CN114736843B - 一种大肠杆菌重组菌株、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大肠杆菌重组菌株、其制备方法和应用，具体地，改造大肠杆菌B菌系ompC位点，恢复ompC蛋白的完整性，及ompC和ompF两个膜通道蛋白的表达调控机制。改造后的新菌种可以提高重组蛋白的表达量及分泌效率。

Description

一种大肠杆菌重组菌株、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种大肠杆菌重组菌株、其制备方法和应用。

背景技术

大肠杆菌B菌系和K菌系为工业生产级别表达重组多肽蛋白最为广泛使用的大肠杆菌宿主菌。通过对B菌系和K菌系全基因组序列分析发现：B菌系的REL606菌株[GenBank:NC_012967]和K菌系的MG1655菌株[GenBank:NC_000913]基因组区域对比的平均核苷酸同一性为>99.1%。

对B菌系和K菌系基因组的比较表明，其基本基因组的3793种蛋白质中，有一半以上被预测是相同的，大约310种只在B菌系或K菌系中似乎具有功能性。

经对表达蛋白组的分析，膜通道蛋白在二菌系表达差异极为显著。在B菌系中ompF为表达量最高的蛋白之一，还有大量ompF被直接分泌到大肠杆菌细胞外。而在K菌系中高表达的膜通道蛋白为ompC和ompA。其中，ompF和ompC为大肠杆菌主要膜通道，ompF通道孔径较ompC大，大分子如抗生素和胆汁酸可直接通过ompF扩散至细胞内。

进一步分别对K菌系和B菌系中ompC和ompF基因位点及其调控序列进行分析：K菌系中ompC基因与相邻的micF共用同一启动子，共表达。micF表达产物为有调控功能的microRNA（micF RNA）。micF RNA与ompF基因转录的RNA（ompF RNA）的5’端结合，可以降解ompF RNA从而达到调控ompF表达水平，从而实现ompC和ompF两种膜通道蛋白的表达平衡。

B菌系相对K菌系的优势在于，如B菌系中BL21系具有产酸少，氨基酸合成能力强等特性；并且BL21菌系不含lon蛋白酶，也缺乏外膜蛋白酶OmpT，这两种关键蛋白酶的缺失可降低细胞中表达的异源蛋白的降解，更加适合重组多肽蛋白高质量表达，因而更广泛应用于工业生产。然而在B菌系中属于转座元件的插入序列(insertion elements) insA/B-17插入ompC-micF位点，由此造成在B菌系中ompC潜在功能或缺，micF调控功能彻底缺失，ompF表达调控失效，致使B菌系中ompF蛋白超量表达，甚至于大量ompF蛋白直接排入细胞外。对重组蛋白表达生产在细胞层面造成能量浪费。

发明内容

在B菌系中由于insA/B-17插入ompC-micF位点，导致ompC基因N端缺失56个氨基酸编码序列，ompC和micF的启动子及下游rcsD和rcsB基因缺失，其中ompC蛋白N端缺失的56个氨基酸序列中含有信号肽（signal peptide）和使ompC锚定于细胞外膜至关重要的跨膜βstrand。基于以上发现，本发明提供了一种敲除insA/B-17元件，通过插入ompC基因N端缺失56个氨基酸编码序列、ompC和micF的启动子和micF编码序列来使B菌系可以正常表达ompC蛋白，并能通过micF调控ompF蛋白表达的方法。鉴于此，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供了一种大肠杆菌重组菌株的制备方法，所述的大肠杆菌为B菌系菌株，所述的重组菌株表达ompC蛋白，ompF蛋白表达下降。

所述ompF蛋白表达下降是指相对于重组前的B菌系菌株，重组菌株中ompF蛋白表达下降。

优选的，所述的重组菌株表达micF。

优选的，所述的制备方法包括向B菌系菌株基因组中导入融合基因，进一步优选的，所述的融合基因包括ompC-micF启动子、ompC蛋白的部分编码序列和micF基因，更优选的，所述的融合基因包括SEQ ID NO:2。

更优选的，所述ompC蛋白的部分包括ompC蛋白第1-56位氨基酸残基，所述的ompC蛋白的部分序列如SEQ ID NO:13所示。

更优选的，所述ompC-micF启动子的序列包括SEQ ID NO:14。

更优选的，所述micF基因序列包括SEQ ID NO:15。

优选的，所述的制备方法包括敲除B菌系菌株基因组中的insA/B-17序列，进一步优选的，所述的insA/B-17序列包括SEQ ID NO:12。

优选的，所述的制备方法包括使用靶向载体制备重组菌株，进一步优选的，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，更优选的，所述的供体核苷酸序列从5’-3’依次包含I-SceI酶切位点、标记基因、I-SceI酶切位点和上述融合基因。

