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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft das technische Gebiet der Nanobiologie und der
synthetischen Biologie. Insbesondere betrifft sie die Herstellung
einer flexiblen, programmierbaren biologischen Oberfläche durch
Zwei-Komponentensysteme aus Bakterien für die biochemische
Analytik, die Chipherstellung und ein Screeningverfahren im großen
Maßstab (large scale screening).
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Patentschriften bzw. Patentanmeldungen
GB 2 360 788 ,
EP 0 543 407 und
DE 43 010 87 beschreiben Bakterien,
die als Komponenten für Biosensoren verwendet wurden. Es
wurden Bakterien der Familien Aeromonas, Pseudomonas, Serratia u. a.
an die Membran einer Elektrode gekoppelt und zur Abschätzung
des biochemischen Sauerstoffbedarfs benutzt.
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Um
ein Bakterium und dessen Oberfläche derart zu modifizieren,
dass es in einem Biosensor verwendet werden kann, haben die Erfinder
des
US-Patents 6,274,345 das äußere
Membranprotein C (outer membrane Protein C – OmpC) des
Bakteriums Escherichia coli verwendet, um fremde Proteine mit Hilfe
von OmpC als ein Ankermotiv in der Zelloberfläche des Bakteriums
zu exprimieren. Außerdem wurden Antigene und weitere Proteine
mit ähnlichen Ansätzen hergestellt und in Planaren
Doppelschichten (bilayers) getestet (
Holden et al., 2006).
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Eine
Möglichkeit, die Eigenschaften eines Bakteriums in eine
dünne Schicht zu integrieren, beschreibt das Patent
GB 2 373 513 . Durch die
Immobilisierung von lumineszierenden Bakterien in einer Polyvinylalkohol
Dünnschicht können schädliche Chemikalien
und industrielle Gefahrenstoffe in der Umwelt detektiert werden.
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Die
japanischen Patentschrift
JP
8 211 011 offenbart, dass als adäquater Reiz für
ein bakterielles Biosensorsystem auch die Anwesenheit von Cyanid (CN)
verwendet werden kann. In Bakterien der Gattung Pseudomonas fluorescens,
die auf Nitrozellulose immobilisiert sind, wird Cyanid gespalten,
was zur Erniedrigung des freien Sauerstoffgehalts in einer Standardlösung
führt und das elektronische Ausgangssignal (output signal)
moduliert.
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Die
internationale Patentanmeldung
WO 03/018777 verwendet
bereits die Lichtsensitivität von Phytochromen und beschreibt
ein System zur Aktivierung von Promotoren in Bakterien. Die Aktivierung erfolgt
durch die Bindung eines an das Phytochrom gebundenen Proteins, das
gezielt an eine DNA-bindende Domäne des zu aktivierenden
Gens bindet.
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Es
wurde außerdem beschrieben, dass Bacteriophytochrome die
Photosynthese in Bakterien wie Bradyrhizobium sp. und Rhodopseudomonas
palustris durch einen Reaktionsweg über direkte Protein-Protein-Bindungen,
nicht aber durch eine Phosphorylierungskaskade regulieren (Giraud
et al., 2002). Daneben wurden weitere Licht induzierbare Promotorsysteme
beschrieben (Bhoo et al., 2001; Levskoja
et al., 2005).
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Dieser
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine biologische Oberfläche,
die vorzugsweise von einem Bakterium abgeleitet ist, derart zu verändern bzw.
neu herzustellen, dass die von der bakteriellen Zelle synthetisierten
Moleküle gesteuert und kontrolliert aufgebracht werden
können. Im Rahmen der Erfindung wird eine solche biologische
Oberfläche auch als programmierbare Oberfläche
bezeichnet. Die programmierbare Oberfläche kann anschließend technisch
verwendet werden kann, beispielsweise in der Oberflächenbeschichtung
oder der Signalverarbeitung. Eine weitere Verwendung liegt insbesondere in
der Nanobiotechnologie, etwa zur Herstellung einer flexiblen, programmierbaren
biologischen Oberfläche für die Chipherstellung,
für ein Screeningverfahren im großen Maßstab
(lar ge scale screening), für biochemische Laborassays und
für miniaturisierte biochemische Fabrikationsprozesse.
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Aus
dem Stand der Technik sind zwar zahlreiche unterschiedliche Biosensorsysteme
bekannt. Außerdem wurden Bakterien verwendet, um verschiedene
Proteine im großen Maßstab herzustellen. Schließlich
wurden auch Versuche zur Herstellung von Oberflächenbeschichtungen
durch Bakterien beschrieben, die beispielsweise auf Oberflächenschicht-Membranen
(surface-(S)-layer) beruhen.
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Ein
wesentlicher Nachteil der Verfahren des Standes der Technik liegt
aber darin, dass eine Oberflächenbeschichtung nicht oder
nur sehr aufwändig und umständlich programmiert
werden kann. Ferner wird die erstellte Oberfläche nicht
aktiv von den Bakterien abgetrennt, und die Oberflächenmoleküle
geben auch kein bakterielles Signal an das technische System zurück.
Es wurden zwar bereits Vorversuche zu Licht programmierbaren Zwei-Komponentensystemen
in Bakterien beschrieben (Levskoje et al., 2005).
Diese sind aber wenig flexibel und können daher nicht für
die oben beschriebenen, gewünschten Anwendungen verwendet
werden. Als Hilfsmittel werden deshalb technisch aufwändige äußere
Masken verwendet, über die Licht schichtweise auf die Oberfläche
einer ursprünglich bakteriell hergestellten Oberflächenmembran
(surface-(S)-Membran) aufgebracht wird. Ebenso wird nach dem Stand
der Technik durch weitere aufwändige technische Schritte
die Güte der Oberfläche einer Membran beurteilt.
Eine anschließende maschinelle Bearbeitung findet zudem
in mehreren Fertigungsschritten statt.
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Ziel
der Erfindung ist es deshalb die verwendeten Bakterien aktiv, über
neue Zwei-Komponentensysteme, die mit der bakteriellen Zellmembran
in Verbindung stehen, über verschiedene elektromagnetische
Wellen zu programmieren, was die Nutzungsmöglichkeiten
dieser Zwei-Komponentensysteme wesentlich erhöht. So werden
auch die Schritte der Oberflächenanordnung, Qualitätsüberprüfung,
Oberflächenabtrennung und Signalverarbeitung wesentlich
verbessert.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Bakterium mit einem
Zwei-Komponentensystem, wobei ein äußeres Signal
(3) auf die bakterielle Zellmembran trifft, das äußere
Signal (3) durch eine erste Komponente (1) des
Zwei-Komponentensystems innerhalb des Bakteriums empfangen wird,
das Empfangen des äußeren Signals (3)
eine Veränderung einer zweiten Komponente (2)
des Zwei-Komponentensystems bewirkt, die zweite Komponente (2)
in dem Bakterium eine Veränderung im Proteom und/oder Transkriptom
(4) bewirkt, die Veränderung (4) die
bakterielle Zellmembran verändert, und die Veränderung
der bakteriellen Zellmembran in einem Medium außerhalb
des Bakteriums gespeichert wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein modifiziertes Bakterium
mit einem Zwei-Komponentensystem, wobei ein äußeres
Signal (3) durch eine erste Komponente (1) des Zwei-Komponentensystems
empfangen wird. Das Empfangen und Weitergeben des Signals an eine zweite
Komponente (2) wird systematisch, wie in der Erfindung
offenbart, verbessert. Dies geschieht insbesondere, um über
Veränderungen von Proteom und Transkriptom (4)
nach der Signalweitergabe die Eigenschaften des artifiziellen Bakteriums
zu verändern, insbesondere die Membraneigenschaften. Dies erlaubt
eine vielseitige Verwendung des modifizierten Bakteriums mit seinen
veränderten Eigenschaften, insbesondere zur Erzielung einer
programmierbaren bakteriellen Zellmembran, zur Nutzung in der Nanotechnologie,
zur Herstellung von Chips, für Screening- und Analyseverfahren,
in der Informationsverarbeitung, für biomedizinische Anwendungen.
