CN105121593A - 金属纳米壳包被的条码 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用金属纳米壳包被的条码和制造该金属纳米壳包被的条码的方法。本发明的金属纳米壳包被的条码能够用于检测系统,包括多重检测系统。
Description
技术领域
本公开涉及条码以及产生条码的方法的领域。更特别的,本公开涉及金属纳米壳包被的条码。
背景技术
聚合物微珠是化学和生物传感应用的最大通用平台之一。微珠平台提供了与其它检测技术相比更快的反应动力学、更高的生物分子缀合通量能力和更好的分析再现性[1]。当微珠掺入有机荧光素或量子点(QDs)以产生条码时,它们可以同时检测成千上万的分子。有机荧光素条码化的微珠正在成为多重检测方案的基础。这些条码的一个限制包括需要复杂和昂贵的读出设备来补偿用于激发不同荧光素所需的光源,且这些条码仅能被用于特定环境条件下,因为不同荧光素的发射属性受到分析环境的影响。这一限制可通过使用QDs产生条码来克服。可以使用6种不同颜色和强度水平的QDs工程化超过40,000个不同的条码,且它们可以使用一个单一波长进行激发[2]。这一广泛的多重检测技术在多种机理的快速分析和有机和无机标志物的高通量筛选中特别有用。目前对于工程化QD条码存在许多建议的方法[2-5],但这些方法均没能生产可以很容易地被缀合且在不同温度、缓冲液或分析环境中都具有良好的保质期和荧光一致性的QD条码,从而不能使得这些技术被广泛应用。分析过程中QD荧光的任何变化都可能导致条码的错误识别[6,7]。因此,QD条码技术停留在研究阶段,并没有推进至更广泛的应用。
申请人之前显示当它们位于亚-100nm聚苯乙烯珠的中心时,QDs的荧光在不同分析条件下并不发生变化[8]。不幸的是,这种合成方法不能适用于制备更大的微珠。当尝试采用类似策略来制备更大的QD条码时,引发剂在反应中淬灭或改变了QDs荧光性质。然而,这一研究表明在聚苯乙烯微珠内部深处保护的QDs将保护QDs免于与水环境相互作用。
从而,本发明的一个目标是通过提供相对于现有技术的条码而言具有针对降解的稳定性或改进的稳定性和分析灵敏度的条码,并简化缀合过程,来克服上述限制。
本发明的进一步的和其它的目标通过下述发明概述、发明详述及其实施方式和实施例将实现。
发明内容
在一个实施方式中,本发明提供了一种条码,其可被用于在样品中和在用于检测一种或多种感兴趣的目标的多重系统中检测一种或多种感兴趣的目标的方法。在一个实施方式中,本发明的条码包括具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠。
在本发明的条码的一个实施方式中,该荧光素包括有机荧光素、无机荧光素或有机荧光素和无机荧光素的混合物。
在本发明的条码的另一实施方式中,该微珠是聚合的微珠。
在本发明的条码的另一实施方式中,该微珠包含苯乙烯-马来酸酐共聚物的单一聚合物系统。
在本发明的条码的另一实施方式中,该微珠包含聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的混合聚合物系统。
在本发明的条码的另一实施方式中,聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的比率范围为约4:1至约1:1质量比。
在本发明的条码的另一实施方式中,聚合物包括类似物或衍生物。
在本发明的条码的另一实施方式中,荧光素是量子点(QDs)。
在本发明的条码的另一实施方式中,金属选自银或金。
在本发明的条码的另一实施方式中,条码进一步包含缀合至金属纳米壳的目标特异性捕获探针。
在本发明的条码的另一实施方式中,所述目标包括无机材料和有机材料。
在本发明的条码的另一实施方式中,有机材料包括单细胞和多细胞生物及其任何组分、肽、蛋白质、寡糖、脂质、基因、核酸、氨基酸,且其中无机材料包括具有金属原子的无机分子。
在本发明的条码的另一实施方式中,条码包括在微珠表面和金属纳米壳之间的蛋白层。
在本发明的条码的另一实施方式中,相对于没有金属纳米壳的条码,该金属纳米壳有助于延长条码的保质期。
在本发明的条码的另一实施方式中,相对于没有金属纳米壳的条码,该金属纳米壳有助于增强条码的荧光稳定性。
在本发明的条码的另一实施方式中,该金属纳米壳具有约20nm至约80nm的厚度。
在一个实施方式中,本发明提供了一种在条码表面形成金属纳米壳的方法。在一个实施方式中,该在条码表面形成金属纳米壳的方法包括:(a)使条码接触金属纳米颗粒,和(b)将步骤(a)中获得的条码与金属的盐混合足以在条码上形成金属纳米壳的一段时间。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的一个实施方式中,该条码包括具有一个或多个荧光素群的微珠,且该荧光素包括有机荧光素、无机荧光素或有机荧光素和无机荧光素的混合物。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,该微珠是聚合的微珠。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,该微珠包含苯乙烯-马来酸酐共聚物的单一聚合物系统。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,该微珠包含聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的混合聚合物系统。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的比率范围为约4:1至约1:1质量比。
在本发明的条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,聚合物包括类似物或衍生物。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,荧光素是QDs。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,金属选自银或金。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,该方法进一步包括通过将捕获探针缀合至金属纳米壳来功能化该金属纳米壳包被的条码,其中所述捕获探针能够与目标相互作用。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,所述目标包括无机材料和有机材料。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,有机材料包括单细胞和多细胞生物及其任何组分、肽、蛋白质、寡糖、脂质、基因、核酸、氨基酸,且其中无机材料包括具有金属原子的无机分子。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,该方法进一步包括,在使条码接触金属纳米颗粒之前,在条码上加入蛋白质层。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,步骤(b)的时间是形成对应于预选的金属纳米壳厚度的金属纳米壳所需的时间。