优选的，所述的I-SceI酶切位点序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述的标记基因包括但不限于营养缺陷型标记、抗性标记、报告基因标记。

标记基因的应用对于重组细胞(重组子)的筛选起到作用，使得受体细胞能够与未转化的细胞进行显著区分。营养缺陷型标记是通过转入的标记基因与受体细胞突变基因互补，从而使受体细胞表现野生型生长。抗性标记是指将抗性基因转入受体细胞中，转入的基因使受体细胞在一定的药物浓度下表现抗药性。作为本发明的优选方式，应用抗性标记来实现重组细胞的便捷筛选。

在本发明的一个实施方式中，所述的标记基因为抗性标记基因，所述的抗性标记基因包括但不限于安普霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因或新霉素磷酸转移酶基因。

优选的，所述的靶向载体还包含同源臂A（5’同源臂）和同源臂B（3’同源臂），其中，所述同源臂A序列如SEQ ID NO：3所示，所述同源臂B序列如SEQ ID NO：4所示。

在本申请的一个实施方式中，所述的靶向载体还包含位于同源臂A与I-SceI酶切位点之间的5’侧同源序列，所述的5’侧同源序列如SEQ ID NO：18所示。

在本申请的一个实施方式中，所述的靶向载体还包含位于I-SceI酶切位点与融合基因之间的3’侧同源序列，所述的3’侧同源序列如SEQ ID NO：19所示。

优选的，所述的制备方法还包括使用包含I-SceI核酸内切酶编码基因的表达载体表达I-SceI核酸内切酶。

优选的，所述的包含I-SceI核酸内切酶编码基因的表达载体中，以诱导型启动子驱动I-SceI核酸内切酶编码基因诱导型表达。

优选的，所述的诱导型启动子包括：鼠李糖启动子(rha)、trc启动子或lacI启动子(在鼠李糖或IPTG(或乳糖)诱导下启动下游基因表达)。

优选的，所述的制备方法还包括使用包含重组酶编码基因的表达载体(辅助质粒)表达重组酶。

优选的，所述的包含重组酶编码基因的表达载体中，以诱导型启动子驱动重组酶诱导型表达；较佳地，所述的诱导型启动子包括：阿拉伯糖启动子(即：在阿拉伯糖诱导下启动表达)。

优选的，所述的重组酶编码基因和I-SceI核酸内切酶编码基因位于同一表达载体中，或位于不同表达载体中。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。

优选的，所述的导入位点为B菌系菌株基因组的insA/B-17序列处。

本发明第二方面，提供了一种上述的制备方法制备的大肠杆菌重组菌株。

优选的，所述的大肠杆菌为B菌系菌株，所述的重组菌株表达ompC蛋白和micF。

优选的，所述的B菌系菌株基因组缺失insA/B-17序列，进一步优选的，所述的insA/B-17序列包括SEQ ID NO:12。

优选的，所述的重组菌株基因组包含融合基因，进一步优选的，所述的融合基因包括ompC-micF启动子、ompC蛋白的部分编码序列和micF基因，更优选的，所述的融合基因包括SEQ ID NO:2。

所述大肠杆菌重组菌株为上述所限定的大肠杆菌重组菌株。

本发明第三方面，提供了一种生产目的蛋白的方法，所述的方法包括向上述的重组菌株中导入异源核酸，生产目的蛋白。

优选的，所述的异源核酸是包含编码目的蛋白的核酸序列的载体。

优选的，所述目的蛋白是任意适合在大肠杆菌B菌系中表达的蛋白。例如，所述目的蛋白包括全蛋白、蛋白片段、多肽、短肽、可溶性蛋白、非可溶性蛋白、分泌型蛋白。

更优选的，所述目的蛋白为药用蛋白，例如抗体或抗体片段、细胞因子、炎症因子、酶等等。

在一个具体的实施方式中，所述目的蛋白包括但不限于利拉鲁肽、司美格鲁肽、特立帕肽（PTH）、Fc片段（包括免疫球蛋白（IgG、IgA 等）的 Fc片段）、胰岛素、人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、人胰高血糖素样肽-2（GLP-2）、胸腺素、白细胞介素（Interleukin）、成纤维细胞生长因子（FGF）、Cas9、牛肠激酶、胰蛋白酶、碱性磷酸酶等等。

