JPWO2011155435A1 - 近接場増強蛍光センサチップ - Google Patents

Abstract

［課題］本発明は、抗原−抗体反応や蛍光検出の効率を最大化できるＳＰＦＳ用センサチップを提供することを目的とする。［解決手段］透明支持体と金属薄膜とＳＡＭと３次元構造を有する固相化層とリガンドとを含むＳＰＦＳ用センサチップであって；前記センサチップにおいて、前記透明支持体の、前記金属薄膜とは接していない一方の表面から所定の角度で入射した光に対して、前記透明支持体の他方の表面側にある光量検出器で測定した反射光量を、該角度に対してプロットしたグラフから得られる半値幅（α）に対する、透明支持体と金属薄膜とを含むセンサチップの半値幅（β）の、｛半値幅（α）−半値幅（β）｝／半値幅（β）×１００で表される変動率が、０％以上３０％以下であることを特徴とするＳＰＦＳ用センサチップ。

Description

本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ〕用センサチップ、すなわち近接場増強蛍光センサチップおよびその製造方法，該ＳＰＦＳ用センサチップを用いたアッセイ法，アッセイ用装置ならびにアッセイ用キットに関する。

ＳＰＦＳとは、照射したレーザ光が金属薄膜表面で全反射減衰〔ＡＴＲ〕する条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、照射したレーザ光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光色素を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる方法である。

一方、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ〕とは、照射したレーザ光が金属薄膜表面でＡＴＲする条件において、誘電体に接触した金属薄膜表面に発生させた粗密波（表面プラズモン）と、誘電率（または屈折率）の差異による影響を受け易いエバネッセント波との波数が一致したとき両者が共鳴して反射光が減衰する現象である。ＳＰＲを利用することによって、センサ表面においてリガンドとアナライトとが相互作用することによって誘電体の誘電率（または屈折率）に差異が生じ、その結果、表面プラズモン共鳴が変化することによって、リガンドとアナライトとの相互作用を定量することができる。

このようなＳＰＦＳおよびＳＰＲに用いるセンサ基板が、それぞれ特許文献１，２に記載されている。

特許文献１には、図７に示すようなセンサ・ユニット(100)が開示されている。センサ・ユニットとは、ガラス，プラスチック，その他の透明な材料で作られた透明プレートと、該プレートの片面にスパッタリングで形成された金属フィルムと、該金属フィルムに結合したデキストラン層（デキストラン・フィルム）と、該デキストラン・フィルムに結合されたリガンドとを包含するものである。このリガンドは、サンプル溶液内に存在する特定のバイオ分子（例えば、抗原）と相互作用するものであり、可変角内部全反射蛍光発光、すなわちＳＰＦＳを実施することができる。

また、特許文献２には、図８に示すような測定チップ(200)と、該測定チップの表面に共有結合により結合させた生理活性物質とをＳＰＲに用いる技術が記載されている。該測定チップは、誘電体ブロックと、該誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、該金属膜をコーティングする疎水性高分子化合物と、その表面を被覆するヒドロゲルとからなる。

しかしながら、特許文献１，２には、リガンドおよびリガンドを固定化するデキストラン等の密度について記載も示唆もなく、特許文献１，２の記載に基づいて作製したＳＰＦＳ用センサチップは、アッセイに用いるチップによってシグナル（信号）にバラツキがあることがわかった。

特許第３２９４６０５号 特許第４２９２０４３号

例えば、特許文献１に記載のセンサ・ユニットに含まれるリガンド（抗体）の固定化密度を大きくしても、アッセイシグナルがそれほど増加しない割にチップ毎のシグナル強度のバラツキが大きいという問題を克服するために、本発明は、抗原−抗体反応や蛍光検出の効率を最大化できるＳＰＦＳ用センサチップ、それを用いたアッセイ法およびアッセイ用装置ならびにアッセイ用キットを提供することを目的とする。

本発明者らの分析から、ＳＰＦＳ測定において、抗体等リガンドの密度、リガンドを固定化する固相化層の材質（デキストラン等の高分子の種類）、この固相化層の膜厚や固相化層上のリガンドを含めたリガンドと固相化層からなる膜厚が、シグナル強度およびそのバラツキに影響することがわかった。そして、上記条件によって変動する、光源入射角に対して、光量検出器で測定した反射光量をプロットしたグラフから得られる半値幅の変動率をある特定の数値範囲内とすることによって、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明のＳＰＦＳ用センサチップは、透明支持体と；前記透明支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；前記金属薄膜の、前記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；前記ＳＡＭの、前記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された、３次元構造を有する固相化層と；前記固相化層に固定化されたリガンドとを含む表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ〕用センサチップであって；
前記透明支持体の、前記金属薄膜とは接していない一方の表面から所定の角度で入射した光に対して、前記透明支持体の他方の表面側にある光量検出器（例：フォトダイオード〔ＰＤ〕）で測定した反射光量を、該角度に対してプロットしたグラフから得られる半値幅（α）に対する、
前記ＳＰＦＳ用センサチップから前記ＳＡＭと前記固相化層と前記リガンドとを除いた、前記透明支持体と、前記透明支持体の一方の表面に形成された前記金属薄膜とを含む基板の半値幅の（β）の、下記式：
｛半値幅（α）−半値幅（β）｝／半値幅（β）×１００で表される変動率が、０％以上３０％以下であることを特徴とする。

上記固相化層は、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましい。

上記固相化層は、その密度が、２ｎｇ／ｍｍ²未満であることが好ましい。

上記固相化層は、その平均膜厚が、３ｎｍ以上８０ｎｍ以下であることが好ましい。

上記固相化層に固定化された上記リガンドの密度は、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ²以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ²以下であることが好ましい。