在条码表面形成金属纳米壳的方法的另一实施方式中,形成金属纳米壳所需时间选自比较金属纳米壳厚度和金属纳米壳形成时间的标准曲线。
在一个实施方式中,本发明提供了一种用于在样品中检测目标的检测系统。该检测系统,在一个实施方式中,包括多个条码,每个条码包含具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠和缀合至金属纳米壳的捕获探针,该捕获探针能够与目标相互作用且该系统能够产生指示在样品中检测到目标的可检测信号,该可检测信号包含来自具有结合至目标的捕获探针的条码的第一信号和来自结合至目标的第二探针的第二信号。
在本发明的检测系统的一个实施方式中,该检测系统进一步包括一种无线通信设备,该无线通信设备包括收集来自该多个条码和第二探针的可检测信号的工具。
在本发明的检测系统的另一实施方式中,该无线通信设备进一步包括用于分析从该多个条码和第二探针收集的信号的工具,和传输收集的信号用于远程分析的工具的一种或两种。
在本发明的检测系统的另一实施方式中,该检测系统进一步包括第二探针信号,该第二探针信号指示条码捕获探针对目标的成功捕获。
在一个实施方式中,本发明提供了一种用于在单一样品中同时检测多个感兴趣的目标的多重检测系统。本发明的多重检测系统,在一个实施方式中,包括:多个条码,每个条码包含:(i)具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠和(ii)缀合至条码表面的一个捕获探针,其能够与多个感兴趣的目标中的一种相互作用,从而该多个条码针对多个感兴趣的目标的每一种都包括至少一个条码,该多个金属纳米壳-条码的多个感兴趣的目标的每一种能够产生不同的目标特异性信号,每个目标特异性信号包含来自具有与特定感兴趣目标相互作用的捕获探针的条码的第一信号,和来自结合至特定感兴趣目标的第二探针的第二信号。
在本发明的多重检测系统的一个实施方式中,该多重检测系统进一步包括第二探针信号,该第二探针信号指示条码捕获探针对目标的成功捕获。
在本发明的多重检测系统的另一实施方式中,该多重检测系统进一步包括一种无线通信设备,该无线通信设备包括用于收集来自该多个条码的第一信号和来自第二探针信号的第二信号的工具。
在本发明的多重检测系统的另一实施方式中,该无线通信设备进一步包括用于分析从该多个条码和第二探针收集的信号的工具,和传输收集的信号用于远程分析的工具的一种或两种。
本发明,在另一实施方式中,提供了一种在样品中检测感兴趣目标的方法。该方法,在一个实施方式中,包括:使样品接触:(a)多个条码,每个条码包含具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠,和缀合至金属纳米壳的捕获探针,该捕获探针能够与感兴趣的目标相互作用,每个条码能够发射一种目标特异性信号,和(b)第二探针,该第二探针能够与感兴趣的目标相互作用并发射一种第二探针信号;其中条码信号和第二探针信号的存在指示了在样品中检测到目标。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的一个实施方式中,该条码包含具有一个或多个荧光素群的微珠,且其中该荧光素包括有机荧光素、无机荧光素或有机荧光素和无机荧光素的混合物。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,该微珠是聚合的微珠。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,该微珠包含苯乙烯-马来酸酐共聚物的单一聚合物系统。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,该微珠包含聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的混合聚合物系统。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的比率范围为约4:1至约1:1质量比。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,聚合物包括类似物或衍生物。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,荧光素是QDs。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,金属选自银或金。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,所述目标包括无机材料和有机材料。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,有机材料包括单细胞和多细胞生物及其任何组分、肽、蛋白质、寡糖、脂质、基因、核酸、氨基酸,且其中无机材料包括具有金属原子的无机分子。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,条码包括在微珠表面和金属纳米壳之间的蛋白层。
在样品中检测感兴趣的目标的方法的另一实施方式中,该金属纳米壳具有约20nm至约80nm的厚度。
在本发明的一个方面,该样品是生物学或非生物学样品。
在本发明的另一方面,该样品是非人类样品。
在本发明的另一方面,该样品是人类样品。
在本发明的另一方面,该样品是固体或流体样品。
在本发明的另一方面,该样品是生物学或非生物学的,其中生物学样品包括从动物界或植物界的单细胞或多细胞生物提取的固体、液体或气体样品,包括原核生物和真核生物,且其中非生物学样品包括水样品、土壤样品、气体样品和矿物样品。
附图说明
当下仅通过实例的方式来描述实施方式,并参考附图,其中:
图1显示了按照本发明一个实施方式的银纳米壳包被的量子点(QD)微珠的形态学和荧光性。(A)显示银纳米壳包被的QD微珠的制造和功能化过程的方案。(B、C)由(B)苯乙烯-马来酸酐共聚物单一聚合物或(C)苯乙烯-马来酸酐共聚物-聚苯乙烯混合聚合物制成的含QD555(λem=555nm)的未包被微珠的荧光图像。(D-F)具有形成不同时间段的银纳米壳的微珠的扫描电镜图像(在2kV下获得)。(D)用10-nm银纳米颗粒接种的形成0分钟的微珠。(E)形成30min,平均d=70nm,(F)形成120min,平均d=150nm。(B-F)比例:单一图像大小为4X4μm,插入图像大小为500X500nm。(G-I)含有(G)QD510、(H)QD575和(I)QD665的银纳米壳包被的微珠的荧光图像。银纳米壳厚度均为约50nm。单一图像大小为40X40μm。所有荧光图像都是通过长通(>430nm)滤片用汞灯激发(λex=350/50)和100xUPlanApo物镜(NA=1.35)获得的。(J)显示微珠荧光强度与银纳米壳厚度关系的图。未包被微珠的荧光强度被转化为100%,其它组据此进行标准化。
图2是显示在环境条件下由不同组分制成的QD微珠的荧光稳定性的图。左栏(图a、d、g):未包被的苯乙烯-马来酸酐共聚物单一聚合物;中栏(图b、e、h):银纳米壳包被的单一聚合物;右栏(图c、f、i):银纳米壳包被的苯乙烯-马来酸酐共聚物-聚苯乙烯混合聚合物。
