JP6226956B2 - 微生物培養試料中の微生物を検出および同定するための方法、システムならびにデバイス - Google Patents

微生物培養試料中の微生物を検出および同定するための方法、システムならびにデバイス Download PDF

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Description

本発明が開示する主題は、培養試料中の微生物を検出、同定および定量するための方法、システムならびにデバイスに関連する。より具体的には、本発明は、微生物が増殖することができる生物学的に封じ込められた試料中の、１以上の微生物を検出および同定するための指標粒子の使用に関連する。
臨床試料（例えば、血液、糞便、尿等）の微生物培養物中の、微量微生物（病原体を含む）を検出することが、近年、非常に重要になってきている。同様に、産業試料（例えば、食物、化粧品および医薬品）中の微生物（病原体を含む）を検出するための微生物培養が、公衆衛生上、重要となっている。そのような微生物検出により、すでに曝露されている人々の治療のための技術だけでなく、例えば食物試料を検証する等、曝露を防ぐための技術ももたらされる。
食品媒介性の疾病（食中毒）は、健康上の問題だけでなく、ヘルスケアのコストという点でも社会に非常に大きなインパクトを与える。ＣＤＣは、毎年、６人に１人のアメリカ人（約４８００万人）が病気になり、１２８，０００人が入院し、食中毒疾患で３，０００人が死亡すると推定している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｆｏｏｄｓａｆｅｔｙ／ｆａｃｔｓ．ｈｔｍｌ を参照のこと）。また、食中毒、特にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよび大腸菌が原因の細菌性の感染症により、毎年、米国において、１５２０億円ものヘルスケア関連のコストがかかっていると推定されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｄｕｃｅｓａｆｅｔｙｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ａｄｍｉｎ／ａｓｓｅｔｓ／ｆｉｌｅｓ／Ｈｅａｌｔｈ−Ｒｅｌａｔｅｄ−Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ−Ｉｌｌｎｅｓｓ−Ｃｏｓｔｓ−Ｒｅｐｏｒｔ．ｐｄｆ−１．ｐｄｆを参照のこと）。
現在の米国にある食物の安全性レベルは、市場のインセンティブ（例えば法的責任、ブランド価値、風評およびより多くの食品を販売したいという希望）に影響された、産業界自身による自己監視と、政府によるレギュレーションが組み合わされた結果である。米国において、食物の安全性に対して第一に責任を負う当局は、Ｕ．Ｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＦＳＩＳ）であり、これが食肉、鶏肉および加工卵食品に対して責任を負い、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）が、実質的に他の全ての食品に対して責任を負う。１９９６年、ＵＳＤＡのＦＳＩＳは、例えば食肉処理工場による大腸菌類の検査を命じる、病原体削減 危害分析重要管理点方式（ｐａｔｈｏｇｅｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｈａｚａｒｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｏｉｎｔ （ＰＲ／ＨＡＣＣＰ） ｒｕｌｅ）を交付した。また、他のＦＳＩＳのレギュレーションにより、２種の致死的な病原体である、インスタント食品や食肉および鶏肉中のＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ならびに、ウシひき肉中の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対する、ゼロリミットが課せられている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｒｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｂｒｉｅｆｉｎｇ／ｆｏｏｄｓａｆｅｔｙ／ｐｒｉｖａｔｅ．ｈｔｍを参照のこと）。最近では、ホウレンソウからこしょう、ピーナッツに至るまで、ここ数年にわたり連続して発生した食中毒の問題によって、この法律に対する緊急性が強調されるようになり、アメリカ連邦議会（Ｃｏｎｇｒｅｓｓ）により、Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｍｏｄｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｔが承認された。
食物検査は、食物試料それ自身、最終製品材料、中間物、または入荷した生の材料のいずれに対して行われても良い。さらに、ＨＡＣＣＰ（Ｈａｚａｒｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｏｉｎｔ）設計では、病原体が食品試料に紛れ込むリスクを最小限にするために、製造環境の制御が行われる。多くのＨＡＣＣＰ設計の一部分として、表面、床、配水管および処理設備から環境試料が採取され、次いで、病原性生物の存在の有無が分析される。もし病原体が検出された場合、単離され、さらなる確認試験に供されることもある。
今日、実施されている全ての食物病原体検査では、試料中に潜在的に含まれている微量の病原微生物を富化させるための培養工程が必要とされる。試料培養の後、その一部を取り出し、病原体の存在について検査を行う。培養後の病原体検査は、イムノアッセイ（例えば、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ’ｓ Ｖｉｄａｓ（登録商標）自動化ＥＬＩＳＡプラットフォーム、またはＳＤＩＸ’ｓ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）ラテラルフローアッセイ等）またはＰＣＲを元にした検査（例えば、ＤｕＰｏｎｔ Ｑｕａｌｉｃｏｎ’ｓ ＢＡＸ（商標）システム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ’ｓ ｉＱ−Ｃｈｅｃｋ（登録商標）システム等）により行われても良い。もし開始試料中に病原体が存在した場合、培養工程により、１．０Ｅ８〜１．０Ｅ９ｃｆｕ／ｍＬもの高さまで病原体濃度が増加され、それにより、培養後に試料を開けると、ユーザーおよび環境の両方が汚染のリスクに曝されることとなる。この曝露のために、多くの食品製造者が現場で病原体検査を実施することができず、代わりに、外部の検査室への試料送付を選択せざるを得なくなる。さらに、どの試料がどのレベルで病原体を含有しているかが不明であるために、食品安全性検査プロトコールでは、ダメージを受けた１個の病原体を十分な時間をかけて検出可能な濃度にまで増殖させるという、最悪のケースに対応するために非常に長い時間、培養を行う。結果として、多量の病原体を有する試料も、厳に必要とされるよりも長い時間をかけて培養されてしまい、それによって、結果を得るまでの時間が長くなってしまう。ゆえに、当分野においては、結果を得るまでの時間を最小化し、施設および職員が培養された病原体に曝露されるリスクを減少させるための病原体検査法が求められている。
同様の懸念が、血液のような臨床試料においても存在する。１９８０年代半ば頃から、免疫低下状態の患者の人数が増加するにつれ、日和見病原体（例えば酵母、真菌およびマイコバクテリア）による敗血症の発生が増加している。菌血症（血流中に細菌が存在）および真菌血症（血流中に真菌または酵母が存在）は通常、静脈血試料を採取し、対象の細菌または真菌の増殖促進に適した増殖培地を含有する血液培養ボトル中に当該血液試料を処置することによって、検出される。概略は、Ｒｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ ａｎｄ Ｆｕｎｇｅｍｉａ，” Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １０（３）， ４４４−４６５ （１９９７）を参照のこと。次いで、血液培養試料を一定期間インキュベートし、細菌または真菌増殖の指標を断続的にチェックしても良い。
血液培養ボトル中の細菌または真菌の増殖をモニターするための、当分野公知の機械化された方法は、主に、血液培養ボトル中の二酸化炭素および／または酸素濃度の変化を検出するものである。これらの機器は、微生物の存在の有無を検出するが、特定のタイプの生物の存在に関して特異的ではない。例えば血液等の、名目上、滅菌されていることとなっている試料については、試料中の微生物の検出が、重篤疾患の指標となり得る。しかしながら、陽性の結果は部分的または予備的な結果であり、通常は、実用的なものとはみなされない。疾患の最適治療は生物体の同定および、その抗生物質感受性の決定に依っており、検査室の職員は、完全なる同定（ＩＤ）および抗生物質感受性検査（ＡＳＴ）に関する、さらに進んだ陽性培養物を得なければならない。生物体の同定には、検査室職員による、さらなる試料検査のための陽性血液培養試料へのアクセスが必要となる。
陽性血液培養の結果（すなわち、微生物の存在は示唆されるが、同定はされていない）の後の試料の精密検査には多くの場合、微生物を生物の大雑把な２つの種類（グラム陽性またはグラム陰性）のうちの１つにカテゴライズすることが含まれる。培養プロセス中のＣＯ２またはＯ２の検出に基づく血液培養アッセイは増殖の有無に対してのみ感受性がある方法であるため、病原性微生物（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と混入菌（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を区別することができない。生物の分類および同定は、血液培養試料中の増殖が検出された後に実施される。例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓとＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、および他の生物を識別するためのキットが入手可能である。また、例えばＳ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ等の生物を識別するためのキットも入手可能である。これらのキットは、しかしながら、少なくとも血液培養ボトルから血液培養試料のアリコットを取り出すこと、および、操作者が病原体に曝露される可能性がある他の手順、または他の分析にも用いることができる血液培養物の一部を破壊する可能性がある他の手順を必要とする。また、多くの場合、これらキットは、熟練されたスタッフが検査を実施する必要があり、そのため、検査室職員が付加的な検査を実施できない状況（例えば、シングルシフトのみで操作する病院である場合等）のときに、血液培養試料が陽性となった場合、実用的な臨床結果の取得が遅れてしまう可能性がある。
今日では血液中の微生物の有無を検出するための機器（例えば、二酸化炭素または酸素センサーを用いたもの）は存在するが、これらの機器は多くの場合、例えば糞便や食物試料等の滅菌されていない試料では用いることはできない。例えば、食物等の試料については、夥しい濃度の良性の微生物が存在することが予測されるため、本質的に、二酸化炭素または酸素センサーによる生物体の検出は有効ではない。食物試料に関しては、良性の微生物叢の高いバックグラウンドの中で、低レベルの病原性生物の存在を検出し、食中毒のまん延を忌避することが非常に重要である。
それゆえ、名目上滅菌された試料の培養工程の間に生物の存在の有無を検出するだけでなく、その生物を同定するための方法、システムおよびデバイスが求められている。滅菌されていない試料（例えば糞便および食物等）に対する、生物学的に封じ込められた方法での培養物中の、有害な可能性がある生物を特定するための方法、システムおよびデバイスもまた求められている。そのような方法、システムおよびデバイスによって、ユーザーの介入が最小限となり、そして、時間、熟練した職員の必要性、および、職員および環境への病原体の曝露の可能性が最小限となる。
本開示の主題の実施態様は、微生物培養物中の、特定の微生物の存在、量を検出し、および／または、同定するための方法、システムならびにデバイスである。１つの実施態様によれば、本開示アッセイは、ユーザーの介入の必要なく、培養と併せて、特定の微生物の検出および／または同定が行われるように、培養管内で実施することができる。１以上の微生物が、単回の培養で同定することができる。培養管は、微生物の増殖ならびに微生物の検出および同定が、ユーザーまたは周囲の環境のいずれにも曝されることなく行われるように、完全に生物学的に封じ込められていても良い。さらに、培養物の生物学的封じ込めにより、培養物の分析は、ユーザーが培養物にアクセスする必要なく、または培養物を洗浄する必要なく、行われ得る。
対象の１以上の微生物に対するアフィニティーを有する、１以上の特異的結合メンバーとそれぞれ結合される、光学活性指標粒子（例えば、表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＳＥＲＳ））活性ナノ粒子等）は、微生物培養試料中の特定の微生物と複合体を形成することができる。ゆえに、光学活性指標粒子は、洗浄工程無しで、培養試料中で検出することができる光学的シグナルを生み出すことができる任意の粒子であっても良い。さらに、対象の１以上の微生物に対するアフィニティーを有する、１以上の特異的結合メンバーと結合される磁気捕捉粒子（指標粒子と結合される特異的結合メンバーと同じであっても異なっていても良い）を用いて、微生物−指標粒子複合体を捕捉し、次なる検出のために、アッセイ管の局所域で複合体を富化することができる。重要なことは、本発明の実施態様において、微生物の活発な増殖が発生している試料中において、微生物を「リアルタイム」で、検出および同定することができる方法、システムおよびデバイスが開示されるということである。試料は、増殖培地および、例えば血液、糞便、尿もしくは脳脊髄液等のヒトまたは動物（家畜等）から採取された臨床試料を含有する微生物培養物を含んでも良い。また、試料は、増殖培地および、例えば食物、乳製品、飲料、水、環境製品、農業製品、パーソナルケア製品（化粧品を含む）、バイオテクノロジーまたは薬剤等の産業試料を含有する微生物培養物を含んでも良い。重要なことは、ユーザーまたは環境に試料が曝されることなく、生物学的に封じ込められた方法で本方法は実施することができ（クローズドシステム）、および、本方法により、培養を進行させながら、経時的にアッセイシグナルをモニターすることにより、２４時間、自動化された微生物の検出および同定が可能となるということである。微生物培養との検出および同定の組合せにより、実用的な結果をより速く入手することができる。
本発明による微生物の検出は、直接的または間接的に行うことができる。培養で増殖中の微生物の直接的な検出に関しては、磁気捕捉粒子および指標粒子と関連する特異的結合メンバーが、例えば、細菌または酵母の表面への結合等により、大部分は無傷である微生物に対するアフィニティーを有しても良い。間接的な検出については、磁気捕捉粒子および指標粒子と関連する結合メンバーが、微生物の副産物に対するアフィニティーを有していても良い。副産物の例としては、限定されないが、分泌タンパク質、毒素および細胞壁成分が挙げられる。直接検出および間接検出の方法を、単独または組み合わせて用いても良い。
本発明の他の実施態様によると、培養試料の所望量を測定するための管が提示される。管には、その中に培養試料を入れるための容器が含まれ、ここで、当該容器は、開放口と閉鎖口を有している。また、管には、液密な接続で、容器の開放口をはめ込むように構成されたフタも含まれる。さらに、管には、フタに連結された、１以上の貯水容器を含むバスケットが含まれ、ここで、当該バスケットは、容器の開放口と閉鎖口との間に配置される。複数の貯水容器が用いられる場合、各貯水容器は、培養試料の異なる量を保持するように作られる。さらに、当該管には、フタとともにはめ込まれる１以上の針アセンブリが含まれ、ここで、当該針アセンブリは、各貯水容器内に伸長する針を含む。各針は、各貯水容器に含有される試料を選択的に引き出すように構成され、ここで、各針はさらに、当該貯水容器から当該バイアルへの、生物学的に封じ込められた状態での試料の移送のためのバイアルをはめ込むように構成される。ゆえに、当該管は、生物学的に封じ込められた様式で、検出バイアルへの試料の移送を容易にしながら、１つの容器で２つの異なるアッセイのための試料（例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａ）の所望量の測定に適したものであっても良い。本発明の他の実施態様において、試料を受けるアッセイバイアルは、真空状態を維持するように構成されたストッパーまたは隔壁およびキャップにより囲まれている。測定管上の針を含有する互換ポートを有するアッセイバイアルキャップの連結により、試料は、生物学的に封じ込められた状態で移送される。バイアルキャップは、移送物からの液体を外部に現れたままに維持させ、移送物表面との接触からユーザーを防御するという特性を有する。
本発明の他の実施態様は、培養試料を含有する多量のチューブを自動的に処理するためのシステムを目指すものである。当該システムには、その中に複数のサンプルチューブを受け取るインキュベーターが含まれ、ここで、当該インキュベーターは、所定の温度でサンプルチューブをインキュベートするように構成される。例えば、当該チューブは、互いに水平に、かつ隣接するように位置づけられても良い。当該インキュベーターは、１つの実施態様によれば、異なる温度で、異なる分析試料をインキュベートするように構成されても良い。当該システムにはさらに、トレイに連結され、インキュベーター内でサンプルチューブが動くように構成された、第一の並進運動デバイス（例えば、Ｙ軸に沿った動きに対する「Ｙステージ」）を含み、ここで、当該第一の並進運動デバイスはさらに、当該インキュベーターから検出領域へとサンプルチューブが動くように構成され、かつ、検出領域内でサンプルチューブが攪拌されるように構成される。例えば、第一の並進運動デバイスは、その縦軸に沿ってサンプルチューブを動かしても良い。当該システムはまた、検出領域内で、多くのサンプルチューブに磁場を与えるように構成された磁石アセンブリ、ならびに、１以上の微生物を検出するための、検出領域内で複数のサンプルチューブのそれぞれを調べるように構成された光学デバイスを含む。当該システムは、光学デバイスに連結され、各サンプルチューブを調べる検出領域内で光学デバイスを動かすように構成された、第二の並進運動デバイス（例えば、Ｘ軸に沿った動きに対する「Ｘ−ステージ」）を含む。当該システムはまた、磁石アセンブリおよび光学デバイスに連結され、第一のトレイの上に垂直に積み重ねられた他のトレイのチューブにアクセスするための検出領域内で磁石アセンブリおよび光学デバイスを動かすように構成された、第三の並進運動デバイス（例えば、Ｚ軸に沿った動きに対する「Ｚ−ステージ」）を含んでも良い。ゆえに、当該システムにより、培養チューブのインキュベーションの間に、リアルタイムで複数のサンプルを処理するための、自動化された、ハイスループットのシステムが提示される。
一般的に本開示主題を記述したが、ここで、付随の図面（必ずしも縮尺通りに描かれているものではない）に対する参照が作成される。
本発明の実施態様に依る、培養試料中の微生物を検出および同定する方法を示す概略図である。 本発明の１つの実施態様に依る、培養試料を含有および移送するための、富化管および検出バイアルを示す概略図である。 本発明の実施態様に依る、培養試料中の微生物の断続的な検出および同定する方法を示す概略図である。 本発明の実施態様に依る、培養試料中の微生物をリアルタイムで検出および同定する方法を示す概略図である。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管の外観を図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管の外観を図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管の外観を図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管の外観を図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管の外観を図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管の断面図である。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管の分解図である。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管に対するフタの底面図である。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管のバスケットの外観である。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管のバスケットの外観である。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管のバスケットの外観である。 本発明の１つの実施態様に依る、検出バイアルのキャップを図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、検出バイアルのキャップを図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、検出バイアルのキャップを図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、検出バイアルのキャップを図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、検出バイアルをはめ込むキャップの断面図である。 本発明の実施態様に依る、検出バイアルをはめ込むキャップの透視図である。 本発明の実施態様に依る、検出バイアルをはめ込むキャップの分解図である。 本発明の実施態様による、検出バイアルをはめ込むキャップの透視図である。 本発明の実施態様による、検出バイアルをはめ込むキャップの分解図である。 本発明の実施態様による、富化管をはめ込む検出バイアルの断面図である。 本発明の実施態様に依る、富化管をはめ込む検出バイアルの断面図である。 本発明の実施態様に依る、富化管をはめ込む検出バイアルの断面図である。 本発明の実施態様による、培養ボトル内の磁気捕捉粒子−微生物−ＳＥＲＳ活性指標粒子複合体を示す概略図である。 本発明の１つの実施態様に依る、ＳＥＲＳ活性指標粒子を示す。 本発明の１つの実施態様に依る、ＳＥＲＳ活性指標粒子を示す。 本発明の１つの実施態様に依る、ＳＥＲＳ活性指標粒子を示す。 本発明の実施態様に依る、４，４’−ジピリジル（ＤＩＰＹ）ラマン活性色素と関連する、ＳＥＲＳ活性指標粒子の代表的なＳＥＲＳスペクトルを示す。 本発明の実施態様に依る、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの培養時間の間にプロットした代表的なＳＥＲＳシグナルを示す。 本発明の実施態様に依る、微生物増殖をリアルタイムでモニターするためのシステムを示す。 本発明の他の実施態様に依る、微生物増殖をリアルタイムでモニターするためのシステムを示す。 本発明のさらなる実施態様に依る、微生物増殖をリアルタイムでモニターするためのシステムの外観を示す。 本発明のさらなる実施態様に依る、微生物増殖をリアルタイムでモニターするためのシステムの外観を示す。 本発明のさらなる実施態様に依る、微生物増殖をリアルタイムでモニターするためのシステムの外観を示す。 本発明のさらなる実施態様に依る、微生物増殖をリアルタイムでモニターするためのシステムの外観を示す。 本発明の実施態様に依る、サンプルチューブを保持するためのトレイの透視図である。 本発明の実施態様に依る、サンプルチューブをトレイに装着する、インキュベーターにトレイを装着する、およびインキュベーターからトレイを取り出す連続的な工程を図示する。 本発明の他の実施態様に依る、サンプルチューブを保持するためのトレイの透視図である。 本発明の実施態様に依る、サンプルチューブを保持するためのトレイの部分図である。 本発明の実施態様に依る、サンプルチューブを保持するためのトレイの部分図である。 本発明の実施態様に依る、サンプルチューブを保持するためのトレイの部分図である。 本発明の実施態様に依る、インキュベーターの透視図である。 図２６〜２９に示されるシステムの様々な断面図である。 図２６〜２９に示されるシステムの様々な断面図である。 図２６〜２９に示されるシステムの様々な断面図である。 図２６〜２９に示されるシステムの様々な断面図である。 図２６〜２９に示されるシステムの様々な断面図である。 本発明の実施態様に依る、インキュベーターの後部ドアの拡大図である。 本発明の実施態様に依る、Ｘ−ステージの透視図である。 本発明の実施態様に依る、磁石アセンブリ、Ｘ−ステージおよびＺ−ステージの透視図である。 本発明の実施態様に依る、低い位置にある、磁石アセンブリ、沈殿／読み取りアセンブリ、Ｘ−ステージ、Ｙ−ステージおよびＺ−ステージの側面図である。 図２６〜２９に示されるシステムの他の透視図である。 本発明の１つの実施態様に依る、磁石アセンブリ、沈殿／読み取りアセンブリ、およびＸ−ステージの部分透視図である。 本発明の１つの実施態様に依る、磁石アセンブリ、沈殿／読み取りアセンブリ、およびＸ−ステージの部分透視図である。 本発明の１つの実施態様に依る、磁石アセンブリおよびＹ−ステージの部分透視図である。 本発明の実施態様に依る、キャビネットに内包された微生物増殖のリアルタイムモニタリングのためのシステムの透視図である。 本発明の実施態様に依る、キャビネットに内包された微生物増殖のリアルタイムモニタリングのためのシステムの透視図である。 本発明の実施態様に依る、培養試料の攪拌および沈殿のための方法を図示する。 本発明の実施態様に依る、沈殿および光学システムを示す。 本発明の実施態様に依る、培養試料を沈殿させるための代わりの磁石アレンジメントを図示する。 本発明の実施態様に依る、培養試料を沈殿させるための代わりの磁石アレンジメントを図示する。 本発明の実施態様に依る、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよび、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの複合的検出を示す。 本発明の様々な実施態様での使用に適したＳＥＲＳ−ＨＮＷ試薬の有無での、血液培養試料に対する、大腸菌増殖の検出までの時間を比較した実験の結果を示す。 本発明の実施態様に依る、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種、ｅｎｔｅｒｉｃａ 血清型 Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（これ以降、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（または、他のＳａｌｍｏｎｌｌａの血清型の名称）と呼称する）の増殖を、それらに対する沈殿効果に関してモニターしたグラフを示す。 本発明の実施態様に依る、微生物増殖に対する沈殿の効果を解説するグラフを示す。 １つの実施態様に依る、固定された磁石で沈殿した後の、水中のＳＥＲＳ−磁性ビーズ前複合体（ｐｒｅｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＣ）のイメージを示す。 １つの実施態様に依る、固定された磁石と異なる攪拌頻度を用いた、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地中のＰＣペレット形成のイメージである。 １つの実施態様に依る、固定された磁石と異なる攪拌頻度を用いた、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地中のＰＣペレット形成のイメージである。 １つの実施態様に依る、連結された磁石および、異なる攪拌頻度を用いた、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ 第二培地中のＰＣ沈殿形成のイメージである。 １つの実施態様に依る、連結された磁石および、異なる攪拌頻度を用いた、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ 第二培地中のＰＣ沈殿形成のイメージである。 本発明の実施態様に依る、シングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）ＳＥＲＳ検出を用いた、血液中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出時間を比較したグラフを示す。 本発明の実施態様に依る、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＳＥＲＳ法を用いた、血液中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出時間を比較したグラフを示す。 本発明の実施態様に依る、マルチプレックスＳＥＲＳ法を用いた、血液中の大腸菌およびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの検出時間を比較したグラフを示す。 本発明の実施態様に依る、好気性培地および抗生物質吸着樹脂での、血液中の大腸菌のリアルタイム検出のグラフを示す。 本発明の実施態様に依る、異なるサンプル量に対する、血液中の大腸菌検出のグラフを示す。 １つの実施態様に依る、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの第二富化の間の様々な時間で撮られた画像と共にＳＥＲＳ曲線を示す。 １つの実施態様に依る、陰性サンプルに対する第二富化の間の様々な時間で撮られた画像と共にＳＥＲＳ曲線を示す。 １つの実施態様に依る、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの第二富化の間の様々な時間で撮られた画像と共にＳＥＲＳ曲線を示す。 １つの実施態様に依る、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの第二富化の間の異なる攪拌率に対するＳＥＲＳ曲線の重ね合わせを示す。 本発明の実施態様に依る、陽性サンプルおよび陰性サンプルそれぞれに対する、ペレットの画像を示す。 本発明の実施態様に依る、食物サンプルでの培養の間の大腸菌のリアルタイム検出に対するＳＥＲＳ曲線を示す。 本発明の実施態様に依る、食物サンプルでの培養の間の大腸菌のリアルタイム検出に対するＳＥＲＳ曲線を示す。 本発明の実施態様に依る、食物サンプルでの培養の間の大腸菌のリアルタイム検出に対するＳＥＲＳ曲線を示す。 本発明の実施態様に依る、食物サンプルでの培養の間の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓのリアルタイム検出に対するＳＥＲＳ曲線を示す。 本発明の実施態様に依る、培養の間のステンレス鋼から綿棒で採取されたＬｉｓｔｅｒｉａのリアルタイム検出に対するＳＥＲＳ曲線を示す。 本発明の実施態様に依る、線形攪拌を用いた、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの検出に対するフェーズのフローチャートを示す。 本発明の実施態様に依る、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、および陰性サンプルに対する第二富化の間のＳＥＲＳ曲線の重ね合わせを示す。 本発明の実施態様に依る、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの第二富化の間に形成されたペレットの画像を示す。 １つの実施態様に依る、Ｓ．ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓおよびＳ．ｋｅｎｔｕｃｋｙの第二富化の間のロッキング攪拌および線形攪拌から得られたＳＥＲＳ曲線を示す。 本発明の１つの実施態様に依る、ＳＥＲＳ試薬の有無での、ＥＤＴＡウサギ血漿中にＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含有するサンプルチューブの画像を示す。 本発明の１つの実施態様に依る、ＳＥＲＳ試薬の有無での、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓでのラテックス凝集アッセイの画像を示す。 本発明の１つの実施態様に依る、磁性粒子およびＳＥＲＳタグの混合物のグラム染色の拡大図である。 本発明の１つの実施態様に依る、磁性粒子およびＳＥＲＳタグでの、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよび大腸菌のグラム染色対照の拡大図である。 本発明の実施態様に依る、ＳＥＲＳ試薬を用いたＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの血液培養で画線した、ＣＨＲＯＭａｇａｒ Ｓ．ａｕｒｅｕｓプレートの画像を示す。 本発明の実施態様に依る、Ｓｅｎｓｉ−ｄｉｓｃ（商標）テストディスクを用いた大腸菌の血液培養で画線した寒天プレートの画像を示す。 本発明の実施態様に依る、試薬の有無での、大腸菌に対する領域直径測定を示す表である。 本発明の１つの実施態様に依る、ＳＥＲＳ試薬の有無での、ＢＤ Ｓｅｎｓｉ−ｄｉｓｃｓ（商標）および様々な微生物を用いた、マニュアルでの抗生物質感受性試験の結果の概要を示す表である。 本発明の実施態様に依る、ａｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌ ＢＤ Ｔａｘｏ（商標）ディスクを敷いた、試薬の有無での、大腸菌およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの血液培養で画線した寒天プレートの画像を示す。 本発明の実施態様に依る、異なる攪拌頻度および沈殿時間を用いた、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地中で形成されたペレットの画像を示す表である。 本発明の実施態様に依る、沈殿分散に対する攪拌頻度の効果を示す表である。 本発明の他の実施態様に依る、富化管を図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、シリンジの断面図である。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管にはめ込んだシリンジの断面図である。 本発明の実施態様に依る、富化管にはめ込んだシリンジの拡大断面図である。 本発明の実施態様に依る、富化管にはめ込んだシリンジの拡大断面図である。 本発明の実施態様に依る、富化管にはめ込んだシリンジの拡大断面図である。 本発明の１つの実施態様に依る、シリンジの拡大断面図である。 本発明の１つの実施態様に依る、シリンジの拡大断面図である。 本発明の１つの実施態様に依る、プランジャーの透視図およびシリンジの断面図である。 本発明の他の実施態様に依る、プランジャーの透視図およびシリンジの断面図である。 本発明の実施態様に依る、再構成ステーションを図示する。 本発明の実施態様に依る、再構成ステーションを図示する。 本発明の実施態様に依る、再構成ステーションを図示する。 本発明の１つの実施態様に依る、組立蛍光シリカナノ粒子の像である。 本発明の１つの実施態様に依る、組立蛍光シリカナノ粒子および普遍的なＳＥＲＳタグのシグナル強度を表すグラフを示す。 本発明の１つの実施態様に依る、ホウレンソウ中のＬｉｓｔｅｒｉａの存在を検出するための、組立蛍光シリカナノ粒子および普遍的なＳＥＲＳタグの経時的なシグナル強度を表すグラフを示す。 本発明の１つの実施態様に依る、キャベツ中のＬｉｓｔｅｒｉａの存在を検出するための、組立蛍光シリカナノ粒子および普遍的なＳＥＲＳタグの経時的なシグナル強度を表すグラフを示す。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管のための容器の透視図である。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管のためのフタの頂点図である。 図１０１に示されるフタの底面図である。 図１０１に示されるフタの底面透視図である。 図１０１に示されるフタの側面図である。 図１０１に示されるフタの断面図である。 本発明の１つの実施態様に依る、富化管に対するバスケットの側面図である。 図１０６に示されるバスケットの頂点図である。 図１０６に示されるバスケットの底面図である。 図１０６に示されるバスケットの透視図である。
本開示の主題を、添付の図面を参照として、以下に、より完全に記述するが、それらは本開示の主題の一部であり、全てが示されるものではない。多くの改変および、本明細書に記述される本開示の主題の他の実施態様が、前述および関連図面の教示による利益を有する本開示の主題の属する分野の当業者には明らかである。それゆえ、本開示の主題は、開示される特定の実施態様に限定されるものではなく、改変および他の実施態様が、添付のクレームの範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書において特定の用語が用いられているが、包括的および記述的な意味において用いられているのみであり、限定の意図は無い。
「１つの」（ａ、ａｎ、およびｔｈｅ）という用語は、クレームを含む本明細書において用いられた場合、「１つ以上」を指す。ゆえに、例えば、「１つの試料」と言及された場合、逆のこと（例えば、複数の試料等）などが明確に文脈にない限りは、複数の試料を含む。
本明細書およびクレーム全体を通じて、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓおよびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という文言は、文脈上、他の意味を有する場合を除き、非排他的な意味で用いられる。
本明細書において、「約」という用語は、値を指す場合、特定の値およびその変動を包含することを意味する。そのような変動は、そのような変動が本開示の方法を実施する、または本開示の組成を用いるのに適切であり、特定された量から、一部の実施態様においては、±１００％であっても良く、一部の実施態様においては、±５０％であっても良く、一部の実施態様においては、±２０％であっても良く、一部の実施態様においては、±１０％であっても良く、一部の実施態様においては、±５％であっても良く、一部の実施態様においては、±１％であっても良く、一部の実施態様においては、±０．５％であっても良く、および一部の実施態様においては、±０．１％であっても良い。
さらに、量、濃度または他の値もしくはパラメーターが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられた場合、任意の上限範囲または好ましい値と、任意の下限範囲または好ましい値の任意の対（たとえ、範囲が別々に開示されていても）から形成される全ての範囲が具体的に開示されているものとして理解されたい。本明細書において数字の値の範囲が列挙される場合、他で述べられない限り、当該範囲は、そのエンドポイント、および範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。本開示の主題の範囲が、範囲を定義する際に列挙された特定の値に限定されることは意図されない。
本発明の実施態様により、Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｎｏ Ｗａｓｈ ａｓｓａｙ（ＨＮＷ）により細菌培養試料中の１以上の微生物を検出および／または特定するための指標粒子（例えば、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）−活性指標粒子）を用いるシステムおよび方法を提示する。より具体的には、本発明の実施態様により、試料内の微生物レベルを経時的に増加させながら、「リアルタイム」で微生物の濃度をモニターするための技術が開示される。指標粒子は、試験用の１以上の微生物に対するアフィニティーを有する１以上の特異的結合メンバーと関連する。１以上の対象の微生物を含有する微生物培養試料と接触した場合、本明細書において通常、指標粒子−微生物複合体と呼称される、対象の１以上の微生物と特異的結合メンバーと関連する指標粒子との複合体が形成され得る。指標粒子−微生物複合体は、磁気捕捉粒子により捕捉され、富化され、局所領域（すなわち、「測定領域」）中に、シグナル測定（例えば、ＳＥＲＳスペクトル）および／または、ペレット画像の外観検査による検出のためのペレットを形成させることができる。本明細書において、「ペレット」という用語は、限定の意図は無く、１つの実施態様において、磁場をかけることにより促進された局所領域に位置する複数の指標粒子と磁気捕捉粒子の集まりを指し、ここで、当該ペレットは目視、光学的、または他の適切な手段を用いて検出することができる。また、当該ペレットに、それらの間に捕捉された微生物が含まれても良く、もし存在すれば、他の成分および／または微生物が、磁性粒子に非特異的に付着していても良い。当該ペレットは、以下にさらに詳述される磁場の除去で分散され得るため、ペレットは一時的に形成されても良い。