本发明的第四方面，提供上述重组菌株或上述的生产目的蛋白的方法的应用，所述的应用包括通过重组菌株制备目的蛋白。

优选的，所述目的蛋白是任意适合在大肠杆菌B菌系中表达的蛋白。例如，所述目的蛋白包括全蛋白、蛋白片段、多肽、短肽、可溶性蛋白、非可溶性蛋白、分泌型蛋白。

更优选的，所述目的蛋白为药用蛋白，例如抗体或抗体片段、细胞因子、炎症因子、酶等等。

在一个具体的实施方式中，所述目的蛋白包括但不限于利拉鲁肽、司美格鲁肽、特立帕肽（PTH）、Fc片段（包括免疫球蛋白（IgG、IgA 等）的 Fc片段）、胰岛素、人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、人胰高血糖素样肽-2（GLP-2）、胸腺素、白细胞介素（Interleukin）、成纤维细胞生长因子（FGF）、Cas9、牛肠激酶、胰蛋白酶、碱性磷酸酶等等。

本发明的有益效果：

本发明通过改造大肠杆菌B菌系ompC位点，敲除insA/B-17，将ompC蛋白N端缺失的编码序列，ompC-micF启动子及micF基因重新插回该位点，恢复ompC蛋白的完整性，及ompC和ompF两个膜通道蛋白的表达调控机制。改造后的新菌种可以提高目的蛋白的表达量及分泌效率。

附图说明

图1：大肠杆菌B菌系改造技术路线示意图；

图2：S014质粒结构示意图；

图3：S001 pSEH质粒结构示意图；

图4：PCR产物琼脂糖电泳结果；

图5：菌落在培养平板上的生长情况；

图6：SDS-PAGE电泳分析重组蛋白S、P和F的表达情况，图6A为SDS-PAGE电泳分析条带结果，图中M为marker，图6B为基于SDSPAGE胶图进行条带像素对SQLb菌种三种蛋白表达的相对量分析；

图7：ALP蛋白进行UPLC定量分析结果，其中，图7A为ALP表达情况，图7B为ALP分泌效率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 大肠杆菌重组菌株的构建

本研究通过对K菌系与B菌系的序列比对发现在B菌系中由于insA/B-17插入ompC-micF位点，导致ompC基因N端缺失56个氨基酸编码序列，ompC和micF的启动子及下游rcsD和rcsB基因缺失，其中ompC蛋白N端缺失的56个氨基酸序列中含有信号肽（signal peptide）和使ompC锚定于细胞外膜至关重要的跨膜βstrand，K菌系ompC蛋白表达序列如SEQ ID NO:16所示，B菌系ompC蛋白表达序列如SEQ ID NO:17所示。基于以上发现，本发明通过I-sceIDNA内切酶无痕（scarless）同源重组对大肠杆菌B菌系改造，得到ompC-micF基因位点修复的新菌种，所述的方法包括：1）敲除大肠杆菌B菌系ompC位点中的insA/B-17；2）将ompC-micF启动子、ompC蛋白N端56个残基的编码序列，及micF基因重新插回该位点，获得大肠杆菌重组菌株，所述大肠杆菌重组菌株中，具有表达完整的ompC蛋白的能力，ompC蛋白与ompF蛋白表达可进行动态调节。

具体B菌系菌株改造的技术路线如图1所示，本研究中使用到的helper质粒为S001pSEH，包含araC和lacI promoter元件。首先通过加入阿拉伯糖诱导helper上的araC元件启动重组功能将包含同源臂A和B、分别位于同源臂A与I-SceI酶切位点之间以及I-SceI酶切位点与融合基因之间的5’和3’侧同源序列，I-sceI DNA内切酶、目标插入序列（OmpC^N-micF）的线性DNA同源重组到B菌系基因座上，之后加入IPTG诱导lacI promoter元件使得helper上的I-SceI表达使得I-SceI核酸内切酶识别位点被切割并经同源重组后获得改造后的B菌系菌株。