图3:(A)是显示夹心法分析方案的图。(B)显示使用未包被和银纳米壳包被的微珠的分析灵敏度比较的图。(C(插图))检测到多达10飞摩尔的目标。黑色实点和空心圆圈分别代表银纳米壳包被的珠和未包被的珠。
图4是显示由银纳米壳包被的QD条码对DNA目标进行的多重检测的图。图(a)和(b)分别是恶性疟原虫(P.falciparum)和间日疟原虫(P.vivax)各自DNA序列的剂量响应曲线。图(c)多重地显示了DNA目标的多重检测。
图5是条码的体积直方图,显示了QD条码的大小分布。未包被QD条码的直径和浓度通过Vi-细胞分析仪测定。上图中的直径是4.5±0.7nm(中值±标准差)。
图6是在珠上银纳米壳形成随时间变化的SEM图像。对每个形成时间点,较低放大倍数量级(10kX)的图像在顶行显示,对应的放大图像(100kX)在下方显示。银纳米壳的表面覆盖与形成周期相关。
图7是显示银纳米壳厚度对混合聚合物QD条码荧光强度的影响的图。
图8是显示银纳米壳形成时间对(A)QD600条码的荧光强度和(B)前方散射的影响的图。
图9显示了银纳米壳形成过程中QD条码的(A)荧光和(B)吸收光谱。
图10是按照本发明一个实施方式的金纳米壳包被的微珠的SEM图像。
图11是显示金纳米壳形成时间对(A)QD条码的荧光强度和(B)QD条码的前方散射的影响的图。
图12是显示在不同环境条件:(A)–pH、(B)–缓冲液和(C)–温度下由单一聚合物和混合聚合物制成的未包被QD条码的荧光稳定性的图。
图13:不同条件下由不同组分制成的QD条码的完整性。左栏(a、d、g):未包被的苯乙烯-马来酸酐共聚物单一聚合物;中栏(b、e、h):银纳米壳包被的单一聚合物;右栏(c、f、i):银纳米壳包被的苯乙烯-马来酸酐共聚物-聚苯乙烯混合聚合物。银纳米壳厚度为20-30nm。
图14是流式细胞术中的前方散射(FSC)-侧向散射(SSC)图。
图15是显示金纳米壳对不同pH下的条码荧光稳定性的影响的图。
图16是显示使用未包被的和银或金纳米壳包被的微珠的分析灵敏度比较的图。两种金属的壳厚度均为约50nm。分析并行进行。两种金属纳米壳均增强了分析表现,如剂量响应曲线所示。银纳米壳包被的珠表现出三种条件下最好的分析表现。
图17是显示QDs的发射光谱和4重银纳米壳包被的条码及其在流式细胞术中的荧光图的图。通过荧光计检测了用于制造条码的QDs(QD530和QD580)的发射光谱。通过改变这些QDs的强度,发明人制备了4种条码,还测定了其发射光谱。这些条码在流式细胞术图中显示了不同的荧光强度分布。水平标尺是FITC通道(525nm)强度。垂直标尺是PE通道(575nm)强度。条码1(B1)和4(B4)分别为阴性和阳性对照。B2和B3分别代表间日疟原虫和恶性疟原虫。
具体实施方式
定义
在本说明书和随后的权利要求书中将引用被定义为具有如下含义的多个术语。所有的数字类指定,例如,尺寸和重量,包括范围,都是近似值,其典型地可以视情况按照0.1、1.0或10.0的增量进行变化(+)或(-)。所有的数字类指定都可被理解为在前面被术语“约”所修饰。除非上下文另有说明,否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括了复数的引用。本文引用的所有出版物以及优先权文件都全文引入作为参考。
"捕获探针"指结合样品中的目标分子、从而它们的相对表达水平能被检测的化合物。捕获探针可以包括核酸序列、蛋白质、噬菌体、抗体,酶等等。目标可以包括有机分子,其包括核酸、蛋白质、脂质、糖、毒素、单细胞和多细胞生物、病毒及其组分;和无机分子,其可以包括金属原子;以及任何可以结合至捕获探针的其它感兴趣的目标。
术语“第二探针”指一种分子,其能够识别捕获探针的目标并响应捕获探针与所述捕获探针的目标和该第二探针之间的相互作用而产生可检测信号。第二探针可以包括核酸序列、蛋白质、噬菌体、抗体、酶等等。该第二探针可以包括荧光分子。
术语“包含”表示任何列举的元素都是必然被包括的,且其它元素可以可选地被包括。“基本上由……组成”表示任何列举的元素都是必然被包括的,在实质上影响所列举元素的基础和新颖特性的元素被排除,而其它元素可以可选地被包括。“由……组成”表示除了所列举的元素之外的所有元素均被排除。由这些术语的每一个所定义的实施方式均落入本发明的范围。
本文使用的“量子点”(QD)是一种半导性光致发光材料,如本领域已知的(例如,参见Alivasatos,Science271:933-937(1996))。QDs的非限制性示例包括:CdS量子点、CdSe量子点、CdSe/CdS核/壳(core/shell)量子点、CdSe/ZnS核/壳量子点、CdTe量子点、PbS量子点和/或PbSe量子点。如本领域技术人员已知的,CdSe/ZnS表示ZnS壳包被在一个CdSe核的表面(即:“核-壳”量子点)。核-壳QD的壳材料具有较高的能带隙并使核QD表面钝化,导致比核QD更高的量子产率和更高的稳定性和更广的应用。
本文使用的关于荧光素,包括QDs的术语“群”指共有一个共同的最大发射和强度的波长的多个荧光素。
本文使用的“条码”指含有1、2、3或更多个荧光素群的珠或微珠。如果荧光素强度发生变化得到多个亚群,那么具有发射单一颜色的单一荧光素群是可能的。每个珠含有鉴定表面缀合分子的独特的光学签名。合适的荧光素可包括有机荧光素、QDs、多-金属棒或能够形成光学签名的任何其它荧光素。使用5-6种不同颜色的量子点和6个强度水平可以工程化约10,000-40,000个不同的条码(9)。这允许了显著的多重技术,且这些条码能够在流式细胞仪(10–13)或微流体通道(14,15)中检测目标。
术语“样品”包括固体和流体样品两者。固体类型的样品可以被溶解于合适的流体中。样品可以是生物学的和/或环境的(即,非生物学)。生物学样品(流体或固体)可以包括取自动物界或植物界的生物体(单细胞或多细胞)的样品,包括原核生物和真核生物体。非流体样品可以被溶解于合适的溶液中。环境样品(流体或固体)可以包括水样品、土壤样品、矿物样品等等。
本文使用的“接种”指将金属颗粒或离子加至珠表面,后者作为成核位点用于金属壳围绕着珠的形成。
在本文中,术语"保质期"指珠和条码在各种环境条件例如缓冲液类型、溶液pH范围和温度范围下保持完整的能力,以及保持它们的荧光信号响应这些变化的环境诱因的能力。
金属纳米壳包被的条码
在此描述了一种新的和非显而易见的具有改进的稳定性和改进的分析灵敏度的纳米壳包被的条码,和制备金属纳米壳包被的条码的方法。
在一个实施方式中,本发明的条码包括具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠。
微珠可以是由单一聚合物系统或混合聚合物系统制成的聚合物珠。聚合物可以是任何合适的聚合物,包括不同分子量的聚苯乙烯和其它聚苯乙烯(随机-或嵌段-)共聚物,包括其类似物或衍生物。单一聚合物珠可以是任何合适的聚合物。在一个实施方式中,单一聚合物珠可以由苯乙烯-马来酸酐共聚物、类似物或衍生物制成。混合聚合物系统可以包括聚合物的混合物。在一个实施方式中,聚合物的混合物可以是聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物或其类似物或衍生物的混合物。聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物(或其类似物或衍生物)的比例可以在4:1-1:1质量比之间变化。