さらに、本発明の様々な実施態様は、同じ微生物培養試料内で、経時的にペレットの形成、分散および再形成を行うことにより、ＨＮＷアッセイを繰り返し実施することに関する。これにより、特定検体の濃度が、微生物培養試料内で、リアルタイムでモニターされ、および、微生物濃度が、経時的に変化する場合（例えば、細菌増殖に応じて）に、特に有益なものとなる。より具体的には、本発明の実施態様は、微生物培養管内でＨＭＷアッセイを実施することに関連し、それにより、増殖させながら、微生物を同時に検出および特定することができる。さらに、当該技術は、培養試料をモニターする他の方法と（例えば、ガスセンサーまたは画像分析等）併せて用いることができる。
本発明の実施態様によると、試料の微生物培養は、ＨＮＷ試薬も含有する管内で行われる。培養管を、温度制御されたインキュベーションが可能であり、そして光学デバイス（例えば、ラマン光学、ラマンレーザー、および分光計等）を含む機器へと挿入する。培養の間の一定の時間間隔で磁場を適用し、ＳＥＲＳシグナルを、磁石ペレットから読み取る。当該ペレットは、読み取りの間に分散し、試薬と試料の相互作用を継続させる。標的生物濃度が富化プロセスの間に増加し、微生物濃度が当該技術の検出閾値に到達するとすぐに、ＳＥＲＳ技術による微生物の検出および同定が行われる。培養中にＳＥＲＳシグナルを継続的にモニターすることにより、最低限必要とされる培養時間で済むようになり、および、機器が、微生物が検出および同定されるとユーザーに自動的にアラートすることができるようになる。
さらなる実施態様において、ＨＮＷアッセイの間に、（培養管内の、連結された指標粒子および磁気ビーズおよび標的病原体を含む）ペレットの形成およびサイズをモニターするためのカメラが用いられる。画像により、ペレットサイズの増加が示され、一部の場合においては、ＨＮＷアッセイが進行するにつれ、カメラの画像からのペレットの消失が示される。ペレットサイズの増加および／またはペレットの消失は、標的病原体の存在を示すものである。病原体を伴わない連結指標粒子および磁気ビーズを含有する試料の分析の間に撮られた画像には、ペレットサイズの変化およびペレットの消失は認められない。この検出方法は、単独で用いることができ、または他の検出方法と併せて用いることができる。
Ｉ．微生物培養試料中の微生物の検出および同定に関する概論
本明細書において、「微生物培養試料」という用語は、培養培地（例えば、試料中に存在すると推測される１以上の微生物の増殖を支持することができる、血液培養液等）中に処理された、培養培地と混合された、または培養培地と組み合わされた微生物を含有する可能性を持つ、「臨床」または「産業用」試料を含有する組成物を指す。より具体的には、本発明の実施態様により、臨床試料（例えば、血液、糞便、尿または脳脊髄液等）または産業製品試料（例えば、食物、環境中の綿棒またはスポンジ、水、化粧品、衛生用品、医薬品）、または、動物もしくはヒトにより使用または消費されることが意図される他の製品のいずれかにおける微生物の増殖を支持することができる培地を含有する微生物培養試料中の微生物を検出するための方法、システムおよびデバイスが提示される。
特に光学的な方法を用いた、または分光法を用いた、微生物培養試料中の微生物検出、および／または、同定には、試料基質のその複雑性により、多くの困難をはらむ。臨床試料、特に例えば血液または糞便等の臨床試料は光学的に吸収性であるため、オリジナルの試料にある、光学的に干渉する成分を除去するための洗浄工程または溶解工程無くしては、光学的シグナルまたは分光シグナルを検出することは困難である。例えば食物や化粧品試料等の産業試料も光学的に吸収性である可能性があり、やはり、オリジナルの試料中の光学的に干渉する物質を除去するための洗浄工程または溶解工程が必要となる。哺乳類細胞および微生物の検出にＳＥＲＳを適用すること、および、血液または食物試料の存在下での様々な検体の検出にＳＥＲＳ活性指標粒子を診断適用することが報告されているが、微生物増殖によって濃度が変化する中で、「リアルタイム」で細菌および真菌の濃度をモニターするための、ＳＥＲＳ活性指標粒子の適用は報告されていない。本明細書において、「リアルタイム」は限定の意図は無く、連続的に培養試料をモニターすること、または既定の延長時間の中で培養試料をモニターすることを言及しても良い。例えば、培養試料は、試料を開けることなく（それによって、試料の生物学的封じ込めが維持されながら）、既定のインキュベーション期間にわたり、既定の延長時間（例えば、３０分毎、１時間毎等）の中で繰り返し検証されても良い。本明細書において、「生物学的封じ込め」もまた限定の意図は無く、例えば、培養試料が封じ込められている容器の外側の周辺環境が、培養される微生物に曝されることがないようなクローズドシステム中にある、培養試料を指しても良い。
さらに、本開示方法により、検出中の微生物の増殖を阻害しない方法で、微生物培養中の指標粒子を、診断的に使用することが可能となる。
微生物が増殖する間に病原体の有無を検出するための現在の方法（例えば、血液培養キャビネット等）は、生物を特異的に検出するのではなく、むしろ非特異的な代謝産物（例えば、二酸化炭素等）を検出するものである。ゆえに、これらのセンサーは、他のプロセス（例えば、酸化、分解および、血液試料中の正常な微生物叢である、血液培養細胞（例えば哺乳類細胞）の呼吸等）により産生された二酸化炭素によって、間違って作動してしまう可能性がある。この重大な「血液バックグラウンド」シグナルは、陽性アルゴリズムを複雑化させ、全体的な分析感度を低下させる重要なノイズ源である。一方、特異的結合イベントから発生したシグナル（本開示方法に記述される）は、病原体の存在を示す明確な指標であり、誤る可能性は少ない。
本発明の様々な方法により、単一バイアル配置内にある全てのものを継続的に増殖させ、検出し、同定することが可能となる。さらなる同定情報（例えば、グラム染色情報または同定）と共に、ＳＥＲＳ−ＨＮＷ技術により、２４時間（２４時間／１週間につき７日間）、陽性試料の増殖でアラートを出すことができる培養システムが可能となる。増殖の有無を検出する、現在市販されている血液培養システムとは対照的に、ＳＥＲＳ−ＨＮＷアッセイは、微生物または微生物の種類の同定を提示することができる。ＳＥＲＳおよび磁性粒子に連結される抗体を選択して、グラム陰性細菌に対するグラム陽性細菌を特異的に同定することができる。重要なことは、ＳＥＲＳ技術固有の複合的な性能は、血液培養および産業応用にとってキーとなるということである。
例えば、血液培養キャビネットで用いられている、既存のガスベースのセンサーは、良性微生物の高レベルのバックグラウンドが予測されるため、試料（例えば、糞便、食物または環境試料等）中の病原性微生物の存在の検出には不適である。現在のところ、食物または環境試料中の病原体をリアルタイムで検出する方法は無い（通常、これらのタイプの試料は、培養の間に増殖するバックグラウンド（良性）微生物を有しており、増殖ベースのセンサーは、標的病原体の増殖と、バックグラウンド生物の増殖をと区別することができないため）。
さらに、微生物同定のための既存の方法では、試料調製および／または洗浄工程を組み合わせて干渉成分を除去し、バックグラウンドシグナルを最小化させ、および／または、光学的に透明である試料を作製する必要がある。試料の調製および洗浄が必要となるため、これらの方法は、培養が進行している中では適用することができない。
ＳＥＲＳ−ＨＮＷアッセイでは、汚濁し、または単離されていない試料においても読み取ることができるラマンシグナルを作り出すことにより、洗浄工程の必要性という課題を克服する。また、複雑な基質中の複合的な検出および同定も可能であるため、血流中の感染物質または食品病原体の複合的な検出に適している。これらのＨＮＷアッセイの特性は、従前に開示されている。しかしながら、全ての公知の開示情報において、ＨＮＷアッセイは、単一の試料に対し、一度だけ適用される（すなわち、１つのペレットが形成され、「答え」（同定＋検出）を作製するために読み取られる）。ＨＮＷアッセイの実施により、培養におけるリアルタイムモニタリングという特殊な要件、特に：
−培養物の生存能力を維持する必要性（微生物との複合体形成は、増殖を阻害しない）；
−磁性ペレットが形成された時点でそれを確実に再現性良く分散させることにより、ＳＥＲＳおよび磁性試薬を、継続的に試料と相互作用させること；
−ＳＥＲＳ−ＨＮＷアッセイシグナルを、標的濃度の継続的な変化に対応して、経時的に増加および減少させること；および
−要求される試薬量に桁違いの費用がかかり、および／または、全体量を表すペレットを形成することは不可能であろうと当初予測される、血液培養および産業応用において通常用いられるような大容量で、ＨＮＷアッセイを行うことができること（どんな合理的な大きさの磁場も、局所の微小環境から磁性粒子を引き出すのみであることが予測される）
に対応できることは何も示唆されていない。
本発明の実施態様によるＨＮＷアッセイを用いて、食物または環境試料中で増殖する、例えば大腸菌、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ等の病原体を検出することができる。損傷を受けた１匹の微生物の存在でさえも重要であるため、通常は試料を培養して病原体を回収し、検出レベルにまで選択的に増殖させる。当初の試料は、様々な病原体濃度、病原体の様々な損傷レベル、および／または、非常に多様な競合バックグラウンド微生物を有している可能性があるため、任意の所与の分析法の検出限界に達するまでに必要とされる培養時間も広範に変化し得る。このため、検出プロトコールは、通常、「最悪のケース」のシナリオに対して組まれる。すなわち、長い培養時間が選択され、ただ１匹の損傷を受けた病原体が検出レベルまで確実に増殖するようにする。次いで、培養が完了した時点で、病原体の検出および同定（例えば、イムノアッセイまたはＰＣＲによる）を実施する。任意の所与の試料中の病原体の当初量は経験的に不明であるため、全ての試料を、この長い培養プロトコールに供し、全ての病原体を逃さないようにする。しかしながら、多くの試料は、より短い培養プロトコールで陽性の検出および同定を行うことができ、より速く、試料に問題があることを検査者に通告できる可能性がある。ＳＥＲＳベースのＨＮＷアッセイと、培養とを組み合わせることにより、培養の間に、試料の病原体量をリアルタイムでモニターすることができ、培養プロトコール中、可能な限り早く、高い病原体量を有する試料を検出することができるという大きな利点が生まれる。
ＩＩ．微生物培養試料中の微生物の特定のためのシステム、方法およびデバイス
本発明の実施態様は、培養試料中の微生物を検出および同定するための方法、システムならびにデバイスを目的とする。図１に関連して、通常、当該プロセスには、複数の指標粒子、結合メンバーおよび磁気捕捉粒子を管に入れるステップと、１以上の微生物を含有する可能性のある試料を添加するステップとが含まれる。当該管はまた、微生物の選択増殖または付加的増殖に役立つ培養物、または、増殖培地を含んでも良い。次いで、当該試料をインキュベートし、所定の期間、攪拌する。インキュベーションの間に選択された時点で、または既定のスケジュールで、ペレットが形成されるように管に磁場を適用する。次いで、当該ペレットに、検出および分析される、検出可能なシグナル（例えば、ＳＥＲＳスペクトル）を発する光を当てて調べる。次いで、当該ペレットを分散させ、次の所定の時点で当該プロセスを繰り返しても良い。
図２において、培養試料中の微生物を検出および同定するために用いられ得る、技法およびデバイスの１つの実施態様を示す。この点において、図２は、環境試料の所望される量（例えば、約１Ｌか、それ以下）、食物試料の所望される量（例えば、約２５ｇ〜３７５ｇで、約２５０ｍＬ〜３Ｌの量になる）、または臨床試料の所望される量（例えば、約１００ｍＬかそれ以下）を得て、富化管内に置くことを図示する。この例において、富化管は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａアッセイの分析を促進するように構成されている。既定量の試料を、富化管を規定の期間、インキュベートした後、生物学的に封じ込められた方法で検出バイアルへと移す（以下の詳述される）。次いで、検出バイアルを、さらなるインキュベーションおよびＳＥＲＳ技術を用いた自動化分析のための、リアルタイムＳＥＲＳシステムに置く（これもまた、以下に詳述）。
１つの実施態様によると、ＳＥＲＳシステムは、複数の検出バイアルに適応し、それによってハイスループットなシステムがもたらされるように構成されている。ＳＥＲＳシステムはまた、複数の異なるアッセイの自動的な分析を促進するように構成されていても良い。例えば、ＳＥＲＳシステムは、各アッセイを操作し、分析するための専用の領域を含んでも良い。
本発明の実施態様によるシステムおよび方法により、微生物培養試料中の微生物増殖をリアルタイムでモニタリングすることが提示される。図３において、微生物増殖の断続的なモニタリングの実施態様、またはエンドポイントの実施態様が示されている。この実施態様において、ＳＥＲＳ−ＨＮＷ試薬１は、培養が行われる管２へと添加される。培地３および試料４は、管２へと添加され、そして管２は、微生物（例えば、細菌、酵母または細胞等）が増殖できるように、インキュベーター５内へと置かれる。ユーザーが選択した時点（培養の間、または培養期間の最後）で、管はインキュベーター５から取り出され、ＳＥＲＳリーダー６へと置かれ、試料の適切な混合の後で、磁性ペレットを形成し、ラマンシグナルが読み取られる。次いで、もしラマンシグナルが検出されなかった場合には、当該管をインキュベーター５へと再挿入し、さらなる増殖時間を取っても良い。
図４において、細菌増殖の間、継続的にＳＥＲＳシグナルがモニターされる別の実施態様を示す。この実施態様において、インキュベーターおよびＳＥＲＳリーダーは、１つの機器７へと統合され、既定の時点で、磁性ペレットを形成し、ＳＥＲＳシグナルを読み取り、ユーザーの介在の必要なく、試薬を分散させる。
Ａ．富化管および検出バイアル
本開示の方法、システムおよびデバイスでの使用に適した微生物培養ボトル、チューブ、シリンジ、バイアル、管等（例えば、富化管および検出バイアル）は、一部の実施態様において、ガラスまたはプラスチックから作製されても良い。一部のアプリケーションにおいて、重層的なプラスチックが、ガス透過性を制御するために望ましい。微生物培養管が重層的なプラスチックで作製されている実施態様において、当該ボトルは、射出成形またはブロー成形されていても良く、および、ナイロン、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、ポリエチレンビニルアルコールまたはそれらのコポリマーもしくは混合物の中間層により分離される、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、またはそれらの任意のコポリマーもしくは混合物の内層および外層を有していても良い。しかしながら、当該管は、他の実施態様においては、重層的なものでなくとも良く、かつ、類似の技術（例えば、射出成形またはブロー成形）を用いて形成されていても良いことを理解されたい。一部のアプリケーションにおいて、当該管の構成要素は、管／試料の相互作用を制御するための、または物理的特性を制御するための表面コーティングまたは化学的な技法で処理されていても良い。一部の実施態様において、当該管は、可視光に対して透明であっても良いが、特定の実施態様においては、そのような透明性は必要とされていない。さらに一部の実施態様において、本開示の管は、滅菌対応であっても良い。さらなる一部の実施態様において、当該管は、好気性または嫌気性培養に適する。１つの実施態様において、当該管は、ガス透過性である。さらに、当該管は、その長さに沿って、沈殿形成および光学的分析を向上させ得る、一定した壁の厚さを含んでいても良い。
図５Ａ〜５Ｅおよび７において、本発明の１つの実施態様による、富化管５０を図示する。任意選択的に、富化管５０は、乾燥または液体の培養培地を保持していても良い。通常、富化管はフタ５２、バスケット５４、針アセンブリ５６、および容器５８を含んでいる。フタ５２は、バスケット５４にはめ込まれており、液密な接続で容器５８をはめ込み、密封するように構成されている（例えば、ねじ式の接続またはスナップ式の接続を用いて）。１つの例において、フタ５２は、容器５８上に装着されていても良いが、バックオフ機構の付加的な取り外し作業（例えば、取り外すために、フタを押して回す等）なしにフタが外れてしまうことを防ぐための、１以上のバックオフ機構を含んでいる。ゆえに、フタ５２、針アセンブリ５６およびバスケット５４は、容器５８をユニットとしてはめ込み、および取り外すことができるように、共に連結されていても良い。例えば、フタ５２およびバスケット５４は、スナップ式で共に連結されていても良く、または他の適切な技術（例えば、接着剤、熱かしめ、または留め金具等）を用いて共に連結されていても良い。この点において、図９Ｃに、バスケット５４が、フタとバスケットを共に固定するための留め金具６２とはめ込むための留め金具穴６０を含む図を示している（図５Ａも参照のこと）。図８は、それを通して留め金具６２を受け取るためのバスケット上の各穴６０（図９Ｃを参照のこと）と並ぶ、複数の穴６５を含むフタの底を示す。同様に、針アセンブリ５６は、類似の固定技術（例えば、圧力ばめ、ねじ式はめ込み、または接着剤等）を用いて、フタ５２に付着されていても良い。容器５８は、その中に所望の量の試料を保持するように構成されており、ゆえに、必要に応じて、様々なサイズおよび形態となっていても良い。例えば、図５Ａ〜５Ｃ、７および１００において、容器５８の例示的な形態を図示する。１つの実施態様において、バスケット５４および容器５８は、容器内の可視性、特に貯水容器６４、６６内の試料の可視性を上げるために透明であっても良く、または半透明であっても良い。さらに、図１００において、容器５８が、容器内に含有される試料の量を可視化するために、１以上の体積線５９を含み得ることを図示する。図７はまた、管５０が、フタ５２と容器５８の間の液密な接続を確実にするために用いられるガスケット６８または他の密封部材を含み得ることを示す。
富化管５０は、針アセンブリ５６と貯水容器６４、６６のペアを含む。しかしながら、別の実施態様では、１以上の針アセンブリ５６と貯水容器６４、６６を含み得ることを理解されたい。図示された実施態様においては、１つの針アセンブリ５６と貯水容器６４または６６が、特定のタイプのアッセイ（例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＬｉｓｔｅｒｉａ）で使用のために構成されている。異なる微生物は、異なる培地および異なる試料サイズを用いて培養されるが、富化管によって、異なるアッセイに対して単一のバスケットを用いることが容易となる。
バスケット５４は、図９Ａ〜９Ｃに詳細に示されている。バスケット５４は、貯水容器６４、６６（各貯水容器は、所定の試料体積を保持するように構成されている）のペアを含む。示されるように、貯水容器６４、６６は、容器５８の底から離れて置かれており、このスペースは、所望の試料を保持するために構成されている。この点において、第一の貯水容器６６は、第二の貯水容器６４よりも大きな体積を保持できるように構成されている。１つの特定の実施態様において、第一の貯水容器６６は、約５ｍＬを保持するように構成され、第二の貯水容器６４は、約１００μＬを保持するように構成されている。示されるように、貯水容器６４、６６は、試料の測定ならびに、各針アセンブリ５６との位置合わせを容易にするように形作られていても良い。例えば、図５Ａ〜５Ｃおよび６において、各針７０は、貯水容器６４、６６内に挿入されており、そして実質的に全ての測定試料が確実に取り出せるように、その中の最も低い位置に、挿入されていることを図示する。第一の貯水容器６６の中に伸長する針は、第二の貯水容器６４の中に伸長する針よりも長いため、針７０の長さは、貯水容器のサイズにより調製されても良い。貯水容器６４、６６の形は、所望量の試料を保持するのに適した任意の形であっても良い。例えば、図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｅおよび９Ｂにおいて、第二の貯水容器６４が概して円錐状の形を有する一方で、第一の貯水容器６６は、針に沿って伸長し、針の基部に向かって細くなる表面を有していることを示す。
図９Ｃは特に、バスケット５４が、それを通り規定される多くの穴７２、７４を含むことを図示する。典型的には、容器５８の試料の量は、容器が直立の位置にあるときには穴７２よりも下にあり、しかし、所望の量が測定されるように、少なくとも各貯水容器６４、６６に対する入り口よりも下にある。穴７２は、貯水容器に隣接するバスケット内に規定されても良く、一方で、穴７４は、フタはめ込み部７８に隣接するバスケットの上面７６を通って規定されても良い。貯水容器６４、６６に隣接する穴７２は、各貯水容器内の過剰な試料を排出するように構成されている。すなわち、富化管５０が、貯水容器６４、６６のうちの１つを満たすための直立水平の位置から傾いている場合、当該管を直立位に戻すことにより、貯水容器に試料が満杯以上に入り、過剰量の試料が、次いで、穴７２を通じて排出される。そのようにして、所望量が各貯水容器６４、６６内で繰り返し測定される。バスケット５４の上面７６に規定される穴７４を用いて、望ましくない試料中の微粒子が貯水容器へと移されることを防ぎつつ、試料を貯水容器６４、６６へと入れても良い。バスケット５４は、測定される試料の量、試料のタイプにより改変され得る（例えば、貯水容器６４、６６のサイズと深さ、ならびに穴のサイズと深さを改変する）ことを理解されたい。この点において、図９Ｃに、穴７２、７４（貯水容器に隣接する穴７２への入り口は、バスケットの上面７６の穴７４への入り口よりも大きい）が、排出を補助するために、互いに異なる方向で先細りになり得ることを図示する。より小さな穴の入り口を用いて、望ましくない任意の粒子を貯水容器に入らないようにろ過しても良い。さらに、図１０６〜１０９において、ほぼ同じサイズである穴７２、７４をバスケット５４が含む場合の実施態様を図示する。さらに、バスケット５４はまた、バスケットを通じて液体を排出するのに役立つよう構成された、リブ（ｒｉｂ）７５または他の高くなった表面を有しても良い。特に、リブ７５を、バスケット５４の中心に位置させて、バスケットの上面７６の残りの穴とは異なる排出機構を有する、バスケットを超えた過剰の液体を排出させることができる表面を与えることにより、ろ過および排出の間の放出を促進させても良い。図１０６および１０８において、貯水容器６４、６６の底面が、１以上の突起１１９（貯水容器から液体をウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）させ、複数の排出穴７２からの液体をまとめさせることにより排出を容易にする）を有し得る実施態様を図示する。
図９Ｂに示されるように、各貯水容器６４、６６は、各頭部スペース８０、８２によりバスケットの上面７６から分離される。頭部スペース８０、８２は、容器が傾けられた際に、試料が各貯水容器６４、６６に入るのを容易にする。ゆえに、容器５８が傾けられた際、試料は、バスケット５４の上面７６に規定される穴７４を通して、頭部スペース８０、８２へと入り、および、貯水容器６４、６６に入る。容器５８が直立位に戻ると、貯水容器６４または６６は、頭部スペース８０または８２にある過剰量の試料により満杯となり、次いで、ここで、過剰量の試料は、貯水容器に隣接して規定される穴７２を通って排出され、容器へと戻る。図９Ｂに示されるように、貯水容器６４、６６に隣接して規定される穴７２は、貯水容器へと導く開口部の下に位置し、所望量の試料の排出および測定を容易にする。
各貯水容器６４、６６は、図５Ａ〜５Ｃおよび６に示されるように、各針アセンブリ５６と並んでいる。１つの実施態様において、フタ５２は、フタはめ込み部位７８を含み、ここで、当該フタはめ込み部位は、上述のようにバスケット５４とフタとが共に連結されるように構成される。フタはめ込み部位７８およびバスケット５４は、容器内に挿入されるように構成されるために、容器５８の開口部の内径よりも、小さな外形を有している。フタはめ込み部位７８はまた、貯水容器６４、６６内へと伸長する各針アセンブリ５６を受け取るための開口部を有していても良い。針７０は、当該針が、以下にさらに詳述される検出バイアルをはめ込むために構成されるように、フタはめ込み部位７８内に位置する。この点において、フタはめ込み部位７８は、針アセンブリ５６を受け取り、はめ込むように構成された各開口部１０２、１０４の反対側にある、円錐または先細りの表面１０５を含む。針７０はさらに、円錐表面１０５の底面に規定される各開口部を通って、頭部スペース８０、８２へと、および各貯水容器６４、６６内に伸長する（図５Ａ〜５Ｃおよび６を参照のこと）。図６において、各針アセンブリ５６が、針７０が貯水容器６４、６６に近接して伸長するような、フタはめ込み部位７８とはめ込まれ得ることを図示する。図６において、フタ５２がまた、培養の間に圧力が高まるのを防ぐために、任意の無害な、ガス状の副産物を容器から逃させるための、その中に規定されるベント８６を有し得ることを図示する。図１０２〜１０３および１０５において、ベントポスト１２５がフタ５２の底面から伸長している別の実施態様を図示する。ベントポスト１２５は、容器５８を出る任意のガス状の副産物をろ過するためのフィルターを受け取り、はめ込むための、それを通じる開口部を規定する。ベントポスト１２５は、ベント８６と並んでいる。この点において、ベントポスト１２５は、無害な、ガス状の副産物が、当該ベントポストの開口部を通り、そしてフタ５２の上面に規定されるベント８６を通るように誘導するように構成される。
また、図１０２〜１０３および１０５において、フタ５２がさらに、フタの底面から外側に伸長する、はめ込みポスト１２７を含み得ることを図示する。はめ込みポスト１２７は、図１０６、１０７および１０９に示されるように、バスケット５４の上面から外側に伸長する、対応するはめ込みポスト１２９と並び、そしてはめ込むように構成される。図示されるように、はめ込みポスト１２７は、はめ込みポスト１２９よりも小さな直径を有しているが、当該ポストの相対サイズは、もし必要であれば、逆転しても良い。さらに、図１０３〜１０５に示されるはめ込み部位７８は、バスケット５４の上面上に規定される、対応するはめ込み部位１２１をはめ込むように構成される（図１０６、１０７および１０９を参照のこと）。特に、はめ込み部位７８は、はめ込み部位１２１を覆い、および取り囲むような大きさであっても良く、そのように構成されても良い。はめ込み１２１表面の外側の周辺は、複数のリブ１２３を規定し得る。はめ込み表面７８および１２１を、互いにはめ込ませる場合（例えば、互いに対してスライディングさせる、および／または回転させることにより）、リブは、リブ１２３を圧迫するように構成されても良い。圧迫は、リブ５２とバスケット５４の間に十分な摩擦適合を生じさせるのに十分であっても良い。１つの実施態様において、リブ１２３は、摩擦適合を生じさせるために、押しつぶされても良く、またはさもなければ変形されても良い。
各針アセンブリ５６は、各検出バイアル１００をはめ込むように構成される。検出バイアル１００は、フタ５２内に規定される各開口部１０２、１０４と係合するための特定のキャップ構造を含んでも良い。ゆえに、各キャップは、微生物にとって良くない培地を用いるリスクを最小限にするために、試料の特定のタイプに関連し得る。例えば、フタ５２は、キャップが鍵穴１１０をはめ込むように正しく位置づけられた場合にのみ、検出バイアルのキャップと合致させる、適合させた開口部１０４を有していても良い（図６を参照のこと）。図１０１は、鍵穴１１０が、円錐表面１０５に沿い、開口部１０４の長さに沿って規定される場合の、フタ５２の別の実施態様を示す。鍵穴１１０は、図６に示されるように、開口部の内面上に規定されても良く、または、図１０１〜１０３に示されるように、開口部の内面および外面の両方の上に規定されても良い。
図１０Ａおよび１０Ｂにおいて、検出バイアルとの使用に適したキャップ１０６の例示的な実施態様を図示する。この点において、キャップ１０６は、フタ５２の開口部１０４中に規定される各鍵穴１１０をはめ込むように構成される、複数のリブ１０８を含む（図５Ｄを参照のこと）。ゆえに、キャップ１０６を開口部１０４内に挿入するために、リブ１０８は、鍵穴１１０内に放射状に並べられる必要がある。さらに、キャップ１０６は、スナップ式に検出バイアル１００をはめ込むように構成される複数のはめ込み機構１１２を含む。スナップ連結は、検出バイアル１００の楕円化、ならびに操作中のキャップ１０６の外れを最小化しても良い。キャップ１０６および検出バイアル１００は、他の適切な技術（例えば、ねじ式、または圧着されたスリーブ管／キャップはめ込み、接着剤、超音波溶接、および／または、熱かしめ等）を用いて、共に固定されても良いことを理解されたい。図１３Ａにおいて、本発明の１つの実施態様による、検出バイアル１００にはめ込まれたキャップ１０６を図示する。
上述のように、キャップ１０６は、不正確な検出バイアル１００を用いるリスクを排除するために、異なるアッセイに対して異なる構成を有しても良い。例えば、図１１Ａおよび１１Ｂは、別のキャップ１１４構造を図示し、図１４Ａは、検出バイアル１００にはめ込まれたキャップ１１４を示す。図示されるように、各キャップ１０６、１１４は、複数のリブ１０８を含んでも良く、および、はめ込み機構１１２を有していても良い。キャップ１１４は、各開口部１０２内で受け取られるように構成されても良いが、開口部は、対応する鍵穴を含むことを必要とはしない。ゆえに、キャップ１１４は、その放射状の方向に関わらず、開口部１０２内で受け取られても良いが、キャップ１１４は、開口部１０４内に挿入されることはできない。ゆえに、キャップ１１４の外形が、開口部１０４へのアクセスを妨げるように、キャップ１０６のリブ１０８は、フタ５２の開口部１０２へのアクセスを妨げ得る。
図１２、１３Ｂおよび１４Ｂは、本発明の１つの実施態様による、検出バイアル１００およびキャップ１１４の付加的な特性を図示する。いわゆる、キャップ１１４は、ストッパー１１６および、キャップとストッパーの間に配置される、吸収性パッド１１８を含む。吸収性パッド１１８を用いて、富化管５０から検出バイアルへと試料を移した後に検出バイアル１００を出る任意の試料を吸収し、それにより技術者または環境への曝露を最小限としても良い。キャップ１１４はまた、濡れている可能性のあるパッドへの偶発的な接触を避けるための、指のスタンドオフ１１７を有しても良い。さらに、ストッパー１１６は、検出バイアル１００と液密な接続を形成するように構成される任意の適切な物質（すなわち、液体およびガス）であっても良く、ならびに、針により穴を開けられた後に液密に再密封し、検出バイアルにはめ込むための、針により穴を開けられるように構成される任意の適切な物質であっても良い。例えば、ストッパー１１６は、適切なゴムまたは弾性物質であっても良い。また、図１２において、はめ込み機構１１２と検出バイアル１００の突起１１５の間のはめ込みを図示する。ゆえに、キャップ１０６、１１４は、スナップ式で検出バイアル１００にはめ込まれても良く、キャップの意図されない除去または移動を防ぐ。突起１１５の形態は、はめ込み機構１１２とスナップ式を維持することができる任意の形態であっても良い。
検出バイアル１００は、試薬を含んでも良く、および任意選択的に、試料中で検証される微生物によっては、例えば特異的増殖培地等の培地を含んでも良い。試薬および培地は、乾燥した（例えば、脱水された）形態で検出バイアルに存在しても良く、または湿った（例えば、水和した）形態で検出バイアルに存在しても良い。例えば、培地および試薬は乾燥されていても良い。検出バイアル１００はまた、ストッパー１１６がそれにはめ込まれている場合には、真空を維持していても良い。ゆえに、検出バイアル１００がフタ５２の各開口部１０２、１０４内に挿入される場合、ストッパー１１６および吸収性パッド１１８は、針７０により穴が開けられ、そして貯水容器６４または６６内の試料は、針を通じて引き出され、検出バイアルへと入る（図１５〜１７を参照のこと）。１つの例において、開口部１０２または１０４へと伸長する針７０の部分は、検出バイアル１００が下方に押され、針とはめ込まれると圧縮されるように構成された、防御スリーブ管１２０を含んでいても良い。防御スリーブ管１２０が圧縮される場合、針７０は露出され、ストッパー１１６を貫通し、それにより、当該真空が、貯水容器６４または６６内に入っている試料部分を引き出す。液体の移送および検出バイアル１００の取り出しが完了した後、防御スリーブ管１２０は、針７０を覆う、元の形態へと戻される。そのようにして、富化管５０と検出バイアル１００の間の試料移送が、生物学的封じ込めの様式で行われる。各検出バイアル１００内の真空は、貯水容器から所望される量の試料を引き出すのに十分な任意の量であっても良い（例えば、５ｍＬの試料に対しては、８〜１０ｍＬの引き出し力）。検出バイアル１００の任意のさらなる余剰の真空は、貯水容器６４または６６からの液体の後の空気により使い果たされる。
検出バイアル１００は、エンドユーザー（例えば、社内使用か、アウトソースして使用するか）によって、培養物もしくは増殖培地、ストッパー１１６、パッド１１８、およびキャップ１０６もしくは１１４（真空の有無はどちらでも）が有っても、または無くても、試薬と共に提供されても良い。このような感じで、検出バイアル１００は、試薬の保持のためのみで、ストッパー１１６のみにアセンブリされていても良く、一方で、キャップ１０６または１１４は、検出バイアルの内部へとアクセスする必要があるユーザーのために別々に供給されても良い。あるいは、検出バイアル１００は、図１２に示されるように、ストッパー１１６、パッド１１８およびキャップ１０６、１１４の組合せであらかじめアセンブリされていても良い。さらに、培地および試薬の量は、１つの実施態様によると、最初の富化量ではなく、検出バイアル１００により決定される。
こうして、富化管５０と検出バイアル１００の構造により、生物学的に封じ込められた状態で試料が入れられ、そして移送されることができ、それによって、技術者または施設が曝露されることを減らすことができる。富化管５０はまた、試料の所望される量を正確に測定することを容易にし、一方で、複数のタイプの試料に適合するように構成される。例えば、異なるアッセイ、培地、および試料の量を利用することができる場合、これは特にＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＬｉｓｔｅｒｉａに対して有用である。富化管５０および検出バイアル１００はまた、富化管および検出バイアルの間の合致機構を組み込むことにより、正しくないバイアルが検証に用いられるリスクを減少させるように構成される。
図８６および８８において、富化管１２５の別の態様を図示する。前述のように、管１２５は、液密に容器１２８にはめ込まれたフタ１２６を含む。示されるように、富化管１２５は、フタ１２６から容器１２８内へと伸長する縦方向のシリンジサポート１３０を含む。シリンジサポート１３０は、フタ１２６に取り付けされても良く、またはそれと一体的に形成されても良い。シリンジサポート１３０は、その中にシリンジ１３４を受け取るように構成された開口部１３２を含み、多くの場合、シリンジ１３４と合致する関係性で形作られる。シリンジサポート１３０のベースではめ込まれるのは、ハブ１３３および針１３５を含む針アセンブリであり、ここで、当該ハブは、シリンジサポートにはめ込まれ、当該針は、容器１２８内に伸長し、それを通じて試料を引き出すように構成される。針１３５は、シリンジ１３４内の針の部分を覆って伸長する圧縮性のカバー１４１を含んでも良い。上述されるように、フタ１２６は、無害な、ガス状の副産物を容器から逃させるためのベント１３１を含んでも良い。
図８７において、通常、ハンドル１３６、ハンドルに連結されたプランジャーロッド１３７、キャップ１３８、プランジャーロッドの末端に連結されたプランジャー１３９、隔壁１４０、およびシール１４６を含む、シリンジ１３４の１つの実施態様を図示する。図８７においてさらに、容器１２８の外へ試料を引き出す間に適用される牽引力を支持するために、例えばツイストロックインターフェース１４２等により、開口部１３２にはめ込まれるようにシリンジ１３４が構成されることを図示する。ゆえに、プランジャー１３７は、シリンジ１３４内で縦方向に動かすことが可能である。隔壁１４０は、針により穴を開けられ、当該針の除去で再密封されるように構成される。他の実施態様において、隔壁１４０はまた、隔壁を通じて流れ出る任意の液体によるユーザーの汚染を防ぐための、吸収パッドおよびスタンドオフ機構を含む。シール１４６は、液密な接続を生じさせるために、シリンジ１３４およびキャップ１３８にはめ込まれる。シリンジ１３４はまた、開口部１３２内に配置された、第一のより大きな穴１４９、および第二のより小さな穴１５１を含むネック領域１５７を含んでも良い。図８７および８８に示されるように、より小さな穴１５１の部分は、より大きな穴１４９内に伸長するように、エクステンション１５３は、ネック領域１５７からより大きな穴１４９へと伸長する。以下に詳述されるように、エクステンション１５３とネック領域１５７のベースとの間に規定される、１以上のスロットまたは開口部１５５があっても良い。
図８９Ａ〜８９Ｃにおいて、容器１２８からシリンジ１３４へと試料を取り出す際の、開始位置、「ソフト」ストップ、および「ハード」ストップの進行を図示する。図８９Ａに示されるように、シリンジ１３４がシリンジサポート１３０にはめ込まれる際、プランジャー１３９は、開始位置の針１３５に隣接して位置づけられ、容器１２８とシリンジ１３４との間で、針を介した液体流通が行われるように、カバー１４１を圧縮するよう構成される。図８８において、シリンジ１３４がシリンジサポート１３０にはめ込まれる際に、針１３５が隔壁１４０を貫通するように構成されることをさらに図示する。プランジャーロッド１３７は、シリンジ１３４から外側に引き出されるため、試料の部位１４４は、針１３５を通って引き出され、穴１５１へと入り、および、プランジャーロッド上の第一のはめ込み機構１４５は、さらなるその引き出しを止めるためにシール１４６をはめ込む。この方法において、試料は、所望される速度で引き出され、それにより、試料の引き出しを防ぐために、液体は、真空に付いていくことができる。
図８９Ｃにおいて、プランジャーロッド１３７は、シリンジ１３４からさらに引き出され、それによって、プランジャーロッド１３７上の第二のはめ込み機構１４７は、プランジャーロッドのさらなる引き出しを防ぐためにシール１４６をはめ込む。さらに、第一のはめ込み機構１４５は、プランジャーロッド１３７がシリンジ１３４から外へさらに動かされることを防ぐシール１４６内に規定されるポケット１４８内にはめ込まれる。図８９Ｃに示されるように、プランジャー１３９は、穴１５１がもう閉じられないようにプランジャーロッド１３７およびプランジャー１３９が位置づけられることにより、これ以上真空に引かれないようにシリンジ１３４のエクステンション１５３内に位置されても良い。すなわち、プランジャー１３９がもう開口部１５５を覆わない場合、穴１４９および１５１は、真空にもう引き出せないような、互いに液体流通している状態にある。さらに、プランジャーロッド１３７とシール１４６のはめ込みにより、プランジャーロッドが、シリンジ１３４へと引き戻されないようになり、ユーザーもプランジャーを引き出すことができず、試料に曝されるリスクから守られる。
図９０Ａおよび９０Ｂにおいて、プランジャーロッド１３７の他の実施態様を図示する。プランジャーロッド１３７は、キャップ１３８内に規定されるスロット内にスライドするように構成される、縦方向リブ１５９を含む。さらに、図９０Ｂにおいて、プランジャー１３７が、リブ１５９をスロットから外し、プランジャーがシリンジ１３４へと戻らないようにキャップ１３８をはめ込むために、ねじることができることを示す。
図９１および９２において、容器１２８から異なる量を引き出すために用いても良い、別のプランジャーロッドおよびプランジャーを図示する。この点において、図９１は、図８７、８８および８９Ａ〜Ｃと関連して記述されるものに対応する。ゆえに、プランジャー１３９は、より小さな穴１５１（例えば、約１２５μＬ）へ少量を引き出すのに適している。従って、プランジャーのサイズおよびプランジャーロッドの長さは、必要に応じて変化し得る。他の実施態様において、図９２は、より大きな穴１４９（例えば、約５ｍＬ）へと試料を引き出すのに適したプランジャー１６１を示す。ゆえに、シリンジ１３４は、試料の異なる量を引き出すための異なるプランジャーでの使用に適しており、異なる微生物（例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）に対する検証に有用である。さらに、ユーザーは、シリンジ１３４およびプランジャー／プランジャーロッドのアセンブルされたものを受け取っても良く、または、ユーザーは、試薬、再構成液体等を加え、次いで、シリンジに対し、プランジャー／プランジャーロッドをアセンブリしても良い。
本発明の実施態様に依る、微生物培養試料中の１以上の微生物を検出および同定する方法は、微生物培養管で実施しても良い。微生物培養管は、その中に１以上の指標粒子、および１以上の磁気捕捉粒子（各々、１以上の検証される微生物に対するアフィニティーを有する１以上の結合メンバー（例えば、抗体）と関連する）を配置しても良い。指標粒子および磁気捕捉粒子は、１以上の検証される微生物を含有すると推測される臨床試料または産業試料を配置する前に、同時に、または後で、微生物培養管に配置されても良い。培養増殖培地は、臨床試料または産業試料の添加の前、同時に、または後で、微生物培養管に入れられても良い。指標粒子、磁気捕捉粒子、培養培地、および臨床試料または産業試料が培養管内に入れ、次いで、培養管を継続的または断続的に攪拌し、指標粒子および磁気捕捉粒子を、組合せ試料および培養培地と混合する。本明細書に記述される好ましい実施態様において、攪拌プロファイル（例えば、スピードおよび／または移動）は、培養または読み取りサイクルのステージの差異で変化し得る。臨床試料または産業試料に存在する場合、１以上の検証される微生物は、指標粒子および磁気捕捉粒子と関連する１以上の結合メンバーと結合し、磁気捕捉粒子−微生物−指標粒子複合体を形成することができる。