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Ein
weiterer Gegenstand ist die Verwendung des erfindungsgemäßen
Bakteriums in der Nanotechnologie, synthetischen Biologie, zur Herstellung von
Chips, für Screeningverfahren und/oder für biochemische
Assays.
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Ferner
betrifft die vorliegende Erfindung eine programmierbare, bakterielle
Zellmembran, die aus einem erfindungsgemäßen Bakterium
durch Isolieren der Zellmembran von dem Bakterium herstellbar ist.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1 zeigt
ein erfindungsgemäßes Bakterium mit einem Zwei-Komponentensystem,
das zum Programmieren von bakteriellen Membranen verwendet wird.
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2 zeigt
eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Bakteriums.
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3 zeigt
verschiedene bakterielle Konstrukte, die durch das erfindungsgemäße
Zwei-Komponentensystem gezielt verwendet oder verändert werden.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein modifiziertes
Bakterium mit einem Zwei-Komponentensystem, wobei ein äußeres
Signal (3) auf die bakterielle Zellmembran trifft, das äußere
Signal (3) durch eine erste Komponente (1) des
Zwei-Komponentensystems innerhalb des Bakteriums empfangen wird,
das Empfangen des äußeren Signals (3) eine
Veränderung einer zweiten Komponente (2) des Zwei-Komponentensystems
bewirkt, die zweite Komponente (2) in dem Bakterium eine
Veränderung im Proteom und/oder Transkriptom (4)
bewirkt, die Veränderung (4) die bakterielle Zellmembran
verändert, und die Veränderung der bakteriellen
Zellmembran in einem Medium außerhalb des Bakteriums gespeichert
wird.
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Eine
bakterielle programmierbare Membranoberfläche durch Nutzung
neuer Zwei-Komponentensysteme wird als vielseitig verwendbares neues
Werkzeug für die Nutzung in der Nanobiotechnologie und
für die Nutzung in der synthetischen Biologie beschrieben,
etwa für die Chipherstellung, für large-scale
Screeningverfah ren, für biochemische Laborassays und weitere
miniaturisierte biochemische Fabrikationsprozesse.
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Eine
bakterielle Membranoberfläche wird durch Nutzung und gezielte
Veränderung von bakteriellen Zwei-Komponentensystem Signalkaskaden programmiert.
Erzielt wird dies durch (i) spezifische Chimären der Kinasenkomponente,
(ii) gezieltes Design aller beteiligten Komponenten der Zwei-Komponentensystem
Signalkaskade. Zur Herstellung verwendete Bakterien können
aktiv, über neue Zwei-Komponentensysteme an der Membran über verschiedene
elektromagnetische Wellen programmiert werden. So werden auch die
Oberflächenanordnung, Qualitätsüberprüfung,
Oberflächenabtrennung und Signalverarbeitung der programmierten Membran
verbessert.
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Außerdem
wird durch diese Erfindung jeweils systematisch verbessert:
- (i) Eingabe über neue Zwei-Komponentensysteme
und deren weitere Optimierung über Screeningverfahren
- (ii) Programmierung von Ein- und Ausgabe-Eigenschaften der Membran
- (iii) Ausgabe und Rückkoppelung der Eingabe mit und
in ein technisches System
- (iv) Membranstrukturierung.
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Das
modifizierte Bakterium wird erzielt durch die Nutzung und gezielte
Veränderung von bakteriellen Zwei-Komponentensystem-Signalkaskaden. Dies
wird erreicht durch (i) spezifische Chimären der Kinasenkomponente
oder (ii) gezieltes, wie hier offenbartes Design verschiedener beteiligter
Komponenten der Zwei-Komponentensystem-Signalkaskade.
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Umfasst
sind außerdem die Nutzung bakterieller programmierbarer
Membranoberflächen sowie die Steuerung anderer Prozesse,
wobei sich die Nutzung dieser neuen Zwei-Komponentensysteme als vielseitig
verwendbare neue Werkzeuge für die Nutzung in der Nanobiotechnologie
und für die Nutzung in der synthetischen Biologie, in der
Nutzung für die Chipherstellung, für lange-scale
Screening verfahren, für biochemische Laborassays und weitere
biochemische Fabrikationsprozesse und deren Miniaturisierung eignen.
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Dabei
können die verwendeten Bakterien aktiv, über neue
Zwei-Komponentensysteme an der Membran auch über verschiedene
elektromagnetische Wellen programmiert werden. Diese erzielte neue
Anwendung ist ebenso umfasst wie die durch die Zwei-Komponentensysteme
erzielte verbesserte Oberflächenanordnung, Qualitätsüberprüfung,
Oberflächenabtrennung und Signalverarbeitung der programmierten
Membran und die erzielten neuen Eigenschaften der Membran, nämlich
(i) die Eingabe über die genannten neuen Zwei-Komponentensysteme
und deren weitere Optimierung, insbesondere der Empfindlichkeit
auch der Chromophore, Kinasenkomponenten und anderen beteiligten
Komponenten des Zwei-Komponentensystems für eingehende
Signale, auch bezüglich verschiedener Wellenlängen, und
auch über die hier offenbarten Screeningverfahren; (ii)
die Programmierung von Ein- und Ausgabe-Eigenschaften der oben bezeichneten
Membran; (iii) die Ausgabe und Rückkoppelung der Eingabe
in die bakterielle Membran mit und in technische Systeme sowie (iv)
die ermöglichte Membranfeinstrukturierung.
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In
einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein
modifiziertes Bakterium, wobei die erste (1) und/oder die
zweite (2) Komponente Bestandteile von Kinasen, DNA-bindenden
Domänen und/oder Protein-bindenden Domänen aufweisen.
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In
einer weiteren Ausführungsform ist die erste Komponente
(1) des Zwei-Komponentensystems eine Kinase, ein Kanalprotein
und/oder ein Transmembranprotein. Besonders bevorzugt ist ein neues
lichtempfindliches Kinasensystem. Bekannt sind hierbei lichtempfindliche
Kinasesysteme, welche die lichtempfindliche natürliche
Komponenten von beispielsweise Synecocystis sp. verwenden.