纳米壳可以由金属制成。可以使用的金属包括银和金。还可以使用能够在条码微珠表面上形成壳的提供实质的保质期和实质的分析灵敏度的任何其它合适的金属。
本发明的金属纳米壳包被的条码可以使用如下所述的目标特异性捕获探针进行功能化。
制备金属纳米壳包被的条码的方法
在一个实施方式中,本发明提供了在条码上制备金属纳米壳的方法。在一个实施方式中,该方法可以包括:(a)用金属纳米颗粒接触或接种一个或多个条码群,和(b)将接种有金属纳米颗粒的条码与金属的盐进行混合。
在本发明方法的一个实施方式中,该方法还可以包括将目标特异性捕获探针缀合至金属纳米壳。
在该方法的一个实施方式中,荧光素可以是聚苯乙烯包被的QDs。在另一实施方式中,QDs可以用一系列疏水聚芳族聚合物进行修饰,所述聚合物与组成微珠内部区域的基质聚合物在结构上相似。
条码的制备
制备本发明的金属纳米壳包被的条码的一个实施方式描述于图1A。
参见图1A,条码可以包括具有一个或多个荧光素群102的微珠101。条码100可以通过本领域已知的任何方法制备,例如通过控制浓度的流动聚焦(CCFF)技术[2]。荧光素102,例如QDs,可以与单一聚合物系统混合以形成单一聚合物条码,或与混合聚合物系统混合以形成混合聚合物条码。单一聚合物系统可以由任何合适的单独聚合物例如苯乙烯-马来酸酐共聚物制成。混合聚合物系统可以由两种或多种不同聚合物的混合物制成。在一个实施方式中,混合聚合物系统可以由苯乙烯-马来酸酐共聚物和聚苯乙烯制成。在单一或混合聚合物系统中其它也可用于制备微珠的聚合物包括不同分子量的聚苯乙烯和其它聚苯乙烯(随机-或嵌段-)共聚物。聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的比例可以在4:1-1:1质量比之间变化。
用于制备条码的荧光素可以用胺末端聚苯乙烯聚合物包被。聚苯乙烯包被的QDs可以通过本领域已知的任何方法制备[1]。在一个实施方式中,QDs可以被提供为三正辛基膦氧化物(TOPO)QDs。使用TOPOQDs作为示例,QD表面上的TOPO配体可被替换为胺末端聚苯乙烯聚合物,从而获得聚苯乙烯包被的QDs。可以使用配体交换过程来将TOPO配体替换为胺末端聚苯乙烯聚合物。其它用于修饰量子点表面化学的方法包括将配体交换为单配位基或多配位基的硫醇-、膦-或胺化的配体;聚合物包覆;硅烷化。可以使用这些方法的任一种来产生表面修饰的量子点。
图1B和图1C是说明含有由单一聚合物(图1B)和混合聚合物(图1C)制备的QDs的未包被微珠在广视野显微镜下成像的SEM图。QDs在单一混合物珠中表现为均匀分布(图1B),但是当存在聚合物的混合物时它们表现为分离成小液滴(图1C)。
金属纳米壳在微珠表面的形成
参见图1A,金属纳米壳106可以在单一聚合物或混合聚合物条码100表面形成。金属纳米壳106的形成包括用金属纳米颗粒104接种条码100的聚合微珠101(单一聚合物或混合聚合物),和通过加入还原剂和金属的盐来在微珠101表面形成金属纳米壳106以形成金属纳米壳包被的条码120。金属纳米壳包被的条码可以用一个或多个捕获探针108、110进行功能化,后者可以如下文将要描述的被附着至金属纳米壳包被的条码120。
为了形成金属纳米壳,条码的微珠表面可富集对接种过程使用的金属纳米颗粒具有增强的亲和力的基团。在一个实施方式中,该富集步骤可以通过对微珠表面富集硫醇或巯基来实现。可对条码的微珠表面提供羧基用于表面功能化。例如,可通过马来酸酐形成羧基。在一个实施方式中,微珠表面的羧基可通过例如碳化二亚胺介导的反应用胱胺进行修饰。然后可以将硫醇化的微珠与金属纳米颗粒一起孵育作为接种过程(参见图1D)。可商购的大多数微珠依赖羧基进行表面功能化;然而,也可以得到胺功能化的微珠。为了硫醇化胺微珠,可使用巯基乙酸或含硫醇基的胺反应性酯来代替胱胺。由纯的聚苯乙烯制备的微珠具有可以吸附蛋白质的疏水表面。在与聚苯乙烯珠一起孵育后可以在珠表面形成蛋白质层。该蛋白质层具有与接种步骤中用于接种目的的金属纳米颗粒的高亲和力。
金属纳米颗粒的直径可以在6-12nm范围内。在一个实施方式中,金属纳米颗粒可以具有平均直径为6nm,在另一实施方式中为7nm,在另一实施方式中为8nm,在另一实施方式中为9nm,在另一实施方式中为10nm,在另一实施方式中为11nm,在另一实施方式中为12nm。金属纳米壳可以通过还原剂和所使用的金属的盐来在条码的微珠表面上形成。在银的情形中,金属盐可以是硝酸银;在金的情形中,金属盐可以是氯化金。金属壳的厚度和微珠上的表面覆盖可以用延长或缩短的形成时间和连续加入还原剂和硝酸银/氯化金来进行调节或控制。形成时间范围可以为0分钟(参见图1D)至多达2小时(参见图1F)。多于2小时也是可能的。纳米壳厚度范围可以是20-80nm。还原剂与金属盐的比例可以是1:1。该过程在扫描电镜下进行表征(图1D-F)。壳厚度在形成2小时后增加至150nm。含有不同发射颜色的QDs的条码可以用约50nm厚的银纳米壳进行包被(图1G-I)。金属纳米壳随时间形成的进一步的详细图像可见于图6。照此,可以开发标准曲线用于比较金属纳米壳厚度和形成时间。然后可以在制造本发明条码的方法中使用该标准曲线,通过使壳形成对应于预选厚度的形成时间来使该条码具有预选厚度的金属纳米壳。
检测和多重-检测系统
本发明的纳米壳包被的条码可以适用于在样品中检测有机或无机目标的系统和方法。本发明的金属纳米壳包被的条码还可用于在单一样品中同时检测多个有机目标的方法和多重检测系统,所述有机目标包括生物学目标,例如病原体、肽、蛋白质组和基因组目标、氨基酸序列、核酸序列、脂质、多糖等等,或无机目标例如含有金属原子的那些。
照此,在一个实施方式中,本发明提供了一种在样品中检测感兴趣目标的方法。在一个实施方式中,该方法可以包括:使样品接触:(a)多个条码,每个条码包含具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠,和缀合至金属纳米壳的捕获探针,该捕获探针能够与感兴趣的目标相互作用,每个条码能够发射一种目标特异性信号,和(b)第二探针,该第二探针能够与感兴趣的目标相互作用并发射一种第二探针信号;其中条码信号和第二探针信号的存在指示了在样品中检测到目标。
在另一实施方式中,本发明提供了一种用于在样品中检测目标的检测系统。在一个实施方式中,该检测系统可以包括多个条码,每个条码包含具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠和缀合至金属纳米壳的捕获探针,该捕获探针能够与目标相互作用且该系统能够产生指示在样品中检测到目标的可检测信号,该可检测信号包含来自具有结合至目标的捕获探针的条码的第一信号和来自结合至目标的第二探针的第二信号。