指標粒子がＳＥＲＳに活性である場合、培養管２内の磁気捕捉粒子−微生物−ＳＥＲＳ活性指標粒子複合体の例を図１８に示す。ＳＥＲＳ活性指標粒子１０は、検証される１以上の微生物１２に対するアフィニティーを有する特異的結合メンバー１１の１以上と関連する。磁気捕捉粒子１３はまた、検証される１以上の微生物１２に対するアフィニティーを有する特異的結合メンバー１４の１以上と関連する。磁気捕捉粒子１３は、１以上の微生物１２と結合することができ、それらはまた、ＳＥＲＳ活性粒子１０と結合することもでき、それにより磁気捕捉粒子−微生物−ＳＥＲＳ活性粒子複合体を形成し、それらはまた、本明細書において、サンドイッチ複合体をとも呼称され、ここで、当該微生物は、２以上の特異的結合メンバーにより同時に結合されている。この特定のサンドイッチ複合体において、少なくとも１つの特異的結合メンバー１４が磁気捕捉粒子１３に付着し、そして少なくとも１つの他の特異的結合メンバー１１がＳＥＲＳ活性指標粒子１０に付着する。ゆえに、微生物１２は、磁気捕捉粒子１３とＳＥＲＳ活性指標粒子１０との間で「サンドイッチ」される。
磁場を、磁石１５を介して試料に適用し、磁気捕捉粒子１３を引き寄せ、磁気捕捉粒子−微生物−ＳＥＲＳ活性指標粒子複合体を、ＳＥＲＳシグナルを検出するための培養管２の内側の測定領域９内のペレットへと局在させる。次いで、光源１６からの放射を当該ペレットに当て、ＳＥＲＳシグナルをラマン検出器１７により検出しても良い。光源１６および検出器１７を用いて、ＳＥＲＳ活性指標粒子１０により発せられるラマン痕跡をそれぞれ導入、および測定する。検出領域で磁性粒子に結合しているＳＥＲＳ活性指標粒子を局在化することによる、磁気捕捉粒子−微生物−ＳＥＲＳ活性指標粒子複合体の局在化によりＳＥＲＳシグナル（その強度は、微生物濃度を反映している）がもたらされ、それにより、溶液中に残っている、未結合のＳＥＲＳ活性指標粒子と分けることができる。
一部の実施態様において、測定領域は、微生物培養ボトルまたは管の内面に沿って位置することができる。例えば、ボトルに関しては、測定領域は、ボトルネック内の内面、またはボトルネックに隣接する内面に沿って位置することができ；ボトル中央部を含有する内面に沿って位置することができ；または例えば別のセンサー（例えば、蛍光ベースのセンサーまたは比色分析ベースのセンサー）に隣接するボトルの底面に沿った内面に沿って位置することができ、別のセンサーが存在しない実施態様においては、基盤の内面、すなわち、微生物培養ボトルの底面に沿って位置することができる。１つの好ましい実施態様において、測定領域は、多くの場合、培養ボトルまたは管の中央部での内面に沿って位置される。ゆえに、測定領域は、ボトルもしくは管の末端よりも、ボトルもしくは管の中心に、または中心により近い位置にあっても良い（例えば、管の中央５０％内）。
対象の１以上の微生物の検出および／または同定は、微生物（複数含む）が、結合メンバー−微生物−指標粒子複合体の一部としてペレット中に結合される場合にのみ達成される。すなわち、１以上の微生物が微生物培養試料中に存在しない場合、または、もし存在しても、微生物が指標粒子と関連する結合メンバーにより認識されるエピトープを有していない場合には、シグナルは発生しない。そのような環境下では、指標粒子は、測定領域に実質、存在しない。
磁場を適用しても、およびペレットの光学的調査を行っても明らかなＳＥＲＳシグナルが観察されない場合、ペレットに入った磁性粒子は、試料との相互作用を継続させるために、溶液中へと再び分散された可能性がある。もし当該技術の検出限界以下の微生物が存在する場合、微生物濃度は培養培地中で微生物が増殖するにつれ経時的に増加するはずであり、その後に磁場を与えれば、ＳＥＲＳシグナルは測定領域中で最終的には検出される。要するに、シグナルが結合メンバー−微生物−指標粒子複合体から観察されるまで、または、試料が対象の微生物に対して陰性であると決定されるまで、磁性ペレットは、形成され、光学的に調査され、分散され、試料と相互作用し、次いで、特定の頻度で再形成される。本プロセス中の様々なステージでの培養管の攪拌が、重要な役割を果たし得る。攪拌は様々な目的を果たす。第一に、ＳＥＲＳおよび磁性粒子と、試料および培養培地の混合を確実なものとし、結合メンバー−微生物−指標粒子複合体を形成させる。第二に、ペレットが形成された時点での磁性粒子の溶液への再分散を可能とする。第三に、好ましい実施態様においては、磁場が適用される間に攪拌を行うことができる。磁場適用中の攪拌により、培養管内の様々な空間点から、局所的な磁場フィールドへと液体を持ち出すこととなり、それにより、磁性粒子が、局所的な磁場フィールドの外側の試料領域から確実に採取される。最終的に、粒子（例えば、樹脂、木炭、または炭酸カルシウム等）を含有する試料中において、沈殿前および沈殿中の攪拌により、これらの粒子数が、検出領域に入り、光学シグナルに干渉することを制限することができる。異なる攪拌率およびプロファイルが、これらの異なる機能のそれぞれに対して最適なものであっても良い。
例えば、異なる攪拌率（例えば、頻度）および「スロー（ｔｈｒｏｗ）」（すなわち、軸に沿ったバイアルの移動）が、測定サイクルの異なる段階で用いられても良い。１つの例示的な実施態様において、測定サイクルは、各段階が特定の攪拌率およびスローを有する、混合、沈殿前の分散、沈殿、読み取り、および分散が含まれても良い。この点において、混合には、攪拌がインキュベーションの間に行われる段階（沈殿前分散は混合の後および沈殿の前に行われる）が含まれる。沈殿は、沈殿前分散の後に行われ、その後、読み取り段階となる。読み取り段階は、読み取りヘッドによるバイアルの調査に相当し、分散段階は、バイアル内で再分散される沈殿に対して行われる。各段階の間の遅延はあっても無くとも良い。１つの実施態様において、各段階に対する攪拌率およびスローは、それぞれ、約０〜３Ｈｚおよび約０〜１００ｍｍの範囲であっても良い。例えば、以下の攪拌率およびスローを、本発明の実施態様に従い用いても良い：混合−約０．５〜１．５Ｈｚおよび２５〜７５ｍｍ；沈殿前分散−約１〜２Ｈｚおよび２５〜７５ｍｍ；沈殿−約０．５〜２Ｈｚおよび２５〜７５ｍｍ；読み取り−０Ｈｚおよび０ｍｍ；ならびに、分散−約１〜２Ｈｚおよび約２５〜７５ｍｍ。さらに、各段階の特定の期間もまた変化しても良い。例えば、混合段階は、沈殿前分散、沈殿、読み取り、分散段階（例えば、約５〜１２０秒／段階）よりも、かなり長く（例えば、５〜６０分）ても良い。
図２３において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対する、磁気捕捉粒子により捕捉された結合メンバー−微生物−指標粒子複合体の時間依存性ＳＥＲＳシグナル強度の一例を示す。多くの場合、ＳＥＲＳシグナルの上昇の始まりは、微生物の存在を暗示している。この点において、約６時間の培養の後で微生物の存在が示唆され、約９時間でのピークで、高濃度の微生物が示唆される。しかしながら、図２３においても示されるように、例えば約１２時間での、ＳＥＲＳシグナルの下降でも、微生物は存在し続ける可能性がある。この例において、下降はまた、微生物の存在を意味する可能性があり、あるケース（例えば、多くの微生物がインキュベーションの始まりで存在している場合）における、陽性を特定する有用な手段となり得る。そのようにして、ＳＥＲＳシグナルの上昇または下降のいずれかが、培養試料中の微生物の存在を暗示し得る。この点において、ＳＥＲＳシグナルにおけるそのような変化を特定するために、インキュベーション期間の間の長い期間、定期的に読み取りが行われても良い。
Ｂ．指標粒子
本明細書において「指標粒子」とは、試料を除去することなく（例えば、洗浄工程の実施等）、培養試料中で直接検出することができるシグナルを発生させることができる任意の粒子であっても良い。例えば、指標粒子は、（例えば、光源と共に）調査された際に、任意の光学的シグナル（例えば、蛍光またはラマンまたは光学的な画像）を発生させても良い。指標粒子の例としては、ＳＥＲＳ活性粒子、量子ドット、近赤外フルオロフォア、または近赤外蛍光粒子が挙げられる。
「表面増強ラマン散乱」または「ＳＥＲＳ」とは、ラマン活性分子がある金属（例えば、金または銀等）の表面の上で、または近接して（例えば、約５０Å内）吸収された際、ラマン散乱シグナルまたは強度が増強される場合に発生する現象を指す。そのような環境下で、ラマン活性分子から発生するラマンシグナルの強度は、増強されることができる。「表面増強共鳴ラマン散乱」または「ＳＥＲＲＳ」とは、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子表面に近接したレポーター分子が励起波長で共鳴した際に発生する、増強されたＳＥＲＳシグナルを指す。「ラマン散乱」は多くの場合、分子上の光子入射の非弾性の分散を指す。非弾性に分散された光子は、入射光の頻度（ｖ０）とは異なる光学頻度（ｖｉ）を有する。入射光および非弾性的な散乱光の間のエネルギーの差（ΔＥ）は、（ΔＥ）＝ｈ｜ｖ０−ｖｉ｜と表されることができ、ここで、ｈはプランク定数であり、分子により吸収されたエネルギーに相当する。入射放射線は、任意の頻度ｖ０であっても良いが、通常、可視スペクトル領域または近赤外スペクトル領域にある単色放射線である。絶対差｜ｖ０−ｖｉ｜は赤外線（例えば振動）の頻度である。「ラマン分散された」放射線の頻度ｖ１は、ｖ０よりも大きくても小さくても良いが、頻度ｖ１＜ｖ０（ストーク放射線）を有する光の量は、頻度ｖ１＞ｖ０を有するもの（抗ストーク放射線）よりも大きい。
本明細書において、「放射線（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）」という用語は、検証される試料（例えば、それと関連する、１以上のＳＥＲＳ活性レポーター分子を有するＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含有する試料）中の表面増強ラマン散乱を誘導することができる電磁放射線の形態にあるエネルギーを指す。より具体的には、「放射線」という用語は、ナノ粒子表面に近接するレポーター分子中で、ナノ粒子表面に光散乱（例えばラマン散乱）を誘導する、放射する、サポートする、または引き起こす電磁放射線の形態にあるエネルギーを指す。
本明細書において、「レポーター分子」とは、適切な波長の放射線を当てられた場合に、ラマンスペクトルを発することができる任意の分子または化学化合物を指す。「レポーター分子」はまた、本明細書において、「ラベル」、「色素」、「ラマン活性分子」、または「ＳＥＲＳ活性分子」（其々は相互交換可能に用いることができる）として呼称されることもできる。
当業者であれば、様々な分子がＳＥＲＳレポーター分子として作用することができることを認識するであろう。例えば、一部の蛍光色素分子もまた、ＳＥＲＳレポーター分子として用いることができる。例えば、米国特許出願第１２／１３４，５９４号（２００８年６月６日出願、Ｔｈｏｍａｓら）、ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６０２３（２００８年６月６日出願、Ｔｈｏｍａｓら）（各々は、参照によりそれらの全体が援用される）を参照のこと。一般的に、ＳＥＲＳレポーター分子としての使用に適切な分子は、小分子、大分子、または複合分子（その分子は、ＳＥＲＳレポーター分子として作用するために複合体である必要性は無いが）であっても良い。ＳＥＲＳレポーター分子は、一部の実施態様において、少なくとも１つの芳香環を有しても良い。さらに、いずれかの学説に縛られることを望まないが、結合の分極率の変化がラマン活性に必要とされる。また、対称的な分子は、特異的で強力なラマンシグナルを発する傾向にある。有利なことに、レポーター分子は、高いラマン分散クロスセクションおよび良く特性解析されたスペクトル特性を示す。
本明細書において言及される、ＳＥＲＳ活性ナノ粒子には、表面増強ラマン光散乱（ＳＥＲＳ）または表面増強共鳴ラマン光散乱（ＳＥＲＲＳ）を誘導する、引き起こす、または支持する表面を有するナノ粒子が含まれる。粗い表面、ざらつきのある表面、および平滑な表面を含む他の表面を含む、多くの表面が、ＳＥＲＳシグナルを発することができる。
本開示のアッセイでの使用に適したＳＥＲＳ活性指標粒子には、ラマン効果を誘導するコアが含まれ、さらに、コアの外表面に位置するＳＥＲＳ活性物質の１以上の層およびタイプ、および任意選択的にＳＥＲＳ活性分子もしくはコアを部分的または完全にカプセル化するカプセル材をさらに含んでも良い。
図１９〜２１において、ＳＥＲＳ活性指標粒子の様々な例を示す。図１９において、ナノ粒子コアの外表面に位置するレポーター分子２２、およびコアおよびレポーター分子を完全にカプセル化するシリカ層２３を有する、コアとして単一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子２１を有するＳＥＲＳ活性指標粒子２０を示す。そのようなＳＥＲＳ活性指標粒子は、米国特許第６，５１４，７６７号に記述されている（Ｎａｔａｎ）（その全体が参照により本明細書に援用される）。
本明細書において、「ナノ粒子」という用語は、１ｎｍおよび１０００ｎｍの間の任意の整数値（約１、２、５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００および１０００ｎｍを含む）を含む、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲にある寸法を少なくとも１つ有する粒子を指す。一部の実施態様において、ＳＥＲＳ活性指標粒子のコアは、金属ナノ粒子である。一部の実施態様において、ＳＥＲＳ活性指標粒子は、約２ｎｍ〜約２００ｎｍの間の直径（約２、５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、１００および２００ｎｍを含む）を有する球状の粒子、または、実質的に球状の粒子である。一部の実施態様において、ＳＥＲＳ活性指標粒子は、約２ｎｍ〜約１００ｎｍの間の直径（約２、５、１０、２０、３０，４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００ｎｍを含む）を有し、および一部の実施態様においては、約２０ｎｍ〜１００ｎｍの間の直径（約２０、２１、２２、２３、２４、２５、 ２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００ｎｍ）を有する。
本開示アッセイでの使用に適したＳＥＲＳ活性指標粒子はまた、２以上のナノ粒子を含有するコアを含んでも良い。図２０において、第一のＳＥＲＳ活性ナノ粒子３１および第二のＳＥＲＳ活性ナノ粒子３２をコアに有し、第一３１および第二３２のＳＥＲＳ活性ナノ粒子の間に位置するレポーター分子３３を有する、ＳＥＲＳ活性指標粒子３０を示す。そのようなＳＥＲＳ活性指標粒子は、米国特許第６，８６１，２６３号に記述されている（Ｎａｔａｎ）（その全体が参照により本明細書に援用される）。また、他の例として、米国特許出願公開第２００３／０２３２３８８号（Ｋｒｅｉｍｅｒら、２００３年１２月１８日公開）（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと。ゆえに、コアＳＥＲＳ活性指標粒子は、単一のナノ粒子を含んでも良く、または、共に凝集した複数のナノ粒子を含んでも良い。そのような凝集体はまた、さらに本明細書に記述されるようにカプセル化されても良い。
本開示方法での使用に適したＳＥＲＳ活性指標粒子のコアは多くの場合、少なくとも１つの金属、すなわち、金属として通常知られる、元素周期表から選択される少なくとも１つの元素を含有する。適切な金属としては、群１１の金属（例えば、Ｃｕ、ＡｇおよびＡｕ）または、ＳＥＲＳをサポートすることが当業者に公知の他の任意の金属（例えばアルカリ金属）が挙げられる。一部の実施態様において、コアナノ粒子は実質的に、単一の金属元素を含有する。例えば、金ナノ粒子の調製は、Ｆｒｅｎｓ，Ｇ．，Ｎａｔ．Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．，２４１，２０（１９７２）に記述されている。他の実施態様において、コアナノ粒子は、少なくとも２つの元素の組合せ（例えば、合金、例えば二元合金）を含有する。一部の実施態様において、コアナノ粒子は磁性である。
他の実施態様において、ＳＥＲＳ活性指標粒子のコアは、２つの成分を含み、第一の物質は、第二の物質から形成される殻により囲まれる内部コアを形成する（例えば、Ａｕ２Ｓ／Ａｕコア−殻粒子）。図２１において、コアとしてＡｕから形成された外殻４２により囲まれた、Ａｕ２Ｓの内部コア４１を有し、コアの外表面に位置するレポーター分子層４３ならびに、コアおよびレポーター分子層を完全にカプセル化するシリカ層４４を有する、そのようなＳＥＲＳ活性指標粒子４０を示す。Ａｕ２Ｓ／Ａｕコア殻−粒子は、広く調節が可能な、近ＩＲ光学共鳴を有するとして報告されている。Ａｖｅｒｉｔｔ，Ｒ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．，“Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｏｐｔｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ，” ＪＯＳＡ Ｂ，１６（１０），１８２４−１８３２（１９９９）を参照のこと。さらに、例えばＣａｏ，Ｙ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ Ａｇ／Ａｕ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，” Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３（３２），７９６１−７９６２（２００１）、に記述されるＡｇコア／Ａｕ殻粒子、または、Ａｕコア／Ａｇ殻粒子、またはＳＥＲＳ活性金属を含む任意のコア殻の組合せを用いることができる。コア−殻粒子での利用に適した他の組み合わせもまた、本開示主題での使用に適しており、ＡｕまたはＡｇ官能化シリカ／アルミナコロイド、ＡｕまたはＡｇ官能化ＴｉＯ２コロイド、Ａｕナノ粒子キャップ化Ａｕナノ粒子（例えばＭｕｃｉｃ， ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｉｎａｒｙ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，” Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０（４８），１２６７４（１９９８）、を参照のこと）；Ａｕナノ粒子キャップ化ＴｉＯ２コロイド；および例えば銀キャップ化ＳｉＯ２コロイドまたは金キャップ化ＳｉＯ２コロイド等の、金属殻（すなわち、ナノ殻）を有するＳｉコアを有する粒子、が含まれる。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１（５２）：１７９３０−５ （２００４）、または米国特許第６，３４４，２７２号および第６，６８５，９８６号（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら、参照により本明細書にその全体が援用される）を参照のこと。バイオセンシングにおけるそのようなナノ殻の使用が記述されている。米国特許第６，６９９，７２４号（Ｗｅｓｔら、参照により本明細書にその全体が援用される）を参照のこと。
ＳＥＲＳ活性指標粒子のコアとしての使用に適した他種のナノ粒子としては、内部表面を有するナノ粒子が挙げられる。そのようなナノ粒子としては、中空粒子および中空ナノ結晶、または多孔質もしくは半多孔質ナノ粒子が挙げられる。例えば、米国特許第６，９１３，８２５号（Ｏｓｔａｆｉｎら、参照により本明細書にその全体が援用される）を参照のこと。一部の実施態様において、内部表面を有するコア／殻およびナノ粒子は、改善されたＳＥＲＳシグナルを示し得る。
粒子の形態およびアスペクト比がナノ粒子の物理的、光学的および電子的特性に影響を与えることが認識されている一方で、特定の形、アスペクト比、または内部表面の有無は、ナノ粒子としての粒子の適格性には影響を与えない。従って、ＳＥＲＳ活性指標粒子のコアとしての使用に適したナノ粒子は、様々な形態、サイズおよび組成を有することができる。さらに、ナノ粒子のコアは、固体であっても良く、または一部の実施態様においては、上述のように、中空であっても良い。コアとしての使用に適したナノ粒子の非限定的な例としては、コロイド金属中空もしくは充填ナノバー、磁性、常磁性、伝導性もしくは絶縁性ナノ粒子、合成粒子、ハイドロゲル（コロイドまたはバー）等が挙げられる。当業者であれば、ナノ粒子は様々な形態（限定されないが、球状、棒状、ディスク上、ピラミッド状、立方体、円柱、ナノヘリックス、ナノスプリング、ナノリング、棒状ナノ粒子、矢状ナノ粒子、涙状ナノ粒子、テトラポッド状ナノ粒子、プリズム状ナノ粒子、および複数の他の幾何学的形態および非幾何学的形態を含む）で存在し得ることを認識するであろう。
さらに、ＳＥＲＳ活性指標粒子のコアとしての使用に適したナノ粒子は、等方性または異方性であっても良い。本明細書に言及されるように、異方性のナノ粒子は、１つの長さと１つの幅を有している。一部の実施態様において、異方性ナノ粒子コアの長さは、ナノ粒子が産生される開口部に平行な寸法である。一部の実施態様において、異方性ナノ粒子コアは、約３５０ｎｍからそれ未満の直径（幅）を有している。他の実施態様において、異方性ナノ粒子コアは、約２５０ｎｍからそれ未満の直径（幅）を有しており、一部の実施態様において、異方性ナノ粒子コアは、約１００ｎｍからそれ未満の直径（幅）を有している。一部の実施態様において、異方性ナノ粒子コアの幅は、約１５ｎｍ〜約３００ｎｍの間である。さらに一部の実施態様において、異方性ナノ粒子コアは長さを有しており、ここで当該長さは、約１０ｎｍ〜約３５０ｎｍの間である。
多くのＳＥＲＳ文献（実験および理論の両方）が、異方性粒子（棒状、三角形、プリズム状）は、球状と比較してラマンシグナルの増強の強化をもたらし得ることを報告している。例えば、いわゆる「アンテナ効果」は、ラマン増強は、高い曲率の領域でより大きくなることが予期されると予測する。銀（Ａｇ）プリズムおよび「分枝状」金（Ａｕ）粒子を含む、異方性粒子に関する多くの報告書が近年、公開されている。
異方性ＡｕおよびＡｇナノロッドは、Ｎａｎｏｂａｒｃｏｄｅｓ（登録商標）粒子（Ｏｘｏｎｉｃａ Ｉｎｃ．， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の製造に類似した方法で、あらかじめ作製されたアルミナ鋳型への電着により製造することができる。例えば、Ｎｉｃｅｗａｒｎｅｒ−Ｐｅｎａ，Ｓ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ ｍｅｔａｌｌｉｃ ｂａｒｃｏｄｅｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，１３７−１４１（２００１）；Ｗａｌｔｏｎ，Ｉ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．，“Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ： ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｉｐｅｄ ｍｅｔａｌｌｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，” Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４，２２４０−２２４７（２００２）を参照のこと。これらの粒子は、材料、典型的にはＡｕおよびＡｇの交代層を、あらかじめ作製されたアルミナ鋳型へと堆積させることにより調製することができ、約２５０ｎｍの直径と、約６ミクロンの長さを有していても良い。
本開示方法での使用にも適したＳＥＲＳ活性指標粒子は、混成のナノ構造（例えば、サテライト構造およびコア殻構造）を含む（ＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７７００号。Ｗｅｉｄｅｍａｉｅｒら。２００８年３月２０日出願。参照により本明細書にその全体が援用される）。
培養試料中の微生物を検出するための、ＳＥＲＳアッセイおよびデバイスの実施態様の優位な点は、調製され得る様々なＳＥＲＳ活性ナノ粒子（各々がユニークなＳＥＲＳ特性を有している）である。本開示方法に有用な代表的なＳＥＲＳ活性指標粒子としては、限定されないが、Ｏｘｏｎｉｃａ Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＳＥＲＳ活性指標粒子が挙げられる。そのようなＳＥＲＳ活性指標粒子は、ＳＥＲＳレポーター分子で標識され、ガラス殻にカプセル化されたナノ粒子コアを含む。
代表的な、非限定的なレポーター分子としては、４，４’−ジピリジル（ＤＩＰＹ）、Ｄ８−４，４’−ジピリジル（ｄ８ＤＩＰＹ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ｂｉｓ（４−ピリジル）−エチレン（ＢＰＥ）、および２−キノリンチオール（ＱＳＨ）（米国特許出願公開第２００６／００３８９７９号。Ｎａｔａｎら。２００６年２月２３日公開（参照により本明細書にその全体が援用される）において有用なラマン活性レポーター色素としてそれぞれが開示されている）が挙げられる。本開示方法に対して適切なレポーター分子のさらなる非限定的な例としては、１，２−ｄｉｌ（４−ピリジル）アセチレン（ＢＰＡ）、４−アゾビス（ピリジン）（４−ＡＺＰ）、ＧＭ１９、１−（４−ピリジル）−１−シアノ−２−（２−フルオロ−４−ピリジル）−エチレン（ＣＮＦＢＰＥ）、１−シアノ−１−（４−キノリニル）−２−（４−ピリジル）−エチレン（ＣＱＰＥ）、色素１０および、４−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）ピリジン（１３６−７）が挙げられる。４，４’−ジピリジル（ＤＩＰＹ）で標識されたＳＥＲＳ活性ナノ粒子の代表的なＳＥＲＳスペクトルは、図２２に示す。図２２に示されるように、ＤＩＰＹ色素分子は、約１６０１ｃｍ−１で、主要なピークを有している。
本開示方法での使用に適したＳＥＲＳ活性指標粒子としては、限定されないが、米国特許出願第１２／１３４，５９４号（Ｔｈｏｍａｓら。２００８年６月６日出願）、およびＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６０２３（Ｔｈｏｍａｓら。２００８年６月６日出願）（各々、参照により本明細書にその全体が援用される）に開示される表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）活性レポーター分子を含有するナノ粒子コア、およびＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７７００（Ｗｅｉｄｅｍａｉｅｒら。２００８年３月２０日出願。参照により本明細書にその全体が援用される）に開示される様々なＳＥＲＳ活性指標粒子が挙げられる。
一部の実施態様において、ＳＥＲＳ活性指標粒子は、カプセル化材を含有する。ＳＥＲＳ活性ナノ粒子は、水性溶液中で凝集する傾向を有しており、いったん凝集すると、再分散することが困難である。さらに、一部のラマン活性分子の化学組成は、他の分子（例えばタンパク質）が金属ナノ粒子へ付着するために用いられる化学物質と相性が悪い。これらの特性により、ラマン活性分子、付着化学物質および、金属ナノ粒子に付着される他の分子の選択が限定される可能性がある。従って、一部の実施態様において、本開示方法は、付加された場合（例えば、ナノ粒子コアへの吸着または共有結合的な付着）に、レポーター分子が異なる物質（誘電性物質（例えばポリマー、ガラス、金属、酸化金属（例えばＴｉＯ２，ＳｎＯ２）、硫化金属、またはセラミック物質等）を含む）の、殻内にコートされる、またはカプセル化されることができる、ＳＥＲＳ活性指標粒子を含有する。そのようなＳＥＲＳ活性指標粒子の調製方法は、米国特許第６，５１４，７６７号（Ｎａｔａｎ。参照により本明細書にその全体が援用される）に開示されている。
カプセル化材の厚さは、ＳＥＲＳ活性指標粒子の必要とされる物理的特性により変化し得る。ナノ粒子コア、カプセル化材および色素の特定の組合せに依存して、カプセル化材の厚いコーティング（例えば、およそ１ミクロンまたはそれ以上のコーティング）は、ラマンシグナルを潜在的に弱める可能性がある。さらに、薄いコーティングは、カプセル化材表面上の分子による、関連微生物のラマンスペクトルの干渉をもたらす。同時に、物理的特性（例えば沈殿係数）は、カプセル化材の厚さにより影響を受ける可能性がある。概して、カプセル化材が厚くなると、金属ナノ粒子コア上のＳＥＲＳ活性色素の、周辺溶媒からの隔離がより効果的となる。
カプセル化材がガラスである実施態様において、ガラスの厚さは、約１ｎｍ〜７０ｎｍの範囲にあっても良い。非限定的な例示において、ＳＥＲＳ活性指標粒子は、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲にある直径を有する、球状のガラスにカプセル化された金ナノ粒子を含有し、球状のガラスの厚さは約５ｎｍ〜約６５ｎｍの範囲にあり、一部の実施態様においては、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍであり、一部の実施態様においては、約１５ｎｍ〜約４０ｎｍであり、および、一部の実施態様においては、約３５ｎｍである。本開示のＳＥＲＳ活性指標粒子の寸法の最適化は、当業者により達成することができる。
さらに、ＳＥＲＳ活性色素を含有するＳＥＲＳ活性指標粒子は、例えば、標的微生物に結合することができる結合対の特異的結合メンバー等の分子で官能化されていても良い。標的微生物に結合すると、ＳＥＲＳ活性レポーター分子のＳＥＲＳシグナルは、標的微生物の存在または量が測定できるような方法で変化する。官能化ＳＥＲＳ活性指標粒子の使用により、非官能化指標粒子を超える、いくつかの利点が得られる。第一に、官能基により、標的微生物との特異的な相互作用がもたらされることによって、指標粒子に対するある程度の特異性が得られる。第二に、標的微生物は、それ自身、ラマン活性である必要は無く、その存在は、ナノ粒子コアに付着したラマン活性色素のＳＥＲＳシグナルにおける変化を観察することにより測定することができる。そのような測定は、本明細書において、「間接的な検出」と呼称され、培養試料中の標的微生物の有無は、対象の微生物から直接発せられないＳＥＲＳシグナルを検出することにより測定される。
他の実施態様において、ＳＥＲＳ活性指標粒子は、コアとしてＳＥＲＳ活性ナノ粒子を含有し、レポーター分子またはカプセル化材は有さない。コアの表面を、例えば標的微生物に結合することができる結合対の特異的結合メンバー等の分子で官能化しても良い。標的微生物に結合すると、標的微生物それ自身のＳＥＲＳスペクトルが検出され、標的微生物の存在または量が確認される。そのような測定は、本明細書において、「直接検出」と呼称され、血液培養試料中の標的微生物の有無は、対象の微生物から直接発せられるＳＥＲＳシグナルを検出することにより測定される。
ＳＥＲＳ活性指標粒子を官能化して、少なくとも２つの異なる方法で標的検体に結合させても良い。一部の実施態様において、ＳＥＲＳ活性レポーター分子、すなわちＳＥＲＳ活性色素は、結合対の特異的結合メンバーと結合されていても良く、一方で、他の実施態様において、結合対の特異的結合メンバーは、ナノ粒子コアに直接的に付着されていても良い。ナノ粒子コアが、カプセル化殻により少なくとも部分的に囲まれている実施態様において、結合メンバーは、カプセル化殻の外表面に付着されていても良い。
Ｃ．特異的結合メンバー
本明細書において、「特異的結合メンバー」という用語およびその文法的な派生は、少なくとも１つの別れた、相補的な結合分子が存在する分子を指す。特異的結合メンバーは、特異的な分子、例えば対象の微生物に結合する、付着する、またはさもなければ関連する分子である。特定のタイプの特異的結合メンバーが特定のタイプの分子に結合する場合、当該特異的結合メンバーは、「特異的結合の対」と呼称される。例えば、抗体は、抗原に特異的に結合する。従って、「特異的結合の対」は、当該分子のうち１つは化学的または物理的手段を介して、第二の分子に特異的に結合する場合の２つの異なる分子を指す。この意味において、検証される微生物は、特異的結合の対の相互メンバーである。検証される特定の微生物との使用に適した代表的な結合メンバーを、以下に提示する。
さらに、特異的結合の対は、元々の特異的結合のパートナーのアナログであるメンバー（例えば、検体に対して類似の構造を有する検体アナログ）を含んでも良い。「類似」に関しては、例えば、検体アナログが、当分野公知のアライメントプログラムおよび標準的なパラメーターを使用した検体アミノ酸配列と比較して、少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有することが意図される。検体のアナログはまた、検体と同じ機能を有しても良い。
特異的結合メンバーは、例えばＳＥＲＳ活性指標粒子と結合された場合、特定の微生物が存在もしくは存在しない場合、または特定の微生物が様々な濃度で経時的に存在する場合に区別することが可能な、検出可能なラマンシグナルを発することができる方法で検証される特定の微生物と相互作用する。
「検出可能なシグナルを発する」という用語は、結合メンバー−微生物複合体を検出することができる様式で、報告された群の存在を認識することができること、または報告群（例えば、ＳＥＲＳ活性レポーター分子）の特性における変化を認識することができることを指す。さらに、検出可能なシグナルを発することは、可逆的であっても、非可逆的であっても良い。シグナル発生イベントは、一度だけのアプリケーションまたは再利用可能なアプリケーションを含む、持続的な、プログラムされた、および一時的な方法を含む。可逆的なシグナル発生イベントは、検体の存在または濃度との相関が確立されている限りは、瞬間的なものであっても良く、または時間依存性のものであっても良い。
特異的結合メンバーと、例えば微生物との間の結合、付着または関連は、化学的なもの、または物理的なものであっても良い。「アフィニティー」という用語は、特定の結合部位での、１つの結合メンバーと結合の対の他のメンバーの間の付着の強度を指す。「特異性」という用語およびその派生は、結合メンバーが、結合の対の他の意図されるメンバー（試料中の他の成分に対立する標的）に優先的に結合する尤度を指す。１つの結合メンバー（例えば、結合タンパク質）と結合の対のもう１つの結合メンバー（例えば、リガンドまたは検体）の間のそのような結合は、可逆的であっても良い。
さらに、米国特許出願第１２／１３４，５９４号（Ｔｈｏｍａｓら。２００８年６月６日出願）およびＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６０２３（Ｔｈｏｍａｓら。２００８年６月６日出願）（それぞれ、参照によりその全体が援用される）に記述されるように、一部の実施態様において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを用いて、特異的な結合メンバーを、ＳＥＲＳ活性指標粒子、磁気捕捉粒子、または固形支持体に付着させても良い。本開示方法において、リンカー分子（例えばＰＥＧ）をまた用いて、特異的な結合メンバーを、ＳＥＲＳ活性指標粒子または磁気捕捉粒子に付着させても良い。ＰＥＧリンカーの使用により、本開示アッセイにおける非特異的結合を減らすことができる。非特異的吸着を排除することは、分析性能に対する大きな課題であり得る。例えば、磁気捕捉アッセイにおいて、タンパク質または溶液由来の他の生物分子が、標的検体に対する結合メンバーを提示している磁気捕捉粒子またはＳＥＲＳ活性指標粒子の表面に付着するプロセス、または、磁気捕捉粒子およびＳＥＲＳ活性ナノ粒子の表面が、非特異的相互作用を介して付着するプロセスが、非特異的結合に含まれる可能性がある。一部の実施態様において、ＰＥＧリンカーは、２以上のエチレングリコールサブユニットにより分離される、直鎖状分子のいずれか末端上の官能基を有する二機能性ＰＥＧ分子を含有する。一部の実施態様において、ＰＥＧ分子は、２〜約１０００のエチレングリコールサブユニットを含有する。特定の実施態様において、ＰＥＧリンカーは、少なくとも１２のエチレングリコールサブユニットを含有する。さらに、ＰＥＧリンカーは、約２００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの分子量を有することにより特徴付けられても良い。
結合メンバーに応じて、当業者は、本開示の主題のレビューで、ＰＥＧ以外のリンカーを用いることができることを認識するであろう。例えば、アルカンチオールを抗体およびペプチドに対するリンカーとして用いることができる。短鎖アルカンチオール（限定されないが、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）およびＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）を含む）を、スルフィドリル脱保護の後のリンカーとして用いることができる。例えばリンカー鎖の長さ等の他の特性もまた、リンカーの選択を決定することができる。例えば、ＰＥＧは、試薬表面を保護するようにも作用し、および弾力性もあるため、対象の検体に試薬が結合する能力を高めることができるという点で、望ましい。
一部の実施態様において、特異的な結合メンバーは、標的微生物またはそれにより分泌される標的上の抗原に結合する抗原結合領域を含有する、イムノグロブリン（本明細書において抗体とも呼称される）である。
本開示方法およびデバイスにおける使用に適した抗体およびその断片は、天然発生または遺伝子組換えにより得られたものであっても良く、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ化抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインまたは可変重鎖（ＶＨ）ドメインのいずれかを含有する断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより産生された断片および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含んでも良い。全ての場合において、抗体またはその断片は、標的抗原に対して特異的な１以上の相補的な決定領域（ＣＤＲ）を有している。本発明の目的に対して、「抗体の相補的な決定領域」とは、エピトープに結合する抗体の部分であり、そのような結合に必要な任意のフレームワーク領域を含み、ヒト重鎖Ｖ、ＤおよびＪ領域、ヒト軽鎖ＶおよびＪ領域、ならびに／またはその組合せによりコードされるアミノ酸残基のサブセットから構成されても良い。
当業者であれば、標準的な当分野公知の技術を用いて任意のそのような抗体誘導体を作製することができる。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５において、ヒト抗体のＣＤＲをマウス抗体由来のものと置換する方法を開示している。Ｍａｒｘ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：４５５−４５６において、マウス可変領域およびヒト定常領域を有するキメラ抗体を開示している。Ｒｏｄｗｅｌｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：９９−１００において、抗体ＣＤＲ情報から得られた低分子量認識エレメントを開示している。Ｃｌａｃｋｓｏｎ（１９９１）Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３０５２：３６−３９は、Ｆｖ断片誘導体、単鎖抗体、融合タンパク質キメラ抗体およびヒト化げっ歯類抗体を含む遺伝子操作されたモノクローナル抗体を開示している。Ｒｅｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７は、ラット超可変領域が移植されたヒト抗体を開示している。Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６において、ヒト抗体へのマウス抗原結合部位の移植を開示している。
Ｄ．磁気捕捉粒子
本開示実施態様での使用に適した磁気捕捉粒子は、約１５％〜約１００％の磁気物質（例えば、約１５％マグネタイト、約２０％マグネタイト、約２５％マグネタイト、約３０％マグネタイト、約３５％マグネタイト、約４０％マグネタイト、約４５％マグネタイト、約５０％マグネタイト、約５５％マグネタイト、約６０％マグネタイト、約６５％マグネタイト、約７０％マグネタイト、約７５％マグネタイト、約８０％マグネタイト、約８５％マグネタイト、約９０％マグネタイト、約９５％マグネタイト、および約１５％〜約１００％の間の任意の整数のマグネタイト、を含むマグネタイト）から構成されても良い。さらに、当該磁気捕捉粒子は、約１００ｎｍ〜約１２ミクロンの範囲の直径を有しても良い。一部の実施態様において、磁気捕捉粒子は、約４００ｎｍ〜約８ミクロンの範囲の直径を有する。他の実施態様において、磁気捕捉粒子は、約８００ｎｍ〜約４ミクロンの範囲の直径を有する。さらに他の実施態様において、磁気捕捉粒子は、約１．６ミクロン〜約３．５ミクロンの範囲（限定されないが、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、および約３．３、約３．４、約３．５、および約４．５ミクロンを含む）の直径を有する。磁気捕捉粒子としての使用に適した代表的な粒子は、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｆｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｄｉａｎａ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）、または、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から入手することができる。