1．制备线性DNA同源重组模板

1.1 以S014质粒为模板用引物M13F和M13R扩增线性DNA片段，建立300 μl PCR反应体系如表1所示，其中，S014质粒具体结构如图2所示。

表1： PCR反应体系

具体PCR步骤如表2所示：

表2： PCR步骤

理论PCR产物长度为3473 bp，具体序列如SEQ ID NO:5所示，其中，I-SceI酶切位点序列如SEQ ID NO:1，引入的ompC N端、ompC调控（ompC-micF启动子序列）和micF编码序列如SEQ ID NO:2，同源臂A序列如SEQ ID NO:3所示，同源臂B序列如SEQ ID NO:4所示，5’侧同源序列如SEQ ID NO：18所示，3’侧同源序列如SEQ ID NO：19所示。

所使用的引物序列如表3所示：

表3： PCR引物序列

1.2 清除PCR反应体系中模板质粒

使用DNA 内切酶dpnI酶切降解模板质粒,具体应用体系如下表4：

表4：模板质粒降解体系

37˚C温浴酶切1小时后，65˚C温浴15分钟使dpnI失活。

1.3 PCR产物纯化

将dpnI酶切后的PCR产物进行1%琼脂糖电泳，从琼脂糖胶上切下相应条带，使用Promega Wizard SV Gels and PCR Clean-up System依照使用说明进行纯化，纯化后的线性DNA置于-20℃备用。

2 I-sceI DNA内切酶无痕（scarless）同源重组

2.1 制备大肠杆菌电转化感受态细胞

将携带卡那霉素抗性基因的helper质粒通过热激法转化入大肠杆菌BL21(DE3)衍生工程菌SQLa中，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的培养平板；从培养平板上挑质粒转化成功的单克隆菌落于含有50μg/ml卡那霉素及10mM arabinose的LB液体培养基中培养至菌液浓度OD₆₀₀为0.4，用预冷的10%甘油溶液清洗，将大肠杆菌重悬于10%甘油溶液，得到电转化感受态细胞，其中，helper质粒为S001 pSEH，质粒具体结构如图3所示。

2.2 使用BioRad MicroPulser电穿孔仪将1μg步骤1.3得到的线性DNA片段加入到50μl的电转化感受态细胞中，将电击复苏后的菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素，100μg/ml安普霉素（Apra）的LB固体培养平板上，30℃培养过夜。

3. 从培养平板挑取一个中间菌（SQLa-Apra）单克隆菌落在2ml含有50μg/ml卡那霉素及10mM阿拉伯糖（Arabinose）的LB液体培养基中30℃振荡培养2小时后加入2mM IPTG继续振荡培养6小时。将培养菌液按照1%稀释至LB 50μg/ml卡那霉素，10mM Arabinose，2mMIPTG液体培养基，30℃振荡培养过夜。重复上述步骤，将培养菌液按照1%稀释至LB 50μg/ml卡那霉素，10mM Arabinose 2mM IPTG液体培养基，30℃振荡培养3小时。将菌液做系列梯度稀释后涂布于LB50μg/ml卡那霉素，10mM Arabinose，2mM IPTG固体培养平板，30℃培养过夜。

4. 然后从平板上挑取约4个菌落标记为SQLb candidate进行PCR，以SQLa和中间菌SQLa-Apra为对照。通过1%琼脂糖电泳确认特异扩增片段大小与设计一致。

其中，PCR产物理论长度如表5所示，实际结果如图4所示：

表5： PCR产物理论长度

5. 对以Upstream-F和Downstream-R为引物，SQLb为模板的PCR产物进行碱基测序，确认序列无误，其中，PCR产物具体序列如SEQ ID NO:6所示，引物序列如表6所示。

表6： PCR引物序列

6. 将克隆1号、2号分别在LB，固体平板上划线，放置于42℃培养过夜，以使得工程菌丢失helper质粒S001。

7. 从过夜培养平板上挑取1号、2号单克隆菌落在分别LB，LB安普霉素，LB卡那霉素固体培养平板划线，放置于37℃培养过夜。结果如图5所示，确认最终工程菌SQLb中helper质粒已丢失，并且只能在未添加抗生素的培养平板上生长。

