。分析项目主要有葡萄糖残余量、细胞OD600、对赖氨酸的转化率，对赖氨酸的转化率是指以600ul的培养液与400ul的质量浓度为40％的赖氨酸反应2h时的转化率结果。结果如下：
本对比例中重要参数的具体的检测方法如下(下文的对比例、实施例同)：
赖氨酸转化率的测定：取600ul的摇瓶发酵液与400ul的浓度为40％(质量浓度，以下对比例、实施例同)的L-赖氨酸盐酸盐及5ul的0.1M的磷酸吡哆醛混匀。在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中反应2h。反应结束后离心(12000rpm离心3min，常温离心机，品牌及型号Beckman coulter microfuge 16centrifuge，下同)收集反应液上清。上清通过核磁共振分析(Bruker 400MHZ)分别测定反应液中残留的L-赖氨酸以及产生的1,5-戊二胺，通过计算1,5-戊二胺的摩尔量除以L-赖氨酸和1,5-戊二胺的总摩尔量即得发酵液对L-赖氨酸的转化率。
OD600测量方法：将3ml的未培养细胞的培养基加入到1cm宽的比色皿中，在UV-8000紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)中600nm下吸收光(ABS)校零。将比色皿洗净晾干后加入2.9ml未培养细菌的培养基，加入0.1ml的发酵液混匀后在UV-8000紫外可见分光光度计中测试600nm下的吸收光值。仪器显示数值乘以30即为发酵液的OD600。(其他波长下吸收值采用类似方法)。
葡萄糖含量测定：取10支25mL具塞刻度试管编号1-10，每管加入1.5ml的3,5-二硝基水杨酸(DNS)，在1-10号试管中分别加入1mg/mL的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2,1.4，1.6,1.8ml，用蒸馏水补齐至总体积3.5ml；将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上测出540nm下的吸收值，用1号管调零点，测出2～10号管的吸收值；以吸收值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，做出标准曲线。取1ml发酵液经离心后取100ul上清，加入到25mL具塞刻度试管中，加入1.5ml的DNS，用水补齐至3.5ml；在沸水浴中准确加热5min，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，加塞后颠倒混匀，测出540nm下的吸收值；通过标曲换算出参与的葡萄糖含量。
对比例2
本对比例中的培养基的组份和组份的浓度如下：
在培养基中的葡萄糖浓度为16g/L；
在培养基中的玉米浆浓度为38g/L；
在培养基中的酵母膏浓度为2g/L；
在培养基中的氯化钠浓度为3g/L；
在培养基中的磷酸二氢钾浓度为0.1g/L；
在培养基中的硫酸镁的浓度为0.3g/L；
培养基的初始pH为6.5。
制备方法如下：在烧杯中加入500ml去离子水，并将玉米浆、酵母膏、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁按照配方中的含量加入烧杯中，充分搅拌溶解后定容至900ml。调节pH至6.5。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。121℃灭菌15min。使用前在每个摇瓶中加入4ml灭好菌的葡萄糖溶液，并加入1ml灭菌的去离子水。
将重组蜂房哈夫尼菌在LB的试管种子培养基中培养过夜后以2％的转接量转接至上述摇瓶培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中培养。培养至18h、24h、42h、和48h时取样分析。分析项目主要有葡萄糖残余量、细胞OD600、对赖氨酸的转化率，对赖氨酸的转化率是指以600ul的培养液与400ul的浓度为40％的赖氨酸反应2h时的转化率结果。结果如下：
对比例3
本对比例中的培养基的组份和组份的浓度如下：
在培养基中的葡萄糖浓度为20g/L；
在培养基中的玉米浆浓度为30g/L；
在培养基中的酵母膏浓度为1g/L；
在培养基中的氯化钠浓度为3g/L；
在培养基中的磷酸二氢钾浓度为0.1g/L；
在培养基中的硫酸镁的浓度为0.3g/L；
培养基的初始pH为6.5。
制备方法如下：在烧杯中加入500ml去离子水，并将玉米浆、酵母膏、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁按照配方中的含量加入烧杯中，充分搅拌溶解后定容至900ml。调节pH至6.5。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。121℃灭菌15min。使用前在每个摇瓶中加入5ml灭好菌的葡萄糖溶液。
将重组蜂房哈夫尼菌在LB的试管种子培养基中培养过夜后以2％的转接量转接至上述摇瓶培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中培养。培养至18h、24h、42h、和48h时取样分析。分析项目主要有葡萄糖残余量、细胞OD600、对赖氨酸的转化率，对赖氨酸的转化率是指以600ul的培养液与400ul的浓度为40％的赖氨酸反应2h时的转化率结果。结果如下：