当該粒子の磁気捕捉は、限定されないが、強い磁石を置くこと、またはアッセイ管の局所領域で磁場を誘導することを含む、当分野公知の任意の方法を用いて達成することができる。局在化された磁場は、例えば、１以上の永久磁石、電磁石および／または磁場を伝導する、律する、または集中させる物質（例えば、鉄系材料）により、誘導することができる。１つの実施態様を表す図１８に図示されるように、磁石１５を用いて、磁気捕捉粒子−微生物−ＳＥＲＳ活性指標粒子複合体を測定領域９のうちに局在させる。所望された波長の入射放射線（例えばレーザービーム）を次いで、濃縮された磁気捕捉粒子−微生物−ＳＥＲＳ活性指標粒子複合体のペレットに集中させることができ、当該複合体からＳＥＲＳシグナルが得られる。
Ｅ．微生物培養試料中の増殖をモニターするためのリアルタイムシステム
図２４において、臨床試料および産業試料中の病原体の自動化検出に対する、微生物培養試料中の微生物増殖のリアルタイムモニターをもたらすリアルタイムシステム１５０の実施態様を図示する。システム１５０には、複数の培養管１５４を温度制御された筐体内に保持する、カルーセル１５２が含まれる。例えば、２５までの微生物培養管を用いても良い。この実施態様において、管１５４は、カルーセル１５２の辺縁周辺に置かれ、それにより、各管は、沈殿および読み取りステーション１５６へとプログラム可能な頻度（例えば、１０〜６０分毎に１回の読み取り）で次々に回転して送り出される。沈殿および読み取りステーション１５６には、光学的読み取りヘッド（落射照明とシグナル採取のための適切なフィルターとレンズを備える）と共に沈殿を形成させるための磁石アセンブリが含まれる。例えば、７８５ｎｍの波長で安定したレーザーにより照明がなされても良く、採取されたシグナルは、ラマン分光に適した分光計で検出される。所与の試料の沈殿および読み取りの後、カルーセル１５２は回転し、カルーセル中の次の試料を沈殿および読み取りステーションへ１５６と送り出す。この順序は、カルーセル１５２中の全ての試料が読み取られるまで続き、この時点でカルーセルがスピンモードに入り、カルーセルは、次の測定サイクルまで連続的に回転する。カルーセルならびに、沈殿および読み取りステーションは、ロッキングプラットフォームから伸長するアームに乗っている。得られた「オフセットロッキング」モーションにより、線形モーションおよびロッキングモーションの両方を介した攪拌がなされる。ロッキングプラットフォームは、実験期間の間、全ての測定サイクルの段階に対して選択された頻度で操作する。攪拌は複数の目的に役立つ。第一に、１つの測定サイクルの最後から、次の開始まで、ＳＥＲＳおよび磁性粒子と、試料および培養培地を確実に混合し、結合メンバー−微生物−指標粒子複合体を形成させる。第二に、沈殿が読み取られた後、磁性粒子を溶液中に分散させる。第三に、沈殿の間、攪拌は、液体中の磁性粒子を試料管内の様々な空間点から局所的な磁場領域へと移動させ、局所的な磁場の外側の試料の領域の磁性粒子の回収を確実にする。最後に、粒子（例えば、樹脂、木炭、または炭酸カルシウム）を含有する試料中で、沈殿の前および沈殿中の攪拌により、これらの粒子が検出領域へと沈んでしまい、光学シグナルを干渉してしまうことを防ぐことができる。標的生物の濃度を富化プロセスで増加させながら、例えばＳＥＲＳ技術等の光学による微生物の検出および同定が、当該技術の検出閾値に微生物濃度が達するとすぐに、行われる。培養の間連続的にＳＥＲＳシグナルをモニターすることにより、最小限必要とされる培養時間を用いることができ、病原体または微生物が検出および同定された際には、ユーザーに機器が自動的にアラートを確実に出すことができる。
図２５において、複数の試料を処理するように構成されたシステム２００の他の実施態様を示す。この特定の実施態様において、各微生物培養試料は並行して処理され、同じ温度帯内でインキュベートされる。この実施態様において、試料チューブは、同じ水平面に並べられる。システム２００は、温度帯を形成する筐体内に置かれても良い。
全ての試料は、試薬結合、沈殿および沈殿の分散段階に対して、共に攪拌される。１つの実施態様において、沈殿の後、全ての試料の攪拌を止め、連続して読み取りを行う。並行処理には、第一のシステム１５０構造において使用されたカルーセルとは異なる試料配置が必要となる。ここでは、試料チューブ２０２は、平らなトレイ２０４にお互いに隣接して置かれる。この実施態様において、攪拌は、チューブ２０２の縦軸に沿って、線形往復により行われ、アッセイを通して、異なる頻度およびプロファイルでプログラムされても良い。これにより、ペレット形成、ペレット分散および試薬結合の段階に対して異なるタイプおよびレベルの攪拌が可能となる。また、読み取りのために攪拌を停止させる。並行した試料処理法により、各段階で異なる攪拌のプログラムが可能となる。
図２５において示されるシステム２００には、沈殿のためにチューブ２０２に隣接した位置へと旋回し、次いで、調査のために試料チューブから旋回して離れるように構成された磁石アセンブリ２０６が含まれる。図２５に示されるシステム２００の実施態様に対して、光学的な調査は、ペレット形成後、磁石アセンブリ２０６が試料チューブ２０２から旋回して離れ、光学読み取りヘッド２０８が試料チューブの測定領域へとアクセスさせることにより行われても良い。試料は読み取りの間、攪拌されていないため、この構造において磁石アセンブリ２０６の引き上げが可能である。あるいは、沈殿後、磁石を適切な位置に維持させながら、読み取りヘッド２０８による読み取りが行われるスロットがもたらされるように、磁石の対を配置しても良い。ゆえに、読み取りヘッド２０８は、磁石が各チューブを調査する間に、スロットに沿って動くように構成される。これにより、沈殿とチューブの読み取りの間に磁石を移動させる必要性を無くすという利点が得られる。
図２６〜２９において、培養試料中における微生物増殖を自動的にリアルタイムでモニタリングするための、システム２５０の別の実施態様を図示する。システム２５０は、１以上の異なるアッセイを同時に自動的に処理するように構成される。通常、システム２５０には、検出領域において、一度に１つずつトレイ２５６にサービス（沈殿および読み取り）を行うためのインキュベーターの後ろに移動する、１つの沈殿／読み取りアセンブリ２５４により使用可能となる、複数のインキュベーター２５２が含まれる。各インキュベーター２５２は、複数の試料チューブ２５８を保持したトレイ２５６を受け取るように構成される。チューブの各トレイ２５６は、インキュベーター２５２から沈殿／読み取りアセンブリ２５４へと移動するように構成され、ここで、ペレットが形成され、検出領域においてデータが採取される。沈殿／読み取りアセンブリ２５４は、ペレットを形成するための磁石アセンブリ２６０および、光学的シグナルを採取するための光学的部品（例えば、ラマン光学、レーザー、および分光計）を含有する。
１つの実施態様において、システム２５０には、複数のインキュベーター２５２が含まれる。様々なアッセイにおいては、培養試料は異なる温度で培養され得る。ゆえに、システム２５０は、異なる温度で操作することができる複数の温度領域２６２（インキュベーション領域）を含んでも良く、ここで各領域には、１以上のインキュベーターが含まれる。各インキュベーター２５２におけるアッセイは同時に処理され、ここで、各インキュベーターは、１以上の試料チューブ２５８を保持する１以上のトレイ２５６を含んでも良い。しかしながら、試料チューブ２５８は、バッチで処理される必要は無い。この点において、各試料チューブ２５８は、異なるときにインキュベーター２５２に置かれても良く、それにより、その検証期間中、異なる開始時間を有することになる。試料チューブ２５８は全て、その検証期間の間、同じ繰り返しのテストサイクルに供されても良い。試料チューブ２５８の多くは、バッチで共に導入されても良い。図２６および２７において示されるように、システムには、４つのインキュベーター２５２（２つの温度領域２６２に分けられる）を含む。温度領域２６２は、２つのインキュベーター２５２が各温度領域に関連するように、垂直に配置されても良い。同一の温度領域２６２は、図２７に示されるように垂直に積み重ねられる。しかしながら、温度領域２６２は、所望する場合には、水平に配置されても良く、または、並んで配置されても良いことを理解されたい。各領域２６２は、共通の温度で操作する同一のインキュベーターレベルで維持された、１以上のインキュベーター２５２を含んでも良い。１つの例示的な実施態様において、領域２６２は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＬｉｓｔｅｒｉａアッセイの処理のために構成され、異なる温度に維持される（例えば、それぞれ約４２℃および３０℃）。ゆえに、システム２５０は、アッセイのタイプに関わらず、異なる試料チューブ２５８（例えば、検出バイアル等）を処理するように構成される。
１つの実施態様において、各インキュベーター２５２は、その中でトレイ２５６を受け取り、特定の試料の培養に必要な、前もって決定された温度の維持に適した筐体を形成する。図３４において、インキュベーター２５２の一例を示す。インキュベーター２５２は、底面および側面を含む、ベースブロック２６４、フロンドドアおよび後部ドア２６６、２６８、ならびに頂点面２７０を含んでも良い。インキュベーター２５２は、筐体に制御された温度をもたらすのに適した、様々な物質から形成されても良い。例えば、インキュベーター２５２は、温度制御された領域の底および側面を形成する、１つの機械加工された金属のベースブロック２６４（例えばアルミニウム）から構成されても良く、一方で、金属プレート（例えばアルミニウム）は頂点面２７０を形成する。インキュベーター２５２はまた、Ｙステージ２７８の制御下でトレイ２５６をＹ方向に振動させるための、ベルトドライブ２７４を支持するように構成されるベースブロックの左側面上のチャンネル２７２を含んでも良い。トレイ２５６の可動範囲は、熱せられた領域の深さを超えて伸長し、インキュベーター２５２の後ろ側、沈殿／読み取り領域内へのトレイのストロークがもたらされる。ゆえに、各トレイ２５６の可動範囲は、沈殿／読み取りアセンブリ２５４による沈殿および画像解析のための、チューブ２５８の適切な攪拌ならびにインキュベーター２５２の外側へのチューブの再配置に必要な移動量に依存する。
１つの実施態様において、インキュベーター２５２には、フロントドア２６６および後部ドア２６８が含まれ、ここで、当該ドアは、頂点面２７０およびベースブロック２６４と協調し、筐体を形成する。フロントドア２６６は、操作者によって選択的に開閉されるように構成される（図３１を参照のこと）。例えば、フロントドア２６６は、トレイ２５６がインキュベーター２５２の正面から最小限の距離だけ伸長し、当該ドアがチューブへのアクセスまたは視界を邪魔しないようにスイングするように構成されても良い。フロントドア２６６は、開閉を容易にするための様々な技術を用いて備え付けられても良い。例えば、フロントドア２６６は、インキュベーター２５２内にトレイが引かれることでドアを閉じる、ねじりバネを積んだヒンジに備え付けられても良い。押すメカニズムは、ドア開放を補助するために、トレイの正面の両サイドまたは１サイドから伸長しても良い。１つの態様によると、フラッグは、フロントドアが閉じられたときを感知するために、インキュベーター２５２の内部側壁上に備え付けられた光学センサーを遮断するように構成された、フロントドア２６６の内部に位置づけられる。
同様に、後部ドア２６８は、インキュベーター２５２の後部からのトレイ２５６の出入りで開閉するように構成されても良い（図４０を参照のこと）。ゆえに、トレイ２５６がインキュベーター２５２を出るときに、当該トレイが、後部ドア２６８が少なくとも部分的に開くように押すように構成される。フロントドア２６６のように、後部ドア２６８は、ねじりバネを積んだヒンジに備え付けられても良く、トレイ２５６の後部の機構は、当該トレイがインキュベーター２５２の後部から表に出るにつれて、後部ドアが開くように押すように構成されても良い。さや２７６は、インキュベーター２５２を出ることで、トレイ２５６を受け取るように構成され、以下に詳述されるように、Ｚ軸に沿った動きに対して構成される。後部ドア２６８が部分的に開かれるとすぐに、インキュベーター２５２と並ぶために当該さやがＺ軸に沿って上がるにつれ、さや２７６が、後部ドアを完全に開くように構成されても良い。さや２７６がドアを開いた状態に維持し、後部ドア２６８からの干渉を受けることなく、トレイ２５６は、沈殿／読み取り領域で自由に動く。後部ドア２６８は、トレイ２５６がインキュベーター２５２内に引っ込み、さや２７６が下がると、閉じるように構成される。インキュベーター２５２は、トレイ２５６が適切にその中に位置づけられていることを示唆するセンサーを含んでも良い。例えば、後部ドア２６８の内側のフラッグは、後部ドアが閉じられたことを感知するために、インキュベーターの内部側壁に備え付けられた光学センサーを妨害するように構成されても良い。このセンサーはまた、トレイ２５６のホームインジケーターとして用いられても良い。ゆえに、後部ドアセンサーは、インキュベーター２５２の後部への出入りのときに、トレイ２５６の位置を明らかにさせても良い。第二のホームセンサーは、沈殿／読み取り領域への各移動の間の、沈殿および光学ハードウェアに関連する、各トレイ２５６に対するホームの位置を示しても良い。
各インキュベーター２５２は温度制御されているため、当該インキュベーターは、断熱物質（例えば、クローズドセル発砲断熱材（ｃｌｏｓｅｄ ｃｅｌｌ ｆｏａｍ ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ）等）により包まれていても良い。温度領域２６２のそれぞれはまた、断熱物質により分離されていても良く、それは、異なる温度で領域が維持されている場合に有用である。また、領域間のクロストークを制限するための領域間にギャップがあっても良い。さらに、断熱物質を用いて、１つのインキュベータードア２６６または２６８が正面または後部に開けられ、他方が閉じられている場合の、熱相互作用を阻害しても良い。断熱スペーサーが、領域２６２のインキュベーターを分離させても良い。同様に、領域２６２はまた、スペーサーと断熱物質を用いて分離されても良い。
各インキュベーター２５２は、発熱体を用いて加熱される。例えば、発熱体は、ベースブロック２６４を介して熱を導くように構成されても良く、またはインキュベーター内に加熱した熱をもたらすように構成されても良い。１つの実施態様によると、発熱体は、ベースブロック２６４の底面に付着された、または、ベースブロック２６４の底面に統合された平坦な発熱体である。発熱体への配電は、インキュベーター２５２の左側のＹドライブ２７８部を介した熱のロスを補うために、トレイ２５６のチューブ２５８全体の熱勾配を最小限とするために調製されても良い。各インキュベーター２５２は、その中の温度（例えば、ベースブロック２６４および／またはインキュベーター内の空気の温度）をモニターするための１以上のセンサーと共に提供されても良い。
上述のように、各インキュベーター２５２は、その中に各トレイ２５６を受け取るように構成される。図３０〜３２において、各インキュベーター内の位置調整に適したトレイ２５６の例示的な実施態様を図示する。各インキュベーター２５２のトレイ２５６は、複数のチューブ２５８を収容できるように構成される。図示された実施態様において、各温度領域２６２が３０チューブを保持するように、トレイ２５６は１５のチューブ２５８を保持するが、任意の数のチューブを用いても良い。チューブ２５８は、トレイ２５６のそれぞれにおいて、平面アレイに水平に配置されても良い。図３１に示される１つの実施態様において、技術者は、手でサンプルチューブ２５８を、取り外し可能なサンプルトレイ２５６に置いている。次いで、技術者はトレイ２５６をインキュベーター２５２の中に置いている。アッセイは、陽性結果が測定されたとき、または、あらかじめ決められた期間、結果が陰性のままであるときに完了する。アッセイが完了すると、技術者はトレイ２５６を取り出し、新しいチューブ２５８を再度詰める。あるいは、技術者はトレイまたは隣接するインキュベーターの他のチューブ内ですでに進行しているアッセイを止めることなく、必要に応じて個々にチューブを取り除く、および／または、トレイへ加えても良い。陽性試料は、さらなる解析のために隔離されても良い。他の実施態様において、トレイ２５６は、取り除かれない。ゆえに、チューブ２５８は、各インキュベーター２５２の取り外し不可能なトレイ２５６へと個々に置かれることができる。さらに他の実施態様において、インキュベーター２５２がその中にチューブ２５８の保持に適切な手段を有している場合には、トレイ２５６は必要ではない。
トレイ２５６にチューブ２５８を水平に、および並んで配置することにより、個々のサンプルチューブまたはトレイの、インキュベーター２５２の正面からの装着が容易になる。トップローディングの装着を容易にするために、トップローディング装着されたトレイをほぼチューブの長さだけシステムの正面の外側に伸長させる必要があるため、正面装着は、システムの正面のベンチスペースまたは島スペースの使用を避ける。さらに、一端が飛び出した伸長されたトレイに、ユーザーが過剰な圧力をかけた場合に、トレイおよびスライディングサポートは、高い負荷に耐えなければならない。
各トレイ２５６は、チューブ２５８を保持し、インキュベーター２５２内に配置を容易にするために、様々なサイズおよび構造であっても良い。例えば、図３１において、チューブ２５８が、トレイ２５６に規定される各スロット２８４内に挿入されていることを図示する。チューブ２５８は、トレイ２５６内に配置された圧力ばめ、または締まりばめ、またはバイアス用要素を用いて適切な位置に保持されても良い。トレイ２５６がインキュベーター２５２から取り除かれた場合、トレイは、技術者がトレイを保持し、インキュベーター内でトレイを操作することができるようにさせる、１以上の保持機構２８６を有しても良い（図３３Ａ〜３３Ｃ）。
１つの実施態様において、トレイ２５６は、チューブ２５８の一部が、トレイを通じて見えるように、長手方向のスロット２８４を含んでいる。長手方向のスロット２８４はまた、チューブ２５８がトレイ２５６の底面の下に飛び出るようにさせ、沈殿磁石２８８との接触領域をもたらす。トレイ２５６を横切り、磁石と十分に接触できるように、各チューブ２５８は、トレイで垂直に合わせられても良い。例えば、バネにより、磁石がチューブに合うように上がるときにチューブ２５８を磁石に対して下に保持させても良い。また、トレイの振動する動きに擦り合わせることにより、バネがトレイ２５６にチューブ２５８を保持しても良い。
１つの実施態様によると、トレイ２５６は、Ｙステージ２７８の制御下で、各インキュベーター２５２のＹ軸に沿って水平に振動し、試料、培養培地および試薬を含有するチューブを攪拌するように構成される。この水平の動きは、以下のいくつかの機能を果たし得る。
ａ）インキュベーター２５２での動的な混合のための攪拌
ｂ）操作者が装着のためおよび取り外すために、インキュベーター２５２の正面の外側にチューブを伸長させる
ｃ）沈殿／読み取りアセンブリ２５４まで、インキュベーター２５２の後部の外側にチューブを伸長させる
ｄ）安定した物質（例えば、培地または試料の固体成分）を分散させるためにチューブ２５８を攪拌する
ｅ）ペレットを形成させるために、沈殿／読み取りアセンブリ２５４でチューブ２５８および磁石２８８を攪拌する
ｆ）データ採取のために読み取りヘッド２９０の上にチューブ２５８を置く
ｇ）サンプルＩＤのバーコードリーダーの上にチューブラベルを置く
ｈ）内部標準、画像ベースの検出法、または遠隔診断に対して、ペレットを可視化するためにカメラの上にペレットを置く
ｉ）読み取りの後に、ペレットを分散させるため、チューブ２５８を攪拌する
ｊ）インキュベーターフロントドア２６６を操作する
ｋ）インキュベーター後部ドア２６８を操作する
ｌ）温度勾配を減少させるために、インキュベーター２５２内の空気を循環させる
図３４に示されるように、システムには、Ｙ軸に沿ってトレイ２５６を動かす（トレイを振動または攪拌すること、およびインキュベーター２５２の後部内外にトレイを動かすことを含む）ための、Ｙステージ２７８を含む。図２７に示されるように、各インキュベーター２５２は、互いに垂直に配置されるように、Ｚ軸に沿って配置された各Ｙステージ２７８を含んでも良い。トレイ２５６は、１以上のキャリッジ２８２を用いてＹステージ２７８に連結されても良い。例えば、トレイ２５６は、リニアレール２９２に備え付けられたキャリッジ２８２から一端が飛び出していても良く、ここで、当該リニアレールは、インキュベーターベースブロック２６４に備え付けられている。Ｙステージ２７８は、レール２９２の両末端でベルト２７４をタイミング滑車周辺に運ぶためのモーター２８０を含む。Ｙステージ２７８は、そのトレイ２５６を特定のアッセイおよびアプリケーションに依って、様々な頻度および大きさで攪拌するように構成されることを理解されたい。例えば、トレイ２５６は、沈殿／読み取りアセンブリ２５４に配置されるときよりも、インキュベーター２５２にあるときに、よりゆっくりと振動されても良い。
また、Ｙステージ２７８部分は、断熱物質により囲まれても良く、一方、Ｙステージを運ぶモーター２８０は断熱領域の外側にある。トレイ２５６およびキャリッジ２８２は、断熱物質の開口部を通って動いても良い。
また、システム２５０は、インキュベーター２５２の後ろに配置されたＺステージ２９４を含む（図３９、４２および４３を参照のこと）。Ｚステージ２９４は、さや２７６、磁石アセンブリ２６０、光学部分（例えば、分光計３０８、ラマンプローブ３１０等）、およびＺ軸に沿ったＸステージ２９６を運ぶように構成される。Ｚステージ２９４は、垂直リニアレール３００に乗るように構成されたキャリッジ２９８を含んでも良い。モーター３０２は、Ｚ方向にＺステージを上げたり下げたりするように構成される（例えば、Ｚステージブラケット３０６に連結されたシャフト３０４内に配置されたリニアスクリューおよびナットを用いて）。センサーを用いて、Ｚステージ２９４がＺ方向の移動の底にあるときを示しても良い。分光計３０８、磁石アセンブリ２６０、さや２７６およびＸステージ２９６は、Ｚステージブラケット３０６に備え付けられ、それら全ては、ユニットとして、Ｚ方向に共に移動する。Ｚステージ２９４は、インキュベーター２５２から出る各トレイ２５６を収容するために、Ｚ方向に動くように構成される。Ｚステージ２９４はまた、底部インキュベーター後部ドア２６８が閉まるように、十分に底部インキュベーター２５２の下に移動するように構成される。
また、システム２５０は、図４２、４５および４６に示されるように、磁石アセンブリ２６０を含む。磁石アセンブリ２６０は、チューブ２５８に磁場を適用するために構成された磁石フレーム３１８に備え付けられた１以上の磁石２８８を含んでも良く、それにより、各チューブ内でのペレットの形成を促進する。例えば、図４５および４６において、読み取りヘッド２９０がそれを通じて読み取りを得られるように伸長できるように十分な距離で離れた長手方向の磁石２８８の対を図示する。ゆえに、磁石２８８は、沈殿の後で適切な位置にあり、一方で、チューブ２５８は、読み取りヘッド２９０により読み取られている。各長手方向の磁石２８８は、１つの磁石であっても良く、または端から端まで配置された複数の磁石の集まりであっても良い。
ペレットは、磁石２８８が、水平に方向づけられたチューブ２５８の底に接触したときに、または近づいたときに形成されても良い。チューブ２５８および磁石２８８は、溶液中の磁性粒子が磁場を確実に通り、磁場が集中するポイントに引き寄せられるように、ペレット形成の間、ゆっくりと振動する。１つの実施態様において、磁石アセンブリ２６０は、Ｚステージブラケット３０６に取り付けられたレール３１４上に、Ｙ方向に乗ったキャリッジ３１２に備え付けられている（図４６を参照のこと）。レール３１４は、Ｙステージレール２９２に平行であっても良い。
トレイ２５６がインキュベーター２５２の後部の外側に伸長し、沈殿／読み取りアセンブリ２５４内へと入るとき、Ｚステージ２９４は、Ｚ軸に沿って下から上げられても良い。図４２および４７に示されるように、磁石フレーム３１８から外側に伸長するピン３１６は、トレイ２５６の下面の穴にはめ込まれるように構成されても良い。はめ込まれた時点で、磁石フレーム３１８はトレイ２５６に連結され、そして磁石フレームおよびトレイは、レール３１４に沿ってＹ方向に共に動くことができる。それゆえ、１つの実施態様において、沈殿／読み取りアセンブリ２５４は、１度に１つのトレイ２５６を処理するように構成される。沈殿振動の大きさは、特定のアッセイに特異的な多くの因子に依存して変化しても良い。１つの例において、振動の大きさは、約５０ｍｍまでであっても良い。磁石フレーム３１８およびトレイ２５６は、Ｙ方向にＹステージが完全に移動した位置で連結されても良く、一方で、沈殿振動の中心は、Ｙ方向に２分の１の大きさに調整するために、カップリング位置から前に位置づけられても良い。
１つの実施態様において、チューブ２５８と磁石２８８の振動との間の少量の相対運動によって、磁性粒子が、磁場により、さらに強固なペレットへと集まるようになる。ゆえに、トレイ２５６と磁石フレーム３１８との間の緩やかな連結が望ましい。そのような連結を、例えば、２つのバネの間のフレーム３１８のスロットに保持されたブロック上にフレーム３１８を備え付けることにより行っても良い。トレイ２５６はＹ方向に前後に振動するので、バネが第二の振動モーションで交互に縮みながら、フレーム３１８は、トレイとの関連で動く。緩やかな連結ストロークは、例えば、約５ｍｍであっても良い。バネ定数は、最適な振動頻度をもたらすために選択される。
本発明の１つの実施態様によると、磁石アセンブリ２６０は、同時にトレイ２５６においてチューブ２５８のそれぞれが沈殿するように構成される。磁石２８８は、チューブ２５８が読み取りヘッド２９０により読み取られながら、所定の場所に留まるように構成されても良い。あるいは、ペレットは、読み取りのために、磁石２８８またはチューブ２５８が互いに離れることができるように、十分に持続的なものであっても良い。
図４１において、Ｚステージ２９４に連結されるＸステージ２９６の一例を示す。このように、Ｘステージ２９６は、ＺステージによりＺ方向に動かされるように構成される。また、Ｘステージ２９６は、各チューブ２５８の読み取りのためのＸ方向の読み取りヘッドの２９０の動きを促進する。Ｘステージ２９６は、並んだチューブ２５８の下の読み取りヘッド２９０をスキャンし、ペレットが形成された後、アッセイデータを採取する。沈殿の間、Ｘステージ２９６は、読み取りヘッド２９０および磁石アセンブリ２６０を邪魔することなく連結トレイ２５６を動かすことができるＸ位置へと移動する。沈殿の後、トレイ２５６が固定された状態で、Ｘステージ２９６は、各チューブ２５８へと移動し、全てのチューブが読み取られるまで、データ採取のために停止する。その後、Ｘステージ２９６がその開始位置に再び位置づけられた後、トレイ２５６が移動される。１つの例示的な実施態様において、Ｘステージドライブ（例えば、モーター３２０およびベルト３２２）は、Ｚステージブラケット３０６のチャンネル３２４に備え付けられ、Ｙステージ２７８のものと類似のデザインを利用する。読み取りヘッド２９０は、Ｘステージ２９６のレール３２８に沿って動くように構成されたキャリッジ３２６に備え付けられる。フレキシブルなスリーブ管３３０を用いて、読み取りヘッド２９０電気ケーブルおよびフレキシブルな光ファイバーケーブルを、Ｚステージ２９４から動く読み取りヘッドへと送っても良い。フレキシブルなスリーブ管３３０は、光ファイバーバンドルを防御するだけでなく、ファイバーをＸ方向に曲げさせ、所望の曲げ半径をもたらすように構成される。
他の実施態様によると、Ｘステージ２９６は、チューブ２５８のそれぞれ上のバーコードまたは他の識別子の読み取りのためのバーコードリーダー（示さず）、を運ぶように構成される。例えば、バーコードリーダーを用いて、チューブ２５８が正しい温度領域２６２の中にあることを確認しても良く、それにより、偽陰性を防ぐことができる。バーコードには、例えば同定情報およびアッセイ情報等の他のデータも含まれる。上述のように、チューブ２５８は、バーコードリーダーによるそのような読み取りを容易にする長手方向のスロット２８４を含んでも良い。さらに、バーコードリーダーは、内分標準、画像ベースの検出法、および／または、遠隔診断のためのペレットの画像データを提供しても良い。
上述のように、さや２７６は、トレイがインキュベーター２５２の後部を出るとき、各トレイ２５６を受け取るように構成される。特に、絶縁さや２７６は、Ｚステージ２９４の上に運ばれ、沈殿／読み取り領域２５４の中へ、インキュベーターの後部の外に伸長する際に、トレイ２５６を囲むように、各インキュベーター２５２と並ぶように構成される。絶縁さや２７６は、トレイ２５６がインキュベーター２５２の外に伸長する間のトレイ温度の変化を最小限にする。さや２７６は絶縁スリーブ管を提供し、および、その中に含有されるトレイ２５６とチューブ２５８の冷却から出される気流をブロックする。また、さや２７６は、その熱質量を最小限化し、ゆえに先行する領域とは異なる温度でのトレイ２５６との熱エネルギー交換を最小限化する物質から構築される。例えば、さや２７６は、絶縁物質により囲まれる薄いアルミニウム構造を含有しても良い。１つの特定の実施態様において、約４２℃でさやに入る、約３０℃のトレイは、約０．５℃よりも大きく温度が増加しない。
インキュベーターが完全にさやの中の温度を制御できないような、インキュベーター２５２と並べられたさや２７６との間に規定されるギャップ３３２があっても良い。インキュベーター２５２の温度が大気温度よりも高い場合のこれらの例において、さや２７６を囲む空気がトレイ２５６よりも温度が低い場合があり、さやからの熱の移転が、より低いトレイ温度へと向かっても良い。しかしながらトレイ２５６のインキュベーター２５２からさや２７６への移動から生じる変動がある場合、一部のアッセイには受容可能な温度許容範囲がある。例えば、４２℃でのＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよび３０℃でのＬｉｓｔｅｒｉａに対するアッセイは、短時間の負温度の低下（例えば、約−２℃）は、温度上昇（例えば、約＋０．５℃）よりも寛容である。ゆえに、負への移動が受容可能な許容範囲内にある限りは、インキュベーター２５２で完全な温度密封を形成する必要性は無い。
伸長トレイ２５６を囲むことに加え、さや２７６はまた、図４２に示されるように磁石アセンブリ２６０を包囲しても良い。ゆえに、さや２７６は、上述のように、トレイ２５６を連結し、および連結を外すために、Ｚステージ２９４が、磁石アセンブリ２６０と垂直に動くことができるような大きさであっても良い。さらに、さや２７６は、さやの底に沿って読み取りヘッド２９０、および、Ｙステージ２７８を介して側面に沿って動くキャリッジ２８２のための隙間をもたらすためのカットアウトを含んでも良い。さや２７６の頂点面はまた、後部インキュベータードア２６８のためのカットアウトを含んでも良い。
図４８Ａおよび４８Ｂに示されるように、システム２５０の前述の部分は、キャビネット３３４に内包されても良い。外板は、気流を制御し、温度制御を付加するための、インキュベーター２５２および沈殿／読み取り領域２５４の周辺のキャビネット３３４を形成する。キャビネット３３４はまた、光学部分（例えばレーザー）を操作するのに安全な筐体をもたらし得る。システム２５０はさらに、アッセイの状態を示唆するための、１以上の可視シグナルまたは可聴シグナルを含んでも良い。例えば、１以上のＬＥＤ３３６を用いて、アッセイが進行中であること、および、陽性結果が得られたことを示しても良い。各チューブ２５８および／またはトレイ２５６は、そのような目的のための関連ＬＥＤ３３６を含んでも良い。異なるＬＥＤの色は、異なる指示のために用いられても良く、ここで、当該色は、インキュベーター２５２の正面ドア２６６が開いた、または閉じた際に、可視であっても良い。
通常、インキュベーター２５２は、大気よりも高い温度で維持される。この温度差異を得ることを補助し、過剰な熱がさや２７６に伸長するトレイ２５６にもたらされないように、気流パスを採用しても良い。フィルターを備えたファンもまた用いて、キャビネット３３４を加圧し、ゴミの侵入を減らし、例えばモーター等の部分のために他の熱散逸技術を用いても良い。例えば熱電気クーラー等の他の技術を用いて、さらにキャビネット３３４を冷やしても良い。
当分野公知の、様々な電気部品を、システム２５０とのインターフェースおよび制御に用いても良い。例えば、様々なモータードライバーボードを用いて、モーターを制御し、例えばセンサーやエンコーダー等の他のデバイスへのインターフェースを提供しても良い。他のボードを用いて、例えば、読み取りヘッド２９０および分光計３０８のための、電源供給およびインターフェースシグナル、ならびに、ヒーター操作および関連サーミスタの読み取り等の、追加機能をもたらしても良い。さらに、システム２５０は、様々な他の部品（例えば、当分野公知の自動化方法でシステムを制御するためのマイクロコントローラー等）を用いても良い。
Ｅ．攪拌および沈殿技術
図４９において、試薬量を最小限化し、大容量を表す（例えば、２５０ｍＬまで）読み取りを得るように開発された、本発明の一実施態様による攪拌および沈殿法を図示する。これは主に、磁場の適用の間、その長軸方向に沿って培養管を攪拌することにより達成される。ペレットは、長軸方向に沿って、チューブの側面上で形成される。サンプル対チューブ量（例えば、１：２）、チューブの長さ／幅のアスペクト比（例えば、７：１）および攪拌パラメーターの結果の組合せが、パフォーマンスの最適化のために選択されても良い。より大きな容量から粒子を確実に磁石に近づけることにより、攪拌は、より効果的にペレット形成を促進する。さらに、磁場方向から離れた力を適用することにより、攪拌は、非複合体化の細胞、微生物および緩い個体（例えば血液培養試料中の樹脂）、ペレットの外部に維持することを助ける。
図５０において、磁性ペレットを形成し、調査するためのデバイスの１つの実施態様を図示する。このデバイスは、図２４に示されるカルーセルシステム１５０の実施態様において用いられても良い。図５０に図示される実施態様において、磁石アセンブリは、オブジェクトレンズを備える光学読み取りヘッドの部品を囲み、かつ、同一線上の磁石リングの積み重ねからなる。中空の円錐スチールチップは、円錐の頂点で磁場を集中させ、読み取りヘッドの焦点でペレットを形成させる。この配置は自動的に、読み取りヘッドの焦点とペレットを並べ、チューブ、磁石および読み取りヘッドのアライメント上の圧迫を和らげる。ペレット、磁石および読み取りヘッドの一定したアライメントは、アッセイの経過中の全てのサンプルにわたる一定の測定にとって重要であり、このデザインにより、アッセイの経過の間の複数の読み取りにわたる、サンプルチューブおよび機器全体の、信頼性のある、再現可能なペレット形成がもたらされる。
図５１および５２において、本開示のシステムに従い用いられる、ペレット形成の別の方法が示される。水平面でチューブを並べることにより、沈殿後に引き出されるか、または沈殿位置で維持されるか、いずれかでの磁石で読み取られる光学シグナルがもたらされる。これにより、様々な磁石配置の検証が可能となる。２つの配置が、特に有効であると証明されている。１つは、「Ｎｏｒｔｈ−ｕｐ」と名付けられ、チューブに対して垂直方向の磁化を有する棒磁石を用いる（図５２）。これは、読み取りヘッドでの読み取りに理想的な、対称的な円状のペレットを形成する。他の配置は「Ｎｏｒｔｈ−ｆａｃｉｎｇ−Ｎｏｒｔｈ ｐａｉｒ」と名付けられ（図５１）、２つの棒磁石がお互いに隣接し、平行して配置される。磁化は、Ｎ極が互いに向かい合うように、各磁石の厚さ（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を介し、磁石に対して垂直な線に沿って方向づけられる。磁石の間の適切な隙間を取ると、最も高い磁気勾配の領域が、磁石の間の領域の中になり、磁石の間の領域に集中されたペレットが得られ、所定位置での磁石での読み取りが、容易にアクセスしやすくなる。
本発明の他の実施態様において、カメラをまた検証ステーションに加え、ＳＥＲＳ−ＨＮＷアッセイの間、培養管内における、結合ＳＥＲＳ指標粒子および磁気ビーズおよび標的病原体を含有するペレットの形成およびサイズをモニターする。ペレットサイズは増加し、およびＨＮＷアッセイが進行するにつれ、一部のケースにおいては、カメラの視界からペレットが消える。ペレットサイズの増加および／またはペレットの消失は、標的病原体の存在を示唆する。病原体の無い結合ＳＥＲＳ指標粒子および磁気ビーズを含有する試料の分析の間に撮られた画像は、ペレットサイズに変化は無く、ペレット消失も示さない。この病原体検出法は単独で用いることもでき、または、例えば従前に記述した、バリデーション手段としてのＳＥＲＳ分析等の他の検出方法と併せて用いることもできる。
本開示方法の実施態様は、当分野公知の任意の適切な分光計、またはラマン分光計システム（例えば、Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｃｅｎｔｉｃｅ， Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、例えば米国特許第７，００２，６７９（Ｂｒａｄｙら）に開示されるラマン分光計システム（その全体で参照により本明細書に援用される）を含む）で実施することができる。他の適切な分光計またはラマン分光計システムの非限定的な例としては、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ９４０５ＣＡおよび、Ｉｎｔｅｖａｃ ＲｅｐｏｒｔｅＲが挙げられ、ならびに、ファイバー連結およびフリースペース光学構造の両方が挙げられる。本開示のＳＥＲＳ活性指標粒子での使用に適したさらなる機器は、ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７７００（Ｗｅｉｄｅｍａｉｅｒら。２００８年３月２０日出願。その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。
液体ベースの磁気捕捉ＳＥＲＳアッセイの実施に対する代表的な方法は、ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７７００（Ｗｅｉｄｅｍａｉｅｒら。２００８年３月２０日出願。その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。そのような方法には、磁性ペレットサイズ、形態または位置取りの変化を補うための参照すること、および制御方法、および改善ラマン参照スペクトルを作製する方法、および液体ベースの磁気プルダウンアッセイにおけるスペクトル分析が含まれても良く、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７７００にまた開示されている。さらに、複数のレポーター分子を用いて、特に、比較的弱いシグナルを示す、または示すと予期される試料における、シグナル検出からバックグラウンドノイズを区別するために用いることができる内部参照シグナルを生成しても良い。
さらに、米国特許出願第１２／１３４，５９４号（２００８年６月６日出願、Ｔｈｏｍａｓら）、ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６０２３（２００８年６月６日出願、Ｔｈｏｍａｓら）（各々は、参照によりそれらの全体が援用される）に開示されるように、ＳＥＲＳ活性指標粒子のレポーター分子としての使用に適した色素は通常、狭いライン幅を有する、比較的シンプルなラマンスペクトルを示す。この特性により、同じ試料体積で、いくつかの異なるラマン活性種の検出が可能となる。従って、この特性により、異なるタイプの指標粒子の混合物中で、各色素のラマンスペクトルが区別されることができるように加工された、複数のＳＥＲＳ活性指標粒子（各々が異なる色素を含有する）の使用が可能となる。この特性により、少量の試料中で、異なるいくつかの標的種のマルチプレックスな検出が可能となる（本明細書において、マルチプレックスアッセイと呼称される）。
従って、一部の実施態様において、１以上のタイプの結合メンバーを、ＳＥＲＳ活性指標粒子に付着させることができる。例えば、ＳＥＲＳ活性指標粒子に付着される結合メンバーのタイプは、異なる標的微生物に対して、異なるアフィニティーを有する複数の試薬をもたらすために、変化させることができる。このようにして、当該アッセイは、対象の１以上の微生物を検出することができ、または、１以上の微生物に対し、異なる選択性または感受性を示すことができる。ＳＥＲＳ活性指標粒子は、１以上の微生物の存在、または１以上の微生物の濃度が変化し得る培養試料に対して調製することができる。
ＳＥＲＳアッセイ試薬は、当該アッセイの必要性に応じて、１以上のタイプの標識（例えば、１以上のタイプのＳＥＲＳ活性レポーター分子）を含むことができる。例えば、異なる波長でラマンシグナルを示す、ＳＥＲＳ活性レポーター分子を用いて、対象の特定の微生物に対するユニークなラマン「フィンガープリント」を生成することができ、これにより、アッセイの特異度を上げることができる。異なる特異的結合メンバーに付着される、異なるレポーター分子をナノ粒子コアに付着させ、１以上の対象の微生物（例えば、複数の対象の微生物）を検出することができる試薬をもたらすことができる。
本発明の実施態様において、ＳＥＲＳ−ＨＮＷ技術のマルチプレックスな性能を用いて、血流感染を引き起こす最も普遍的な生物のうちの６つを同定する。ＳＥＲＳ活性指標粒子の６つの異なるタイプ、または「フレーバー（ｆｌａｖｏｒ）」（各々、検出される６つの生物のうちの１つに特異的な抗体と結合されている）を、血液培養ボトルに入れる。また、ＳＥＲＳ活性指標粒子とサンドイッチを形成することができる磁気捕捉粒子を管内に入れる。磁気捕捉粒子は、複数のＳＥＲＳ活性指標粒子をサンドイッチする、一般的な捕捉抗体、または抗体のセットが存在するように、あるいは、管内に６つの別々の磁性結合体（それぞれの磁性結合体は、６つのＳＥＲＳ活性指標粒子のそれぞれと一意的にサンドイッチを形成することができる）が存在するように、構成されることができる。磁性ペレットが形成され、ペレット由来のＳＥＲＳシグナルが読み取られる場合、測定されたラマンスペクトルは、ペレット中に存在するＳＥＲＳ活性指標粒子の各フレーバーからの結果であり、ＳＥＲＳ活性指標粒子の存在は、そのＳＥＲＳ活性指標粒子が特異的な微生物の存在を示唆する。デコンボリューションアルゴリズム（Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）は、測定された凝集スペクトルから、６つの個々のＳＥＲＳ活性指標粒子のスペクトルを効果的に区別することができる。