8. 挑取单克隆在LB液体培养基中37℃振荡培养至OD₆₀₀为1.0，加入甘油溶液，混匀后分装于冻存管，于-80℃超低温冰箱长期保存。

实施例2 改造后的大肠杆菌B菌系重组菌株在外源蛋白表达中的应用

将表达重组蛋白S（促表达融合标签链接的GLP1（7-37）），重组蛋白P（促表达融合标签链接的PTH（特立帕肽））和重组蛋白F（免疫球蛋白IgG的 Fc片段）的表达质粒通过热激法分别转入SQLa（对照组）和SQLb（重组菌株）感受态细胞中，在TB培养基中37℃培养至OD₆₀₀为2.0左右，加入IPTG（终浓度为1ｍＭ）诱导重组蛋白表达。37℃诱导过夜后离心收集菌体，进行超声波破壁。对全蛋白，可溶性蛋白及非可溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图6A所示，其中，Protein S分子量为5154 Da，Protein P分子量为5888 Da，Protein F分子量为24928 Da，图6B中进一步使用imagJ软件对SDS PAGE胶图进行条带像素分析。将在SQLa菌种三种蛋白像素分别设为100%，计算SQLb菌种三种蛋白表达的相对量，可以发现三组重组蛋白在改造后的B菌系菌株上的表达量有显著性的提高。

将表达分泌型重组蛋白碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表达质粒通过热激法分别转入SQLa和SQLb感受态细胞中，在TB培养基中37℃培养至OD₆₀₀为2.0左右，加入IPTG（终浓度为0.1ｍＭ）诱导重组蛋白表达。23℃诱导过夜后离心收集菌体及上清液。对细胞内及分泌至胞外得ALP蛋白进行UPLC定量分析，结果如表7和图7A和图7B所示。

表7：ALP蛋白进行UPLC定量分析结果

以上结果表明，改造后的B菌系无论是全蛋白、可溶性蛋白、非可溶性蛋白或是分泌型蛋白，从蛋白表达量、蛋白分泌效率角度看都得到了显著的提高。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 北京质肽生物医药科技有限公司

<120> 一种大肠杆菌重组菌株、其制备方法和应用

<130> 1

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attaccctgt tatcccta 18

<210> 2

<211> 799

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaggtctgg tcgccatcta catctttgtt gtcagagaaa tagtgcaggc cgtctacttt 60

accgtacaga tctaatttgt tgccgtcttt gttgtaaact tcagcagcgt ttgctgcgcc 120

tgctaccagc agagctggga ccaggaggga cagtacttta actttcatgt tattaaccct 180

ctgttatatg cctttatttg cttttttatg ccactgcata ctgattaacc ctcattaatc 240

agtcggcaag tccattctcc ccaaaaatgc agaataatcc aacacgaata tgatactaaa 300

acttttaaga tgtttcattt atcgctatag atgtttcaaa atgtaaatgc aagggaactt 360

tttaagatta ttgcggaatg gcgaaataag cacctaacat caagcaataa taattcaagg 420

ttaaaatcaa taacttattc ttaagtattt gacagcactg aatgtcaaaa caaaaccttc 480

actcgcaact agaataactc ccgctatcat cattaacttt atttattacc gtcattcatt 540

tctgaatgtc tgtttacccc tatttcaacc ggatgcctcg cattcggttt tttttaccct 600

tctttacaca cttttcatta ttctgtgcta ccacagaaaa actataacgc ttgttaacta 660

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ttgttgggct ttttgtaggt tatttgtaca gcaaaatggc gcttgtacat ctatttcccc 780

caatgcagga tgataaata 799

<210> 3

<211> 595

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 509

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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ttgcactgaa tgccggatgc ggcgtaaacg ccttatccgt cctacgaatc ccgcgatttc 120

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<210> 5

<211> 3473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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tcgaggccct gcgtgctgcg ctgggtccgg gagggacgct cgtcatgccc tcgtggtcag 1380

gtctggacga cgagccgttc gatcctgcca cgtcgcccgt tacaccggac cttggagttg 1440

tctctgacac attctggcgc ctgccaaatg taaagcgcag cgcccatcca tttgcctttg 1500

cggcagcggg gccacaggca gagcagatca tctctgatcc attgcccctg ccacctcact 1560

cgcctgcaag cccggtcgcc cgtgtccatg aactcgatgg gcaggtactt ctcctcggcg 1620

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agaatgacca ctgctgtgag cgctttgcct tggcggacag gtggctcaag gagaagagcc 1800