对比例4
本对比例中的培养基的组份和组份的浓度如下：
在培养基中的葡萄糖浓度为20g/L；
在培养基中的玉米浆浓度为30g/L；
在培养基中的酵母膏浓度为1g/L；
在培养基中的氯化钠浓度为3g/L；
在培养基中的磷酸二氢钾浓度为0.1g/L；
在培养基中的硫酸镁的浓度为0.3g/L；
在培养基中碳酸钙的最终质量为1、2、3、4、5和6g/L；
培养基的初始pH值为6.5。
制备方法如下：在烧杯中加入500ml去离子水，并将玉米浆、酵母膏、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁按照配方中的含量加入烧杯中，充分搅拌溶解后定容至900ml。调节pH至6.5。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。并加入1-6g的碳酸钙。121℃灭菌15min。使用前在每个摇瓶中加入5ml灭好菌的葡萄糖溶液。
将重组蜂房哈夫尼菌在LB的试管种子培养基中培养过夜后以2％的转接量转接至上述摇瓶培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中培养。培养至18h、24h、42h、和48h时取样分析。分析项目主要对赖氨酸的转化率，对赖氨酸的转化率是指以600ul的培养液与400ul的浓度为40％的赖氨酸反应2h时的转化率结果。结果如下：
发酵过程的pH值变化见下表或图1
对比例5
本对比例中的培养基的组份和组份的浓度如下：
在培养基中的葡萄糖浓度为20g/L；
在培养基中的玉米浆浓度为30g/L；
在培养基中的酵母膏浓度为1g/L；
在培养基中的氯化钠浓度为3g/L；
在培养基中的磷酸二氢钾浓度为0.1g/L；
在培养基中的硫酸镁的浓度为0.3g/L；
培养基的初始pH为8.0。
制备方法如下：在烧杯中加入500ml去离子水，并将玉米浆、酵母膏、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁按照配方中的含量加入烧杯中，充分搅拌溶解后定容至900ml。调节pH至8.0。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。121℃灭菌15min。使用前在每个摇瓶中加入5ml灭好菌的葡萄糖溶液。
将重组蜂房哈夫尼菌在LB的试管种子培养基中培养过夜后以2％的转接量转接至上述摇瓶培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中培养。培养至18h、24h、42h、和48h时取样分析。分析项目主要有葡萄糖残余量、细胞OD600、对赖氨酸的转化率，对赖氨酸的转化率是指以600ul的培养液与400ul的浓度为40％的赖氨酸反应2h时的转化率结果。结果如下：
实施例1
本实施例中的培养基的组份和组份的浓度如下：
在培养基中的葡萄糖浓度为20g/L；
在培养基中的玉米浆浓度为30g/L；
在培养基中的酵母膏浓度为1g/L；
在培养基中的氯化钠浓度为3g/L；
在培养基中的硫酸镁的浓度为0.3g/L；
在培养基中pH缓冲剂磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中磷酸根的总浓度为0.01、0.05、0.1、0.2M，其中磷酸二氢钠中的磷酸根摩尔数占pH缓冲剂中磷酸根总摩尔数比值为68.5％，磷酸氢二钠中磷酸根摩尔数占pH缓冲剂中磷酸根总摩尔数比值为31.5％(以下实施例同)；
培养基的初始pH值为6.5。
制备方法如下：在烧杯中加入500ml去离子水，并将玉米浆、酵母膏、氯化钠、硫酸镁按照配方中的含量加入烧杯中，充分搅拌溶解后定容至800ml。调节pH至6.5。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装40ml。为了使培养基中含0.01M的磷酸盐，添加3.43ml的0.1M的磷酸二氢钠和1.57ml的0.1M的磷酸氢二钠；为了使培养基中含0.05M的磷酸盐，添加3.43ml的0.5M的磷酸二氢钠和1.57ml的0.5M的磷酸氢二钠；为了使培养基中含0.1M的磷酸盐，添加3.43ml的1M的磷酸二氢钠和1.57ml的1M的磷酸氢二钠；为了使培养基中含0.2M的磷酸盐，添加3.43ml的2M的磷酸二氢钠和1.57ml的2M的磷酸氢二钠。121℃灭菌15min。使用前在每个摇瓶中加入5ml灭好菌的葡萄糖溶液。
将重组蜂房哈夫尼菌在LB的试管种子培养基中培养过夜后以2％的转接量转接至上述摇瓶培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中培养。培养至18h、24h、42h、和48h时取样分析。分析项目主要对赖氨酸的转化率，对赖氨酸的转化率是指以600ul的培养液与400ul的浓度为40％的赖氨酸反应2h时的转化率结果。结果如下：
实施例2
本实施例中的培养基的组份和组份的浓度如下：
在培养基中的葡萄糖浓度为20g/L；
在培养基中的玉米浆浓度为30g/L；
在培养基中的酵母膏浓度为1g/L；
在培养基中的氯化钠浓度为3g/L；
在培养基中的硫酸镁的浓度为0.3g/L；