図５３において、２つのＳＥＲＳ活性指標粒子のみを用いた、マルチプレックスな実施態様の概略を示す。好ましい実施態様において、ＳＥＲＳシグナルと、ｐＨセンサーシグナルの両方を同時にモニターするために、標準的なガスセンサー（例えば、ＢＡＣＴＥＣ（商標））が用いられる。これにより、ＳＥＲＳ−ＨＮＷ抗体により認識されない任意の微生物の効果的な検出が可能となる。
ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５７７００（Ｗｅｉｄｅｍａｉｅｒら。２００８年３月２０日出願）でさらに記述されるように、ＳＥＲＳ活性指標粒子を含む本開示アッセイにおいて、検出可能なシグナルを発することができ、および、１以上のＳＥＲＳ活性指標粒子と関連する、少なくとも１つのＳＥＲＳ活性レポーター分子に対するアフィニティーを有する、特異的結合メンバーの少なくとも１つと関連する、レポーター分子の第二のアリコートの、試料および／または少なくとも１つのＳＥＲＳ活性レポーター分子をその中に配置する前に、同時に、または後で、添加することにより、ＳＥＲＳスペクトルを増幅することができ、ここで、レポーター分子の第二のアリコートは、ＳＥＲＳ活性指標粒子と関連するＳＥＲＳ活性レポーター分子の少なくとも１つと同じである。一部の実施態様において、レポーター分子の第二のアリコートは、ＳＥＲＳシグナルを発することができるＳＥＲＳ活性指標粒子と関連する、ＳＥＲＳ活性レポーター分子を含有する。レポーター分子の第二のアリコートがアッセイ管内に配置される実施態様において、レポーター分子の第二のアリコートの特異的結合メンバーは、捕捉領域を含有する、または磁気捕捉粒子に付着される、特異的結合メンバーの１つ以上を認識しない。
Ｆ．ワークフローの例
１つの例示的な実施態様によると、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの検出および同定のための培養試料が、前述の実施態様と連動して提示される。１つの実施態様において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは最初に、富化管内で、非選択的培地で培養され、次いで、検出試薬および第二の選択培地を含有する検出バイアルへと生物学的に封じ込めされた状態で移送される。多くの場合、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの検証には、任意選択的な補充がなされた培地を培地調製管に添加することが含まれる。次いで、当該培地を富化管内に分注し、試料を富化管内へ添加する。任意選択的に、試料は、富化管への添加の前にホモジナイズ（例えば、消化または混合により）される。この場合において、ホモジナイザーへの試料の添加と共に、培地調製管からの培地が添加される。ホモジナイズの後、試料を、富化管へと移し、管をフタで閉める。培地および試料が富化管に添加され、富化管のフタが閉められた時点で、一連の管理同定の目的のために管上のバーコードが読み取られても良い。次いで、富化管があらかじめ決められた期間、インキュベートされる。インキュベーションの後で、富化管および検出バイアルが、バーコードリーダーでスキャンされても良い。検出バイアルには、選択培地および、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの検出に特異的な検出試薬が含まれる。検出バイアル中の培地が脱水されている場合においては、再構成液が検出バイアルに添加され、当該バイアルは混合のために転倒混和される。次いで、富化容器を傾け、所望量の試料（例えば、１００μＬ）で各貯水容器を満たす。検出バイアルを富化管へと挿入し、生物学的封じ込めでの検出バイアルへの試料の移送のために、開口部内に針をはめ込む。次いで、検出バイアルを、試料のインキュベーションおよび自動化検証（試料の沈殿および光学的分析を含む）のために、リアルタイム自動化システム内に挿入する。陽性試料が検出されると、検出バイアルは取り出され、バーコードスキャナーでスキャンされ、およびさらなる処理のために送られても良い。
別の例示的な実施態様において、Ｌｉｓｔｅｒｉａの検出および同定のための培養試料が、前述の実施態様と連動して提示される。好ましい実施態様において、検出バイアル内でのＬｉｓｔｅｒｉａの培養は、ワークフローを通じて１つの培地が用いられるように、富化管で用いられたものと同じ培地で行われる。多くの場合、Ｌｉｓｔｅｒｉａの検証には、任意選択的な補充がなされた培地を培地調製管に添加することが含まれる。次いで、当該培地を富化管内に分注し、試料を富化管内へ添加する。任意選択的に、試料は、富化管への添加の前にホモジナイズ（例えば、消化または混合により）される。この場合において、ホモジナイザーへの試料の添加と共に、培地調製管からの培地が添加される。ホモジナイズの後、試料を、富化管へと移し、管をフタで閉める。培地および試料が富化管に添加され、富化管のフタが閉められた時点で、一連の管理同定の目的のために管上のバーコードが読み取られても良い。次いで、富化管があらかじめ決められた期間、インキュベートされる。インキュベーションの後で、富化管および検出バイアルが、バーコードリーダーでスキャンされても良い。検出バイアルには、Ｌｉｓｔｅｒｉａの検出に特異的な検出試薬が含まれる。次いで、富化容器を傾け、所望量の試料（例えば、５ｍＬ）で各貯水容器を満たす。検出バイアルを富化管へと挿入し、生物学的封じ込めでの検出バイアルへの試料の移送のためのポート内に、針をはめ込む。次いで、検出バイアルを、試料のインキュベーションおよび自動化検証（試料の沈殿および光学的分析を含む）のために、リアルタイム自動化システム内に挿入する。陽性試料が検出されると、検出バイアルは取り出され、バーコードスキャナーでスキャンされ、およびさらなる処理のために送られても良い。
Ｇ．再構成ステーション
図９３〜９５において、本発明の実施態様と併せて用いられ得る再構成ステーションを図示する。上述のように、再構成液は、検出バイアル中の培地が脱水されている場合に、検出バイアルに添加されても良い。再構成ステーションにより、所望量の測定が容易となり、検出バイアル内に保持される真空状態を保ったまま、再構成液を添加することができる。図９３において、再構成ステーション３５０がブラダー３５２またはピンチバルブ３５４を備えた類似の第二の貯水容器を含む場合の実施態様を図示する。再構成ステーション３５０は、液体がメインの貯水容器から、チュービング３５８を通って、バルブ３５４が空いていればブラダー３５２へと流れるように構成される、自重送り装置である。例えば、レバー３５６を時計回りに回して、バルブ３５４でチュービングを閉鎖するために、チュービング３５８をはめ込む、または締め付けても良い。次いで、ユーザーは、アクセスポート内に配置された針をストッパー３６４へとはめ込み、チューブ内へと再構成液を引き込むために、検出バイアル３６０を、アクセスポート３６２内へと挿入することができる。検出バイアル３６０をアクセスポート３６２から取り出した後、ストッパー３６４は、その中の真空状態を維持するために検出バイアルを密封するように構成される。さらに、ブラダー３５２は、再構成ステーション３５０が常に準備状態となるように、自動的に再充填するように構成される。
別の方法として、図９４において、他の実施態様に従う、ロータリーバルブ３７６を有する再構成ステーション３７５を図示する。この点において、再構成液は、貯水容器３７８に貯蔵され、第二の貯水容器またはブラダーに自重送りされる。ロータリーバルブ３７６が「閉じた」位置にある場合、ブラダーからの漏出により、液体はアクセスポート３８０から流れ出ることができない。液体を移すために、ロータリーバルブ３７６は、「開いた」位置に回転されても良い。検出バイアル３８２は、アクセスポート３８０内に挿入され、それにより、アクセスポート内に配置された針をストッパーがはめ込む際に、ブラダーから液体を取り出すことができる。バルブ３７６を開放位置へと回転させることにより、ブラダー内へと送り込む自重送りラインも閉鎖される。バルブ３７６が閉鎖位置に回転して戻されると、ブラダーは自動的に再充填されることができる。ロータリーバルブ３７６は、ノブ、またはバルブの開閉に適した他のメカニズムにより操作されても良いが、回転作業は、バルブのそのような開閉を行うために必須なものではない（例えば、線形モーションを介して作動されるバルブ等）。
図９５において、本発明の他の実施態様による、ロータリーバルブ４０４と液体連通しているシリンジ４０２を含む、再構成ステーション４００を図示する。前述の実施態様とは異なり、再構成ステーション４００は、自重送りではなく、再構成液は、シリンジの動作を介して、貯水容器４０６からシリンジ４０２へと引き出される。この点において、シリンジ４０２は、所望量の再構成液を、シリンジ、またはロータリーバルブ４０４が閉鎖位置にある際にその中に配置されるブラダーへと引き出すように構成されても良い。シリンジが満たされた時点で、バルブ４０４を開始位置へと回転させることにより、アクセスポート４０８内に検出バイアルを挿入し、アクセスポート４０８に配置された針をはめ込むことによって、シリンジに含有される液体にアクセスすることができる。バルブ４０４を開始位置に回転することによって、貯水容器４０６からブラダーへ供給するラインが閉鎖される。繰り返すが、回転バルブ４０４は、バルブの開閉を容易にする任意の適切なメカニズムであっても良いことを理解されたい。同様に、シリンジ４０２は、貯水容器４０６から所望量の再構成液を引き出すように構成された任意の適切なデバイスであっても良い。
表現された実施例は、外部電源を必要としない再構成ステーションを示している。当業者であれば、電源供給された液体測定システムを思い描くことができるであろう。
ＩＩＩ．代表的な微生物
本発明の実施態様を用いて、細菌血症および真菌血症から生じる血流感染疑いを検出することができる。通常、複数の血液試料は、対象（例えば、患者）の別々の血管から、異なる時間の間隔で、対象の症状（例えば、発熱の所見またはいくつかの他の初診等）に応じて採取される。血液試料量（例えば、成人に対して約３ｍＬ〜約１０ｍＬ、小児試料にたいしては１ｍＬ）は、採取の後、血液培養増殖ボトルへと配置することができる。各採取サイクルの典型として、１つの試料は、好気性生物に適した血液培養増殖ボトルへと配置され、そして１つの試料は、嫌気性生物に適した血液培養増殖ボトルへと配置される。
血液培養試料中の微生物増殖測定としてのガス産生の増加を検出する、当分野公知の方法とは異なり、本開示方法は、細胞内病原体（例えば細菌、ウイルス）の検出が可能となるという利点がある。細胞内微生物または病原体は、他の細胞（例えば真核細胞）内で増殖および再生産されるため、当分野公知のガスセンサーを用いて検出することはできない。本開示方法で検出することができる代表的な細胞内微生物としては限定されないが、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが挙げられる。
表１に示される微生物は、細菌血症または敗血症の原因として、対象において普遍的に発見され、対象において発見される順でランク付けされている。また、血液培養試料における全陽性結果の合計８０％を占めた微生物、および、治療不十分であるとみなされる微生物を、表２において注釈している。
食物、水、化粧品、医薬品および環境試料は通常、限定されないが、以下の微生物に対してスクリーニングされる：腸内毒素原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管出血性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、腸管侵入性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、腸管凝集性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＡＥＣ）、びまん性付着Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、志賀毒素産生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）、大腸菌Ｏ１５７、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、大腸菌Ｏ１０４、大腸菌Ｏ２６、大腸菌Ｏ４５、大腸菌Ｏ１０３、大腸菌Ｏ１１１、大腸菌Ｏ１２１および、大腸菌Ｏ１４５、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ種、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｌｓｈｍｅｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｏａｇｕｌａｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ（正式には、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ種、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ． ｐｕｔｉｄａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、Ｓｅｒｒａｔｉａ種、 Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ種、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ種、酵母およびカビ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ種、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｍｕｃｏｒ種、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ種、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ種、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ種、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ種、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ種、Ｕｓｔｉｌａｇｏ種、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ種、Ｍｉｚｕｋａｂｉ種、Ｓｐｉｎｅｌｌｕｓ種、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ種、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ種、Ｍｏｎｉｌｉａ種、Ｍａｎｏｓｃｕｓ種、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ種、Ｏｉｄｉｕｍ種、Ｏｏｓｐｒｏａ 種、Ｔｈａｍｎｉｄｉｕｍ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種）。
さらに、これらの試料は多くの場合、限定されないが、大腸菌群、糞便大腸菌群、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、大腸菌ファージ、またはバクテリオファージを含む、指標生物に対してスクリーニングされる。
加えて、一部の試料は、臨床的に重要な微生物の抗生物質耐性株（限定されないが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびバンコマイシン抵抗性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種を含む）に対してスクリーニングされる。
本発明の実施態様に従い検出することができる微生物は、限定されないが、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、抗酸菌性グラム陽性細菌、真菌（酵母を含む）が挙げられる。本発明の１つの実施態様に従い、代表的な細菌および真菌微生物、すなわち抗原であって、本開示血液培養アッセイの標的となるものを、本明細書の以下に提示する。本明細書の別の箇所で記述したように、本明細書の以下に提示される抗原に特異的な抗体は、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ’、Ｆａｂ”、組換え抗体、単鎖抗体（ＳＣＡ）、ヒト化抗体、またはキメラ抗体が挙げられる。全ての場合において、抗体は、本明細書の以下にリストアップされる抗原に特異的な１以上のＣＤＲを有している。抗体は当分野に公知であり、選択された抗原に対して容易に利用可能である。一部の例において、抗原は細胞表面上に提示されている。他の例において、抗原は細胞から分泌され、血液培養培地中に「遊離抗原」として存在している。さらに他の例において、遊離抗原および結合抗原の両方が、細菌血症または真菌血症を確認するために同時に測定することができる。
培養管内で求められる診断情報に関わらず、特異的結合メンバーは多くの場合、広範な特異度を有している。特異的結合メンバーは、汎株、汎血清群、汎種、または汎属であっても良い。
細菌細胞壁は、複合体、半硬質構造であり、生物の形態を規定し、下層の壊れやすい細胞膜を囲み、外部環境から細菌細胞を防御する。細菌細胞壁は、ペプチドグリカンとして知られる高分子ネットワークから構成され、細菌細胞周辺に格子を形成する炭水化物およびポリペプチドを含有する。細菌細胞壁により、細菌細胞に機械的安定性がもたらされ、浸透圧溶解から防御する。本発明に最も適切な部分は、細菌の主要な種類を識別するために用いられる細胞壁の化学的組成物である。
細菌の異なる種の細胞壁は、厚さ、構造および組成において、大きく異なり得る。しかしながら、２つの主な細菌細胞壁のタイプがあり、所与の細菌種が細胞壁のうちの１つ、または他方のタイプのいずれを有しているかは、通常、ある色素に対する細胞の反応により決定されることができる。おそらく、最も広く用いられている細菌染色の色素はグラム染色である。このクリスタルバイオレットおよびヨード染色で染色された場合、染色を維持する細菌をグラム陽性、そうではないものをグラム陰性と呼ぶ。
本明細書において、「グラム陽性細菌」とは、グラム染色された際に色素を保持し、青紫に染まる細菌の株、型、種または属を意味する。
本明細書において、「グラム陰性細菌」とは、グラム染色された際に色素を保持せず、青紫に染まらない細菌の株、型、種または属を意味する。当業者はもちろん、色素の濃度および染色時間に応じてグラム陰性細菌がややグラム染色され、軽く青紫に染まるようになることを認識している。しかしながら、同じグラム染色製剤で、同じ時間、染色されたグラム陽性細菌と比較すれば、グラム陰性細菌は、グラム陽性細菌と比較して、非常に薄い青紫である。
代表的なグラム陰性細菌としては、限定されないが、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科にある細菌が挙げられる。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科にある代表的なグラム陰性細菌としては、限定されないが、例えば大腸菌種（モデル）等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属にある細菌が挙げられる。例えば抗体等の、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科にグラム陰性細菌に対するアフィニティーを有する適切な結合メンバーとしては、限定されないが、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）または外膜タンパク質（ＯＭＰ）に特異的に結合する抗体が挙げられる。ＬＰＳ Ｌｉｐｉｄ−Ａ成分、ＬＰＳ Ｏ−Ｒｅｇｉｏｎ、および内部コア領域および外部コア領域を有するＬＰＳコアは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属にあるグラム陰性細菌に対するアフィニティーを有する特異的結合メンバーに対する適切な抗原としての役割を果たすことができる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の代表的なメンバーとしては、以下が挙げられる：Ｅ．ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａ、Ｅ．ａｌｂｅｒｔｉｉ、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ、ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅ．ｈｅｒｍａｎｎｉｉ、およびＥ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ。
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科にある他の代表的な属は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属であり、限定されないが、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（モデル）が挙げられる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属のグラム陰性細菌に対するアフィニティーを有する、適切な結合メンバー（例えば、抗体）としては、限定されないが、ＬＰＳ、莢膜多糖（ＣＰＳ）またはＫ抗原（約５０〜約７０ｋＤａの分子量を有する高分子量莢膜多糖）またはＯＭＰに特異的に結合するものが挙げられる。
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の代表的なメンバーは、Ｋ．ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｋ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｋ．ｏｒｎｉｔｈｉｎｏｌｙｔｉｃａ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋ．ｏｚａｅｎａｅ、Ｋ．ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓ、Ｋ．ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ、Ｋ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ、Ｋ．ｔｒｅｖｉｓａｎｉｉ、およびＫ．ｖａｒｒｉｃｏｌａが挙げられる。
グラム陰性細菌にはまた、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ科に属する細菌が挙げられる。Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ科の代表的なグラム陰性細菌としては、限定されないが、例えばＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ種（モデル）等の、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属にある細菌が挙げられる。Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ科のグラム陰性細菌に対するアフィニティーを有する、適切な結合メンバー（例えば、抗体）としては、限定されないが、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ）または、主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）を含む、外膜タンパク質（ＯＭＰ）に特異的に結合するものが挙げられる。
代表的なＣｈｌａｍｙｄｉａ属のメンバーとしては、Ｃ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ、Ｃ．ｓｕｉｓ、および、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓが挙げられる。
適切なグラム陰性細菌はまた、限定されないが、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（モデル）を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属にあるもの、限定されないが、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（モデル）を含む、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属にあるもの、および、限定されないが、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ（モデル）を含む、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属にあるものが挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のグラム陰性細菌に対するアフィニティーを有する、特異的結合メンバーにより認識される適切な抗原としては、限定されないが、ＬＰＳ、ＯＭＰ、鉄制御膜タンパク質（ＩＲＭＰ）、鞭毛、ムコイド菌体外多糖（ＭＥＰ）および、外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）が挙げられる。Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属のグラム陰性細菌に対するアフィニティーを有する、特異的結合メンバーにより認識される適切な抗原としては、限定されないが、ＬＰＳ、鞭毛、主要細胞外プロテアーゼ、ＯＭＰ、ＩｇＧ Ｆｃに結合する３０ｋＤａ露出タンパク質、および４８．５ｋＤａ膜タンパク質が挙げられる。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属のグラム陰性細菌に対するアフィニティーを有する、特異的結合メンバーにより認識される適切な抗原としては、限定されないが、ＬＰＳ、Ｄ−ｒｈａｍｏｓを有するＬＰＳ、Ｂａｐ（バイオフィルム関連因子）、莢膜多糖（ＣＰＳ）およびＯＭＰが挙げられる。
代表的なグラム陽性細菌としては、限定されないが、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科にある細菌が挙げられる。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科にある細菌グラム陽性細菌としては、限定されないが、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（モデル）種を含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌が挙げられる。グラム陽性細菌に対するアフィニティーを有する適切な結合メンバー（例えば抗体）としては、限定されないが、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、ペプチドグリカン、バイオフィルム抗原（１４０／２００ｋＤａバイオフィルム抗原および２０ｋＤａポリサッカリド（ＰＳ）を含む）、またはＬｉｐｉｄ Ｓ（グリセロホスホ−糖脂質）に特異的に結合するものが挙げられる。限定されないが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のグラム陽性細菌に対するアフィニティーを有する、他の適切な結合メンバーとしては、タイコ酸、微生物表面成分認識付着マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、鉄反応性表面決定基Ａ（ＩｓｄＡ）、１１０ｋＤａ、９８ｋＤａおよび６７ｋＤａタンパク質、ＲＮＡＩＩＩ活性化タンパク質（ＲＡＰ）、ＲＮＡＩＩＩ活性化タンパク質の標的（ＴＲＡＰ）、α毒素、ポリ−ｎ−スクシニルβ−１−６グルコサミン（ＰＮＳＧ）、リパーゼ、スタフィロリシン、ＦｎＢＰＡ、ＦｎＢＰＢ、ブドウ球菌免疫優性抗原、莢膜多糖、またはメチシリン耐性関連細胞表面抗原に特異的に結合するものが挙げられる。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の代表的なメンバーは、以下が挙げられる：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．ｃａｐｒａｅ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｆｅｌｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒｉ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓ．ｖｉｔｕｌｕｓ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ、およびＳ．ｘｙｌｏｓｕｓ。
他の代表的なグラム陽性細菌としては、限定されないが、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｄ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓとしてもまた知られる）およびＥ．ｆａｅｃｉｕｍを含む、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌である。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓに対するアフィニティーを有する、適切な結合メンバー（例えば抗体）としては、限定されないが、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、コラーゲン結合表面抗原（ＣＮＡ）、凝集物質（ＡＳ）、莢膜多糖、タイコ酸様莢膜多糖、Ｅｓｐ遺伝子産物、Ｇｌｓ２４、Ｅｐａ遺伝子産物、Ａｃｅ（ＥＣＭバインダー）、またはペプチドグリカンに特異的に結合するものが挙げられる。Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍに対するアフィニティー有する、例えば抗体等の適切な結合メンバーは、限定されないが、ＡＣＭタンパク質（コラーゲンバインダー）またはＳａｇＡタンパク質に特異的に結合するものが挙げられる。
代表的な抗酸性グラム陽性細菌としては、限定されないが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の細菌が挙げられる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の抗酸性グラム陽性細菌としては、限定されないが、例えばＭ．ｂｏｖｉｓ（モデル）種およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ種（モデル）等の、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌が挙げられる。抗酸性グラム陽性細菌に対するアフィニティーを有する、抗体等の適切な結合メンバーとしては、限定されないが、アラビノマンノン（ａｒａｂｉｎｏｍａｎｎｏｎ、ＡＭ）、リポアラビノマンノン（ＬＡＭ）または３８ｋＤａ抗原に特異的に結合するものが挙げられる。
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の代表的なメンバーとしては、以下が挙げられる：Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ａｇｒｉ、Ｍ．ａｉｃｈｉｅｎｓｅ、Ｍ．ａｌｖｅｉ、Ｍ．ａｒｕｐｅｎｓｅ、Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ａｕｂａｇｎｅｎｓｅ、Ｍ．ａｕｒｕｍ、Ｍ．ａｕｓｔｒｏａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複合体（ＭＡＣ）、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｓｉｌｖａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ａｖｉｕｍ“ｈｏｍｉｎｉｓｓｕｉｓ”、Ｍ．ｂｏｅｎｉｃｋｅｉ、Ｍ．ｂｏｈｅｍｉｃｕｍ、Ｍ．ｂｏｌｌｅｔｉｉ、Ｍ．ｂｏｔｎｉｅｎｓｅ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｒａｎｄｅｒｉ、Ｍ．ｂｒｉｓｂａｎｅｎｓｅ、Ｍ．ｂｒｕｍａｅ、Ｍ．ｃａｎａｒｉａｓｅｎｓｅ、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ．ｃｅｌａｔｕｍ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｃｈｉｍａｅｒａ、Ｍ．ｃｈｉｔａｅ、Ｍ．ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｍ、Ｍ．ｃｈｕｂｕｅｎｓｅ、Ｍ．ｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｅ、Ｍ．ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎｅｎｓｅ、Ｍ．ｃｏｎｆｌｕｅｎｔｉｓ、Ｍ．ｃｏｎｓｐｉｃｕｕｍ、Ｍ．ｃｏｏｋｉｉ、Ｍ．ｃｏｓｍｅｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｄｉｅｒｎｈｏｆｅｒｉ、Ｍ．ｄｏｒｉｃｕｍ、Ｍ．ｄｕｖａｌｉｉ、Ｍ．ｅｌｅｐｈａｎｔｉｓ、Ｍ．ｆａｌｌａｘ、Ｍ．ｆａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｍ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｍ、Ｍ．ｆｌｕｏｒｏａｎｔｈｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ ｓｕｂｓｐ．ａｃｅｔａｍｉｄｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｅ、Ｍ．ｇａｄｉｕｍ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｇｉｌｖｕｍ、Ｍ．ｇｏｏｄｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ．ｈａｓｓｉａｃｕｍ、Ｍ．ｈｅｃｋｅｓｈｏｒｎｅｎｓｅ、Ｍ．ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｎｓｅ、Ｍ．ｈｉｂｅｒｎｉａｅ、Ｍ．ｈｏｄｌｅｒｉ、Ｍ．ｈｏｌｓａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｈｏｕｓｔｏｎｅｎｓｅ、Ｍ．ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｊｅｃｔｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｋｏｍｏｓｓｅｎｓｅ、Ｍ．ｋｕｂｉｃａｅ、Ｍ．ｋｕｍａｍｏｔｏｎｅｎｓｅ、Ｍ．ｌａｃｕｓ、Ｍ．ｌｅｎｔｉｆｌａｖｕｍ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ、Ｍ．ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｅ、Ｍ．ｍａｇｅｒｉｔｅｎｓｅ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｅ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ｍｏｎａｃｅｎｓｅ、Ｍ．ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｅｎｓｅ、Ｍ．ｍｏｒｉｏｋａｅｎｓｅ、Ｍ．ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｍｕｒａｌｅ、Ｍ．ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｅ、Ｍ．ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍ．ｎｅｗｏｒｌｅａｎｓｅｎｓｅ、Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｎｏｖｏｃａｓｔｒｅｎｓｅ、Ｍ．ｏｂｕｅｎｓｅ、Ｍ．ｐａｌｕｓｔｒｅ、Ｍ．ｐａｒａｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｐａｒｍｅｎｓｅ、Ｍ．ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｐｈｏｃａｉｃｕｍ、Ｍ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ、Ｍ．ｐｏｒｃｉｎｕｍ、Ｍ．ｐｏｒｉｆｅｒａｅ、Ｍ．ｐｓｅｕｄｏｓｈｏｔｔｓｉｉ、Ｍ．ｐｕｌｖｅｒｉｓ、Ｍ．ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍ．ｐｙｒｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｍ．ｒｈｏｄｅｓｉａｅ、Ｍ．ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｅｏｕｌｅｎｓｅ、Ｍ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｓｈｉｍｏｉｄｅｉ、Ｍ．ｓｈｏｔｔｓｉｉ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｐｈａｇｎｉ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔｉｂｉｌｅ、Ｍ．ｔｏｋａｉｅｎｓｅ、Ｍ．ｔｒｉｐｌｅｘ、Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体（ＭＴＢＣ）、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉ、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ． ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ’、Ｍ．ｔｕｓｃｉａｅ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｖａｃｃａｅ、Ｍ．ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ、Ｍ．ｗｏｌｉｎｓｋｙｉ、およびＭ．ｘｅｎｏｐｉ。
酵母を含む、代表的な真菌としては、限定されないが、例えばＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ（モデル）等のＣａｎｄｉｄａ属を含む、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科が挙げられる。Ｃａｎｄｉｄａ属に属する真菌に対するアフィニティーを有する、例えば抗体等の適切な結合メンバーは、限定されないが、マンナン、ホスホマンナン、アンノタンパク質５８（ａｎｎｏｐｒｏｔｅｉｎ ５８、ｍｐ５８）、ガラクトマンナン、ベータ−Ｄ−グルカン、メタロアビニトール、細胞壁関連グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ−（４７／４８ｋＤａ）、分泌−アスパルチル−プロテナーゼ（ＳＡＰ）、またはヒートショックプロテイン９０（ＨＳＰ−９０）に特異的に結合するものが挙げられる。