本発明のアッセイ法は、少なくとも、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする；
工程（ａ）：本発明のＳＰＦＳ用センサチップに、検体を接触させる工程、
工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経たＳＰＦＳ用センサチップに、さらに、前記ＳＰＦＳ用センサチップに含まれる上記リガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程、
工程（ｃ）：前記工程（ｂ）を経たＳＰＦＳ用センサチップに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、レーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。

本発明のアッセイ法において、上記アナライトに、上記コンジュゲートが結合することが好ましい。

上記アナライトは、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原であってもよい。

本発明のアッセイ用装置は、上述のＳＰＦＳ用センサチップを用い、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。

また、本発明のアッセイ用キットは、透明支持体と；前記透明支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；前記金属薄膜の、前記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたＳＡＭと；前記ＳＡＭの、前記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された、３次元構造を有する固相化層とからなり、上述のＳＰＦＳ用センサチップに用いられるセンサチップ用基板を、少なくとも含むことを特徴とする。

本発明のＳＰＦＳ用センサチップはデキストラン等を含む固相化層を用いているにも関わらず、アッセイに用いた際、シグナルのムラが出ず（すなわち、変動係数〔ＣＶ〕が極めて小さく、安定化している）、かつシグナルが増加することから、検出の安定性向上および高感度化が達成できる。

図１は、本発明のＳＰＦＳ用センサチップの好ましい一態様を模式的に示した縦断面図である。 図２は、図１に示す、ＳＰＦＳ用センサチップを用いてＳＰＦＳ測定を実施した際、固相化層の密度（すなわち、固相化層に固定化された抗体の密度）を横軸に、増強電場，免疫反応およびＳＰＦＳシグナルを縦軸にプロットした理想的なグラフを示す。 図３（Ａ）〜（Ｃ）それぞれ、比較例１，比較例２および実施例１で製造したＳＰＦＳ用センサチップの縦断面図を模式的に示したものである。 図４は、実施例１および比較例１，２ならびに作製例２でそれぞれ製造したＳＰＦＳ用センサチップならびに基板を用いて、光源入射角に対して、該光源入射角での、フォトダイオードで測定した反射率（対入射光量）をプロットしたグラフを示す。 図５は、比較例１，２でそれぞれ製造したＳＰＦＳ用センサチップを用いて、固相化層の屈折率に対して、原子間力顕微鏡〔ＡＦＭ〕により測定した膜厚をプロットしたグラフを示す。 図６は、本発明のＳＰＦＳ用センサチップの一態様において、固相化層に固定化されたリガンドである抗体の密度〔ｍｏｌ／ｃｍ²〕に対して、"Ｓｉｇｎａｌ"（信号）〔ａ．ｕ．〕をプロットしたグラフを示す。 図７は、特許文献１に開示されているセンサ・ユニットの縦断面図を模式的に示したものである。 図８は、特許文献２に開示されている測定チップの縦断面図を模式的に示したものである。

以下、本発明のＳＰＦＳ用センサチップおよびその製造方法について具体的に説明する。

＜ＳＰＦＳ用センサチップ＞
本発明のＳＰＦＳ用センサチップは、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたＳＡＭと；該ＳＡＭの、該薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された、３次元構造を有する固相化層と；該固相化層の中および外面に固定化されたリガンドとを含む「ＳＰＦＳ用センサチップ」であって；
該センサチップにおいて、該支持体の、該薄膜とは接していない一方の表面から所定の角度で入射した光に対して、該支持体の他方の表面側にある光量検出器（例：フォトダイオード〔ＰＤ〕）で測定した反射光量を、該角度に対してプロットしたグラフから得られる半値幅（α）に対する、
透明支持体と、該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜とを含む「基板」の半値幅（β）の、下記式：
｛半値幅（α）−半値幅（β）｝／半値幅（β）×１００で表される変動率が、０％以上３０％以下であることを特徴とする。

すなわち、本発明の「ＳＰＦＳ用センサチップ」の半値幅を「半値幅（α）」とし、本発明の「ＳＰＦＳセンサチップ」からＳＡＭと固相化層と固相化層に固定化されたリガンドとを除いた「基板」すなわち透明支持体と金属薄膜からなる「基板」の半値幅を「半値幅（β）」としたとき、｛半値幅（α）−半値幅（β）｝／｛半値幅（β）｝×１００と定義する変動率が０％以上３０％以下、好ましくは０％以上２０％以下、より好ましくは０．００１％以上２０％以下であることを特徴とする。なお、一般に、半値幅（α）＞半値幅（β）である。

本発明で用いる「半値幅」とは、上記グラフにおいて、直行平面座標のｘ軸である光源入射角（°）に対して、ｙ軸である反射光量〔ＰＤ出力（Ｖ）〕をプロットしたものは下に凸の曲線を描き、上記半値幅とは、該反射光量の最大値と最小値との和を２で割った値（すなわち、半値）における凸状曲線のｘ軸方向の幅を意味する。

上記変動率が、上記数値範囲の上限値を超えると、ＳＰＦＳ用センサチップをアッセイ法に用いた場合に電場増強度が低下し、ＳＰＦＳシグナルが低減する虞がある。この変動率が０％に近づくにつれ、ＳＰＦＳ用センサチップは本発明の効果をより高いレベルで達成できるようになり、変動率が０％のＳＰＦＳ用センサチップが理想的な状態と言える。

なお、本明細書において、透明支持体と該金属薄膜とがこの順序で積層された基板を、単に「基板」といい、透明支持体と該金属薄膜と該ＳＡＭとがこの順序で積層された基板を、特に「センサ基板」といい、該センサ基板のＳＡＭ表面に該固相化層を形成したものを、特に「センサチップ用基板」という。「センサ基板」のＳＡＭ上に固相化層を積層することなく、ＳＡＭを介してリガンドを固定化したものもここでは「ＳＰＦＳ用センサチップ」といい、例えば、図３（Ａ）のＳＰＦＳ用センサチップが挙げられるが、本発明の「ＳＰＦＳセンサチップ」とは異なる。「センサチップ用基板」の固相化層にリガンドを固定化したものが、本発明の「ＳＰＦＳ用センサチップ」に相当する。