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Ein
Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Erzielung von
neuen Sensorkinasen indem neue Chimären der Kinasekomponente
auf von außen zugeführte elektromagnetische Wellen,
wie beispielsweise Licht, UV und/oder Radiowellen ansprechen. Umfasst
ist auch ein Screeningverfahren, um ein optimiertes Chromophor zu
erzielen. Der Erfinder stellt zusätzlich eine effizientere
neu konstruierte Kinasenchimäre bereit, die das Sensorsystem
von Deinococcus radiodurans bzw. Proteine, die hierzu sequenz- oder
zumindest funktionshomolog sind, vorteilhaft nutzt und mit anderen
Proteindomänen aus beispielsweise E. coli kombiniert.
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Eine
vorteilhafte Verwendung ist die Korrektur der Programmierung der
Bakterienoberfläche durch technische Systeme, weil beispielsweise
ein technischer Lichtreiz eine Kinase erregt, das in der Kombination
zum korrekten Speichern eines Textes in der programmierbaren Membran
führt. Eine Verwendung zum elektronischen Einlesen eines
Textes, wofür lichtempfindliche Fotodioden bei einem technischen
Datenträger bzw. Leuchtdioden für die Umprogrammierung
der Bakterienoberfläche durch Lichtsignale genutzt werden
können, ist möglich.
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Andere
Möglichkeiten der Rückkoppelung mit einem technischen
System sind die gezielte Expression von Kanalproteinen oder von
Proteinen, die elektromagnetische Wellen emittieren für
andere Wellenlängen, als Alternative zu dem grün
fluoreszierenden Protein (GFP), die nicht Fluoreszenslicht, sondern
Radiowellen bzw. Infrarotlicht emittieren. Die Rückkoppelung
zwischen technischem und biologischem System spielt hierbei eine
entscheidende Rolle.
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In
einer weiteren Ausführungsform weist die erste (1)
und/oder die zweite (2) Komponente des Zwei-Komponentensytems
mindestens eine weitere Komponente (7) auf, die von einem
heterologen Organismus stammt.
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In
einer weiteren Ausführungsform umfasst die erste (1)
Komponente ein Chromophor (8). Diese Ausführungsform
erzeugt mit dem hier offenbarten systematischen Design verbesserte
Kinasekomponenten und Empfänger-(Receiver)- komponenten
für die Nutzung als Zwei-Komponentensystem zur Programmierung
von Bakterien und insbesondere deren Membranoberfläche.
Dabei werden systematisch DNA-Bindematritzen für das verbesserte
Design der Bindeeigenschaften der Empfänger-(Receiver)-komponente
an die DNA sowie Struktur- und Interaktionsüberlegungen
für das Design neuer Chimären und verbesserter
Interaktion der Kinasekomponenten und der Empfänger-(Receiver)-komponenten
genutzt.
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Das
für elektromagnetische Wellen empfindliche Chromophor der
Kinasekomponente wird ebenfalls unter Nutzung von Strukturinformation
verbessert, und alle Komponenten werden durch ungerichtete Mutationen,
wie zufällige oder unexakte PCR, Nitrosoguanidin oder gerichtete
Selektionsschemata für die Nutzung als programmierbare
Zwei-Komponentensysteme für die Programmierung von Bakterienmembranen
oder die gezielte Steuerung anderer Prozesse in den Bakterien verwendet.
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Insgesamt
wird damit die Möglichkeit eröffnet, dass die
offenbarten Zwei-Komponentensysteme auf unterschiedlichste Reize
oder Signale, wie etwa auch durch Nutzung von Kinasekomponenten ohne
Chromophor, optimal reagieren können und mit den anderen
beteiligten Komponenten, wie der Empfänger-(Receiver)-komponente
oder den DNA-Bindestellen, verschiedene Gene ansteuern können.
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Das
Design der Komponente ermöglicht, dass als äußere
Signal (3) sichtbares Licht, UV-Licht, Infrarot Licht,
Fluoreszenzlicht, eine Fotodiode, eine Leuchtdiode, Röntgenstrahlung,
Radiowellen und/oder eine weitere elektromagnetische Welle verwendet
wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform werden auf die bakterielle
Zellmembran vor dem Auftreffen des äußeren Signals
(3) weitere Schichten aufgedampft. Auf diese Weise kann
die Vorstrukturierung der Membran durch technische Eingriffe weiter
verbessert werden. Die Membraneigenschaften werden verändert,
die Membran reagiert verändert auf äußere
Signale (3) oder Reize, wird widerstandsfähiger und
stabiler gegen biologische Veränderungen.
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Ferner
ist es bevorzugt wenn die Transkription des Gens zur Expression
eines Proteins, insbesondere zur Expression des grün fluoreszierenden Proteins
(GFP) führt.
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In
einer alternativen Ausführungsform wird die Veränderung
der bakteriellen Zellmembran in einem technischen Datenspeicher
oder in einem biologischen System gespeichert, beeinflusst das technische
oder biologische System oder kommuniziert mit ihm. Die Veränderung
bakterielle Zellmembran beeinflusst die einen technischen Datenspeicher
oder ein biologisches System (Speicherung, Modifizierung) oder es
wird von ihm beeinflusst (Programmierung). Die hierdurch erzielte
und offenbarte Rückkoppelung zwischen technischen bzw.
weiteren biologischen Systemen ist ebenfalls umfasst.
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Es
hat sich ferner als vorteilhaft erwiesen wenn die Bewegungsrichtung
des Bakteriums von außen gesteuert wird. Dies ist insbesondere
möglich wenn das Che-System angesteuert wird, was der Anwendung
als drahtlose Fernsteuerung gleichkommt. Vorteilhaft ist außerdem
die Verwendung nieder- bzw. hochfrequenter elektromagnetischer Wellen, wie
beispielsweise Radiowellen oder UV-Licht.
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In
einer weiteren Ausführungsform verwendet das Zwei-Komponentensystem
mindestens eine DNA Sequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ
ID NR:1 bis SEQ ID NR:55 ausgewählt ist. Das Zwei-Komponentensystem
bindet mindestens eine dieser DNA Sequenzen optimiert.
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Ein
weiterer Gegenstand ist die Verwendung des erfindungsgemäßen
Bakteriums in der Nanotechnologie, synthetischen Biologie, zur Herstellung von
Chips, für Screeningverfahren und/oder für biochemische
Assays.
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Ferner
betrifft die vorliegende Erfindung eine programmierbare, bakterielle
Zellmembran, die aus einem erfindungsgemäßen Bakterium
durch Isolieren der Zellmembran von dem Bakterium herstellbar ist. Vorteilhaft
ist die gezielte Expression verschiedener Proteine und Membraneigenschaften
durch das erfindungsgemäße Zwei-Komponentensystem. Über dieses
Zwei-Komponentensystem wird die Membran programmierbar weil die
von außen zugeführten elektromagnetischen Wellen
in eine Aktivität von Signalkaskaden durch das Zwei-Komponentensystem umgewandelt
werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellmembran
zum Speichern oder Modifizieren von Information in der Membran verwendet.