在另一实施方式中,本发明提供了一种用于在单一样品中同时检测多个感兴趣的目标的多重检测系统。本发明的多重检测系统,在一个实施方式中,可以包括:多个条码,每个条码包含:(i)具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠和(ii)缀合至条码表面的一个捕获探针,其能够与多个感兴趣的目标中的一种相互作用,从而该多个条码针对多个感兴趣的目标的每一种都包括至少一个条码,该多个金属纳米壳-条码能够产生针对多个感兴趣的目标的每一种的不同目标特异性信号,每个目标特异性信号包含来自具有与特定感兴趣目标相互作用的捕获探针的条码的第一信号,和来自结合至特定感兴趣目标的第二探针的第二信号。
在一个实施方式中,该检测系统或该多重检测系统可以组合本发明的金属纳米壳包被的条码和无线通信设备,例如计算机、手机、平板电脑和手表以使对样品中多个有机或无机目标的同时检测成为可能。本发明的无线多重检测系统可以允许使用无线通信设备来检测和定量分析多个目标,所述无线通信设备具有对来自该多重检测系统的可检测信号成像的照相机。本发明的系统和方法的无线能力可以允许其用于远程设置,使无线传输数据用于解读成为可能,并可以允许对目标分布进行标绘和监视。该无线通信设备可以包括用于收集来自条码的信号的工具、用于传递所收集的信号的工具、或两者。
优点
如下文进一步例示的,本发明的纳米壳包被的条码表现出具有:在不同生物学环境中的实质性的荧光稳定性和一致性(参见图2)、增强的保质期(参见图13和14)、容易缀合捕获探针(参见图3和表2)、和作为感兴趣的有机或无机目标的多重检测系统的应用(参见图4)。
本发明的纳米壳包被的条码的其它优点包括:(a)微珠直径、QDs荧光和金属纳米壳厚度是可调的。(b)本发明条码的荧光可以在广泛的pH范围、缓冲液和温度条件中具有实质上更高的一致性。对这些参数的控制可导致条码信号一致性的改进。(c)与未包被的微珠相比观察到使用金属纳米壳包被的微珠对遗传目标的分析灵敏度有约2个数量级的增加。该分析过程简单、可靠且相对快速,且检测灵敏度比得上其它具有信号放大机制的基于微珠的检测平台[29,30]。(d)微珠能够以优秀的条码表现进行多重检测。发明人显示了该条码可被用于区分潜在的致死性恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)疟疾病原体和较少致死的疟疾种类,例如间日疟原虫(Plasmodiumvivax)。这些优点使得该平台成为在广泛领域中的高灵敏度和高通量多重探测应用的理想候选者。
为了使本发明能够被更好地理解,给出了以下实施例。这些实施例仅作为说明目的,而不构成以任何方式对本发明范围的限制。
实施例
实验流程
QD合成:基于公开的流程[31]合成并表征了三正辛基膦氧化物(TOPO)ZnS-包覆的CdSeQDs,并储存于氯仿中。根据批次,QDs的量子产率为0.2-0.4。
QD表面上的配体交换:通过温和气流蒸发TOPO包被的QDs溶液的氯仿。将胺末端的聚苯乙烯聚合物(Mn=5000,来自PolymerSource)和QDs(摩尔比=1000:1)溶于甲苯并在60°C下孵育过夜。通过加入甲醇来沉淀聚苯乙烯包被的QDs,并重悬于氯仿中用于珠合成。
QD条码的合成:通过修饰自一份之前的报道[32]的控制浓度的流动聚焦(CCFF)技术来合成QD条码。将聚苯乙烯包被的QDs在氯仿中混合单独的苯乙烯-马来酸酐共聚物聚合物(4%,w/v)或苯乙烯-马来酸酐共聚物(2%)-聚苯乙烯(2%)混合聚合物。对溶液通过0.2-μmPTFE过滤器过滤,并随后以1.2mL/小时的速度通过注射泵(WorldPrecisionInstruments)与以180mL/小时的速度通过数字齿轮泵(ColeParmerInstruments)的聚焦流体(水)一起注射至用户化喷嘴系统(Ingeniatrics)中。喷嘴的底部浸入水中。合成后,通过过夜搅拌硬化QD条码并通过离心收集。条码的大小和浓度通过Vi-细胞分析仪(BeckmanCoulter)测定。
金属纳米壳在条码表面的形成:将1百万条QD条码与100μL的EDC(20mg/mL的MES缓冲溶液,pH6.5,50mM)和30μL的胱胺(50mM的MES缓冲溶液)在室温下孵育4小时。通过在5,000g下重复离心5分钟将过量的胱胺洗脱至水中。将硫醇化的微珠与银或金纳米颗粒(平均直径=10nm,100μL100nM的1mM柠檬酸盐溶液,来自Nanocomposix)在室温下孵育过夜。金属纳米颗粒作为金属形成的成核位置。然后通过在500g下反复离心5分钟在水(含0.05%TWEEN-20)中洗涤条码。将接种银或金的条码分别重悬于50μL的硝酸银或氯化金(1mM)和对苯二酚(1mM)中多达2小时,并通过在100g下反复离心5分钟在水(0.05%TWEEN-20)中进行洗涤。金属纳米壳包被的珠在4oC下储存于水中。
扫描电镜(SEM)成像:将金属纳米壳包被的条码滴加至碳膜包被的网格(300目,来自TedPella)并通过HitachiS-5200SEM在2.0kV下成像。
用DNA捕获探针功能化条码表面:用DNA探针功能化条码表面的流程修饰自公开报道[33]。将1百万的珠与50μL的硫醇化捕获探针(30μM的PBST溶液,含0.9M的氯化钠)在室温下孵育2小时。通过在100g下反复离心5分钟在水(0.05%TWEEN-20)中洗涤条码。对于未包被的珠,缀合条件之前已有优化[34]。1百万未包被的珠与胺化捕获探针(与银纳米壳包被的条码使用的硫醇化捕获探针相同的量)和EDC(10mg,100μLMES缓冲液中,pH5.0,100mM)在室温下孵育过夜。然后通过在5000g下反复离心5分钟在水中洗涤条码。微珠上捕获探针的量通过检测缀合和离心后上清液中剩余的DNA量,并从捕获探针的总量中扣除来计算。缀合过程中相同量的捕获探针被用于未包被和银-纳米壳包被的珠。每微珠的捕获探针的量见于表2。
DNA分析:对每个样品,将约5,000微珠与不同浓度的目标DNA链和Alexa647-标记的第二探针在杂交缓冲液(5XSSC缓冲液,来自Sigma)中一起孵育,终体积20μL。报告子探针的量比分析中最高的目标量摩尔过量100倍。在HL-2000HybriLinker杂交箱(UVP)中40oC下反应20分钟,然后通过96孔0.45-μm过滤板(Millipore)进行洗涤。然后将微珠重悬于PBST并通过流式细胞仪(BDBiosciences)进行分析。
DNA链的序列:DNA链由IDT或BioBasic合成。
表1
结果
金属纳米壳包被的条码的荧光强度
本发明的金属包被的QD条码的荧光强度显示在广视野显微镜下保持明显。还显示具有控制厚度的金属纳米壳可以基本上不影响QDs的条码能力。本发明QD微珠的荧光强度随着壳厚度增加而降低(参见图1J),因为更少的光子能够透入和穿过具有较厚壳的微珠。
如图7、8和9所示,相对于金属纳米壳厚度的增加而减少的荧光对于单一和混合聚合物条码是相似的,对含有不同发射QDs的条码也是相似的。图7是显示银纳米壳厚度对混合聚合物QD条码荧光强度的影响的图。与图1J相似,银纳米壳在由混合聚合物制成的条码上形成不同时间段并通过流式细胞术检测。未包被珠的中值荧光强度被标准化为100%。
图8包括显示银纳米壳形成时间对(A)QD600条码的荧光强度和(B)前方散射的影响的图。银纳米壳在含有QD600的微珠上形成不同时间段并通过流式细胞术检测。未包被珠的中值荧光强度和前方散射(FSC)值分别被标准化为100%。银纳米壳以与图1i(图A)中的QD555条码相似的方式降低了QD600条码的荧光强度。FSC值随形成时间而增加,显示加入银纳米壳的微珠的更大直径(图8B)。