本発明のＳＰＦＳ用センサチップの好ましい一態様を図１および図３（Ｃ）に示す。図１および図３（Ｃ）に示すように、３次元構造を有する固相化層を形成するカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕１本１本がそれぞれ垂直に近い状態でセンサ基板に固定化されていても、１本のデキストランが複数箇所でセンサ基板に固定化されていてもよく、本発明はいずれの態様にも限定されるものではない。

（透明支持体）
本発明において、ＳＰＦＳ用センサチップの構造を支持する支持体として透明支持体が用いられる。本発明において、支持体として透明支持体を用いるのは、後述する金属薄膜への光照射をこの透明支持体を通じて行うからである。

本発明で用いられる透明支持体について、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はない。例えば、この透明支持体はガラス製であってもよく、また、ポリカーボネート〔ＰＣ〕，シクロオレフィンポリマー〔ＣＯＰ〕などのプラスチック製であってもよい。

また、透明支持体は、ｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎ_d〕が好ましくは１．４０〜２．２０であり、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍである。透明支持体の大きさ（縦×横）は特に限定されない。

なお、ガラス製の透明支持体は、市販品として、ショット日本（株）製の「ＢＫ７」（屈折率〔ｎ_d〕１．５２）および「ＬａＳＦＮ９」（屈折率〔ｎ_d〕１．８５），（株）住田光学ガラス製の「Ｋ−ＰＳＦｎ３」（屈折率〔ｎ_d〕１．８４），「Ｋ−ＬａＳＦｎ１７」（屈折率〔ｎ_d〕１．８８）および「Ｋ−ＬａＳＦｎ２２」（屈折率〔ｎ_d〕１．９０），ならびに（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ１０」（屈折率〔ｎ_d〕１．７２）などが、光学的特性と洗浄性との観点から好ましい。

透明支持体は、その表面に金属薄膜を形成する前に、その表面を酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。

酸による洗浄処理としては、０．００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間浸漬することが好ましい。

プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ２００」）中に、０．１〜３０分間浸漬させる方法が挙げられる。

（金属薄膜）
本発明に係るＳＰＦＳ用センサチップでは、上記透明支持体の一方の表面に金属薄膜を形成する。この金属薄膜は、光源からの照射光により表面プラズモン励起を生じ、電場を発生させ、蛍光色素の発光をもたらす役割を有する。

上記透明支持体の一方の表面に形成された金属薄膜としては、金，銀，アルミニウム，銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。

なお、透明支持体としてガラス製基板を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム，ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。

透明支持体上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法等），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および／または金属薄膜を形成することが好ましい。

金属薄膜の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ，銀：５〜５００ｎｍ，アルミニウム：５〜５００ｎｍ，銅：５〜５００ｎｍ，白金：５〜５００ｎｍ，およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜２０ｎｍが好ましい。

電場増強効果の観点から、金：２０〜７０ｎｍ，銀：２０〜７０ｎｍ，アルミニウム：１０〜５０ｎｍ，銅：２０〜７０ｎｍ，白金：２０〜７０ｎｍおよびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロムの薄膜の厚さとしては、１〜３ｎｍがより好ましい。

金属薄膜の厚さが上記範囲内であると、表面プラズモンが発生し易いので好適である。また、金属薄膜の大きさ（縦×横）は特に限定されない。

（ＳＡＭ）
ＳＡＭ〔Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；自己組織化単分子膜〕は、上記固相化層を固定化する足場として、またＳＰＦＳ用センサチップをアッセイ法に用いた場合に蛍光分子の金属消光を防止する目的で、上記金属薄膜の、上記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成される。

ＳＡＭを構成する単分子としては、通常、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（例えば、（株）同仁化学研究所、シグマ アルドリッチ ジャパン（株）などから入手可能）、特に好ましくは１０−カルボキシ−１−デカンチオールが用いられる。炭素原子数４〜２０のカルボキシアルカンチオールは、それを用いて形成されたＳＡＭの光学的な影響が少ない、すなわち透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いなどの性質を有していることから好適である。

このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。具体例として、金属薄膜がその表面に形成された透明支持体を、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）を含むエタノール溶液に浸漬する方法などが挙げられる。このように、１０−カルボキシ−１−デカンチオールが有するチオール基が、金属と結合し固定化され、金薄薄膜の表面上で自己組織化し、ＳＡＭを形成する。

また、ＳＡＭを形成する前に「誘電体からなるスペーサ層」を形成してもよく、この場合、ＳＡＭを構成する単分子としては、加水分解でシラノール基〔Ｓｉ-ＯＨ〕を与えるエトキシ基（またはメトキシ基）を有し、他端にアミノ基やグリシジル基、カルボキシル基などの反応基を有するシランカップリング剤を用いることが好ましい。

このようなＳＡＭの形成方法としては、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。

このような「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素〔ＳｉＯ₂〕，二酸化チタン〔ＴｉＯ₂〕または酸化アルミニウム〔Ａｌ₂Ｏ₃〕を含むことが好ましい。

誘電体からなるスペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強の効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。

誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法，電子線蒸着法，熱蒸着法，ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法，またはスピンコータによる塗布などが挙げられる。

（固相化層）
固相化層は、上記ＳＡＭの、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成され、３次元構造を有するものである。