Das elektronische Einlesen der Membran und das Programmieren der
Membran sind ebenfalls umfasst.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Bakterium
für gezieltes Design zur (i) Mustervergrößerung
oder -verkleinerung durch Wachstum der Kolonie (Muster aus synthetischen Bakterien
oder in der Membran der synthetischen Bakterien) oder (ii) Nutzung
als unbelebtes Speichersystem, insbesondere der bakteriellen Membran, durch
gezieltes Stoppen der biologischen Wachstums- und Replikationsvorgänge,
wie beispielsweise durch einen induzierbaren Promotor oder ein Apoptoseprogramm,
erzielt.
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Mit
dem erfindungsgemäßen programmierbaren Zwei-Komponentensystem
wird außerdem mittels eines Screeningverfahrens spezifisch
nach Sensorkinasechimären gesucht, die nicht durch Licht,
sondern durch andere elektromagnetische Wellen angeregt werden.
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Es
ist außerdem vorteilhaft wenn die gespeicherte Information
an ein zweites modifiziertes Bakterium oder an eine weitere programmierbare
bakterielle Zellmembran weitergegeben wird bzw. vererbbar ist. Das
System kann beispielsweise dafür genutzt werden, dass ein
Lichtmuster, wie etwa über GFP Expression in einem ersten
Bakterienrasen, an einen zweiten Bakterienrasen mit ebenfalls lichtemp findlicher
Kinase weitergegeben werden kann. Hierbei handelt es sich um eine
gegenseitige Verschaltung und Vernetzung zweier programmierbarer
bakterieller Membranen. Umfasst ist auch die Nutzung des beschriebenen
modifizierten Bakteriums zur Mustervergrößerung
oder -verkleinerung einer bakteriellen Oberfläche sowie
eine Nutzung nach Abtötung des modifizierten Bakteriums
als nicht lebendes Speichersystem.
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Vorteilhaft
ist es weiterhin, wenn die Oberflächenstruktur und/oder
die Feinstruktur der Membran weitergegeben wird bzw. vererbbar ist/sind.
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Umfasst
ist ferner die Selbstoptimierung der Membran durch biologische Selektion
und technisch gesteuerte Rückkoppelung. Alle Verwendungen
sind umfasst.
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Wie
oben erwähnt kann die von erfindungsgemäßen
Zwei-Komponentensystemen vorstrukturierte Membran die gespeicherte
Anordnung an die Tochtermembran weitergeben. Dies ist beispielsweise
bei Bakterien möglich. Im Rahmen der Erfindung hat dies
interessanterweise dazu geführt, dass bei geeigneten Bedingungen
auch die programmierte Anordnung der Proteine weitergegeben wird,
wenn an der Membran eine neue Membran synthetisiert wird. Besonders
bevorzugt und beispielhaft hierfür ist die Expression von
Avidin, die nur bei Belichtung erfolgt. Ein Muster bzw. ein Schriftzug
wird anschließend beispielsweise durch Licht mit Hilfe
des erfindungsgemäßen Zwei-Komponentensystems
programmierbar.
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Ferner
ist das Erzeugen einer Polarität auf der Membran möglich.
Das unbelichtete oder mit weniger Lichtintensität belichtete
Konstrukt führt zur Expression eines anderen Proteins,
beispielsweise eines Oberflächenproteins, das zur Ablösung
der Bakterienschicht vom Untergrund führt. Dies erfolgt
nach Austitrieren der Proteinkonzentration der Empfänger-(Receiver)-komponente,
die bei niedrigeren Lichtintensitäten und damit niedrigerer
Konzentration der aktiven Empfänger-(Receiver)-komponente durch
ein anderes Protein, wie beispielsweise einem Transkriptionsfaktor
oder einem anderen DNA-bindenden Protein, von ihrer nor malen Promotorbindestelle
durch Kompetition entfernt wird. Dies führt zur Expression
eines alternativen Proteins in den Bereichen der Bakterienkolonie,
die weniger Lichtintensität erhalten. Hierbei kann es sich
um beispielsweise Licht abgewandte, untere Bereiche handeln, die
eine andere Proteinexpression an den Licht abgewandten Bakterienmembranen
zeigen.
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In
einer alternativen Ausführungsform können gewünschte
Eigenschaften der Membran selektiert werden. Die Membraneigenschaften
tragen dazu bei (einschließlich Selbstoptimierung).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform wird das äußere
Signal (3) von einem technischen Datenträger abgegeben
bzw. eingelesen.
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Abschließend
sei angemerkt, dass sämtlichen Merkmalen, die in den Anmeldungsunterlagen und
insbesondere in den anhängigen Ansprüchen genannt
sind, trotz dem vorgenommenen formalen Rückbezug auf einen
oder mehrere bestimmte Ansprüche, auch einzeln oder in
beliebiger Kombination eigenständiger Schutz zukommen soll.
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Detaillierte Beschreibung der Figuren
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1 stellt
das erfindungsgemäße Zwei-Komponentensystem zur
Programmierung von bakteriellen Membranen und anderer bakterieller Prozesse
dar. Gezeigt ist das Prinzip der Programmierung. Das Zwei-Komponentensystem
wird in Bakterien exprimiert. Die erste Komponente 1, die
im vorliegenden Beispiel eine Kinase ist, wird spezifisch für die
Reaktion auf eine gewünschte elektromagnetische Welle 3 oder
andere Signale optimiert und steuert eine zweite Komponente 2,
die im vorliegenden Fall eine Empfänger-(Receiver)-komponente
ist, an. Die Empfänger-(Receiver)-komponente 2 bindet
an ein wichtiges Gen 4, steuert dessen Transkription 5 und
verändert dadurch die bakterielle Membranbeschaffenheit
bzw. weitere bakterielle Prozesse 6. Wichtig ist die ermöglichte
allgemeine Nutzung verschiedener elektromagnetischer Wellen 3 für
die Kinasekomponente 1. Es werden zudem neue Kinase- 1 und
Empfänger-(Receiver)-komponenten 2 generiert.
Dies führt zu besseren Möglichkeiten, weitere Gene 4 anzusteuern,
was auch das gezielte Einführen von Bindestellen umfasst;
um anschließend die bakterielle Membran 6 in ihrer
Beschaffenheit zu ändern und zu programmieren. Entscheidend
ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Rückkoppelung
der Eingabe mit und in technische Systeme sowie zur Membranstrukturierung
und die Weitergabe dieser Strukturierung.
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2 zeigt
eine bevorzugte Ausführungsform und Weiterentwicklung des
Zwei-Komponentensystems aus 1. Die Ziffern 1 bis 6 bezeichnen
die gleichen Komponenten wie in 1. Eine
Optimierung der Schalteffizienz des Zwei-Komponentensystems erfolgt
durch chimäre Proteine 7, die für die
erste und/oder zweite Komponente 1, 2 eingesetzt
werden können. Zur Aufnahme des externen Signals 3 kann
zusätzlich ein Chromophor 8 in der Kinasendomäne 1 verwendet
werden, was die Empfindlichkeit gegenüber dem externen
Signal 3 erhöht oder die Aufnahme anderer Wellenlängen
ermöglicht. Durch ein spezielles Domänendesign
wird das System durch Zugabe von Liganden 9 oder anderen
interagierenden Partnern moduliert. Weiterhin kann eine DNA-Bindestelle
der Empfänger-(Receiver)-domäne 2 gezielt
an andere Genorte 10 transplantiert werden. Daneben kann
die Protein-Protein und Protein-DNA Interaktion 11 des
Systems durch Verfahren der gezielten Proteinveränderung
(protein engineering) verändert werden.
