CN101418310B - 表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表面展示外源蛋白的重组芽孢的制备方法，特别是枯草芽孢杆菌芽孢表面展示对虾白斑综合征病毒Vp28蛋白的重组芽孢。该方法利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与对虾白斑综合征病毒表面抗原蛋白基因重组，构建融合表达的整合性重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白的重组芽孢。

Description

表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法

技术领域：

本发明涉及表面展示外源蛋白的重组芽孢的制备方法，特别是枯草芽孢杆菌芽孢表面展示对虾白斑综合征病毒Vp28蛋白的重组芽孢。

背景技术

对虾白斑综合征是由白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，简称为WSSV)引发的一种综合性病症，给对虾养殖造成巨大的经济损失，对虾白斑综合征病毒疫苗是控制病毒感染最为有效的措施。斑节对虾口服接种在大肠杆菌中表达的重组WSSV囊膜蛋白rVp28，保护率达77％(Witteveldt J，et al.2004.J.Virol.78(4)：2057-61)。但重组的Vp28或Vp19蛋白疫苗在水体环境中稳定性差、利用率低；口服可溶性抗原(或重组抗原)疫苗易被消化道内的蛋白酶所降解、耐受性差、储存时间短，因此难以大规模应用于对虾白斑综合征病毒感染的控制。利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)营养细胞分泌性表达Vp28，并通过对虾口服该重组枯草芽孢杆菌芽孢后在消化道中萌发成营养细胞分泌性表达Vp28，可使对虾获得抗病毒感染能力(Hu LL，et al.2008.Lett.Appl.Microbiol，46(2008)：581-586)，但免疫能力依赖于芽孢在消化道中的停留时间和分泌性表达的Vp28的降解程度，因难以完全有效的通过对虾消化道屏障的而限制其免疫效果。对虾口服重组可溶性Vp28抗原产生的抗WSSV感染的免疫学机制目前还不清楚。

Bacillus subtilis为环境友好菌，其芽孢具有独特的抗逆性、容易培养、芽孢比重大易分离、不需要复杂的分离纯化操作；芽孢具有独特的抗逆特性，能在极端环境(如高温、干燥、化学药物)中长期存活，可顺利通过动物消化道屏障，可作为极端环境(如胃肠道)下异源蛋白或生物活性分子的载体(Oggioni MR，et al.2003.Vaccine.21：96-101)。

本发明的目的在于将Vp28蛋白展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，构建表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的枯草芽孢杆菌重组芽孢，使Vp28蛋白获得良好抗逆性，适用于对虾口服接种，但迄今尚未见类似的报道或发明专利。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法。该方法以枯草芽孢杆菌芽孢为载体，通过芽孢表面展示技术将对虾白斑综合征病毒保护性抗原蛋白Vp28展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，制备枯草芽孢杆菌重组芽孢。

本发明所采用的技术方案是：

一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法，是利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与对虾白斑综合征病毒表面抗原蛋白基因重组，构建融合表达的整合性重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白的重组芽孢。

本发明选择具有转化能力且可产芽孢的枯草芽孢杆菌菌株作为重组质粒的转化菌株，如Bacillus subtilis 168及其系列衍生菌株(Bacillus GeneticStock Center，Department of Biochemistry，The Ohio State University，West 12th Avenue，Columbus，Ohio，43210，USA)；选择芽孢衣壳蛋白基因cotC(Gene BanK序列号：NP_389653)和cotG(Gene BanK序列号：NP_391488)作为表面展示蛋白的分子载体，选择对虾白斑综合征病毒衣壳抗原蛋白基因vp28为被重组基因。

本发明涉及本发明所选择的芽孢衣壳蛋白基因cotC和cotG分别与vp28基因编码序列重组后构建的重组质粒，在这些重组质粒中分别含有芽孢衣壳蛋白基因的启动子、不含终止密码子的编码序列与vp28基因的编码序列重组后的基因，可在枯草芽孢杆菌分化形成芽孢芽孢时分别融合表达CotC-Vp28、CotG-Vp28.