この「３次元構造」とは、後述するリガンドの固定化を、「センサ基板」表面（およびその近傍）の２次元に限定することなく、該基板表面から遊離した３次元空間にまで広げられる固相化層の構造をいう。

このような固相化層は、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。

ＣＭＤの分子量は、１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下が好ましく、４ｋＤａ以上１，０００ｋＤａがより好ましい。

固相化層（例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの）は、その密度として２ｎｇ／ｍｍ²未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が上記ＳＡＭに、このような密度の範囲内で固相化されていると、ＳＰＦＳ用センサチップをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。なお、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製「Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５」の密度は２ｎｇ／ｍｍ²であった。この密度は、このＣＭ５基板および金膜のみの基板を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅライフサイエンス社製のＳＰＲ測定機器により得られた測定シグナルにおいて、平均２０００ＲＵを測定した結果、２ｎｇ／ｍｍ²と見積もられたものである。

固相化層の平均膜厚は、３ｎｍ以上８０ｎｍ以下であることが好ましい。この膜厚は原子間力顕微鏡〔ＡＦＭ〕などを用いて測定することができる。固相化層の平均膜厚がこのような範囲内であると、ＳＰＦＳ用センサチップをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。

固相化層の形成方法については、後述する＜ＳＰＦＳ用センサチップの製造方法＞の項目で詳述する。

（リガンド）
本発明では、リガンドは、上記固相化層の中および外面に固定化、すなわち固相化層の３次元構造の中に分散して固定化され、本発明のＳＰＦＳ用センサチップを本発明のアッセイ法に用いた際に、検体中のアナライトを固定（捕捉）させる目的で用いられるものである。

本明細書において、本発明のアッセイ法に用いる「リガンドと蛍光色素とのコンジュゲート」のリガンドと区別するために、本発明のＳＰＦＳ用センサチップで用いるリガンドを以下「第１のリガンド」とし、本発明のアッセイ法に用いるリガンドを以下「第２のリガンド」とする。なお、第１のリガンドと第２のリガンドは同じであっても異なっていてもよい。

本発明において、第１のリガンドとは、検体中に含有されるアナライトを特異的に認識し（または、認識され）結合し得る分子または分子断片をいう。このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等，またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

「タンパク質」としては、例えば、抗体などが挙げられ、具体的には、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（（株）日本医学臨床検査研究所などから入手可能），抗ガン胎児性抗原〔ＣＥＡ〕モノクローナル抗体，抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体，抗ＰＳＡモノクローナル抗体などが挙げられる。

なお、本発明において、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体，遺伝子組換えにより得られる抗体，および抗体断片を包含する。

この第１のリガンドの固定化方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕などの反応性官能基を有する高分子が有するカルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、このように活性エステル化したカルボキシル基と、第１のリガンドが有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；上記ＳＡＭが有するカルボキシル基を、上述のようにして第１のリガンドが有するアミノ基と脱水反応させ固定化させる方法などが挙げられる。

なお、後述する検体等がＳＰＦＳ用センサチップに非特異的に吸着することを防止するため、上記リガンドを固定化させた後に、ＳＰＦＳ用センサチップの表面を牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕等のブロッキング剤により処理することが好ましい。

上記固相化層の中および外面に固定化されたリガンドの密度は、１フェムトｍｏｌ／ｃｍ²以上１ナノｍｏｌ／ｃｍ²以下が好ましく、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ²以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ²以下がより好ましい。リガンドの密度が上記範囲内であると、図６に示すように、信号強度が大きくなるため好適である。

＜ＳＰＦＳ用センサチップの製造方法＞
本発明のＳＰＦＳ用センサチップの製造方法は、分子量１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下の上記高分子を０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下；Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．０１ｍＭ以上３００ｍＭ以下；水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を０．０１ｍＭ以上５００ｍＭ以下含む、ｐＨ４．０以上ｐＨ６．５以下のＭＥＳ緩衝生理食塩水（イオン強度：０．１ｍＭ以上３００ｍＭ以下）に、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成されたＳＡＭとを含むセンサ基板を０．２時間以上３．０時間以下浸漬する工程を少なくとも含むことを特徴とする。

上記高分子として例えばＣＭＤを用いる場合、膨大な実験により、ＣＭＤの分子量とＣＭＤの濃度と反応に用いる緩衝液（生理食塩水）の組成とを調整することで、ＣＭＤの膜厚やその密度などを任意に設定できることを本発明者らは見出した。また、ＣＭＤの固定化条件が変動すると、その後の抗体固定化条件が同一であったとしても、抗体固相密度や固相膜厚が変動することもわかっている。

換言すると、本発明者らは、抗体固相密度と固相膜厚との組み合わせを試行錯誤し、｛半値幅（α）−半値幅（β）｝／半値幅（β）×１００の式で表される変動率が０〜３０％を満たすこれらの組み合わせをすべて把握している。

ＳＰＦＳ測定は、センサ表面極近傍の高さ方向数百ｎｍに存在する不均一な局在電場と固相抗体に起因する免疫反応と、さらに抗体固相密度に起因する増強電場低下などの現象とが複雑に関与し、最終的な蛍光シグナルを出力する。そのため、シグナルの強度相関は膜厚や抗体固相密度などの一義的な各パラメータで決定されるものではなく、それぞれが複雑に関与していると思われる。

すなわち、この工程は、上記ＳＡＭの、上記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に３次元構造を有する固相化層を形成することによって「センサチップ用基板」を得る工程である。

透明支持体と金属薄膜とＳＡＭとがこの順序で積層された「センサ基板」を製造する工程、および該センサチップ用基板にリガンドを固定化することによって本発明のＳＰＦＳ用センサチップを得る工程は上述した通りである。

固相化層に含まれる高分子として、カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を用いた場合の、上記センサチップ用基板製造工程について具体的に説明する。なお、本発明の製造方法に係る該工程は、ＣＭＤに限定されない。