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3A zeigt
die natürliche Situation in Deinococcus radiodurans. Gezeigt
sind die folgenden Gene: 1 = β-Ketothiolase, 2 = Mannose-6-phosphat-isomerase,
3 = Resistenzgen, BphO = bacteriophytochrome heure oxygenase; Es
konvertiert Häm in Billiverdin in Deinococcus radiodurans,
BphP = Bacteriophytochrome (Phytochrome-like protein in Deinococcus
radiodurans), BphR = Bacteriophytochrome response regulatorisches
Gen in Deinococcus radiodurans. Die letzten drei Gene kodieren dann
die Proteine für das entsprechende Zwei-Komponenten system
in D.radiodurans. Das natürliche Zwei-Komponentensystem
enthält nun eine neue Domänenzusammensetzung durch
gezieltes Domänendesign.
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3B zeigt
die folgenden Domänen: PAS leitet sich von 3 Proteinen
ab: Perperiod circadian Protein; Arnt- Ah receptor nuclear translocator
Protein; Sim- single-minded Protein. GAF (GAF domain, beschrieben
in Aravind L., Ponting C.P.; The GAF domain: an evolutionary
link between diverse phototransducing Proteins. Trends Biochem.
Sci. 22: 458–459 (1997)). HiskA = Histidin Kinase
A. HATPase C = histinde knase-, B-, phytochrome-like ATPase.
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In
dieser Anordnung kann kurz vor der Histidine Kinase A (Phosphoakzeptordomäne)
geschnitten werden. Die Region zwischen der Loopregion und der HiskA
enthält die Aminosäuren 467–521 (das entspricht
den Nukleotiden 1401–1563).
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3C zeigt
die Domänenanordnung von envZ aus E. coli K12. Das envZ
Gen kodiert die Histidinkinase (HiskA) des Zwei-Komponentensystems EnvZ/OmpR
in E. coli. Reguliert werden dadurch u. a. die Membranproteine OmpC
und OmpF, wobei die bakterielle Membran mit diesem Sensorsystem
auf eine osmotische Änderung (osmotic upshift) reagiert. In
diese E. coli Histidinkinase (HiskA) wird der N-terminale, lichtsensitive
Teil der obigen Kinasedomäne von Deinococcus radiodurans
(vgl. 3A und B) eingesetzt. In E.
coli K12 wird hierfür vor der Aminosäure 221 enzymatisch
geschnitten, die genau in der HAMP Domäne (Domäne
für Histidinkinasen, Adenylylzyklasen, Methyl-bindenden
Proteinen und Phosphatasen) liegt. Das Schneiden beeinträchtigt die
Aktivität der Chimäre nicht. Vorteilhaft ist hierbei eine
NdeI-Schnittstelle, an der passend geschnitten wird und die zur
Generierung der Kinasen-Chimäre genutzt wird. Dabei bleibt
der Leserahmen intakt.
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Detail
des zweiten Ausführungsbeispiels: Nutzung von DNA-Bindematritzen,
entsprechend der andere DNA-Regionen angepasst und von der Empfänger-(Receiver)-Komponente
angesteuert werden können.
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Die
neu erstellte DNA-Bindematrix für OmpR wurde als Beispiel
gewählt (vgl. auch die Sequenzen des beigefügten
Sequenzprotokolls). Außerdem können genauso zahlreiche
andere Empfänger-(Receiver)-domänen genutzt und
ihre DNA-Bindung optimiert werden. Wichtig ist für das
Design das Wissen um die Varianten der Konsensussequenz. In die
Erfindung sind mehrere neu sequenzierte Teilbereiche aus E. coli
Stämmen eingeschlossen. Durch die im Sequenzprotokoll angegebenen
Sequenzen können Bindungen bzw. Inhibition der DNA-Bindung
von OmpR weiter optimiert werden. Insbesondere kann so auch die
Bindestelle künstlich an anderer Stelle eingesetzt bzw.
transplantiert werden. Es können auch andere Bindestellen
an die Konsensussequenz durch Mutationen angepasst werden.
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1. PDB-Code für OmpR
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Als
homologes Template sollte 1mvoA (PhoP Receiver Domäne von
B. subtilis) bzw. 1gxqA (die PhoB E. coli Daten enthalten die kritischen
DNA-bindenden Transaktivierungsreste) genutzt werden.
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2. BphO
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BphO
steht für „bacteriophytochrome heure oxygenase";
Genbank Zugangsnummer: AAM00353; um ein Chromophor auch in E. coli
herzustellen, damit auch der lichtempfindliche Teil der Zwei-Komponentenkinase
von Deinococcus radiodurans genutzt werden kann. Das PDB file d1j77a
bzw. a.132.1.2. nach SCOP („Gram-negative bacterial heure
oxygenase” (Neisseria meningitidis)) kann als Template
für die Modellierung und anschließende Strukturmodifizierung
bzw. in diesem Fall die gezielte Veränderung der Chromophordomäne über
Mutagenese des Enzyms verwendet werden.
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3. BphP
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1ZTU_A – direkte
Strukturauflösung genau dieses Phytochroms. Optimierung
der Protein-Protein Passung (Holm und Park, 2000)
nach Identifikation der beteiligten Strukturdomänen (Schmidt
et al., 2002) und Methoden der Sequenz-, Domänen-
und Strukturanalyse (Gaudermann et al., 2006).
Gezieltes Suchen und Einpassen von modulierenden Interaktionspartnern
durch die Proteininteraktionsdatenbank STRING (v. Mering
et al., 2003).
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4. Weitere Strukturinformationen
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Weitere
Strukturinformationen, die für weiteres Strukturdesign
zur Verfügung stehen, insbesondere zur Generierung alternativer
Zwei-Komponentensystem-Sensor-Chimären sind: EnvZ von E.
coli: Für die Histidinkinasedomäne liegt eine
NMR Struktur vor (PDB Code: 1bxd). Für den Responseregulator
zur Histidinkinase BphP in Deinococcus radiodurans steht eine homologe
Kristallstruktur zur Verfügung, nämlich 1I30, „response
regulator for cyanobacterial phytochrome" RCP1 aus Synechosystis sphaeroides.
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5. Chromophor-Optimierung
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Die
Chromophor-Optimierung ist möglich, indem man insbesondere
das Chromophor durch Proteindesign verändert. Unter Nutzung
der kürzlich publizierten Strukturdaten (Wagner
et al., 2005) kann insbesondere nach Domänenanalyse
auch der „Iight-sensing knot" in einer lichtempfindlichen
Sensordomäne durch Design und Mutagenese gezielt verändert
und für andere Lichtwellenlängen angepasst werden.