ttcagaagga aggtccagtc ggtcatgcct ttgctcggtt gatccgctcc cgcgacattg 1860

tggcgacagc cctgggtcaa ctgggccgag atccgttgat cttcctgcat ccgccagagg 1920

cgggatgcga agaatgcgat gccgctcgcc agtcgattgg ctgagctcat aagttcctat 1980

tccattaccc tgttatccct agaagcagct ccagcctaca cccggtcagc tggtcagtaa 2040

cctgagtttc acctttgaag ccaagacgca tgtaggtctg gtcgccatct acatctttgt 2100

tgtcagagaa atagtgcagg ccgtctactt taccgtacag atctaatttg ttgccgtctt 2160

tgttgtaaac ttcagcagcg tttgctgcgc ctgctaccag cagagctggg accaggaggg 2220

acagtacttt aactttcatg ttattaaccc tctgttatat gcctttattt gcttttttat 2280

gccactgcat actgattaac cctcattaat cagtcggcaa gtccattctc cccaaaaatg 2340

cagaataatc caacacgaat atgatactaa aacttttaag atgtttcatt tatcgctata 2400

gatgtttcaa aatgtaaatg caagggaact ttttaagatt attgcggaat ggcgaaataa 2460

gcacctaaca tcaagcaata ataattcaag gttaaaatca ataacttatt cttaagtatt 2520

tgacagcact gaatgtcaaa acaaaacctt cactcgcaac tagaataact cccgctatca 2580

tcattaactt tatttattac cgtcattcat ttctgaatgt ctgtttaccc ctatttcaac 2640

cggatgcctc gcattcggtt ttttttaccc ttctttacac acttttcatt attctgtgct 2700

accacagaaa aactataacg cttgttaact atttcacaaa taattaacat ccgcataatt 2760

tccagcaatc tttgtttatt tgcaattatt tttgttgggc tttttgtagg ttatttgtac 2820

agcaaaatgg cgcttgtaca tctatttccc ccaatgcagg atgataaata tatttcaaca 2880

aattacatta aagtaggcca gataagacgc gtcagcgtcg catctggcat ttgcactgaa 2940

tgccggatgc ggcgtaaacg ccttatccgt cctacgaatc ccgcgatttc ctgaccctct 3000

cggcatataa cgtcagcgtc tgttttatca catccagcgt taccggcttc gacaggcagc 3060

tgtccatacc ggactccaga caccgctgct tctcttcagc caacgcatta gcagttactc 3120

cgattaccgg caacgtcagt cccaactgac gaatgcgttg cgtcaagcgg taaccatcca 3180

tatttggcat gttgacgtcg ctaagcacga tatcaatatg attcttgcta agtacattaa 3240

gcgcatcgac gccatcattc gcggttttac attgatagcc caacgatccc aactgatctg 3300

ccagcaaacg ccggttaatc ggatgatcat ccacgaccag aatcatcata tcgtcattat 3360

cgctgaccgc tttgtccgtg aattcatcct cgaggttccc tttagtgagg gttaattgcg 3420

agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gct 3473

<210> 6

<211> 1991

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agggaaccta cgcgagttgc gttgtaggtc tgggtgtact gagcagccag gtagatgttg 60