在培养基中磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中磷酸根的总浓度为0.1M；培养基的初始pH为6.3、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。
制备方法如下：
在烧杯中加入500ml去离子水，并将玉米浆、酵母膏、氯化钠、硫酸镁按照配方中的含量加入烧杯中，充分搅拌溶解后定容至800ml。
加入30ml的1M的磷酸氢二钠溶液和70ml的1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至6.3。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
或加入35.2ml的1M的磷酸氢二钠溶液和64.8ml的1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至6.5。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
或加入57.7ml的1M的磷酸氢二钠溶液和42.3ml的1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至7.0。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
或加入84.5ml的1M的磷酸氢二钠溶液和15.5ml的1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至7.5。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
或加入93.2ml的1M的磷酸氢二钠溶液和6.8ml的1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至8.0。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
或加入99ml的1M的磷酸氢二钠溶液和1ml的1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至8.5。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
121℃灭菌15min。
使用前在每个摇瓶中加入5ml灭好菌的葡萄糖溶液齐。
将重组蜂房哈夫尼菌在LB的试管种子培养基中培养过夜后以2％的转接量转接至上述摇瓶培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中培养。培养至18h、24h、42h、和48h时取样分析。分析项目主要对赖氨酸的转化率，对赖氨酸的转化率是指以600ul的培养液与400ul的浓度为40％的赖氨酸反应2h时的转化率结果。结果如下：
发酵过程中pH值的变化见下表或图2
实施例3
本实施例中的培养基的组份和组份的浓度如下：
在培养基中的葡萄糖浓度为20g/L；
在培养基中的玉米浆浓度为30g/L；
在培养基中的酵母膏浓度为1g/L；
在培养基中的氯化钠浓度为3g/L；
在培养基中的硫酸镁的浓度为0.3g/L；
在培养基中磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中磷酸根的总浓度为0.01M；培养基的初始pH为6.5、7.0、7.5和8.0。
制备方法如下：
在烧杯中加入500ml去离子水，并将玉米浆、酵母膏、氯化钠、硫酸镁按照配方中的含量加入烧杯中，充分搅拌溶解后定容至800ml。
加入35.2ml的0.1M的磷酸氢二钠溶液和64.8ml的0.1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至6.5。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
或加入57.7ml的0.1M的磷酸氢二钠溶液和42.3ml的0.1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至7.0。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
或加入84.5ml的0.1M的磷酸氢二钠溶液和15.5ml的0.1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至7.5。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
或加入93.2ml的0.1M的磷酸氢二钠溶液和6.8ml的0.1M的磷酸二氢钠溶液，并调节pH至8.0。分装至250ml的三角摇瓶中，每瓶分装45ml。
121℃灭菌15min。
使用前在每个摇瓶中加入5ml灭好菌的葡萄糖溶液。
将重组蜂房哈夫尼菌在LB的试管种子培养基中培养过夜后以2％的转接量转接至上述摇瓶培养基中，在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中培养。培养至18h、24h、42h、和48h时取样分析。分析项目主要对赖氨酸的转化率，对赖氨酸的转化率是指以600ul的培养液与400ul的浓度为40％的赖氨酸反应2h时的转化率结果。结果如下：
发酵过程中pH值的变化见下表或图3：