-
6. Domänen-Rekombination:
-
Insbesondere
wird in der vorliegenden Erfindung die Histidinkinase-Empfindlichkeit
eines Bakterienstammes (erste Domänenhälfte bis
zur hierzu ausgewählten Restriktionsenzymschnittstelle)
verwendet, um anschließend mit Hilfe einer Chimäre
das Zwei-Komponentensystem in einem anderen Bakterienstamm (insbesondere
E. coli) zu steuern.
-
Bevorzugte Ausführungsformen
und detaillierte Beispiele
-
Die
folgenden Beispiele stellen die Erfindung näher dar. Sie
sind exemplarisch angegeben und sollen den Schutzbereich der Erfindung
nicht beschränken.
-
Im
Unterschied zu anderen Innovationen auf dem Gebiet der Nanobiotechnologie
wurde im Rahmen dieser Erfindung nicht versucht, allgemein beliebige
Promotoren zu modifizieren oder zu aktivieren, sondern es werden
gezielt veränderte Signalkaskaden aus der Mikrobiologie,
insbesondere Zwei-Komponentensysteme verwendet. Ebenso ist nicht
Ziel der Erfindung lediglich ein gewünschtes Protein zu exprimieren,
sondern eine interaktive, programmierbare bakterielle Zelloberfläche
zu erzielen, die insbesondere direkt durch Lichtreize umprogrammiert
werden kann und Proteine dadurch exprimiert bzw. nicht exprimiert
werden.
-
Auch
erlaubt es die Erfindung, mehrere Responseregulatoren und Binderegionen
in der weiteren Ausgestaltung zu verwenden, um durch äußere Signale,
wie beispielsweise zwei verschiedene Farben, unterschiedlich Proteine
zu exprimieren oder Proteinkomplexe unterschiedlich anzuordnen.
-
Die
Erfindung zeichnet sich durch die Rückkopplung (feedback
loop) in der bakteriellen Membranoberfläche zur technischen
Eingabe (Input) aus, was ein geschlossenes System bildet. Ein fluoreszierendes
Protein kann ein eindeutiges, insbesondere maschinenlesbares Signal
an der Zelloberfläche erzeugen. Alternativ dazu kann ein
elektronisches Signal durch Öffnen eines Kanalproteins,
das sich deshalb öffnet, weil über das Zwei-Komponentensystem eine
entsprechende Kaskade aktiviert wurde, generiert werden.
-
Für
die Erfindung ist die Kombination natürlich vorhandener
Signalsysteme in den Bakterien entscheidend, die weiter modifiziert
werden, um die obigen Bearbeitungsschritte exakter, billiger und schneller
voranzubringen. Die Nutzung und Modifikation von Zwei-Komponentensignalsystemen
aus verschiedenen Spezies, zugehörige Operons und zelleigener
Signalsysteme beispielsweise zur Sporulation erlaubt es, eine solche
biologische Vorverarbeitung von Membranen und ihre aktive Schaltbarkeit
bezüglich Oberflächenbeschichtung wesentlich effektiver zu
gestalten.
-
Im
Folgenden wird eine bakterielle programmierbare Membranoberfläche
unter Verwendung von Zwei-Komponentensystemen als vielseitig verwendbares
neues Werkzeug, speziell für die Verwendung in der Nanobiotechnologie
und der synthetischen Biologie beschrieben.
-
Es
wird damit eine programmierbare Membranoberfläche durch
Nutzung und gezielte Veränderung von bakteriellen Komponenten
wie Membran und Zwei-Komponentensystem Signalkaskaden erzeugt.
-
Dabei
ergeben sich die folgenden spezifischen vier Ausgestaltungsaspekte
für die Membranoberfläche, die durch die Erfindung
jeweils systematisch vorteilhaft beeinflusst werden.
-
1. Eingabe
-
Erzielung
von neuen Sensorkinasen indem neue Chimären der Kinasekomponente
auf elektromagnetische Wellen (z. B. Licht, UV, Radiowellen) ansprechen.
-
Neues
lichtempfindliches Kinasesystem: Bekannt sind hierbei lichtempfindliche
Kinasesysteme, welche die lichtempfindliche natürliche
Komponente von Synechocystis benutzen. Es wird ein neu konstruiertes
Zwei-Komponentensystem u. a. mit Kinasechimäre vorgeschlagen,
die z. B. das Sensorsystem von Deinococcus radiodurans bzw. Proteine,
die hierzu sequenz- oder zumindest funktionshomolog sind, vorteilhaft
verwenden, und mit anderen Proteindomänen (z. B. aus E.
coli) kombinieren.
-
1.1 Gezieltes Design des Zwei-Komponentensystems
-
Zwei-Komponentensystem,
durch Design gezielt optimiert, einerseits lichtempfindlich (Beiträge aus
Deinococcus radiodurans), andererseits garantieren E. coli Genetik
und E. coli Interaktionen als weitere Komponenten des Systems wenig
experimentellen Aufwand. Besonders wichtig für diese erste
Ausführung ist das gezielte Erzeugen einer neuen Kinasen-Chimäre
zwischen den Organismen, wie in 3 gezeigt
ist.
-
In
der Erfindung wird gezieltes Design verwendet. Insbesondere wird
in der Erfindung ein gezielter Match zwischen Transkriptionsfaktorbindestelle
an der DNA und dem – von der Kinase aktivierten – Empfänger-(Receiver)-protein
erzielt. In der einfachen Ausführung wird dies durch die
Chimärenbildung und eine geschickte Wahl der Schnittstelle
erzielt, weil anschließend die weitere Interaktion in E. coli
erfolgt und dort das E. coli Empfänger-(Receiver)-Protein
bereits zu der entsprechenden Empfängerbindestelle in der
DNA passt und die Transkription anschließend auslöst
und steuert.
-
In
der weiter verbesserten Ausführung wird eine optimale Passung
gezielt durch Design erzielt und erlaubt dadurch eine höhere
Vielfalt und Auswahl der Implementierung der Erfindung:
- (i) Es werden in einer weiteren Ausführung Konsensus-Receiver-Bindestellen
genutzt. Erfindungsgemäß wird dies durch Erstellen
einer erweiterten Matrix („Position specific scoring matrix” (PSSM)
oder weiter bevorzugt, „Hidden Markov Model" (HMM)) für
das zentrale Motiv erreicht, um die Bindestelle bei E. coli unter
Nutzung homologer Sequenzen verschiedener, auch neu sequenzierter
E. coli Genome optimiert zu erzeugen (vgl. Sequenzprotokoll). Das
Sequenzprotokoll bezieht sich auf die OmpR Bindestelle. Alignments
erlauben auch die Generierung von PSSMs oder HMMs um Varianten der
Bindestelle sicher zu erkennen, ohne aber zuviel Varianz zuzulassen. Dies
ist noch wichtiger bei anderen Zwei- Komponentensystemen weil OmpR
eine relativ gut konservierte Konsensussequenz aufweist. Damit können
auch andere Gene angepasst werden, oder die Bindestelle kann direkt
hiervor transplantiert werden.