すなわち、好ましくは分子量１ｋＤａ以上５，０００ｋＤａ以下であり、上述したようなカルボキシメチルデキストランを０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下と、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．０１ｍＭ以上３００ｍＭ以下と、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を０．０１ｍＭ以上５００ｍＭ以下とを含むＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕に、透明支持体と金属薄膜とＳＡＭとがこの順序で積層された「センサ基板」を０．２時間以上３．０時間以下浸漬し、ＳＡＭにカルボキシメチルデキストランを固定化することができ、「センサチップ用基板」が得られる。

得られた固相化層の密度は、反応点数（ＳＡＭの官能基数），反応溶液のイオン強度およびｐＨ，ならびにカルボキシメチルデキストラン分子のカルボキシル基数に対するＷＳＣ濃度によって調整することができる。また固相化層の平均膜厚は、カルボキシメチルデキストランの分子量および反応時間によって調整することができる。

＜アッセイ法＞
本発明のアッセイ法は、少なくとも下記工程（ａ）〜（ｄ）、好ましくはさらに洗浄工程を含むことを特徴とする。

工程（ａ）：本発明のＳＰＦＳ用センサチップに、検体を接触させる工程。

工程（ｂ）：該工程（ａ）を経て得られたＳＰＦＳ用センサチップに、さらに、該ＳＰＦＳ用センサチップに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程。

工程（ｃ）：該工程（ｂ）を経て得られたＳＰＦＳ用センサチップに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程。

工程（ｄ）：該工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。

洗浄工程：上記工程（ａ）を経て得られたＳＰＦＳ用センサチップの表面および／または上記工程（ｂ）を経て得られたＳＰＦＳ用センサチップの表面を洗浄する工程。

［工程（ａ）］
工程（ａ）は、本発明のＳＰＦＳ用センサチップに、検体を接触させる工程である。

（検体）
「検体」としては、例えば、血液（血清・血漿），尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられ、所望の溶媒、緩衝液等に適宜希釈して用いてもよい。これら検体のうち、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液および唾液が好ましい。

（接触）
「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、ＳＰＦＳ用センサチップの第１のリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、ＳＰＦＳ用センサチップと検体とを接触させる態様が好ましい。なお、第１のリガンドに検体を接触させて、検体中のアナライトが第１のリガンドに捕捉されれば良く、必ずしも流路は設けなくてもよい。

「流路」とは、上述のとおり角筒状または丸筒（管）状のものであって、ＳＰＦＳ用センサチップを設置する個所近傍は角筒状構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は丸筒（管）状を有することが好ましい。

その材料としては、ＳＰＦＳ用センサチップ部または流路天板ではメチルメタクリレート，スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、薬液送達部ではシリコーンゴム，テフロン（登録商標），ポリエチレン，ポリプロピレン等のポリマーを用いることが好ましい。

ＳＰＦＳ用センサチップ部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、ＳＰＦＳ用センサチップ部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。

流路にＳＰＦＳ用センサチップを固定する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、ＳＰＦＳ用センサチップの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを該ＳＰＦＳ用センサチップの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとＳＰＦＳ用センサチップとをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい。

工業的に製造される大規模ロット（工場レベル）では、流路にＳＰＦＳ用センサチップを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品にセンサ基板を形成、または別途作製したセンサ基板を固定し、金属薄膜表面に（好ましくは誘電体からなるスペーサ層）ＳＡＭ，固相化層およびリガンドの固定化を行った後、流路天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。

「送液」としては、検体を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕，トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕，ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。

送液の温度および送液を循環させる循環時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。

送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。

送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。

［洗浄工程］
洗浄工程とは、上記工程（ａ）を経て得られたＳＰＦＳ用センサチップの表面および／または下記工程（ｂ）を経て得られたＳＰＦＳ用センサチップの表面を洗浄する工程である。

洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に、Ｔｗｅｅｎ２０，ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１０〜５００ｍＭ含有するものが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ ＨＣｌでｐＨが１．５〜４．０のものであってもよい。

洗浄液を循環させる温度および流速は、上記工程（ａ）の送液を循環させる温度および流速と同じであることが好ましい。

洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。

［工程（ｂ）］
工程（ｂ）とは、上記工程（ａ）、好ましくは上記洗浄工程を経て得られたＳＰＦＳ用センサチップに、さらに、該ＳＰＦＳ用センサチップに含まれるリガンド（第１のリガンド）とは同じであっても異なっていてもよいリガンド（第２のリガンド）と蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程である。

（蛍光色素）
「蛍光色素」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。

本発明で用いられる蛍光色素は、金属薄膜による吸光に起因する消光を受けない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルタを備えた分光蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。

このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製），ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製），クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製），シアニン・ファミリーの蛍光色素，インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素，オキサジン・ファミリーの蛍光色素，チアジン・ファミリーの蛍光色素，スクアライン・ファミリーの蛍光色素，キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製），ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素，ピレン・ファミリーの蛍光色素，トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。

これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。

また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、Ｅｕ，Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光色素となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ³⁺が挙げられる。

本発明においては、後述する蛍光量の測定を行う際に、金属薄膜に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属薄膜として金を用いる場合には、金薄膜による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。したがって、この場合には、Ｃｙ５，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属薄膜として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。

これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。

（第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲート）
「本発明のＳＰＦＳ用センサチップに含まれるリガンド（第１のリガンド）とは同じであっても異なっていてもよいリガンド（第２のリガンド）と蛍光色素とのコンジュゲート」は、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。

本発明のアッセイ法において、第２のリガンドは、アナライトに蛍光色素による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、上記第１のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンドとして用いる１次抗体がポリクローナル抗体である場合、第２のリガンドとして用いる２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。