本发明还涉及本发明构建的融合表达CotC-Vp28、CotG-Vp28的重组质粒转化枯草芽孢杆菌筛选所得到的重组菌株，这些重组菌株诱导形成的芽孢表面展示Vp28，并可通过荧光免疫检测其芽孢表面展示重组蛋白Vp28。

本发明涉及基因vp28编码序列片断扩增的引物序列：

vp28-1：GAGACGAGCTCTCGGTCGTGTCGGCCATCC

vp28-2：GAGACGAATTCTTACTCGGTCTCAGTGCCAG

本发明涉及基因cotC启动子及不含终止密码子的编码序列片段扩增的引物序列：

cotC-1：GACTGAGTCTAGATGTTCAAAATAAATGCATTC

cotC-2：GACTGAGGGTACCGTAGTGTTTTTTATGCTTTTT

本发明涉及基因cotG启动子及不含终止密码子的编码序列片段扩增的引物序列：

cotG-1：GACAGGTCTAGACTCTGCCTTTGGAGACAGTGTCCC

cotG-2：GAGACAGGTACCGTCGTCGCAGTGGTGGTGCG

本发明涉及枯草芽孢杆菌淀粉酶基因amy-E片段扩增的引物序列：

amyE-1：CATTGCTCGGGCTGTATGACTGG

amyE-2：GATTGTGAATTGATCTCCATCC

与本领域已知的方法相比，本发明方法将对虾白斑综合征病毒Vp28展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用芽孢所具有的独特抗逆性，使Vp28顺利通过对虾消化道屏障。本发明构建的表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的枯草芽孢杆菌重组芽孢，可用于对虾抗白斑综合征病毒的口服重组疫苗，相对于其他重组Vp28抗原，具有更好稳定性。

附图说明

图1发明人克隆的WSSV vp28基因编码序列在Gene Bank中搜索比对结果

图2融合表达CotC-Vp28整合性重组质粒pJS253结构示意图。amyE 5’-end和amyE 3’-end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端DNA片断，通过双交换整合在Bacillus subtilis 168(trp-)染色体的淀粉酶基因中；Cm^r，Em^r，Apr分别表示氯霉素抗性基因，红霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大肠杆菌或Bacillus subtilis 168(trp-)中的筛选；cotC-vp28为在Bacillussubtilis 168(trp-)芽孢中融合表达CotC-Vp28重组蛋白的基因片段，该片段含cotC启动子序列、不含cotC终止密码子的CotC编码序列，以及Vp28的全编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段

图3菌株DRJS253表面展示Vp28的重组芽孢荧光免疫鉴定。A可见光下观察菌株DRJS253重组芽孢(10×100油镜)；B紫外下光观察菌株DRJS253重组芽孢。兔抗-Vp28多克隆抗体与重组枯草芽孢杆菌菌株DRJS253重组芽孢结合后，与以FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体免疫反应，荧光显微镜(10×100油镜)观察并拍照。

图4融合表达CotG-Vp28整合性重组质粒pJS256结构示意图。amyE 5’-end和amyE 3’-end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端DNA片断，通过双交换整合在Bacillus subtilis 168(trp-)染色体的淀粉酶基因中；Cm^r，Em^r，Ap^r分别表示氯霉素抗性基因，红霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大肠杆菌或Bacillus subtilis 168(trp-)中的筛选；cotG-vp28为在Bacillussubtilis 168(trp-)芽孢中融合表达CotG-Vp28重组蛋白的基因片段，该片段含cotG启动子序列、不含cotG终止密码子的CotG编码序列，以及Vp28的全编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段

图5菌株DRJS256芽孢表面展示Vp28的重组芽孢的荧光免疫鉴定。A可见光下观察菌株DRJS256重组芽孢(10×100油镜)；B紫外下光观察菌株DRJS256重组芽孢。兔抗-Vp28多克隆抗体与菌株DRJS256重组芽孢结合后，与以FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体免疫反应，荧光显微镜(10×100油镜)观察并拍照。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明实施例中涉及的由发明人保存的生物材料，均可向公众提供20年。