对比例5、实施例2、实施3不同条件下OD600值的结果见下表或图4
从图1和图2及对比例4、实施例2的结果中可以看出，初始pH值为6.5的情况下，发酵48小时后最终的pH值也相差无几的情况下，实施例2中发酵液对赖氨酸的转化率远远高于对比例4。而从对比例5及实施例2和实施例3及相关图中可以看出，尽管初始pH值均为8且发酵48小时后pH也相差无几，实施例2和实施例3中发酵液对赖氨酸的转化率远远地高于对比例5。从对比例3和对比例5可以看出，虽然初始pH从对比例的6.5提高到了对比例的8.0，但是发酵液对赖氨酸的转化率并没有明显的提高；在实施例3中，在磷酸盐浓度为0.01M的培养基中，培养基的初始pH从6.5逐步提高到8.0，对应的发酵液对赖氨酸的转化率也逐步提高；在实施例2中，在磷酸盐浓度为0.1M的培养基中，初始pH同样由6.5逐步提高到8.0，但是对应的发酵液对赖氨酸的转化率并没有逐步提高，而是稳定在一个相对较高的值。为此可以认为增加初始pH并不一定能够提高发酵液对赖氨酸的转化率，而高浓度的磷酸盐或者低浓度的磷酸盐辅以高初始pH则可以有效地提高发酵液对赖氨酸的转化率。另外在实施例2和实施例3中，尽管添加了不同浓度的磷酸盐，且其初始pH也不尽相同，发酵到18小时后，其pH值下降到6.0或5.0以上，比对比例的略高，但是这段时间内的发酵液对赖氨酸的转化率并没有明显地比对比例多，而发酵到42小时后，pH值均降低至5.1左右，这段时间内发酵液的pH值与对比例的相差无异，但是实施例发酵液对赖氨酸转化率得到了大幅增加。即在pH存在差异区段，发酵液对赖氨酸的转化率提高的有限，而在pH值趋同区段，发酵液对赖氨酸的转化率有了较高的提高，因此更加证明在本发明中添加磷酸盐缓冲液起到的也不仅仅是提高发酵液的pH，而是由于某些未知作用，引起了发酵液对赖氨酸转化率的极大提高。

Claims (9)

1.一种培养基，包括以下组份：
碳源；
氮源；
pH缓冲剂；
其特征在于：所述pH缓冲剂包括磷酸一氢盐和磷酸二氢盐，所述磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的摩尔比例为99:1-30:70，优选为93.2:6.8-35.2:64.8；在所述培养基中，pH缓冲剂的磷酸根的总浓度为0.01M-0.3M，优选为0.05M-0.2M，更优选为0.075M-0.125M；所述培养基的初始pH值为6-9，优选为6.5-8，更优选为7-8。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述碳源的含量为5g/L-20g/L；进一步，所述碳源包括下列任一种碳源：葡萄糖，蔗糖，糖蜜，葡萄糖和蔗糖的混合物，葡萄糖和糖蜜的混合物，蔗糖和糖蜜的混合物，葡萄糖、蔗糖和糖蜜的混合物。
3.如权利要求1-2任一项所述的培养基，其特征在于：所述氮源的含量为：10.1g/L-49g/L；进一步，所述氮源包括下列任一种氮源：玉米浆；酵母膏；玉米浆和酵母膏的混合物。
4.如权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于，所述pH缓冲剂是磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
5.如权利要求1-4任一项所述的培养基，其特征在于：所述培养基还包括含微量元素的无机盐；所述含微量元素的无机盐的含量为：1.1g/L-5.5g/L；进一步，所述含微量元素的无机盐包括可溶性镁盐、钾盐和钠盐中的一种或两种以上；又进一步，所述含微量元素的无机盐包括可溶性镁盐和钠盐；更进一步，所述可溶性镁盐的含量为0.1g/L-0.5g/L，所述钠盐的含量为1g/L-5g/L。
6.如权利要求1-5任一项所述的一种培养基，其特征在于，包括以下组份及浓度：
磷酸一氢盐和磷酸二氢盐所述磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的摩尔比例为99:1-30:70，优选为93.2:6.8-35.2:64.8，更优选为68.5：31.5；在所述培养基中，磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的磷酸根的总浓度为0.01M-0.3M，优选0.05M-0.2M，更优选0.075-0.125M，又更优选为0.1M；所述培养基的初始pH值为6-9，优选6.5-8，更优选7-8。
7.一种培养基的制备方法，其特征在于，所述培养基如权利要求1-6任一项所述，所述制备方法包括以下步骤：
1)将所述氮源、所述含微量元素的无机盐溶解在去离子水中；
2)加入所述pH缓冲剂；
3)加入所述碳源的去离子水溶液；
4)灭菌。
8.一种培养基的用途，所述培养基如权利要求1-6任一项所述，所述培养基的用途是用作发酵培养表达L-赖氨酸脱羧酶的细菌的培养基。
9.如权利要求8所述的一种培养基的用途，其特征在于，所述表达L-赖氨酸脱羧酶的细菌包括或者是野生或重组大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)或产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
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