さらに、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）と競合する第２のアナライト（競合抗原；ただし、標的抗原とは異なるものである。）と２次抗体とがあらかじめ結合した複合体を用いる態様も好ましい。このような態様は、蛍光信号（蛍光シグナル）量と標的抗原量とを比例させることができるため好適である。

第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの作製方法としては、第２のリガンドとして２次抗体を用いる場合、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。

このように作製された第２のリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートの送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。

送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。

［工程（ｃ）］
工程（ｃ）とは、上記工程（ｂ）を経て得られたＳＰＦＳ用センサチップに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、必要に応じてプリズム等を経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。

（光学系）
本発明のアッセイ法で用いる光源は、金属薄膜にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。

レーザ光の照射により、全反射減衰条件〔ＡＴＲ〕において、金属薄膜の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、透明支持体の屈折率、金属薄膜の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金では約１０〜２０倍の増加量となる。

蛍光色素は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。

「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ，０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤ；波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。），０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。

「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、ＳＰＦＳ用センサチップに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明支持体と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。このようなプリズムの市販品としては、上述した「ガラス製の透明支持体」の市販品と同様のものが挙げられる。

「光学フィルタ」としては、例えば、減光〔ＮＤ〕フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光〔ＮＤ〕フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。

「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。

「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、ＳＰＦＳ用センサチップ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズ，および蛍光色素の自家蛍光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。

「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。

「ＳＰＦＳ検出部」としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適である。

［工程（ｄ）］
工程（ｄ）とは、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程である。

より具体的には、工程（ｄ）は、既知濃度の標的抗原もしくは標的抗体での測定を実施することで検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中のアナライト（標的抗原量もしくは標的抗体）量を測定シグナルから算出する工程である。

（アナライト）
「アナライト」としては、第１のリガンドに特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片であって、このような「分子」または「分子断片」としては、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等，またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド，オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ〔αフェトプロテイン〕などのがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。

（アッセイシグナル変化量）
さらに、工程（ｄ）は、上記工程（ｂ）の前に測定したシグナルを"ブランクシグナル"、としたとき、下記式で表されるアッセイシグナル変化量を算出することができる。

シグナル変化量＝｜（アッセイ蛍光シグナル）−（ブランク蛍光シグナル）｜
＜アッセイ用装置＞
本発明のアッセイ用装置は、少なくとも、上述のＳＰＦＳ用センサチップを含み、上記アッセイ法に用いられることを特徴とする。

このような装置としては、上記ＳＰＦＳ用センサチップ以外に、例えば、レーザ光の光源，各種光学フィルタ，プリズム，カットフィルタ，集光レンズ，表面プラズモン励起増強蛍光〔ＳＰＦＳ〕検出部なども含むものとし、検体液，洗浄液または標識抗体液などを取り扱う際に、ＳＰＦＳ用センサチップと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、例えば、送液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。

また、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード，ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰〔ＡＴＲ〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。），ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。

光源，光学フィルタ，カットフィルタ，集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。

「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ，送り精度が高く脈動が少ないが循環することができないシリンジポンプ，簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。

＜アッセイ用キット＞
本発明のアッセイ用キットは、透明支持体と；該支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と；該薄膜の、該支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と；該ＳＡＭの、該薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された、３次元構造を有する固相化層とからなり、上述のＳＰＦＳ用センサチップに用いられるセンサチップ用基板を、少なくとも含むことを特徴とし、上述のアッセイ法を実施するにあたり、抗原などのアナライト，検体および２次抗体以外に必要とされるすべてのものを含むことが好ましい。

また、本発明のアッセイ用キットは、該ＳＰＦＳ用センサチップ用基板の該固相化層に１次抗体が予め固定化されていてもよい。

本発明のアッセイ用キットと、検体として、例えば、血液，血漿または血清と、特定の腫瘍マーカーに対する抗体とを用いることによって、特定の腫瘍マーカーの含有量を、高感度かつ高精度で検出することができる。この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。

このようなアッセイ用キットとしては、ＳＰＦＳ用センサチップ用基板以外に、例えば、抗体を固相化層に固定化するために用いる水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕；蛍光色素；検体を溶解または希釈するための溶解液または希釈液；ＳＰＦＳ用センサチップと検体とを反応させるための各種反応試薬および洗浄試薬などが挙げられ、本発明のアッセイ法を実施するために必要とされる各種器材または資材や上記「アッセイ用装置」を含めることもできる。

さらに、キット要素として、検量線作成用の標準物質、説明書、多数検体の同時処理ができるマイクロタイタープレートなどの必要な器材一式などを含んでもよい。

次に、本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

［作製例１］（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体の作製）
２次抗体として、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕モノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５ｍｇ／ｍＬ，（株）日本医学臨床検査研究所製）を、市販のビオチン化キット（（株）同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した。手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。

次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液とストレプトアビジン標識Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）溶液とを混合し、４℃で６０分間、攪拌混合することで反応させた。

最後に、未反応抗体および未反応酵素を、分子量カットフィルタ（日本ミリポア（株）製）を用いて精製することで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。

［作製例２］（基板の作製）
屈折率〔ｎ_d〕１．７２，厚さ１ｍｍのガラス製の透明支持体（（株）オハラ製の「Ｓ−ＬＡＬ １０」）をプラズマ洗浄し、該支持体の片面にクロム薄膜をスパッタリング法により形成した後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法により形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４２〜４７ｎｍであった。

以下、この基板を用いて測定した半値幅を半値幅（β）とし、その値は７．６°であった。

［実施例１］
（ＳＰＦＳ用センサチップ（Ｃ）の製造）
作製例２で得られた基板を、１ｍＭに調製した１０−アミノ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金薄膜の片面にＳＡＭを形成した。このセンサ基板を、該エタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールでそれぞれ洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。