本发明实施例中所用的WSSV vp28基因由本发明人克隆、测序鉴定并保存：以下是WSSV vp28克隆、测序鉴定：

因白斑综合征病毒感染后发病死亡的对虾样品采于海南省万宁市，取上述死亡对虾0.1g鳃组织，加入5倍的TN缓冲液(0.02M Tris-HCl，0.4M NaCl，pH 7.4)，以玻璃匀浆器研磨，12000转/分钟离心10分钟，取上清病毒液。加十二烷基磺酸钠至终浓度为0.5％，蛋白酶K至终浓度为100mg/ml，在37℃下处理2小时，利用苯酚/氯仿混合液抽提，加1/4体积的5mol/L的氯化钠和两倍体积的乙醇在-20℃下沉淀16小时，于4℃以12000g离心15分钟，干燥DNA沉淀，溶于最小体积的无菌超纯水中，用于PCR扩增WSSV vp28基因片断的模板。

WSSVvp28基因片断的PCR扩增引物为：

vp28-a：GATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGG

vp28-b：GTTACTCGGTCTCAGTGCCAG

PCR扩增反应体系见本发明实施例1中的1.3 PCR扩增。PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物大小为617bp，包括WSSV vp28基因的615bp的编码序列。扩增片段克隆于pMD18-T载体中(购自宝生物工程(大连)有限公司)，克隆重组质粒命名为pJS201，克隆片断测序(由上海生工生物工程技术服务公司完成)，重组质粒中WSSV基因vp28序列为SEQ ID NO.1所示。

测序结果在Gene Bank中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索比对。WSSV(海南株)基因vp28序列与Gene BanK中序列号分别为EU414753，DQ902658，DQ098011，AY324881，AF272979等21个vp28基因的同源性均为100％；与AY873785，EF534254，AY682926等10个vp28基因的同源性均为99％，(见本发明附图说明及附图1)。

实施例1

以CotC为载体蛋白表面展示Vp28的枯草芽孢杆菌重组芽孢的制备

1.分子生物学操作

1.1枯草芽孢杆菌染色体的提取

离心收集10mL Bacillus subtilis1 68(trp^-)(Bacillus Genetic Stock Center，Department of Biochemistry The Ohio State University 484 West TwelfthAvenue Columbus，Ohio 43210，USA)培养物，加0.5ml TE悬浮沉淀。每个微量离心管加入30μl溶菌酶(100mg/ml)，于37℃反应1小时；加入50μl SDS(10％)与20μl蛋白酶K(20mg/ml)，震荡均匀，于37℃反应2小时，加入等体积的苯酚/氯仿抽提后取上清，加入2倍体积的乙醇，室温下使DNA沉淀超过2小时，12,000g离心10分钟，弃上清液后以75％乙醇500μl洗DNA沉淀物，以去除无机盐离子。待DNA沉淀物干燥后，加入30～50μlTE或ddH₂O溶解DNA，于-20℃下保存备用。

1.2分子生物学技术

所有质粒的构建采用Sambrook等人(《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)所述的标准分子生物学技术进行，用于本发明的所有回收DNA片段均采用上海生工生物工程有限公司凝胶回收试剂盒分离纯化。所有PCR产物克隆片段均经上海生工生物工程有限公司测序

1.3 PCR扩增

用于基因扩增的引物由上海生工生物技术有限公司合成，为便于扩增产物的克隆部分引物5’端添加限制性内切酶识别位点，PCR反应体系中含10mmol/LTris·Cl(pH 8.3)，50mmol/L MgCl₂，上下游引物各100pmol，200μmol/L dNTPs，50ng模板DNA，2.5U DNA聚合酶(Taq/Pfu＝1/1，U/U)。PCR反应程序根据不同引物特征设置。

2.质粒的构建

2.1基本质粒构建

WSSV vp28基因的获得。应理解，本领域技术人员可通过已知的WSSV vp28基因序列合成WSSV vp28基因，或者是利用现有公开的WSSV病毒株克隆得到vp28基因。