- (ii) Analog hierzu wird zusätzlich oder alternativ ein
allgemeines „Sequence-Structure-Tempiate" (Methodik
zum Erstellen des Templates: vgl. z. B. Holm und Park, 2000; Schmidt
et al., 2002; Gaudermann et al., 2006),
das spezifisch für Empfänger-(Receiver)-domänen
ist, etwa vom OmpR Typ, erstellt.
Damit können sowohl
die Nukleotidbindestelle in anderen Nukleotidsequenzen wie auch
die benötigte Bindedomäne in anderen Proteinen
identifiziert oder künstlich eingesetzt werden.
- (iii) Ebenso wird ausgehend von bekannten 3D Strukturen das
Strukturtemplate für die Interaktion zwischen Histidin-Kinase
und Receiver-Domäne genutzt; um weitere Domänen
und Proteine durch gezielte Mutationen für die Erfindung
zu nutzen und anzupassen, die weitere erstrebenswerte Eigenschaften
aufweisen. Möglich ist hier beispielsweise eine gute Ausbeute
bei ihrer Expression oder weiteren Sensoreigenschaften, eine einfache
technische Handhabung oder ein gewünschter Organismus etc.
-
Schließlich
können die offenbarten Verfahren (i) bis (iii) auch mit
Protein-Engineering Schritten zum Erstellen neuer Proteinchimären
kombiniert werden.
-
Ein
erfindungsgemäßes Bakterium mit dem Zwei-Komponentensystem
kann als „synthetisches" Bakterium genutzt werden. Der
Einsatzbereich bewegt sich vorwiegend im Fachgebiet der so genannten „synthetic
biology". Möglich ist der Einsatz als Bakterium mit gezieltem
Design zur Mikromustervergrößerung oder -verkleinerung.
Dabei wird ein Rasen aus synthetischen Bakterien mit Licht programmiert. Die
Bakterien exprimieren an schließend in den belichteten Bereichen
ein gewünschtes Protein oder Peptid. Durch geeignete Wahl
des genetischen Konstruktes ist nach dem Belichten die Histidinkinase ständig
aktiv weil die Lichtaktivierung auch eine Rekombinase aktiviert
und die Histinkinase einen konstitutiven Promotor erhält.
Damit kann ein programmiertes Expressionsmuster mit dem Rasen mitwachsen.
Ebenso können mehrere Muster, für die mehrere Lichtquellen
und verschiedene Histinkinasen mit verschiedenen Chromophoren verwendet
werden sowie induzierbare und reversible Konstrukte genutzt werden,
die auch zur gezielten Musterverkleinerung eingesetzt werden können.
-
Die
programmierten Membranen können auch ohne Zellen genutzt
werden, z. B. als Speichermedium wenn das exprimierte Protein technisch,
wie beispielsweise optisch, angesteuert wird und in zwei unterschiedlichen
Zuständen anwesend sein kann, wie beispielsweise Rhodopsine,
Prionproteine oder Antikörper. Ferner kann durch ein anderes
Signal, z. B. Antibiotika induzierbarer Promotor, gezielt die übrigen
Bakterienzellen abtöten bzw. von der Membran gelöst
werden.
-
1.2 Design des Chromophors
-
Das
Chromophor macht die Histidinkinase lichtempfindlich. Aus früheren
Arbeiten ist hierzu beispielsweise das BphO Gen von Deinococcus
radiodurans bekannt (Bhoo et al., 2001). Für
die technische Anwendung ist eine höhere Flexibilität
für andere Reize oder Signale, insbesondere der Wellenlänge,
sehr vorteilhaft. Ferner ist es bevorzugt wenn das Chromophor auch
auf andere elektromagnetische Wellen spezifisch reagiert. Hierfür
verwendet die vorliegende Erfindung ein Screeningverfahren für
geeignete Chromophore. Das Screeningverfahren sieht wie folgt aus:
- (i) Vormutagenese des Konstruktes bzw. des Chromophor
erzeugenden Enzymsystems etwa durch zufällige (random),
nicht exakte PCR Mutagenese oder die Verwendung von Mutagenen wie Nitrosoguanidin
in Bakteri enstämmen, die bereits das neue synthetische
Zwei-Komponentensystem in einer ersten Form tragen.
- (ii) Ein gezieltes Design des Chromophors wird durch die Kombination
und Nutzung der Daten von Rockwell et al. (2006), van
Thor et al. (2006), Borucki et al. (2005) und Wagner
et al. (2005) ermöglicht.
- (iii) Noch vorteilhafter ist das gezielte Selektieren des veränderten
Chromophors über einen Selektionsassay: Das mutierte Chromophor
(vgl. (i), (ii)) muss für die veränderte Wellenlänge
sensitiv sein und über das Zwei-Komponentensystem für
Antibiotika Expression sorgen, weil sonst eine negative Selektion
auftritt, die zum Absterben der Bakterien durch das Antibiotikum
führt. Triviale „Escape-Mutanten" werden durch
entgegen gesetztes Screening (Counterscreening) weiter reduziert. Hierfür
ist es entscheidend, dass das Zwei-Komponentensystem funktionieren
muss, sonst wird ein Metabolit toxisch verstoffwechselt. Beispielhaft
ist hierfür 4-Fluoruracil.
-
1.3 Weitere Ausgestaltungen
-
Das
derart gewonnene, neue empfindliche Zwei-Komponenten-Sensorsystem
in Bakterienmembranen kann wie folgt weiter ausgestaltet werden:
- a) Mit dem erfindungsgemäßen
Screeningverfahren wird spezifisch nach Sensorkinasechimären gesucht,
die nicht durch Licht, sondern durch andere elektromagnetische Wellen
erregt werden.
- b) Neue, hier offenbarte Anwendungen sind insbesondere eine
Fernsteuerung der Bewegungsrichtung von Bakterien durch das System,
wenn etwa das Che-System über das Zwei-Komponentensystem
angesteuert wird. Als Anwendung kommt zum Beispiel die drahtlose
Fernsteuerung in Betracht.
- c) Ferner können nieder- oder hochfrequente elektromagnetische
Wellen, wie Radiowellen oder UV-Licht verwendet werden.
-
2. Programmierung:
-
2.1 Eingabe und Ausgabe Eigenschaften
der Membran
-
Die
Eingabe und Ausgabe Eigenschaften der Membran werden durch die Membranstrukturierung verändert.
Verwendet wird die gezielte Expression verschiedener Proteine und
erzielter Membraneigenschaften durch das erfindungsgemäße
Zwei-Komponentensystem. Über dieses Zwei-Komponentensystem-System
wird die Membran programmierbar weil ein elektromagnetischer Wellen-Input
stattfindet. Wichtig ist dabei, dass die Chimäre gezielt
verändert und moduliert werden kann. Es findet eine Umwandlung
der Aktivität von Signalkaskaden durch das Zwei-Komponentensystem
statt. Das Design der Membranoberfläche betrifft z. B.
die gezielte Expression von Lektinen, um bestimmte Gewebe oder Membranen
besiedeln zu können, die gezielte Expression von monoklonalen
Antikörpern, um Peptide gezielt binden zu können
oder Transmembran-(TM)-Rezeptoren bzw. Ionenkanäle oder
Designerproteine (z. B. Kinasen) um auf andere Signale gezielt mit
der Membran reagieren zu können. Dabei können
insbesondere auch die Membraneigenschaften verändert werden.