Ｃａｎｄｉｄａ属の代表的なメンバーとしては、以下が挙げられる：Ｃ．ａａｓｅｒｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ａｍａｐａｅ、Ｃ．ａｎａｔｏｍｉａｅ、Ｃ．ａｎｃｕｄｅｎｓｉｓ、Ｃ．ａｎｔｉｌｌａｎｃａｅ、Ｃ．ａｐｉｃｏｌａ、Ｃ．ａｐｉｓ、Ｃ．ａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｃ．ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｃ．ａｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ａｕｓｔｒｏｍａｒｉｎａ、Ｃ．ａｚｙｍａ、Ｃ．ｂｅｅｃｈｉｉ、Ｃ．ｂｅｒｔａｅ、Ｃ．ｂｅｒｔｈｅｔｉｉ、Ｃ．ｂｌａｎｋｉｉ、Ｃ．ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｃ．ｂｏｌｅｔｉｃｏｌａ、Ｃ．ｂｏｍｂｉ、Ｃ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｃ．ｂｕｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃ． ｂｕｔｙｒｉ、Ｃ．ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ、Ｃ．ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ、Ｃ．ｃａｓｔｒｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｃａｔｅｎｕｌａｔａ、Ｃ．ｃｈｉｌｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｃｈｉｒｏｐｔｅｒｏｒｕｍ、Ｃ．ｃｈｏｄａｔｉｉ、Ｃ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ、Ｃ．ｃｏｉｐｏｍｏｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｃｏｎｇｌｏｂａｔａ、Ｃ．ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ、Ｃ．ｄｅｎｄｒｉｃａ、Ｃ．ｄｅｎｄｒｏｎｅｍａ、Ｃ．ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ、Ｃ．ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ、Ｃ．ｄｉｖｅｒｓａ、Ｃ．ｄｒｉｍｙｄｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｅｄａｘ、Ｃ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｃ． ｅｒｇａｓｔｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｅｒｎｏｂｉｉ、Ｃ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｃ．ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ、Ｃ．ｅｕｐｈｏｒｂｉｉｐｈｉｌａ、Ｃ． ｆａｂｉａｎｉｉ、Ｃ．ｆａｍａｔａ、Ｃ．ｆａｍａｔａ ｖａｒ．ｆａｍａｔａ、Ｃ．ｆａｍａｔａ ｖａｒ．ｆｌａｒｅｒｉ、Ｃ．ｆｅｎｎｉｃａ、Ｃ．ｆｅｒｍｅｎｔｉｃａｒｅｎｓ、Ｃ．ｆｉｒｍｅｔａｒｉａ、Ｃ．ｆｌｏｒｉｃｏｌａ、Ｃ．ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｆｒｅｙｓｃｈｕｓｓｉｉ、Ｃ．ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｉｉ、Ｃ．ｆｒｕｃｔｕｓ、Ｃ．ｇａｌａｃｔａ、Ｃ．ｇｅｏｃｈａｒｅｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｇｌａｅｂｏｓａ、Ｃ．ｇｌｕｃｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ ｖａｒ． ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ ｖａｒ．ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃ．ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ、Ｃ．ｈｏｍｉｌｅｎｔｏｍａ、Ｃ．ｈｕｍｉｌｉｓ、Ｃ．ｉｎｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｃ．ｉｎｃｏｎｓｐｉｃｕａ、Ｃ．ｉｎｓｅｃｔａｌｅｎｓ、Ｃ．ｉｎｓｅｃｔａｍａｎｓ、Ｃ．ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ、Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃ．ｉｓｈｉｗａｄａｅ、Ｃ．ｋａｒａｗａｉｅｗｉｉ、Ｃ．ｋｅｆｙｒ、Ｃ．ｋｒｉｓｓｉｉ、Ｃ．ｋｒｕｉｓｉｉ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｌａｃｔｉｓ−ｃｏｎｄｅｎｓｉ、Ｃ．ｌａｕｒｅｌｉａｅ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｌｌａｎｑｕｉｈｕｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｌｏｄｄｅｒａｅ、Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃ．ｌｙｘｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｍａｇｎｏｌｉａｅ、Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｃ．ｍａｒｉｓ、Ｃ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｃ．ｍｅｌｉｂｉｏｓｉｃａ、Ｃ． ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｃ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ、Ｃ．ｍｉｌｌｅｒｉ、Ｃ． ｍｏｇｉｉ、Ｃ． ｍｏｎｔａｎａ、Ｃ． ｍｕｌｔｉｇｅｍｍｉｓ、Ｃ．ｍｕｓａｅ、Ｃ．ｎａｅｏｄｅｎｄｒａ、Ｃ．ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｎｅｍｏｄｅｎｄｒａ、Ｃ．ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｎｏｒｖｅｇｉｃａ、Ｃ．ｏｄｉｎｔｓｏｖａｅ、Ｃ．ｏｌｅｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｏｖａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｌｍｉｏｌｅｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｐａｌｕｄｉｇｅｎａ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｒｕｇｏｓａ、Ｃ．ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｃ．ｐｅｌｔａｔａ、Ｃ．ｐｅｔｒｏｈｕｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｐｉｇｎａｌｉａｅ、Ｃ．ｐｉｎｉ、Ｃ．ｐｏｐｕｌｉ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｌａｍｂｉｃａ、Ｃ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ、Ｃ．ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｃ．ｒａｉｌｅｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｒｅｕｋａｕｆｉｉ、Ｃ．ｒｈａｇｉｉ、Ｃ．ｒｏｂｕｓｔａ、Ｃ．ｒｕｇｏｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｃ．ｒｕｇｏｓａ、Ｃ．ｓａｉｔｏａｎａ、Ｃ．ｓａｋｅ、Ｃ．ｓａｌｉｄａ、Ｃ．ｓａｌｍａｎｔｉｃｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｓａｎｔａｍａｒｉａｅ、Ｃ． ｓａｎｔｊａｃｏｂｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｓａｖｏｎｉｃａ、Ｃ．ｓｃｈａｔａｖｉｉ、Ｃ．ｓｅｑｕａｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅ、Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅ ｖａｒ．Ｉｎｓｅｃｔｏｓａ、Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅ ｖａｒ． ｌｉｇｎｏｓａ、Ｃ．ｓｈｅｈａｔａｅ ｖａｒ．ｓｈｅｈａｔａｅ、Ｃ．ｓｉｌｖａｅ、Ｃ．ｓｉｌｖａｎｏｒｕｍ、Ｃ．ｓｉｌｖａｔｉｃａ、Ｃ．ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｒｉｘ、Ｃ．ｓｏｌａｎｉ、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｓｏｐｈｉａｅ−ｒｅｇｉｎａｅ、Ｃ．ｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ、Ｃ．ｓｏｒｂｏｓａ、Ｃ．ｓｏｒｂｏｘｙｌｏｓａ、Ｃ．ｓｐａｎｄｏｖｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｓｔｅｌｌａｔａ、Ｃ．ｓｕｃｃｉｐｈｉｌａ、Ｃ．ｓｕｅｃｉｃａ、Ｃ．ｔａｎｚａｗａｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｔａｐａｅ、Ｃ．ｔｅｃｈｅｌｌｓｉｉ、Ｃ． ｔｅｎｕｉｓ、Ｃ．ｔｏｒｒｅｓｉｉ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｔｓｕｃｈｉｙａｅ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｖａｃｃｉｎｉｉ、Ｃ．ｖａｌｄｉｖｉａｎａ、Ｃ．ｖａｌｉｄａ、Ｃ．ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｉｉ、Ｃ．ｖａｒｔｉｏｖａａｒａｅ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｖｉｎｉ、Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃ．ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ、Ｃ．ｘｅｓｔｏｂｉｉ、およびＣ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ。
メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株に対する特異性を有する、例えばＡｕｒｏｇｒａｂ（商標）等の治療抗体もまた、捕捉または指標表面上で用いることができる。同様に、ヒートショックプロテインＨＳＰ９０に対する特異性を有する治療様モノクローナル抗体（ｍａｂ）Ｍｙｏｇｒａｂ（商標）（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）もまた、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出に用いることができる。
本開示のＳＥＲＳ活性指標粒子は、例えば増殖を支持するために用いられる培養培地、全血、ＳＰＳ抗凝血剤、食物微粒子および添加剤の成分等の、培養環境中に存在し得る、他の多くの光学活性物質から識別することができる。さらに、特異的ＳＥＲＳ活性指標粒子は、少量の細菌細胞の検出を行うために必要なシグナル強度を示す。加えて、様々なＳＥＲＳ活性指標粒子（各々が、ユニークなＳＥＲＳ特性を有する）により、血液培養試料を、哺乳類（例えば、ヒト）の血液において通常、存在することができる複数の微生物（例えば、２０）のうちの任意の１つに対して調査することができるようになる。そのような実施態様において、各特定の微生物の検出は同時に行うことができ、本明細書において、それを「マルチプレックスアッセイ」と呼称する。
例えば血液培養等の、１つの実施態様によると、本開示のマルチプレックスアッセイの主要な標的は、以下が挙げられる：コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｖｉｒｉｄａｎｓ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、および、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ。そのような複数の標的を、一部の実施態様においては、本開示のマルチプレックスアッセイにより同時に検出することができる。
ＩＶ．代表的な培養培地
本発明の実施態様での使用に適した代表的な培養培地を、以下に提示する。当業者であれば、本開示の製剤は、特定の実施内容の必要性に応じて改変し得ることが認識される。従って、特定のアプリケーションに応じて、これらの製剤に、ＣＯ２、Ｏ２、Ｎ２およびその組合せを付加し、好気性、嫌気性、または微好気性の増殖に適した環境を作り出すことができる。任意選択的に、一部の培養培地は、培養培地から、培養の間に産生された代謝物、または対象の血液試料中に存在し得る抗生物質または免疫成分等の干渉物を単離する（すなわち、取り出す）ための吸着剤を含有する。例えば、米国特許第５，６２４，８１４号（その全体で参照により本明細書に援用される）を参照のこと。例えば、ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｍｅｄｉａ Ｐｌｕｓ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ、ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｐｌｕｓ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆおよび、ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＰＥＤＳ Ｐｌｕｓ／Ｆ（それぞれ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙより、入手できる）は全て、血液培養培地中の微生物増殖を阻害し得る抗生物質の単離のための樹脂を含有している。当該樹脂は血液のいずれの成分よりも直径が十分に大きく、血液中に存在する哺乳類細胞よりも固い。培養吸着剤の他の例は、食物試料および環境試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａを選択培養するために用いられている、様々なＴｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ Ｂｒｏｔｈ中に存在する沈殿炭酸カルシウム（１％〜２．５％ｗ／ｖ）である。炭酸カルシウム微粒子は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの増殖によるテトラチオン酸塩の還元により産生される硫酸を中性化する。
Ａ．ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｍｙｃｏ／Ｆ溶解培養バイアル
ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｍｙｃｏ／Ｆ溶解培養バイアルは、好気性微生物の増殖および検出をサポートする。より具体的には、ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｍｙｃｏ／Ｆ溶解培養バイアルは、血液検体から抗酸菌、ならびに、血液および滅菌体液から酵母ならびに真菌を採取するための、好気性血液培養培地に対する添加物として用いるための、非選択的培養培地である。
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ）およびｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ以外の抗酸菌（ＭＯＴＴ）、特にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ複合体（ＭＡＣ）は再興感染症となっている。１９８５年から１９９２年にかけて、報告されるＭＴＢの症例数は、１８％増加した。１９８１年〜１９８７年の間、ＡＩＤＳ症例のサーベイランスにより、ＡＩＤＳを有する患者の５．５％が、播種性非結核性抗酸菌感染症（例えば、ＭＡＣ）に罹患していた。１９９０年までに、播種性非結核性抗酸菌感染症の増加症例は、７．６％の累積発症率となっていた。１９８０年代初期から、真菌血症の症例も、着実に増えてきている。これらの増加により、真菌血症および抗酸菌症に対する有効な診断手段の必要性が高まっている。
本開示製剤の成分には、限定されないが、クエン酸第二鉄アンモニウムもしくは、抗酸菌および真菌の特定の株に鉄源を供給する等価物、または、サポニンもしくは等価の血液溶解剤、および、栄養補給をもたらすための特定のタンパク質および糖を含有しても良い。
Ｂ．ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）１２Ｂ抗酸菌培養バイアル Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ１２
定性ＢＡＣＴＥＣ（商標）１２Ｂ抗酸菌培地は、臨床検体、唾液、胃、尿、組織、粘液膿性検体、他の体液および他の呼吸分泌物からの抗酸菌の培養および回収、他の抗酸菌からのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体の区別、ならびに、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの薬剤感受性テストのために用いることができる。
Ｃ． ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＬＹＴＩＣ／１０ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培養バイアル
Ｔｈｅ ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＬＹＴＩＣ／１０ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ Ｔｈｅ ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＬＹＴＩＣ／１０ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培地もまた、本発明の実施態様に適している。
Ｄ．ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｐｌｕｓ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ＊および、Ｐｌｕｓ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ＊培養バイアル
Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ Ｂｒｏｔｈ
ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｐｌｕｓ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ、および、Ｐｌｕｓ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培地は、血液からの微生物（細菌および酵母）の培養および回収のための定性法を提供し、１０ｍＬまでの血液の添加ができるように設計されている。これらの大容量サンプルの添加により、全体的に高い検出率と、検出までの時間短縮が得られる。
Ｅ．ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｖｉａｌｓ Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ
ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｖｉａｌｓ Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔ培養液により、血液からの嫌気性微生物の培養および回収のための定性法が提供される。
Ｆ．ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＰＥＤＳ ＰＬＵＳ（商標）／Ｆ培養バイアル
ＢＡＣＴＥＣ（商標）培養バイアルのタイプである、ＰＥＤＳ ＰＬＵＳ（商標）／Ｆ（ＣＯ２との濃縮ダイズ−カゼイン消化物培養液）は、好気培養での使用が意図されており、通常、３ｍＬ量未満である小児および他の血液検体からの、好気性微生物（主に、細菌および酵母）の培養および回収を提供する。
Ｇ．Ｓｔａｎｄａｒｄ／１０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培養バイアル
ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ／１０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培養バイアル（ＣＯ２との濃縮ダイズ−カゼイン消化物培養液）は、好気性血液培養での使用が意図されており、血液からの好気性微生物（主に、細菌および酵母）の培養および回収を提供する。
Ｈ． ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（商標）培養バイアル
ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（商標）ＦＡＮ、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（商標）ＦＮ、およびＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（商標）ＳＮ培養バイアル（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）は、嫌気性血液培養での使用が意図されており、血液からの嫌気性微生物（主に、細菌および酵母）の培養および回収を提供する。
Ｉ．選択性大腸菌培養培地
ピルビン酸塩有する改変緩衝ペプトン水（ｍＢＰＷｐ）およびアクリフラビン−セフスロジン−バンコマイシン（ＡＣＶ）サプリメントは、ＦＤＡ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ （ＢＡＭ）により規定された、下痢性大腸菌の検出のための試料富化の培地である。
Ｊ．選択性リステリア培養培地
Ｆｒａｓｉｅｒ Ｂｒｏｔｈ ＢａｓｅおよびＦｒａｓｅｒ Ｂｒｏｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種を選択的に富化し、検出する。Ｔｈｅ ＵＳＤＡ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ （ＭＬＧ）は、赤肉、鶏肉、卵および環境試料中のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの検証の際には、Ｆｒａｓｉｅｒ Ｂｒｏｔｈを使用することを推奨している（ＵＳＤＡ ＭＬＧ Ｃｈａｐｔｅｒ ８．０７、２００９年８月３日に改訂）。
Ｋ．選択性サルモネラ培養培地
Ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ Ｂａｓｅ Ｂｒｏｔｈ、Ｈａｊｎａは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの選択的富化のために設計された培地である。Ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅは、富化の直前にヨウ素およびヨウ化カリウムを添加することにより作製される。Ｔｈｅ ＵＳＤＡ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌは、牛豚肉、鶏肉、殺菌卵およびナマズ製品におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの選択的富化にこの培養液を規定している（ＵＳＤＡ ＭＬＧ Ｃｈａｐｔｅｒ ４．０５。２０１１年１月２０日に改訂）。
Ｌ．サルモネラ培養培地
上述の培養培地に加え、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの培養または維持に、いくつかの培養液（限定されないが、以下を含む）が当分野に一般的に知られている。脳心臓浸出培養液、ブリリアントグリーンサルファ富化（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、改変ブリリアントグリーン培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、緩衝ペプトン水（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、緩衝ペプトンカゼイン水（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、 Ｄｅｙ−Ｅｎｇｌｙ培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、ＥＥ培養液 Ｍｏｓｓｅｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、グラム陰性培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、グラム陰性培養液Ｈａｊｎａ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、ラクトース培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、Ｌｅｔｈｅｅｎ培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、リジンデカルボキシラーゼ培養液、Ｍ培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、マロン酸培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、ＭＲ−ＶＰ培養液、栄養培養液、Ｏｎｅ Ｂｒｏｔｈ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｏｘｏｉｄ）、フェノールレッド糖質培養液（ＢＤ ＢＢＬ（商標））、シアン化カリウム培養液、紫糖質培養液（ＢＤ ＢＢＬ（商標））、ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第一培地（ＳＤＩＸ）、サプリメント補充ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）ＳＥＬＥＣＴ（商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第一（ＳＤＩＸ）、ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）ＳＥＬＥＣＴ（商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地（ＳＤＩＸ）、Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ培地、改変Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ培地、Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ Ｒ１０培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（ＲＶＳ）ダイズ培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、Ｒａｐｐａｐｏｒｔ−Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ Ｓｏｙａペプトン培養液、セレナイト培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、セレナイト−Ｆ培養液（ＢＤ ＢＢＬ（商標））、セレナイトシスチン培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標））、テトラチオネート培養液、テトラチオネート（Ｈａｊｎａ）培養液、トリプトン培養液、トリプチカーゼソイ培養液、トリプチカーゼソイ培養液（硫酸鉄含有）、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ培養液、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｅｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ培養液（クエン酸第二鉄アンモニウム無し）および尿素培養液。
Ｍ．リステリア培養培地
上述の培養培地に加え、Ｌｉｓｔｅｒｉａの培養または維持に、いくつかの培養液（限定されないが、以下を含む）が当分野に一般的に知られている。脳心臓浸出（ＢＨＩ）培養液、緩衝Ｌｉｓｔｅｒｉａ富化培養液（ＢＬＥＢ）、栄養培養液、紫糖質醗酵培養液ベース（Ｍ１３０１５）、デキストロース、エスクリン、マルトース、ラムノース、マンニトールおよびキシロースの０．５％溶液含有、ＳＩＭ培地、トリプチカーゼソイ培養液（０．６％酵母抽出物含有）、トリプトース培養液、改変Ｖｅｒｍｏｎｔ大学（ＵＶＭ）培養液、モルホリンプロパンスルホン酸緩衝Ｌｉｓｔｅｒｉａ富化培養液（ＭＯＰＳ−ＢＬＥＢ）、Ｄｅｍｉ−Ｆｒａｓｉｅｒ、Ｆｒａｓｅｒ培養液、Ｌｉｓｔｅｒｉａ富化培養液（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ（商標）、Ｏｘｏｉｄ）、Ｏｎｅ Ｂｒｏｔｈ−Ｌｉｓｔｅｒｉａ（Ｏｘｏｉｄ）、ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｌｉｓｔｅｒｉａ培地（サプリメント補充）（ＳＤＩＸ）およびＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｆ．Ａ．Ｓ．Ｔ．（商標）培地（ＳＤＩＸ）。
Ｖ．代表的な試料
検証される試料中に存在する１以上の微生物の量は、濃度として表すことができる。濃度は、例えば、「ハイ」または「イイエ」応答等の、陽性または陰性型の結果として、定性的に表すことができ、それにより、微生物の存在の有無、または定性値として示すことができる。さらに、培養試料中の所与の微生物の濃度は、相対値、または絶対量（例えば、「定量値」として）表すこともできる。
微生物の量（すなわち、濃度）は、ゼロと等しくとも良く、探索される特定の検体の非存在、または特定の検体の濃度が当該アッセイの検出限界以下であることを示す。測定量は、いずれの付加的な測定または操作も加わっていない、シグナル（例えば、ＳＥＲＳシグナル等）であっても良い。あるいは、測定量は、限定されないが、標準物または他の微生物を含む、他の化合物の測定値に対する、特定の微生物の測定値の比率またはパーセント、差異として表すことができる。差異は、測定された微生物（複数含む）の量における減少を示す、陰性のものであっても良い。また、量は、異なる時点で測定された、微生物（複数含む）対それ自身の比率または差異として表されても良い。微生物の量は、作製されたシグナルから直接決定されても良く、または、作製されたシグナルは、試料中の微生物（複数含む）の量に対する、作製されたシグナルの値の相互関係を比較するために設計されたアルゴリズムで用いられても良い。上述のように、本発明の実施態様は、１以上の微生物の濃度をリアルタイムで測定することができるデバイスでの使用を受容する。
以下の実施例は、本開示主題の代表的な実施態様を当業者が実施するためのガイダンスを提示するためのものである。本開示および当業者の一般的なレベルを考慮すれば、以下の実施例が例示の目的のためのみであり、本開示主題の範囲から逸脱することなく、多くの変化、改変および修正を採用することができることを、当業者は認識することができる。以下の実施例は、限定の目的ではなく、解説の目的で提示される。
実施例１ 大腸菌検出までの時間に対するＳＥＲＳ ＨＮＷ試薬の効果
図５４において、大腸菌増殖の検出までの時間を、本発明の様々な実施態様での使用に適したＳＥＲＳ−ＨＮＷ試薬を用いてまたは用いずに、血液培養試料に対して比較した実験の結果を示す。
本実験において、非結合のＳＥＲＳ活性指標粒子（ＳＥＲＳ４４０タグ）および非結合の磁気捕捉粒子（Ｄｙｎａｌ（登録商標）ビーズ）を、７０％エタノールで洗浄することにより滅菌した。滅菌ＳＥＲＳ活性指標粒子および磁気捕捉粒子を、次いで、大腸菌を接種したＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ／１０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培地ボトルへと添加した。ＢＡＣＴＥＣ（商標）９０５０センサーによる、大腸菌増殖検出までの時間を、ＨＮＷアッセイ試薬の有無で、ボトル間で比較した。大腸菌無し、ＨＮＷアッセイ試薬有り、または無しのＢＡＣＴＥＣ（商標）ボトルを、陰性対照として含めた。図に見られるように、ＢＡＣＴＥＣ（商標）の検出までの時間は、本実験においてＳＥＲＳ活性指標粒子および磁性粒子の存在に影響を受けなかった。ゆえに、ＳＥＲＳ−ＨＮＷアッセイ試薬は、微生物増殖の活性に大きな影響を与えない。
実施例２ 反復沈殿は、微生物増殖と両立し得る
図５５において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの増殖を、実験の経過中にモニターし、沈殿が生物増殖にネガティブな影響を与えるかを測定した実験の結果を示す。
本実験において、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ１４０２８）を、サプリメント補充したＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ選択第一培地中で、４２℃、一晩培養して増殖させた。１：１００希釈を、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地にした。第二培地への開始接種は、栄養寒天プレート上のプレートカウントにより、１．８ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌであると測定された。接種された第二培地を、次いで、複数のチューブ（全て、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ抗体に結合されたＳＥＲＳタグと磁性粒子を含有している）へと入れた。チューブをシステム１５０（図２４参照）に置き、４２℃で増殖中、モニターした。チューブを沈殿させ、増殖中、０．５時間毎に調査した。本実験において、１、３、６、９および１１の沈殿および読み取りサイクルの後、機器からチューブを取り出した。これらのチューブは、栄養寒天プレート上に希釈物を塗ることにより、数えられた。図に見られるように、Ｓ． Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの増殖は、ＳＥＲＳタグおよび磁性粒子の存在で阻害されず、反復沈殿およびレーザーによるペレットの調査でも阻害されない。
実施例３ 沈殿頻度調整の効果
微生物増殖およびアッセイ実施に対する反復沈殿の効果を検証する実験において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ（ＡＴＣＣ９２６３）のシングルコロニーを、ＢＤ ＢＢＬ（商標）栄養寒天画線プレートからピックアップし、６ｍＬのＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標）第一培養培地（６０μＬのファージサプリメントを含有）中で４２℃、一晩培養した。一次培養の後、９０％の第二および１０％の第一ＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標）培地からなる、５ｍＬの第二培養培地を調整した。並行して、第一培地へ１：１００希釈した一次培養物を調整し、１２５μＬの希釈物を、５ｍＬの第二培地、１６μＬのＳＥＲＳタグ、および２０μＬの磁性ビーズを含有するＢＤ ＭＧＩＴ（商標）チューブへと接種した。一次培養の最終濃度の１：４０００希釈物では、およそ２．５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの播種濃度を得られた。次いで、チューブを、２つのカルーセルベースのシステム（図２４を参照のこと）のうちの１つに入れ、２４時間、４２℃、約１Ｈｚのスピードで線形攪拌した。読み取り頻度を除く全ての実験パラメーターは、２つの機器の間で同じ値で維持した。各機器に対する読み取り頻度は、５または２読み取り／時間のいずれかにセットした。
図５６において、実験から得られた代表的なデータセットを示す。２つのシステムから得られたデータを、比較のためにスケールされた強度の座標軸と共に示す。（機器間のタグウェイトの絶対強度は、光学的効率における差のために比較できないことに注意されたい。）増殖曲線の形はほぼ同一で、沈殿形成、測定および分散のサイクル数の増加は、増殖または検出を妨げなかったことが示唆された。唯一の有意差は、より頻繁に読み取りを行った曲線は、増殖反応速度に対して、より良い解像度をもたらすということである。
実施例４ サンプルチューブおよび磁石の相対的な動きの効果
再現可能な沈殿形成は、再現可能なアッセイシグナルを得るために重要な工程である。本実験は、ペレットを形成する２つの異なる方法を用いる。第一は（固定磁石）、磁石が定位置に固定されて保持され、一方で、チューブは、攪拌スローの幅いっぱいに、磁石の上を移動する。第二の好ましい構成では（連結）、図４９に示すように、磁石はチューブに沿って動く。一連の実験において、ＳＥＲＳタグは、トシル活性化磁性粒子に共有結合され、ＳＥＲＳ−磁性ビーズ前複合体（ＰＣ）を形成した。前複合体化されたビーズは、ＳＥＲＳ表面上のチオール（−ＳＨ）基と、磁性粒子の表面上のトシル（Ｔｏｓ）基との反応を介した、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０トシル−活性化磁性粒子へのＳＥＲＳ粒子の共有結合により調整された。ＰＣは、ＳＥＲＳシグナルに関してペレットが調査され得る、ペレット形成テストに対するモデルシステムとしての役割を果たす。水中、ならびに市販のＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対する第二培地（ＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標））のＰＣのペレット形成を、固定磁石および連結配置に対して比較した。これらのテストは、平らなベッドシステム構造（例えば、図２５を参照のこと）を用いて実施された。
図５７において、固定磁石で沈殿した後の、水中のＰＣの画像を示す。水中のＰＣは、０．５Ｈｚの攪拌頻度および２５ｍｍのスローで、固定された棒磁石の上でチューブを動かすことにより、１．５分間沈殿させた。攪拌を止め、磁石を３０秒間そのままにした後、チューブから棒磁石を取り除いた。図５７に示すように、１つのペレットが形成された。この画像では、磁石により磁性複合体が水中を引きずられる様子に注目している。
対照的に、図５８Ａおよび５８Ｂにおいて、固定された磁石および２つの異なる攪拌頻度を用いた、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地中でのＰＣペレットの形成を示す。ＳＤＩＸ第二培地中のＰＣは、２Ｈｚ（２１Ａ）または０．５Ｈｚ（２１Ｂ）のいずれかの攪拌頻度および２５ｍｍのスローで固定された棒磁石の上でチューブを動かすことにより、３分間沈殿させた。攪拌を止め、磁石を３０秒間そのままにした後、チューブから棒磁石を取り除いた。図５８Ａに示すように、磁性複合体の２つのペレットは、チューブの底に引き出され、チューブと磁石との間の相対的な動きの端に位置していた。遅い攪拌に対しては（図５８Ｂ）、２つのペレットは、ペレットをつなぐ明確に定まらない線に沿った磁石の動きの末端で形成された。濃く、再現可能に位置づけられたペレットに伴って、再現可能なＳＥＲＳシグナルが最も良く得られるが、図５８Ａおよび５８Ｂは、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地を介して磁性ビーズを引きずることが不可能と思われる（おそらくは、この培地中に存在する固形粒子によるものと思われる）、固定磁石構造の不利な点を際立たせる。
図５９Ａにおいて、連結磁石構造を使用した好ましい実施態様を示す。ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地中のＰＣは、１．５Ｈｚの攪拌頻度および２５ｍｍのスローで、棒磁石と連結されたチューブを動かすことにより、１．５分間沈殿させた。攪拌を止め、３０秒間、磁石をそのままにした後、チューブから磁石を取り除いた。１つの濃いペレットが、試料チューブと棒磁石が接触した場所に形成された。固定磁石構造を用いて形成されたペレットと比較して、連結磁石を用いて形成されたペレットは、より小型で、濃いものであった（図５９Ａに示す）。図５９Ｂに、０．８Ｈｚの攪拌頻度のみを用いた連結磁石での同様の実験を示す。１つのペレットが形成されたが、ペレットの中央部の拡散した粒子により明らかなように、沈んだ培地が、濃いペレットの引っ張りを妨害している。