本实施例中所用的WSSV vp28基因来自本发明人克隆并保存在质粒pJS201中含vp28基因的全编码序列。

根据本发明人克隆并保存的WSSVvp28基因序列合成引物：

vp28-1：GAGAGAGCTCTCGGTCGTGTCGGCCATCC

vp28-2：GAGACGAATTCTTACTCGGTCTCAGTGCCAG

为便于克隆，上游引物vp28-1添加了SacI位点，下游引物vp28-2添加了EcoRI位点以vp28-1和vp28-2：为引物，以pJS201质粒为模板，PCR扩增vp28基因编码序列片段，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物大小为603bp，分别以限制性内切酶SacI和EcoRI消化酶切产物用凝胶回收试剂盒回收后插入pUC18(《分子克隆：试验手册》第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)相应的克隆位点，克隆片段测序确定序列正确后命名为pJS212。

本领域技术人员能够将其他方法获得的WSSV vp28基因插入pUC18，得到相应质粒。

以BamHI酶切由发明人保存的质粒pRL598(Black，T.A.，and C.P.Wolk.1994.J.Bacteriol.176：2282-2292.)，回收含氯霉素(Cmr)-红霉素抗性(Emr)基因片段(约1.9kb)，以T₄DNA聚合酶处理后，与SalI酶切、T₄DNA聚合酶补平的pJS212连接，分别以BamHI和KpnI酶切鉴定后重组质粒命名为pJS213。

根据Bacillus subtilis 168染色体上的淀粉酶基因amyE(Gene BanK序列号：NP_388186)序列，设计并合成引物：

amyE-1：CATTGCTCGGGCTGTATGACTGG

amyE-2：GATTGTGAATTGATCTCCATCC

以amy-1和amy-2为引物，Bacillus subtilis 168(trp^-)染色体为模板PCR扩增amyE基因部分编码序列片段。PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物大小约1kb，抽提沉淀后以T₄DNA聚合酶处理后与PvuII酶切pUC18的大片段连接，连接产物传化E.coli DH5α，鉴定后的重组质粒为整合平台质粒pJS225。

以PvuII酶切质粒pJS213，回收Cm^r-Em^r-vp28(大小约2.5kb)重组DNA片段插入整合平台质粒pJS225中的SmaI位点，鉴定后的重组质粒命名为pJS226，该质粒为不含Bacillus subtilis复制位点的整合型质粒，可通过质粒中的被插入失活的amyE基因片段与Bacillus subtilis 168(trp^-)染色体上的同源片段重组而整合与染色体上，并使重组基因得以稳定遗传。

2.2融合表达CotC-Vp28重组蛋白整合型重组质粒构建

根据Bacillus subtilis 168染色体上的cotC(Gene BanK序列号：NP 389653)序列，设计并合成以下引物：

cotC-1：GACTGAGTCTAGATGTTCAAAATAAATGCATTC

cotC-2：GACTGAGGGTACCGTAGTGTTTTTTATGCTTTTT

为便于克隆，上游引物cotC-1添加了XbaI位点，下游引物cotC-2添加了KpnI位点。以cotC-1和cotC-2为引物，Bacillus subtilis168(trp^-)染色体为模板，扩增含cotC基因的启动子和不含终止密码子的编码序列，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸5min。扩增产物大小为650bp，抽提沉淀后以XbaI和KpnI酶切，插入质粒pJS226中的XbaI和KpnI位点，得到的重组质粒以测序确定克隆基因正确后命名pJS253。整合型重组质粒pJS253中含重组基因cotC-vp28，该质粒的物理图谱见本发明附图说明及附图2。