続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を１ｍｇ／ｍＬと、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１ｍＭとを含むｐＨ７．４のＭＥＳ緩衝生理食塩水〔ＭＥＳ〕（イオン強度：１０ｍＭ）にＳＡＭを形成したセンサ基板を１時間浸漬し、ＳＡＭにＣＭＤを固定化し、１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。

続いて、ＮＨＳを５０ｍＭと、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＭＥＳに１時間浸漬させた後に、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５；２．５μｇ／ｍＬ，（株）日本医学臨床検査研究所製）溶液に３０分間浸漬することで、ＣＭＤに１次抗体を固相化した。

さらに、１重量％の牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳにて３０分間循環送液することで、非特異的吸着防止処理を行った。半値幅（α）は、８．６°であった。半値幅の変動率は、１３％であった。この変動率は、作製例２で得られた基板の半値幅を半値幅（β）として算出したものである。

（アッセイ法の実施）
上述のように製造したＳＰＦＳ用センサチップ（Ｃ）を用いて、以下のアッセイ法を実施した。

まず、抗体を固相化したＳＰＦＳ用センサチップ上に、流路高さ０．５ｍｍを有し、かつ適当な形状および大きさを有する穴のあいたポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートを設け、さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは送液に触れない状態にある）。このＰＤＭＳ製シートおよび該シリコーンゴム製スペーサの上に、送液導入用の穴および送液排出用の穴を予めそれぞれ形成してあるＰＭＭＡ基板を、ＰＤＭＳ製シートで囲まれた領域の内側にこれらの穴が位置するように配置した（このとき、抗体を固相化した表面が流路の内側となるように、ＰＭＭＡ基板が配置されている）。これらを流路の外側から圧着し、ビスでＰＭＭＡ基板と流路シート（すなわち、前記ＰＤＭＳ製シート）とＳＰＦＳ用センサチップ（Ｃ）とを固定した。

工程（ａ）として、上述のようにして得られたＳＰＦＳ用センサチップ（Ｃ）に標的抗原としてＡＦＰを０．１ｎｇ／ｍＬ、０．１ｍＬＰＢＳ溶液を２５分間循環させた。

工程（ｂ）として、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むトリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕を送液として１０分間循環させることによって洗浄した後、作製例１で得られたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識２次抗体（２μｇ／ｍＬとなるように調製したＰＢＳ溶液）を０．１ｍＬを５分間循環させた。

工程（ｃ）として、まず、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５重量％含むＴＢＳを送液として１０分間循環させることによって洗浄した。プラズモン励起センサに、ガラス製の透明支持体の、金薄膜を形成していないもう一方の表面から、プリズム（シグマ光機（株）製）を経由してレーザ光（６４０ｎｍ，４０μＷ）を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を光電子増倍管〔ＰＭＴ〕で検出した光量（シグナル値）を計測し「アッセイシグナル」とした。

得られた結果を表２に示す。

なお、工程（ｄ）としては、工程（ｃ）で得られた蛍光量の測定結果から、検体中に含有されるアナライト量の算出を行った。

［実施例２］
実施例１において、分子量５０万のＣＭＤの代わりに分子量１５万のＣＭＤを用いた以外は実施例１と同様にしてＳＰＦＳ用センサチップ（Ｄ）を製造した。このＳＰＦＳ用センサチップ（Ｄ）は半値幅（α）が７．９°であったことから、半値幅の変動率は４％であった。ＳＰＦＳ用センサチップ（Ｄ）を用いて、実施例１と同様にしてアッセイ法を実施し、得られた結果を表２に示す。

［実施例３］
実施例１において、分子量５０万のＣＭＤの濃度１ｍｇ／ｍＬを１０ｍｇ／ｍＬに変更し、ＮＨＳの濃度０．５ｍＭを１００ｍＭに変更し、ＷＳＣの濃度１ｍＭを１００ｍＭに変更し、ＭＥＳ（イオン強度：１０ｍＭ）のｐＨ７．４をｐＨ６．０（イオン強度：１０ｍＭ）に変更した以外は実施例１と同様にしてＳＰＦＳ用センサチップ（Ｅ）を製造した。このＳＰＦＳ用センサチップ（Ｅ）は半値幅（α）が８．８°であったことから、半値幅の変動率は２９％であった。ＳＰＦＳ用センサチップ（Ｅ）を用いて、実施例１と同様にしてアッセイ法を実施し、得られた結果を表２に示す。

［比較例１］
（ＳＰＦＳ用センサチップ（Ａ）の製造）
実施例１において、ＳＡＭを形成する際、１０−アミノ−１−デカンチオールの代わりに１０−カルボキシ−１−デカンチオールを用い、かつＣＭＤによる固相化層を形成せずにＳＡＭに直接抗体を固定化した以外は実施例１と同様にしてＳＰＦＳ用センサチップ（Ａ）を製造した。半値幅は７．７°であったことから、半値幅の変動率は、１．３％であった。

なお、このように製造したＳＰＳＦ用センサチップを用いて得られた半値幅は、厳密には半値幅（α）とは言えないものであるが、表２中では、該半値幅を便宜的に半値幅（α）とした。

（アッセイ法の実施）
実施例１において、実施例１で製造したＳＰＦＳ用センサチップ（Ｃ）の代わりに、上述のように製造したＳＰＦＳ用センサチップ（Ａ）を用いて、実施例１と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表２に示す。