图9显示了银纳米壳形成过程中QD条码的(A)荧光和(B)吸收光谱。银纳米壳形成过程中对同一样品的荧光光谱通过荧光计进行了记录。激发波长设定为450nm。银纳米壳的整个形成时间中QD条码的发射峰保持恒定于555nm(图9A)。还对同一样品的吸收通过分光计进行了记录(图9B)。
如图9所示,金属纳米壳仅减少了QD条码的荧光强度,但是没有改变其发射波长。因此,在实际应用中纳米壳厚度可以被控制以允许激发荧光并通过照相机或光探测器进行捕捉。这将允许对条码的正确鉴定。不同的壳厚度也可被用于增加QD条码的数量,因为厚度将影响荧光强度。
图11包括显示金纳米壳形成时间对(A)QD条码的荧光强度和(B)QD条码的前方散射的影响的图。在图11的情况下,QD条码用金(Au)纳米壳包被不同的时间段并通过流式细胞术检测。未包被珠的中值荧光强度和FSC值分别被标准化为100%。结果与银纳米壳所获得的结果相似。银纳米颗粒吸收约420nm的事实可以提供相对更大的第二荧光素的选择。
金属纳米壳包被的条码的荧光稳定性
图12显示了在不同环境条件:pH(图12A)、缓冲液(图12B)和温度(图12C)下由单一聚合物和混合聚合物制成的未包被QD条码的荧光稳定性的图。对每个条件将pH7、水和25oC下的微珠的中值荧光强度分别标准化为100%。如图12所示,两种组分的条码荧光在这些条件中显示了相似的趋势。
将未包被的单一聚合物QD条码与银纳米壳包被的单一和混合聚合物条码进行了比较。未包被的混合聚合物条码没有比较,因为,如前所示,聚合物组分不会显著影响其保质期(参见图12)。图2显示了由不同组分制成的QD微珠的荧光稳定性。银纳米壳厚度为20-30nm。在pH4-11下将微珠孵育24小时(a-c),或在水、HEPES(pH7)、TE(pH8)、PBS(pH7)和SSC(pH7)缓冲液中孵育24小时(d-f),或在25oC-95oC下孵育20分钟(g-i)。微珠的中值荧光强度在处理后通过流式细胞术进行测定。在每个条件中,将pH7、水和25oC下的微珠强度值转化为100%,其它组据此标准化。如图2所示,未包被的单一聚合物珠的荧光在高于8的pH、具有盐浓度超过100mM的缓冲液和高于40oC的温度下快速下降(图2a、d、g)。与未包被的珠相比,银纳米壳在测试的缓冲液和温度条件下显著改进了单一和混合聚合物微珠的荧光稳定性。
金属纳米壳包被的条码的保质期
在pH4-11下将微珠孵育24小时(图13,a-c),或在水、HEPES(pH7)、TE(pH8)、PBS(pH7)和SSC(pH7)缓冲液中孵育24小时(图13,d-f),或在25oC-95oC下孵育20分钟(图13,g-i)。这些样品与图2中的样品相同。不同条件下完整珠的数量通过流式细胞术中前方散射(FSC)-侧向散射(SSC)进行测定并概括如上(图14)。在每个条件中,将pH7、水和25oC下的完整微珠数转化为100%,其它组据此标准化。结果见于图13和14。
前方散射和侧向散射图表明未包被的珠在碱性、高离子强度和高热条件下很容易降解(参见图14)。有了银纳米壳,微珠在这些条件下保持完整。图14显示了未包被的单一聚合物珠在pH11下急速降解。在所有pH下银-纳米壳包被的混合聚合物条码中都没有明显变化。微珠在缓冲液和温度中的图显示了与上文相似的结果。银纳米壳包被的单一聚合物珠是完整的,但是其荧光被高pH改变(图2b)。具有银纳米壳的由混合聚合物制成的珠看上去显示了对pH4-11、所有缓冲液和高达70oC的温度的最优的相容性(图2c、f、i)。微珠内独特的相隔离域阻止了水性离子接触QDs并与QDs反应。因此,银纳米壳和混合聚合物两者看上去对获得更好的QD条码荧光稳定性和珠结构都是重要的。
如图15所示,金纳米壳(约50nm厚度)显示了与银纳米壳相似的对条码的保护效果。两种珠都由单一聚合物制成。
金属纳米壳包被的条码的应用
本发明的金属纳米壳包被的条码可以通过在金属纳米壳表面缀合捕获探针被功能化。
发明人比较了未包被和银纳米壳包被的微珠在检测试验中的分析表现。多重实验中使用的阳性对照DNA链(cggcgatgaatacctagcacacttactaggccgccgatattgg)被选作模型目标。通过碳化二亚胺偶联剂使未包被的QD555珠缀合目标链(aaaaaaaaaccaatatcggcggcc)的胺化的捕获探针。缀合条件在之前的研究中已有优化[16,17]。简而言之,将1百万未包被的珠在100μL含10mg的EDC和28皮摩尔的捕获探针的MES缓冲液(pH6.5,50mM)中孵育过夜。银纳米壳包被的珠用硫醇化的捕获探针功能化。用于缀合的捕获探针的量在未包被和银纳米壳包被的QD条码间保持恒定。然后通过夹心法分析使用两种类型的珠进行平行试验来检测目标链(图3A)。夹心法分析指目标结合至条码上的捕获探针和第二探针。分析过程中在洗涤去除未结合材料的步骤后(条码可以在捕获探针缀合至条码表面后洗涤,在具有捕获探针的条码与目标一起孵育之后洗涤,和在条码和目标复合物与第二探针孵育之后洗涤),条码和第二探针两者信号的存在表明成功捕获了目标。
银纳米壳包被的珠表现出3微微微摩尔(attomole)的检测极限,这对未包被的珠而言是2个数量级的改进(参见图3B)。通过1步20分钟的夹心法分析得到了这一检测的灵敏度,而没有任何的信号放大。这些发现是第一批结果,显示微珠表面上的金属纳米壳显著改进了生物传感的检测灵敏度。有几个潜在的机制有助于信号增强。首先,在每个银纳米壳包被的珠上有超过未包被珠3倍的捕获探针(参见表2)。结果,目标链将具有更高的几率被银纳米壳包被的条码捕获。但是珠表面上增加的捕获探针数量显然不足以解释整体的检测灵敏度提升。一种机制可能是银纳米壳表面是轻微粗糙化的。对于未包被的珠,发明人发现捕获探针的立体效应影响了分析灵敏度[16]。因此,粗糙化表面上的捕获探针倾向于轻微无序,这最小化了目标分子与捕获探针之间的立体相互作用。发明人还发现未包被的珠在多种情况下显著分裂,导致减少的分析信号。与图2中显示的结果一致,银纳米壳增加了在分析条件下的条码稳定性。这可能有助于改进的分析表现。未包被的珠还显示了较之银纳米壳包被的珠更高水平的第二探针非特异性结合,导致更高的背景信号和减少的检测灵敏度(图3)。另一可能的因素可以是由银纳米壳导致的报告子荧光素的金属增强的荧光效果。银纳米颗粒可以依赖距离和厚度的方式增强荧光素的荧光强度[18,19]。对于分析实施例中使用的第二荧光探针Alexa647而言,强的金属增强的荧光可以在远离厚度/直径为10-150nm的银纳米颗粒15-50nm的距离发生[20,21]。在目前的设计中,基于捕获探针和报告子探针(序列见表1)的长度,Alexa647和银纳米壳之间的距离为约25nm,这在金属增强的荧光的范围内。可能上述因素和其它未知因素的组合导致了最终的检测灵敏度增强。
多重检测系统
发明人进一步通过进行4重DNA分析用以将恶性疟原虫——一种潜在死亡性疟疾种类——与其它非致死性疟疾种类进行区分显示了本发明的金属纳米壳包被的QD条码在多重检测中的实际应用。
每年有超过1百万人死于疟疾感染[22,23]。有四种不同的寄生虫导致人的疟疾:恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)和三日疟原虫(P.malariae)。区分鉴别潜在死亡性恶性疟原虫和其它种类的能力对于正确的临床治疗和减少耐药性是重要的。