図５７〜５９において図示される結果において、様々な攪拌頻度を用いた、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地の存在下での固定磁石沈殿法は、２５ｍｍのスローに対しては、１つの濃いペレットを形成し損ねたことが示されている。急速に沈み、チューブの底に沿って磁石が磁性複合体を引っ張ることを妨げる固形の粒子を、この培地は含有している。素早く攪拌することで固形培地が沈まないようにできるが、２つのペレットが、チューブと磁石との間の相対的な動きの端で形成される。攪拌が停止まで減速するにつれ、これらのペレットは、１つのペレットを形成するように培地中を引きずられることができない。磁性複合体は水中を引きずられることができるため、固定磁石法は、水中でのＰＣ沈殿に用いることができる。
連結磁石沈殿法は、様々な攪拌頻度、ＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地の存在下で、１つの濃いペレットを形成する。沈殿のためにチューブに磁石を連結することは、チューブの底に沿って磁性複合体を引きずる必要は無く、それらは共通点まで引きずられ、１つのペレットを形成する。
連結磁石を用いると、ゆっくりした攪拌と比較して、素早い攪拌により、より濃いペレットが形成される。これは、ゆっくりした攪拌では固形培地が沈み、ペレット形成を妨害するためであろう。素早い攪拌を用いると、固形物が溶液中で懸濁され、磁性複合体は、培地から干渉されずにペレットへと引き入れられる。
実施例５ ヒト血液における、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのシングルプレックス検出
図６０において、シングルプレックス形式に対する、血液培養試料（添加血液）内での微生物の検出および同定の例を示す。本実験において、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ １０２３１）を、３０℃、振とう培養で、シングルコロニーからＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース培養液で一晩培養して増殖させた。培養物を希釈し、ヒト血液中へ、３ｃｆｕ／ｍｌまたは０ｃｆｕ／ｍｌ（陰性対照として）で、接種した。陽性試料および陰性試料を、検出試薬無しでＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔｄ １０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆボトルへと接種し、ならびに、検出試薬とＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔｄ １０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培地を含有するチューブへ接種した（ＳＥＲＳタグおよび磁性粒子は、Ｖｉｒｏｓｔａｔ ６４１１抗Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ抗体に結合されている）。培地に対する血液全体の比率は１：８であった。接種物を、計数のためにＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）へと置いた。検出チューブは、カルーセルシステム１５０（図２４を参照のこと）へと挿入し、ＢＡＣＴＥＣ（商標）ボトルは、３５℃での増殖の間のリアルタイムモニタリングのために、ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＦＸ機器へと挿入された。陽性ＳＥＲＳチューブは１８時間で検出され、ＢＡＣＴＥＣ（商標）ボトルは３０時間で陽性となった。ヒト血液における本シングルプレックスアッセイのためのＢＡＣＴＥＣ（商標）ＦＸの前に、少なくとも１２時間で、ＳＥＲＳシグナルにより検出がなされ、ＩＤが提示される。
実施例６ ４−ｐｅｘアッセイ形式での、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出
図６１において、マルチプレックス形式に対する、血液培養試料（添加血液）内での、微生物の検出および同定の例を示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、大腸菌０１５７、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ａｕｒｅｕｓの検出に対する、当該４プレックスアッセイにおいて、４つの異なるラマンレポーターを有するＳＥＲＳタグはそれぞれ、４つの生物のうちの１つに対する抗体に結合されている。（ＳＥＲＳタグに結合された抗体 Ｖｉｒｏｓｔａｔ６４１１ポリクローナル抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ＭＡＶ１１９−４９９モノクローナル抗−大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、バイオデザインＣ５５５７３Ｍモノクローナル抗Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよび、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｃ−８０８６１モノクローナル抗Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。４つの微生物に対する捕捉抗体に結合された磁性ビーズと共に、４つの全てのタイプのＳＥＲＳタグがアッセイ混合物中に存在している。アッセイに存在している磁性ビーズは、Ｄｙｎａｌ（登録商標）抗大腸菌０１５７磁性粒子（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔａｌｏｇ ＃７１０−０３）、Ｖｉｒｏｓｔａｔ ６４１１ ポリクローナル抗−Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに結合されたＤｙｎａｌ（登録商標）Ｍ２８０ビーズ、バイオデザインＣ５５５７３Ｍモノクローナル抗Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに結合されたＤｙｎａｌ（登録商標）Ｍ２８０ビーズ、および、アフィニティーバイオ試薬ＰＡ１−７２２６ポリクローナル抗Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに結合されたＤｙｎａｌ（登録商標）Ｍ２８０ビーズからなる磁性ビーズのプールであった。
図６１に図示される実験において、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ１０２３１）を、振とう培養、３０℃で、シングルコロニーから、Ｓａｂｏｕｒａｕｄデキストロース培養液で一晩培養して増殖させた。培養物を希釈し、ヒト血液中へ、３ｃｆｕ／ｍｌまたは０ｃｆｕ／ｍｌ（陰性対照として）で、接種した。陽性試料および陰性試料を、ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔｄ １０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆボトルへと接種し、ならびに、検出試薬を有するＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔｄ １０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培地を含有する試料チューブへ接種した。最終試料中の培地に対する血液の比率は１：８であった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ接種物を、計数のためにＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）へと置いた。ＳＥＲＳ試薬を含有するサンプルチューブを、カルーセルシステム（図２４を参照のこと）へと挿入し、一方、検出試薬の無いＢＡＣＴＥＣ（登録商標）ボトルは、３５℃での増殖の間のリアルタイムモニタリングのために、ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＦＸ機器へと挿入された。
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは、１６．６時間でＳＥＲＳにより検出された一方、ＢＡＣＴＥＣ（商標）ガスセンサーは２８時間で陽性を検出した。さらに、ＳＥＲＳによる検出は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓとしての微生物の同定と同時であり、一方で、ＢＡＣＴＥＣ（商標）機器は、同定情報を提示しない。図６１に示されるように、マルチプレックス形式でのＳＥＲＳによるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの検出では、他の（非Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）ＳＥＲＳタグからの有意なＳＥＲＳシグナルは無かった。
実施例７ ウサギ血液における大腸菌およびＳ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｓの共感染の検出
図６２において、共感染モデルに対する、血液培養試料（添加試料）内の微生物のマルチプレックス検出および同定の例を示す。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ７００７２８）および、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ５５１３３）を、ＢＤ栄養培養液中で一晩、振とう培養、３７℃でシングルコロニーから別々に増殖させた。培養物を希釈し、ウサギ血液中に、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対しては２．６ｃｆｕ／ｍｌ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対しては１２．５ ｃｆｕ／ｍｌで共接種した。陽性試料および陰性試料を、ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔｄ １０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆボトル（ＳＥＲＳ試薬無し）へと接種し、ならびに、実施例６に記述される、検出試薬とＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔｄ １０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培地を含有するチューブへ接種した（Ｖｉｒｏｓｔａｔ６４１１、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ＭＡＶ１１９−４９９、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｃ５５５７３ＭおよびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｃ−８０８６１に結合されたＳＥＲＳタグ、ならびに、Ｖｉｒｏｓｔａｔ ６４１１、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｃ５５５７３Ｍおよび、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ ＰＡ１−７２２６に結合された、Ｄｙｎａｌ（登録商標）抗大腸菌Ｏ１５７磁性粒子、および、Ｄｙｎａｌ（登録商標）Ｍ２８０粒子）。血液は、ＢＡＣＴＥＣ（商標）培地で１：８に希釈された。接種物を、計数のためにＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ（登録商標）へと置いた。ＳＥＲＳ試薬を含有する検出チューブは、カルーセルシステム１５０（図２４を参照のこと）へと挿入し、一方で、ＳＥＲＳ試薬の無いＢＡＣＴＥＣ（商標）ボトルは、３５℃での増殖の間のリアルタイムモニタリングのために、ＢＡＣＴＥＣ（商標）ＦＸ機器へと挿入された。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は、７．９時間でＳＥＲＳにより検出および同定された一方、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、１１．４時間でＳＥＲＳにより検出および同定された。ＢＡＣＴＥＣ（商標）ボトルは１０．４時間で陽性であったが、同定の情報はまったく提示しなかった。
実施例８ 粒子を含有する試料におけるリアルタイムＳＥＲＳ検出
本実施例において、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ７００７２８）をグリセロールストックから溶解し、１：８の比率でＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｐｌｕｓ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培地へと希釈したウサギ血液に接種した。ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｐｌｕｓ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ培地は、特別の処理の必要なく、生物の回収を増加させるための樹脂粒子（１７％ｗ／ｖ）を含有している。接種された血液と培地は、プレートカウントにより計数され、５ｃｆｕ／ｍｌの接種を確認した。試料を、ＳＥＲＳおよび磁性粒子結合体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ＭＡＶ１１９−４９９および、Ｇ５Ｖ１１９−５００抗体）を含有する、３つの複製チューブに置いた。検出チューブは３５℃での増殖の間のリアルタイムモニタリングのために、カルーセルシステム１５０（図２４を参照のこと）へと挿入された。図６３に結果を示す。カルーセルシステムは、樹脂の存在下で、効率的にペレットを形成し、調査することができた。
実施例９ 大容量での検出
沈殿の間の攪拌により、大容量試料であっても、または、低濃度の磁性ビーズでも、磁性粒子が効率的に捕捉された。
１つの例において、一定量に保たれたＳＥＲＳおよび磁性粒子試薬で行われ、一方、広範囲の試薬濃度をもたらすために、試料の量は変化させたアッセイが行われた。ＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ １０ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ血液培養培地で１：１０希釈した５、１０、２０、３０、４０および５０ｍＬのウサギ血液の試料を、大容量試料のために改変したカルーセルベースのアッセイシステム上の５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）チューブで検証した（図２４を参照のこと）。大腸菌Ｏ１５７は凍結ストックから溶解し、各試料に１０４ｃｆｕ／ｍＬで添加した。６日にわたり、各量は、３重で検証され、１日につき、１つ既定量の試料のみが検証された。
各チューブにおいて、７９５μＬの血液および培地（１：１０）に溶解した、１２５μＬのＳＥＲＳタグと８０μＬの磁性粒子を組み合わせることにより、５ｍＬ試料に対して主に用いられたマスターミックスが作製された。得られた１ｍＬのマスターミックスを各検証試料に添加した。Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ ＭＡＶ１１９−４９９抗大腸菌抗体およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）から入手したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）抗大腸菌Ｏ１５７（７１０−０４）磁性粒子に結合されたＳＥＲＳタグを用いた。
試料は３５℃で、カルーセルベースのアッセイシステム（図２４を参照のこと）に置き、６０秒間沈殿させ、レーザー入射電力５０ｍＷ、５秒ＣＣＤ積分時間、約０．５サイクル／秒でのロッカー操作、および読み取り頻度は５／時間であった。
各量の代表的な試料に対する結果を図６４に示す。シグナル強度は試薬濃度が低くなるにつれ減弱しているが、システムは、効果的にペレットを形成し、標準よりも１０倍低い濃度でさえも、増殖を検出することができる。図に見られるように、アッセイは、様々な量に対し、増殖を効率的に検出している。
実施例１０ カルーセルシステムにおける、素早い攪拌を用いた沈殿の失敗
カルーセルシステム（図２４を参照のこと）において、磁性ペレットを形成させ、全液体量からの磁性複合体を、局所的な磁場を確実に通過させながら、試料を攪拌する。アッセイ中のペレット形成をモニターするために、レーザー調査の間、カメラはペレットの画像を撮影する。
図６５Ａにおいて、カルーセルシステム１５０（図２４を参照のこと）における素早い攪拌頻度で、１０７ＣＦＵ／ｍＬ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ １４０２８）の数時間の第二富化以内で、ペレットが形成されなかった例を示す。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ１４０２８）は、サプリメントを含有するＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標）第一培地中で、４２℃で一晩培養された。培養物とＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地との１：１００希釈を、結合磁性粒子およびＳＥＲＳタグを有する第二容器へと接種し、カルーセルシステム１５０へ置いた。第二培地中の開始接種は、栄養寒天プレート上でのプレートカウントにより、１×１０７ＣＦＵ／ｍＬであることが測定された。機器は、１時間毎に２回読み取り、３０秒間沈殿させ、２Ｈｚ、２５ｍｍスローで攪拌した。図６５Ａにおいて、第二富化の間の様々な時点で撮られた画像と共に、得られたＳＥＲＳ曲線を示す。最初のペレット画像には、ペレットが形成されるべき領域を強調する黄色の円がある。この図において、ペレットが２時間までにサイズが大きくなり、第二富化時間の３時間近くで形成に失敗することを示す。
非常に多い量のＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対しては、ペレット中に多くの病原体が存在しているため、ペレットは特に大きくなる。攪拌が早すぎる場合、磁場は流体力学に打ち勝つことができなくなり、ペレット形成に失敗する。
図６５Ｂにおいて、陰性試料（培地中で結合磁性ビーズおよび結合ＳＥＲＳタグ）に対する、第二富化の間のＳＥＲＳ曲線および対応する画像を示す。このデータより、アッセイの間、一貫して低いラマンシグナルと、ペレットのサイズが変わらないことが示される。
１０７ＣＦＵ／ｍＬのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ １４０２８）の第二富化の間の攪拌頻度を１Ｈｚまで下げることにより、ペレットが、アッセイの間中、常に形成されるようになる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ１４０２８）を、サプリメント補充したＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標）第一培地で、４２℃、一晩培養して増殖させた。１：１００のＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ第二培地で希釈した培養物を、結合磁性粒子およびＳＥＲＳタグを有する第二容器へと接種し、カルーセルシステム１５０へと置いた。第二培地中の開始時の接種は、栄養寒天プレート上のプレートカウントにより、１×１０７ＣＦＵ／ｍＬであることが測定された。機器は１時間当たり２回読み取り、３０秒間沈殿させ、および１Ｈｚ、２５ｍｍスローで攪拌した。図６５Ｃにおいて、第二富化の間の様々な時点で撮られた画像と共に、得られたＳＥＲＳ曲線を示す。第一のペレット画像には、ペレットが形成されるべき領域を強調するための黄色い円が含まれている。図６５Ｃは、実験の間中、ペレットが維持されていることを示す。図６６において、２Ｈｚおよび１Ｈｚ（それぞれ、図６５Ａおよび６５Ｃ）の攪拌率からのＳＥＲＳ曲線を重ね合わせることによる、ペレットの持続性に対する攪拌率の影響を示す。攪拌をゆっくりにすると、シグナルの減衰も非常にゆっくりとなり、ピークは攪拌が早いときよりもずっと広いものとなる。さらに、インライン化カメラを介したペレットのリアルタイムモニターから、早い攪拌に対するシグナルの消失は、ペレットが存在しないためであり、一方、弱い攪拌に対しては、ペレットは常に形成されていることが示される。２Ｈｚ攪拌で、３時間近くでペレットは形成に失敗するが、１Ｈｚの攪拌を用いると、ペレットは常に存在する。高い生物量でのペレットの一定した形成により、ＳＥＲＳシグナルがより長く持続される。例えば、もし試料が検出試薬に添加されたときと、試料が機器内に置かれたときの間で減衰がある場合、ＳＥＲＳシグナルにおけるこの持続性は利点であり得る。
実施例１１ サンドイッチイムノアッセイにおける、ペレットの目視検査を用いた標的病原体の存在測定
この例において、本発明の実施態様に従う、レーザー、光学、および分光計を必要としない、微生物試料内での微生物の検出法が開示される。この方法には、一連のＳＥＲＳ−ＨＮＷアッセイの間、ペレットの形成をモニターするための、読み取りの間に画像を撮影するカメラの使用が含まれる。
実施例１１に記述され、および図６５Ａ、６５Ｂおよび６５Ｃに示される実験において、微生物の存在により、ペレットのサイズは増加する（図６５Ａおよび６５Ｃ）。対照的に、微生物が存在しなければ、ペレットのサイズおよびＳＥＲＳシグナルは両方とも、安定したままである。標的病原体が存在しなければ、サンドイッチは形成されず、ラマンシグナルが発生せず、ペレットサイズも増加しない。図６７において、カルーセルシステム（例えば、図２４を参照のこと）における第二富化の３時間後の、陽性試料に対するペレットサイズと比較した、陰性試料のペレットサイズを示す。この図において、陰性試料と比較して、陽性試料はより大きなペレットを形成したことを示す。
画像から、結合ＳＥＲＳタグおよび磁性ビーズおよび標的病原体を含有する試料の第二富化の間にペレットのサイズが増加し、一部のケースにおいては、アッセイが進行するにつれて形成に失敗することが示されている。ペレットサイズの増加および／またはペレットの消失は、標的病原体の存在を示唆するものである。病原体を含まない、結合ＳＥＲＳタグと磁性ビーズを含有する試料の読み取りの間に撮影された画像においては、ペレットサイズに変化が無いこと、およびペレットの消失が無いことが示されている。ペレットサイズをモニターするための画像解析を用いることにより、アッセイにおける微生物の検出方法が提示されても良い。この検出方法は単独で用いても良く、または他の検出方法と併せて用いても良い。
実施例１２ 食物試料における、培養の間の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のリアルタイム検出
図６８Ａ、６８Ｂおよび６８Ｃにおいて、消化された牛ひき肉、ホウレンソウの水溶液（リンセート、ｒｉｎｓａｔｅ）および乳固形分中の大腸菌Ｏ１５７の検出のための、カルーセルシステム（図２４を参照のこと）で得られた代表的なデータを示す。
生の牛ひき肉を、ＵＳＤＡ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ（ＭＬＧ Ｃｈａｐｔｅｒ ５）に従い調製した。２５ｇの牛ひき肉試料を、消化袋（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ ｂａｇ）で、ノボビオシンを含む２２５ｍｌのｍＴＢＳで希釈した。次いで、各消化袋を、２分間、Ｓｅｗａｒｄ Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）４００で消化させた。消化された牛ひき肉の５ｍｌのアリコートを、ＳＥＲＳタグおよび磁性粒子結合物を含有するチューブへと移した。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８８８）を、シングルコロニーから振とう培養で、３７℃、栄養培養液中で、一晩培養して、増殖させた。培養物をおよそ栄養培地中、１０２〜１０４まで連続希釈した。０．０５ｍｌのアリコートを、各陽性チューブに添加し、０．０５ｍｌの栄養培養液のアリコートを陰性対象チューブへと添加した。
ホウレンソウ水溶液は、ＦＤＡ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ＢＡＭ Ｃｈａｐｔｅｒ ４Ａ）に従い調製した。等重量のＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄのリン酸緩衝液を、再密封可能なプラスチックバッグの中のホウレンソウの葉に添加し、手で５分間、攪拌した。次いで、ホウレンソウ水溶液を、２倍の強度（ｘ２）の等量のｍＢＰＷｐへ添加した。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８８８）を、シングルコロニーから振とう培養で、３７℃、栄養培養液中で、一晩培養して、増殖させた。培養物を連続希釈し、ホウレンソウ水溶液＋（ｘ２）ｍＢＰＷｐへ、１０３または０ｃｆｕ／ｍｌの濃度で接種した。これらの試料の５ｍｌのアリコートを、ＳＥＲＳタグおよび磁性粒子結合物を含有するチューブへ添加した。
ミルク試料は、ＦＤＡ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ＢＡＭ Ｃｈａｐｔｅｒ ４Ａ）に従い調製した。ホールミルク（Ｗｈｏｌｅ ｍｉｌｋ）を、１０分間、１０，０００ｇで遠心させた。上清層を棄て、ペレットを、元のミルクの体積の１．１２５倍でｍＢＰＷｐに再懸濁した。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８８８）を、シングルコロニーから振とう培養で、３７℃、栄養培養液中で、一晩培養して、増殖させた。培養物を、栄養培地中で５０００ｃｆｕ／ｍｌまで希釈した。５０μｌの希釈大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７培養物のアリコート、または栄養培養液（陰性対照）を、再懸濁したミルク培養物＋アッセイ試薬の５ｍｌのチューブに添加した。
全ての接種物を、計数のためにＢＤ ＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）プレート上に置いた。チューブは、３５℃、８時間で増殖する間のリアルタイムモニタリングのために、カルーセルシステムへと挿入した。
実施例１３ 食物試料における培養の間のＳａｌｍｏｎｅｌｌａのリアルタイム検出
図６９において、熱ストレスを与えたＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０７６）が、牛ひき肉を添加した培養培地中のリアルタイム増殖中に検出された例を示す。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを、シングルコロニーから振とう培養により、３７℃、栄養培養液中、一晩培養して増殖させた。培養物を栄養培養液中で１：１００希釈し、２０分間、５４℃で熱ストレスを与えた。熱ストレスを与えた試料をさらに、栄養培養液で２００ｃｆｕ／ｍｌにまで希釈した。生の牛ひき肉の２５ｇの試料２つを、希釈し、熱ストレスを与えたＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの培養物の１ｍｌのアリコートで接種した。接種材料を、栄養寒天プレート上に、計数のために置いた。接種された牛ひき肉試料は、接種材料が完全に混ざるように、２分間、消化バッグ内で、手でマッサージした。ＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標）第一培地（サプリメント含有）を２２５ｍｌ、消化バッグ内の接種試料へと添加した。陰性対照試料は、ＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標）第一培地（サプリメント含有）の２２５ｍｌに入れた２５ｇの生の牛ひき肉で調整された。次いで、各消化バッグを、２分間、Ｓｅｗａｒｄ Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）４００で消化させた。次いで、各消化バッグをおよそ２２時間、４２℃のインキュベーターに置いた。次いで、富化された第一培養物の試料１００μｌを、４．５ ｍｌのＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地、０．４ｍｌのＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標）第一培地およびアッセイ試薬を含有するチューブへと添加した。次いで、チューブを、８時間、４２℃での増殖の間、リアルタイムモニタリングのために、カルーセルシステム（図２４を参照）へと挿入した。陽性試料はおよそ２時間以内に検出され、一方、陰性試料からは、フラットな検出曲線を得た。
実施例１４ 環境試料中のＬｉｓｔｅｒｉａの検出
図７０において、ステンレススチールクーポン（ｃｏｕｐｏｎ）上でのＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１９１１５）の検出を示す。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１９１１５）を、シングルコロニーから、３０℃、振とう培養中で一晩、脳心臓浸出培養液中で培養して増殖させた。培養物は、ＰＢＳ＋５％ミルク中で、５ｘ１０４または０ｃｆｕ／ｍｌまで希釈した。０．１ｍｌのアリコートを、１“ｘ１”のステンレススチールクーポン上に置き、一晩、空気乾燥させた。翌日、Ｄ／Ｅ中性化培養液で濡らした綿棒で、何度か表面をぬぐった。次いで、綿棒を、チューブに入った５ｍｌのＳＤＩＸＬｉｓｔｅｒｉａ培地（サプリメント、ＳＥＲＳタグ、および磁性粒子を含有）に添加した。次いで、３０℃での増殖の間のリアルタイムモニタリングのために、カルーセルシステム（図２４を参照）にチューブを挿入した。陽性試料はおよそ１９〜２７時間の間に検出された一方、陰性試料は、フラットな検出曲線となった。
実施例１５ フラット−ベッドシステムを用いたＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出
本実施例において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを、線形攪拌およびフラットベッドシステム（図２５を参照のこと）を用いて検出した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ １４０２８）および、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ １３０７６）を、ＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標）第一培地（サプリメント含有）中にて、４２℃で一晩、別々に培養して増殖させた。各株を、別のＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地のロットで、１：１００希釈した。第二培地中の各株の開始接種は、栄養寒天プレートのプレートカウントにより、１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍＬであると測定された。各株を、抗Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ抗体（Ｖｉｒｏｓｔａｔ０７０１）で結合された磁性粒子およびＳＥＲＳタグを含有するチューブへ、二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）で接種した。これらのチューブを、２つの陰性試料（ＳＤＩＸ第二培地および結合ＳＥＲＳタグおよび磁性粒子、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ無し）と共に、４２℃での第二富化の間のモニタリングのために、機器に置いた。
本実施例で用いられたシステムは、フラットベッド構造（図２５を参照のこと）であった。本構成において、攪拌は、チューブの軸に沿った線形の往復運動であり、アッセイの間、異なる頻度およびプロファイルでプログラムされていても良い。各サイクルは以下のフェーズからなる：混合、沈殿前分散、沈殿、読み取り、および分散。本実施例で用いられた磁石の構造は、試料に面するＮ極を有する単一の棒磁石であった。ペレットが形成された時点で、棒磁石を試料から取り除き、読み取りを行った。図７１において、各フェーズに対して用いられた攪拌頻度およびスローを示す。実験は、約２０分毎に繰り返されるサイクルとともに、約１９時間、行われた。
沈殿前分散のフェーズは、沈殿の前に、ＳＤＩＸ第二培地中に沈んだ固形物を再懸濁する意図で行われた。培地に沈んだ固形物は、磁性複合体の沈殿を妨げることが知られている。単一の棒磁石を、攪拌の間、チューブと接触させ、試料を６０秒間沈殿させる。攪拌を５秒間止め、そして磁石を試料チューブから離し、光学エンジンに各ペレットを調べさせる。また、各ペレットの画像をカメラで撮影する。ペレットを分散させるために攪拌を再開し、そして当該サイクルを繰り返す。
図７２において、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ１４０２８）、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ（ＡＴＣＣ１３０７６）および陰性試料の第二富化の間のＳＥＲＳ曲線を示す。図に見られるように、ＳＥＲＳ曲線はなめらかであり、陰性のものとは容易に区別される。図７３において、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの第二富化の間の様々な時点で形成されたペレットの画像を示す。図に示されるように、フラットベッド機器を用いたアッセイの間中、丸い、濃いペレットが一定して形成されている。
実施例１６ 線形攪拌とロッキング攪拌
本実施例において、同一のＳａｌｍｏｎｅｌｌａアッセイを、異なる攪拌方法（チューブの軸に沿った線形往復運動およびロッキング振動）を用いた２つのカルーセルシステム（図２４を参照のこと）で実施した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ１３０７６）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ（ＡＴＣＣ９２６３）を、ＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標）第一培地（サプリメント含有）中、４２℃で一晩、別々に培養して増殖させた。各株を、別のＳＤＩＸ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地のロットで、１：１００希釈した。第二培地中の各株の開始接種は、栄養寒天プレートのプレートカウントにより、１ｘ１０７ＣＦＵ／ｍＬであると測定された。各株を、抗Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ抗体（Ｖｉｒｏｓｔａｔ０７０１より入手）で結合されたＳＥＲＳタグおよび磁性粒子を含有するチューブへ、二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）で接種した。これらのチューブを、４２℃での第二富化の間のモニタリングのために、カルーセルシステムに置いた。各機器は、１時間毎に２回読み取りを行い、３０秒間沈殿させ、そして１Ｈｚで攪拌した。
図７４において、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓおよび、Ｓ．Ｋｅｎｔｕｃｋｙの第二富化の間の、ロッキング攪拌および線形攪拌カルーセルシステムから得られたＳＥＲＳ曲線を示す。良い結果が両方の方法から得られたことが認められる。
本実施例において、ロッキング攪拌を超える、いくつかの利点が線形攪拌において明らかとなった。沈殿の性能は、ロッキングと比較して線形攪拌を用いたものの方が良く、これは、線形攪拌を用いた場合には、読み取りヘッドの中心にペレットが常に形成されていたためであった。ロッキング攪拌システムはロッカーアームに対して対称的に振動せず、そのため、チューブの回転力は前方向の動きになりがちであった。この非対称の液体の動きにより、ペレットにかかる流体力が、チューブの前面側へと向かうことになった。ロッキング攪拌と比べ、線形攪拌は機械的に単純であり、好ましい攪拌方法である。
実施例１７ リアルタイムの洗浄無しアッセイの、次なる試料処理との適合性
本実施例において、ＳＥＲＳベースのリアルタイムアッセイと、試料処理テスト（通常、従来的なガスセンサーによる陽性血液培養試料の検出の後に行われる）との適合性を検証した。これらの検証を用いて、陽性血液培養ボトルの中から、生物の同定を提示しても良い。これらの検証には、標準チューブコアグラーゼアッセイ、ラテックス凝集アッセイ、グラム染色、発色培地の発色、マニュアルの抗生物質感受性テストおよびプレート培養上の抗真菌阻害が挙げられる。
標準チューブコアグラーゼアッセイは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓまたは、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのいくつかのコロニーを画線培養プレートから別々に選択し、ＢＡＣＴＥＣ（商標）培地へと乳化することにより行った。ＳＥＲＳ試薬（アッセイ濃度）を含む、または含まない、乳化細菌の試料５０μｌを、５００μｌのＥＤＴＡウサギ血漿へと添加し、３７℃でインキュベートした。ＳＥＲＳ試薬を含む、または含まないＳ．ａｕｒｅｕｓ試料の両方が、４時間以内で血漿を凝固させた（図７５）。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ試料は、４時間以内ではウサギ血漿を凝固させなかった。ゆえに、ＳＥＲＳ試薬の存在は、比較的高いＳＥＲＳ試薬濃度であっても、凝固活性を介したＳ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの識別を妨げることはない。
また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ同定のためのラテックス凝集テストも、ＳＥＲＳアッセイ粒子によりもたらされる干渉に関して評価した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの試料（ＳＥＲＳ試薬をアッセイ濃度で含むもの、および含まないもの）を、上述のように調製した。次いで、ＢＤ ＢＢＬ（商標）Ｓｔａｐｈｙｌｏｓｌｉｄｅ（商標）テストラテックスの１滴を、アッセイカードへ添加した（１滴は対照ラテックス）。ラテックスの各タイプに対して、１０μｌの１）ＳＥＲＳ試薬を含むＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、２）ＳＥＲＳ試薬を含まないＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、３）ＳＥＲＳ試薬を含むＳ．ａｕｒｅｕｓ、４）ＳＥＲＳ試薬を含まないＳ．ａｕｒｅｕｓ、の試料を添加した。溶液を混合し、約２０秒間振動させた。図７６において、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（左のカード）およびＳ．ａｕｒｅｕｓタイプ８（右のカード）のカードを示す。ＳＥＲＳ試薬を有する細菌試料を、上の行へと加え、ＳＥＲＳ試薬を含まない試料を下の行に添加した。結果は、試薬のある試料、無い試料で同じであり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ試料のみが凝集を示している。凝集を示す唯一の試料が、ＳＥＲＳ試薬を含む、および含まないＳ．ａｕｒｅｕｓの試料であったことから、ＳＥＲＳ試薬は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在下でのラテックス凝集を妨げないことが示され、対照ラテックスの偽凝集、および、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの存在下での、検証ラテックスの偽凝集を発生させることがないことが示された。
アッセイ試薬とグラム染色もまた、下流の処理適合性のテストとして実施された。緩衝溶液に溶解したＳＥＲＳタグおよび磁性粒子を、ＢＤ ＢＢＬ対照グラムスライド（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３（グラム陽性球菌）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２（グラム陰性桿菌）を含有する）に添加し、１００Ｘの油浸対象レンズを用いて画像撮影した（臨床上、一般的に用いられている）。図７７において、対照生物を有していない磁性粒子およびＳＥＲＳタグを示す。磁性粒子は、大きな茶色い球形としてはっきりと見える。また、磁性粒子は色およびサイズが均一であり、顕微鏡観察に対する内部サイズ標準（約３μｍ）として有効に機能する。０．１〜０．２μｍの直径であるＳＥＲＳタグは見えない。図７８に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（紫の球菌）および大腸菌（ピンクの桿菌）の混合物の存在下の磁性粒子を、１００倍率で画像化したものを示す。磁性粒子は明確に染まらず、この画像においては、微生物から容易に識別することができる。
ＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）発色培地は、固形培地中で単一の色を発色させることにより、単一の病原体を同定、識別および分離することができる。ＳＥＲＳ試薬を含有するＳ．ａｕｒｅｕｓタイプ８および、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを一晩、血液培養した試料を、ＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）プレート上に画線した。得られた結果（図７９）から、ＳＥＲＳ試薬は、シングルコロニーの入手に影響を与えないこと、および種特異的なＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）の発色を妨げないことが示される（Ｓ．ａｕｒｅｕｓは左に、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは右側に示されている）。予測された通り、ＢＤ ＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）Ｓｔａｐｈ ａｕｒｅｕｓプレート上に画線した場合、Ｓ．ａｕｒｅｕｓコロニーは藤色である一方、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのコロニーは白であった。
また、寒天ディスク拡散法（ＢＤ Ｓｅｎｓｉ−ｄｉｓｃ（商標））を用いた手動の抗生物質テストを、ＳＥＲＳ試薬の存在下で検証した。ＳＥＲＳ試薬と大腸菌Ｏ１５７を一晩血液培養したものを、ＢＤ ＢＢＬ（商標）Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ ＩＩ Ａｇａｒプレート上に画線し、３つのＢＤ ＢＢＬ（商標）Ｓｅｎｓｉ−ｄｉｓｃ（商標）テストディスクを、トップに置き、３７℃で一晩、培養させた。翌日、阻害域（図８０）を測定し（ｍｍ）、感受性、抑制性または抵抗性の単離株の決定に関して、Ｓｅｎｓｉ−ｄｉｓｃ（商標）Ｚｏｎｅ Ｄｉａｍｅｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｖｅ Ｃｈａｒｔと比較した。図８０において、アンピシリン−１０（左上）、レボフロキサシン−５（右上）、バンコマイシン−３０（下）を示す。域の直径測定は、試薬の有無で、大腸菌培養物の間に１〜２ｍｍを超える変化は無かった（図８１）。このプロセスを、他の血液培養細菌および酵母（図８２）で繰り返したが、ディスク拡散法を用いた微生物の抗生物質感受性の測定に、ＳＥＲＳ試薬の存在は影響を与えないことが明らかとなった。
酵母の検証に対しては、Ｎｙｓｔａｔｉｎ Ｔａｘｏ（商標）ディスクを用いた。これらのディスクは、感受性テストには用いられないが、細菌と酵母の両方を含む検体からの細菌の識別および単離に用いられる。ゆえに、やや異なる方法を検証した。大腸菌とＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの混合血液培養物（ＳＥＲＳ試薬を含むものと、含まないもの）を、ＴＳＡ ＩＩプレート上に画線した。Ｎｙｓｔａｔｉｎ Ｔａｘｏ（商標）ディスクをトップに置き、培養物を３７℃で一晩、増殖させた。アッセイ試薬を含む試料（図８３の左の画像）と含まない試料（図８３の右の画像）の両方において、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ増殖のＮｙｓｔａｔｉｎ阻害が、単離大腸菌コロニーの領域にもたらされた。
実施例１８ ペレット形成に対する攪拌頻度と沈殿時間の効果
本実施例は、攪拌の間中、磁石がチューブと共に動き、チューブに対して同じ相対位置に維持されるように、チューブに磁石が連結された構造（例えば、図４９参照）を用いた沈殿に関連する。一連の実験において、ＳＥＲＳタグはトシル活性化磁性粒子に共有結合され、ＳＥＲＳ−磁性ビーズの前複合体（ＰＣ）を形成した。前複合体化されたビーズは、磁性粒子の表面のトシル（Ｔｏｓ）基と、ＳＥＲＳ表面上のチオール（−ＳＨ）基の反応を介した、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０トシル活性化磁性粒子への、ＳＥＲＳ粒子の共有結合により調製される。ＰＣは、ペレットが、ＳＥＲＳシグナルに関して調査され得る、ペレット形成テストに対するモデルシステムとしての役割を果たす。本実施例において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対する市販の第二培地（ＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標））中でのＰＣのペレット形成を、様々な攪拌頻度および沈殿時間を用いて比較した。これらのテストは、チューブに面するＮ極を有する単一棒磁石（図５２を参照のこと）と共に、フラットベッドシステム構造（図２５を参照のこと）を用いて行われた。
図８４において、３つの異なる攪拌頻度および、３つの異なる沈殿時間を用いた、ＳＤＩＸＳａｌｍｏｎｅｌｌａ第二培地中のＰＣを用いて形成されたペレットの画像表を示す。ＳＤＩＸ第二培地中のＰＣは、５０ｍｍのスロー（振幅）で、様々な攪拌頻度での、棒磁石に連結されたチューブの攪拌により沈殿された。攪拌を止め、磁石を５秒間そのままに維持し、その後、チューブから棒磁石を取り除いた。ペレットの画像は、磁石がチューブから取り除かれた時点で撮影された。
図８４に示されるように、ゆっくりした攪拌と比較して、早い攪拌ではより濃いペレットが形成された。これは、ゆっくりした攪拌では固形培地が沈み、ペレット形成が阻害されたためと考えられる。早い攪拌では、固形物は溶液中に懸濁され、磁性複合体が、培地からほぼ干渉されることなく、ペレットへと引っ張られることができる。３０、６０および９０秒の沈殿時間、０．７Ｈｚの攪拌頻度を用いて形成されたペレットにおいて、沈んだ培地が、濃いペレットの引っ張りを妨げることが認められる（これは、拡散したペレットにより明らかである）。
実施例１９ ペレット分散に対する攪拌頻度の効果
本実験は、様々な攪拌スロー（振幅）および頻度を用いた、ペレットの完全な分散に必要とされる時間の測定に関する。各場合において、ペレットは、磁石がチューブと共に動き、攪拌の間中、チューブに対して同じ相対位置に維持されるように磁石に連結されたチューブの構造（図４９を参照）を用いて形成された。本実施例に用いられた磁石は、図５２に示されるように、試料チューブに面するＮ極を有する単一棒磁石であった。
本実施例において、チューブは手動で振られ、その後、各テストは完全に培地（ＳＤＩＸ ＲａｐｉｄＣｈｅｋ（登録商標）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＳＥＬＥＣＴ（商標））およびＰＣと混合された。試料をフラットベッド機器にロードし、ペレットは、１．８Ｈｚ、２５ｍｍのスローで９０秒間、攪拌されることにより形成された。攪拌を止め、５秒間、磁石をそのままにした後、チューブから磁石を取り除いた。様々な攪拌頻度およびスローを、別々のテストで用いて、ペレットを分散させた。ペレットの分散は、目視でモニターされ、ペレットの完全な分散に要する時間が測定された。アスタリスク付きのデータは、沈んだ培地が観察されなかったことを示す。
図８５に示されるように、早い攪拌は、ゆっくりした攪拌と比較して、より少ない時間でペレットを分散させる。また、所与の攪拌頻度に対して、ペレットは、長い攪拌スローで、より速く分散する。本実施例の結果に基づくと、第二培地中の固形培地は、２５ｍｍスローでの２．５Ｈｚ超の攪拌頻度、および５０ｍｍスローでの１．５Ｈｚ超の攪拌頻度で溶液中に懸濁状態が維持される。
実施例２０ 食物の存在下での、蛍光ＨＮＷ アッセイ実現可能性検証
本実施例により、ＳＥＲＳタグの代わりに、近赤外（ＮＩＲ）蛍光粒子を用いた培養と併せた、均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）洗浄無しのアッセイの実施可能性を示す。本実施例において、蛍光シリカナノ粒子は、シラン−ＮＩＲ色素結合物（蛍光シグナルを発するため）およびチオール化シラン（抗体結合のための化学的手段を得るため）の両方を組み込む、改変Ｓｔｏｂｅｒ増殖法を用いて組み立てられた。粒子は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）、ＵＶ／Ｖｉｓ消光分光法、および蛍光分光法により特徴が明らかにされ、そして、比較的単分散であり、輝いていることが判明した。図９６において、ＮＩＲ蛍光シリカナノ粒子のＴＥＭ画像（スケールバーは２００ｎｍ）を図示し、図９７において、ＮＩＲ蛍光ナノ粒子の蛍光スペクトル（ＯＤ０．５）および標準ＥＳ／ＨＢ ＳＥＲＳタグのラマンスペクトル（ＯＤ１．２）を図示する。蛍光ナノ粒子は、ＳＥＲＳタグに対する蛍光ナノ粒子濃度、表面積および質量の差を補うために改変された標準的な結合プロトコールを用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ抗体と結合された。結合蛍光シリカナノ粒子は、カルーセルシステム１５０（図２４を参照）上で、ホウレンソウとキャベツの１０％ｗ／ｖの混合試料を用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ＨＮＷアッセイで検証された。対照のテストは、ホウレンソウおよびキャベツ試料の両方を有するＳＥＲＳタグを用いて実施された。
蛍光タグは、両方の食物試料においてＬｉｓｔｅｒｉａを成功裏に検出することができた。図９８において、ＮＩＲ蛍光ナノ粒子タグおよびＳＥＲＳタグを用いて採取されたホウレンソウのデータを図示し、図９９において、ＮＩＲ蛍光ナノ粒子タグおよびＳＥＲＳタグを用いて採取されたキャベツのデータを図示する。シグナルおよびバックグラウンドの両方とも、ＳＥＲＳタグよりも蛍光タグの方が高いことが判明したが、比較的高いシグナル−バックグラウンド比約４：１で検出に成功した。
前述の主題が、解説および図により、理解の明確化の目的のためにいくらか詳細に記述されているが、当業者であれば、添付のクレームおよびその均等の範囲内で、ある変更や改変を行い得ることが理解されるであろう。
全ての公表文献、特許出願、特許および他の参照文献は、各々の公表文献、特許出願、特許および他の参照文献が、具体的に、および個々に参照により援用されることが示唆されているのと同程度に、参照により本明細書の一部をなすものとする。多くの特許出願、特許および他の参照文献が本明細書に言及されているが、そのような参照文献は、これらの文献のいずれもが、当分野の普遍的で一般的な知識の一部を形成するとの承認を構成するものではないことが理解されよう。
前述の記述は、本発明の様々な実施態様の例示を意図している。当業者であれば、添付のクレームに規定される、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、開示される実施態様に対して様々な変更および改変がなされ得ることを理解するであろう。

Claims (15)

  1. 試料中の１以上の微生物を検出するための方法であって、
    （ａ）１以上の微生物を含有することが推測される試料を準備するステップと、
    （ｂ）前記試料をアッセイバイアル中に配置するステップと、ここで、前記アッセイバイアルには、培養試料を形成するための微生物増殖を支持することができる培養培地、および、前記１以上の微生物に対するアフィニティーを有する特異的結合メンバーの少なくとも１つと関連する、１以上の指標粒子を含有する試薬、ならびに、前記１以上の微生物に対するアフィニティーを有する特異的結合メンバーの少なくとも１つと関連する、１以上の磁気捕捉粒子が配置され、ここで、前記指標粒子と関連する前記結合メンバーは、前記磁気捕捉粒子と関連する前記結合メンバーと同じであっても異なっていても良く、
    （ｃ）前記１以上の微生物が試料中に存在する場合、磁気捕捉粒子−微生物−指標粒子の複合体を形成させるために、予め決められた期間、前記培養試料をインキュベートするステップと、
    （ｄ）前記アッセイバイアルを攪拌するステップと、
    （ｅ）前記複合体が前記アッセイバイアルの局所領域へと移動するように誘導するために、前記磁気捕捉粒子−微生物−指標粒子の複合体を磁場に曝すステップと、
    （ｆ）前記指標粒子が前記試料中の前記１以上の微生物を検出するための検出可能なシグナルを発するように誘導するために、前記アッセイバイアルの前記局所領域を光学的に監視するステップと、
    （ｇ）前記磁気捕捉粒子−微生物−指標粒子の複合体を分散させるステップと、
    （ｈ）（ｃ）〜（ｇ）のステップを１回以上繰り返すステップと
    を含む方法。
  2. （ｉ）（ｃ）〜（ｇ）のステップの繰り返しが、一定時間間隔で起こる、
    （ｉｉ）ステップ（ｃ）および（ｄ）が、同時に起こる、または、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｅ）が、磁気捕捉粒子−微生物−指標粒子の複合体を含有するペレットを形成する、請求項１に記載の方法であって、任意選択的に、前記ペレットが、視覚的手段または光学的手段を用いて検出可能である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記試料が、血液試料、食物試料または環境試料を含有する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記試料をアッセイバイアルに配置するステップは、所望量の前記試料を任意の培養培地と共に、管から移動させるステップを含む請求項１に記載の方法であって、ここで、前記管は、
    培養試料をその中に受け取るための容器と、ここで、当該容器は開放口と閉鎖口を有し、
    前記容器の開放口を液密な接続ではめ込むように構成されたフタと、
    前記フタに連結され、かつ、少なくとも１つの貯水容器を含むバスケットと、ここで、前記バスケットは、前記容器の開放口と閉鎖口の間に配置され、前記貯水容器は、その中に培養試料の容積を有するように構成され、
    前記フタとともにはめ込まれる少なくとも１つの針アセンブリと、ここで、前記針アセンブリは、前記貯水容器内に伸長する針を備える、
    ここで、前記針は、前記貯水容器に含有される試料を選択的に引き抜くように構成され、かつ、前記針は、試料の、前記貯水容器から前記バイアルへの生物学的に封じ込められた移送のために、バイアルをはめ込むようにさらに構成される、
    方法。
  5. 前記試料をアッセイバイアルに配置するステップは、前記磁性粒子および指標粒子が存在していない管から、生物学的に封じ込められた状態で、任意の培養培地と共に前記試料を抽出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 所望量の試料を測定するための管であって、
    請求項１に記載の方法において使用するための培養試料をその中に受け取るための容器と、ここで、当該容器は開放口と閉鎖口を有し、
    前記容器の開放口を液密な接続ではめ込むように構成されたフタと、
    前記フタに連結され、かつ、少なくとも１つの貯水容器を含むバスケットと、ここで、前記バスケットは、前記容器の開放口と閉鎖口の間に配置され、前記貯水容器は、その中に培養試料の容積を有するように構成され、
    前記フタとともにはめ込まれる少なくとも１つの針アセンブリと、ここで、前記針アセンブリは、前記貯水容器内に伸長する針を備える、
    を備え、
    ここで、前記針は、前記貯水容器に含有される試料を選択的に引き抜くように構成され、かつ、前記針は、試料の、前記貯水容器から前記バイアルへの生物学的に封じ込められた移送のために、バイアルをはめ込むようにさらに構成される、管。
  7. （ｉ）前記容器が、可視光に対して透過性の物質から構築されている、または、
    （ｉｉ）前記針が、前記針を覆う防御スリーブ管を備え、前記防御スリーブ管は、前記バイアルが下方に押され、前記針とはめ込まれた際に圧縮されるように構成され、かつ、前記防御スリーブ管は、前記生物学的封じ込められた移送を可能とするために、前記針とのはめ込みから前記バイアルが引き出される際に、前記針を覆うように、その元の形へと戻るように構成される、
    請求項６に記載の管。
  8. 前記バスケットが、
    （ｉ）第一の貯水容器および第二の貯水容器、ここで、前記フタが前記第一の貯水容器内に伸長する第一の針を有する第一の針アセンブリおよび前記第二の貯水容器内に伸長する第二の針を有する第二の針アセンブリを規定する、
    （ｉｉ）前記バスケットを介した液体の排出を補助するように構成されるリブ、または、
    （ｉｉｉ）前記容器が直立位置へと戻った後に、過剰量の試料が前記容器へと排出されるように構成される、少なくとも１つの穴
    を規定し、任意選択的に、前記第一の針および第一の貯水容器が、第一のタイプのアッセイでの使用のために構成され、前記第二の針および前記第二の貯水容器が、第二のタイプのアッセイでの使用のために構成され、かつ、第一のタイプのアッセイが、第二のタイプのアッセイとは異なり、好ましくは、前記第一の貯水容器が、およそ５ｍＬを保持するように構成され、および、ここで、前記第二の貯水容器が、およそ１００μＬを保持するように構成される、請求項６に記載の管。
  9. （ｉ）前記容器が傾けられた際に、前記試料が前記少なくとも１つの貯水容器に容易に入ることができるようにするために、前記少なくとも１つの貯水容器の上にヘッドスペース、
    （ｉｉ）前記容器を出るガス性副産物をろ過するためのフィルターを受け入れ、かつ、はめ込むための開口部を規定する、前記フタの底面から伸長するベントポスト、または、
    （ｉｉｉ）前記フタの底面から外側に伸長する第一のはめ込みポストと、前記バスケットの上面から外側に伸長する第二のはめ込みポスト、ここで、前記第一のはめ込みポストは、前記第二のはめ込みポストと並び、かつ、はめ込むように構成される、
    をさらに備える、請求項６に記載の管。
  10. 前記フタが、
    （ｉ）前記容器内に圧力が高まることを防ぐために、無害なガス性の副産物を前記容器から逃がすためのベントを規定する、
    （ｉｉ）前記バイアルの特定のキャップとの合致を可能とするように構成された、少なくとも１つの適合させた開口部を規定する、または、
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのバックオフ機構をさらに備え、前記バックオフ機構の付加的な取り外し無しに前記フタが外れてしまうことを防ぐ、
    請求項６に記載の管。
  11. 請求項１に記載の方法において、所望量の試料を測定するための容器とともに使用するためのフタアセンブリであって、
    容器の開口部を液密な接続ではめ込むように構成されるフタと、ここで、前記フタは任意選択的にガスケットを含み、
    前記フタに連結され、少なくとも１つの貯水容器を備えるバスケットと、ここで、前記貯水容器は、その中に試料の容積を有するように構成され、
    前記フタとともにはめ込まれる少なくとも１つの針アセンブリと、ここで、前記針アセンブリは、前記貯水容器内に伸長する針を備える、
    を備え、
    ここで、前記針は、試料の、前記貯水容器から前記バイアルへの生物学的に封じ込められた移送のために、バイアルをはめ込むように構成される、
    フタアセンブリ。
  12. 前記バスケットが、第一の貯水容器および第二の貯水容器を規定し、かつ、前記フタは、前記第一の貯水容器内に伸長する第一の針を有する第一の針アセンブリおよび前記第二の貯水容器内に伸長する第二の針を有する第二の針アセンブリを規定する、または、前記バスケットが、前記バスケットを介した液体の排出を補助するように構成されるリブを規定する、請求項１１に記載のフタアセンブリ。
  13. 前記第一の針および前記第一の貯水容器が、第一のタイプのアッセイでの使用のために構成され、前記第二の針および前記第二の貯水容器が、第二のタイプのアッセイでの使用のために構成され、かつ、第一のタイプのアッセイは、前記第二のタイプのアッセイとは異なり、かつ、任意選択的に、前記第一の貯水容器が、およそ５ｍＬを保持するように構成され、かつ、前記第二の貯水容器が、およそ１００μＬを保持するように構成される、請求項１２に記載のフタアセンブリ。
  14. 前記フタが、
    （ｉ）無害なガス性の副産物を逃がすためのベントを規定する、
    （ｉｉ）前記バイアルの特定のキャップとの合致を可能とするように構成された、少なくとも１つの適合させた開口部を規定する、または、
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのバックオフ機構をさらに備え、前記バックオフ機構の付加的な取り外し無しに前記フタが外れてしまうことを防ぐ、
    請求項１１に記載のフタアセンブリ。
  15. （ｉ）前記フタの底面から伸長するベントポストをさらに備え、前記ベントポストが、ガス性副産物のろ過のためのフィルターを受け入れ、かつ、はめ込むための開口部を規定する、
    （ｉｉ）前記フタの底面から外側に伸長する第一のはめ込みポストと、前記バスケットの上面から外側に伸長する第二のはめ込みポストとをさらに備え、前記第一のはめ込みポストが、前記第二のはめ込みポストと並び、かつ、はめ込むように構成される、または、
    （ｉｉｉ）前記針が、前記針を覆う防御スリーブ管を備え、前記防御スリーブ管は、前記バイアルが下方に押され、前記針とはめ込まれた際に圧縮されるように構成され、かつ、前記防御スリーブ管は、前記生物学的封じ込められた移送を可能とするために、前記針とのはめ込みから前記バイアルが引き出される際に、前記針を覆うように、その元の形へと戻るように構成される、
    請求項１１に記載のフタアセンブリ。
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Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI541504B (zh) * 2014-01-20 2016-07-11 國立陽明大學 尿晶體檢測系統及方法
US10422795B2 (en) 2014-01-20 2019-09-24 National Yang-Ming University Urinary crystal detection method
CN105462824B (zh) 2014-05-27 2021-02-02 Bd控股私人有限公司 在商业无菌检测中使用血培养基平台的改进
CN104062276A (zh) * 2014-06-06 2014-09-24 上海交通大学 基于dna快速组装技术的核壳拉曼探针的制备方法
FR3027678B1 (fr) * 2014-10-24 2016-12-30 Viovy Jean Louis Procede de detection d'organismes dans un echantillon dilue
WO2016095961A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Medcom Advance, S.A Analysis device, analysis apparatus for identification of analytes in fluids and use of the analysis device
US20160291002A1 (en) * 2015-03-12 2016-10-06 Pathogen Systems, Inc. dba Crystal Diagnostics Ltd Sample Preparation and Specific Capture for Multiplex Detection of Target Analytes (i.e., Bacteria, Viruses, Etc.)
WO2016172387A1 (en) * 2015-04-21 2016-10-27 Purdue Research Foundation Culture imaging system
CN104807993B (zh) * 2015-04-23 2017-01-25 广东国际旅行卫生保健中心（广东出入境检验检疫局口岸门诊部） 一种结核分枝杆菌esat‑6蛋白检测试剂盒、制备方法以及使用方法
CN105137072B (zh) * 2015-04-30 2017-03-01 广东国际旅行卫生保健中心（广东出入境检验检疫局口岸门诊部） 一种结核分枝杆菌lam检测试剂盒、制备方法以及使用方法
US10054522B1 (en) * 2015-05-15 2018-08-21 Colleen Kraft Systems, devices, and methods for specimen preparation
MX2017015203A (es) * 2015-05-28 2018-08-15 Bd Kiestra Bv Método y sistema automatizados para obtener y preparar una muestra de microorganismo para ensayos tanto de identificación como de susceptibilidad a antibióticos.
EP3108962A1 (de) * 2015-06-22 2016-12-28 Thinxxs Microtechnology Ag Probenträger
FR3046797A1 (fr) * 2016-01-15 2017-07-21 Biofilm Control Procede de detection rapide de sensibilite de microorganismes aux drogues
FR3046795A1 (fr) * 2016-01-15 2017-07-21 Biofilm Control Procede de classification de microorganismes
CA3011991A1 (en) * 2016-01-21 2017-07-27 T2 Biosystems, Inc. Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods
KR20180128424A (ko) 2016-03-18 2018-12-03 앤드류 알리안스 에스. 에이. 액체 핸들러의 팁에서의 비드 조작 방법 및 장치
JP2017169479A (ja) * 2016-03-23 2017-09-28 オリンパス株式会社 観察装置、測定システム及び培養容器
KR102043491B1 (ko) * 2016-03-29 2019-11-13 주식회사 포스코 철분 제거 장치 및 이를 포함하는 재생 시스템
CN109562142B (zh) * 2016-04-04 2022-09-13 纽约哥伦比亚大学董事会 使用核苷酸类似物和拉曼检测的dna合成测序
CN105866436B (zh) * 2016-06-01 2017-12-15 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种华纳氏葡萄球菌间接血凝检测试剂盒及其应用
MX2019000902A (es) 2016-07-21 2020-09-03 I2Pure Corp Desinfectantes topicos emolientes.
AU2017326760A1 (en) * 2016-09-16 2019-05-02 The University Of Western Australia Magnetic tool and method of collecting magnetic particles using same
CN106370644A (zh) * 2016-12-01 2017-02-01 无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司 一种动物组织中磺胺二甲基嘧啶的检测方法及试纸条
EP3605107A4 (en) * 2017-04-28 2020-12-30 Ezdia Tech Inc. AUTOMATED IMMUNOASSAY DEVICE AND METHOD USING A LARGE MAGNETIC COMPLEX OF PARTICLES
CN108795790A (zh) * 2017-04-28 2018-11-13 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种培养基及其制备方法和用途
US20180314803A1 (en) 2017-04-30 2018-11-01 Genefluidics, Inc. Generation of data for use with antimicrobials
US11433402B2 (en) 2017-07-19 2022-09-06 Amgen Inc. Magnetic assisted separation apparatuses and related methods
US11371071B2 (en) 2017-08-08 2022-06-28 International Business Machines Corporation Cell culturing structure including growth medium and non-growth medium
CN108254559A (zh) * 2018-01-03 2018-07-06 北京市理化分析测试中心 快速检测微生物的方法
EP3824094A4 (en) * 2018-07-18 2022-03-16 Selux Diagnostics Inc. TESTING FOR ANTIBIOTIC SENSITIVITY AND MICROBIAL IDENTIFICATION
EP3837531A4 (en) * 2018-08-17 2022-05-04 Genefluidics, Inc. GENERATION OF DATA FOR USE WITH ANTIMICROBIAL SUBSTANCES
CN109395875B (zh) * 2018-12-11 2023-10-20 苏州英赛斯智能科技有限公司 一种磁珠分离机构、装置以及磁珠分离方法
KR102170259B1 (ko) * 2019-07-15 2020-10-28 주식회사 어큐노스 형광 이미징 기반의 미생물 신속 검출을 위한 용액 치환형 자성입자 농축방법 및 장치
KR102257511B1 (ko) * 2019-08-13 2021-05-31 고려대학교 산학협력단 자성-광학 복합 나노구조체
CN110954696A (zh) * 2019-11-27 2020-04-03 深圳华瑞达生物科技有限公司 一种曲霉半乳甘露聚糖聚糖检测试剂盒及其应用
CN112834749B (zh) * 2020-12-14 2023-05-02 黑龙江大学 一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用
CN112646720B (zh) * 2021-01-07 2022-07-05 东莞兰卫医学检验实验室有限公司 一种针对突变型小分子抗癌药物研发装置
CN112725403A (zh) * 2021-01-25 2021-04-30 宁夏医科大学总医院 一种血流感染病原阴性菌微量肉汤荧光药敏方法
CN113504346B (zh) * 2021-09-09 2021-11-23 南通化学环境监测站有限公司 一种用于公共场所的卫生检测装置
KR102594680B1 (ko) * 2021-10-08 2023-10-25 한국생명공학연구원 표면증강라만산란 기반 표적 바이러스 면역검정법
WO2023073399A1 (en) * 2021-10-26 2023-05-04 Alakhmimi Nuha An automated system for microbial testing
EP4205849A1 (en) * 2021-12-30 2023-07-05 Elmedix NV System and method for thermal treatment of cancer cells
WO2023235793A2 (en) * 2022-06-01 2023-12-07 The Regents Of The University Of California Novel technique to quantify gaseous reactive chlorine species by liquid ion chromatograpy

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5624814A (en) 1981-08-20 1997-04-29 Becton Dickinson And Company Culture medium and method for culturing body fluids containing antibiotics
GB9020352D0 (en) * 1990-09-18 1990-10-31 Anagen Ltd Assay or reaction apparatus
US5128103A (en) * 1990-12-14 1992-07-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Apparatus for automatically processing magnetic solid phase reagents
US5312009A (en) 1993-06-07 1994-05-17 Sage Products, Inc. Liquid specimen collector with removable extraction device
US5374395A (en) * 1993-10-14 1994-12-20 Amoco Corporation Diagnostics instrument
US5653686A (en) 1995-01-13 1997-08-05 Coulter Corporation Closed vial transfer method and system
US6344272B1 (en) 1997-03-12 2002-02-05 Wm. Marsh Rice University Metal nanoshells
US6699724B1 (en) 1998-03-11 2004-03-02 Wm. Marsh Rice University Metal nanoshells for biosensing applications
EP2316571A3 (en) 1998-05-01 2011-07-27 Gen-Probe Incorporated Automated diagnostic analyzer and method
US20030232388A1 (en) 1999-09-27 2003-12-18 Kreimer David I. Beads having identifiable Raman markers
DK1226422T3 (da) 1999-10-06 2008-04-14 Oxonica Inc Overflade-forstærkede spektroskopi-aktive nano-partikler
WO2002079764A1 (en) 2001-01-26 2002-10-10 Nanoplex Technologies, Inc. Surface-enhanced spectroscopy-active sandwich nanoparticles
JP4513085B2 (ja) * 2001-09-11 2010-07-28 アイキューム インク 試料の容器
US20030053938A1 (en) * 2001-09-19 2003-03-20 Becton, Dickinson And Company. Liquid specimen collection container
US6913825B2 (en) 2001-09-20 2005-07-05 University Of Notre Dame Du Lac Process for making mesoporous silicate nanoparticle coatings and hollow mesoporous silica nano-shells
US20060038979A1 (en) 2004-08-05 2006-02-23 Michael Natan Nanoparticles as covert taggants in currency, bank notes, and related documents
US20050054101A1 (en) * 2003-07-17 2005-03-10 Global Cell Solutions Llc Automated cell culture system and process
US20050191665A1 (en) 2003-12-29 2005-09-01 Xing Su Composite organic-inorganic nanoclusters
US7002679B2 (en) 2004-05-11 2006-02-21 Duke University Encoded excitation source Raman spectroscopy methods and systems
EP1861721B1 (en) * 2005-03-10 2017-05-03 Gen-Probe Incorporated Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples
ES2493990T3 (es) * 2006-02-08 2014-09-12 Becton Dickinson And Company Ensayos con nanoetiquetas SERS
US20080025877A1 (en) 2006-05-15 2008-01-31 Alley Kenneth A Specimen collection and testing apparatus
EP2044402B2 (en) 2006-07-24 2016-11-30 Becton Dickinson and Company Apparatus and method for performing an assay using magnetic particles
US7891446B2 (en) 2006-10-06 2011-02-22 Irobot Corporation Robotic vehicle deck adjustment
US7745169B2 (en) * 2006-11-10 2010-06-29 Biolumix Inc. Device and method for the detection and enumeration of multiple groups of microorganisms
EP2461163A3 (en) * 2007-03-20 2012-09-26 Becton, Dickinson and Company Assays using surface-enhanced raman spectroscopy (sers)-active particles
EP2152319B1 (en) 2007-06-06 2015-04-08 Becton Dickinson and Company Near-infrared dyes as surface enhanced raman scattering reporters
ITFI20070275A1 (it) * 2007-12-07 2009-06-08 Diesse Diagnostica Senese Spa "dispositivo e metodo di analisi microbiologica di campioni biologici"
US20090169433A1 (en) * 2007-12-28 2009-07-02 Sankaran Kumar System for improved biodetection
WO2009102824A1 (en) 2008-02-14 2009-08-20 3M Innovative Properties Company Methods and compositions for detecting microorganisms
JP2011516075A (ja) * 2008-04-09 2011-05-26 バイオニア コーポレーション 自動精製装置、マルチウェルプレートキット及び生物学的試料からヘキサンを抽出する方法
JP5685538B2 (ja) 2008-09-24 2015-03-18 ストラウス ホールディングス インコーポレイテッド 分析物を検出するためのキットおよび装置
AU2010327159B2 (en) 2009-12-04 2013-10-10 Unisensor A/S System and method for time-related microscopy of biological organisms
JP2011163910A (ja) 2010-02-09 2011-08-25 Beckman Coulter Inc 分注精度管理方法、分注量補正方法、攪拌性能管理方法、自動分析装置および分析キット
FR2962445B1 (fr) 2010-07-08 2013-06-28 Biomerieux Sa Procede de detection et d'identification directe d'un microorganisme dans un echantillon biologique dilue dans un bouillon d'enrichissement

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