3.融合表达重组蛋白的枯草芽孢杆菌菌株的筛选鉴定

将整合型质粒pJS253转化Bacillus subtilis 168(trp^-)，以含0.4μg/mL红霉素的LB平板筛选转化子，从平板上挑单菌落接种在3mL含相同抗生素的液体LB培养基中培养过夜，按以下两种方法鉴定转化子：(1)淀粉平板碘液染色法。1％淀粉平板的制备：固体LB培养基中加可溶性淀粉至终浓度为1％，高压灭菌后制备平板；碘液的配制：碘化钾2g；蒸馏水300ml；碘1g，先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至300mL，保存在棕色玻璃瓶内。取5μL于含红霉素液体培养基中培养的菌液涂在淀粉平板上，37℃培养16小时，取2mL碘液喷于淀粉平板上，菌落及周围颜色为白色表明重组基因插入Bacillus subtilis 168(trp^-)染色体上的淀粉酶基因amyE中，菌落及周围颜色变蓝表明重组基因没有插入淀粉酶基因amyE中；(2)特异性引物PCR鉴定。将菌落及周围颜色为白色的转化子培养物提取染色体，PCR进一步鉴定转化子中的重组基因。以引物cotC-1和vp28-2检测pJS253转化后的Bacillus subtilis168(trp^-)菌株；经上述方法鉴定后的重组菌株分别命名为DRJS253。

4.表面展示Vp28重组芽孢的诱导及其鉴定

以DSM培养基诱导重组菌株DRJS253形成芽孢。DSM培养基的配制：0.8％肉汤营养液(Difco)，0.1％KCl，0.025％ MgSO₄·7H₂O，1.0mM Ca(NO₃)₂，10μM MnCl₂，1.0μM FeSO₄。取重组菌株DRJS253单菌落接种于3mL DSM培养基中，37℃震荡培养40小时，5000转/分钟离心10分钟收集芽孢，重悬于1mL无菌水中。以终浓度为10mg/mL溶菌酶37℃处理30分钟破坏营养细胞，5000转/分钟离心10分钟沉淀芽孢，加1mL水重悬芽孢。.取10uL芽孢悬液涂于载玻片上，干后用丙酮在37℃固定15分钟；用滴加25uL兔抗-Vp28多克隆抗体，置湿盒内，37℃作用30分钟；取出载玻片用PBS冲洗后，用PBS漂洗3次，每次5分钟；用滤纸轻轻吸干玻片后，加25uL FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体，置湿盒内，37℃作用30分钟；漂洗(操作同上)后，用蒸馏水淋洗一次，于电吹风下吹干(或自然干燥)，加封载剂(缓冲甘油)后盖上盖玻片(注意避免产生气泡)置荧光显微镜下观察结果(见本发明附图说明及附图3)。产生绿色荧光的芽孢表明表面展示Vp28蛋白，该芽孢即为表面展示Vp28蛋白的重组芽孢。

实施例2

以CotG为载体蛋白表面展示Vp28的枯草芽孢杆菌重组芽孢的制备

1.分子生物学操作

1.1病毒染色体的提取

具体操作方法同本发明实施例1，1.1病毒染色体的提取

1.2枯草芽孢杆菌染色体的提取

具体操作方法同本发明实施例1，1.2枯草芽孢杆菌染色体的提取

1.3分子生物学技术

具体操作方法同本发明实施例1，1.3分子生物学技术

1.4 PCR扩增

具体操作方法同本发明实施例1，1.4分子生物学技术

2.质粒的构建

2.1基本质粒构建

具体操作方法同实施例1，2.1基本质粒的构建

2.2融合表达CotG-Vp28重组蛋白整合型重组质粒构建

根据Bacillus subtilis 168染色体上的cotG(Gene BanK序列号：NP_391488)序列，设计并合成以下引物：

cotG-1：GACAGGTCTAGACTCTGCCTTTGGAGACAGTGTCCC

cotG-2：GAGACAGGTACCGTCGTCGCAGTGGTGGTGCG

为便于克隆，上游引物cotG-1添加了XbaI位点，下游引物cotG-2添加了KpnI位点。以cotG-1和cotG-2为引物，Bacillus subtilis 168染色体为模板，扩增含cotG基因的启动子和不含终止密码子的编码序列，PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸5min。扩增产物大小为974bp，抽提沉淀后以XbaI和KpnI酶切，插入质粒pJS226中的XbaI和KpnI位点，得到的重组质粒以对应的插入片段上有引物测序确定克隆基因正确后命名pJS256。整合型重组质粒pJS256中含重组基因cotG-vp28，该质粒的物理图谱见本发明附图说明及附图4。