ttagcgtcgt atttcagacc accagtgtag gtttcagcac ggtcgccgtt accgatgtaa 120

gcagcggtgt tctgagcatc agtacgtttg gagctggaga tcgcaccacc gataccgaaa 180

ccttcgtaat cataagtgat agaaccgccg acgccgtcgc cgttttgacg cagtgcgtca 240

cgaccgttgt tagttacgcc actagtaaag ccttcaccag atgggttgcc gtttttaccc 300

tggtactgaa cagcaaagtt caggccgtca accagaccga agaagtcagt gttacggtag 360

gtcgcgaagc cgttaccacg ctgctgcatg aagttgtcag aaccgtaggt gtcaccaccg 420

aattctggca gtacgtcggt ccaggaagtt acgtcataaa caacgccgta gttacgaccg 480

tagtcgaaag aacccacatc ctggaatttc agacctgcga atgccacacg ggtccaggag 540

ttgttttcgt tttcagcgct gttgccctgg atctgatatt cccactggcc gtaaccggtc 600

agctggtcag taacctgagt ttcacctttg aagccaagac gcatgtaggt ctggtcgcca 660

tctacatctt tgttgtcaga gaaatagtgc aggccgtcta ctttaccgta cagatctaat 720

ttgttgccgt ctttgttgta aacttcagca gcgtttgctg cgcctgctac cagcagagct 780

gggaccagga gggacagtac tttaactttc atgttattaa ccctctgtta tatgccttta 840

tttgcttttt tatgccactg catactgatt aaccctcatt aatcagtcgg caagtccatt 900

ctccccaaaa atgcagaata atccaacacg aatatgatac taaaactttt aagatgtttc 960

atttatcgct atagatgttt caaaatgtaa atgcaaggga actttttaag attattgcgg 1020

aatggcgaaa taagcaccta acatcaagca ataataattc aaggttaaaa tcaataactt 1080

attcttaagt atttgacagc actgaatgtc aaaacaaaac cttcactcgc aactagaata 1140

actcccgcta tcatcattaa ctttatttat taccgtcatt catttctgaa tgtctgttta 1200

cccctatttc aaccggatgc ctcgcattcg gtttttttta cccttcttta cacacttttc 1260

attattctgt gctaccacag aaaaactata acgcttgtta actatttcac aaataattaa 1320

catccgcata atttccagca atctttgttt atttgcaatt atttttgttg ggctttttgt 1380

aggttatttg tacagcaaaa tggcgcttgt acatctattt cccccaatgc aggatgataa 1440

atatatttca acaaattaca ttaaagtagg ccagataaga cgcgtcagcg tcgcatctgg 1500

catttgcact gaatgccgga tgcggcgtaa acgccttatc cgtcctacga atcccgcgat 1560

ttcctgaccc tctcggcata taacgtcagc gtctgtttta tcacatccag cgttaccggc 1620

ttcgacaggc agctgtccat accggactcc agacaccgct gcttctcttc agccaacgca 1680

ttagcagtta ctccgattac cggcaacgtc agtcccaact gacgaatgcg ttgcgtcaag 1740

cggtaaccat ccatatttgg catgttgacg tcgctaagca cgatatcaat atgattcttg 1800

ctaagtacat taagcgcatc gacgccatca ttcgcggttt tacattgata gcccaacgat 1860

cccaactgat ctgccagcaa acgccggtta atcggatgat catccacgac cagaatcatc 1920

atatcgtcat tatcgctgac cgctttgtcc gttgacggca gagcgttagc aggatcgtcg 1980

ctctccatct c 1991

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agggaaccta cgcgagttgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agggaaccta cgcgagttgc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccacgctgct gcatgaagtt 20

<210> 12

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtgatgctg ccaacttact gatttagtgt atgatggtgt ttttgaggtg ctccagtggc 60

ttctgtttct atcagctgtc cctcctgttc agctactgac ggggtggtgc gtaacggcaa 120

aagcaccgcc ggacatcagc gctatctctg ctctcactgc cgtaaaacat ggcaactgca 180

gttcacttac accgcttctc aacccggtac gcaccagaaa atcattgata tggccatgaa 240

tggcgttgga tgccgggcaa ctgcccgcat tatgggcgtt ggcctcaaca cgattttacg 300

tcacttaaaa aactcaggcc gcagtcggta acctcgcgca tacagccggg cagtgacgtc 360

atcgtctgcg cggaaatgga cgaacagtgg ggctatgtcg gggctaaatc gcgccagcgc 420

tggctgtttt acgcgtatga caggctccgg aagacggttg ttgcgcacgt attcggtgaa 480

cgcactatgg cgacgctggg gcgtcttatg agcctgctgt caccctttga cgtggtgata 540

tggatgacgg atggctggcc gctgtatgaa tcccgcctga agggaaagct gcacgtaatc 600

agcaagcgat atacgcagcg aattgagcgg cataacctga atctgaggca gcacctggca 660

cggctgggac ggaagtcgct gtcgttctca aaatcggtgg agctgcatga caaagtcatc 720

gggcattatc tgaacataaa acactatcaa taagttggag tcattacc 768

<210> 13

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala

1 5 10 15

Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu

20 25 30

Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Asp Asn Lys

35 40 45

Asp Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr

50 55

<210> 14

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttattaaccc tctgttatat gcctttattt gcttttttat gccactgcat actgattaac 60

cctcattaat cagtcggcaa gtccattctc cccaaaaatg cagaataatc caacacgaat 120

atgatactaa aacttttaag atgtttcatt tatcgctata gatgtttcaa aatgtaaatg 180

caagggaact ttttaagatt attgcggaat ggcgaaataa gcacctaaca tcaagcaata 240

ataattcaag gttaaaatca ataacttatt cttaagtatt tgacagcact gaatgtcaaa 300

acaaaacctt cactcgcaac tagaataact ccc 333

<210> 15

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gctatcatca ttaactttat ttattaccgt cattcatttc tgaatgtctg tttaccccta 60

tttcaaccgg atgcctcgca ttcggttttt ttt 93

<210> 16

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala

1 5 10 15

Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu

20 25 30

Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Asp Asn Lys

35 40 45

Asp Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu

50 55 60

Thr Gln Val Thr Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Gln

65 70 75 80

Ile Gln Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val

85 90 95

Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gln Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly

100 105 110

Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu

115 120 125

Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe Met Gln Gln

130 135 140

Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe Phe Gly Leu

145 150 155 160

Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Gln Gly Lys Asn Gly Asn

165 170 175

Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp

180 185 190

Ala Leu Arg Gln Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Thr Tyr Asp

195 200 205

Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser Lys Arg Thr

210 215 220

Asp Ala Gln Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu

225 230 235 240

Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala

245 250 255

Ala Gln Tyr Thr Gln Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly

260 265 270

Trp Ala Asn Lys Ala Gln Asn Phe Glu Ala Val Ala Gln Tyr Gln Phe

275 280 285

Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gln Ser Lys Gly Lys

290 295 300

Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys Tyr Val Asp

305 310 315 320

Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp

325 330 335

Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gln Phe Thr Arg Asp Ala Gly

340 345 350

Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr Gln Phe

355 360 365

<210> 17

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gln Val Thr Asp Gln Leu Thr

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Gln Ile Gln Gly Asn Ser Ala Glu Asn

20 25 30

Glu Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gln

35 40 45

Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp

50 55 60

Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr

65 70 75 80

Gly Ser Asp Asn Phe Met Gln Gln Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr

85 90 95

Arg Asn Thr Asp Phe Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val

100 105 110

Gln Tyr Gln Gly Lys Asn Gly Asn Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser

115 120 125

Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp Ala Leu Arg Gln Asn Gly Asp Gly

130 135 140

Val Gly Gly Ser Ile Thr Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly

145 150 155 160

Ala Ile Ser Ser Ser Lys Arg Thr Asp Ala Gln Asn Thr Ala Ala Tyr

165 170 175

Ile Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr

180 185 190

Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Arg Ala Ala Gln Tyr Thr Gln Thr Tyr Asn

195 200 205

Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly Trp Ala Asn Lys Ala Gln Asn Phe

210 215 220

Glu Ala Val Ala Gln Tyr Gln Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu

225 230 235 240

Ala Tyr Leu Gln Ser Lys Gly Lys Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp

245 250 255

Glu Asp Ile Leu Lys Tyr Val Asp Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn

260 265 270

Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp

275 280 285

Asn Gln Phe Thr Arg Asp Ala Gly Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala

290 295 300

Leu Gly Leu Val Tyr Gln Phe

305 310

<210> 18

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccggtcagct ggtcagtaac ctgagtttca cctttgaagc caagacgcat attccgggga 60

tccgtcgacc tgca 74

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccggtcagct ggtcagtaac ctgagtttca cctttgaagc caagacgcat 50

Claims (13)

1.一种大肠杆菌重组菌株的制备方法，其特征在于，所述的大肠杆菌为B菌系菌株，所述的重组菌株表达ompC蛋白，ompF蛋白表达下降，所述的制备方法包括敲除B菌系菌株基因组中的insA/B-17序列，向B菌系菌株基因组导入融合基因，所述的融合基因包括ompC-micF启动子、ompC蛋白的部分编码序列和micF基因。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括使用靶向载体制备重组菌株，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列从5’-3’依次包含I-SceI酶切位点、标记基因、I-SceI酶切位点和所述的融合基因。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含同源臂A和同源臂B，其中，所述同源臂A序列如SEQ ID NO：3所示，所述同源臂B序列如SEQ ID NO：4所示。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括使用包含I-SceI核酸内切酶编码基因的表达载体表达I-SceI核酸内切酶，所述的表达载体中以诱导型启动子驱动I-SceI核酸内切酶编码基因诱导型表达。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的诱导型启动子包括：rha启动子、trc启动子或lacI启动子。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括使用包含重组酶编码基因的表达载体表达重组酶，所述的表达载体中以诱导型启动子驱动重组酶诱导型表达。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的诱导型启动子包括阿拉伯糖启动子。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述的重组酶编码基因和I-SceI核酸内切酶编码基因位于同一表达载体中，或位于不同表达载体中。

10.一种权利要求1-9任一所述的制备方法制备的大肠杆菌重组菌株。

11.一种生产目的蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括向权利要求10所述的重组菌株中导入异源核酸生产目的蛋白。

12.权利要求10所述的重组菌株或权利要求11所述的方法在制备药物中的应用，其特征在于，所述的应用包括通过重组菌株制备目的蛋白。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述目的蛋白包括药用蛋白。

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