为了检测恶性疟原虫和其它疟原虫种类,基于恶性疟原虫和间日疟原虫的18SrRNA基因的遗传保守区[24,25]设计了捕获探针,使用Alexa647标记的序列作为第二探针。还设计了阴性和阳性对照链(DNA序列见表1)。对每个目标用硫醇化的捕获探针功能化了四种不同荧光签名的银纳米壳包被的QD条码[26]。
恶性疟原虫和间日疟原虫的剂量响应曲线见于图4a和4b。两种目标链均表现出其浓度和分析信号之间的良好的线性。间日疟原虫的信号强度是恶性疟原虫的约10倍高。发明人在其它研究中也观察到相似的区别[16]。链之间分析信号的区别与DNA序列有关,因为核苷酸的组成影响了解链温度和结合亲和力,导致分析效率的变化。不同的DNA目标表现出由捕获探针和目标链次级结构不同所致的不同的分析信号强度和缀合效率。为了考察目标链间的交叉反应性,通过混合不同组合的目标链加上阳性对照链(10飞摩尔)制备了5种不同的模拟基因样品。报告子探针与银纳米壳包被的珠存在可忽略的非特异性结合,如所有的阴性组所显示的。目标链并不影响彼此的信号,表明链之间没有交叉反应性(图4c)。目前的结果清楚地表明这些条码在单一反应管中区分不同疟疾寄生虫株的能力。目前用于区分疟疾种类的金标准方法是使用蛋白生物标志物的侧向流分析[27]。这一临床上批准的技术仅能够检测高寄生虫血症(即,血液中的寄生虫负担)下的恶性疟原虫和其它疟疾种类,但对低寄生虫血症感染可靠度较差[28]。PCR诊断技术具有比侧向流分析更好的分析灵敏度,并可区分疟疾种类,但是PCR对于实地或远程环境的应用将是困难的。本发明的金属纳米壳包被的条码的分析灵敏度接近于PCR,但是微珠分析可以很容易地自动进行,并使用显微镜、荧光仪和流式细胞仪进行检测。从而,微珠分析具有比PCR更高的实地应用的可能性。
发明人还研究了是否一般的金属纳米壳都能增强分析表现。如图16所示,在条码上形成了金和银纳米壳(~50nm厚,~3微米珠上)。两种纳米壳相对于未包被条码都增强了分析表现,且银纳米壳表现出比金纳米壳更好的信号。图17A显示了多重分析中使用的4重条码的荧光光谱。QD540和QD580被用于制备该4重条码,其发射光谱见于图17B。这些条码在流式细胞图中显示了明显的荧光强度分布(图17C)。水平标尺是FITC通道(525nm)强度。垂直标尺是PE通道(575nm)强度。条码1(B1)和4(B4)分别为阴性和阳性对照。B2和B3分别代表间日疟原虫和恶性疟原虫。我们检测了珠表面上DNA捕获探针的密度。如表2所示,银纳米壳包被的条码具有比未包被条码显著更高的DNA密度。图18是显示未包被的珠上和银纳米壳包被的珠上捕获探针数量的表。
表2–珠上捕获探针的量
未包被的珠 | 银纳米壳包被的珠 | |
每个珠上捕获探针的量(微微微摩尔) | 54 | 181 |
本文呈现了纳米壳包被的QD条码和合成金属纳米壳包被的QD条码的方法。微珠的直径、QDs的荧光和金属纳米壳的厚度都是高度可调的。本发明的QD条码的荧光具有在大范围的pH、缓冲液和温度条件下比未包被的珠更高的一致性。这将会导致条码信号一致性的改进。发明人表明与未包被的微珠相比使用金属纳米壳包被的微珠检测遗传目标的分析灵敏度有至少2个数量级的增加。该分析过程非常简单、可靠且快速,且检测灵敏度比得上其它具有信号放大机制的基于微珠的检测平台[29,30]。最后,本文显示该复合微珠能够以优秀的条码表现进行多重检测。本发明的条码能够区分潜在的致死性恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)疟疾病原体和其它疟疾种类。这些优点使得该平台成为在广泛领域中的超高灵敏度和高通量多重探测应用的理想候选者。
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本说明书中引用的优先权文件和所有出版物和专利申请均通过引用并入本文,如同每个单独的出版物或专利申请特别地和单独地指出通过引用并入一样。虽然为了清楚理解对上述发明的一些细节以说明和举例的方式进行了描述,但是本领域普通技术人员参照本发明的教导可对其作出不脱离所附权利要求的精神或范围的某些变化和修改将是显而易见的。
Claims (66)
1.一种条码,该条码包含具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠。
2.权利要求1的条码,其中该荧光素包括有机荧光素、无机荧光素或有机荧光素和无机荧光素的混合物。
3.权利要求1的条码,其中该微珠是聚合的微珠。
4.权利要求1的条码,其中该微珠包含苯乙烯-马来酸酐共聚物的单一聚合物系统,包括苯乙烯-马来酸酐共聚物的类似物或衍生物。
5.权利要求1的条码,其中该微珠包含聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的混合聚合物系统,包括这些聚合物的类似物或衍生物。
6.权利要求5的条码,其中聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物,包括它们的类似物或衍生物,的比例的范围为质量比约4:1至约1:1。
7.权利要求1的条码,其中荧光素是量子点(QDs)。
8.权利要求7的条码,其中该微珠是聚合的微珠。
9.权利要求7的条码,其中该微珠包含苯乙烯-马来酸酐共聚物的单一聚合物系统,包括苯乙烯-马来酸酐共聚物的类似物或衍生物。
10.权利要求7的条码,其中该微珠包含聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的混合聚合物系统,包括这些聚合物的类似物或衍生物。
11.权利要求10的条码,其中聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物,包括它们的类似物或衍生物,的比例范围为质量比约4:1至约1:1。
12.权利要求1的条码,其中金属选自银或金。
13.权利要求1的条码,其中条码进一步包含缀合至金属纳米壳的目标特异性捕获探针。
14.权利要求13的条码,其中该目标包括无机材料和有机材料。
15.权利要求14的条码,其中有机材料包括单细胞和多细胞生物及其任何组分、肽、蛋白质、寡糖、脂质、基因、核酸、氨基酸,且其中无机材料包括具有金属原子的无机分子。
16.权利要求1的条码,其中条码包括在微珠表面和金属纳米壳之间的蛋白层。
17.权利要求1的条码,其中相对于没有金属纳米壳的条码,该金属纳米壳有助于延长条码的保质期。
18.权利要求1的条码,其中相对于没有金属纳米壳的条码,该金属纳米壳有助于增强条码的荧光稳定性。
19.权利要求1的条码,其中该金属纳米壳具有约20nm至约80nm的厚度。
20.一种在条码表面形成金属纳米壳的方法,该方法包括:(a)使条码接触金属纳米颗粒,和(b)将步骤(a)中获得的条码与金属的盐混合足以在条码上形成金属纳米壳的一段时间。
21.权利要求20的方法,其中该条码包含具有一个或多个荧光素群的微珠,且其中荧光素包括有机荧光素、无机荧光素或有机荧光素和无机荧光素的混合物。
22.权利要求21的方法,其中该微珠是聚合的微珠。