3.融合表达重组蛋白的枯草芽孢杆菌菌株的筛选鉴定

将整合型质粒pJS256转化Bacillus subtilis 168(trp^-)，以含0.4μg/mL红霉素的LB平板筛选转化子，从平板上挑单菌落接种在3mL含相同抗生素的液体LB培养基中培养过夜，通过以下方法鉴定重组菌株：(1)以淀粉平板碘液染色法鉴定重组菌株，操作方法同本发明实施例1中3.融合表达重组蛋白的Bacillussubtilis168(trp^-)菌株的筛选鉴定。(2)特异性引物PCR鉴定，将菌落及周围颜色为白色的转化子培养物提取染色体，PCR进一步鉴定转化子中的重组基因。以引物cotG-1和vp28-2检测pJS256转化后的Bacillus subtilis168(trp^-)菌株；经上述方法鉴定后的重组菌株分别命名为DRJS256。

4.表面展示Vp28重组芽孢的诱导及其鉴定

表面展示Vp28重组芽孢诱导及其鉴定的操作方法同本发明实施例1中4.表面展示Vp28重组芽孢的诱导及其鉴定，鉴定结果见本发明附图说明及附图5。产生绿色荧光的芽孢表明表面展示Vp28蛋白，该芽孢即为表面展示Vp28蛋白的重组芽孢。

SEQUENCE LISTING

<110>江苏大学

<120>表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法

<160>1

<210>1

<211>615

<212>DNA

<213>对虾(Penaeus)

<400>1

atggatcttt ctttcactct ttcggtcgtg tcggccatcc tcgccatcac tgctgtgatt     60

gctgtattta ttgtgatttt taggtatcac aacactgtga ccaagaccat cgaaacccac    120

acagacaata tcgagacaaa catggatgaa aacctccgca ttcctgtgac tgctgaggtt    180

ggatcaggct acttcaagat gactgatgtg tcctttgaca gcgacacctt gggcaaaatc    240

aagatccgca atggaaagtc tgatgcacag atgaaggaag aagatgcgga tcttgtcatc    300

actcccgtgg agggccgagc actcgaagtg actgtggggc agaatctcac ctttgaggga    360

acattcaagg tgtggaacaa cacatcaaga aagatcaaca tcactggtat gcagatggtg    420

ccaaagatta acccatcaaa ggcctttgtc ggtagctcca acacctcctc cttcaccccc    480

gtctctattg atgaggatga agttggcacc tttgtgtgtg gtaccacctt tggcgcacca    540

attgcagcta ccgccggtgg aaatcttttc gacatgtacg tgcacgtcac ctactctggc    600

actgagaccg agtaa                                                     615

Claims (5)

1.一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法，其特征在于，利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的基因重组，构建融合表达的整合性重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢。

2.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为cotC和cotG。

3.如权利要求2所述的表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法，其特征在于，所述的融合表达的整合性重组质粒是将枯草芽孢衣壳蛋白基因分别与vp28基因重组构建的质粒，在这些重组质粒中含有整合基因amyE片段、适用于大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因、芽孢衣壳蛋白基因的启动子和不含终止密码子的编码序列与vp28基因的编码序列重组后的基因。

4.如权利要求3所述的表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌重组菌株是整合性重组质粒转化枯草芽孢杆菌的所得菌株，该菌株染色体上含有适用于枯草芽孢杆菌的抗性选择标记基因、以及芽孢衣壳蛋白基因的启动子和不含终止密码子的编码序列与vp28基因的编码序列重组后的基因，这些基因插入淀粉酶基因中并导致重组菌株的淀粉酶是失活。

5.如权利要求4所述的表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法，其特征在于，重组芽孢是枯草芽孢杆菌重组菌株诱导形成的枯草芽孢杆菌芽孢，芽孢表面展示有Vp28蛋白。

Images