［比較例２］
（ＳＰＦＳ用センサチップ（Ｂ）の製造）
実施例１において、１ｍｇ／ｍＬのＣＭＤを１００ｍｇ／ｍＬに、０．５ｍＭのＮＨＳを１００ｍＭに、１ｍＭのＷＳＣを１００ｍＭに、ｐＨ７．４のＭＥＳ（イオン強度：１０ｍＭ）をｐＨ６．０（イオン強度：１５０ｍＭ）に変更した以外は実施例１と同様にしてＳＰＦＳ用センサチップ（Ｂ）を製造した。半値幅（α）が１３．６°であったことから、半値幅の変動率は、７９％であった。

（アッセイ法の実施）
実施例１において、実施例１で製造したＳＰＦＳ用センサチップ（Ｃ）の代わりに、上述のように製造したＳＰＦＳ用センサチップ（Ｂ）を用いて、実施例１と同様にしてアッセイ法を実施した。得られた結果を表２に示す。

［考察］
表２から、実施例１（変動率：１３％）、実施例２（変動率：４％）および実施例３（変動率：２９％）で得られたアッセイシグナルは、比較例１（変動率：１．３％）および比較例２（変動率：７９％）で得られたものより有意に大きく、さらに実施例１〜３の変動係数〔ＣＶ〕、すなわちバラツキは、比較例２のＣＶより有意に低く、比較例１のＣＶとほぼ同等であることがわかった。

すなわち、実施例１〜３のＳＰＦＳ用センサチップは、比較例２と同様にデキストラン層を用いているにも関わらず、アッセイシグナルのムラが出ず（すなわち、安定化し）、かつ顕著に増加している。よって、本発明のＳＰＦＳ用センサチップは、検出の安定性向上および高感度化が達成できる。

本発明のＳＰＦＳ用センサチップを用いたアッセイ法は、高感度かつ高精度に検出することができる方法であるから、例えば、血液中に含まれる極微量の腫瘍マーカーであっても検出することができ、この結果から、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができる。

１・・・・・・透明支持体
１’・・・・・透明プレート
２・・・・・・金属薄膜
２’・・・・・金属フィルム
３・・・・・・ＳＡＭ
４・・・・・・カルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕
４’・・・・・デキストラン層
５・・・・・・リガンド（抗体）
６・・・・・・アナライト（抗原）
７・・・・・・蛍光標識抗体
８・・・・・・蛍光色素
９・・・・・・固相化層
１１・・・・・・誘導体ブロック
１２・・・・・・金属膜
１３・・・・・・その表面がヒドロゲルで被覆されている疎水性高分子化合物
１０・・・・・・ＳＰＦＳ用センサチップ
１００・・・・・・センサ・ユニット
２００・・・・・・測定チップ

Claims (10)

1. 透明支持体と、
   前記透明支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、
   前記金属薄膜の、前記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と、
   前記ＳＡＭの、前記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された、３次元構造を有する固相化層と、
   前記固相化層に固定化されたリガンドとを含む表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ〕用センサチップであって；
   前記透明支持体の、前記金属薄膜とは接していない一方の表面から所定の角度で入射した光に対して、前記透明支持体の他方の表面側にある光量検出器で測定した反射光量を、該角度に対してプロットしたグラフから得られる半値幅（α）に対する、
   前記ＳＰＦＳ用センサチップから前記ＳＡＭと前記固相化層と前記リガンドとを除いた、前記透明支持体と、前記透明支持体の一方の表面に形成された前記金属薄膜とを含む基板の半値幅（β）の、下記式：
   ｛半値幅（α）−半値幅（β）｝／半値幅（β）×１００
   で表される変動率が、０％以上３０％以下であることを特徴とするＳＰＦＳ用センサチップ。
2. 上記固相化層が、
   グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびに
   ビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含む請求項１に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
3. 上記固相化層は、その密度が２ｎｇ／ｍｍ²未満である請求項１または２に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
4. 上記固相化層は、その平均膜厚が、３ｎｍ以上８０ｎｍ以下である請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
5. 上記固相化層に固定化された上記リガンドの密度が、１０フェムトｍｏｌ／ｃｍ²以上１００ピコｍｏｌ／ｃｍ²以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載のＳＰＦＳ用センサチップ。
6. 少なくとも、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とするアッセイ法；
   工程（ａ）：請求項１〜５のいずれか一項に記載のＳＰＦＳ用センサチップに、検体を接触させる工程、
   工程（ｂ）：前記工程（ａ）を経たＳＰＦＳ用センサチップに、さらに、前記ＳＰＦＳ用センサチップに含まれるリガンドとは同じであっても異なっていてもよいリガンドと蛍光色素とのコンジュゲートを反応させる工程、
   工程（ｃ）：前記工程（ｂ）を経たＳＰＦＳ用センサチップに、上記透明支持体の、上記金属薄膜を形成していないもう一方の表面から、レーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程、および
   工程（ｄ）：前記工程（ｃ）で得られた測定結果から、検体中に含有されるアナライト量を算出する工程。
7. 上記アナライトに、上記コンジュゲートが結合する請求項６に記載のアッセイ法。
8. 上記アナライトが、腫瘍マーカーまたはがん胎児性抗原である請求項６または７に記載のアッセイ法。
9. 請求項１〜５のいずれか一項に記載のＳＰＦＳ用センサチップを用い、請求項６〜８のいずれか一項に記載のアッセイ法に用いられることを特徴とするアッセイ用装置。
10. 透明支持体と、
    前記透明支持体の一方の表面に形成された金属薄膜と、
    前記金属薄膜の、前記透明支持体とは接していないもう一方の表面に形成された自己組織化単分子膜〔ＳＡＭ〕と、
    前記ＳＡＭの、前記金属薄膜とは接していないもう一方の表面に形成された、３次元構造を有する固相化層とからなり、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＳＰＦＳ用センサチップに用いられるセンサチップ用基板を、少なくとも含むことを特徴とするアッセイ用キット。