-
2.2 Weitere Ausgestaltung
-
Diese
Vorstrukturierung der Membran kann durch technische Eingriffe weiter
verbessert werden, beispielsweise durch (i) Aufdampfen von Schutzschichten.
Dies verändert die Membraneigenschaften, macht sie widerstandsfähiger
und stabilisiert sie gegen biologische Veränderungen. Außerdem
ist eine (ii) verbesserte Programmierbarkeit der Membranoberfläche
durch lokalisiertes Aufbringen (Epitaxie oder durch Fotolithografie
oder andere schonende Verfahren, z. B. UV-induziertes Kleben in
belichteten Bereichen) von organischen oder metallischen Leitern,
Halbleitern oder Isola torschichten mit der Membranoberfläche
oder von Peptiden, Aptameren, Imprints oder selektiven Bindepartnern
möglich.
-
3. Ausgabe und Rückkoppelung
-
Die
Ausgabe auf einen Input kann durch Expression verschiedener Proteine
an der Membran erfolgen. Möglich ist die Expression des
grün fluoreszierenden Proteins (green fluorescence Protein (GFP)),
die ein Lichtsignal bzw. über die Expression eines Kanalproteins
ein elektronisches Signal erzeugt. Im Rahmen der Erfindung wird
dies für eine Rückkoppelung in
- a)
ein technisches Datenspeichersystem, wie beispielsweise einen Massenspeicher,
einen Computer oder ein Speichermedium; oder
- b) ein biologisches System aus Rezeptoren oder anderen Designer
Kaskaden etc. verwendet.
-
3.1 Weitere Ausgestaltung:
-
- a1) Möglich ist eine Nutzung zur Korrektur
der Programmierung der Bakterienoberfläche durch technische
Systeme. Beispielhaft hierfür sind Leuchtdioden für
die Umprogrammierung der Bakterienoberfläche durch Lichtsignale.
Ein technischer Lichtreiz programmiert eine Kinase des Zwei-Komponentensystems,
das anschließend in der Kombination zum korrekten Speichern
eines Textes in der programmierbaren Membran führt.
- a2) Der Output der programmierten Membran kann umgekehrt elektronisch
eingelesen werden wobei dazu lichtempfindliche Fotodioden bei dem technischen
Datenträger genutzt werden können. So führt
beispielsweise eine selektive Proteinexpression in der bakteriellen
Membran, wie die selektive GFP Expression zu gespeicherten Bits bzw.
Wörtern im technischen System. Die Rückkoppelung
ist wiederum ein entscheidendes Merkmal.
- b) Die Erfindung eröffnet auch die Nutzung, dass ein
Lichtmuster an einen zweiten Bakterienrasen mit ebenfalls lichtempfindlicher
Kinase weitergegeben werden kann. Dabei kann GFP und die erfindungsgemäße
Designerkaskade durch eine dünne, insbesondere lichtdurchlässige
Membran vom nächsten Bakterienrasen getrennt sein, oder es
kann ein direkter Kontakt erfolgen.
- c) Andere Möglichkeiten der Rückkoppelung
mit einem technischen System sehen vor:
– die gezielte
Expression von Kanalproteinen, etwa Na+,
K+, Cl– Ionenkanäle,
die wiederum elektronische Effekte ausüben und so vom technischen
System abgelesen werden können.
– Die Emittierung
von anderen Wellenlängen durch so genannte „emitting
Proteins", die alternativ zu GFP eingesetzt werden können,
die kein Fluoreszenslicht, sondern Radiowellen bzw. Infrarot emittieren.
- d) Das Gesamtsystem erlaubt damit deutlich mehr als die Summe
der einzelnen Teile: Beispielsweise sind auch „feedback
loop" Fluoreszenz Proteine an der Oberfläche und technisches
Einlesen möglich, worauf hin sich der Lichtinput in das
biologische System ändert, der anschließend über das
Zwei-Komponentensystem wieder zu einer anderen Proteinexpression
führt. Hierdurch wird eine Feinbearbeitung der Oberfläche
möglich. Denkbar ist ferner eine Qualitätssicherung
der exprimierten Proteine, etwa hinsichtlich der Güte oder
Leistungsfähigkeit der exprimierten Ionenkanäle
oder eine lichtgestützte bzw. elektromagnetische Überprüfung
der Antigen/Antikörpereigenschaften der programmierten
Membran.
-
4. Membranstrukturierung und -imprint
-
Die
von Zwei-Komponentensystemen vorstrukturierte Membran kann die gespeicherte
Anordnung an die Tochtermembran weitergeben, etwa bei Bakterien.
In der Erfindung führt dies interessanter Weise dazu, dass
nun bei geeigneten Bedingungen auch die vorher programmierte und
erzielte Anordnung der Proteine weitergegeben wird, wenn an der Membran
eine neue Membran synthetisiert wird. Dieser hier verwendete und
beschriebene, durch die biologische Membran angestoßene
Prozess der Musterreplikation ist eine exaktere, biologische und schnellere
Alternative zu neueren technischen Verfahren, etwa der Musterreplikation
durch elektrische Felder in Polymeren (Morariu et al., 2002)
oder durch modifiziertes Trocknen („dewetting”)
von Polymerfilmen (Harkema et al., 2003). Dies
kann außerdem zusätzlich alle weiteren Arten von
Membran-Imprint und Strukturierung einbeziehen.
-
4.1 Beispiel
-
Das
grün fluoreszierende Protein (GFP) wird nur bei Belichtung
exprimiert; es entsteht ein GFP-Muster, wie z. B. ein Schriftzug,
der durch Licht programmierbar ist (Levskaya et al., 2005).
Dieser Effekt wird erfindungsgemäß über
ein neues, hochflexibles Zwei-Komponentensystem erzielt. Entscheidend
dabei ist, dass im Rahmen der Erfindung eine programmierbare Membranoberfläche
entsteht. Es wird beispielsweise eine Polarität erzeugt,
so dass das unbelichtete oder wenig belichtete Designer-Konstrukt
die Expression eines anderen Proteins, etwa eines Oberflächenproteins,
das zur Ablösung der Bakterienschicht vom Untergrund führt,
erlaubt. Anschließend wird das Musters weitergegeben, weil
die nächste Bakterienschicht wiederum ein lichtempfindliches
Zwei-Komponentensystem aufweist und dieses nun die GFP Expression
erneut steuert. Ähnlich können auch Membranimprints;
Proteinausstülpungen oder Proteingruben von einem Bakterienrasen
an den nächsten durch das erfindungsgemäße
Zwei-Komponentensystem weiter gegeben werden.
-
4.2 Weitere Ausgestaltung
-
Möglich
ist auch eine Selbstoptimierung der Membran, zunächst entsprechend
dem hier offenbarten Selektionsschema, anschließend über
die technischen „feedback loops", wie oben beschrieben.
Die jeweils neue Membrankonfiguration wird so Schritt für
Schritt in den Bakterien bzw. gemeinsam mit dem technischen System
optimiert.
-
Referenzliste
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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