23.权利要求21的方法,其中该微珠包含苯乙烯-马来酸酐共聚物的单一聚合物系统,包括苯乙烯-马来酸酐共聚物的类似物或衍生物。
24.权利要求21的方法,其中该微珠包含聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的混合聚合物系统,包括这些聚合物的类似物或衍生物。
25.权利要求24的方法,其中聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物,包括它们的类似物或衍生物,的比例范围为质量比约4:1至约1:1。
26.权利要求21的方法,其中荧光素是QDs。
27.权利要求26的方法,其中该微珠是聚合的微珠。
28.权利要求26的方法,其中该微珠包含苯乙烯-马来酸酐共聚物的单一聚合物系统,包括苯乙烯-马来酸酐共聚物的类似物或衍生物。
29.权利要求26的方法,其中该微珠包含聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的混合聚合物系统,包括这些聚合物的类似物或衍生物。
30.权利要求29的方法,其中聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物,包括它们的类似物或衍生物,的比例范围为质量比约4:1至约1:1。
31.权利要求20的方法,其中金属选自银或金。
32.权利要求20的方法,其中该方法进一步包括通过将捕获探针缀合至金属纳米壳来功能化该金属纳米壳包被的条码,其中所述捕获探针能够与目标相互作用。
33.权利要求32的方法,其中该目标包括无机材料和有机材料。
34.权利要求33的方法,其中有机材料包括单细胞和多细胞生物及其任何组分、肽、蛋白质、寡糖、脂质、基因、核酸、氨基酸,且其中无机材料包括具有金属原子的无机分子。
35.权利要求20的方法,其中所述方法进一步包括,使条码接触金属纳米颗粒之前,在条码上加入蛋白质层。
36.权利要求20的方法,其中步骤(b)的时间是形成对应于预选的金属纳米壳厚度的金属纳米壳所需的时间。
37.权利要求36的方法,其中形成金属纳米壳所需时间选自比较金属纳米壳厚度和金属纳米壳形成时间的标准曲线。
38.一种用于在样品中检测目标的检测系统,该检测系统包含多个条码,每个条码包含具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠和缀合至金属纳米壳的捕获探针,该捕获探针能够与目标相互作用且该系统能够产生指示在样品中检测到目标的可检测信号,该可检测信号包含来自具有结合至目标的捕获探针的条码的第一信号和来自结合至目标的第二探针的第二信号。
39.权利要求38的检测系统,其中该检测系统进一步包括一种无线通信设备,该无线通信设备包括用于收集来自该多个条码和第二探针的可检测信号的工具。
40.权利要求39的检测系统,其中该无线通信设备进一步包括用于分析从该多个条码和第二探针收集的信号的工具,和传输收集的信号用于远程分析的工具的至少一种。
41.权利要求38的检测系统,其中该样品是生物学样品或非生物学样品。
42.一种用于在单一样品中同时检测多个感兴趣的目标的多重检测系统,该多重检测系统包含:多个条码,每个条码包含:(i)具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠和(ii)缀合至条码表面的一个捕获探针,其能够与多个感兴趣的目标中的一种相互作用,从而该多个条码针对多个感兴趣的目标的每一种都包括至少一个条码,该多个金属纳米壳-条码能够产生针对多个感兴趣的目标的每一种的不同的目标特异性信号,每个目标特异性信号包含来自具有与特定感兴趣目标相互作用的捕获探针的条码的第一信号,和来自结合至特定感兴趣目标的第二探针的第二信号。
43.权利要求42的多重检测系统,其中该多重检测系统进一步包括第二探针信号,该第二探针信号指示条码捕获探针对目标的成功捕获。
44.权利要求42的多重检测系统,其中该多重检测系统进一步包括一种无线通信设备,该无线通信设备包括用于收集来自该多个条码的第一信号和来自第二探针信号的第二信号的工具。
45.权利要求44的多重检测系统,其中该无线通信设备进一步包括用于分析从该多个条码和第二探针收集的信号的工具,和传输收集的信号用于远程分析的工具的至少一种。
46.权利要求42的多重检测系统,其中该样品是生物学样品或非生物学样品。
47.一种用于在样品中检测感兴趣目标的方法,该方法包括:
使样品接触:(a)多个条码,每个条码包含具有一个或多个荧光素群的金属纳米壳包被的微珠,和缀合至金属纳米壳的捕获探针,该捕获探针能够与感兴趣的目标相互作用,每个条码能够发射一种目标特异性信号,和(b)第二探针,该第二探针能够与感兴趣的目标相互作用并发射一种第二探针信号;
其中条码信号和第二探针信号的存在指示在样品中检测到目标。
48.权利要求47的方法,其中该条码包括具有一个或多个荧光素群的微珠,且其中该荧光素包括有机荧光素、无机荧光素或有机荧光素和无机荧光素的混合物。
49.权利要求47的方法,其中该微珠是聚合的微珠。
50.权利要求47的方法,其中该微珠包含苯乙烯-马来酸酐共聚物的单一聚合物系统,包括苯乙烯-马来酸酐共聚物的类似物或衍生物。
51.权利要求47的方法,其中该微珠包含聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的混合聚合物系统,包括这些聚合物的类似物或衍生物。
52.权利要求51的方法,其中聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物,包括它们的类似物或衍生物,的比例范围为质量比约4:1至约1:1。
53.权利要求47的方法,其中荧光素是QDs。
54.权利要求53的方法,其中该微珠是聚合的微珠。
55.权利要求53的方法,其中该微珠包含苯乙烯-马来酸酐共聚物的单一聚合物系统,包括苯乙烯-马来酸酐共聚物的类似物或衍生物。
56.权利要求53的方法,其中该微珠包含聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物的混合聚合物系统,包括这些聚合物的类似物或衍生物。
57.权利要求53的方法,其中聚苯乙烯和苯乙烯-马来酸酐共聚物,包括它们的类似物或衍生物,的比例范围为质量比约4:1至约1:1。
58.权利要求47的方法,其中金属选自银或金。
59.权利要求47的方法,其中所述目标包括无机材料和有机材料。
60.权利要求59的方法,其中有机材料包括单细胞和多细胞生物及其任何组分、肽、蛋白质、寡糖、脂质、基因、核酸、氨基酸,且其中无机材料包括具有金属原子的无机分子。
61.权利要求47的方法,其中条码包括在微珠表面和金属纳米壳之间的蛋白层。
62.权利要求47的方法,其中该金属纳米壳具有约20nm至约80nm的厚度。
63.权利要求47的方法,其中该样品是生物学样品或非生物学样品。
64.权利要求47的方法,其中该样品是取自人类的生物学样品。
65.权利要求47的方法,其中该样品是取自非人类生物体的生物学样品。
66.权利要求47的方法,其中该样品是环境样品。
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |